JP2003535338A

JP2003535338A - 無洗浄ビーズアッセイ、キットおよび操作

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Publication number: JP2003535338A
Application number: JP2002501043A
Authority: JP
Inventors: マーク、ケイ．ヘキンジャー
Original assignee: サイトメトリー、アプリケーションズ、インコーポレーテッド
Priority date: 2000-06-02
Filing date: 2001-06-04
Publication date: 2003-11-25
Also published as: CA2421031A1; EP1292829A4; WO2001092887A1; AU2001265419B2; US20050221379A1; EP1292829A1; MXPA02011906A; US20020004199A1; AU6541901A

Abstract

(57)【要約】無洗浄ビーズベースアッセイの作製方法では、緩衝液からなる第一の試薬を調製し、タンパク質からなる第二の試薬を調製する。ビーズを緩衝液で洗浄してビーズ‐緩衝液マトリックスを形成し、ビーズの界面活性力を有効量まで減少させることを含めて、５％未満の変動係数を有する前選択サイズのビーズを調製する。次いで、抗原がビーズへ付着してビーズ‐抗原混合物を形成するように、標的種の存在を検出するための抗原がビーズ‐緩衝液マトリックスへ加えられる。ビーズの界面活性力はそれへの抗原の付着を促す。緩衝液がビーズ‐抗原混合物へ加えられ、次いでその混合物がインキュベートされる。非特異的結合部位を減少または除去するために、第二の試薬がビーズ‐抗原混合物へ加えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の分野および背景】

本発明は、アッセイ、アッセイキットおよびその製造方法に関する。そのアッ
セイはフローサイトメーター向けのすべてビーズベースであり、それによって、
各々が異なる付着性を有した異なるサイズおよび／または色のビーズが、フロー
サイトメトリー技術を用いて分析される。

【０００２】ビーズベースのフローサイトメトリー分析の技術的進歩が、適切なリガンドで
コートされたビーズまたはビーズシステムと結合するようになる、抗体、抗原、
酵素、タンパク質、化学物質または他の物質の検出および／または同定のための
迅速で効率的な方法について、抗しがたい要求を生み出した。この出願（請求の
範囲を含む）において、“リガンド”および“抗原”という用語は広義の意味を
有しており、即ち、内容が明らかに他を示していないかぎり、相補的物質と結合
する物質を表わす。ある物質とその相補的物質とのこのような結合の例には、双
方ともリガンドである抗原‐抗体の組合せがあるが、それに限定されない。ビー
ズベースアッセイシステムでは、フローサイトメーター内を流動するビーズのサ
イズ、前方角光散乱（ＦＡＬＳ）、蛍光および他のパラメーターを検出しうるレ
ーザーフローサイトメーターを利用している。ビーズまたは少くともその一部は
、抗体、抗原、酵素、タンパク質などと直接または間接的に付着していてもよい
。ビースおよび／またはそれへ付着した物質の存在および／または特徴は、付着
物を有するおよび有しないビーズがフローサイトメーター内を流動する際に測定
および記録される。

【０００３】ビーズ、あるいは抗体、酵素、タンパク質または他の物質へ付着したビーズの
パラメーターおよび／または物理的特徴のおかげで、シングルまたはマルチビー
ズシステムに特有のサイジング特性を識別しながら、同時にビーズ自体と結合す
る特異的抗体、酵素などへ付着した蛍光色素を検出することができる。一部のシステムでは反応でビーズの凝集を検出および測定することのみを求め
ているが、これはフローサイトメーターでも検出しうる。

【０００４】これらのビーズベースアッセイシステムで操作しうる多くの手法がある。しか
しながら、そのシステムにもかかわらず、付着物を有するビーズがフローサイト
メーターにより分析される前に、多数の操作およびステップを行わねばならない
という問題が常にある。このようなステップとして、ビーズと共に物質の添加、
洗浄、（例えば、蛍光抗体、酵素または化学物質のような）検出システムの添加
、インキュベート、次いで更にもう１回の洗浄がある。更に、一部の方法では２
回の洗浄ステップよりも更に多くを要することがある。結果的に、アッセイの過
程である程度まで必要とされる多数回のステップは、第一に、その目標が時間と
労力を節約することにあるビーズベースフローサイトメトリーシステムの発展と
いう目的を損なうものである。

【０００５】

【発明の要旨】

本発明の一面によると、無洗浄ビーズベースアッセイの作製方法が提供され、
その方法では：緩衝液からなる第一の試薬を調製し；タンパク質からなる第二の
試薬を調製し；ビーズを緩衝液で洗浄してビーズ‐緩衝液マトリックスを形成し
、ビーズの界面活性力を有効量まで減少させることを含めて、５％未満の変動係
数を有する前選択サイズのビーズを調製し；ビーズの界面活性力はそれへの抗原
の付着を促すのであるが、抗原がビーズへ付着してビーズ‐抗原混合物を形成す
るように、標的種の存在を検出するための抗原をビーズ‐緩衝液マトリックスへ
加え；ビーズ‐抗原混合物へ緩衝液を加え、次いでその混合物をインキュベート
し；第二の試薬をビーズ‐抗原混合物へ加えて、非特異的結合部位を減少または
除去する。

【０００６】したがって、本発明は、一面において、“無洗浄”能力を備えることで、より
慣用的または伝統的な方法と比較して著しい時間量をオペレーターが節約しうる
、ベースアッセイキットおよび操作の提供に関する。このように、本発明は、結
果を得るために、何回もの洗浄を含めた複雑な操作を行うことなく、簡単に短時
間で標的物質または種の存在について最終ユーザーが試験しうるように調製され
たプロセス、ビーズシステムおよび／またはアッセイキットに関する。

【０００７】確かに、本発明の“無洗浄”方法およびキットは、標準ビーズベースフローサ
イトメーターアッセイを行うために必要なステップの回数を減らして、時間の量
を短縮する。本発明は、他面において、バックグラウンドを調整する必要性が有
意に減少するかまたは事実上消失すらして、マルチビーズベースシステムの変動
係数が最少または無凝集で最適化される方法およびキットも提供する。アッセイ
の結果に影響を及ぼしうるバックグラウンドには、例えば、アッセイ自体に非特
異的な蛍光シグナル、あるいは自己蛍光、またはビーズへのインジケーター試薬
の非特異的結合によるものがある。

【０００８】一面において、本発明では、いかなるビーズベース被検体検出システムも用い
られて、同一反応容器でインキュベートされる、標的物質または種の存在を検出
するためのキットおよび操作について記載している。換言すると、そのアッセイ
プロセスに伴うマルチステップは、より短時間でより効率的な試験メカニズムを
もたらせるように減少している。本発明の一態様において、ビーズは別々に詰め
込んでも、またはそれらは異なるサイズおよび／または色の混合スラリーで組み
合わせてもよい。記述のように、多数回の洗浄ステップは不要であるため、アッ
セイを行うために必要な時間および労力の量を減少させる。慣用的なビーズベー
スアッセイは、少くとも一部において、サンプルの前希釈、多数回の洗浄および
別々なインジケーターを要する伝統的なＥＬＩＳＡアッセイに現在は取って代わ
っているが、それにもかかわらず、多数の工程がこれら慣用的なビーズベースア
ッセイでなお必要とされており、それらをキットとしてパッケージすることを厄
介にして、最終ユーザーによる実施を難しくしている。

【０００９】別な面において、本発明では、アッセイ全体を通して“無洗浄”操作を利用す
ることにより、フローサイトメトリー装置で用いられるビーズベースシステムの
検出および分析のための条件を最適化しようと試みている。本発明は、一面にお
いて、“無洗浄”方法を利用しようとすると、大抵の場合にビーズを凝集しやす
くさせて、ダブレットを有する、および／または著しい“バックグラウンド”蛍
光を有することがある、慣用的なビーズ染色アッセイ操作における問題の一部に
取り組んでいる。したがって、このようなアッセイで得られる結果は読み取りが
難しく、明確性を欠いていることから、それらは大いに主観的となりうる。

【００１０】アッセイの調製は、好ましくはビーズサイズで低い変動係数（Ｃ．Ｖ．）を有
する、適正なビーズ物質を選択することにより開始される。ビーズサイズ当たり
で低いＣ．Ｖ．のとき、個々のチューブまたはアッセイで異なるサイズまたは色
のビーズを多く利用しうることから、低いＣ．Ｖ．の方が好ましい。通常、低Ｃ
．Ｖ．とは、所定のサンプルでビーズサイズの変動が少なく、そのためそのロッ
トの全ビーズがより均一なサイズになりやすいことを意味する。逆に、高Ｃ．Ｖ
．はサイズの変動が高いことを示し、この状況において、アッセイ向けに選択さ
れるビーズサイズが様々であれば、用いられるビーズがサイズ上かなり異なって
くるにちがいないであろう。選択されるビーズ物質は、タンパク質コーティング
に適してもよい。次いで、ビーズは炭酸緩衝液で慎重に前洗浄（遠心／デカント
）され、連続滴定で測定されるように特定濃度（通常マイクログラム濃度）の抗
原または他のリガンドでコートされ、次いで混合される。次いで、緩衝液が適切
な容量までビーズペレットの上へ加えられる。その混合液は数分または数時間に
わたりインキュベートされてから、それが遠心され、ビーズが炭酸緩衝液で洗浄
される。システムに応じて、得られるビーズ／緩衝液混合物は５〜１０のｐＨを
有する。

【００１１】その混合物は攪拌懸濁に付してもよく、一例にすぎないが、システムまたはア
ッセイの要求に応じて、タンパク質または他のタイプの溶液、例えば０．１〜１
０％でコートしてもよい。この溶液はインジケーター試薬またはサンプル成分の
非特異的結合を阻止して、アッセイの読取りを混乱させうる偽の陽性シグナルの
量を減少させることにより、真に陽性のシグナル間でより明確な分離を行わせる
。

【００１２】次いで、混合液は攪拌、回転およびデカントされる。最終の炭酸緩衝液懸濁で
は、穏やかな攪拌後に、その最終濃度までビーズペレットを再懸濁する。

【００１３】本発明は、ビーズと共にインキュベートしうる、陽性および陰性コントロール
の使用にも関する。コントロールにおけるサンプル対ビーズ懸濁物の全容量比の
最適化は、対照と比較されるように、上記手法〔即ち、ＥＬＩＳＡ〕の結果をま
ねて、より高い感度閾値に達することを助けるアッセイの能力を大いに増すこと
がある。例えば、アッセイ毎にビーズ／炭酸濃度を固定することにより、サンプ
ルは、ビーズ懸濁液へ加える前に、前希釈する必要があるかもしれない。ＥＬＩ
ＳＡアッセイの場合のように、患者サンプルの前希釈は検出抗原、患者サンプル
およびインジケーターシステムの間で平衡を確立するため、感度および特異性を
最適化させる。

【００１４】本発明は、蛍光標識された抗体、抗原、酵素基質または他の化学化合物のよう
なインジケーター物質の使用にも関し、これらは適切なインキュベート期間、例
えば約１５〜３０分間のインキュベート期間後に加えうる。最終停止溶液および
バックグラウンドエリミネーターを調製するためにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）も加
えてよいが、必須ではない。好ましくは、十分量のＰＢＳがフローサイトメータ
ーによる分析を最適化するために加えられるべきである。それにもかかわらず、
ビーズ、抗原、インジケーター試薬の相対濃度は、ＰＢＳの添加なしに、使用前
に最適化されるべきである。

【００１５】蛍光および散乱光電子増倍管（ＰＭＴ）電圧も、標準または陰性染色サンプル
と共にインキュベートされたビーズを利用することにより、本発明に従い最適化
してよい。これらの電子検出器は、ビーズおよびそれらの蛍光性により生じるア
ナログシグナルをデジタル表示に変換する。フローサイトメーターの最適化とは
、１）サイズまたは蛍光グラフですべてのビーズを表示し、２）定量のために用
いられる蛍光グラフを陰性または“標準”コントロール（例えば、無または低シ
グナル）で調整することを意味する。蛍光チャンネルのアライメントには、一定
の平均チャンネル値をおそらく設定しうる標準化蛍光物質（ビーズ）の使用も含
めてよい。これで日常機器（結果）のバラツキを解消しうるであろう。

【００１６】

【発明の具体的な説明】

本発明は、同一の希釈および反応容器を用いて、いくつかの抗体、抗原または
他のリガンドの検出を行えるため、アッセイを簡素化して、その時間も減らせる
、ビーズベースフローサイトメトリーアッセイに関する。ビーズベースアッセイ
は、試験操作中にアッセイの洗浄が不要となる（または減少する）ようにアッセ
イを進行させる手法で作られる。フローサイトメーターによる分析向けのアッセ
イを行う上で単一反応容器および最少ステップの使用は、標的物質向けにより効
率的で正確な試験をもたらす。

【００１７】１つの具体的態様では、下記の抗原がビーズへ付着され、各抗原は好ましくは
異なるサイズおよび／または色のビーズへ付着される：ＲｎＰ／Ｓｍ；Ｓｍ抗原
；ＳＳ‐Ａ；ＳＳ‐Ｂ；Ｓｃｌ‐７０；ｄｓＤＮＡ

【００１８】ビーズは抗原以外の他成分へ付着させてもよく、その例は次の通りである：ヒ
ストン；脂質；ウイルス抗体；ウイルス抗原；細菌抗体；細菌抗原；組換えタン
パク質；細胞抗原；他の化学物質。

【００１９】上記の具体的抗原は対応抗体の検出向けアッセイのためにこの態様で選択され
たが、本発明がこのような抗体の検出に制限されないことは明らかであり、した
がって上記のリストは代表的だが排他的ではない例である。更に、本発明は抗原
の使用に制限されず、ビーズベースフローサイトメトリーで用いうるいかなるリ
ガンド（抗体／抗原）でもよい。更に、検出システムは蛍光ビーズおよび／また
は二次蛍光インジケーターおよび／または異なるサイズのビーズを組み合わせて
もよい。

【００２０】本発明では抗原が付着される様々なビーズも要し、下記のリストは様々なサイ
ズのビーズの好ましい選択と、アッセイでよく機能することがわかったサイズお
よび異なる含浸色の組合せについて記載している；これらのビーズは次のとおり
である：３μラテックスビーズ；４μラテックスビーズ；５μラテックスビーズ
；６μラテックスビーズ；７μラテックスビーズ；８μラテックスビーズ；１０
μラテックスビーズ。

【００２１】上記のビーズは、それらサイズの違い、互いのサイズの広がり、および、各ビ
ーズ群内におけるそれらのサイズ均一性に基づき、単一操作でマルチアッセイを
行える実用群をもたらす、本発明の一態様として選択された。サイズなどで異な
る組合せも用いうる。このように、本発明が単一試験で多種の標的物質を検出し
うるビーズベースアッセイを提供することは明らかであろう。ビーズアッセイで
は多種のビーズのミックスを用い、各々が抗原、抗体などに付着されているため
、アッセイは一度に抗体、抗原などについて各々同時に試験しうる。

【００２２】したがって、ビーズベースアッセイを調製して、ビーズベースアッセイを含む
キットを製造するための方法により、キットの最終ユーザーが本発明の“無洗浄
”操作を行えるのである。この明細書で、“無洗浄”という用語は広義に解釈さ
れ、結果をより迅速かつ正確に得る上で少ないステップ、特に洗浄ステップ、で
済む操作で標的物質の存在について試験しうる、ビーズベースキットの最終ユー
ザーの能力を表わす。

【００２３】本発明のアッセイおよびキットの調製にはいくつかのステップを伴い、下記の
ように、操作および試験向けにある試薬の調製を初めに要する。

【００２４】試薬３種の試薬が、下記のように、本発明のビーズベースアッセイおよびキットの
調製に際して、好ましくは必要とされる。第一の試薬は、一態様において、無菌水１Ｌをメスフラスコに入れ、炭酸ナト
リウム３ｇおよび重炭酸ナトリウム１．６ｇを水のフラスコへ加えることにより
調製される、炭酸緩衝液からなる。諸成分をよく混合し、約９〜１０、好ましく
は約９．６のｐＨを有する、ｐＨ９．６±０．１の好ましい範囲内にある炭酸緩
衝液を作る。上記のように調製された炭酸緩衝液は、２〜８℃の温度で約１週間
貯蔵してもよい。

【００２５】本発明の“無洗浄”操作で要求される第二の試薬は、好ましくは塩水中におけ
る、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または関連タンパク質である。好
ましくは、試薬組成物は塩水中０．５％ＢＳＡからなるが、有効変動もこの濃度
で用いてよい（０．１〜５％）。本発明において、好ましい態様ではこの混合液
１００ｍｌを要する。試薬は、ＢＳＡ１ｇを慎重に秤量し、それを無菌１００ｍ
ｌボトルへ加えることにより調製する。次いで、無菌生理塩水１００ｍｌが加え
られ、ＢＳＡが完全に塩水に溶解するまでＢＳＡ１ｇと混合される。こうして調
製された試薬は冷蔵庫で貯蔵してもよく、６月間以内の貯蔵期間を有する。用いられる更に別の試薬は上記と同様であるが、その希釈液は、ビーズが抗原
でコートされた後でそれらを洗浄するために用いられる炭酸緩衝液である。

【００２６】 “無洗浄”プロセスで調製される第三の試薬は、例えば、ヤギ抗ヒトＩｇ、Ｆ
（ａｂ′）^２−ＦＩＴＣまたは被検体と適合する他のインジケーター物質、また
は試験される標的物質である。この試薬は本発明の一態様において１：２０比で
調製される。試薬は無菌１００ｍｌボトルへ０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）９５ｍｌを加えることにより調製される。無菌ピペットを用いて、ニートま
たは未希釈ヤギ抗ヒトＩｇ５ｍｌがそのボトルへ加えられ、均一に分布するまで
諸成分が混合される。混合液を含有したボトルは好ましくはアルミニウムホイル
でラップするか、光から防護された琥珀色ボトルで貯蔵するが、冷蔵庫で貯蔵し
てもよい。混合液は６月間以内の貯蔵期間を有する。

【００２７】第三の試薬は、試験される標的物質を同定する目的で、アッセイ調製段階とは
違う試験段階で用いられ、今度はビーズへ付着される。第三の試薬は、特定の標
的物質を同定して、その存在が検出されるように、具体的に選択される。

【００２８】他の蛍光複合抗体、抗原なども本発明の範囲内で用いてよく、これらの抗体お
よび／または抗原は開発に際してアッセイと免疫学的に依存してもよい。

【００２９】 “無洗浄”操作を有して、ビーズベース製品の有効性を保証するように、試験
向けビーズベースアッセイを調製するに際して、至適有効性のためには、冷蔵庫
に貯蔵された試薬はできるだけ光から防護または遮蔽されて、冷蔵庫から繰り返
しの試薬取出しは避けることが好ましい。好ましい態様において、複合体はその
ままで凍結貯蔵される。更に、冷蔵された成分はそれらの有効性のためにベスト
に保存され、２回以上の凍結サイクルは排除または回避される。加えて、貯蔵は
好ましくは無菌条件下にすべきである。

【００３０】ビーズを抗原でコートするための操作ビーズを抗原でコートしてから、品質コントロールステップを行うための操作
が、以下で更に詳細に記載されている。ビーズを抗原でコートするための操作は
公認ＧＭＰ施設（ＦＤＡにより公認された研究所であるGood Manufacturing Pra
ctice）で行うことが、もちろん好ましい。更に、特に記載されていないが、当
業者により通常知られている標準取扱い操作（ＳＯＰ）も、アッセイおよびそれ
らの調製方法の完全性を保証するために、すべての品質コントロール技術につい
て、好ましくは適切なものにすべきである。

【００３１】下記ビーズのコーティングは抽出性核抗原（ＥＮＡ）によるものでもよいが、
アッセイおよびその調製操作は、他の抗原またはリガンド、通常、例えば、抗ウ
イルス抗体を検出するためのウイルス組換えタンパク質とのコーティングに関し
ても等しく有効であることが、また理解されるであろう。

【００３２】好ましい形態において、ビーズベースアッセイは伝統的または慣用的ロット量
を用いて前選択量で製造される。したがって、望ましいロット量を製造するため
に必要な抗原、ビーズおよび複合体の量を決めることがまず重要である。これは
各成分で様々な濃度を用いた数回の前製造滴定実験で行われる。これは“ブロッ
ク滴定”として知られている。緩衝液１ｍｌ当たりで推奨されるビーズ量が下記
表Ｉで示されており、そこでは濃度が既に決められている。炭酸緩衝液による様
々な最終希釈で、すべてのロット成分を最適化する。

【００３３】表Ｉビーズサイズ(μ) 固形分％Ｃ．Ｖ．量(μＬ)/ｍｌ試験３０．０５１．２％２５０Ｓｃｌ‐７０４０．３５１．０％１００ＲｎＰ／Ｓｍ５０．３０１．２％２００Ｓｍ６０．３０１．２％３００ＳＳ‐Ａ７０．２９１．３％７００ＳＳ‐Ｂ８０．２８１．２％８００ｄｓＤＮＡ

【００３４】上記表では、直径が３〜８ミクロンにわたる６種のビーズサイズが用意されて
いる。特定抗原でコートされるものとして、特定サイズのビーズが表で示されて
いる。即ち、サイズ３ミクロンのビーズは抗原Ｓｃｌ‐７０でコートされ、サイ
ズ４ミクロンのビーズは抗原ＲｎＰ／Ｓｍでコートされる、等である。“試験”
の項目では、特定のビーズサイズへコートされる抗原が示されている。

【００３５】固形分（％）という項目のデータは、１００ｍｌ当たりの溶液中ラテックスビ
ーズのｇ重量を表わしている。“Ｃ．Ｖ．”の項目では、ビーズサイズの変動係
数が示されている。すべてが１．０％〜１．３％の範囲で変動係数を有している
。Ｃ．Ｖ．が低下するほど、特定のビーズサイズ内でビーズのサイズ変動が少な
くなるが（上記表の欄１参照）、逆も当てはまるであろう。

【００３６】最後に、“量”の項目では、ｍｌ当たりのビーズ濃度μＬが示されている。表
示されたビーズ濃度は、好ましくかつ重要であるが、それにもかかわらず状況に
応じて変えてよい。しかしながら、上記のビーズ濃度であれば、更に以下で記載
されているように、改善されたできるだけ正確な結果をもたらすアッセイおよび
操作を促すことがわかった。

【００３７】最適量の抗原、ビーズおよび複合体が、所要量、および上記表Ｉに含まれた情
報に基づき決められたら、好ましくは冷蔵庫で貯蔵されたビーズがそこから取り
出されて、使用前に室温へ平衡化される。“最良”濃度とは、凝集およびバック
グラウンド蛍光を最少に抑えながら、最高の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生じるも
のであることに留意されたい。

【００３８】製造プロセスでは、抗原でコートされた各ビーズが調製される容器が用意され
る。好ましい態様において、各々が２５０ｍｌ容量を有する容器６個が存在し、
それらは好ましくは平底遠心容器である。容器６個の各々が、上記表Ｉの“試験
”項目における抗原６種、即ちＲｎＰ／Ｓｍ、Ｓｍ、ＳＳ‐Ａ、ＳＳ‐Ｂ、Ｓｃ
ｌ‐７０およびｄｓＤＮＡのうち、１つで適切にラベリングされる。次いで、既
定量の抗原が適切にラベリングした各容器に入れられる。

【００３９】次に、前記“試薬”項目の記載に従い調製されるような緩衝液は、どの最終容
量の所望ビーズについても１ｍｌの量で遠心容器に加えられる。ビーズの最終希
釈率はビーズ固形分の初期濃度に応じて変わる。

【００４０】他の“緩衝液対ビーズ”濃度も利用してよい。用いられる実際の濃度は、試験
の具体的パラメーターにより決められる。しかしながら、円錐形ボトルを有する
遠心容器は、遠心操作中にビーズの凝集を増す可能性があることに留意すべきで
ある。したがって、この凝集を減少または解消するために、好ましくは平底容器
が用いられるべきである。更に、容量も新たな各ロットのビーズ、抗原、複合体
または緩衝液に応じて変えてよい。

【００４１】本発明の好ましい態様において、貯蔵溶液内における、界面活性剤の量、また
は凝集を防ぐためにビーズ製造業者により用いられる化学安定剤の量は、初期（
貯蔵）ビーズで５％を超えるべきでない。単一のビーズ分布を維持または促進し
ながら、製造業者の元で貯蔵される化学物質である界面活性剤について、増量は
洗浄を難しくする。ひいては、これはビーズを抗原でコートすることを難しくす
る。したがって、本発明では、ビーズへの抗原または他の物質の適正な付着を保
証するために、界面活性力の程度が許容限度または限界内で保たれることを好ま
しくは要する。こうすれば、低または無洗浄操作を行えるように、実際の試験条
件下におけるビーズシステムの使用を最終的に促せる。

【００４２】ビーズサイズの変動は様々なサイズのビーズのロット間で生じうることに留意
することが重要である。したがって、抗原によるビーズのコーティング前に変動
が許容限界内にあるように、ロットの精度を調べることも必要である。更に、各
ビーズロットはコーティング前に２回洗浄して、フローサイトメーターでランし
、変動係数について許容度を調べるべきである。

【００４３】この点では、サイズ特定のビーズが各々の試験容器に加えられる。各試験容器
に加えられるビーズの量は、前記のように、所要の容量およびそのうちの緩衝液
の量に依存する。

【００４４】例：ＲｎＰ／Ｓｍコーティングビーズの望ましい最終キット容量が２４ｍｌである
か、または約２４０回の試験に必要な量であるならば、製造時点のビーズ１ｍｌ
が１６ｍｌのキットビーズに相当する。したがって、望まれるビーズ２４ｍｌを
キットビーズ１６ｍｌで割ると、製造時点の製品１．５ｍｌが必要なことを示し
ている。そこで前記表Ｉを参照すると、緩衝液１．５ｍｌ＋４μビーズ１５０μ
Ｌが、ＲｎＰ／Ｓｍ‐４μ抗原‐ビーズ複合体の試験サンプルを調製するために
必要とされることに留意すべきである。

【００４５】同様の計算を用いれば、いかなるサイズ特定ビーズの量も計算でき、上記式に
従い、既に前記されたように、残り５種のビーズは５種の異なる抗原および緩衝
液を含有した残り５種の試験容器に加えられる。

【００４６】次いで、ビーズの均一懸濁液が得られるまで各容器を攪拌し、その後で所望最
終濃度のビーズを得るために必要な適量の抗原を解凍する。各ビーズ懸濁液を慎
重に遠心し、最終上澄を取出す。ビーズペレットが均一に分布するまで、それを
攪拌する。抗原をビーズペレットへ直接適用し、攪拌し、次いで計算された未希
釈容量で再懸濁し、インキュベートする。下記表IIは未希釈ビーズ緩衝液１ｍｌ
当たりにおける抗原の推奨量を示している。

【００４７】表 II 抗原量単位(μＬ)/ｍｌビーズＳｃｌ‐７０５０ＲｎＰ／Ｓｍ４０ＳＳ‐Ａ４０ＳＳ‐Ｂ４０ｄｓＤＮＡ１０ＳＭ２０

【００４８】例：この例では、前記のＲｎＰ／Ｓｍビーズが用いられて、製造ビーズ１．５ｍｌ
が調製される、とします。この場合に、表IIは、１ｍｌのビーズ毎に４０単位（
μＬ）の抗原がビーズ／緩衝液懸濁物へ加えられることを示している。したがっ
て、全ビーズ／緩衝液容量１．５ｍｌのとき、４０×１．５＝６０単位（μＬ）
の抗原が溶液へ加えられることになる。

【００４９】抗原の量がロット毎にやや変わりうることに留意することは重要である。した
がって、新しいすべてのロットを滴定することが勧められる。たとえ−８０℃で
凍結されても、特にＲｎＰ／Ｓｍ抗原は２年後に不安定になりやすく、いかなる
場合にもアッセイの結果の継続的完全性を保証するためには、貯蔵時間は慎重に
モニターおよびコントロールされるべきである。これらのファクターをモニター
およびコントロールすることに失敗すると、コートされた抗体がもはやビーズ上
の抗原を認識しえなくなることがあるため、抗原性を不都合な方向に変えうる。

【００５０】遠心プロセスを行う際には、円錐形遠心管をできうるかぎり避けることも重要
であり、その理由は、濃縮効果がこれら管の底で再度ビーズ凝集を引き起こし、
これらが最終的にダブレットとしてフローサイトメーターでみられ、そのためビ
ーズ２個以上の同サイズ形成マトリックスとして見誤り、原ビーズサイズの２×
、４×などに外見上みられることがあるからである。そのため、前記のようにい
つでも平底の管または容器が好ましい。

【００５１】遠心プロセスの終了時に、ビーズを遠心機から取出し、上澄を慎重にデカント
または吸引する。このときビーズを捨てないように注意が払われるべきである。
次いでビーズを攪拌することにより再懸濁させるが、これは必要なだけ、好まし
くはすべての物質がもはや“ペレット”形でなくなるまで続ける（“ペレット”
とは遠心により形成されたビーズの濃縮層として規定される）。

【００５２】この時点で、更に緩衝液を各ビーズ容器へ加えるが、加えられる緩衝液の容量
は、緩衝液へ加えられるビーズの量の計算に関して前記されたように、好ましく
は、加えられる初期計算量と等しくするべきである。例えば、前例のＲｎＰ／Ｓ
ｍでは、１．５ｍｌの緩衝液に再懸濁することが必要である。

【００５３】このとき、抗原ビーズコーティングプロセスの調製に際しては、冷却遠心機に
て１４００ｇで１０分間にわたる遠心を繰返し、次いで遠心機からビーズを取出
し、慎重に上澄をデカントまたは吸引する。更に、すべてのビーズ物質がもはや
“ペレット”形でなくなるまで、ビーズを再び攪拌することにより再懸濁させる
。

【００５４】前洗浄が界面活性剤を除去して、アッセイおよびフローサイトメトリー操作に
際してビーズの凝集を妨げる上で役立つことから、これら様々な前洗浄ステップ
は本発明にとり非常に重要かつ重大である。

【００５５】前洗浄の終了時、所定容量の緩衝液を加える前に、特定量の抗原を洗浄ビーズ
の各々へ直接加える。ビーズへ直接抗原を加えることも、均一なコーティングを
保証する。タンパク質の結合は受動系で数分内に生じる。混合物を攪拌し、特定
量の緩衝液を前記のように各容器へ加える。穏やかな攪拌を更に行う。最初に少
量の緩衝液でビーズを濃縮させておくと、ビーズ表面で抗原の均等な分布を行え
る。

【００５６】適量の抗原がビーズへ加えられたら、ビーズ懸濁液を数分〜数時間にわたり２
〜８℃でインキュベートする。インキュベート後、それらを冷却遠心機にて約１
４００ｇで約１０分間にわたり遠心する。遠心機の冷却によりもたらされる冷た
さは、ビーズの凝集を妨げる上で役立ち、それらが室温で生じるほど有意には凝
集しない。

【００５７】次いで、生成物を４℃で約１２〜１８時間インキュベートした後、ビーズ／抗
原溶液を穏やかに再懸濁する。このとき、ビーズ懸濁液を遠心し、ビーズを取出
し、上澄をデカントまたは吸引することにより、更に洗浄が好ましくは行われる
。ほとんどのビーズ懸濁液（ｄｓＤＮＡを除く）は、非特異的結合部位を除去す
るために、炭酸緩衝液中０．５％ＢＳＡで追加洗浄を要する。遠心およびデカン
トを続ける。

【００５８】次いで、このときに要する最終キット容量まで緩衝液を加える。前記例では、
最終キット容量が製造時点の容量の１６倍である。例えば、原製造時点のインキ
ュベート容量は１．５ｍｌであり、最終容量は１：１６希釈の場合で１．５×１
６ｍｌとなるため、２４ｍｌの緩衝液が加えられることを要する。最終容量はキ
ットのタイプ、ビーズの初期濃度、製造時のロス、およびアッセイチューブにお
けるビーズの総数に応じて変わる。

【００５９】次いで、均一に再懸濁されるまで容量全体を混合することにより試験混合物を
処理し、各ビーズ／抗原懸濁液を適切なボトルへ詰めて、キットを形成または作
製する。キットは、例えば、１００回分試験キットで５ｍｌに分けて、１：２０
希釈の複合体を含有してもよい。加えて、ビーズ成分は別々に詰めて、後で最終
ユーザーにより一緒にさせてもよい。ビーズ成分は、その代わりに、１本のバイ
アル中に全ビーズの混合物またはスラリーとして詰めてもよい。陽性および陰性
コントロールもキットへ加えて、パッケージを完成させてもよい。同様に、サン
プル希釈液（アジド含有炭酸緩衝液中０．５％ＢＳＡ）も含有させてよい。キッ
トパッケージは下記のように品質コントロール試験に付される。

【００６０】品質コントロール好ましくは、ビーズ製品が許容レベルの品質を有することを保証するために行
われる品質コントロールステップが、以下で記載されている。１．得られた新たな抗原ロットは−８０℃で貯蔵されねばならない。２．抗原±１０単位（μＬ）の全新ロットが現ロットから滴定されるべきであ
る。３．得られたすべての余分な抗原は−８０℃で分割して貯蔵すべきである。４．ＲｎＰ／Ｓｍ抗原は、抗原性変化のせいで、−８０℃で２年以上も貯蔵す
べきではない。５．すべての新ビーズロットは、使用前にＣ．Ｖ．を確認するために、フロー
サイトメーターで試験ランしなければならない。６．Ｃ．Ｖ．パーセントは、このようなビーズの供給または製造業者から受領
した精度検定書の±０．５％の範囲内であることを保証するために、調べるべき
である。７．最も重要なことだが、ビーズは０．５％以下の界面活性剤を有するように
製造されるべきであり、そうでなければ抗原コーティングが生じない。この低い
界面活性剤レベルは、抗原がビーズへ確実に付着する上で特に勧められる（ビー
ズおよび抗原は受動的吸着で互いに付着していることに留意すべきである）。８．未希釈複合体またはインジケーター試薬は、好ましくは暗所下−８０℃で
、使用準備できるまで貯蔵される。９．単一特異性ヒトまたは組換え生成物のプールから作製された陽性コントロ
ールの全新ロットは、現力価の±１希釈で滴定されることが好ましい。この点で
は、単一特異性“ゴールド”標準が対照物質として利用されるべきである。これ
らの標準は、所定の陽性度で行えることが、ＣＤＣまたはＮＩＨのようなグルー
プにより保証されている。１０．複合体力価の結果は、前値の±１希釈内に入らねばならない。１１．好ましくは、アッセイの個別ビーズの目標値は、約５．０％以下のＣ．
Ｖ．であることを証明すべきである。分離は前方（サイズ）散乱ヒストグラムで
明白かつ明瞭でなければならない。１２．重要なことに、前記の炭酸緩衝液は、調製から約１週間以内に用いられ
ないかぎり、新ロットの各ビーズで新たにすべきである。１３．緩衝液のｐＨは、好ましくは９．６で、±０．１の範囲内であることを
保証するために、調べなければならない。１４．分析で使用前に凝集を示したいかなるビーズ製品も廃棄すべきであり、
その理由はこのようなビーズ製品がアッセイで至適効果に満たないからである。

【００６１】特定の抗原がビーズへコートされうることは、上記の詳細な説明から明らかと
なるであろう。しかしながら、前記のように、上記例で示された抗原は代表例に
すぎず、他の抗原、抗体、酵素、ウイルス、リガンドまたは他の化学物質もフロ
ーサイトメーターアッセイでビーズと共に標的組成物の検出に用いてよい。

【００６２】ここで記載された“無洗浄”技術操作はすべてのビーズアッセイで用いうるた
め、適量の各サイズビーズおよび試薬が１本のチューブへ同時に入れられ、イン
キュベートされ、次いである種の蛍光インジケーターが加えられる。

【００６３】緩衝液中で、前記で提示された様々なビーズ濃度であれば、ビーズがそれらの
均一性を維持して、凝集およびダブレットの発生を防ぎうる。換言すると、ビー
ズ複合体はフローサイトメーターで分析上独特な群を構成し続ける。更に、抗原
はビーズの表面へカップリングされても、互いに交差反応しないため、ダブリン
グを防止する。交差反応の不在または最少化は、緩衝液の好ましいｐＨはもちろ
んのこと、抗原自体の性質によるかもしれない。更に、比較的少ないバックグラ
ウンドで済む。

【００６４】ｐＨ緩衝液の選択はビーズ‐抗原アッセイを作製する上で重要であることが強
調される。特定濃度、好ましくは５％以下の界面活性剤も強調されるため、ビー
ズを懸濁させると同時に、固形ビーズ混合物も懸濁させる上で、十分なコーティ
ングをビーズは有している。ほとんどのビーズが確かに界面活性剤を有して、こ
れが５％を超えるとき、ビーズは有効な洗浄およびコーティングを妨げる。もち
ろん、界面活性剤は抗原によるビーズのコーティング前に事実上洗い落とされる
が、界面活性剤を除去するために有効な洗浄ステップにより界面活性剤の過剰な
存在が一層難しくなることは明らかであろう。

【００６５】本発明で重要な操作の１つは、界面活性剤が洗い落とされると、抗原がビーズ
へ直接加えられることである。抗原は互いにカップリングさせても、またはビー
ズへ化学的に付着させてもよい。そこで、１ｍｌのビーズ溶液が用意されたら、
それはビーズをペレットに圧縮するため迅速にかつ高速で遠心され、そのとき上
澄が除去され、ビーズペレットが再懸濁されて、抗原がビーズペレットへ直接加
えられる。次いで攪拌するが、これはビーズ上への等しいコーティングを促し、
抗原をビーズ上へ受動的に吸着させて、そこに残留させる。抗原がビーズの懸濁
液へ加えられる他の方法は、厳しすぎる化学的または機械的プロセスのせいで、
コーティングを均一化するとは認められていない。前記の具体的操作は、抗原が
表面上に形成されたビーズが長期間にわたり確実に安定となるように、コーティ
ングおよびアフターコーティング操作を微調整する上で重要な発展を表わしてい
る。

【００６６】製品の安定性は、記載されたように、緩衝液中でそれを貯蔵することにより得
られる。炭酸緩衝液は、抗原をビーズへ結合させる適正な力として必要なｐＨを
もたらすが、それらは吸着または静電気のいずれでもよい。更に、ビーズが特定
の抗原でコートされたら、そのビーズを再び安定化させて、抗原の平衡を維持す
るような緩衝液中に、それを入れる。製品化したら、反応バイアル（例えば、試
験管、微量滴定プレートなど）中へ抗原コートビーズを加え、既定量のサンプル
（例えば、血清、全血など）を加えて、インキュベートする。ビーズサンプル複
合体を洗浄せずに、蛍光インジケーターを加え、再びインキュベートする。この
とき、サンプルはフローサイトメーターで分析しうるようになる。

【００６７】本発明は前記された詳細な内容および方法そのものに限定されない。本発明の
範囲内で変更しうる。一部の変更例は次のとおりである。キット：ウイルス／細菌抗体または抗原が
付着される；蛍光色素で含浸されたビーズおよび異なるサイズ、ビーズ上の様々
な抗原の定量操作；（患者サンプルおよび試薬を保存して、コストを下げるため
に）分析が行われた後で無洗浄システムへビーズを追加しうる；１本のチューブ
で１種、２種またはそれ以上のビーズ組合せを用いたビーズのモジュール化；異
なるタイプのアッセイを組合せて適合させること（例えば、抗体検出と抗原検出
）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】緩衝液からなる第一の試薬を調製し；タンパク質からなる第二の試薬を調製し；ビーズを緩衝液で洗浄してビーズ‐緩衝液マトリックスを形成し、ビーズの界
面活性力を有効量まで減少させることを含めて、５％未満の変動係数を有する前
選択サイズのビーズを調製し；ビーズの界面活性力はそれへの抗原の付着を促すのであるが、抗原がビーズへ
付着してビーズ‐抗原混合物を形成するように、標的種の存在を検出するための
抗原をビーズ‐緩衝液マトリックスへ加え；ビーズ‐抗原混合物へ緩衝液を加え、次いでその混合物をインキュベートし；
および第二の試薬をビーズ‐抗原混合物へ加えて、非特異的結合部位を減少または除
去する；ことを含んでなる、無洗浄ビーズベースアッセイの作製方法。
【請求項２】第一の試薬が炭酸緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】炭酸緩衝液が、９．０〜１０．０の範囲内でｐＨを有する、請求項２に記載の
方法。
【請求項４】炭酸緩衝液が９．６のｐＨを有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】第二の試薬がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】ＢＳＡが塩水中０．１〜５．０％ＢＳＡからなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】ＢＳＡが塩水中０．５％ＢＳＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】ビーズのサイズが、３μラテックスビーズ、４μラテックスビーズ、５μラテ
ックスビーズ、６μラテックスビーズ、７μラテックスビーズ、８μラテックス
ビーズ、９μラテックスビーズおよび１０μラテックスビーズからなる群のうち
１以上から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】ビーズが、５％を超えない変動係数を有するように選択される、請求項８に記
載の方法。
【請求項１０】ビーズが、１．３％を超えない変動係数を有するように選択される、請求項９
に記載の方法。
【請求項１１】マルチサイズのビーズが選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】加えられる抗原が、ＲＮＰ／ＳＭ、ＳＭ、ＳＳ‐Ａ、ＳＳ‐Ｂ、ＳＣＬ‐７０
およびｄｓＤＮＡからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】抗原が、ヒストン、脂質、ウイルス抗体、ウイルス抗原、細菌抗体、細菌抗原
、組換えタンパク質および細胞抗原からなる群のうち１以上から選択される、請
求項１に記載の方法。
【請求項１４】ビーズの界面活性力が、ビーズを抗原でコートしうる能力を高めるために、５
％以下まで減少される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】界面活性力がビーズの０．５％以下である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】ビーズベースアッセイが平底容器中で調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】ビーズ‐緩衝液マトリックスが少くとも１回の前洗浄ステップに付される、請
求項１に記載の方法。
【請求項１８】ビーズ‐緩衝液マトリックスおよびビーズ‐抗原混合物を遠心し、それを再懸
濁させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】ビーズ‐緩衝液マトリックスおよびビーズ‐抗原混合物を攪拌し、それを再懸
濁させるステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】標的物質の存在について試験するビーズベースアッセイを行うための無洗浄キ
ットの製造方法であって、緩衝液からなる第一の試薬を調製し；タンパク質からなる第二の試薬を調製し；第三の試薬は標的物質を同定しうるその能力について選択されるのであるが、
インジケーター抗体からなる第三の試薬を調製し；ビーズを緩衝液で洗浄してビーズ‐緩衝液マトリックスを形成し、ビーズの界
面活性力を有効量まで減少させることを含めて、５％未満の変動係数を有する前
選択サイズのビーズを調製し；ビーズの界面活性力はそれへの抗原の付着を促すのであるが、抗原がビーズへ
付着してビーズ‐抗原混合物を形成するように、標的物質の存在を検出するため
の抗原をビーズ‐緩衝液マトリックスへ加え；ビーズ‐抗原混合物へ緩衝液を加え、次いでその混合物をインキュベートし；第二の試薬をビーズ‐抗原混合物へ加えて、非特異的結合部位を減少または除
去し；アッセイ試験操作で使用向けの第一の容器にビーズ‐抗原混合物を入れ；およ
び試験操作で使用向けの第二の容器に第三の試薬を入れるが、標的物質を同定す
る目的のビーズへ標的物質が付着した後で、第三の試薬が用いられる；ことを含んでなる、上記製造方法。
【請求項２１】第三の試薬がヤギ抗ヒトＩｇからなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】多種の異なる抗原が異なるサイズのビーズへ各々付着されている、多種のビー
ズ‐抗原混合物を含んでなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】ビーズサイズが、次の３μラテックスビーズ、４μラテックスビーズ、５μラ
テックスビーズ、６μラテックスビーズ、７μラテックスビーズ、８μラテック
スビーズ、９μラテックスビーズおよび１０μラテックスビーズから選択される
、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】１種以上の抗原が、ＲＮＰ／ＳＭ、ＳＭ、ＳＳ‐Ａ、ＳＳ‐Ｂ、ＳＣＬ‐７０
およびｄｓＤＮＡからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】標的物質の存在について試験するビーズベースアッセイを行うための無洗浄キ
ットであって、該キットが請求項１に記載された方法に従い作製されたビーズベースアッセイ
からなり、検出アッセイ試薬がインジケーター抗体からなり、検出アッセイ試薬
が標的物質を同定しうるその能力について選択される、上記無洗浄キット。
【請求項２６】標的物質の存在について試験するための無洗浄ビーズベースアッセイであって
、該アッセイが請求項１に記載された方法に従い作製されている、上記無洗浄ビ
ーズベースアッセイ。