JPH11503825A

JPH11503825A - 感染または病原性の阻害に有用な化合物のスクリーニング法

Info

Publication number: JPH11503825A
Application number: JP8529623A
Authority: JP
Inventors: フレデリックエム．アウスベル; ローレンスジー．ラーム; マン−ワータン; ギャリービー．ラブクン
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-27
Publication date: 1999-03-30
Also published as: EP0828520A4; EP0828520A1; WO1996030053A1; US6461854B1; CA2215836A1

Abstract

(57)【要約】感染または病原性の阻害に有用な化合物を同定するためのスクリーニング方法が開示される。また、病原体毒性因子を同定するための方法も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】感染または病原性の阻害に有用な化合物のスクリーニング法発明の背景本発明は、真核宿主生物における感染症もしくは疾患を阻害する化合物を同定する、または宿主病原体防御機構を誘導もしくは刺激するスクリーニング法に関する。本発明はまた、該化合物の抗病原体剤としての利用にも関する。さらに、本発明は、病原体毒性因子(pathogenic virulence factor)を同定する方法にも関する。細菌、プロトゾア、真菌、線虫、およびウイルスなどの病原微生物には、動植物に感染することが可能な、大きく多様な生物群が含まれる。感染生物が病原性で、宿主が病原体の進入を受けやすい状態である場合、感染が開始する。宿主の感受性のある細胞または組織と十分に接触した後、病原体はその宿主から栄養を得るため、自身の生存が容易となる。感染プロセスの間に、病原体は、分子学的、生化学的、および生理学的プロセスのカスケードを活性化させ、その結果、宿主に有害な物質を放出し、疾患を進行させる（例えば、Scientific American Me dicine，フリーマンら(W.H.Freeman and Co.)，CA，San Francisco，1995；アグリオス(Agrios，G.N.)，Plant Pathology，Academic Press，1988)。微生物の病原作用は様々な方法で起こる。病原体の中には、分泌物を介して作用するものがある。例えば、ジフテリアは、桿菌であるジフテリア菌(Corynebacterium diptheriae)によって引き起こされる。この生物は宿主に吸入され、上気道で感染症を確立する。細菌自身が血流に侵入しなくとも、その強力な毒素は血流に入る。その後、これらの毒素が生物の細胞に吸収され、酵素機能が損なわれ、宿主細胞が破壊される。その他の疾患は、病原体に対する生体反応の結果である。例えば、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)によって引き起こされる肺炎では、感染症は、肺の肺胞嚢への体液および細胞の流出を引き起こし、呼吸を妨げる。皮膚の真菌感染症もまた、そのような炎症反応の結果である。またその他の細菌は日和見病原体である。例えば、緑膿菌（Pseudomonas aeru ginosa)は、熱傷の患者および免疫不全患者またはそれ以外の免疫学的疾患を有する患者に感染する。緑膿菌感染症は、急性で、角膜潰瘍および中耳炎のように局所的になることもあるし、嚢胞性線維症患者の肺のように慢性となることもあるし、または血流侵入後に全身性となることもある。植物病原性疾患もまた、植物および植物産物に対して損傷を引き起こすため、問題となっている。植物病原体は、以下のような多くの方法によって植物に疾患を引き起こす：（1）宿主細胞の栄養を消費する；（2）毒素、酵素、または増殖制御因子によって宿主細胞代謝を阻害または遮断する；（3）クロロシスの誘発によって光合成に影響を及ぼす（例えば、葉緑体の崩壊によって）；および（4 ）導管組織の遮断および正常な生理学的過程の妨害。農作物、観賞植物、樹木、および潅木は、特に細菌、真菌、ウイルスおよび線虫によって引き起こされる疾患を起こしやすい。例えば、植物病原性細菌は、葉の斑点および胴枯れ病、腐敗病、立ち枯れ病、異常増殖、赤カビ病、腐爛病などの多くの疾患症状を発症させる。細菌疾患は、ジャガイモ、ニンジン、タマネギ、アヤメ、またはヒヤシンスなどの新鮮な貯蔵組織を有する野菜(および一部の鑑賞植物)に最も多く起こる。それらはまた、新鮮な果実を有する植物(キュウリ、カボチャ、ナス、またはトマト)と同様、葉の植物(キャベツ、セロリ、レタス、またはホウレン草など)にも起こる可能性がある。植物の細菌疾患は世界中で起こっており、栽培中に、輸送中に、および保存中に農作物に重度の損傷を引き起こす。植物病原性の作用機序は数多く、多様である。例えば、一つの植物病原細菌であるエルウィニア(Erwinia)は、傷口または接近可能な自然の開口部から植物に入り込むことによって、腐敗病および火傷病などの植物病を引き起こす。一度内部に入り込むと、細菌は植物の中心薄葉を破断する酵素を分泌し、結果的に組織を軟化させ、最終的に細胞の死をもたらす。シュードモナス属の特定の菌株のようなその他の細菌が、植物内の木質部を粉砕することによって、水の転位を妨害することがある。シュードモナス属は、根および茎の木質部に侵入し、一度内部に入ると、植物を破壊する酵素および毒素を分泌する。アグロバクテリウム(Agr obacterium)およびコリネバクテリウム(Corynebacterium)などの、さらに別の植物病原性細菌は、罹患組織での細胞***および細胞の肥大を刺激する。これは、一般に無定型の異常増殖、菌瘤、または根、茎もしくはその他の器官の腫瘍の発生(例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaci ens)によって引き起こされる根頭癌腫病)、または感染器官の増殖（例えば、アグロバクテリウム・リゾジェネス(Agrobacterium rhizogenes)によって引き起こされる毛状根)が起こる。抗病原菌剤の適切な選択、ならびに臨床的および農業的感染症の処置を成功させるには、原因となる菌を速やかに同定することが必須である。しかし、医学および農業におけるスルフォンアミド、テトラサイクリン、アンピシリン、セファロスポリン、およびアミノグリコシドなどの抗病原菌剤の広範な使用は、耐性微生物種の選択には非常に好都合であった。これは、伝染性耐性プラスミドを含有する細菌株には特に当てはまる。例えば、セラチア属(Serratia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アシネトバクター属(Acinet obacter)、エンテロバクター属(Enterobacter)、および連鎖球菌属(Streptococc us)の高度耐性株による院内感染の集団発生は、重篤かつ再発性のある疾患となりつつある。耐性株選択の結果、緑膿菌(P.aeruginosa)が、過去数十年にわたって院内感染の10％〜20％を引き起こしている、重篤かつ問題となる臨床病原体であることが明らかにされた。現在、いくつかのアミノグリコシドおよび第三世代セファロスポリンは、緑膿菌に対して有効であるが、緑膿菌が耐性を獲得するのは比較的容易であるため、代替物となる可能性を有する新規化合物または代替療法を探索する必要がある。発明の概要本発明者らは、動物および植物宿主の双方の感染症および病原性には、共通の病原体毒性因子が関係することを発見した。そのような宿主依存型毒性因子が同定されたことにより、動物または植物宿主のいずれかまたはその双方における病原性の阻害に有用な治療薬の評価および同定を目的とする改良スクリーニング法を設計することが容易となった。さらに、本発明者らの発見により、多様な新規毒性因子の同定に有用なスクリーニング法の基本原理が提供される。そのような毒性因子の同定により、抗病原菌剤として用いられる標的試薬の開発も容易となる。したがって、最初の面において、本発明は一般的に真核宿主生物において病原体を阻害することが可能な化合物を同定する方法を特徴とする。本方法は、（a ）少なくとも１つの生物が非齧歯類である、少なくとも２つの異なる真核宿主生物を(連続して、または同時に)、少なくとも１つの候補化合物の存在下で単一の病原体に曝露すること；および（b）真核宿主生物のそれぞれにおいて病原体を阻害する化合物を同定することを含む。好ましい態様において、病原体は細菌(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)であり；真核宿主細胞は、脊椎動物(例えば、非齧歯類)および植物、脊椎および無脊椎動物；または無脊椎動物および植物である。好ましくは無脊椎動物は、線虫(例えば、セノルハブディティス属(Caenorhabditis)の一種)であり、植物はアブラナ(例えば、アラビドプシス属(Arabidopsis)の一種)である。別の好ましい態様において、真核宿主生物のそれぞれは、植物；脊椎動物；または無脊椎動物である。第二の面において、本発明は、一般に、非齧歯類真核宿主生物において病原体を阻害することが可能な化合物を同定する方法を特徴とする。本方法は、（a）非齧歯類真核宿主生物を、少なくとも１つの候補化合物の存在下で単一の病原体に曝露こと；および（b）真核宿主生物において病原体を阻害する化合物を同定することを含む。一つの好ましい態様において、病原体は細菌(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)であり、非齧歯類真核宿主生物は、線虫(例えば、セノルハブディティス属の一種)であり、植物はアブラナ(例えば、アラビドプシス属の一種)である。第二の好ましい態様において、病原体は、細菌(緑膿菌UCBPP-PA14)であり、非齧歯類真核宿主生物は、植物(例えば、アラビドプシス属の一種)である。第三の面において、本発明は一般に、病原体毒性因子の同定法を特徴とする。本発明は、（a）少なくとも１つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核宿主生物に感染することが可能な病原体を同定すること；（b）病原体の変異体を作製すること；（c）各生物を(連続して、または同時に)変異病原体に曝露すること；（d）変異病原体が、各生物に疾患を引き起こすことが可能か否かを判定し、野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較して、両生物に疾患の減少があれば、それを病原体毒性因子の変異の指標とすること；および（e）病原体毒性因子を同定するためのマーカーとして変異を用いることを含む。第四の面において、本発明は一般に、病原体毒性因子を変異させる方法を特徴とする。本方法は、（a）少なくとも一つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核宿主生物に感染することが可能な病原体を同定すること；（b）病原体の変異体を作製すること；（c）各生物を(連続してまたは同時に)変異病原体に曝露すること；（d）変異病原体が、各生物に疾患を引き起こすことが可能か否かを判定し、野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較して、両生物に疾患の減少があれば、それを病原体毒性因子の変異の指標とすることを含む。第五の面において、本発明は一般に、病原体の毒性を低下させる方法を特徴とする。本方法は、（a）少なくとも一つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核宿主生物に感染することが可能な病原体を同定すること；（b）病原体の変異体を作製すること；（c）各生物を(連続してまたは同時に)変異病原体に曝露すること；（d）変異病原体が、各生物に疾患を引き起こすことが可能か否かを判定し、野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較して、両生物に疾患の減少があれば、それを病原体毒性因子の変異の指標とすることを含む。「病原体の阻害」とは、真核宿主生物における病原体媒介疾患または感染症の発症または進行を減少、抑制、減弱、縮小、または停止させる候補化合物の能力を意味する。好ましくはそのような阻害は、適当な病原性解析(例えば、本明細書に記載の解析法)において、候補化合物の非存在下での症状と比較して、病原性を少なくとも５％、より好ましくは少なくとも25％、最も好ましくは少なくとも50％減少させる。一つの特定の例では、阻害は、試験化合物または抽出物に曝露した宿主生物の病原性症状をモニターすることによって測定され、化合物に曝露していない宿主生物での病原性症状レベルと比較して、症状レベルが減少すれば、それを病原体の化合物介在阻害の指標とする。「非齧歯類」とは、マウス、ラット、モルモット、またはハムスターではないあらゆる生物を意味する。「病原体毒性因子」とは、それがなければ病原体が真核宿主生物に疾患または感染症を引き起こすことができない細胞成分(例えば、転写因子などの蛋白)を意味する。本発明は、微生物病原体に対する化合物の有効性を識別し、評価するために用いる、広範な種類の標準的なスクリーニング法に優る待望の利点を提供する。例えば、本明細書に記載のスクリーニング法は、単純なインビボスクリーニングにおける抗病原体能と共に、宿主毒性の同時評価を可能にする。さらに、本発明の方法により、化合物の微生物病原性阻害能力を評価することが可能になり、同時に、病原体の攻撃に対する宿主の反応を刺激および強化する化合物の能力を評価することが可能になる。したがって、本発明の方法は、真核宿主生物において安全に用いられ(すなわち、生物の正常な発達および生理には負の影響を及ぼさない)、しかも病原性微生物に対して有効な(すなわち、病原体の毒性を抑制する)化合物を同定する容易な手段を提供する。さらに、本発明の方法は、大量処理、高感度、および低複雑性で、抗病原体作用に関して、いかなる数の化合物も実質的に分析する経路を提供する。本方法はまた、実施が比較的安価で、精製または粗抽出物のいずれかに認められる少量の活性物質の分析を可能にする。さらに、本明細書に開示の方法は、真核細胞膜を通過することが可能な、インビボ投与法において治療の有効性を維持する抗病原体化合物を同定する手段を提供する。本発明のその他の特徴および利点は、好ましい態様に関する以下の記述および請求の範囲からも明白となると思われる。詳細な説明まず図面を説明する。図面図１は、アラビドプシス葉(生態型ラゴステラ(Llagostera(L1))に、シュードモナス・シリンジ(Pseudomonas syringae)および緑膿菌(Pseudomonas aeruginos a)が引き起こす症状を示す写真である。偽接種(左)；シュードモナス・シリンジ pv.マキュリコーラ(Pseudomonas syringae pv.maculicola)株 ES4326(中央)；緑膿菌株UCBPP-PA14(右)。図２A〜Dは、アラビドプシス葉におけるシュードモナス・シリンジおよび緑膿菌の増殖を示すグラフである。図２Aは、生態型ラゴステラにおけるシュードモナス・シリンジpv.マキュリコーラ(maculicola)株 ES4326(白四角)、緑膿菌株UC BPP-PA14（白丸）、および緑膿菌株UCBPP-PA29(白三角)の増殖を示すグラフである。図２Bは、３つのアラビドプシス生態型における緑膿菌株UCBPP-PA14の増殖を示すグラフである：コロンビア(Columbia)(黒四角)；アルケンタート(Argenta t)(黒丸)；およびベンシャイム(Bensheim)(黒三角)。図２Cは、緑膿菌株UCBPP-P A14(黒丸)および同系のplcS(白四角)、およびtoxA(白菱形)変異株の増殖を示すグラフである。図２Dは、生態系ラゴステラにおける緑膿菌株UCBPP-PA14(黒丸) 、同系gacA(白菱形)、およびdegP(白四角)変異株の増殖を示すグラフである。アラビドプシス葉における細菌数は、本明細書に記載のように実施した。４サンプルの平均値±SDを示す。独立した３回の実験は同様の結果が示された。植物のインキュベーション条件は、下記の表Iに示す実験と同一であった。図３は、野生型緑膿菌株UCBPP-PA14上および同系のdepP変異株上で増殖するセノルハブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)の死亡率の比較を示すグラフである。図４は、野生型緑膿菌株UCBPP-PA14上および同系のgacA変異株上で増殖するセノルハブディティス・エレガンスの死亡率の比較を示すグラフである。本発明者らは、細菌性病原体が植物、動物および線虫のいずれにおいても疾患を引き起こすことが可能であること、ならびに植物、動物、および線虫において病原微生物疾患を引き起こす原因となる毒性因子には共通性があることを示す実験的証拠を以下に記述する。これらの実施例は、例示を目的とするものであり、本発明の請求の範囲を制限するものではない。植物および動物における緑膿菌病原性に必要な共通の毒性因子の同定多宿主毒性因子を同定するため、本発明者らはまず、植物および動物の双方の病原性モデルに疾患を発現できる細菌病原体を探索した。アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)葉病原性浸潤系を用いて、多様な緑膿菌単離株をスクリーニングした。次に、マウス全層性皮層熱傷モデルおよび線虫飼育アッセイにおいて、アラビドプシスに疾患症状を発現した単離菌の病原性を試験した。特に、本発明者らはまず、ヒト臨床単離菌30例、土壌単離菌20例、および植物単離菌25例(カリフォルニア大学バークレー校植物病理学科から入手)を含む緑膿菌収集物をスクリーニングした。これらの単離菌のそれぞれを、異なる４つのアラビドプシス生態型(在来種または野生型獲得)の葉に別々に注射して、単離菌が植物病原体であるか否かを明らかにした。アラビドプシスの病原体を含む植物病原体は、典型的に高レベルの宿主品種または生態型特異性を示すため、いくつかのアラビドプシス生態型を解析して、適当な病原体を同定する可能性を増大させた。生態型特異性を示す緑膿菌は、真の植物病原体である可能性が(実験室で作られた人工環境に限って植物を感染させることができる人工的病原体より)高いため、多宿主解析も実施した。アラビドプシス葉病原性浸潤系を用いたスクリーニング実験は、以下のように実施した。緑膿菌株を37℃でルリアブロス(Luria Broth)(LB)培地で増殖させ、1 0 mM MgSO₄で２回洗浄し、吸光度600[OD₆₀₀]＝0.2で10 mM MgSO₄に再懸濁し、10 0倍希釈して(細菌濃度10³cfu/cm²に対応)、６週齢のアラビドプシス植物の葉に注射した。一連の実験を通して、植物を28〜30℃および相対湿度90〜100％で増殖チャンバー内に維持した。疾患症状および生育を５日間毎日モニターした。注射５日後に発現した症状の特徴は以下の通りであった：「なし」症状なし；「弱」注射部位周辺組織の局所的な弱い吸水およびクロロシス（黄化）；「中等度」接種部位周辺組織の大部分が軟化した中等度の吸水およびクロロシス；または「重度」注射後２〜３日目の吸水反応域および注射部位周囲のクロロシスを特徴とする接種葉全体の重度腐敗病。腐敗病症状は、注射後４〜５日目には葉全体に広がった。細菌を含有する葉細胞間液を５日目に採取して、常法(例えば、ドング( Dong)ら、(1991)Plant Cell 3:61参照)に従って細菌数を計数した。１サンプル当たり２枚の葉ディスクを用いて、異なる４つのサンプルを得た。３つの独立した実験から同様の結果が得られた。10 mM HgSO₄を接種した対照植物は、実験期間を通じて症状を示さなかった。別の対照実験では、遺伝的に特徴解析がなされた緑膿菌株PAK、PAO1、またはPO37のいずれも、調べたアラビドプシス生態型のいずれに対しても認識可能な症状を引き起こさなかった。これらの株は、試験した生態型では非病原性であるが、培養系では病原性であることが判明した。スクリーニングした緑膿菌株75株の大部分が、アラビドプシス葉において症状を引き起こさなかったが、いくつかの株は注射部位周辺組織のクロロシスと吸水を特徴とする弱から中等度の腐敗病症状を示した。２つの株、UCBPP-PA14(ヒト臨床単離菌)およびUCBPP-PA29(植物単離菌)は、調べた生態型のいくつかに高度毒性植物細菌病原体の典型である重度腐敗病症状を引き起こした。表Iは、異なるアラビドプシス生態型における、注射後５日目での緑膿菌株UCBPP-PA14および UCBPP-PA29の増殖、ならびにこれらの緑膿菌株によって発現した疾患症状を示す。特に、株UCBPP-PA14は、ラゴステラ(L1)およびコロンビア(Col)アラビドプシス生態型のいずれにおいても、重度の腐敗病を引き起こしたが、生態型アルケンタート(Argentat:Ag)では症状を引き起こさず、生態型ベンシャイム(Bensheim:B e)では中等度の症状のみを示した。表Iはまた、株UCBPP-PA29がL1に重度の症状を起こし、Colでは症状は弱いが、AgまたはBeでは症状を起こさなかったことも示している。図１に示すように、UCBPP-PA14(一番右)によって引き起こされた重度の症状は、吸水反応域およびクロロシスを特徴とし、感染後４〜５日目では葉の完全な軟化および崩壊が起こった(一番左の対照と比較して)。これらの症状は、高度に毒性のアラビドプシス病原体であるシュードモナス・シリンジpv.マキュリコーラ( Pseudomonas syringae pv.maculicola)株 ES4326(中央に示す)によって誘発された症状と本質的に識別できなかった。疾患症状の重症度が細菌の増殖と相関することを確認するため、上記のアラビドプシス葉において、各株UCBPP-PA14およびUCBPP-PA29の増殖を実験の間数日間にわたって測定した。図２Aに示すように、株UCBPP-PA14(白丸)およびUCBPP-PA2 9(白三角)は、生態型L1において５日間で約10⁷個/cm²葉面積の最高細菌濃度に達し、これは初回接種量の10⁴倍増加に相当した。L1におけるこれらの株の増殖プロフィールは、毒性のアラビドプシス病原体であるシュードモナス・シリンジpv .マキュリコーラ株 ES4326と類似していた(図２A、白四角)。株UCBPP-PA14も同様に生態型Colでは10⁴倍増殖した(図２B、黒四角；表I)。対照的に株UCBPP-PA14 は、Beおよびkg葉ではそれぞれ、わずか10³および10²倍の増加(図２B、それぞれ黒三角および黒丸；表I)、ならびに株UCBPP-PA29は生態型CoL、Ag、およびBeにおいてわずか10²〜６×10²倍の増加に過ぎなかった(表I)。それぞれの場合について、葉の細菌数の減少は、症状発症の重症度の低下を反映していた。したがって、これら各々の緑膿菌株は、生態型特異的方法によって疾患を引き起こす能力がその他の植物病原性細菌と同様であった。アラビドプシスに疾患症状を発現させることが判明したUCBPP-PA14およびUCBP P-PA29単離菌を次に、マウス全層性皮層熱傷アッセイで試験した。これは、腹部皮膚の外側領域に形成されたマウス体表面積の５％が関係する（スチーブンス(S tevens)ら、(1994)J.of Burn Care and Rehabil.15:232)。このモデルでは、損傷を受けた表皮および真皮は凝固壊死を受けるるが、その下にある腹直筋(RA)は損傷を受けない。感染しない場合、動物は全て生存する。この病原性アッセイを実行するため、緑膿菌接種物を熱傷の焼痂の中心の襞に皮内注射した。細菌は熱傷の傷で増殖し、その下にある正常なRA筋に侵入する株もある。非常に病原性の強い株は、血管にも浸潤する。24時間後に熱傷の下層、および隣接するRA筋に認められる細菌数は、局所浸潤性の定量的指標となり、死亡率は局所および全身性浸潤の双方を示す。マウス全層性皮層熱傷試験は以下のように実施した。体重25〜35 gの６週齢の雄性CD-1マウス(チャールス・リバー動物農場(Charles River Animal Farm))を以下の動物熱傷モデルの全ての実験に用いた(スチーブンスら、上記)。マウスに約５×10³個の細胞を注射した。細菌注射直後またはその他の試験で疑似損傷を受けた動物では、下層のRA筋からは生存細菌細胞は回収されなかった。死亡率試験では、熱傷直後、マウスに10²個の細胞を注射し、敗血症のため死亡したマウスを10日間毎日モニターした。（i）熱傷を負っているが注射しなかったマウスおよび（ii）加熱殺菌UCBPP-PA14を注射したマウスから成る対照群２群の死亡率は０％であった。表II(下記)に示すデータは、マウス全層性皮層熱傷モデルにおける緑膿菌株の増殖を示すものである。表IIは、UCBPP-PA14およびUCBPP-PA29が、十分に特徴解析がなされた緑膿菌ヒト単離株PO37、PAK、およびPAO1と同等に、増殖し、RA筋に浸潤することを示している。全ての株は、熱傷および感染部位の真下から採取したRA筋の生検において、1.8×10⁸〜3.6×10⁸cfu/g組織の範囲の力価に達した( 表II)。さらに、熱傷に隣接する部位から採取したRA筋の生検では、全ての株が、4.0×10⁷〜8.2×10⁷cfu/g組織の範囲の力価に達した。加えて、ルーチン組織学用に調製した組織サンプルにより、株UCBPP-PA14が株PO37と同程度筋肉に浸潤したことが明らかになった。上記のマウス全層性皮膚熱傷モデルにおいて死亡率試験を実施することによって、PO37とUCBPP-PA14株およびUCBPP-PA29株との毒性の比較も同様に評価した。株UCBPP-PA14、UCBPP-PA29、およびPO37による死亡率は、熱傷および感染後10日目までにそれぞれ、77％(17/22)、６％(1/16)、および22％(２/９)であった(表I II)。追加実験から、PAO1およびPAKがこのモデルではUCBPP-PA14より有意に低い死亡率を呈することが示された。次に、UCBPP-PA14株は、病原性転帰を定量できた植物および動物病原性モデルのいずれに対しても感染力を有し、これらのモデルにおける毒性のレベルが既知の植物および動物病原体と同等であったため、この株をさらなる試験のために選択した。特に、本発明者らは、UCBPP-PA14株において、両宿主において病原性に必要な共通の毒性決定因子があるか否かを判定しようと試みた。本発明者らの計画は、４つの異なる遺伝子に挿入変異を有するUCBPP-PA14変異株を産生するマーカー交換法を用いることで、これら４つの遺伝子の２つは、動物宿主における緑膿菌の毒性決定因子であることが知られており、一つは植物宿主における植物病原性細菌の毒性決定因子であることが知られており、そしてもう一つは動物宿主におけるいくつかの動物細菌性病原体の毒性決定因子であることが知られている。緑膿菌の２つの動物毒性遺伝子は、輸出蛋白であるフォスフォリパーゼCおよび外毒素AをコードするplcSおよびtoxAであった(オーマン(Ohman)ら、（1980）I nfect.Immum.,28:899；オストロフ(Ostroff)ら、（1987）J.Bacteriol.169:4597 )。外毒素AはG蛋白をリボシル化し、フォスフォリパーゼCは真核細胞のリン脂質を選択的に分解する(イグリュースキー(Iglewski)ら、（1975）Proc.Natl.Acad. Sci.72:2284;バーカ(Berka)ら、（1982）J.Bacteriol．152:239)。植物病原体毒性決定因子はgacAで、これは、非病原性土壌細菌である蛍光菌(P.fluorescens) において分泌された抗真菌因子の総合制御因子として同定された(ラビル(Lavill e)ら、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.89:1562；ガフネイ(Gaffney)ら、（1994）M ol.Plant-Microbe Interact.7:455)。植物病原菌P.シリンジpv.シリンジおよびP .シコリ(P.cichorii)では、gacAは病原性に関係する細胞外産物をコードする遺伝子の転写制御因子として作用すると考えられている(リッチ(Rich)ら、（1994 ）J.Bacteriol.176:7468)。その他の動物毒性決定因子、degP(htrAとしても知られる)は、ブルセラ属(Brucella)およびサルモネラ属(Salmonella)において、誤って折り畳まれた原形質周囲蛋白の分解に関与するストレス反応性プロテアーゼとして同定された(エルツァー(Elzer)ら、（1994）Infection and Immunity 62: 4135;Johnson(1991)ら、Mol.Microbiol.5:410)。 plcSおよびtoxAのUCBPP-PA14同族体は、緑膿菌株PAKのplcSおよびtoxA遺伝子に対応するクローンDNA断片をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、株UCBPP-PA14のゲノムコスミドライブラリーにおいて同定された。株UCBPP-PA14 のゲノムライブラリーは、pHC79からのバクテリオファージラムダcos部位を含む 1.6kbのbgIII断片(例えば、ホーン(Hohn)ら、（1980）Gene 11:291参照)をpRR54 のbgIII部位(例えば、ロバーツ(Roberts)ら、（1990）J.Bacteriol.172:6204参照)にライゲーションすることによって構築されるコスミドクローニングベクターpJSR1において常法に従って調製した。toxA遺伝子を含むプラスミドpMS150から単離した1.7 kbのBamH1断片(例えば、ロリー(Lory)ら、（1983）Gene 22:95参照)およびplcS遺伝子を含むプラスミドpSL2から単離した3.0 kbのBamH1-PstI断片( 例えば、ロリー(Lory)ら、（1988）J.Bacteriol.170:714参照)を、pJSR1におけるUCBPP-PA14ゲノムライブラリーのプローブとして用いた。 gacAのUCBPP-PA14同族体は、常法に従って、蛍光菌のgacA遺伝子の保存領域に対応するPCR-増幅産物を用いて同じコスミドライブラリーにおいて同定された。オリゴヌクレオチド5'-GCTAGTAGTCGATGACC-3'(配列番号：１)および5'-GCTGGCAT CAACCATGC-3'(配列番号：２)をgacA遺伝子の配列に基づいて設計し(ラビル(Lavi lle)ら、（1992）Proc.Natl.Acad.Sci.89:1562)、これを用いて蛍光菌のgacA遺伝子を含む625塩基対の産物を増幅し、次にこれを用いて上記のpJSR1におけるUC BPP-PA14ゲノムライブラリーのプローブとした。degP遺伝子のUCBPP-PA14同族体は、シュードモナス・シリンジpv.マキュリコーラ(P.syringae pv.maculicola) のdegP遺伝子をプローブとして用いて、UCBPP-PA14コスミドライブラリーにおいて同定された。４つの遺伝子は全てサブクローニングし、常法によりゲンタマイシン耐性をコードするカセットを挿入して変異遺伝子とした。さらに、UCBPP-PA14株のplcS遺伝子を含むコスミドクローンから単離した６ k bのBamHI断片を、pJSR1由来コスミドからpBR322のBamHI部位にサブクローニングした。得られたクローン、pLGR101はplcS遺伝子のXhoI部位にゲンタマイシンコードDNAカセットを挿入することによって変異遺伝子とし、pLGR201を構築した。ゲンタマイシン耐性遺伝子カセットは、プラスミドpH1JIからの1.8 kbのBamHI断片である(例えば、ルビン（Rubin）（1987）Plasmid 18,84参照)。toxA遺伝子を含む1.6 kbのBamHI断片は、pJSR1由来コスミドからpBR322にサブクローニングしてpLGR102を構築し、その後ゲンタマイシンカセットをtoxA遺伝子のBglII部位に導入して変異遺伝子とし、プラスミドpLGR202を構築した。そして緑膿菌株UCBPP -PA14のgacA遺伝子を含む2.5 kbのHindIII-EcoRI断片を、pJSR1由来コスミドからpBR322へとサブクローニングしてpLGR103を構築した。gacA推定遺伝子を部分的に配列決定して、UCBPP-PA14のgacAがクローニングされていることを確認した。pLGR103は、gacAのSalI部位にゲンタマイシンカセットを挿入することによって変異遺伝子とし、プラスミドpLGR203を構築した。degP遺伝子の一部を含む1.6 のPstI断片は、株UCBPP-PA14のコスミドクローンpH126の誘導体であるpPY201からpUC19 のPstI部位にサブクローニングしてpNASを構築した。ゲンタマイシンカセットを含む1.6 kbのSalI断片をpNASのdegP遺伝子のXhoI部位に挿入して、pNASGmを構築した。次に、3.2 kbのSphI/XhoI断片をpNASGmベクターから単離して、pCVD442の SphI/XhoI部位にサブクローニングして変異degP遺伝子を含むpPY206を構築した。標準的なマーカー交換技術を用いて、変異遺伝子をUCBPP-PA14ゲノムに移し、得られたマーカー交換変異の構造をDNAブロット分析によって確認した。このように、プラスミドpLGR201、pLGR202、pLGR203、およびpPY206を用いて、ラーム( Rahme)らが「J.Bacteriol.170:575(1991)」に記述している方法によってそれぞれ、plcS、toxA、gacA、およびdegP遺伝子の遺伝子交換を行い、二重交叉事象をスクリーニングする場合にはゲンタマイシン30 mg/mlを用い、ベクター損失をスクリーニングする場合にはカルベニシリン300 mg/mlを用いた。これら４つの変異のいずれも、栄養豊富培地、または最小培地のいずれにおいても、野生型と比較して細菌の増殖には検出可能な効果を示さなかった。 pleS、toxA、gacAおよびdegP変異がアラビドプシスモデルにおけるUCBPP-PA14 の病原性に及ぼす効果を、変異株をアラビドプシス生態型L1に浸潤させて試験した。野生型UCBPP-PA14とは異なり、変異株のいずれも葉の軟化および崩壊を起こさなかった。特に、同系toxA変異株は、UCBPP-PA14の特徴である罹患組織の軟化を伴うことなく、腐敗病およびクロロシス症状を減弱させた。plcS、gacAおよび degP変異株はさらに弱い症状を示し、クロロシスのみを引き起こした。症状の減弱と一致して、toxA、plcS、gacA、およびdegP変異株の５日後の増殖はそれぞれ、野生型の増殖と比べて約10倍、10²倍、５×10³倍、および10²倍少なかった(図 2Cおよび2D)。試験した３つの変異株(plcS、toxA、およびgacA)の増殖および症状は、これらの変異株をプラスミド上に保有する対応する野生型遺伝子で相補すると、植物の野生型レベルまで十分に回復する。これは、株UCBPP-PA14のplcSRオペロンを含むゲノムライブラリーのコスミドクローンpB85から、６ kbのBamHI断片をプラスミドpRR54のBamHI部位ヘサブクローニングし、pLGR301を構築することによって得られた。次に、プラスミドpLGR301を用いて、plcS変異株の遺伝子相補試験を行った。株PAKのtoxA遺伝子を含むプラスミドpHS150から単離した2.4 kbのEcoRI /EcoRV 断片を、プラスミドpBR322のEcoRI/EcoRV部位にサブクローニングしてpLGR106を構築した。pLGR106から、toxAを含むSphI/PStI断片をpRR54のSphI/PstI部位にクローニングして、pLGR206を構築した。gacA遺伝子を含む1.2 kbのHindIII/XhoI 断片をコスミドクローンpH106から単離して、プラスミドpRR54のHindIII/SalI部位にサブクローニングしてpLGR204を構築した。次にプラスミドpLGR206およびpL GR204を用いて、toxAおよびgacA変異株の遺伝子相補試験を行った。表IIIは、マウス全層性皮層熱傷モデルにおけるこれら３つの緑膿菌変異株に対応する死亡率試験を示す。そのような死亡率試験では、火傷をさせて、plcSまたはtoxA変異株のいずれかに感染させたマウスは、野生型株に感染させた場合(7 7％)と比較して、有意に低い死亡率を示した(両変異株について40％)。gacAおよびdegP変異株は死亡を起こさなかった(表III)。変異株と野生型との死亡率の差は、95％以上の信頼水準で統計学的に有意であった。死亡率データの統計学的有意性は、イェーツ修正を行ったカイ二乗検定を用いて決定した。群はP≦0.05で統計学的に有意と見なされた。全ての変異株が統計学的有意に達した（plcSおよびtoxA、P=0.05；gacA、P=0.00005)。上記の結果は、plcS、toxA、gacA、およびdegPが植物および動物病原性のいずれにも関与していることを示し、疾患発症に必要な病原体の機構の一部が、動物および植物宿主において共通または共有していることを示している。共有された毒性因子の一つ、gacAは、制御レベルで活性を示し、毒性因子の制御機構が植物および動物病原体において維持されることを示している。plcSおよびtoxA遺伝子産物はそれぞれ、植物および動物細胞において、おそらく膜を攻撃し、蛋白合成を阻害する特異的毒性決定因子である。これらの結果を第三の宿主系に広げるため、緑膿菌UCBPP-PA14の病原性を線虫飼育アッセイにおいて測定した。飼育アッセイは以下のように設定した。まず、緑膿菌UCBPP-PA14またはdegPもしくはgacA変異体を有する同系の緑膿菌株UCBPP- PA14の一晩培養液５ μlをNGM寒天プレートの中心に接種して、37℃で24時間培養した。室温で数時間冷却した後、プレートにセノルハビディティス・エレガンス L4-期線虫８匹を播種した。その後プレートを暗室内で25℃でインキュベートし、死亡した線虫を６時間毎に評価した。動きがなく、咽頭のポンプ行動を示さない場合、そして排便行動を示さない場合、線虫は死亡していると見なす。図３および４はそれぞれ、野生型UCBPP-PA14およびそのdegPおよびgacA同系変異株を用いた線虫飼育アッセイの結果を示す。図３および４に示した結果から、緑膿菌UCBPP-PA14によりC.エレガンス(C.elegans)が死亡することが示される。結果はまた、degPまたはgacA遺伝子のいずれかを機能的に無能にする挿入物を有する緑膿菌UCBPP-PA14の同系変異株は、線虫およびマウス全層性皮層熱傷アッセイのいずれにおいても毒性が有意に低下したことを示している(図３および４；表III)。gacA遺伝子は、植物宿主におけるP.シリンジの毒性決定因子であることが知られており、degPはP.シリンジおよびネズミチフス菌(Salmonella typhimur ium)の双方に対する毒性因子であることが知られている。後述するように、本発明者らはこれらのスクリーニング法を用いて、線虫およびアラビドプシスにおいて病原性の低下を示すいくつかの変異株を同定した。本発明者らが単離した変異株の３つは、マウスでは病原性が低いことが判明した。本明細書に記載する多宿主動物／植物病原体系は、いくつかの実用的な効果を有する。例えば、これらの結果は、病原性の分子的基礎が植物と動物では極めて類似していることを示している。このように、下に記すように、多宿主病原体系を新しい毒性因子の同定および試験に用いることができる。特に、異なる宿主生物において個々に変異した緑膿菌を試験することによって、例えば、本明細書に記載のアラビドプシスまたは線虫アッセイを用いて、緑膿菌の全ゲノムを病原性関連遺伝子についてスキャンすることができる。このようにして同定された遺伝子は次に、マウス全層性皮層熱傷モデルにおいて試験することができる。また、この系により、細菌性病原体の宿主特異性の分子的機序の解明が容易となる。このモデルシステムを用いて同定された毒性因子は、臨床的および農業的微生物疾患の双方に対する新しい世代の化学療法の開発のための標的を提供する。共通の毒性遺伝子を同定するためのスクリーニング系一連の緑膿菌毒性因子が異なる３つの宿主における病原性に関与し、これらの共通の毒性決定因子が、宿主非依存的な病原性細菌の基本的な特徴を明確に表すことを示す上記の結果に基づき、本発明者らは、植物および動物の病原性に重要な毒性決定因子の同定法を開発した。スクリーニングは、多宿主動物／植物病原体(例えば、緑膿菌UCBPP-PA14)を利用し、実質的にいかなる宿主生物においても、無作為に作製された何千もの微生物変異体を容易にスクリーニングする能力を活用する。有用な真核宿主生物は、線虫(例えば、セノルハブディティス・エレガンス)、植物(例えば、アラビドプシスの種子または葉)、酵母またはその他の真菌、魚(例えば、熱帯魚)、ハエ(例えば、ドロソフィア・メラノガスター(Dros ophia melanogaster))、マウス等であるが、これに限定されない。一般に、微生物病原体は、当技術分野に周知の標準的な方法によって変異させ、次に宿主生物に疾患を誘発する能力について評価する。病原性が減弱したことが判明した、または非病原性にされた変異病原体は、本発明の方法において有用である。次に、当技術分野に周知の方法に従って、そのような変異病原体を用いて、病原性に関与する宿主依存性または宿主非依存性毒性因子を同定する。以下は、異なる３つのモデル：マウス全層性皮層熱傷モデル、C.エレガンス線虫飼育モデル、およびアラビドプシス・サリアナ葉浸潤モデルにおいて感染力を有することが判明したヒト臨床単離菌である緑膿菌UCBPP-PA14を利用する毒性因子線虫スクリーニング系の実施例である。シュードモナス属のようなヒトまたは植物病原体を調べるために、線虫を宿主として用いることの利点は、線虫における非病原性シュードモナス変異株の同定が比較的単純であるためである。例えば、C.エレガンススクリーニングは、２匹のL4期線虫を緑膿菌変異株を播種した上に載せ、５日後の生存線虫を観察することから成る。緑膿菌UCBPP-PA14などの病原菌は、例えば、標準的なインビボまたはインビトロ挿入変異誘発法などの常法によって変異させる(例えば、クレックナー(Kleckner)ら、(1977)J.Mol.Biol.11 6:125参照)。その他の方法、例えば化学的変異誘発も利用可能である。５日目に、野生型の病原性細菌を播種したプレートでは、生存線虫は非常に少数であるかまたは認められなかったが、大腸菌もしくは非病原性変異株を播種したプレートでは、最初の２匹の両性個体線虫の何百または何千もの生存子孫が存在する。このように、変異緑膿菌の存在下で増殖する線虫は、病原性に関与する遺伝子が不活化されている指標となる。不活化された変異の位置をマップで示すと、変異毒性因子のクローニングおよび同定ができる(例えば、ヌクレオチド配列決定) 。病原性に関係する遺伝子を同定するため、本発明者らは、緑膿菌UCBPP-PA14の変異株をトランスポゾン変異誘発の標準技術に従って作製した(例えば、マノイル(Manoil)ら、（1985）Proc.Natl.Acad.Sci.82:8129；テイラー(Taylor)ら、（ 1989）J.Bacteriol.171:1870参照)；8000以上の変異株を作製した。次に、これらの変異株の1900の病原性を、上記のC.エレガンス飼育アッセイを用いて評価した。表IVに示すように、本発明者らは、C.エレガンスにおいて病原性の減弱を示した８個のUCBPP-PA14変異株を単離した。さらに、本発明者らはまた、トランスポゾン変異誘発性によって生じた変異株の別の収集物の病原性を常法を用いたレタス葉病原性アッセイにより調べた(例えば、チョー(Cho)ら、（1975）Phytopathology 65:425参照)。このアッセイを用いて、本発明者らはレタス葉において病原性の減弱を示したUCBPP-PA14変異株 2900個を単離した。次に、これらの変異株を、本明細書に記載の方法に従ってアラビドプシス葉病原性アッセイにおいて試験した。表IVに示すように、本発明者らはアラビドプシスにおいて病原性の減弱を示すUCBPP-PA14変異株12株を単離した。次に、アラビドプシス浸潤アッセイにおいて同定された１つのUCBPP-PA14変異株の病原性を、C.エレガンス飼育アッセイおよびマウス全層性皮層熱傷アッセイの双方において試験した。本発明者らは、野生型のUCBPP-PA14株と比べて、この UCBPP-PA14変異株が双方の系において病原性が弱いことを発見した。本発明者らはさらに、マウス全層性皮層熱傷アッセイにおける病原性に関して、アラビドプシスバイオアッセイで同定された２つの変異株についても試験した。これらの変異株もまた、野生型のUCBPP-PA14株と比較するとマウスでの病原性が弱いことが判明した。これらの結果と共に、植物および動物における病原性に関する共通の毒性因子の存在のさらなる証拠が提供される。上記の結果は、緑膿菌UCBPP-PA14とC.エレガンスの間に病原性相互作用が起こっていることを示している。UCBPP-PA14株は、C.エレガンスを死亡させる。UCBP P-PA14はまた、アラビドプシス・サリアナ葉浸潤アッセイ(図１および２；表Ｉ) およびマウス全層性皮層熱傷モデル(表IIおよびIII)においても感染力を有する。さらに、本発明者らは、UCBPP-PA14 degPおよびgacA遺伝子におけるゼロ変異が、３つの全てのモデルにおいて病原性を有意に減少させることを示した。このように、本発明者らは、植物および動物における病原性に関する共通の毒性因子の存在に対する最初の証拠を提供した。そのような毒性因子により、毒性因子機能を妨害する化合物の単離が可能となり(例えば、病原性の直接の減少、または宿主反応の増強を通じて)、また単純な実験系(例えば、セノルハビディティス) におけるこれらの化合物の同定が可能となる。治療薬または植物保護剤を同定するためのスクリーニング系先に論じたように、本発明者らの実験結果は、一連の緑膿菌毒性因子が異なる３つの宿主における病原性に関与し、これらの共通の毒性決定因子が宿主非依存的な細菌性病原性の基本的特徴を明確に表すことを示している。この発見に基づき、本発明者らは、動物(例えば、ヒト患者)または植物(例えば、市販の農作物) のいずれかに独立して感染することが可能な病原体の阻害に用いることができる治療化合物(例えば、抗病原性医薬品)を同定するスクリーニング法を間発した。一般に、本方法は、本明細書に記載の多宿主動物／植物病原体(例えば、緑膿菌U CBPP-PA14)系を用いることによって、治療的または農業的に活性な物質に関していかなる数の化合物もスクリーニングすることを含む。植物、マウス、および線虫における病原性には共通の毒性因子がある、という本発明者らの証明に基づき、線虫においてそのような毒性因子の機能を阻害する化合物により、哺乳類(例えば、ヒト患者)または植物における有効な治療剤も提供されることは、容易に理解されると思われる。医学または農業で現在用いられているほとんどの抗生物質は、殺菌性、または静菌性のいずれかであり、その結果有利な株または変異体がそれらに対して耐性を示すのに対し、本明細書に記載のスクリーニング法で同定された化合物(例えば、線虫システム)は、細菌を殺さないが、その代わりにそれらを非病原性にする。さらに、本発明のスクリーニング法は、インビボで実施されるため、同定された化合物が真核宿主生物に対して強い毒性を示す可能性は低い。したがって、本発明の方法によって、細菌、真菌、ウイルス、環系動物、線虫、扁形動物、およびプロトゾアによって引き起こされる疾患などの病原性疾患の治療を目的とする薬物および植物保護剤のような活性剤の評価、同定、および開発が容易になる。一般に、本発明のスクリーニング法により、さらに評価を行い、少数の活性のある選択的材料に凝縮されるべき大集団から、天然抽出物または興味ある化合物を選択するための容易な手段が提供される。次に、本発明の方法において、このプールの構成物を精製および評価して、抗病原性活性を明らかにする。以下に本発明者らは、抗病原菌剤としての化合物の有効性を評価するためのスクリーニング法を記述する。これらの実施例は、例示を目的とするものであり、本発明の請求の範囲を制限するものではない。試験抽出物および化合物一般に、新規抗病原体薬または植物保護剤は、当技術分野に周知の方法に従って、天然物もしくは合成(または半合成)抽出物双方を含む大きいライブラリー、または化学ライブラリーから同定される。医薬品の探索および開発分野の当業者は、試験抽出物または化合物の正確な供給源が、本発明のスクリーニング法にとって重要ではないことを理解すると思われる。したがって、本明細書に記載の方法を用いれば、実質的にいかなる数の化学抽出物または化合物もスクリーニングすることができる。そのような抽出物または化合物の例として、既存の化合物の修飾ならびに植物、真菌、真核生物、または動物に基づく抽出物、発酵ブロス、および合成化合物が含まれるが、これに限定されない。糖類、脂質、ペプチド、および核酸に基づく化合物を含むが、これに限定されないいかなる数の化学的化合物の任意のまたは指向的合成(例えば、半合成または全合成)を行うために、無数の方法もまた利用できる。合成化合物のライブラリーは、ブランドン・アソシエーツ（Brandon Associates）(Merrimack，NH)およびアルドリッチ・ケミカル（Aldrich Chemical）(Milwaukee，WI)から市販されている。または、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形での天然化合物のライブラリーは、バイオティックス（Biotics）(Sussex，UK)、ゼノバ（Xenova）(Slough，UK)、ハーバー・ブランチ・オーシャングラフィックス・インスティテュート（Harbor Branch Oc eangraphics Institute）(Ft.Pierce，FL)、およびファーママー(PharmaMar)U.S .A(Cambridge，MA)などの多くの販売元から市販されている。さらに、必要に応じて、天然および合成的に作製されたライブラリーを、当技術分野に周知の方法に従って、例えば、標準的な抽出および分画法によって作製する。さらに、必要に応じて、いかなるライブラリーまたは化合物も、標準的な化学的、物理的、または生化学的方法を用いて容易に修飾される。さらに、薬物探索および開発分野における当業者は、脱複製法(例えば、分類学的脱複製、生物学的脱複製、および化学的脱複製、もしくはそれらの組み合わせ)または、複製物の消失もしくはその抗病原体活性が既に知られている材料の反復法は、可能であれば常に用いるべきであることを容易に理解できると思われる。粗抽出物が抗病原体活性を有することが判明すれば、認められた効果に関与する化学構成物を単離するために、明確なリード抽出物のさらなる分画が必要である。このように、抽出、分画、および精製過程の目標は、抗病原菌活性を有する粗抽出物内の化学的実体の注意深い特徴解析および同定である。そのような不均一な抽出物の分画および精製法は当技術分野において既知である。必要に応じて、病原性の治療に有用な薬物であることが示されている化合物を、当技術分野に周知の方法に従って化学的に修飾する。病原体に対する抵抗性の促進、または病原体の阻害における分子または化合物の有効性を評価するために有用な大量処理システムの例を以下に述べる。これらの例は、本発明を説明するために提供するが、本発明はこれに限定されない。線虫バイオアッセイシステム効率の良い、系統立った方法において、大量の天然物、抽出物、または化合物のマススクリーニングを可能にするため、セノルハブディティス・エレガンス(C aenorhabditis elegans)L4両性個体幼虫をマイクロタイタープレートのウェル中で培養し、操作の半自動化およびデータ収集の完全自動化を容易にした。先に論じているように、本発明者らは、緑膿菌UCBPP-PA14がC.エレガンスに感染してこれを死亡させるが、変異毒性遺伝子を有する緑膿菌UCBPP-PA14は非病原性であることを発見した。病原体が減少すれば、病原性のL4線虫が生存し、成虫の両性個体となり、何千もの生存子孫を生じる。したがって、C.エレガンスを病原体とインキュベートすると、緑膿菌の病原性を減少させる化合物が存在しなければ、線虫は死亡する。そのような生存子孫の存在は、標準的な顕微鏡による肉眼的スクリーニングを含む、様々な方法を用いて容易に検出される。試験化合物または抽出物が、病原体に対する宿主抵抗性を促進する能力、または病原体の病原性を抑制する能力を評価するため、一晩培養した病原体、例えば緑膿菌UCBPP-PA14の適当量を播種したNGM寒天に、試験化合物または抽出物の適当量を接種した。必要に応じて、宿主および病原体の双方に効果を及ぼす用量を評価するために、様々な濃度の試験化合物または抽出物を接種することができる。対照ウェルには、非病原性細菌(陰性対照)または試験化合物もしくは抽出物の非存在下での病原体(陽性対照)を接種した。次に、病原体の増殖を促進するため、プレートを37℃で24時間インキュベートした。その後、マイクロタイターディッシュを25℃に冷却して、２匹のC.エレガンスL4両性個体幼虫をプレートに加え、C.エレガンスの正常な生理学的完全性が得られる上限である25℃でインキュベートした。適当な時間間隔、例えば４〜５日で、例えば、運動検出器を用いて線虫の動きをモニターすることによって、ウェル中の生存子孫を調べる。処置幼虫と対照幼虫との比較試験を用いて、病原体に対する宿主抵抗性の促進、または病原体の毒性の阻害における試験分子もしくは化合物の相対的有効性を調べる。病原体に対する宿主の抵抗性を有効に刺激する、高める(boost)、増強する、増加させる、もしくは促進するか、または病原体の病原性を阻害、不活化、抑制、抑圧、または調節し、しかも線虫の正常な生理学、生殖、もしくは発育に負の影響を及ぼさない試験化合物を、本発明において有用と見なす。植物バイオアッセイシステム効率の良い、系統立った方法において、大量の天然物、抽出物、または化合物のマススクリーニングを可能にするため、宿主植物(例えば、種子、実生苗、苗木、萌芽、成熟植物、または葉)を、マイクロタイタープレートのウェル中またはその他の適当な容器で培養し、操作の半自動化およびデータ収集の完全自動化を容易にした。このバイオアッセイに有用で適当な植物宿主の特定の例は、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、タバコ、アラビドプシス、大豆、トウモロコシ、小麦、ライ麦、米、大麦、またはその他の商業的または農業的に重要な植物であるが、これに限定されない。植物の栽培方法は当技術分野で周知である(例えば、ベジル(Vasil I.K.)Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants Ｉ、II、III巻、実験法とその応用(Laboratory Procedures and Their Applicatio ns)、Academic Press，New York，1984；ディクソン(Dixon R.A.)Plant Cell Cu lture - 実践的アプローチ(A Practical Approach)、IRL Press,Oxford Univers ity，1985参照)。上述しているように、本発明者らは、緑膿菌UCBPP-PA14がアラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)に感染してこれを死亡させるが、変異毒性遺伝子を有する緑膿菌UCBPP-PA14は非病原性であることを発見した。したがって、病原体の病原性が減少すれば、植物は症状を発症せず、または対照植物と比較して減弱された症状を呈すると考えられる。アラビドプシス・サリアナ植物を病原体と共にインキュベートすると、緑膿菌の病原性を減少させる化合物が存在しない場合、植物は死亡するか、多様な疾患症状（例えばクロロシスまたは腐敗病）を呈すると考えられる。そのような生存実生苗および関連疾患症状の存在は、肉眼的スクリーニングを含めた多様な方法を用いて容易に検出される。宿主(例えば、アラビドプシス・サリアナ)の病原体に対する抵抗性を促進する、または病原体の病原性を抑制する試験化合物または抽出物の能力を評価するため、試験化合物または抽出物を適当な用量で組織培養培地(例えば、固化寒天ベース培地)に接種する。さらに、必要に応じて、従来の手段、例えば、実生苗または苗木に試験化合物を含む溶液をスプレーすることができる手段によって、宿主植物を、候補植物保護剤または抗病原体化合物で前処置することができる。宿主植物は、標準的な病原性スクリーニング系、例えば、上記のアラビドプシスおよびレタス葉浸潤アッセイを用いて、または標準的な真空浸潤法によってアッセイする。例えば、常法に従って、宿主実生苗に病原体を真空浸潤させる。真空浸潤後、実生苗を当技術分野に周知の方法(例えば、アラビドプシスの栽培法は Meth ods in Arabidopsis Research、コンツ(Koncz C.)、チャ(Chua N.-H.)、シェル( Shell J.)著、World Scientific Publishing Co.,Pte.Ltd.,Singapore 1992に記載されている)によって栽培する。必要に応じて、宿主および病原体の双方に効果を及ぼす用量を評価するため、様々な濃度の試験化合物または抽出物を接種することができる。対照実生苗に、非病原性細菌(陰性対照)または試験化合物もしくは抽出物の非存在下で病原菌(陽性対照)を浸潤させる。適当な時間間隔、例えば、３〜５日で実生苗の疾患症状を調べる。処置実生苗と対照実生苗との比較試験を用いて、病原体に対する宿主抵抗性の促進、または病原体の毒性の阻害における試験分子または化合物の相対的有効性を判定する。病原体に対する宿主抵抗性を有効に刺激する、高める、増強させる、増加させる、もしくは促進する、または病原体の病原性を阻害、不活化、抑制、抑圧、もしくは調節し、しかも実生苗の正常な生理学、生殖、または生育に負の影響を及ぼさない試験化合物を、本発明において有用と見なす。利用本発明の方法により、病原性を阻害するかまたは生物の病原体に対する抵抗能を増強させることが可能な生物毒性因子および化合物を同定する単純な手段が提供される。したがって、本明細書に記載の方法を用いて医学的または農業的価値を有することが発見された化学的実体は、薬物、植物保護剤として、または例えば、合理的薬物設計によって既存の抗病原性化合物の構造的修飾に関する情報のいずれかとして有用である。そのような方法は、細菌、真菌、環系動物、線虫、扁形動物、およびプロトゾアを含むが、これに限定されない多様な病原体に対する作用を有する化合物のスクリーニングに有用である。病原性細菌の例として、アエロバクター属(Aerobacter)、アエロモナス属(Aeromonas)、アシネトバクター属(Acinetobacter)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、バチルス属( Bacillus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、バルトネラ属(Bartonella)、ボルテア属(Bortella)、ブルセラ属(Brucella)、カリマトバクテリウム属(Calymmato bacterium)、カンピロバクター属(Campylobacter)、シトロバクター属(Citrobac ter)、クロストリジウム属(Clostridium)、コリネバクテリウム属(Cornyebacter ium)、エンテロバクター属(Enterobacter)、大腸菌属(Eschericia)、フランシセラ属(Francisella)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、ハフニア属(Hafnia)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、クレブシエラ属(Klebsiella)、レジオネラ属(Leg ionella)、リステリア属(Listeria)、モルガネラ属(Morganella)、モラキセラ属 (Moraxella)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia )、シゲラ属(Shigella)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、連鎖球菌属(Streptoc occus)、トレポネーマ属(Treponema)、キサントモナス属(Xanthomonas)、ビブリオ属(Vibrio)、およびエルシニア属(Yersinia)が含まれるが、これに限定されない。治療的利用のため、本明細書に開示の方法を用いて同定された組成物または薬物を、例えば、生理食塩液などの薬学的に許容される緩衝液中に処方して全身投与してもよい。好ましい投与経路は、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、または患者に薬物の一定量を持続的に投与する皮内注射である。ヒト患者またはその他の動物の治療は、生理学的に許容される担体中の抗病原体剤の治療的有効量を用いて実施されうる。適当な担体およびその製剤は、例えば、E.W.マーチン (Martin)による「レミントンの製薬科学(Remington's Pharmaceutical Science) 」に記述されている。投与すべき抗病原体剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重、ならびに疾患のタイプおよび疾患の程度によって異なる。一般的に、特定の例では、化合物の特異性が増加したためにより少ない量で済む場合もあるが、量は、その他の微生物疾患の治療に用いられるその他の薬物について用いられる量の範囲内である。化合物は、微生物の増殖を阻害する用量を投与する。例えば、全身投与では、化合物は0.1 ng〜10 g/kg体重の範囲内で投与するのが典型的である。農業的利用において、本明細書に開示の方法を用いて同定された組成物または薬物を、植物の本葉上へのスプレーまたは粉末として適用する化学物質として用いてもよい。そのような薬物は感染を予防するために、病原体の前に植物表面に投与するのが典型的である。種子、球根、根、塊茎、および球茎もまた、それらが有する病原体、または植えられた場所の土壌中に存在する病原体を調節することによって、植えた後の病原体の攻撃を予防するために処置する。野菜、観賞植物、潅木、または木を植えた土壌もまた、多様な微生物病原体を調節するために、化学燻煙剤で処置することができる。処置は、植える数日または数週前に行うことが好ましい。化学物質は、例えば、トラクターのような機械的散布、または手による散布のいずれかによって適用することができる。さらに、解析方法を用いて同定された化学物質を、消毒剤として用いることができる。本明細書で言及した全ての出版物および特許は、各個々の出版物または特許が参照として組み入れられるよう特別にかつ個々に示されているものとする。先の記述から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、様々な利用および状態にそれを適合させるよう本発明に様々な変更および修正を加えることができる。したがってその他の態様も請求の範囲内である。寄託緑膿菌UCBPP-PA14株は、1995年３月22日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)に寄託され、ATCC寄託番号55664を有する。本出願人らは、これより発布された特許の期限満了までに株の生存性が失われた場合には、この株を交換する責務を承認しており、寄託物が公に利用できるようになる期日である本特許の発行日を、アメリカンタイプカルチャーコレクションに通知する責務を承認している。その期日までは、寄託株はCFR§1.14 および35 USC §112の下、特許庁長官により利用可能とされる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９６年１０月２８日【補正内容】６．病原体が細菌である、請求項１または５記載の方法。７．細菌が緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)UCBPP-PA14である、請求項６記載の方法。８．非齧歯類真核宿主生物が線虫である、請求項１または５記載の方法。９．線虫がセノルハブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)である、請求項８記載の方法。 10．非齧歯類真核生物がアラビドプシス(Arabidopsis)である、請求項１または５記載の方法。 11．以下を含む、病原体毒性因子を同定する方法： (a) ２つの齧歯類でもなく２つの植物でもない少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定； (b) 該病原体の変異株の作製； (c) 各々の該生物の、該変異病原体への曝露； (d) 該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性因子の変異が示される判定；および (e) 該病原体毒性因子を同定するためのマーカーとしての該変異体の利用。 12．以下を含む、病原体毒性因子を変異させる方法： (a) ２つの齧歯類でもなく２つの植物でもない少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定； (b) 該病原体の変異株の作製； (c) 各々の該生物の、該変異病原体への曝露； (d) 該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性因子の変異が示される、判定。 13．以下を含む、病原体の毒性を減少させる方法： (a) ２つの齧歯類でもなく２つの植物でもない少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定； (b) 該病原体の変異株の作製； (c) 各々の該生物の、該変異病原体への曝露； (d) 該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性の減少が示される、判定。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｑ 1/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者タンマン−ワーアメリカ合衆国マサチューセッツ州サマービルファイブモーガンストリートアパートメント＃２ (72)発明者ラブクンギャリービー. アメリカ合衆国マサチューセッツ州ケンブリッジレミントンストリート 14

Claims

【特許請求の範囲】１．真核生物において病原体を阻害することが可能な化合物を同定するための、以下を含む方法：（a）少なくとも一つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核生物を、少なくとも一つの候補化合物の存在下で単一の病原体に曝露すること；および（b）該真核生物のそれぞれにおいて該病原体を阻害する化合物を同定すること。２．真核生物が以下のいずれかを含む、請求項１記載の方法：（a）脊椎動物および植物；（b）脊椎動物および無脊椎動物；（c）植物および無脊椎動物；（d）異なる属の２つの脊椎動物；または（e）異なる属の２つの無脊椎動物。３．真核生物に異なる属の２つの植物が含まれる、請求項１記載の方法。４．脊椎動物が哺乳類である、請求項２記載の方法。５．非齧歯類真核宿主生物において病原体を阻害することが可能な化合物を同定するための、以下を含む方法：（a）非齧歯類真核宿主生物を少なくとも一つの候補化合物の存在下で単一の病原体に曝露すること；および（b）該真核宿主生物において病原体を阻害する化合物を同定すること。６．病原体が細菌である、請求項１または５記載の方法。７．細菌が緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）UCBPP-PA14である、請求項６記載の方法。８．非齧歯類真核宿主生物が線虫である、請求項１または５記載の方法。９．線虫がセノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）である、請求項８記載の方法。 10．非齧歯類真核生物がアラビドプシス（Arabidopsis）である、請求項１または５記載の方法。 11．以下を含む、病原体毒性因子を同定する方法：（a）少なくとも一つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定；（b）該病原体の変異株の作製；（c）各々の該生物の、該変異病原体への曝露；（d）該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性因子の変異が示される、判定；および（e）該病原体毒性因子を同定するためのマーカーとしての該変異体の利用。 12．以下を含む、病原体毒性因子を変異させる方法：（a）少なくとも一つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定；（b）該病原体の変異株の作製；（c）各々の該生物の、該変異病原体への曝露；および（d）該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性因子の変異が示される、判定。 13．以下を含む、病原体の毒性を減少させる方法：（a）少なくとも−つが非齧歯類である少なくとも２つの異なる真核生物に感染させることが可能な病原体の同定；（b）該病原体の変異株の作製；（c）各々の該生物の、該変異病原体への曝露；（d）該変異病原体が該生物の各々において疾患を引き起こすことが可能か否かについての判定であって、該野生型病原体によって引き起こされる疾患と比較した該生物の双方における疾患の減少により、該病原体毒性における減少が示される、判定。