JPH11503526A - コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするためのアフィニティークロマトグラフィー法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 生理学的に対応する条件下で対象となる生物学的物質に対する低分子量リガンドの親和性を測定するためのアッセイ法であって、対象となる生物学的物質を固相マトリックスに固定化し、リガンドを含む混合物とこれを接触させ、結合していないリガンドをマトリックスから除去し、リガンドをマトリックスから溶離し、カラム上でのそれらの保持の程度を参照して対象となる生物学的物質に対するそれらの親和性を確証することを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】 コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための アフィニティークロマトグラフィー法 本発明は、生理学的に対応する条件下で対象となる生物学的物質（ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に対する化合物の親和性を測定する方法 に関する。特に本発明は、化合物のライブラリー混合物の解析に関する。 Zuckerman et al（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,4505-4509）には、ゲル 濾過によりタンパク質抗体に対するペプチド系リガンドの特定のペプチドライブ ラリーからアフィニティー選択して、抗体とそれの選択されたリガンドとの複合 体の混合物を得る用途が記載されている。次いで別個の工程でリガンドを抗体か ら解離させ、続いて別個のＨＰＬＣ分析により同定したのち、質量分析およびア ミノ酸分析を行う。関連法においてSogyang et alのCell,1993,72,767-778には 、アフィニティークロマトグラフィーの固定相であるアガロース−グルタチオン に固定化したＧＳＴ−ＳＨ２融合タンパク質を用いて、ＳＨ２タンパク質に対す るリガンドを選択するアフィニティークロマトグラフィーの用途が記載されてい る。次いで選択されたリガンドを濃縮し、アミノ酸分析により分析する。 しかしこれらの方法は多数の欠点をもつ。たとえばそれらは別個の選択工程お よび同定工程を必要とすることによって制限される。標的として、同定済みの十 分に解明された生体内高分子を必要とする。それらの方法では、最も有用な、強 固に結合するリガンドの親和性がランク付けされない。アミノ酸分析も、標的と する生体内高分子に対する親和性をもつリガンドを同定する方法としては制限が ある。 本発明者らは、化合物の混合物のうち、標的とする対象となる生物学的物質に 対する親和性をもつものを選択および同定する万能法をここに開示する。 本発明は、ＤＮＡジャイレース酵素のフラグメントを高性能液体クロマトグラ フィーカラムの固定相に固定化して、ＤＮＡジャイレース酵素に対するノボビオ シン類似体の親和性をアッセイするために有効に使用できるという本発明者らの 知見に基づく。 したがって本発明の第１態様においては、対象となる生物学的物質に対する複 数の低分子量リガンドの親和性を測定するためのアッセイ法であって、対象とな る生物学的物質を固相マトリックスに固定化し、リガンドを含む混合物とこれを 接触させ、結合していないリガンドをすべてマトリックスから除去し、リガンド をマトリックスから溶離し、カラム上でのそれらの保持の程度を参照して対象と なる生物学的物質に対するそれらの親和性を確証することを含むアッセイ法を提 供する。 対象となる生物学的物質はペプチド高分子であってもよく、合成その他の方法 で修飾されたその変異体であってもよい。本発明方法の格別な利点は、選ばれた 高分子の本質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、構造および／または機能が本発明の性能に とって重要ではないことである。それは構造的にも機能的にも完全である必要は ない。種々のエピトープに対する種々のリガンドを同定するために、対象となる 生物学的物質を多様な様式で固相マトリックスに結合させうることは理解される であろう。 対象となる生物学的物質自体は、その特性（たとえば結合親和性）を模倣した い既知のリガンドに対するそれの親和性により、たとえばアフィニティークロマ トグラフィーにより単離されたかもしれない。それは比較的大きな高分子のフラ グメントであってもよく、それらのフラグメントはそれが由来する比較的大きな 高分子の生化学的機能を欠如してもよい。本発明の１具体例においては、対象と なる生物学的物質は酵素フラグメントである。 リガンドは、それに対して容易に抗体を形成しえない低分子量種である。その ような種類のものとして、それらは約２０００ダルトン未満の分子量をもつもの であってもよい。特にそれらは約１２００ダルトン未満の分子量をもつ。より具 体的には、リガンドは約１０００ダルトン未満、たとえば８００、６００、４０ ０または２００ダルトン未満の分子量をもつ。それらは所望により化学的に修飾 された天然産物の抽出物であってもよい。あるいはそれらは所望により代謝によ り修飾された合成産物の抽出物であってもよい。それらは、それに対して容易に 抗体を形成しえないペプチドの混合物、たとえばペプチドライブラリーであって もよい。一般に抗体は２０残基未満、たとえば１２残基未満、または７残基未満 のポリペプチドに対しては形成しえない。特に低分子量リガンドは有効な薬物候 補であり、すなわち混合物として、たとえばコンビナトリアルライブラリーとし て、または所望により精製した別個の単一化合物類から製造した混合物として製 造された、小さな分子の合成化合物である。混合物中には好都合ないかなる数の リガンドが存在してよく、たとえば最高５、１０、２０、３０、４０、５０、１ ００、２００、４００、１０００または最高１０，０００のリガンドが存在しう る。 以上から、低分子量リガンドはたとえば抗体と対応する抗原の場合のように対 象となる生物学的物質に対する特異的リガンドまたは相手ではないことが理解さ れるであろう。 本発明者らは、リガンドの必要量はリガンド測定および同定のための従来の方 法に必要な量よりかなり少ないことを見出した。さらに、通常の調製法および分 析法と比べて、リガンドを含有する混合物の調製および分析に必要な時間および 作業が少ない。 固相マトリックスは、それに対象となる生物学的物質を結合させたカラム、た とえばエポキシド系カラム（ｅｐｏｘｉｄｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｌｕｍｎ）であ ることが好都合である。リガンドを含有する混合物を任意の好都合な回数、たと えば１回、２回または３回、カラムに導通する。対象となる生物学的物質に親和 性を示すリガンド（１またはそれ以上）はカラムに保持され、これに対し無視し うるほどの親和性をもつリガンドは保持されずにカラムから洗浄除去される。特 に対象となる生物学的物質を、対象となる生物学的物質および固相の到達可能な 表面にある反応性側鎖を利用して固相に共有結合させる。好適な物質および方法 は、たとえばファルマシア・ファイン・ケミカルズ（Pharmacia Fine Chemicals ）社が刊行した“Affinity Chromatography,principles and methods”に述べら れている。固相を活性化して、エポキシドのような結合部位を付与するか、また は固相がカルボキシルのような反応性表面官能基を本来含んでもいてよい。対象 となる生物学的物質は普通は特定の結合部位に結合するのではなく、むしろ可能 性のある多数の選択部位のうちの１つに結合することは理解されるであろう。必 要であれば、対象となる生物学的物質を固相に結合させる間、リガンド結合部位 を 既知のリガンドで保護してもよい。あるいは固相マトリックスと対象となる生物 学的物質との界面として、特異的結合相互作用、たとえばビオチン／アビジンを 用いてもよい。 次いで、保持されたリガンドを溶離し、好ましくは以後の分析のために幾つか に分けて並べた画分として保存する。本発明方法の格別な利点は、リガンドを生 理学的に対応する条件下で（ｐＨ、温度、塩類濃度など、すべてヒトまたは動物 の体内でみられる条件）対象となる生物学的物質と接触させることである。リガ ンドと対象となる生物学的物質との間の相互作用に影響を与える可能性のある、 たとえば電流や電界の付与は行わない。このような付与はアフィニティーゲル電 気泳動の場合には行われていることである。 本発明の好ましい態様においては、保持されたリガンドを１またはそれ以上の 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）カラムにトラップする。これにより それらをさらに分析できる。好適なトラッピングカラムは当業者に自明であり、 Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカートリッジカラムがこれに含まれる。 本発明のより好ましい態様においては、保持されたリガンドを１またはそれ以 上のＨＰＬＣカラムから（必要によりバックフラッシング後に）、質量分析計、 たとえば電気スプレー式質量分析計（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｍａｓｓ ｓ ｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）中へ溶離する。 本発明の他の態様においては、対象となる生物学的物質を固定化したＨＰＬＣ カラムを提供する。本発明のさらに他の態様においては、その反応性カラムをア フィニティー選択法、および化合物ライブラリーの解析に使用することを特許請 求する。有利には、反復操作にもかかわらず固相マトリックスは対象となる生物 学的物質を保持し、一般にカラムに追加物質を添加する必要がないことが見出さ れた。 本発明方法は、対象となる生物学的物質に対する相対親和性を、単独でまたは 一連の化合物（リガンド）の混合物中においてランク付けするのに利用できる。 あるいは本発明方法は、対象となる生物学的物質に対する一連のリガンドの各々 の絶対親和性の尺度を得るために検量することができる。 このようなリガンドはそれ自体で、また関連リガンドの設計の出発点としても 有用である。 前記のように、対象となる生物学的物質自体は、その特性（たとえば結合親和 性）を模倣したい既知のリガンドに対するそれの親和性により、たとえばアフィ ニティークロマトグラフィーにより単離できる。 したがって本発明の他の態様においては、対象となる生物学的物質をまず既知 のリガンド（たとえば小さな分子の薬物）に対するそれの親和性により単離する 。これは、本発明方法で同定されたリガンドは既知リガンドの機能的類似体であ ることを意味する。本発明のこの態様に関しては、対象となる生物学的物質の本 質を知る必要はない。これは既知リガンドの機能的類似体を“プリント”する鋳 型として用いられる。そのような類似体は多様な化学構造のものであってよい。 これらのリガンドはすべて、生化学的道具、診断薬および分析試薬、特に医薬 および農薬としての用途をもつ。それらのリガンドは、たとえば有効な治療薬で あるか、またはそれらの薬剤の代謝産物である。これに関して、それらは低分子 量化合物および有効な治療薬であることが好ましい。それらはたとえば約１００ ０ダルトン未満、たとえば８００、６００または４００ダルトン未満のものであ る。 以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらは本発明を限定するもの ではない。実施例１ エポキシド系カラム（ハイドロポア（Ｈｔｄｒｏｐｏｒｅ）ＥＰ、１２ミクロ ン−レーニン、カタログｎｏ．８３−Ａ０３−ＧＴＩ）にジャイレースＢサブユ ニットの２４ｋＤ Ｎ−末端２〜２２０アミノ酸残基フラグメントの透析試料を 充填することにより、アフィニティーカラムを調製した。このサブユニット自体 はGilbertおよびMaxwell（E.J.Gilbert and A.Maxwell,Molecular Microbiology ,1994,12,365-374）の方法で、ノボビオシン−セファロース上でのアフィニティ ークロマトグラフィーにより調製された。カラムは１２時間放置したのち緩衝液 （０．１Ｍ混合リン酸カリウム、ｐＨ７）で洗浄され、ジャイレースアッセイで １ｕｇ／ｍＬから４００ｕｇ／ｍＬ以上の範囲のＩＣ５０値をもつノボビオシン （E.J.Gilbert and A.Maxwell、前掲）類似体を用いて試験することにより、こ のタンパク質に結合する化合物に対するアフィニティーカラムとして作用するこ とを示した。用いたジャイレースアッセイ法はGellert et al（Proc.Natl.Acad. Sci.USA,1976,73,3872-3876）に開示されているものと同様であった。 カラム上の保持の程度は酵素阻害の程度と等しいことが見出された。ノボビオ シンの約１／１０の酵素阻害力価をもつノボビオシンの１つの類似体は、空隙容 量より４〜１０カラム容量の間によって保持された。溶液中の対応するジャイレ ース２４ｋＤフラグメントに対するこの化合物の親和性は約１０⁷であると測定 され、ジャイレース阻害力価は１．６ｕｇ／ｍＬであった。 このようにこのカラムはアフィニティーカラムとして再現性のある挙動を示し 、かつこの挙動は無視しうる程度のジャイレース阻害活性を示す非結合性ノボビ オシン構造類似体が５０倍以上存在しても一定であることが示されたので、この カラムを用いて、それぞれ９種類の異なる置換トリアミノトリアジンを含む３つ のライブラリー混合物を調べた。液体クロマトグラフィー（ヒューレット・パッ カード１０５０、３０５ｎｍでＵＶ検出）を用いて、ＨＰＬＣトレースのテイリ ングにより、３つのライブラリーのうちどれが活性化合物を含有するかを確認で きた。このライブラリーを再度カラムに導通し、その溶出時間が最も強く結合し た成分に対応する画分を、短いＣ１８カラム（ヒューレット・パッカード、カー トリッジＯＤＳハイパーシル、５ミクロン、２０×４ｍｍ）に直接導通して、こ れらの成分をトラップした。次いでこのトラップを直接に電気スプレー式質量分 析計（ＢｉｏＱ質量分析計、バキューム・ジェネレーター・バイオテクノロジー −フィソンス・インスツルメント）の探針に接続し、アセトニトリル／水（５０ ：５０）０．５％ギ酸でバックフラッシした。溶出液を質量分析により連続的に 監視し、約５分後にイオントレース全体に幅広いピークが検出され、２つの主成 分の存在を示した。 それらの質量をライブラリー中の化合物の分子イオンと比較して、これらは実 際にライブラリーの２成分であることが示された(分析は盲検法により行われた) 。別個の実験で、これら２成分の前にアフィニティーカラムから洗浄除去された ものに対応する画分を、直接電気スプレー式質量分析法またはトラッピング法に より分析した。４つの主成分が検出された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．対象となる生物学的物質に対する複数の低分子量リガンドの親和性を測定 するためのアッセイ法であって、対象となる生物学的物質を固相マトリックスに 固定化し、リガンドを含む混合物とこれを接触させ、結合していないリガンドを マトリックスから除去し、リガンドをマトリックスから溶離し、カラム上でのそ れらの保持の程度を参照して対象となる生物学的物質に対するそれらの親和性を 確証することを含むアッセイ法。 ２．対象となる生物学的物質を既知リガンドに対する親和性によりまず同定す る、請求項１記載のアッセイ法。 ３．固相マトリックスがＨＰＬＣカラムである、請求項１記載のアッセイ法。 ４．リガンドを質量分析により同定するために溶離する、請求項１記載のアッ セイ法。 ５．対象となる生物学的物質が共有結合したＨＰＬＣカラムの、請求項１〜４ のいずれか１項記載の方法における使用。 ６．対象となる生物学的物質が酵素フラグメントまたは受容体フラグメントで ある、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。