JPH11503408A - セファレキシンの回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 セファレキシンおよび７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７−ＡＤＣＡ）を含む混合物からのセファレキシンの回収方法であって、セファレキシンおよび７−ＡＤＣＡを含み、ｐＨが７より高く、存在しうる固体セファレキシンを別にしてｐＨ 7〜8.5 で均一である混合物に、7.8 より低いｐＨ値に達するまでｐＨ修正を施し、存在する固体物質を回収する方法。その方法は特に、７−ＡＤＣＡとアシル化剤としてのフェニルグリシン誘導体との酵素アシル化反応の後に得られる反応混合物への適用に適する。こうして、純粋なセファレキシンを簡単な方法で回収することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 セファレキシンの回収方法 本発明は、セファレキシンおよび７−アミノデスアセトキシセファロスポラン 酸（７−ＡＤＣＡ）を含む混合物からセファレキシンを回収する方法に関する。 ７−ＡＤＣＡをＤ−フェニルグリシン誘導体でアシル化するセファレキシンの 製造において、セファレキシンの回収および反応混合物の処理は、一般に困難で ある。すなわち、例えば WO-A-93/12250には、アシル化反応は決して完了するこ とがなく、最終物質の最終的精製は、ある種の成分（特に、US-A-4003896に記載 されているように、７−ＡＤＣＡおよびフェニルグリシン）の酸／塩基性および 溶解性が最終物質のものとあまり変わらないために妨害されることが記載されて いる。その結果、共沈殿が生じ、純粋でないセファレキシンが得られる。WO-A-9 3/12250 および US-A-4003896 では、ナフトールなどの錯化剤の使用が提案され ている。しかし、これは、その方法に相反する別の物質を添加しなければならな いという欠点を伴う。 本発明の目的は、該方法に相反する有機物質を使用することなくセファレキシ ンの精製を可能にする簡単な方法を提供することである。 これは、セファレキシンおよび７−ＡＤＣＡを含み、ｐＨが７より高く、存在 する固体セファレキシンを別にして ｐＨ 7〜8.5 で均一である混合物に、7.8 より低い範囲のｐＨ値に達するまでｐ Ｈ修正を施し、存在する固体物質を回収する本発明に従って達成される。 セファレキシンおよび少量の７−ＡＤＣＡを含む混合物から純粋な形でセファ レキシンを単離する別の方法は、JP-A-2111584 に記載されている。この日本特 許公開に記載されている方法によれば、７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンを含 む混合物を、アルカリ成分、例えばジイソプロピルアミンの存在下、有機溶媒、 例えばジクロロメタン、ジメチルスルホキシドおよび低級アルコールの混合物中 で再結晶する。この方法も、その方法に相反する物質を添加しなければならない という欠点がある。さらに、この精製法では、18 %のセファレキシンの損失を生 じる。 本出願人は、混合物のｐＨを、反応混合物の組成物に応じて 7.8以下の値、例 えば 5〜7.8 、特に 6.0〜7.6 に下げることにより、たとえ多量の７−ＡＤＣＡ が混合物に存在していても、セファレキシンを90重量 %、特に98重量 %の純度で 晶出させることができ、その後、セファレキシンが回収できることを見いだした 。反応混合物は、セファレキシの他に、しばしば、他の有効な成分、例えば７− ＡＤＣＡなどを含む。商業的に魅力的な方法を得るためには、従って、７−ＡＤ ＣＡおよびセファレキシの損失を最少にすることも重要である。また、その後、 該反応混合物のｐＨを 6.5より低い値、特に 1.5〜5.5 に下げると、７−ＡＤＣ Ａおよび残りのセファレキシンが実質的に完全に晶 出し、その後、この７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンの混合物を、例えば濾過 により回収することができることも見いだされた。その結果得られる７−ＡＤＣ Ａおよびセファレキシンの混合物は、所望により再使用することができ、その結 果、７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンがあまり損失することなく、純粋なセフ ァレキシンを与える方法が得られる。 本発明方法の特定の態様では、最初に混合物のｐＨを、 0〜3.5 、好ましくは 0.5〜2.5 の値に達するまで低下させ、その後、 5〜7.8 、好ましくは 6.0〜7. 6 の値に達するまで上昇させる。 本発明方法は、特に、７−ＡＤＣＡがＤ−フェニルグリシンアミド（ＰＧＡ） またはＤ−フェニルグリシンのエステルでアシル化される酵素アシル化反応の後 に得られる反応混合物の処理に適用するのに適している。すなわち、本発明に係 る方法は、例えば、比較的高いｐＨ、例えば 8〜10のｐＨで行った酵素アシル化 反応の反応混合物を濾過して（固定化）酵素を単離し、ｐＨを 7.0〜8.5 の値に 下げることを順次行って得られる出発混合物に適用することができる。アシル化 反応中に生成するＤ−フェニルグリシン（ＰＧ）の量によっては、所望により、 最初に 7.0〜8.5の高いｐＨ値（後者のｐＨ値は、ＰＧは晶出しているが、セフ ァレキシンはまだ晶出していないような混合物に応じて選択される）で、通常は 主としてＰＧから成る最終的に生成した固体物質を単離することができる。 別の態様では、使用する出発混合物が、比較的低いｐＨ、例えば 7〜8.5のｐ Ｈで終わる酵素アシル化反応後、ならびに、主に固定化酵素、およびアシル化反 応中に生成するＰＧの量に依存してＤ−フェニルグリシンを含む固体物質の単離 後に得られる混合物である。 ７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンを含む出発混合物には、かなりの量の７− ＡＤＣＡが存在し得る。７−ＡＤＣＡの量は、通常は、７−ＡＤＣＡ＋セファレ キシンの合計量に対して 75 モル% より少なく、好ましくは 2〜60 %、特に 5〜 50 %である。 ｐＨは、本発明の構成において、いくつかの方法で下げることができ、例えば 、酸、例えば鉱酸、特に硫酸、塩酸または硝酸を添加することにより化学的に行 うことができる。別の可能性は、例えば、ＰＧＡをアシル化反応でのアシル化剤 として使用した場合、またはＰＧのエステルを使用し、アシル化反応中、ｐＨを アンモニアによる滴定により一定に保持した場合、アンモニアの物理的除去によ りｐＨを下げることである。適する物理的除去法は、例えば、蒸気または不活性 ガスによるストリッピング；減圧（蒸気）蒸留、特に薄膜蒸発；噴霧塔での蒸発 ；気体膜分離または電気透析である。 セファレキシンを回収する最適ｐＨは、混合物の組成物に依存し、７−ＡＤＣ Ａおよびセファレキシンの最適分離が達成されるように選択する。実際には、最 適ｐＨは、一方で、セファレキシンを比較的高いｐＨで回収する場合に 達成される回収セファレキシンの高い純度（その結果、セファレキシンの一部は まだ溶液であり、７−ＡＤＣＡはなおも完全に溶液中にある）、および他方で、 セファレキシンを回収するｐＨが比較的低い場合に達成される高い収量（その結 果、セファレキシンが実質的に完全に析出し、同時に、７−ＡＤＣＡの一部も析 出する）の間の妥協点である。当業者であれば、所与の状況で最適ｐＨを決定す るのは容易である。 処理を行う温度は、通常は35℃より低く、好ましくは０〜30℃、特に10〜30℃ である。 純粋なセファレキシンの回収を、さらにｐＨを下げた後に得られる７−ＡＤＣ Ａおよびセファレキシンの混合物の再循環と組み合わせた本発明の方法を、７− ＡＤＣＡのＰＧＡによる酵素アシル化後に得られる混合物に適用すると、７−Ａ ＤＣＡに対して全体的に高い選択率、特に80 %より高い選択率を達成することが できる。残りの濾液は、主に少量の残留ＰＧＡを含むが、所望により、例えば８ より高いｐＨ、特に 8.5〜10のｐＨにして、析出したＰＧＡを回収することによ りさらに処理することができる。所望により、さらに濃縮し、10℃より低い温度 、例えば０〜８℃に冷却することができる。このようにして、７−ＡＤＣＡおよ びＰＧＡが共に高い効率で適用できる方法が得られる。酵素アシル化反応では、 例えば、ＰＧＡまたはＰＧＡのエステルをアシル化剤として使用することができ る。 原則的に、カップリング反応における触媒として適する任意の酵素を使用する ことができる。そのような酵素は、例えば、一般に「ペニシリンアミダーゼ」お よび「ペニシリンアシラーゼ」の名称で知られる酵素である。適する酵素の例と しては、Acetobacter 、Aeromonas 、Alcaligenes 、Aphanocladium 、Bacillus sp.、Cephalosporium、Escherichia 、Flavobacterium、Kluyvera、Mycoplana 、Protaminobacter 、Pseudomonas および Xanthomonas、特に Acetobacter pas teurianum 、Alcaligenes faecalis、Bacillus megaterium 、Escherichiacoli および Xanthomonas citrii に由来する酵素が挙げられる。 好ましくは、固定化酵素を使用する。なぜならば、酵素は容易に単離した後、 再使用することができるからである。固定化酵素は、それ自体公知であり、市販 されている。適する酵素の例は、「Enzygel 」の商標で市販されている Boehrin ger Mannheim GmbH 製の大腸菌（Escherichia coli）酵素、Recordati 製の固定 化ペニシリン−Ｇアシラーゼ、Pharma Biotechnology Hannover 製の固定化ペニ シリン−Ｇアシラーゼおよび WO-A-92.12782の記載のように単離され、EP-A-222 462 の記載のように固定化される大腸菌（Escherichia coli）ペニシリンアシラ ーゼである。 酵素アシル化反応は、通常は、35℃より低い温度、好ましくは 0〜28℃で行わ れる。酵素アシル化反応を行うときのｐＨは、通常は、 6〜10、好ましくは 6.5 〜9 である。 実際には、酵素アシル化反応および反応混合物の処理は、通常、水中で行う。 所望により、反応混合物は、有機溶媒または有機溶媒の混合物を、好ましくは30 体積 %未満で含むこともできる。使用できる有機溶媒の例は、１〜７個の炭素原 子を有するアルコール、例えばモノアルコール、特にメタノールまたはエタノー ル；ジオール、特にエチレングリコール；またはトリオール、特にグリセロール である。 本発明の構成において、種々の成分は、遊離形または塩として反応混合物に存 在させることができる。言及したｐＨ値は、全ての場合において、室温で測定し たｐＨ値である。 本発明を下記実施例によってさらに説明するが、本発明は、下記実施例に限定 されるものではない。略語 ＣＥＸ＝セファレキシン ＣＥＸ・Ｈ2 Ｏ＝セファレキシン一水和物 ７−ＡＤＣＡ ＝７−アミノデスアセトキシ セファロスポラン酸 ＰＧＡ＝Ｄ−フェニルグリシンアミド ＰＧ＝Ｄ−フェニルグリシン 実施例Ｉ： 550 mMのＰＧＡ・１／２Ｈ2 ＳＯ4を 410 mM の７−ＡＤＣＡと５℃で酵素結 合させた後に得られる混合物の処理 80 gのＰＧＡ・１／２Ｈ2 ＳＯ4 、64.2 gの７−ＡＤＣＡおよび 425 ml の水 の混合物を５℃に冷却した後、ｐＨを 25 mlの25重量％ＮＨ4 ＯＨ水溶液で 7.6 にした。得られた懸濁物（「供給材料」）を Recordati(Milan)製の 190gの湿性 固定化ペニシリン−Ｇアシラーゼに添加した。この酵素は、水とグリセロールと の混合物で市販されている（「湿性酵素」）。それは、使用前に 100 ml の水で ３回洗浄した。 ２時間攪拌した後（ｐＨは、そのとき、8.35に上昇した）、反応混合物をＧ− ３ガラスフィルターで濾過した。残渣は、50 ml の水で２回洗浄した。この残渣 は、酵素と反応中に生成したＰＧとの混合物であった。 濾液（黄色溶液）は、そのとき、注意深く濃硫酸（全 4 ml ）でｐＨ＝7.2 に 酸性化した。30分後、濾過、3 x 30 ml の水による洗浄および脱水を行うと、化 学純度（無水物基準）が＞99.5 %である 40.8 g のＣＥＸ・Ｈ2 Ｏが得られた。 ＣＥＸ結晶化の母液を再び、濃硫酸（全 3.7 ml ）でｐＨ＝4.0 に酸性化した 。17時間攪拌した後、濾過および3 x 20 ml の水による洗浄を行うと、30.2 gの 固体物質が得られた（無水物基準で計算）。この固体物質は、ＣＥＸおよび７− ＡＤＣＡの混合物を60:40 のモル比で含んでいた。 実施例II 500 mMのＰＧＡおよび 500 mMの７−ＡＤＣＡの５℃での酵素結合と続く処理 75.0 gの遊離ＰＧＡ、109.2 g の７−ＡＤＣＡ、10.0 gのＰＧおよび 750 ml の水から成る供給材料を５℃に冷却した後、Recordati（Milaan）製の150gの湿 性酵素ペニシリン−Ｇアシラーゼ（最初に洗浄しておいた）に添加した。５℃で ２時間10分攪拌した後、混合物を濾過し（Ｇ−３ガラスフィルターによる）、1 x 100 mlの水で洗浄した。 得られた濾液は、下記成分を含んでいた。 ＣＥＸ＝328 ミリモル ７−ＡＤＣＡ＝161 ミリモル ＰＧ＝75ミリモル ＰＧＡ＝46ミリモル すなわち、７−ＡＤＣＡに対する変換率は66 % になった。この混合物を次の ように処理した。ロータリーフィルムエバポレーターにより、360 mlの全混合物 (971.4 g)を20℃で留去し（約45〜60分）、その後、360 mlの新しい水を添加し た。この工程を１回繰り返した。得られた懸濁物をＧ−３ガラスフィルターによ り濾過した。残渣を冷水(1 x 50 ml)およびアセトン(2 x 30 ml)で再洗浄し、次 いで、一晩脱水した。収量：57.0g の白色物質。無水物基準でのＣＥＸ含量は＞ 99 %であった。次いで、ＣＥＸ濾過からの濾液（洗浄水を含む）を再び５℃に冷 却し、12 Nの Ｈ2 ＳＯ4 水溶液によってｐＨ＝4.5 に酸性化した。２時間攪拌した後、懸濁物 をＧ−３ガラスフィルターにより濾過した。収量：78.4 gの淡黄色物質（無水物 基準で計算した）。この物質は、ＣＥＸおよび７−ＡＤＣＡの混合物を75:25 モ ル比で含んでいた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９５００２９０ (32)優先日 1995年３月31日 (33)優先権主張国 ベルギー（ＢＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファン デン トィール，ウィルヘルム ス，ヨハネス，ヨセフ オランダ国，6241 イーディー メールセ ン，クルーステルベルグ ６エー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．セファレキシンおよび７−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸（７− ＡＤＣＡ）を含む混合物からのセファレキシンの回収方法であって、セファレキ シンおよび７−ＡＤＣＡを含み、ｐＨが７より高く、存在しうる固体セファレキ シンを別にしてｐＨ 7〜8.5 で均一である混合物に、7.8 より低いｐＨ値に達す るまでｐＨ修正を施し、存在する固体物質を回収することを特徴とする方法。 ２．ｐＨを 6〜7.6 の値に下げることを特徴とする請求項１に記載の方法。 ３．最初にｐＨを 0〜3.5 の値に達するまで低下させ、次いで、 5〜7.5 のｐＨ 値に達するまでｐＨを上げることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 ４．0.5 〜 2.5の値に達するまでｐＨを下げることを特徴とする請求項３に記載 の方法。 ５．出発混合物が、７−ＡＤＣＡおよびセファレキシンの全量に対して計算する と 2〜60モル% である７−ＡＤＣＡを含むことを特徴とする請求項１〜４のいず れか一項に記載の方法。 ６．残りの液層のｐＨを 6.5より低い値に下げ、存在する固体物質を回収するこ とを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７．残りの液層のｐＨを 1.5〜5.5 のｐＨに下げることを特徴とする請求項６に 記載の方法。 ８．ｐＨ 8〜10で行った酵素アシル化反応の反応混合物から、ｐＨを 7.0〜8.5 の値に下げ、固体物質を分離し、所望により、ｐＨをさらに 7〜8.5の値に下げ ることによりセファレキシンおよび７−ＡＤＣＡの混合物を調製することを特徴 とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。 ９．アシル化反応の後に得られる反応混合物から、存在する固体物質をまず分離 することを特徴とする請求項８に記載の方法。 １０．セファレキシンおよび７−ＡＤＣＡの混合物を、酵素アシル化反応の反応 混合物から、ｐＨ 7〜8.5 でかつ存在する固体物質を分離して調製することを特 徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。