JPH11503025A

JPH11503025A - 現在のグルコースレベルおよび中期間または長期間の血糖症制御のための組み合わせアッセイ

Info

Publication number: JPH11503025A
Application number: JP8530500A
Authority: JP
Inventors: エス．ギャレン，ロバート; エフ．バード，ジョン; ホブリッツェル，タレイ; ネイヤー，ゲブハード
Original assignee: エルエックスエヌコーポレイション
Priority date: 1995-04-07
Filing date: 1996-04-05
Publication date: 1999-03-23
Also published as: DE69636775T2; DK0819180T3; EP0819180B1; EP0819180A1; US6027692A; CA2215914A1; WO1996031619A1; ES2277342T3; US20040265941A1; DE69636775D1; US6958129B2; EP0819180A4; US5695949A; US6670192B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、全血のような被験体の体液中の、グルコース濃度およびタンパク質結合グルコースレベルを測定することにより、被験体の統合された血糖症状態を決定する単回の試験システムおよび方法に関する。グルコース濃度は被験体の即時の血糖症状態の指標であるが、タンパク質結合グルコース濃度は中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である。必要に応じて、ケトン体または脂肪酸誘導体のような血糖症状態の指標である他の分析物もまた、測定され得る。本発明はまた、糖尿病を診断するための方法を提供する。本発明は、反応促進物質を使用することなく５分以内にフルクトサミン濃度を分析するための方法をさらに提供する。

Description

【発明の詳細な説明】現在のグルコースレベルおよび中期間または長期間の血糖症制御のための組み合わせアッセイ発明の背景発明の分野本発明は、アッセイシステムに関し、そしてより詳細には、グルコース濃度レベルおよびタンパク質結合グルコース濃度レベルを測定することにより、糖尿病の統合された血糖症状態(glycemic condition)を決定することに関する。背景情報 (真性)糖尿病を罹患した個体は、膵臓が、炭水化物代謝を調節するに十分な量の活性ホルモンインスリンを血流中に分泌しないので、概して異常に高い血糖レベルを有している。過血糖状態として知られる異常に高い血糖レベルが長期間継続すると、個体は、網膜症、腎症、神経障害および心臓血管疾患を含む糖尿病の慢性合併症となる。研究は、ほぼ正常な血糖症制御を維持し得る糖尿病患者が、これらの重篤な合併症の傾向を大いに減少させることを示す。従って、血糖症状態を測定および制御するために、いくつかの試験が開発されている。血糖症状態を制御するための１つの一般的な医療試験は、糖尿病患者による血中グルコースレベルの直接測定である。血中グルコースレベルは、個々の症例の性質および重篤度に依存して、食事、活動、および処置によって影響されて、所定の日を通じて顕著に変動するので、いくらかの患者は、１日に７回まで血中グルコースレベルを測定する。測定されたグルコースレベルの観察パターンに基づいて、患者および医師はともに、疾患をより良好に管理するために、食事、運動、およびインスリン摂取を調整する。明らかに、この情報は、患者にすぐに利用可能であるべきである。しかし、所定の日におけるグルコースレベルの頻繁な変動のために、患者の食事、活動、および／または処置とは独立した、かつ血中グルコースレベルの長期の指標を与える試験もまた開発されている。これらの試験は、糖化タンパク質(g lycated protein)または「タンパク質結合グルコース」(PBG)の濃度を測定する。タンパク質（例えば、全血、血清、および他の生体液中に存在するタンパク質）は、非酵素条件下でグルコースと反応して、糖化タンパク質を生成する。反応の程度は、血液のグルコース濃度に直接依存する。開発された最初の糖化タンパク質試験の１つは、糖化ヘモグロビン（すなわち、ヘモグロビンA_1c(HbA_1c)）を測定する。これはおよそ２〜３ヶ月の期間にわたる血糖症制御を反映する。他のこのような試験は、総糖化血清タンパク質のような血清タンパク質、または特定の糖化血清タンパク質（すなわち、糖化アルブミン）を測定する。糖化アルブミンは、およそ２〜３週間の期間にわたる中期間の血糖症制御を反映する。血糖濃度を間接的に評価するさらに別の方法は、フルクトサミン(fructosamin e)濃度を分析することである。糖化タンパク質はまた、フルクトサミンまたはケトアミン(ketoamine)として知られる。血中タンパク質は、グルコースと血中タンパク質の利用可能なアミノ基（主に、リジン残基のε−アミノ基およびタンパク質の末端アミノ酸のα−アミノ基）との間の非酵素反応により、インビボにおいて糖化される。グルコースは、タンパク質のアミノ基と結合し、シッフ塩基（すなわち、グルコシルアミンまたはアルジミン）を形成する。これは、安定なケトアミンを形成する分子転位を受ける。この反応機序(reaction sequence)を図1 aに示す。当該分野では、このようなケトアミンは、総称的に「フルクトサミン」として公知である。タンパク質糖化およびフルクトサミン形成の程度は、血中グルコース濃度に直接比例する。血清または血漿のフルクトサミンレベルの測定は、糖尿病制御をモニターするために有用である。なぜなら、血清または血漿中のフルクトサミン濃度はおよそ半月の期間にわたる血中グルコースレベルの平均を反映するからである。これらの直接および間接的にグルコースを測定する個々の試験が開発されているが、糖尿病患者または医師(physician)が即時グルコースレベルと中期間または長期間の血糖症状態との両方を評価できる利用可能な便利な試験システムは存在しない。現在、グルコース試験は、医師(doctor)または患者によって日常的にいて複雑な技術および高価な機器を用いて実施される。これらの臨床実験室からの結果は、通常、数日間は医師および患者に入手可能ではない。この情報伝達の遅延は、試験結果の価値を低下させる。医師は、次の訪問（数ヶ月先であり得る）まで患者に試験結果を伝えることを忘れてしまうことさえあり得る。近年、北欧の研究者が、糖化タンパク質試験結果を知った医師および患者は、このような結果を知らない医師および患者より良好な血糖症制御を有したことを示した。また、現在、糖化タンパク質が合併症の原因となる因子であり得るとも考えられている。従って、被験体の統合された血糖症状態を決定するために、糖化タンパク質を単独でまたはグルコースとの組み合わせで、便利にかつ迅速に測定する必要性が存在する。現在、被験体の統合された血糖症状態を決定する、すなわち、被験体にその血糖症状態の完全な情報を提供し、従って最良だと考えられるモニタリングおよび処置を可能にする、試験システムは存在しない。特に有用なのは、被験体の統合された血糖症状態を決定するための、医院で、またはなお一層良好には、家庭で糖尿病患者により用いられ得る単一の機器である。本発明は、これらの必要性を満足し、そして関連の利点もまた提供する。発明の要旨本発明は、被験体の体液（例えば、全血）中の、グルコース濃度およびタンパク質結合グルコースレベルを測定することにより被験体の統合された血糖症状態を決定する単回の試験システムおよび方法に関する。グルコース濃度は被験体の即時血糖症状態の指標であるのに対して、タンパク質結合グルコース濃度は中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である。必要に応じて、ケトン体または脂肪酸誘導体のような血糖症状態に関連する他の分析物もまた測定され得る。本発明はまた、糖尿病を診断する方法に関する。本発明はまた、反応促進物質の非存在下でさえ、５分以内にフルクトサミン濃度を分析する方法を提供する。図面の簡単な説明図1aは、インビボでフルクトサミンを形成するための反応機序を示す。図1bは、アルカリ条件下でフルクトサミンが、測定（例えば、比色定量的に）され得る還元剤である、エネアミノール(eneaminol)を形成することを示す。図２は、体液サンプル中のフルクトサミン濃度を測定するために使用され得る多層試験デバイスの１つの実施態様を示す。図3aは、分析されるべき体液が適用される、試薬パッドを有する試験デバイスの１つの実施態様を示す。図3bは、本発明の実施において使用され得る装置の概略のブロック線図である。図4aおよび4bは、フルクトサミン試験デバイス(F)およびグルコース試験デバイス(G)にそれぞれ適用される体液サンプルを示す。図4aおよび4bはまた、それぞれの試験デバイスに適用された体液サンプル中のフルクトサミンおよびグルコースの濃度レベルを決定し得る装置の実施態様を示す。図５は、体液サンプル中の糖化ヘモグロビンを測定するために使用され得る２つの試験細片を有する試験デバイスの１つの実施態様を示す。図６は、体液サンプル中の糖化アルブミンを測定し得る２つの試験細片を有する試験デバイスの１つの例を示す。発明の詳細な説明本発明の方法および単回の試験システムは、糖尿病患者または医師が、被験体の現在のグルコースレベルならびに被験体の中期間または長期間の血糖症状態を評価することを可能にする組み合わせアッセイを提供する。このようなシステムは、糖尿病患者および彼らの血糖症制御の正常化を研究している彼らの医師にとって有用であり、それにより重篤な疾患の合併症の可能性を減少させる。本発明の以前に、患者の完全な血糖症状態は分離試験によってのみ導かれ得、そしてしばしば、糖化タンパク質試験が臨床実験室で行われなければならなかった。本発明の試験システムは、医師が医院でグルコースおよびタンパク質結合グルコースについての組み合わせ試験を行うことを可能にするか、あるいは、さらに良好には、糖尿病患者が家庭で試験を行うことを可能にし、それにより、患者の血糖症状態の迅速、正確、かつ完全な情報が提供される。本発明は、グルコースおよびタンパク質結合グルコースの両方について試験することにより被験体の統合された血糖症状態を決定する、単回の試験システムおよび方法を提供する。グルコースおよびタンパク質結合グルコースの両方について試験することにより提供される情報は特に有用である。なぜなら、グルコース濃度は糖尿病患者において広範に変動し得、そしてこれらの変動は、標準的なグルコース試験レジメンにより見逃されるからである。本明細書中で用いられるように、用語「統合された血糖症状態」は、一定の期間にわたる平均のグルコース濃度と組み合わせた即時グルコース濃度を意味する。「即時」は、測定時における被験体の体液中の現在のグルコースレベルを意味する。一定期間にわたるグルコース濃度は、中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標であり、そしてタンパク質結合グルコース濃度を測定することにより決定され得る。中期間の血糖症状態は、一般的には、数日からおよそ１ヶ月の程度についての状態であり、例えば、およそ半月の期間にわたる体液中の平均のグルコース濃度を反映するフルクトサミンの測定によって示される。長期間の血糖症状態は、１ヶ月より多く、一般的には２〜３ヶ月の期間にわたる血糖症状態を良好に反映する。本発明において、グルコース、タンパク質結合グルコース、および血糖症状態の指標である任意のさらなる分析物を測定する順序は問題とされない。例えば、フルクトサミン濃度が最初に測定され、そしてグルコースレベルが２番目に測定され得る。順序に関係なく、本発明は常に、被験体の統合された血糖症状態を提供する。糖尿病を罹患したことが既知の被験体の血糖症状態をモニターするために本発明を使用することに加えて、本発明はまた、糖尿病の診断学上の特徴として使用され得る。本発明は、糖尿病を罹患したことが疑わしいまたは罹患する傾向があり得る個体を診断またはスクリーニングするために使用され得る。例えば、糖尿病の傾向があり得、そしてスクリーニングが必要である被験体は、妊婦であり得る。診断が特に有用であり得る他の個体は、既知の糖尿病患者の親類である。本発明の単回の試験システムを用いて被験体の糖尿病を診断する方法は、以下の工程を包含する：最初に、少なくとも１つの体液サンプルを被験体から得る工程、次いで、被験体由来の体液サンプル中のグルコース濃度を測定する工程、および被験体由来の体液中のタンパク質結合グルコース濃度を測定する工程。グルコースおよびタンパク質結合グルコースを測定する順序は問題とされない。最後に、測定したグルコース濃度およびタンパク質結合グルコース濃度を正常被験体のグルコース濃度およびタンパク質結合グルコース濃度と比較する。正常な被験体のものと比較して、高いグルコースレベルと高いタンパク質結合グルコース濃度との組み合わせ、または一定期間にわたる高いグルコースレベルの指標であるタンパク質結合グルコースレベルは、糖尿病の診断学上の特徴または指標である。例えば、正常被験体は、70〜120mg/dlの範囲の絶食時のグルコースレベルを有する。120mg/dlより高いグルコースレベルは、糖尿病の指標であり得る。150mg/dlより高いグルコースレベルは、糖尿病の強い指標であり、そして 200mg/dlより高いグルコースレベルは、糖尿病状態のほとんど疑いのない指標である。正常被験体は、２〜３ミリモル濃度（mM）の程度のPBG濃度レベルを有し、対して高グルコースレベルとの組み合わせにおける3mMより高いPBGレベルは、糖尿病の診断学上の特徴であり得る。本発明の組み合わせアッセイの利点は、最近まで血清グルコースが、起こり得る糖尿病についての利用可能な唯一のスクリーニング試験であったことである。異常に高い血清グルコースは決定的ではないが、糖尿病に起因し得る。しかし、血清グルコースはまた、非絶食、ストレス、または特定の薬物の摂取をも反映し得る。グルコース試験のみの欠点を仮定して、Rosenら、Hospital Practice，2 7 ：59-61（1992）は、糖尿病をスクリーニングする手段としてグルコースおよびタンパク質結合グルコースの両方についていくつかの患者の血清サンプルを試験した。しかし、本発明は、試験の前に分離などを必要としない未処理の体液サンプルを試験し得るという付加的な利点を有する。例えば、患者由来の全血のしずくが、試験前に血清または血漿の分離をすることなく、本発明の方法および試験システムとともに使用され得る。このように、本発明の簡易性および利便性は、医師および患者が、医院または家庭のいずれかで、数分間以内に患者の統合された血糖症状態を知ることを可能にする。本明細書中に使用されるように、用語「タンパク質結合グルコース」または「PBG」は、任意の糖化タンパク質またはそれらの組み合わせを包含する。PBG濃度は、一定期間にわたるグルコース濃度に相関する。血糖症状態についてのPBG 試験（すなわち、非グルコース試験）は、体液中に見出される全てのまたは個々の糖化タンパク質についての試験を含み得る。例えば、全ての種の糖化されたヘモグロビンを含む「総糖化ヘモグロビン」が測定され得るか、またはヘモグロビンA_1c（HbA_1c）のような特定のヘモグロビンが測定され得る。同様に、全ての血清糖化タンパク質（すなわち「総糖化血清タンパク質」）、または糖化アルブミンのような特定の糖化血清タンパク質が測定され得る。さらに、「タンパク質結合グルコース」はフルクトサミンを包含する。１つより多いPBGが本発明において測定され得る。例えば、フルクトサミンは中期間の血糖症状態の指標として測定され得、そしてHbA_1cは長期間の血糖症状態の指標として測定され得る。主要な正常ヘモグロビン種はA₀(α₂β₂)、A₂(α₂δ₂)、およびF(α₂γ₂)である。主要ではないが通常に存在する種々のヘモグロビン変異体が存在し、そして一般に、HbA₁または「速い」ヘモグロビンと呼ばれる。なぜなら、これらは電気泳動ゲル上でA₀より先に移動するからである。HbA₁のファミリーは、A_1a1、A_1a2 、A_1b1、A_1b2、A_1b3、A_1c、A_1d、およびA_1cを含み、これらの全てが、糖化ヘモグロビンである。全ての画分は、典型的に、糖尿病でない集団における濃度と比較して糖尿病状態において上昇している。HbA_1cは、主要な部分画分（subfracti on）であるが、これらの画分の全ては、一般に平均の血中グルコース濃度と共に変化し、そして血糖症制御の状態を反映する。ほとんどのヘモグロビンは、一般に、グルコースとヘモグロビン中のリジン残基のε-アミノ基との間の反応を介して糖化される。対照的に、HbA_1cは、そのアミノ末端のバリン残基を介してグルコースに結合する。ヘモグロビンの半減期は約60日であり、従って、総糖化ヘモグロビンまたはHbA_1cの測定値は、長期間（一般的には約２〜３ヶ月の期間を反映する）の血糖症状態の指標である。糖化は、ヘモグロビンに独特ではなく、血清タンパク質とともに起こり得る。アミノ基がグルコースと反応するので、酵素、免疫グロブリン、ならびにほとんどの他のクラスのタンパク質、および個々のタンパク質を含む体液中に存在するほとんどのタンパク質が糖化される。全ての血清糖化タンパク質の総量（すなわち「総糖化血清タンパク質」）が分析され得るか、または糖化アルブミンのような特定の糖化血清タンパク質が測定され得る。糖化血清タンパク質の測定値（総糖化血清タンパク質または個々の糖化血清タンパク質のいずれであろうと）は、中期間の血糖症状態の指標である。糖化アルブミンは約２〜３週間の半減期を有するが、他の血清タンパク質の半減期は2.5〜23日の範囲であり得る。従って、総糖化血清タンパク質または糖化アルブミンの測定値は、中期間の血糖症状態の指標であり、２日から約１ヶ月までの期間にわたるグルコース濃度を反映する。フルクトサミンは糖化タンパク質により形成される。グルコースはタンパク質のアミノ基に結合してシッフ塩基（すなわち、グリコシルアミンまたはアルジミン（aldimine））を形成する。これは、分子転位を受けて安定なケトアミンを形成する。この反応機序を図1aに示す。当該分野において、このようなケトアミンは総称的に「フルクトサミン」として公知である。フルクトサミン形成がグルコース濃度に直接依存するので、糖尿病の個体は、糖尿病でない個体と比較して血液中により高いフルクトサミン濃度を有する。アルカリ条件下で、血液中に形成するフルクトサミンは、図1bに示すようにエネアミノールに転換される。フルクトサミンのエネアミノール形態は、フルクトサミンにより還元され得る適切な指示薬と反応する、化学的に活性な還元物質である。例えば、発色性色素の色の変化、またはこの反応によってもたらされた蛍光試薬の蛍光が測定され得、そして標準と比較して、先の半月の期間にわたる血液サンプル中の平均のグルコース濃度の指標を与える。一般に、血清のような体液中のフルクトサミン濃度は、約半月の期間にわたる平均のグルコース濃度を反映する。必要に応じて、ケトン体または脂肪酸誘導体のような血糖症状態の指標である他の分析物もまた測定され得る。治療的なインシュリン注射の間にインシュリンの代謝の結果として起こり得るようなインシュリンの欠乏中、細胞機能を維持するために必要とされるエネルギーは、細胞へのエネルギーの主要な供給源であるグルコースから十分に誘導され得ない。この状況において、脂肪酸酸化経路は代替的なエネルギー供給源を供給する必要がある。脂肪酸代謝経路が活性化される場合、ケトン体（例えばアセトン、β−ヒドロキシブチレート、およびアセトアセテート）、脂肪酸代謝産物などを含むこの代謝プロセス由来の副生成物が、血液および他の体液中に検出され得る。血中グルコースレベルが正常なレベルに回復される場合、これらの分析物が血液から迅速に取り除かれないので、これらは患者におけるグルコース代謝状態の短期間の指標を提供する。このような分析物は、このような変化の約５分から約12時間以内の糖尿病のグルコース代謝における変化に応答して体液中に存在する。血糖症状態の指標でもある、さらなる分析物についてのこれらの随意の測定は、本発明に関連して当該分野で周知の方法により行われ得る。例えば、上記のようなケトン体を測定し得る試験試薬細片（例えば、Maggioの米国特許第4,397,956号）が本発明の試験システムとともに使用され得る。必要に応じて測定され得、そして血糖症状態の指標でもある別の分析物は、ミクロアルブミンである。一般に、患者の血糖症状態が非常に重篤で、腎臓に関連する合併症をもたらす場合にのみ、ミクロアルブミンが尿中に存在する。被験体由来の体液サンプル（これは、グルコースおよびPBG、または血糖症状態に関連する他の分析物についてもまた分析される）は、以下を含むようなこれらの分析物を含有する任意の未処理の生体液であり得る：例えば、全血、尿、唾液、介在性液、および涙。体液が「未処理である」は、体液が試験される前に処理（例えば、分離技術などによる）される必要がないことを意味する。体液は、例えば、全血から血漿または血清を分離せずに、直接試験デバイスに適用し得る。必要な場合、試験デバイス自身の中で体液を分離し得るか、または別の方法で（例えば、赤血球分離層により）処理し得る。グルコース濃度の測定のために使用される体液サンプルは、PBGの濃度測定のために使用される体液サンプルと同じタイプであり得るが、必ずしも同じではない。例えば、全血は、本発明のグルコース部分およびPBGの局面の両方に用いられ得る。あるいは、尿がグルコース濃度の決定のために使用され、そして全血サンプルがフルクトサミンについてアッセイするために使用されるように、体液サンプル（単数または複数）は、異なるタイプの体液であり得る。本発明が患者自身による家庭環境において有利に用いられ得ることから、グルコース分析および PBG分析の両方に好ましい体液サンプルは全血であり、そしてより好ましくは、指または耳たぶの穿刺により採取される全血である。フィンガースティックが好ましいが、特に、サンプルを回収する場合、ピペット、ドロッパーなどが使用され得る。グルコースおよびPBGが測定される体液サンプル（単数または複数）は、サンプルが被験体から採取される方法に依存して、同じサンプルまたは別個のサンプルであり得る。「別個の」サンプルとは、２つまたはそれ以上のサンプルのような個体の体液サンプルを意味し、これは、上記のように同じタイプの体液であり得るが、必ずしも同じではない。例えば、体液サンプルが、被験体の指の別の穿刺に由来するような血液の各一滴である場合、これらは、「別個の」または異なる「サンプル」である。あるいは、体液は、例えば、血液サンプルの吸引によって、被験体から採取され得る。この場合、グルコースおよびPBGを分析するための体液サンプルは採取された試料から取り出され、そして同じサンプルであると考えられる。例えば、１つより多いのPBGを分析するとき、または随意分析物（例えば、ケトン体）を測定するために、第三の、またはそれ以上の体液サンプルのような、さらなる体液サンプルが使用され得る。本発明は、単回の試験システムにおける、グルコースおよびPBGの測定を提供する。本システムは、体液サンプル中に存在するグルコースの濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含む試験デバイスを提供する。このシグナル産生システムは、グルコース試験デバイスにより産生されるシグナルに応答性の自動グルコース濃度決定手段を有する装置により読みとられる。本発明の試験システムはまた、PBG濃度を測定し得る試験デバイスを含む。非グルコース試験デバイスは、体液サンプル中に存在するPBGの濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含む。このシグナル産生システムは、PBG試験デバイスにより産生されるシグナルに応答性の自動PBG濃度決定手段を有する装置により読みとられる。単回の試験システムにおいて使用される適切な装置は、グルコース試験およびPB G試験の両方の結果を読みとり得る。随意の分析物（血糖症状態の指標となる）もまた測定される場合、対応する試験デバイスが本発明とともに使用され得る。グルコース濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含む試験デバイスは、当該技術分野で周知である。一般に、当該技術分野では、シグナル産生システムは、グルコースオキシダーゼの酵素反応を生じる試薬を含む。グルコースとグルコースオキシダーゼ酵素とが反応して過酸化水素を産生する。ペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）および酸化還元指示薬（例えば、 o-トリジン、o-ジアニシジン、3,3,5,5-テトラメチルベンジジン（TMB）、4-アミノアンチピリン、および当該技術分野で周知の他のもの）は、過酸化水素の存在下で酸化され得、着色産物を産生する。グルコース濃度の分析に使用されるシグナル産生システムのこれらまたは他の試薬を含有する試験細片は、Chenの公開欧州特許出願第0 388 782号、およびPhillipsらの米国特許第5,304,468号（これらの両方は本明細書中で参照として援用される）に記載されるような当該技術分野で周知の方法により調製され得る。好ましい実施態様において、図3aに示すように、グルコース試験デバイス15はシグナル産生システムの試薬を含有する試薬パッド18を有する。試薬パッド18は、切れ目19を有するプラスチックの支持部材16の一端に接着剤17により配置される。試薬パッド、支持部材、および接着剤の材料のさらに詳細な記載は、フルクトサミン試験デバイスの考察において以下に提供され、そしてグルコース試験デバイスに対して同様に適用され得る。必要な場合、グルコース試験デバイスは血液分離層（例えば、以下に記載されるものかまたは当該技術分野で周知の他のもの）をさらに含み得る。さらに、必要に応じて、他のさらなる層（例えば、干渉除去層、放射層、または当該技術分野で公知の以下に記載されるその他のもの）が付加される。上記のように、本発明の試験システムはまた、PBG濃度を測定し得る試験デバイスを有する。非グルコース試験デバイスは、体液サンプル中に存在するPBGの濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含む。シグナル産生システムは、PBG試験デバイスにより産生されるシグナルに応答性である自動PBG濃度決定手段を有する装置により読みとられる。シグナル産生システムおよびPBGに応答してシグナルを産生するために使用される試薬は、測定されるPBG分析物に依存する。１つの実施態様において、PBG試験デバイスは体液サンプル（特に血液）中の糖化ヘモグロビン濃度を測定し得る２つの試験細片を含む。この実施態様は図５に例示される。図５を参照して、両試験細片31および32はともに、溶血剤33を含有する層を有する。この溶血剤は赤血球を溶解し得、それによりヘモグロビンを遊離させる。次いで、試験細片31において、溶血物を、糖化ヘモグロビン結合層 34に通過させる。溶血物中に含まれる任意の糖化ヘモグロビン、または「糖ヘモグロビン」が層34に結合し、一方、全ての非糖化ヘモグロビンは読みとり領域35 まで通過する。試験細片32には、糖化ヘモグロビン結合層は存在せず、そして糖化ヘモグロビンおよび非糖化ヘモグロビンを含む溶血物（以下、「全ヘモグロビン」と称する）は直接読みとり領域に通過する。試験デバイスのこの実施態様において、糖化ヘモグロビンの量は、試験細片31 および32を読みとり、そしてこの２つの差異を決定し得る適切な装置を用いて計算され得る。糖化ヘモグロビンの量は、試験細片32の結果（全ヘモグロビン）から試験細片31から得られた結果（全ヘモグロビンから糖化ヘモグロビンを引いたもの）を減ずることにより計算され得る。層33において使用される溶血剤は、ヘモリジンまたは溶血について当該技術分野で周知の化学的試薬であり得、これらは、試験細片中の層上に含有される場合、赤血球と反応性である。溶血試薬の例として、例えば、サポニンまたは種々の界れる。糖化ヘモグロビン結合層は、例えば、Mezeiの米国特許第4,478,744号、Wagner らの同第4,806,468号、Cohenの同第5,183,739号、およびZeuthenらの同第5,206, 144号に記載されるような、糖ヘモグロビンに対する抗体であり得る。これらの特許の各々は本明細書中で参照として援用される。あるいは、糖化ヘモグロビン結合層は、糖ヘモグロビンに結合することが周知であり、そして、アフィニティークロマトグラフィーに一般に使用される材料を含み得、このような材料としては、例えば、フェニルボロン酸（例えば、m-アミノフェニルボロン酸、および以下に記載される他のものを含む：例えば、Deanの米国特許第4,269,605号およびR osenthalらの同第5,284,777号、これらの各々は本明細書中で参照として援用される）が挙げられる。フェニルボロン酸はグルコース修飾ヘモグロビンのシス- ジオール基に結合し、可逆的な五員環複合体を形成する。ボロン酸は、アガロースまたはセルロースマトリックスを介して、または当該技術分野で周知の他の方法および材料（例えば、上記で特定した特許に記載されるようなもの）により試験細片の層に結合され得る。ヘモグロビンは、単純にヘモグロビンの色を416nm、542nm、または576nmで読みとることにより、読みとり領域においてモニターされ得る。従って、PBG（例えば、ヘモグロビン）濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムは、PBGの直接の測定を含む。さらに、ヘモグロビン濃度は、多数の他の公知のヘモグロビン測定方法のいずれかにより決定され得る。これらの方法は、フェリシアン化カリウムおよびチオシアン酸カリウムとの反応を包含し、これらは、ヘモグロビンを酸化してメトヘモグロビンを形成し、そしてこれを複合体化して531nmで測定され得る着色チオシアン−メトヘモグロビンを形成する。他の公知の方法は、クメンヒドロペルオキシドおよびテトラメチルベンジジンとのヘモグロビンの反応である。ヘモグロビンは、660nm、または890nmの近赤外部のいずれかで測定され得る着色産物を産生する反応を触媒するペルオキシダーゼとして機能する。別の実施態様において、PBG試験デバイスは、糖化アルブミンレベルを測定する試験細片からなる。この実施態様は、上記の実施態様において糖化ヘモグロビンの測定のために使用されるものと類似の技術を使用し得る。ここで、糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンの両方を含む全アルブミンは、一方の試験細片上で測定され、そして別の試験細片上で、全アルブミンから糖化アルブミンを引いたものが決定される。再度、２つの試験細片間の差異が、目的の糖化タンパク質の量を提供する。糖化アルブミンを測定するための試験デバイスをより詳細に説明するために、ここで図６を参照する。図６に示すように、試験細片36および37の両方の第１層は、血漿または血清を分離する血液分離層38である。この分離層は、以下の実施例で記載されるものまたは当該技術分野で周知の他のものと同様であり得る。次いで、分離された血漿は、例えば、両方の細片に存在し、そして易動性標識抗アルブミンを含む次の層39に入る。この層からの標識アルブミン抗体は、サンプル中に存在する糖化アルブミンおよび非糖化アルブミンの両方に結合し、次いで結合体として次の層である固定化アルブミン層40に拡散する。アルブミンに結合しない層39からの遊離の易動性標識抗体は、層40に拡散し、そしてここに含まれるアルブミンに固定化される。試験細片36において、アルブミンと標識抗アルブミンとの結合体が、次いで、糖化アルブミン結合層41に通過し、ここでは糖化アルブミンを含む結合体のみが結合される。試験細片36中の標識抗アルブミンと非糖化アルブミンとの結合体は、全アルブミンから糖化アルブミンを引いたものを示す測定のために読みとり領域42に拡散する。試験デバイスの試験細片37は、糖化アルブミン結合層を含まず、従って試験細片37の読みとり領域42は全アルブミンの指標である。糖化アルブミンの量は、試験細片37の結果（全アルブミン）から試験細片36から得られる結果（全アルブミンから糖化アルブミンを引いたもの）を減ずることにより計算され得る。糖化アルブミンを測定するための上記の実施態様および糖ヘモグロビンの実施態様は、本明細書中で参照として援用される米国特許第4,446,232号においてLio ttaらにより教示されるもの（特に、易動性標識抗体および固定化リガンドの使用）に類似する技術および原理を利用し得る。本発明の易動性標識抗アルブミンは、例えば、Liottaにより教示されるような酵素で標識され得る。このような酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphate）、およびβ-ガラクトシダーゼ、ならびに色素または他のシグナルを生じるために有用な当該技術分野で周知の他の酵素が挙げられる。あるいは、ゾル粒子（例えば、ゴールドゾル、ラテックス、または当該技術分野で周知のシグナルを産生し得る他の標識）のような他の標識が使用され得る。糖化アルブミン結合層は、例えば、抗アルブミンに結合した糖化アルブミンの結合体に特異的な抗体であり得る。あるいは、糖化アルブミン結合層は、糖化タンパク質に結合することが周知である材料（例えば、上記ならびにDeanの米国特許第4,269,605号およびRosenthalら、同第5,284,777号（これらの各々は本明細書中で参照として援用される）に記載されるフェニルボロン酸）を含み得る。上記のように、フェニルボロン酸はグルコース修飾タンパク質のシスジオール基に結合し、可逆的な五員環複合体を形成する。ボロン酸は、アガロースまたはセルロースマトリックスを介して、または当該技術分野で周知の他の方法および材料（例えば、上記で特定した特許に記載されるようなもの）により試験細片の層に結合され得る。なお別の実施態様において、PBG試験デバイスは、フルクトサミン濃度を分析するための多層試験デバイスである。多層試験デバイスは、発色性色素を包含する特定の色素、または蛍光試薬のような、フルクトサミンにより還元され得る指示薬であるシグナル産生システムを含む。多層試験デバイスは、以下および米国特許出願番号第08/269,351号（本明細書中で参照として援用される）により完全に記載される。フルクトサミン多層試験デバイス多層：多層試験デバイスの層は互いに隣接して配置され、その結果それらは液連絡を提供する。隣接する層間の液の流れは、垂直方向または側面方向のいずれかであり得る。従って、多層デバイスの層は重ねられ得るか、または並置され得る。試験デバイスの種々の多層は、緩衝液または指示薬のような目的のアッセイ試薬を含む。目的の試薬は、層中に含浸され得るか、または層中若しくは層上にコートされ得るか、または層に共有結合され得る。本明細書で記載される、緩衝液層、指示薬層、および任意の付加的な層を含む、種々の層のための材料は、目的のアッセイ試薬を含有し得るが、フルクトサミン分析物および他の重要なアッセイ試薬および液体に対して透過性である多孔性マトリックスを含む。透過性は、一般に、多孔度、膨潤能力、または任意の他の特性から生じる。試験デバイス層は、セルロース、紙、羊毛、フェルト、織物などのような種々の多孔性の繊維材料を含み得る(例えば、米国特許第3,802,842号；第3,809,605号；および第3,897,214号を参照のこと。これらすべては参考として本明細書に援用される)。あるいは、試験デバイス層は、微細孔性ポリマーのような、多孔性の、非繊維性材料を含み得る(例えば、本明細書で参考として援用される米国特許第3,552,929号を参照のこと)。これらの層のために用いられ得る適切な材料の特定の例は、３mm濾紙のような濾紙（Whatman，Maidenstone，En gl Y）を含む。緩衝液または指示薬のようなアッセイ試薬を含む多層は、同時にまたは連続的に組み立てられ得る。まず、所定の層の多孔性材料を、緩衝液または指示薬溶液のようなアッセイ試薬の溶液中に置く。乾燥後、層は、それが多層試験デバイス中で使用されるまで、デシケーターキャビネット中に保存され得る。多層は、一般に、以下により完全に説明されるように、１つの支持部材上に取り付けられるか、または２つ以上の支持部材の間に挟まれる試薬パッド(pad)の形態である。多層パッドは、環状または矩形のような任意の幾何学的形状であり得、そして通常、周囲がほぼ0.5〜20mm、好ましくは１〜10mmであり、そして互いに重ねられるかまたは並置されるかのいずれかで配置される。多層の配置に関わらず、本発明においてフルクトサミンを分析するために使用され得る試験デバイスは、基礎構成部分として、緩衝液層、指示薬層を含み、そして以下に記載するように、付加的な層を含み得る。緩衝液層：緩衝液層13は、少なくとも９のpH値を有する緩衝液を含む。種々の公知のタイプの緩衝液が、その緩衝液がフルクトサミンがそれらのエネアミノール形態に転換されるような十分に高いpHを提供する限り、緩衝液層中に含まれ得る。これを達成するために、緩衝液のpHは、約９と約13との間のpH値であるべきであり、そして最適結果のためには、pHは、10と12との間のpH値である。このような緩衝液の例は、リン酸水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、水酸化ナトリウム、グアニジニウム塩、特定のアミノ酸、および当該技術分野で周知の他の適切な緩衝液、またはそれらの組み合わせを含む。緩衝液層が指示薬層の上に重ねられる場合、それは一般に、不透明でない(non-opaque)液体透過性材料である。指示薬層：指示薬層14は、発色性色素を包含する特定の色素、または蛍光試薬のような、フルクトサミンにより還元され得る任意の指示薬を含む。液体サンプル中に存在するフルクトサミンの量に基づいて色を変化させる適切な発色性色素の例として、ネオテトラゾリウムクロライド(NT)、テトラニトロブルーテトラゾリウムクロライド(TNBT)、ブルーテトラゾリウムクロライド(BT)、ヨードニトロテトラゾリウムクロライド、ニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT)、ニトロブルーモノテトラゾリウムクロライド、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロマイド(MTT)、テトラゾリウムバイオレット、2,3,5-トリフェニル-2-H-テトロゾリウムクロライド、チオカルバミルニトロブルーテトラゾリウムクロライド (TCNBT)、テトラゾリウムXTT(XTT)、2-2'-ベンゾチアゾリル-5-スチリル-3-(4'- フタルヒドラジジル)テトラゾリウムクロライド(BSPT)、ジスチリルニトロブルーテトラゾリウムクロライド(DSNBT)のようなテトラゾリウム色素が挙げられる。適切な蛍光試薬の例は、5-シアノ-2,3-ジトリルテトラゾリウムクロライド(CT C)である。付加的な層：緩衝液層および指示薬層に加えて他の層が、フルクトサミン試験デバイスにおいて用いられ得る。例えば、多層試験デバイスは、緩衝液層パッドの前に赤血球(RBC)分離層（単数または複数）を、例えば、図２の部材８および９に示すように、ならびに実施例に記載のように、RBC成分を分離する目的で含み得る。その他の有用な層は、限定されないが、本明細書に参考として援用される米国特許第4,050,898号および第4,042,335号に記載されるような、放射線遮断層、干渉除去層（界面活性剤、キレーター、酸化防止剤、または正確な結果を妨害し得る他の物質を含み得る）、汚染防止層、透析層、濾過層、支持層などを含む。多層の支持：多層を保持する支持部材(単数または複数)は、光またはその他のエネルギーに対して不透過性、反射性、または透明であり得る。支持部材は、意図される分析モードおよび用いられる指示薬(例えば、発色性または蛍光指示薬)に適合する。支持部材に用いられ得る材料は、種々のプラスチックおよびポリマー（例えば、セルロースアセテート、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、およびポリスチレン）を含む。一般に、このような材料が用いられる場合、支持部材は実質的に平面状である。これらの層はまた、層をそれらを適正な向きに保持するプラスチック容器中に収容され得るか、またはそれらは、ICONデバイス(Hybritech，Inc.，SanDiego，CA)のような、当該技術分野で公知の他の材料中に収容され得る。多層デバイスは、必要に応じて検出孔を有する少なくとも１つの支持部材を有する。本明細書で用いる語句「必要に応じて検出孔を有する」は、１つの支持部材が透明である場合検出孔の必要がなく、その一方不透明支持部材を備える場合検出孔が必要でありそして存在することを意味する。検出孔は、指示薬層上の色変化または蛍光を観察するための穴である。一般に、孔のサイズは、多層のサイズより小さく、そしてそのサイズは層または層パッドのサイズに依存する。孔のサイズは、一般に0.5mm〜20mmであり、好ましくは1mmと10mmとの間である。底部支持部材上の検出孔の位置は、多層が重ねられるかまたは並置されるかに依存する。多層が重ねられる場合、検出孔はすべての多層の下である。多層が並置される場合、検出孔は指示薬層または他の最終層の直ぐ下のみにある。１つの支持部材のみが用いられる場合、液体サンプルは、第１の多層に直接適用され得る。液体サンプルは、自由に透過し、そして緩衝液層および存在する任意の付加的な層中に拡散および流れ込み、そしてフルクトサミン濃度が決定され得るように指示薬層に移動する。上記のように１つの支持部材のみが必要であり得るが、さらなる支持部材が用いられ得る。２つ以上の支持体が用いられる場合、多層は、サンプル孔を有する第１の支持部材と、必要に応じて検出孔を有する第２の支持部材との間に挟まれる。検出孔と同様に、サンプル孔は、一般に多層のサイズより小さいサイズであり、そしてそのサイズは、層または層パッドのサイズに大部分依存する。孔サイズは、一般に0.5mm〜20mmであり、好ましくは1mmと10mmとの間である。２つ以上の支持部材は、接着剤のような固定手段により一緒に保持され得る。用いられ得る接着剤の例として、ゼラチン、ゴム、シリコーン、およびアクリレートベース接着剤が挙げられる。さらに、プラスチックのハウジングが、当該技術水準で一般的であるように、超音波溶接またはスナップ止めで一緒にはめ込まれ得る。フルクトサミン濃度の決定に使用される多層試験デバイスの１つの実施態様を図２に示す。図２を参照して、この実施態様は、サンプル孔６を有する外部の第１のプラスチック製の実質的に平面の支持部材１、および検出孔11および溝12を有する外部の第２のプラスチック製の実質的に平面の支持部材５を有する。この実施態様は、液連絡のための穴７を有するさらなる支持部材２、３、および４を含む。さらなる支持部材は、続く実施例でより完全に記載されるように、全血分離層８、９、および10を収容する。外部の第２の支持部材５により、約10と約12 との間のpH値を有する緩衝液を含有する不透明でない液透過性の緩衝溶液層パッド13が支持され、これは、ニトロブルーテトラゾリウム色素を含有する指示薬層パッド14の上に重ねられる。測定される分析物を含有する体液サンプルは、上記のように、測定可能なシグナルを産生するような特定の様式で分析物と相互作用するように設計された試薬を含有する適切な試験デバイスに適用される。体液サンプルを適切な試験デバイスに適用した後、体液サンプル中のグルコース濃度またはPBG濃度が、図４で例示されそして以下でより完全に記載されるような装置で決定され得る。装置は、各々の試験デバイスのシグナル産生システムとグルコースおよびPBGとの反応より産生されるシグナルに応答性である、自動グルコースおよびPBG濃度決定手段を有する。装置はまた、自動決定手段に連結したディスプレイ手段および自動決定手段と接続した受容口を有する。本発明は家庭環境において有利に使用されるために、装置および試験は携帯可能であるべきである。例えば、試験システムにおいて使用される装置はバッテリー作動性であり得る。単回の試験システムにおいて使用される適切な装置は、グルコース試験および PBG試験の両方の結果を読みとり得、それにより「血糖症測定装置（glycemic me asurlng apparatus）と呼ばれる。このような装置は、試験のシグナル産生システムおよび産生されるシグナルに応答性である自動決定手段に依存する仕様で構成される。例えば、自動濃度決定手段または読み出しが色産生である場合、装置は分光計である決定手段を含み得る。本発明とともに使用され得る他の分光光度計は、例えば、蛍光、吸光度、または透過率を測定し得る。読み出しが電気化学的である場合、小型電極システムが使用され得る。例えば、グルコースを電気化学的に測定する方法（例えば、Higginsら、米国特許第4,545,382号、Parksら、米国特許第4,999,582号、およびWhite、米国特許第5,243,516号により教示される（これらは、本明細書中で参考として援用される））が当該分野で周知である。１つより多くの自動決定手段が装置に存在し得る。例えば、グルコース濃度の測定のために電極が装置内に存在し得、そしてフルクトサミン濃度を測定するために反射分光計がまた装置内に存在し得る。グルコースおよびフルクトサミンを測定するための反射分光計の詳細な記載は、以下に示す。しかし、グルコースおよび糖化タンパク質の両方を測定し得る他の装置が構成され得る。血糖症測定装置において、適切な自動グルコースおよびPBG濃度決定手段（例えば、適切なソフトウェアを備える反射分光計）は、適切な時間に特定の部位における反射を自動的に読みとり、反射変化率を計算し、そして較正係数を使用して血液サンプル中の分析物レベルを出力するように作製され得る。このようなデバイスを図3bの概略的に示す。ここで、本発明の試験デバイスが測定され得る。光源21（例えば、高強度発光ダイオード(LED)）は、試験デバイス15の読みとり域上に光線を投射する。この光の一部は読みとり域から拡散的に反射し、そして光検出器22（例えば、受容した光に比例して出力周波数を生じる光−周波数変換器）により検出される。所望される場合、光源21および／または検出器22は、光の特定の波長を生じるか、またはその波長に対して反応するように適合され得る。光源は、多色性（po lychromatic）であり得、そして光検出器は２つ以上の異なる波長を測定し得る。あるいは、またはこれらに加えて、血糖症測定装置は２つ以上の異なる波長の光を放射し得る２つ以上のLED源を有し得る。例えば、好ましい実旋態様において、装置は、２つのLED源（ともにStanley Electoronic Company(Irvine，CA) による、MPG3368Sおよび4VR3368Sと同定）を有する。市販の光−周波数変換器は、Texas Instruments（Houston，TX）により作製され、そしてTSL235と同定され、そして好ましい成分がTSL230であるものを含む。検出器22の出力は、データを処理するためにマイクロプロセッサー24によって処理される。マイクロプロセッサー24は以下の制御機能を提供し得る：(1)完全なシステムのための作動周期調節機能；(2)光−周波数変換器への周波数データを処理する機能；(3)記憶された反射率から分析物レベルを計算する機能；および(4)分析物濃度データをディスプレイ23に出力する機能。DS5000T（Dallas Sem iconductor Company(Dallas，TX)による）のような多くのマイクロプロセッサーが使用され得る。メモリー回線25が、データおよびマイクロプロセッサー操作プログラムを記憶し得る。ディスプレイ手段23は、種々のハードコピーおよびソフトコピーの形態をとり得る。通常これは、液晶（LCD）またはLEDディスプレイのような視覚的表示であるが、テーププリンター、可聴シグナルなどであり得る。計器はまた、開始−停止スイッチを含み、そして所望される場合は、サンプルの適用、読みとり中であることなどを示すための可聴または可視の時間出力を提供し得る。他の測定方法は可能であるが、以下の方法が所望の結果を提供した。作動周期調節が開始された後、特定の間隔で読みとりが行われる。間隔は、どの濃度が測定されているかに依存して変化し得る。例えば、PBG間隔は15秒毎であり得るが、グルコース読みとりは５秒毎であり得る。測定は、短時間LEDに電力を供給することにより行われる。この時間期間で、反射光は、光−周波数変換器により周波数に変換される。この変換は、光−周波数変換器により生じるパルス持続時間を計数することによりマイクロコンピューターによりモニターされる。これらの生の反射読みとりは、出力パルス持続時間の総数で定義される。次いで、この総数を、グルコースまたはPBGの濃度を計算するためにマイクロプロセッサーにより行われる計算に使用する。血糖症測定装置はまた、環境温度および温度変化を感知する温度センサーを有する。このセンサーは試験反応度における温度依存的変化を説明するために特に有用である。環境温度および温度変化を十分にモニターし得るデジタル温度計が使用され得る。Dallas Semiconductor温度センサーDS1620がこの適用のために有用であることが分かっている。温度センサーに関する上述のように、本発明を用いるグルコースおよびPBGの分析は、環境温度または室温（約20℃）で行われ得る。驚くべきことであり、かつ予期されなかったことに、環境温度で、かつ反応促進物質を使用しない場合でさえ、本発明は約５分以内、そしてさらに約４分以内という短時間で、そして好ましくは以下の実施例に示されるように約３分以内でフルクトサミン濃度レベルを分析し得る。先行技術は、反応促進物質または上昇させた温度のいずれかを使用する。例えば、米国特許第4,956,301号に記載されるIsmailの乾燥層フルクトサミンアッセイは、環境温度においてフルクトサミンレベルを分析するために反応促進化合物の使用を必要とする。本明細書中で使用するように、「反応促進物質」は、フルクトサミンアッセイ反応を促進する目的のみのために添加される任意の化合物を意味する。このような化合物は、一般に、フルクトサミンアッセイの反応速度を加速する非イオン性界面活性剤および有機溶媒である。約５分以内でフルクトサミンを分析する本発明の方法は、このような反応促進物質の使用を使用しない。さらに、上記のように、フルクトサミンアッセイを促進する先行技術の方法では、上昇させた温度がまた使用される。例えば、公開欧州特許出願第0,473,109 号に記載されるフルクトサミンを分析するためのSakamotoの多層分析エレメントは、Stanifordらの米国特許第5,370,990号に記載されるフルクトサミンアッセイを行うと同様に、37℃〜40℃程度の上昇させた温度を必要とする。本発明においては、約５分以内で完全なフルクトサミン分析を達成するためには、上昇させた温度は必要ではない。以下の実施例は例示を意図するものであるが、本発明の限定を意図しない。実施例Ｉ本実施例は、全血サンプルを用いるタンパク質結合グルコース、フルクトサミンの調製および試験を提供する。フルクトサミン試験デバイスの調製フルクトサミン試験デバイスの血液分離部分 Tetkoメッシュ#7-280/44（Tetko，Inc．Rueschlikon，Switzerland）を１％ P luronic（Pragmatics，Inc.，Elkhart，IN）の界面活性剤溶液中に１分間置いた。過剰の界面活性剤を除去し、そしてメッシュを60℃で10分間加熱することにより乾燥した。メッシュを乾燥したプラスチックバッグ中で使用するまで保存し、使用時に支持部材２上の多層試験デバイス中に3/16"円形を置いた（図２）。 00μg/mlのポテトレクチン(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)を含有するリン酸緩衝化生理食塩（PBS）溶液中に１分間置いた。過剰の溶液を取り除き、そして膜を40℃で60分間乾燥した。乾燥後、血液分離層膜を乾燥したプラスチックバッグ中で保存した。使用時に、膜の５つの3/16"円形を支持部材２、３、および４の間の多層試験デバイス中に置いた（図２）。 0.4μm孔サイズの未処理のポリカーボネート膜（Corning Coster，Cambrige， MA）を１cm四方にカットし、そして3/16"開口部（opening）を覆っているプラスチックの支持部材４の底に接着させた。フルクトサミン試験デバイスのシグナル産生部分緩衝液層パッド： Schleicher and Schuell型 589濾紙（Keene，N.H.）を、１％のPluronic界面活性剤（Pragmatic Inc.，Elkhard，IN）を含有するpH 11.5 の炭酸グアニジニウム緩衝液(Sigma Chemical Co.，St．Louls，MO)の1.0モル濃度（molar）溶液中に１分間置いた。過剰の緩衝液を取り除き、そして濾紙を60 ℃で30分間乾燥した。乾燥後、緩衝液層濾紙をデシケーターキャビネット中に保存した。使用時に、3/16"円形の緩衝液濾紙をプラスチックの支持部材５に置いた。指示薬層パッド： Ahlstrom A131ラス繊維（Ahlstrom Filtration Inc.，Mt ．Holly Spring，PA）を、５ミリモル濃度のニトロブルーテトラゾリウムクロライド(NBT)(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)の水溶液中に１分間置いた。過剰のNBTを除去し、そしてガラス繊維を60℃で30分間乾燥した。乾燥後、ガラス繊維を暗所で保存した。使用時に、3/16"円形のNBTガラス繊維をプラスチックの支持部材５上に置いた。支持部材５つの白色のポリスチレン製の実質的に平面状の細片（LXN Corp.，Irvine，C A）を使用した。底部細片５は、細片の底部に接着した0.002インチの厚さのポリエチレン製ウィンドウ（window）で覆われた１mm×７mmの溝を伴う3/16"の直径の開口部を有していた。中間の３つの細片２、３、および４は、各細片の底部に接着された3/16インチの直径の開口部を有していた。上部細片１は、細片の底部に接着剤を有する1/8インチの直径の開口部を有していた。多層フルクトサミン試験デバイスの組み立て試験デバイスの血液分離部分およびデバイスのシグナル産生部分を、図２に示すように組み立てた。メッシュ層を、互いに接着させた３つのプラスチック製の着させたプラスチック製支持部材の上部に置いた。１cm四方のポリカーボネートを３つの接着させたプラスチック製支持部材の底部側に接着させた。１つの緩衝液層パッドを、底部のプラスチック製支持部材の開口部において１つのNBT指示薬層パッドの上に重ね、そしてこれを、このプラスチック製支持部材の底部に接着させたウィンドウにプレスした。緩衝液層および指示薬層を含むプラスチックの支持部材を、ポリカーボネート膜の下に重ねられ、そしてプラスチック製の支持部材４の底部に接着剤で接着された緩衝液層パッドを有する血液分離部分に接着した。全血サンプル中のフルクトサミンの分析糖化されたヒト血清糖化アルブミン（G-HSA）を、0.5モル濃度のグルコースを含有する20mlのPBS中で、３グラムのHSA（Sigma Chemical Co．St．Louis，MO）を45℃で14日間インキュベートすることにより調製した。G-HSAを未反応グルコースからPBS中のBio-Gel P-10樹脂カラムを溶出することにより分離した。単一の個体由来の全血サンプルを等量のPBSまたは６ミリモル濃度のフルクトサミンを含有するG-HSAのサンプルのいずれかと混合した。全血サンプルはそれ自体が2ミリモル濃度のフルクトサミンを含有するので、３つのサンプルはそれぞれ１、２、および４ミリモル濃度のフルクトサミンを含有した。15マイクロリットルの各サンプルを上記のようにフルクトサミン多層試験デバイスで試験した。サンプルの添加後、試験デバイスを上記のような血糖症測定装置内に置き、そして反射率を555nmで３分間モニターした。２分から３分における反射率（▲K/S ）の変化は、以下の結果をもたらした。結果から見られ得るように、血液サンプル中のフルクトサミン濃度が増加するにつれて、反応速度が増大した。実施例II 本実施例は、全血サンプルを用いた迅速なグルコース試験の調製および試験を提供する。グルコース試験細片の調製含有する溶液に浸した：ゼラチン-150 Bloom 0.5ｇグルコースオキシダーゼ 0.285ｇ西洋ワサビペルオキシダーゼ 0.133ｇクエン酸 0.593ｇクエン酸ナトリウム 2.61ｇ蒸留水 32 ml 浸した後、シートをオーブンで56℃で20分間乾燥した。次いでシートを以下を含有する溶液に浸した：イソプロピルアルコール 39.5 ml 3,5,3',5'-テトラメチルベンジジン 0.2ｇオルト-トリジン 0.2ｇ Pluronic L64（20%） 0.5ml 浸した後、シートを56℃でさらに20分間乾燥した。図3aは、グルコース試験デバイス19の構成を示す。上記のグルコース試験膜18を１cm四方にカットし、そして接着剤17で５mmの穴20および三角形の切れ目19を有するプラスチック製ホルダー16に接着した。血液サンプルを５mmの穴20に適用した。サンプルは膜を湿らせ、そして反応して、血液サンプル中のグルコースに比例して色を生じた。血液サンプル中のグルコースの分析多様な濃度のグルコースを血液サンプルに添加した。各サンプルの１滴をグルコース試験細片に添加し、そして反射率（▲K/S）を、血糖症測定装置で上記のように45秒で測定した。以下の結果が得られた：グルコース濃度（mg/dL） 45 秒における▲K/S 82 0.198 208 1.380 339 2.347 430 3.270 657 4.373 データは、生じた色が血液サンプル中のグルコース濃度に比例したことを示す。本発明を開示した実施態様に関して記載したが、詳細に記載された特定の実施例が本発明を例示するのみであることは、当業者に容易に認識される。本発明の思想を逸脱することなく種々の改変がなされ得ることを理解すべきである。従って、本発明は、以下の請求項によってのみ制限される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ホブリッツェル，タレイアメリカ合衆国カリフォルニア 92119, サンディエゴ，ハイウッドドライブ 8894−ビー (72)発明者ネイヤー，ゲブハードアメリカ合衆国カリフォルニア 90019, ロサンジェルス，ウェリントンロード 1730

Claims

【特許請求の範囲】１．単回の試験システムを用いて被験体の統合された血糖症状態を決定する方法であって： (a) 被験体由来の全血サンプル中のグルコース濃度を測定する工程； (b) 該被験体由来の全血サンプル中のタンパク質結合グルコース濃度を測定する工程であって、ここで、該グルコース濃度は即時の血糖症状態の指標であって、そしてここで、該タンパク質結合グルコース濃度は中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である、工程；および (c) 必要に応じて、該被験体由来の全血サンプル中の血糖症状態の指標である別の分析物の濃度を測定する工程を包含する、方法。２．単回の試験システムを用いて被験体の統合された血糖症状態を決定する方法であって： (a) 被験体由来の未処理の体液サンプル中のグルコース濃度を測定する工程； (b) 該被験体由来の未処理の体液サンプル中のタンパク質結合グルコース濃度を測定する工程であって、ここで、該グルコース濃度は即時の血糖症状態の指標であって、そしてここで、該タンパク質結合グルコース濃度は中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である、工程；および (c) 必要に応じて、該被験体由来の未処理の体液サンプル中の血糖症状態の指標である別の分析物の濃度を測定する工程を包含する、方法。３．前記タンパク質結合グルコースが中期間の血糖症状態を示すフルクトサミンである、請求項２に記載の方法。４．前記タンパク質結合グルコースが、総糖化ヘモグロビン、およびヘモグロビンA_1c（HbA_1c）、長期間の血糖症状態の指標であるいずれものタンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。５．前記タンパク質結合グルコースが、総糖化血清タンパク質および糖化アルブミン、中期間の血糖症状態を示すいずれものタンパク質からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。６．１つより多くのタンパク質結合グルコースが測定される、請求項２に記載の方法。７．工程２(a)の前記未処理の体液サンプルおよび工程２(b)の前記未処理の体液サンプルが全血である、請求項２に記載の方法。８．工程２(a)の前記未処理の体液サンプルおよび工程２(b)の前記未処理の体液サンプルが別個の体液サンプルである、請求項２に記載の方法。９．必要に応じて工程２(c)で測定され得る血糖症状態の指標である別の分析物が、ケトン体、脂肪酸誘導体、およびミクロアルブミンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。１０．前記ケトン体が、アセトン、β-ヒドロキシブチレート、アセトアセテートからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。１１．工程２(a)のグルコース濃度を測定する前記工程が： (a) 未処理の体液サンプル中に存在するグルコースの濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含有する試験デバイスを提供する工程； (b) 該未処理の体液サンプルを該試験デバイスに適用する工程；および (c) 自動グルコース濃度決定手段を有する装置を用いて該試験デバイスに適用される該未処理の体液サンプル中に存在するグルコースの濃度を決定する工程であって、該自動グルコース濃度決定手段は工程１１(a)で産生されるシグナルに応答性であり、該装置はさらにディスプレイ手段に連結された該自動決定手段を有し、そしてさらに該自動決定手段と接続した受容口を有する、工程を包含する、請求項２に記載の方法。１２．工程２(b)のタンパク質結合グルコース濃度を測定する前記工程が： (a) 未処理の体液サンプル中に存在するタンパク質結合グルコースの濃度をシグナル化し得るシグナル産生システムを含有する試験デバイスを提供する工程； (b) 該未処理の体液サンプルを該試験デバイスに適用する工程；および (c) 自動タンパク質結合グルコース濃度レベル決定手段を有する装置を用いて該試験デバイスに適用される該未処理の体液サンプル中に存在するタンパク質結合グルコースの濃度を決定する工程であって、該自動タンパク質結合グルコース濃度レベル決定手段は工程１２(a)で産生されるシグナルに応答性であり、該装置はさらにディスプレイ手段に連結された該自動決定手段を有し、そしてさらに該自動決定手段と接続した受容口を有する、工程を包含する、請求項２に記載の方法。１３．単回の試験システムを用いて被験体の統合された血糖症状態を決定する方法であって： (a) 被験体由来の未処理の体液サンプル中のグルコース濃度を測定する工程； (b) 該被験体由来の未処理の体液サンプル中のタンパク質結合グルコース濃度を測定する工程であって、ここで、該グルコース濃度は即時の血糖症状態の指標であって、そしてここで、該タンパク質結合グルコース濃度は中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である、工程；および (c) 該被験体由来の未処理の体液サンプル中の血糖症状態の指標である別の分析物の濃度を測定する工程を包含する、方法。１４．単回の試験システムを用いて被験体の糖尿病を診断する方法であって： (a) 被験体から少なくとも１つの未処理の体液サンプルを得る工程； (b) 該被験体由来の未処理の体液サンプル中のグルコース濃度を測定する工程であって、ここで該グルコース濃度が即時の血糖症状態の指標である、工程； (c) 該被験体由来の未処理の体液サンプル中のタンパク質結合グルコース濃度を測定する工程であって、ここで該タンパク質結合グルコース濃度が中期間または長期間のいずれかの血糖症状態の指標である、工程；および (d) 工程１４(b)からの測定されたグルコース濃度および工程１４(c)からの測定されたタンパク質結合グルコース濃度を、正常被験体のグルコース濃度レベルおよびタンパク質結合グルコース濃度レベルと比較する工程からなり、ここで該正常被験体レベルよりも上昇したグルコース濃度およびタンパク質結合グルコース濃度が、糖尿病の診断学上の特徴となる、方法。１５．工程１４(a)の少なくとも１つの未処理の体液サンプルが全血である、請求項１４に記載の方法。１６．被験体の統合された血糖症状態を決定するための単回の試験システムであって： (a) グルコース濃度を測定する手段； (b) タンパク質結合グルコース濃度を測定する手段；および (c) 必要に応じて、血糖症状態の指標である別の分析物の濃度を測定する手段からなる、試験システム。１７．工程１６(a)のグルコース濃度を測定するための前記手段が： (a) 被験体由来の未処理の体液サンプル中に存在するグルコースの濃度をシグナル化し得るシステムを含有する、試験デバイス；および (b) 該試験デバイスを受容し得る受容口を有し、そして該受容口に連結された、工程１７(a)で産生されたシグナルに応答性である自動グルコース濃度決定手段をさらに有する装置であって、該装置はさらに該自動決定手段に連結されたディスプレイ手段を有する、装置を含む、請求項１６に記載の試験システム。１８．前記シグナル産生システムがグルコースオキシダーゼ酵素反応を生じる試薬を含む、請求項１７に記載の試験システム。１９．前記自動決定手段が分光光度計である、請求項１７に記載の試験システム。２０．前記分光光度計が、反射率、蛍光、吸光度、および透過率からなる群から選択されるものを測定する、請求項１９に記載の試験システム。２１．前記自動決定手段が電気化学的センサーである、請求項１７に記載の試験システム。２２．工程１６(b)のタンパク質結合グルコース濃度を測定するための前記手段が： (a) 被験体由来の未処理の体液サンプル中に存在するタンパク質結合グルコースの濃度をシグナル化し得るシステムを含有する、試験デバイス； (b) 該試験デバイスを受容し得る受容口を有し、そして該受容口に連結された、工程２２(a)で産生された該シグナルに応答性である自動タンパク質結合グルコース濃度決定手段をさらに有する装置であって、該装置はさらに該自動決定手段に連結されたディスプレイ手段を有する、装置を含む、請求項１６に記載の試験システム。２３．前記自動決定手段が分光光度計である、請求項２２に記載の試験システム。２４．前記分光光度計が、反射率、蛍光、吸光度、および透過率からなる群から選択されるものを測定する、請求項２３に記載の試験システム。２５．前記タンパク質結合グルコースがフルクトサミンであり、そして前記シグナル産生システムを含有する前記試験デバイスが： (a) 少なくとも９のpH値を有する緩衝液を含有する液透過性緩衝液層； (b) フルクトサミンにより還元され得る指示薬を含有する指示薬層；および (c) 必要に応じて検出孔を有する支持部材；を含有し、ここで、該緩衝液層は該指示薬層に隣接し、そして該緩衝液層および該指示薬層は支持部材によって支持される、請求項２２に記載の試験システム。２６．前記シグナル産生システムを含有する前記試験デバイスが、前記緩衝液層と液接触して１つ以上の付加的な層をさらに含む、請求項２５に記載の試験システム。２７．前記付加的な層が、血球分離層、放射線遮断層、干渉除去層、汚染防止層、透析層、濾過層、および支持層からなる群から選択される、請求項２６に記載の試験システム。２８．前記付加的な層がサンプル孔を有する付加的な支持部材であり、そして前記緩衝液層および前記指示薬層が該支持部材の間に配置される、請求項２７に記載の試験システム。２９．前記緩衝液層が色素層の上に重ねられる、請求項２８に記載の試験システム。３０．前記緩衝液層および前記色素層が並置される、請求項２５に記載の試験システム。３１．前記タンパク質結合グルコースがフルクトサミンであり、そして前記シグナル産生システムを含有する前記試験デバイスが： (a) サンプル孔を有する第１のプラスチック製の実質的に平面状の支持部材； (b) 検出孔を有する第２のプラスチック製の実質的に平面状の支持部材； (c) 全血分離層； (d) 約10と約12との間のpH値を有する緩衝液を含有する液透過性緩衝液層；および (e) ニトロブルーテトラゾリウム色素を含有する指示薬層を含有し、ここで、該分離層が該緩衝液層の上に重ねられ、そして該緩衝液層が該指示薬層の上に重ねられ、そしてここで該分離層、該緩衝液層、および該指示薬層は該第１の支持部材と該第２の支持部材との間に配置され、全てが隣接する層と液接触している、請求項２２に記載の試験システム。３２．被験体の体液サンプル中のフルクトサミン濃度を分析する方法であって、反応促進物質が存在しない条件において、必要とされる総測定時間が５分以内である、方法。３３．前記分析が環境温度で行われる、請求項３２に記載の方法。３４．前記必要とされる総測定時間が４分以内である、請求項３２に記載の方法。３５．前記必要とされる総測定時間が３分以内である、請求項３２に記載の方法。