JP2010500555A

JP2010500555A - 側方流動分析用試験片

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Publication number: JP2010500555A
Application number: JP2009523445A
Authority: JP
Inventors: ケレン，トマー; ドワー，オレン・シユラガ
Original assignee: インバーネス・メデイカル・スウイツツアーランド・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 2006-08-10
Filing date: 2007-08-08
Publication date: 2010-01-07
Also published as: EP2049897A1; AU2007282856A1; US20080038759A1; CA2660290A1; CN101501494A; US7704702B2; AU2007282856B2; WO2008018073A1

Abstract

流体試料中の分析物の検出用に構成された試験片、並びに該試験片の製造方法及び使用方法。試験片は、第１の流動マトリックスと第２の流動マトリックスの間に界面を形成するように順次配置された第１の流動マトリックス及び第２の流動マトリックスを含む。第１の流動マトリックスは、それに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物は、分析物に曝露されると、少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成し、第１及び第２の固体マトリックスは、流体試料が第１の流動マトリックスから第２の流動マトリックスに移動するときに、少なくとも１種類の検出可能な生成物を２つのマトリックスの界面に蓄積するように選択される。

Description

本発明は、一般に、迅速アッセイ用試験装置に関し、より詳細には、新規の側方流動分析用装置及び方法に関する。

生物学的化合物の存在を検出する迅速診断インビトロアッセイは、医学的診断、環境モニタリング、法医中毒学及び食物病原体試験を含めて、種々の適用分野に定常的なものとなった。新しい安価な高感度迅速アッセイに対して絶え間なく増大する要求に応じて、近年、多数の新しい開発がこの分野でなされた。しかし、新しい、改善された、より高感度でより安価な検出方法及び装置が依然として絶えず必要とされている。特に、未熟な人でも使用することができる、診療現場（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）での安価な臨床診断キットが切望されている。

一段階迅速アッセイを実施する一般的な一形式は、アッセイに特異的な試薬で前処理された試験片の一端に試料を塗布する側方流動分析技術である。試料は、試験片に沿って毛管作用によって吸い込まれ、表示域を通過する。表示域では、可視信号又は検出可能な信号の出現によって、試料中の分析物の存在が示される。表示域は、典型的には、試験片の規定領域（典型的には、線）に固定された特異的結合対のメンバーを含む。試験片は、試料塗布域下流に位置する、標識化物質を備えた標識域を更に含み得る。側方流動分析は、分析物を含む疑いのある試料を試料受け末端に塗布し、試験片に沿って毛管作用によって移動させ、標識化合物が存在するときにはそれを取り込ませ、更に下流に移動させて、検出／捕捉域において捕捉及び濃縮されるようにすることによって実施される。試験片に沿って位置する、固定された物質、標識化物質及び他の物質の数及び性質、分析物とそれらの相互作用、並びに検出可能信号の性質及び形成に関して、この基本構造の多数の変形が存在する。例えば、検出可能信号は、固定された物質と分析物の直接相互作用から必ずしも生じるわけではなく、具体的アッセイ及び試験片構造に応じて、固定された物質の上流で形成される第２の生成物であって、その生成に分析物の存在を必要とする第２の生成物との間接的相互作用からも生じ得る。他の変形によれば、検出域が捕捉域の下流に位置しながらも、固定された試薬は、上流の未反応試薬（例えば、未結合標識試薬）を捕捉するのに役立ち得る。しかし、ほとんどの場合、従来技術の側方流動片は、少なくとも１種類のあらかじめ固定された試薬を含む。

本発明は、全検出反応物が試験片に移動可能に結合し、捕捉域が、順次配列された特性の異なる２つの流動マトリックス間の界面に形成された、新規側方流動分析用試験片を提供する。

特に、本発明の試験片は、これらだけに限定されないが、体液中の酵素又は酵素基質の検出に適切である。

本発明の一態様は、あらかじめ固定された試薬のない、流体試料中の分析物の検出用試験片である。試験片は、第１の流動マトリックスと第２の流動マトリックスの間に接合部を形成するように順次配置された第１及び第２の流動マトリックスを含み、第１の流動マトリックスは、それに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物の少なくとも１成分は、第１のマトリックス上に乾燥形態であらかじめ堆積させることができる。検出組成物は、分析物に曝露されると少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。第１及び第２の固体マトリックスは、流体試料が第１のマトリックスから第２のマトリックスに移動するときに、少なくとも１種類の検出可能な生成物をマトリックス間の接合部に蓄積するように選択される。第１のマトリックスは、第２のマトリックスよりも空隙率が高く、第１のマトリックスを通る検出可能な生成物の透過率が高くなる。好ましくは、検出組成物の成分は試料流体に可溶であるが、少なくとも１種類の検出可能な生成物は試料流体に不溶である。好ましくは、第１及び第２のマトリックスは裏張り（ｂａｃｋｉｎｇ）不透過性積層体と上部不透過性積層体に挟まれ、裏張り積層体と上部積層体の少なくとも一方は透明又は半透明である。

本発明の特定の一実施形態によれば、試験片は、流体試料における酵素活性を検出するように構成される。この実施形態によれば、検出組成物は、アッセイにおいて酵素に特異的な発色基質試薬系を含む。発色基質試薬系は、酵素に曝露されると着色生成物を生成する、インドキシル含有基質などの発色酵素基質を含み得る。或いは、発色基質試薬系は、酵素基質と色素生産性試薬の混合物を含み得る。前記色素生産性試薬は、酵素と酵素基質の酵素反応の存在下で、検出可能な着色生成物を生成する。好ましくは、発色基質試薬系の成分は試料流体に可溶であるが、着色生成物は試料流体に不溶である。

本発明の第２の態様は、上で定義した本発明の新規試験片を用意する段階と、試験片を流体試料に曝露する段階と、２つのマトリックスの界面で、明確な変化、好ましくは変色の出現を観察する段階とを含み、明確な変化の出現によって流体試料中の分析物の存在が示される、流体試料中の分析物を測定する方法である。

さらに、本発明の第３の態様は、分析物を検出するための検出組成物を選択する段階（前記検出組成物は、分析物に曝露されると、少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。）と、試料が第１のマトリックスから第２のマトリックスに移動するときに、少なくとも１種類の検出可能な生成物を前記第１及び第２のマトリックスの界面に保持するように、特性の異なる第１及び第２の流動マトリックスを選択する段階と、第１及び第２のマトリックスを、その間に界面を形成するように、非吸収性支持体上に順次配置する段階と、第１のマトリックスに所定量の検出組成物を供給する段階とを含む、流体試料中の分析物を検出するようになされた試験片を製造する方法である。

本発明は、図面と併せて、以下の詳細な説明から、より十分に理解され、認識されるはずである。

本発明の好ましい一実施形態によって構築された側方流動片のそれぞれ分解側面図及び上面図である。本発明の好ましい一実施形態によって構築された側方流動片のそれぞれ分解側面図及び上面図である。本発明の側方流動試験片上で得られる陽性信号の略図である。本明細書の実施例１から３で用いられる試験片の分解図構築スキームであり、異なる試験片層の寸法及び相対位置を明示する。シアリダーゼを検出するように構成された本発明の側方流動試験片を用いて得られた例示的結果を示す図である。左側の試験片は、Ｂ．フラギリスの試料を用いて得られた結果であり、右側の試験片は、泳動緩衝剤を用いた対照試験であり、試験片は、１０分間の温置後に走査された。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を検出するように構成された本発明の側方流動試験片を用いて得られた例示的結果を示す図である。ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を検出するように構成された本発明の側方流動試験片を用いて得られた例示的結果を示す図である。

本発明は、ヒト、動物又は人工試料を含めて、流体試料中の分析物を測定するための新規側方流動分析用試験片を提供する。本発明の試験片は、定性、半定量又は定量測定に使用することができる。本発明は、さらに、試験片の製造及び使用方法も提供する。

本発明の試験片は、これらだけに限定されないが、試料流体、より具体的には体液における酵素活性の検出に適切である。酵素活性の検出は、全生物体、細胞又は細胞抽出物、生物学的流体、化学混合物などの生物又は化学試料の分析に有用である。特に、体液の酵素レベルは、健康状態を示す。ある種の酵素の活性評価は、代謝、病態、並びにウイルス性及び病原性微生物の素性についての情報を提供することができる。

本発明の試験片は、順次配列された、特性の異なる、少なくとも２つの固体流動マトリックスを含み、全検出反応物は、第１のマトリックスに移動可能に結合し、捕捉域は２つの流動マトリックスの界面に形成される。固定された試薬は、第１のマトリックスにも第２のマトリックスにもない。本願を通して使用する「流動マトリックス」という用語は、ニトロセルロース、ナイロン、レーヨン、セルロース、紙、ガラス繊維、シリカ、任意の他の多孔質、繊維状、吸湿性又は非吸湿性材料などの材料を含めて、それを通して液体が流動することができる任意の液体透過性輸送固体材料（ｌｉｑｕｉｄｐｅｒｍｅａｂｌｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｓｏｌｉｄｍａｔｅｒｉａｌ）を指す。流動マトリックスは、好ましくは、実質的に平面状の細長い片として構成される。流動マトリックス材料は、必要に応じて、前処理又は改変することができる。

図１及び２は、全体が１０で示される本発明の試験片を示す。試験片１０は、長さ約１−５ｍｍの界面域８を形成するように、裏張り層１５上に順次配列された２つの流動マトリックス、すなわち、試料受け固体マトリックス２及び反応固体マトリックス４を含む。マトリックス２と４は部分的に重複する。界面重複域８は、検出可能な変化、典型的には変色が、陽性判定で出現する信号域である。マトリックス２と４は、異なる空隙率を有し、その結果異なる透過率を有するように選択される。特に、マトリックスは、マトリックス２の透過率が、マトリックス４の透過率よりも高いように選択される。マトリックス２は、ガラス繊維（ＧＦ）、ろ紙、又は当分野で公知である比較的大孔径の他のろ過若しくは網目媒体、好ましくは繊維状材料であり得る。マトリックス４は、好ましくは、ニトロセルロース（ＮＣ）又はナイロン膜であるが、これらだけに限定されない。好ましくは、膜４の孔径は、約０．２２μｍから約１５μｍの範囲である。具体的な膜４は、試験片が設計される具体的なアッセイに応じて、また、検出可能な生成物を界面８に保持するように、その検出可能な生成物に応じて、選択される。試験片は、試料の連続流動を確保する吸収剤パッド６と、上部積層体２５とを更に含む。上部積層体２５は、膜４を完全に覆い、膜２及び吸収剤パッド６を部分的に覆うように構成され、膜２の一部２０は覆われず、そこに試料が塗布され、パッド６の大部分は露出している。吸収剤パッド６は、セルロース、ろ紙などの吸湿性材料でできており、液体は、マトリックス２及び４を通して吸い込まれ、吸収パッド６に蓄積する。パッド６のサイズ及び形状は、アッセイに用いる液体の体積に応じて選択される。パッド６の典型的な材料としては、セルロース及びろ紙が挙げられるが、これらだけに限定されない。裏面及び上部積層体１５及び２５は、非吸収性フィルムである。好ましくは、両方のフィルム１５及び２５は、試験片の両側から信号を見ることができる透明又は半透明のフィルムである。しかし、一方の面に白色フィルムを使用し、他方の面に透明フィルムを使用すると、ある適用例では信号域のコントラストを高くすることができる。製造を容易にするために、積層体１５及び２５は、好ましくは、剥離ライナーで保護された片面接着性プラスチックフィルムである。実際には、図１に示すように、試験片１０は、積層体１５をその接着面を上向きにして置き、剥離ライナーを剥がし、マトリックス２、４及び６をライナー１５の上に置くことによって、組み立てられる。組立てを完了するために、積層体２５をその接着面を下向きにして、上に置く。

分析物特異的検出組成物を試料受けマトリックス２上に移動可能に堆積させる。検出組成物は、マトリックス２と４の界面８に蓄積する少なくとも１種類の検出可能な生成物を分析物の存在下で生成する試薬を含む。検出組成物は、信号強度を増強する界面活性剤を更に含み得る。酵素アッセイ、例えばシアリダーゼアッセイでは、検出組成物は、発色酵素基質（例えば、シアリダーゼの存在下でインドキシルを生成する５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＢＣＩＮ）など）及び発色試薬（インドキシルと反応して濃色の不溶性インジゴ及びホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩など）を含み得る。酵素アッセイの他の例においては、検出組成物は、酵素基質と、酵素反応に関与して検出可能な生成物を生成する色素生産性試薬との混合物を含み得る。かかる色素生産性試薬は、例えば、酵素の電子伝達鎖（ｅｌｅｃｔｒｏｎｔｒａｎｓｆｅｒｃｈａｉｎ）に関与する電子受容体又は電子供与体であり得る。例えば、デヒドロゲナーゼ酵素は、デヒドロゲナーゼ基質とテトラゾリウム塩などの色素生産性電子受容体とを含む検出組成物を用いて検出することができる。ペルオキシダーゼ酵素は、ペルオキシダーゼ基質とテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などの色素生産性電子供与体とを含む検出組成物を用いて検出することができる。一般に、本発明の装置における酵素アッセイは、酵素組織化学に用いられる検出組成物と等価な検出組成物、すなわち当該酵素の基質と、酵素反応の存在下で不溶性着色沈殿又は検出可能な沈殿を生成する試薬とを含む組成物を選択することによって、実施することができる。

マトリックス２及び４を正しく選択することによって、着色沈殿粒子は、２つのマトリックスの界面で保持され、濃縮されて、明確な信号を発する。

流動マトリックス２上の種々の検出成分の位置は、互いに完全に若しくは部分的に重複し、又は別々の区域を含み得る。同様に、試料塗布域は、検出成分を含浸させた区域と重複し得、又は別個の区域であり得る。マトリックス２上の様々な区域の具体的位置は、十分な相互作用時間を可能にするように、試料成分全部及び検出成分全部が、マトリックス２に沿って移動し、マトリックス４に達する前に、試料流体内で十分に混合され、溶解することを前提に、変動し得ることを理解されたい。製造を単純かつ容易にするために、マトリックス２に検出成分全部を十分含浸させることが好都合である。したがって、全検出成分の混合物が溶液状態で安定であれば、マトリックス２をかかる溶液に所定時間浸漬し、乾燥させることができる。或いは、溶液が不安定であれば、マトリックス２を、相互に安定である成分のみを含む溶液に完全に又は部分的に浸漬してもよい。残りの成分は、乾燥形態の溶液成分をあらかじめ含浸した区域上、又は空いた非含浸区域上の乾燥マトリックスに載せることができる。更に別の代替法は、試料を載せる直前若しくは直後、又は試料を載せるのと実質的に同時に、１種類以上の成分をマトリックス２上に載せることである。

本発明によれば、検出組成物は、ラテックス又はコロイド状金粒子などのあらかじめ成形された標識化粒子を含まないことに注目されたい。生体分子特異的対の１メンバーに結合したかかる不活性粒子は、生体分子特異的対の第２のメンバーと複合体を形成することによって信号を発生する標識化手段として当分野で周知である。本発明によれば、以前には試験片上に存在せず、その形成に分析物の存在を必要とする、検出可能な性質、例えば明確な色を有する新しい生成物の形成によって、陽性信号が発生する。したがって、検出があらかじめ堆積された着色粒子の捕捉に基づく場合と異なり、本発明の信号は、新しい明確な検出可能な性質を有する新しい生成物の形成に基づく。検出成分と分析物の化学反応、すなわち化学結合の開裂及び形成によって形成される、この検出可能な生成物は、２つのマトリックスの界面に濃縮して、信号を増強する。好ましくは、検出可能な生成物は、透過性の低い第２のマトリックスによって保持される沈殿粒子を形成するように、試料流体に不溶であり、一方、検出組成物は、溶出流体に完全に可溶である試薬のみを含む。

試験を実施するために、試料及び溶出剤、典型的には泳動緩衝剤を、パッド２の露出端２０に載せる。典型的には、試料は、水溶液又は体液である。試料は、泳動緩衝剤に前もって添加して、１つの溶液として載せることができる。或いは、試料を点在させた後に、泳動緩衝剤を載せることができる。試料溶液が試験片に沿って移動するにつれて、あらかじめ堆積された検出成分は、溶液中に再溶解して混合され、試料液が試験片に沿って移動するにつれて、試料成分と反応する。したがって、上記酵素の例においては、酵素が試料中に存在する場合、発色基質は開裂して色素生産性中間体を生成し、色素生産性中間体は発色試薬と更に反応して、濃色の生成物を生成する。着色生成物は、２つのマトリックスの重複界面８に蓄積して、明瞭な識別される信号線を生じる。図３を参照すると、陽性の結果は、信号域８における識別される線３０の出現によって示され、陰性の結果は、信号域におけるかかる線の欠如によって示される。

本発明の側方流動試験片は、定性的に使用して、試験試料中の分析物の有無に対応した陽性／陰性の応答を与えることができる。この実施形態によれば、試験片は、試料を載せる受け口と、信号域における少なくとも１個の透明な窓とを備えた側方流動装置に組み込まれ、追加の装置を必要としない単純な自給式検出装置を提供することができる。較正されたスケールに信号強度を照合することによって半定量的測定をする較正色強度スケールを用いて、基準を追加することができる。或いは、分光光度計、スキャナー、濃度計、リーダー、カメラなど、ただしこれらだけに限定されない機器によって、試験片を読み、定量的結果を得ることができる。上述したように、信号は試験片の両側から見ることができるので、信号の吸光度と反射率の両方を測定することができる。

以下の詳細な実施例は、説明のためにのみ記述されるものであって、本明細書に記載する発明を限定するものではない。

シアリダーゼ試験片
以下に示すように、流体試料におけるシアリダーゼ活性を検出するためのシアリダーゼ試験片を本発明に従って構築した。アッセイは、シアリダーゼの存在下での発色シアリダーゼ基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＢＣＩＮ）の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の更なる反応によって、２つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。ＢＣＩＮ及びＮＢＴの化学構造、並びにアッセイ反応の詳細な反応スキームは、その全内容を参照により本明細書に組み入れる、同じ日に出願され、本発明の同じ譲受人に譲渡された同時係属中の出願「ＤｒｙＦｏｒｍａｔＳｉａｌｉｄａｓｅＡｓｓａｙ」に記載されている。細菌性膣症（ＢＶ）の検出用膣スワブ試料を含めた種々の試料を、試験片を用いて試験した。

Ａ．ＮＢＴ含浸試料パッドの調製
ガラス繊維フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＦＣＰ００１００００、１０ｍｍ×１０ｃｍ）をＮＢＴ溶液に暗所で室温で３０分間浸漬した。浸漬したガラス繊維フィルターを吸取紙上に置いて、過剰の流体を除去し、次いで乾燥器に５０℃で１５分間移した。乾燥ＮＢＴ含浸ガラス繊維フィルター（試料パッド）を乾燥室（ＲＨ５−１０％）に室温で乾燥暗所貯蔵した。

Ｂ．カードの組立て
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図４に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、シアリダーゼアッセイ用の複数の試験片を得た。

１．裏面積層体として役立ち、図２において１５で示された、剥離ライナーで保護された接着剤を含む１枚の４３×２５０ｍｍ透明プラスチックフィルム（ＡＲｃａｒｅ８８７６、ＡｄｈｅｓｉｖｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を作業台の上に置いた。剥離ライナーを剥離して、テープの接着面を露出させた。

２．反応膜（ニトロセルロースＨＦ１８００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＳＡ３Ｊ１５４１０１、２５×３００ｍｍ、ＢｉｏｄｙｎｅＢ、ＰＡＬＬ、ＢＮＢＺＦ３ＲＴ、２５×３００ｍｍ、又はＢｉｏｄｙｎｅＰＬＵＳ、ＰＡＬＬ、ＺＮＸＧ３Ｒ、２５×３００ｍｍ）を裏面カバーの接着面上、下端から８ｍｍに取り付けた。

３．（セクションＡで調製した）ＮＢＴ含浸試料パッドを裏面カバーの下側の上に、反応膜上に２ｍｍ重複させて取り付けた。

４．吸収剤パッド（ゲル吸取紙、Ｓ＆Ｓ、ＧＢ００３、２１×３００ｍｍ）を裏面カバーの上側の上に、反応膜上に１２ｍｍ重複させて置いた。

５．上部積層フィルム（ＡＲｃａｒｅ７７５９、ＡｄｈｅｓｉｖｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）の剥離ライナーを剥離して接着面を露出させ、接着面を下方に向けて（ｆａｃｉｎｇｄｏｎｅ）、試料パッド及び吸収剤パッドの上に重ねて、フィルムを反応膜上に取り付けた。

カードを乾燥室（ＲＨ５−１０％）で室温で暗所で終夜硬化させた。硬化後、自動ダイカッターを用いて、カードを４ｍｍ幅の試験片に切り取った。

Ｃ．試験片試料パッド上のＢＣＩＮの含浸
ＢＣＩＮ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−□−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸）溶液１μｌを試料パッド上に添加し、３７℃で１５分間乾燥させた。

Ｄ．シアリダーゼ試験片を用いた試験の実施
Ｄ１．細菌及び精製シアリダーゼ試料
上記セクションＢに記載のように構築された試験片を、シアリダーゼ産生細菌バクテロイデスフラギリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓｆｒａｇｉｌｉｓ）の試料、シアリダーゼ陰性細菌ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ）の試料、及び精製シアリダーゼを用いて、シアリダーゼ活性について試験した。

試験を開始するために、試料２５μｌを試験片の試料パッドに載せた。陽性シアリダーゼ反応の信号である紫褐色が、２つの異なるマトリックス（試料パッドと反応膜）の界面、すなわち信号域に蓄積した。（シアリダーゼが存在しない）陰性対照は、信号域において黄色のバックグラウンドを示した。試験ごとに信号出現時間を記録した。試験片を３０分まで観察した。図５は、バクテロイデスフラギリスの試料（左側の試験片）、及び陰性対照として泳動緩衝剤（右側の試験片）を用いて得られた例示的結果である。

信号域における変色は、視覚的に観察することができ、目視で推定した強度に対応して「＋」値を割り当てた（表１参照）。その代りに、又はそれに加えて、色を電気光学機器によって検出及び測定することができる。試料を試験片に載せてからの信号出現時間、及び１０分における信号強度を下記表１に要約する。

Ｄ２．臨床試料（膣スワブ）
４７個の臨床試料を試験して、細菌性膣症ＢＶの診断に対するシアリダーゼ試験片の臨床上の関連性を試験した。ＷｏｌｆｓｏｎＭｅｄｉｃａｌＣｅｎｔｅｒ，Ｈｏｌｏｎ，ＩｓｒａｅｌのＧｅｎｉｔｏｕｒｉｎａｒｙＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓユニットのボランティアから膣分泌物試料を得た。膣分泌物は、無菌スワブ（５５２Ｃ、Ｃｏｐａｎ、Ｉｔａｌｉａ）を用いて医師によって収集された。スワブ頭部（先端）を２ｍｌねじ口管に入れ、使用まで４℃で保存した。泳動緩衝剤３００μｌを管に添加し、１分間ボルテックス撹拌することによって膣スワブを洗浄して、分泌物をスワブから溶出させ、均質試料を得た。各膣スワブについて、グラム染色及びＮｕｇｅｎｔスコアリングによって、ＢＶを診断した（ＲＰＮｕｇｅｎｔｅｔａｌ．ＲｅｌｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＤｉａｇｎｏｓｉｎｇＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｇｉｎｏｓｉｓＩｓＩｍｐｒｏｖｅｄｂｙａＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄＭｅｔｈｏｄｏｆＧｒａｍＳｔａｉｎＩｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９：２９７−３０１（１９９９））。スワブ洗液３００μｌから２５μｌを試験用に採取した。培養試料について上述したように試験を実施した。

表２は、ＢＶを診断し、シアリダーゼ試験片を用いて試験した、４７個の膣スワブ洗液の結果の要約である。

シアリダーゼ試験片の感度及び特異性は１００％である。表１及び２に要約した結果は、提案するシアリダーゼ試験片をＢＶの診断に使用できることを明確に示している。

シアリダーゼアッセイ用溶液の材料及び調製：
ＮＢＴ溶液５０ｍＭＭＥＳ（Ｍ−８２５０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔｈ、Ｉｓｒａｅｌ）緩衝剤ｐＨ６．０中の２ｍｇ／ｍｌＮＢＴ（塩化ニトロブルーテトラゾリウム、Ｎ−８１００ＢｉｏｓｙｎｔｈＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５％スクロース（５５５３８１０、Ｆｒｕｔａｒｏｍ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）、０．１％ＭｇＣｌ_２（１２００３１０、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）；Ｓｕｒｆｙｎｏｌ−４４０を含むＮＢＴ溶液５０ｍＭＭＥＳ（Ｍ−８２５０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｒｅｈｏｖｏｔｈ、Ｉｓｒａｅｌ）緩衝剤ｐＨ６．０中の２ｍｇ／ｍｌＮＢＴ（塩化ニトロブルーテトラゾリウム、Ｎ−８１００ＢｉｏｓｙｎｔｈＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、５％スクロース（５５５３８１０、Ｆｒｕｔａｒｏｍ、Ｈａｉｆａ、Ｉｓｒａｅｌ）、０．１％ＭｇＣｌ_２（１２００３１０、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．５％Ｓｕｒｆｙｎｏｌ−４４０（２，４，７，９テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオールエトキシラート１．７５ＥＯ／ＯＨ、Ａｌｄｒｉｃｈ、４６１１８０）；ＢＣＩＮ溶液二段蒸留水１ｍｌ中のＢＣＩＮ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩、Ｂ４６６６、Ｓｉｇｍａ）３５．３ｍｇ；泳動緩衝剤ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水）ｐＨ７．８中の０．５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール−１５０００、Ｍｅｒｃｋ、８１９００３）、０．５％ＢＳＡ（０１２０００５０、Ｓｅｒａｃａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−５９２７）、０．１％ＭｇＣｌ_２（Ｍｅｒｃｋ１２００３１０）。

細菌培養物
シアリダーゼ産生細菌：バクテロイデスフラギリス（ＡＴＣＣ＃２３７４５）１０^７ｃｆｕ／ｍｌの培養。培養物を泳動緩衝剤で以下の細胞数、すなわち、５＊１０^４、２．５＊１０^４１０^４及び５＊１０^３に希釈することによって試料２５μｌを調製した。シアリダーゼ陰性細菌：ラクトバチルスプランタルム（ＡＴＣＣ＃１４９１７）１０^８ｃｆｕ／ｍｌの培養。培養物を泳動緩衝剤で希釈することによって、５＊１０^５細胞を含む試料２５μｌを調製した。精製シアリダーゼクロストリジウムパーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）から得られた精製組換え細菌シアリダーゼ（Ｐ０７２０Ｌ、ノイラミニダーゼ）をＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手した。精製シアリダーゼを泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、５単位及び１単位／試料に希釈することによって、試料２５μｌを調製した。

アルカリホスファターゼ試験片
流体試料におけるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性の検出用試験片を実施例１で上述した様式と同様に構築した。アッセイは、ＡＰの存在下での発色ホスファターゼ基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の更なる反応によって、２つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。本試験片例と上記試験片例の主な相違は、本実施例においては、試料受けマトリックスを発色基質ＢＣＩＰと発色試薬ＮＢＴの両方を含有する溶液に浸漬したことであった。

Ａ．ＢＣＩＰ−ＮＢＴ含浸試料パッドの調製
ガラス繊維フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＦＣＰ００１００００、１０ｍｍ×１０ｃｍ）をＢＣＩＰ−ＮＢＴ溶液（０．１ＭＴｒｉｓ緩衝剤ｐＨ９．６中の０．２ｍｇ／ｍｌＢＣＩＰ＋０．３ｍｇ／ｍｌＮＢＴ）に暗所で室温で３０分間浸漬する。ガラス繊維フィルターを乾燥器に移し、５０℃で１５分間乾燥させる。ＢＣＩＰ−ＮＢＴ含浸ガラス繊維フィルター（試料パッド）を乾燥室（ＲＨ５−１０％）に室温で乾燥暗所貯蔵する。

Ｂ．カードの組立て、及び試験片の切り出し
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図４に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、ＡＰアッセイ用の複数の試験片を形成した。

１．剥離ライナーで保護された接着剤を含む４３×２５０ｍｍ透明プラスチックフィルム、すなわち裏面カバー（ＡＲｃａｒｅ８８７６、ＡｄｈｅｓｉｖｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）を作業台の上に置いた。剥離ライナーを剥離して、テープの接着面を露出させた。

２．反応膜（ニトロセルロースＨＦ１８００４、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＳＡ３Ｊ１５４１０１、２５×３００ｍｍを裏面カバーの接着面上、下端から８ｍｍに取り付けた。

３．ＢＣＩＰ−ＮＢＴ含浸試料パッドを裏面カバーの下側の上に、反応膜上に２ｍｍ重複させて取り付けた。

５．上部積層フィルム（ＡＲｃａｒｅ７７５９、ＡｄｈｅｓｉｖｅｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｌｉｍｅｒｉｃｋ、Ｉｒｅｌａｎｄ）の剥離ライナーを剥離して接着面を露出させ、接着面を下方に向けて、試料パッド及び吸収剤パッドの上に重ねて、フィルムを反応膜上に取り付けた。

Ｃ．抗ジゴキシゲニンＡＰを用いたアルカリホスファターゼ（ＡＰ）活性の試験
ａ．抗ジゴキシゲニンＡＰ（Ｒｏｃｈｅ１０９３２７４０．７５単位／μｌ）をＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水）ｐＨ７．８で以下のレベル、すなわち、０．０３７５単位／試験、０．００３７５単位／試験及び０．０００３７５単位／試験に希釈することによって試料２５μｌを調製した。

ｂ．試料２５μｌを試験片の試料パッドに載せた。

結果：
試験結果を図６に示す。陽性反応の信号である紫褐色が、２つの異なるマトリックス（試料パッドと反応膜）の界面、すなわち信号域に蓄積した。（抗ジゴキシゲニンＡＰが存在しない）陰性対照は、信号を発生しなかった。

陽性信号はすべて３分以内に出現した。

ペルオキシダーゼ試験片
流体試料におけるペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性の検出用試験片を実施例１及び２で上述した様式と同様に構築した。しかし、この実施例では、試料受けマトリックスは、検出試薬を含浸されなかったが、その清浄な未処理形態の試験片に組み立てられた。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を色素原として含む発色ペルオキシダーゼ基質混合物の市販溶液を試験片に載せ、直後に試料を載せた。ペルオキシダーゼの存在下で、ＴＭＢ基質混合物は着色生成物を生成する。２種類のＴＭＢペルオキシダーゼ基質混合物ＳｉｇｍａＴ０５６５及びＰｉｅｒｃｅ＃３４０２８を試験した。Ｓｉｇｍａ基質は、不溶性生成物を生成すると報告され、膜用に推奨される。Ｐｉｅｒｃｅ基質は、可溶性生成物基質を生成し、ＥＬＩＳＡ用に意図されている。

Ａ．泳動緩衝剤
ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝食塩水）ｐＨ７．８中の０．５％ＰＥＧ（ポリエチレングリコール−１５０００、Ｍｅｒｃｋ、８１９００３）、０．５％ＢＳＡ（０１２０００５０、Ｓｅｒａｃａｒｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｐ−５９２７）、０．１％ＭｇＣｌ_２（Ｍｅｒｃｋ１２００３１０）
Ｂ．カードの組立て、及び試験片の切り出し
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図４に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、ＰＯＤアッセイ用の複数の試験片を形成した。

３．試料パッド（ガラス繊維フィルター、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＧＦＣＰ００１００００、１０ｍｍ×１０ｃｍ）を裏面カバーの下側の上に、反応膜上に２ｍｍ重複させて取り付けた。

Ｃ．抗ジゴキシゲニンＰＯＤを用いたペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）活性の試験
ａ．抗ジゴキシゲニンＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ１２０７７３３０．１５単位／μｌ）を泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、７．５単位／試験、０．７５単位／試験及び０．０７５単位／試験に希釈することによって試料２５μｌを調製した。

ｂ．テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質混合物（ＳｉｇｍａＴ０５６５又はＰｉｅｒｃｅ＃３４０２８）５μｌを試験片の試料パッド上に置いた。

ｃ．試料２５μｌを試料パッドに載せた。

結果：
図７は、Ｓｉｇｍａ基質及びＰｉｅｒｃｅ基質を用いて得られた結果である。陽性反応の信号である青紫色が、試料パッド、及び２つの異なるマトリックス（試料パッドと反応膜）の界面、すなわち信号域に蓄積した。（抗ジゴキシゲニンＰＯＤが存在しない）陰性対照は、信号を発生しなかった。陽性信号はすべて３分以内に出現した。

本発明は、上で特に示した、また、記載したものに限定されないことを当業者は理解されたい。より正確に言えば、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。

Claims

流体試料中の分析物の検出用に構成された試験片であり、
第１の流動マトリックスと第２の流動マトリックスの間に界面を形成するように順次配置された第１の流動マトリックスと第２の流動マトリックスを含み、前記第１の流動マトリックスは、マトリックスに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物は、分析物の存在下で少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成し、並びに第１及び第２の固体マトリックスは、流体試料が第１の流動マトリックスから第２の流動マトリックスに移動するときに、前記少なくとも１種類の検出可能な生成物を前記界面に蓄積するように選択される、試験片。
前記検出組成物の少なくとも１成分が、再溶解可能な乾燥形態で、前記第１のマトリックス上に堆積された、請求項１の片。
前記第１のマトリックスが、前記第２のマトリックスよりも高い空隙率である、請求項１の片。
第１のマトリックスを通る前記少なくとも１種類の検出可能な生成物の輸送率が、第２のマトリックスを通る前記少なくとも１種類の検出可能な生成物の輸送率よりも高い、請求項１の片。
第１のマトリックスがガラス繊維又はろ紙であり、並びに第２のマトリックスがニトロセルロース又はナイロン膜である、請求項１の片。
前記少なくとも１種類の生成物が、試料流体に不溶である、請求項１の片。
前記検出組成物が試料流体に可溶である、請求項１の片。
前記第１及び第２のマトリックスが、裏張り（ｂａｃｋｉｎｇ）及び上部不透過性積層体に挟まれている、請求項１の片。
前記裏張り及び上部積層体の少なくとも一方が透明又は半透明である、請求項８の片。
前記分析物が酵素であり、並びに前記検出組成物が、前記酵素に特異的である発色基質試薬系を含む、請求項１の片。
流体試料中の酵素の検出用の片であり、
第１のマトリックスと第２のマトリックスの間に接合部を形成する、非吸収性固体支持体上に順次配置された第１のマトリックスと第２のマトリックスを含み、
第１のマトリックスが、移動可能に結合した酵素検出組成物を備え、組成物が、前記酵素に曝露されると少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成する成分の組合せを含み、並びに
前記第１及び第２のマトリックスが、流体試料が第１の流動マトリックスから第２の流動マトリックスに移動するときに、前記少なくとも１種類の検出可能な生成物を前記接合部に蓄積するように選択される、片。
前記検出可能な生成物が試料流体に不溶である、請求項１１の片。
前記酵素検出組成物が、前記酵素の発色基質を含む、請求項１１の片。
前記酵素検出組成物が色増強剤を更に含む、請求項１３の片。
前記基質がインドキシル基を含む、請求項１３の片。
酵素検出組成物がテトラゾリウム塩を更に含む、請求項１５の片。
前記酵素検出組成物が、前記酵素の基質及び色素生産性試薬を含み、前記色素生産性試薬が、酵素及び酵素基質間の酵素反応の存在下で、検出可能な着色生成物を生成する、請求項１１の片。
前記色素生産性試薬が電子供与体又は電子受容体である、請求項１７の片。
流体試料中の分析物を検出する方法であり、
請求項１から１０のいずれかに記載の試験装置を用意する段階、
前記試験装置を流体試料に曝露する段階、並びに
変色の出現を観察する段階
を含み、識別される変色の出現が前記流体試料中の分析物の存在を示す、方法。
流体試料中の分析物を検出するようになされた試験装置を製造する方法であり、
分析物を検出するための検出組成物を選択する段階（前記検出組成物は、前記分析物に曝露されると、少なくとも１種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。）、
特性の異なる第１及び第２の流動マトリックスを選択する段階（前記第１及び第２の流動マトリックスは、試料が第１のマトリックスから第２のマトリックスに移動するときに、前記少なくとも１種類の検出可能な生成物を前記第１及び第２のマトリックスの界面に保持するように選択される。）、
前記第１及び第２のマトリックスを、その間に界面を形成するように、非吸収性支持体上に順次配置する段階、並びに
第１のマトリックスに所定量の前記検出組成物を供給する段階
を含む、方法。