JP2010500555A - 側方流動分析用試験片 - Google Patents
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Abstract
流体試料中の分析物の検出用に構成された試験片、並びに該試験片の製造方法及び使用方法。試験片は、第1の流動マトリックスと第2の流動マトリックスの間に界面を形成するように順次配置された第1の流動マトリックス及び第2の流動マトリックスを含む。第1の流動マトリックスは、それに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物は、分析物に曝露されると、少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成し、第1及び第2の固体マトリックスは、流体試料が第1の流動マトリックスから第2の流動マトリックスに移動するときに、少なくとも1種類の検出可能な生成物を2つのマトリックスの界面に蓄積するように選択される。
Description
本発明は、一般に、迅速アッセイ用試験装置に関し、より詳細には、新規の側方流動分析用装置及び方法に関する。
生物学的化合物の存在を検出する迅速診断インビトロアッセイは、医学的診断、環境モニタリング、法医中毒学及び食物病原体試験を含めて、種々の適用分野に定常的なものとなった。新しい安価な高感度迅速アッセイに対して絶え間なく増大する要求に応じて、近年、多数の新しい開発がこの分野でなされた。しかし、新しい、改善された、より高感度でより安価な検出方法及び装置が依然として絶えず必要とされている。特に、未熟な人でも使用することができる、診療現場(point−of−care)での安価な臨床診断キットが切望されている。
一段階迅速アッセイを実施する一般的な一形式は、アッセイに特異的な試薬で前処理された試験片の一端に試料を塗布する側方流動分析技術である。試料は、試験片に沿って毛管作用によって吸い込まれ、表示域を通過する。表示域では、可視信号又は検出可能な信号の出現によって、試料中の分析物の存在が示される。表示域は、典型的には、試験片の規定領域(典型的には、線)に固定された特異的結合対のメンバーを含む。試験片は、試料塗布域下流に位置する、標識化物質を備えた標識域を更に含み得る。側方流動分析は、分析物を含む疑いのある試料を試料受け末端に塗布し、試験片に沿って毛管作用によって移動させ、標識化合物が存在するときにはそれを取り込ませ、更に下流に移動させて、検出/捕捉域において捕捉及び濃縮されるようにすることによって実施される。試験片に沿って位置する、固定された物質、標識化物質及び他の物質の数及び性質、分析物とそれらの相互作用、並びに検出可能信号の性質及び形成に関して、この基本構造の多数の変形が存在する。例えば、検出可能信号は、固定された物質と分析物の直接相互作用から必ずしも生じるわけではなく、具体的アッセイ及び試験片構造に応じて、固定された物質の上流で形成される第2の生成物であって、その生成に分析物の存在を必要とする第2の生成物との間接的相互作用からも生じ得る。他の変形によれば、検出域が捕捉域の下流に位置しながらも、固定された試薬は、上流の未反応試薬(例えば、未結合標識試薬)を捕捉するのに役立ち得る。しかし、ほとんどの場合、従来技術の側方流動片は、少なくとも1種類のあらかじめ固定された試薬を含む。
本発明は、全検出反応物が試験片に移動可能に結合し、捕捉域が、順次配列された特性の異なる2つの流動マトリックス間の界面に形成された、新規側方流動分析用試験片を提供する。
特に、本発明の試験片は、これらだけに限定されないが、体液中の酵素又は酵素基質の検出に適切である。
本発明の一態様は、あらかじめ固定された試薬のない、流体試料中の分析物の検出用試験片である。試験片は、第1の流動マトリックスと第2の流動マトリックスの間に接合部を形成するように順次配置された第1及び第2の流動マトリックスを含み、第1の流動マトリックスは、それに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物の少なくとも1成分は、第1のマトリックス上に乾燥形態であらかじめ堆積させることができる。検出組成物は、分析物に曝露されると少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。第1及び第2の固体マトリックスは、流体試料が第1のマトリックスから第2のマトリックスに移動するときに、少なくとも1種類の検出可能な生成物をマトリックス間の接合部に蓄積するように選択される。第1のマトリックスは、第2のマトリックスよりも空隙率が高く、第1のマトリックスを通る検出可能な生成物の透過率が高くなる。好ましくは、検出組成物の成分は試料流体に可溶であるが、少なくとも1種類の検出可能な生成物は試料流体に不溶である。好ましくは、第1及び第2のマトリックスは裏張り(backing)不透過性積層体と上部不透過性積層体に挟まれ、裏張り積層体と上部積層体の少なくとも一方は透明又は半透明である。
本発明の特定の一実施形態によれば、試験片は、流体試料における酵素活性を検出するように構成される。この実施形態によれば、検出組成物は、アッセイにおいて酵素に特異的な発色基質試薬系を含む。発色基質試薬系は、酵素に曝露されると着色生成物を生成する、インドキシル含有基質などの発色酵素基質を含み得る。或いは、発色基質試薬系は、酵素基質と色素生産性試薬の混合物を含み得る。前記色素生産性試薬は、酵素と酵素基質の酵素反応の存在下で、検出可能な着色生成物を生成する。好ましくは、発色基質試薬系の成分は試料流体に可溶であるが、着色生成物は試料流体に不溶である。
本発明の第2の態様は、上で定義した本発明の新規試験片を用意する段階と、試験片を流体試料に曝露する段階と、2つのマトリックスの界面で、明確な変化、好ましくは変色の出現を観察する段階とを含み、明確な変化の出現によって流体試料中の分析物の存在が示される、流体試料中の分析物を測定する方法である。
さらに、本発明の第3の態様は、分析物を検出するための検出組成物を選択する段階(前記検出組成物は、分析物に曝露されると、少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。)と、試料が第1のマトリックスから第2のマトリックスに移動するときに、少なくとも1種類の検出可能な生成物を前記第1及び第2のマトリックスの界面に保持するように、特性の異なる第1及び第2の流動マトリックスを選択する段階と、第1及び第2のマトリックスを、その間に界面を形成するように、非吸収性支持体上に順次配置する段階と、第1のマトリックスに所定量の検出組成物を供給する段階とを含む、流体試料中の分析物を検出するようになされた試験片を製造する方法である。
本発明は、図面と併せて、以下の詳細な説明から、より十分に理解され、認識されるはずである。
本発明は、ヒト、動物又は人工試料を含めて、流体試料中の分析物を測定するための新規側方流動分析用試験片を提供する。本発明の試験片は、定性、半定量又は定量測定に使用することができる。本発明は、さらに、試験片の製造及び使用方法も提供する。
本発明の試験片は、これらだけに限定されないが、試料流体、より具体的には体液における酵素活性の検出に適切である。酵素活性の検出は、全生物体、細胞又は細胞抽出物、生物学的流体、化学混合物などの生物又は化学試料の分析に有用である。特に、体液の酵素レベルは、健康状態を示す。ある種の酵素の活性評価は、代謝、病態、並びにウイルス性及び病原性微生物の素性についての情報を提供することができる。
本発明の試験片は、順次配列された、特性の異なる、少なくとも2つの固体流動マトリックスを含み、全検出反応物は、第1のマトリックスに移動可能に結合し、捕捉域は2つの流動マトリックスの界面に形成される。固定された試薬は、第1のマトリックスにも第2のマトリックスにもない。本願を通して使用する「流動マトリックス」という用語は、ニトロセルロース、ナイロン、レーヨン、セルロース、紙、ガラス繊維、シリカ、任意の他の多孔質、繊維状、吸湿性又は非吸湿性材料などの材料を含めて、それを通して液体が流動することができる任意の液体透過性輸送固体材料(liquid permeable transport solid material)を指す。流動マトリックスは、好ましくは、実質的に平面状の細長い片として構成される。流動マトリックス材料は、必要に応じて、前処理又は改変することができる。
図1及び2は、全体が10で示される本発明の試験片を示す。試験片10は、長さ約1−5mmの界面域8を形成するように、裏張り層15上に順次配列された2つの流動マトリックス、すなわち、試料受け固体マトリックス2及び反応固体マトリックス4を含む。マトリックス2と4は部分的に重複する。界面重複域8は、検出可能な変化、典型的には変色が、陽性判定で出現する信号域である。マトリックス2と4は、異なる空隙率を有し、その結果異なる透過率を有するように選択される。特に、マトリックスは、マトリックス2の透過率が、マトリックス4の透過率よりも高いように選択される。マトリックス2は、ガラス繊維(GF)、ろ紙、又は当分野で公知である比較的大孔径の他のろ過若しくは網目媒体、好ましくは繊維状材料であり得る。マトリックス4は、好ましくは、ニトロセルロース(NC)又はナイロン膜であるが、これらだけに限定されない。好ましくは、膜4の孔径は、約0.22μmから約15μmの範囲である。具体的な膜4は、試験片が設計される具体的なアッセイに応じて、また、検出可能な生成物を界面8に保持するように、その検出可能な生成物に応じて、選択される。試験片は、試料の連続流動を確保する吸収剤パッド6と、上部積層体25とを更に含む。上部積層体25は、膜4を完全に覆い、膜2及び吸収剤パッド6を部分的に覆うように構成され、膜2の一部20は覆われず、そこに試料が塗布され、パッド6の大部分は露出している。吸収剤パッド6は、セルロース、ろ紙などの吸湿性材料でできており、液体は、マトリックス2及び4を通して吸い込まれ、吸収パッド6に蓄積する。パッド6のサイズ及び形状は、アッセイに用いる液体の体積に応じて選択される。パッド6の典型的な材料としては、セルロース及びろ紙が挙げられるが、これらだけに限定されない。裏面及び上部積層体15及び25は、非吸収性フィルムである。好ましくは、両方のフィルム15及び25は、試験片の両側から信号を見ることができる透明又は半透明のフィルムである。しかし、一方の面に白色フィルムを使用し、他方の面に透明フィルムを使用すると、ある適用例では信号域のコントラストを高くすることができる。製造を容易にするために、積層体15及び25は、好ましくは、剥離ライナーで保護された片面接着性プラスチックフィルムである。実際には、図1に示すように、試験片10は、積層体15をその接着面を上向きにして置き、剥離ライナーを剥がし、マトリックス2、4及び6をライナー15の上に置くことによって、組み立てられる。組立てを完了するために、積層体25をその接着面を下向きにして、上に置く。
分析物特異的検出組成物を試料受けマトリックス2上に移動可能に堆積させる。検出組成物は、マトリックス2と4の界面8に蓄積する少なくとも1種類の検出可能な生成物を分析物の存在下で生成する試薬を含む。検出組成物は、信号強度を増強する界面活性剤を更に含み得る。酵素アッセイ、例えばシアリダーゼアッセイでは、検出組成物は、発色酵素基質(例えば、シアリダーゼの存在下でインドキシルを生成する5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸(BCIN)など)及び発色試薬(インドキシルと反応して濃色の不溶性インジゴ及びホルマザン色素を生成するテトラゾリウム塩など)を含み得る。酵素アッセイの他の例においては、検出組成物は、酵素基質と、酵素反応に関与して検出可能な生成物を生成する色素生産性試薬との混合物を含み得る。かかる色素生産性試薬は、例えば、酵素の電子伝達鎖(electron transfer chain)に関与する電子受容体又は電子供与体であり得る。例えば、デヒドロゲナーゼ酵素は、デヒドロゲナーゼ基質とテトラゾリウム塩などの色素生産性電子受容体とを含む検出組成物を用いて検出することができる。ペルオキシダーゼ酵素は、ペルオキシダーゼ基質とテトラメチルベンジジン(TMB)などの色素生産性電子供与体とを含む検出組成物を用いて検出することができる。一般に、本発明の装置における酵素アッセイは、酵素組織化学に用いられる検出組成物と等価な検出組成物、すなわち当該酵素の基質と、酵素反応の存在下で不溶性着色沈殿又は検出可能な沈殿を生成する試薬とを含む組成物を選択することによって、実施することができる。
マトリックス2及び4を正しく選択することによって、着色沈殿粒子は、2つのマトリックスの界面で保持され、濃縮されて、明確な信号を発する。
流動マトリックス2上の種々の検出成分の位置は、互いに完全に若しくは部分的に重複し、又は別々の区域を含み得る。同様に、試料塗布域は、検出成分を含浸させた区域と重複し得、又は別個の区域であり得る。マトリックス2上の様々な区域の具体的位置は、十分な相互作用時間を可能にするように、試料成分全部及び検出成分全部が、マトリックス2に沿って移動し、マトリックス4に達する前に、試料流体内で十分に混合され、溶解することを前提に、変動し得ることを理解されたい。製造を単純かつ容易にするために、マトリックス2に検出成分全部を十分含浸させることが好都合である。したがって、全検出成分の混合物が溶液状態で安定であれば、マトリックス2をかかる溶液に所定時間浸漬し、乾燥させることができる。或いは、溶液が不安定であれば、マトリックス2を、相互に安定である成分のみを含む溶液に完全に又は部分的に浸漬してもよい。残りの成分は、乾燥形態の溶液成分をあらかじめ含浸した区域上、又は空いた非含浸区域上の乾燥マトリックスに載せることができる。更に別の代替法は、試料を載せる直前若しくは直後、又は試料を載せるのと実質的に同時に、1種類以上の成分をマトリックス2上に載せることである。
本発明によれば、検出組成物は、ラテックス又はコロイド状金粒子などのあらかじめ成形された標識化粒子を含まないことに注目されたい。生体分子特異的対の1メンバーに結合したかかる不活性粒子は、生体分子特異的対の第2のメンバーと複合体を形成することによって信号を発生する標識化手段として当分野で周知である。本発明によれば、以前には試験片上に存在せず、その形成に分析物の存在を必要とする、検出可能な性質、例えば明確な色を有する新しい生成物の形成によって、陽性信号が発生する。したがって、検出があらかじめ堆積された着色粒子の捕捉に基づく場合と異なり、本発明の信号は、新しい明確な検出可能な性質を有する新しい生成物の形成に基づく。検出成分と分析物の化学反応、すなわち化学結合の開裂及び形成によって形成される、この検出可能な生成物は、2つのマトリックスの界面に濃縮して、信号を増強する。好ましくは、検出可能な生成物は、透過性の低い第2のマトリックスによって保持される沈殿粒子を形成するように、試料流体に不溶であり、一方、検出組成物は、溶出流体に完全に可溶である試薬のみを含む。
試験を実施するために、試料及び溶出剤、典型的には泳動緩衝剤を、パッド2の露出端20に載せる。典型的には、試料は、水溶液又は体液である。試料は、泳動緩衝剤に前もって添加して、1つの溶液として載せることができる。或いは、試料を点在させた後に、泳動緩衝剤を載せることができる。試料溶液が試験片に沿って移動するにつれて、あらかじめ堆積された検出成分は、溶液中に再溶解して混合され、試料液が試験片に沿って移動するにつれて、試料成分と反応する。したがって、上記酵素の例においては、酵素が試料中に存在する場合、発色基質は開裂して色素生産性中間体を生成し、色素生産性中間体は発色試薬と更に反応して、濃色の生成物を生成する。着色生成物は、2つのマトリックスの重複界面8に蓄積して、明瞭な識別される信号線を生じる。図3を参照すると、陽性の結果は、信号域8における識別される線30の出現によって示され、陰性の結果は、信号域におけるかかる線の欠如によって示される。
本発明の側方流動試験片は、定性的に使用して、試験試料中の分析物の有無に対応した陽性/陰性の応答を与えることができる。この実施形態によれば、試験片は、試料を載せる受け口と、信号域における少なくとも1個の透明な窓とを備えた側方流動装置に組み込まれ、追加の装置を必要としない単純な自給式検出装置を提供することができる。較正されたスケールに信号強度を照合することによって半定量的測定をする較正色強度スケールを用いて、基準を追加することができる。或いは、分光光度計、スキャナー、濃度計、リーダー、カメラなど、ただしこれらだけに限定されない機器によって、試験片を読み、定量的結果を得ることができる。上述したように、信号は試験片の両側から見ることができるので、信号の吸光度と反射率の両方を測定することができる。
以下の詳細な実施例は、説明のためにのみ記述されるものであって、本明細書に記載する発明を限定するものではない。
シアリダーゼ試験片
以下に示すように、流体試料におけるシアリダーゼ活性を検出するためのシアリダーゼ試験片を本発明に従って構築した。アッセイは、シアリダーゼの存在下での発色シアリダーゼ基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸(BCIN)の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の更なる反応によって、2つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。BCIN及びNBTの化学構造、並びにアッセイ反応の詳細な反応スキームは、その全内容を参照により本明細書に組み入れる、同じ日に出願され、本発明の同じ譲受人に譲渡された同時係属中の出願「Dry Format Sialidase Assay」に記載されている。細菌性膣症(BV)の検出用膣スワブ試料を含めた種々の試料を、試験片を用いて試験した。
以下に示すように、流体試料におけるシアリダーゼ活性を検出するためのシアリダーゼ試験片を本発明に従って構築した。アッセイは、シアリダーゼの存在下での発色シアリダーゼ基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸(BCIN)の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の更なる反応によって、2つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。BCIN及びNBTの化学構造、並びにアッセイ反応の詳細な反応スキームは、その全内容を参照により本明細書に組み入れる、同じ日に出願され、本発明の同じ譲受人に譲渡された同時係属中の出願「Dry Format Sialidase Assay」に記載されている。細菌性膣症(BV)の検出用膣スワブ試料を含めた種々の試料を、試験片を用いて試験した。
A. NBT含浸試料パッドの調製
ガラス繊維フィルター(Millipore、GFCP0010000、10mm×10cm)をNBT溶液に暗所で室温で30分間浸漬した。浸漬したガラス繊維フィルターを吸取紙上に置いて、過剰の流体を除去し、次いで乾燥器に50℃で15分間移した。乾燥NBT含浸ガラス繊維フィルター(試料パッド)を乾燥室(RH5−10%)に室温で乾燥暗所貯蔵した。
ガラス繊維フィルター(Millipore、GFCP0010000、10mm×10cm)をNBT溶液に暗所で室温で30分間浸漬した。浸漬したガラス繊維フィルターを吸取紙上に置いて、過剰の流体を除去し、次いで乾燥器に50℃で15分間移した。乾燥NBT含浸ガラス繊維フィルター(試料パッド)を乾燥室(RH5−10%)に室温で乾燥暗所貯蔵した。
B. カードの組立て
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、シアリダーゼアッセイ用の複数の試験片を得た。
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、シアリダーゼアッセイ用の複数の試験片を得た。
1. 裏面積層体として役立ち、図2において15で示された、剥離ライナーで保護された接着剤を含む1枚の43×250mm透明プラスチックフィルム(ARcare 8876、Adhesives Research、Limerick、Ireland)を作業台の上に置いた。剥離ライナーを剥離して、テープの接着面を露出させた。
2. 反応膜(ニトロセルロースHF18004、Millipore、SA3J154101、25×300mm、Biodyne B、PALL、BNBZF3RT、25×300mm、又はBiodyne PLUS、PALL、ZNXG3R、25×300mm)を裏面カバーの接着面上、下端から8mmに取り付けた。
3. (セクションAで調製した)NBT含浸試料パッドを裏面カバーの下側の上に、反応膜上に2mm重複させて取り付けた。
4. 吸収剤パッド(ゲル吸取紙、S&S、GB003、21×300mm)を裏面カバーの上側の上に、反応膜上に12mm重複させて置いた。
5. 上部積層フィルム(ARcare 7759、Adhesives Research、Limerick、Ireland)の剥離ライナーを剥離して接着面を露出させ、接着面を下方に向けて(facing done)、試料パッド及び吸収剤パッドの上に重ねて、フィルムを反応膜上に取り付けた。
カードを乾燥室(RH5−10%)で室温で暗所で終夜硬化させた。硬化後、自動ダイカッターを用いて、カードを4mm幅の試験片に切り取った。
C. 試験片試料パッド上のBCINの含浸
BCIN(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−□−D−N−アセチルノイラミン酸)溶液1μlを試料パッド上に添加し、37℃で15分間乾燥させた。
BCIN(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−□−D−N−アセチルノイラミン酸)溶液1μlを試料パッド上に添加し、37℃で15分間乾燥させた。
D. シアリダーゼ試験片を用いた試験の実施
D1. 細菌及び精製シアリダーゼ試料
上記セクションBに記載のように構築された試験片を、シアリダーゼ産生細菌バクテロイデス フラギリス(Bacteroides fragilis)の試料、シアリダーゼ陰性細菌ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)の試料、及び精製シアリダーゼを用いて、シアリダーゼ活性について試験した。
D1. 細菌及び精製シアリダーゼ試料
上記セクションBに記載のように構築された試験片を、シアリダーゼ産生細菌バクテロイデス フラギリス(Bacteroides fragilis)の試料、シアリダーゼ陰性細菌ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)の試料、及び精製シアリダーゼを用いて、シアリダーゼ活性について試験した。
試験を開始するために、試料25μlを試験片の試料パッドに載せた。陽性シアリダーゼ反応の信号である紫褐色が、2つの異なるマトリックス(試料パッドと反応膜)の界面、すなわち信号域に蓄積した。(シアリダーゼが存在しない)陰性対照は、信号域において黄色のバックグラウンドを示した。試験ごとに信号出現時間を記録した。試験片を30分まで観察した。図5は、バクテロイデス フラギリスの試料(左側の試験片)、及び陰性対照として泳動緩衝剤(右側の試験片)を用いて得られた例示的結果である。
信号域における変色は、視覚的に観察することができ、目視で推定した強度に対応して「+」値を割り当てた(表1参照)。その代りに、又はそれに加えて、色を電気光学機器によって検出及び測定することができる。試料を試験片に載せてからの信号出現時間、及び10分における信号強度を下記表1に要約する。
D2. 臨床試料(膣スワブ)
47個の臨床試料を試験して、細菌性膣症BVの診断に対するシアリダーゼ試験片の臨床上の関連性を試験した。Wolfson Medical Center, Holon, IsraelのGenitourinary Infectionsユニットのボランティアから膣分泌物試料を得た。膣分泌物は、無菌スワブ(552C、Copan、Italia)を用いて医師によって収集された。スワブ頭部(先端)を2mlねじ口管に入れ、使用まで4℃で保存した。泳動緩衝剤300μlを管に添加し、1分間ボルテックス撹拌することによって膣スワブを洗浄して、分泌物をスワブから溶出させ、均質試料を得た。各膣スワブについて、グラム染色及びNugentスコアリングによって、BVを診断した(RP Nugent et al. Reliability of Diagnosing Bacterial Vaginosis Is Improved by a Standardized Method of Gram Stain Interpretation(J. Clin. Microbiol., 29:297−301(1999))。スワブ洗液300μlから25μlを試験用に採取した。培養試料について上述したように試験を実施した。
47個の臨床試料を試験して、細菌性膣症BVの診断に対するシアリダーゼ試験片の臨床上の関連性を試験した。Wolfson Medical Center, Holon, IsraelのGenitourinary Infectionsユニットのボランティアから膣分泌物試料を得た。膣分泌物は、無菌スワブ(552C、Copan、Italia)を用いて医師によって収集された。スワブ頭部(先端)を2mlねじ口管に入れ、使用まで4℃で保存した。泳動緩衝剤300μlを管に添加し、1分間ボルテックス撹拌することによって膣スワブを洗浄して、分泌物をスワブから溶出させ、均質試料を得た。各膣スワブについて、グラム染色及びNugentスコアリングによって、BVを診断した(RP Nugent et al. Reliability of Diagnosing Bacterial Vaginosis Is Improved by a Standardized Method of Gram Stain Interpretation(J. Clin. Microbiol., 29:297−301(1999))。スワブ洗液300μlから25μlを試験用に採取した。培養試料について上述したように試験を実施した。
表2は、BVを診断し、シアリダーゼ試験片を用いて試験した、47個の膣スワブ洗液の結果の要約である。
シアリダーゼ試験片の感度及び特異性は100%である。表1及び2に要約した結果は、提案するシアリダーゼ試験片をBVの診断に使用できることを明確に示している。
シアリダーゼアッセイ用溶液の材料及び調製:
NBT溶液 50mM MES(M−8250、Sigma−Aldrich、Rehovoth、Israel)緩衝剤pH6.0中の2mg/ml NBT(塩化ニトロブルーテトラゾリウム、N−8100 Biosynth AG、Switzerland)、5%スクロース(5553810、Frutarom、Haifa、Israel)、0.1%MgCl2(1200310、Merck、Darmstadt、Germany);Surfynol−440を含むNBT溶液 50mM MES(M−8250、Sigma−Aldrich、Rehovoth、Israel)緩衝剤pH6.0中の2mg/ml NBT(塩化ニトロブルーテトラゾリウム、N−8100 Biosynth AG、Switzerland)、5%スクロース(5553810、Frutarom、Haifa、Israel)、0.1%MgCl2(1200310、Merck、Darmstadt、Germany)、0.5%Surfynol−440(2,4,7,9テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシラート1.75EO/OH、Aldrich、461180);BCIN溶液 二段蒸留水1ml中のBCIN(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩、B4666、Sigma)35.3mg;泳動緩衝剤 TBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8中の0.5%PEG(ポリエチレングリコール−15000、Merck、819003)、0.5%BSA(01200050、Seracare、CA、USA)、0.1%Tween 20(Sigma、P−5927)、0.1%MgCl2(Merck 1200310)。
NBT溶液 50mM MES(M−8250、Sigma−Aldrich、Rehovoth、Israel)緩衝剤pH6.0中の2mg/ml NBT(塩化ニトロブルーテトラゾリウム、N−8100 Biosynth AG、Switzerland)、5%スクロース(5553810、Frutarom、Haifa、Israel)、0.1%MgCl2(1200310、Merck、Darmstadt、Germany);Surfynol−440を含むNBT溶液 50mM MES(M−8250、Sigma−Aldrich、Rehovoth、Israel)緩衝剤pH6.0中の2mg/ml NBT(塩化ニトロブルーテトラゾリウム、N−8100 Biosynth AG、Switzerland)、5%スクロース(5553810、Frutarom、Haifa、Israel)、0.1%MgCl2(1200310、Merck、Darmstadt、Germany)、0.5%Surfynol−440(2,4,7,9テトラメチル−5−デシン−4,7−ジオールエトキシラート1.75EO/OH、Aldrich、461180);BCIN溶液 二段蒸留水1ml中のBCIN(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム塩、B4666、Sigma)35.3mg;泳動緩衝剤 TBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8中の0.5%PEG(ポリエチレングリコール−15000、Merck、819003)、0.5%BSA(01200050、Seracare、CA、USA)、0.1%Tween 20(Sigma、P−5927)、0.1%MgCl2(Merck 1200310)。
細菌培養物
シアリダーゼ産生細菌:バクテロイデス フラギリス(ATCC #23745)107cfu/mlの培養。培養物を泳動緩衝剤で以下の細胞数、すなわち、5*104、2.5*104 104及び5*103に希釈することによって試料25μlを調製した。シアリダーゼ陰性細菌:ラクトバチルス プランタルム(ATCC #14917)108cfu/mlの培養。培養物を泳動緩衝剤で希釈することによって、5*105細胞を含む試料25μlを調製した。精製シアリダーゼ クロストリジウム パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)から得られた精製組換え細菌シアリダーゼ(P0720L、ノイラミニダーゼ)をNew England Biolabs、MA、USA)から入手した。精製シアリダーゼを泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、5単位及び1単位/試料に希釈することによって、試料25μlを調製した。
シアリダーゼ産生細菌:バクテロイデス フラギリス(ATCC #23745)107cfu/mlの培養。培養物を泳動緩衝剤で以下の細胞数、すなわち、5*104、2.5*104 104及び5*103に希釈することによって試料25μlを調製した。シアリダーゼ陰性細菌:ラクトバチルス プランタルム(ATCC #14917)108cfu/mlの培養。培養物を泳動緩衝剤で希釈することによって、5*105細胞を含む試料25μlを調製した。精製シアリダーゼ クロストリジウム パーフリンジェンス(Clostridium perfringens)から得られた精製組換え細菌シアリダーゼ(P0720L、ノイラミニダーゼ)をNew England Biolabs、MA、USA)から入手した。精製シアリダーゼを泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、5単位及び1単位/試料に希釈することによって、試料25μlを調製した。
アルカリホスファターゼ試験片
流体試料におけるアルカリホスファターゼ(AP)活性の検出用試験片を実施例1で上述した様式と同様に構築した。アッセイは、APの存在下での発色ホスファターゼ基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファート(BCIP)の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の更なる反応によって、2つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。本試験片例と上記試験片例の主な相違は、本実施例においては、試料受けマトリックスを発色基質BCIPと発色試薬NBTの両方を含有する溶液に浸漬したことであった。
流体試料におけるアルカリホスファターゼ(AP)活性の検出用試験片を実施例1で上述した様式と同様に構築した。アッセイは、APの存在下での発色ホスファターゼ基質5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファート(BCIP)の加水分解によってインドキシルを生成すること、並びに生成したインドキシルとニトロブルーテトラゾリウム(NBT)の更なる反応によって、2つのマトリックスの界面に蓄積するインジゴ及びホルマザンを生成することに基づく。本試験片例と上記試験片例の主な相違は、本実施例においては、試料受けマトリックスを発色基質BCIPと発色試薬NBTの両方を含有する溶液に浸漬したことであった。
A. BCIP−NBT含浸試料パッドの調製
ガラス繊維フィルター(Millipore、GFCP0010000、10mm×10cm)をBCIP−NBT溶液(0.1M Tris緩衝剤pH9.6中の0.2mg/ml BCIP+0.3mg/ml NBT)に暗所で室温で30分間浸漬する。ガラス繊維フィルターを乾燥器に移し、50℃で15分間乾燥させる。BCIP−NBT含浸ガラス繊維フィルター(試料パッド)を乾燥室(RH5−10%)に室温で乾燥暗所貯蔵する。
ガラス繊維フィルター(Millipore、GFCP0010000、10mm×10cm)をBCIP−NBT溶液(0.1M Tris緩衝剤pH9.6中の0.2mg/ml BCIP+0.3mg/ml NBT)に暗所で室温で30分間浸漬する。ガラス繊維フィルターを乾燥器に移し、50℃で15分間乾燥させる。BCIP−NBT含浸ガラス繊維フィルター(試料パッド)を乾燥室(RH5−10%)に室温で乾燥暗所貯蔵する。
B. カードの組立て、及び試験片の切り出し
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、APアッセイ用の複数の試験片を形成した。
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、APアッセイ用の複数の試験片を形成した。
1. 剥離ライナーで保護された接着剤を含む43×250mm透明プラスチックフィルム、すなわち裏面カバー(ARcare 8876、Adhesives Research、Limerick、Ireland)を作業台の上に置いた。剥離ライナーを剥離して、テープの接着面を露出させた。
2. 反応膜(ニトロセルロースHF 18004、Millipore、SA3J154101、25×300mmを裏面カバーの接着面上、下端から8mmに取り付けた。
3. BCIP−NBT含浸試料パッドを裏面カバーの下側の上に、反応膜上に2mm重複させて取り付けた。
4. 吸収剤パッド(ゲル吸取紙、S&S、GB003、21×300mm)を裏面カバーの上側の上に、反応膜上に12mm重複させて置いた。
5. 上部積層フィルム(ARcare 7759、Adhesives Research、Limerick、Ireland)の剥離ライナーを剥離して接着面を露出させ、接着面を下方に向けて、試料パッド及び吸収剤パッドの上に重ねて、フィルムを反応膜上に取り付けた。
C. 抗ジゴキシゲニンAPを用いたアルカリホスファターゼ(AP)活性の試験
a. 抗ジゴキシゲニンAP(Roche 1093274 0.75単位/μl)をTBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8で以下のレベル、すなわち、0.0375単位/試験、0.00375単位/試験及び0.000375単位/試験に希釈することによって試料25μlを調製した。
a. 抗ジゴキシゲニンAP(Roche 1093274 0.75単位/μl)をTBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8で以下のレベル、すなわち、0.0375単位/試験、0.00375単位/試験及び0.000375単位/試験に希釈することによって試料25μlを調製した。
b. 試料25μlを試験片の試料パッドに載せた。
結果:
試験結果を図6に示す。陽性反応の信号である紫褐色が、2つの異なるマトリックス(試料パッドと反応膜)の界面、すなわち信号域に蓄積した。(抗ジゴキシゲニンAPが存在しない)陰性対照は、信号を発生しなかった。
試験結果を図6に示す。陽性反応の信号である紫褐色が、2つの異なるマトリックス(試料パッドと反応膜)の界面、すなわち信号域に蓄積した。(抗ジゴキシゲニンAPが存在しない)陰性対照は、信号を発生しなかった。
陽性信号はすべて3分以内に出現した。
ペルオキシダーゼ試験片
流体試料におけるペルオキシダーゼ(POD)活性の検出用試験片を実施例1及び2で上述した様式と同様に構築した。しかし、この実施例では、試料受けマトリックスは、検出試薬を含浸されなかったが、その清浄な未処理形態の試験片に組み立てられた。テトラメチルベンジジン(TMB)を色素原として含む発色ペルオキシダーゼ基質混合物の市販溶液を試験片に載せ、直後に試料を載せた。ペルオキシダーゼの存在下で、TMB基質混合物は着色生成物を生成する。2種類のTMBペルオキシダーゼ基質混合物Sigma T0565及びPierce #34028を試験した。Sigma基質は、不溶性生成物を生成すると報告され、膜用に推奨される。Pierce基質は、可溶性生成物基質を生成し、ELISA用に意図されている。
流体試料におけるペルオキシダーゼ(POD)活性の検出用試験片を実施例1及び2で上述した様式と同様に構築した。しかし、この実施例では、試料受けマトリックスは、検出試薬を含浸されなかったが、その清浄な未処理形態の試験片に組み立てられた。テトラメチルベンジジン(TMB)を色素原として含む発色ペルオキシダーゼ基質混合物の市販溶液を試験片に載せ、直後に試料を載せた。ペルオキシダーゼの存在下で、TMB基質混合物は着色生成物を生成する。2種類のTMBペルオキシダーゼ基質混合物Sigma T0565及びPierce #34028を試験した。Sigma基質は、不溶性生成物を生成すると報告され、膜用に推奨される。Pierce基質は、可溶性生成物基質を生成し、ELISA用に意図されている。
A. 泳動緩衝剤
TBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8中の0.5%PEG(ポリエチレングリコール−15000、Merck、819003)、0.5%BSA(01200050、Seracare、CA、USA)、0.1%Tween 20(Sigma、P−5927)、0.1%MgCl2(Merck 1200310)
B. カードの組立て、及び試験片の切り出し
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、PODアッセイ用の複数の試験片を形成した。
TBS(Tris緩衝食塩水)pH7.8中の0.5%PEG(ポリエチレングリコール−15000、Merck、819003)、0.5%BSA(01200050、Seracare、CA、USA)、0.1%Tween 20(Sigma、P−5927)、0.1%MgCl2(Merck 1200310)
B. カードの組立て、及び試験片の切り出し
以下の手順、並びにカード成分の各々の正確な長軸方向の寸法及び位置を明記した図4に従って、試験カードを組み立てた。調製後、カードを切り取って、PODアッセイ用の複数の試験片を形成した。
1. 剥離ライナーで保護された接着剤を含む43×250mm透明プラスチックフィルム、すなわち裏面カバー(ARcare 8876、Adhesives Research、Limerick、Ireland)を作業台の上に置いた。剥離ライナーを剥離して、テープの接着面を露出させた。
2. 反応膜(ニトロセルロースHF 18004、Millipore、SA3J154101、25×300mmを裏面カバーの接着面上、下端から8mmに取り付けた。
3. 試料パッド(ガラス繊維フィルター、Millipore、GFCP0010000、10mm×10cm)を裏面カバーの下側の上に、反応膜上に2mm重複させて取り付けた。
4. 吸収剤パッド(ゲル吸取紙、S&S、GB003、21×300mm)を裏面カバーの上側の上に、反応膜上に12mm重複させて置いた。
5. 上部積層フィルム(ARcare 7759、Adhesives Research、Limerick、Ireland)の剥離ライナーを剥離して接着面を露出させ、接着面を下方に向けて、試料パッド及び吸収剤パッドの上に重ねて、フィルムを反応膜上に取り付けた。
C. 抗ジゴキシゲニンPODを用いたペルオキシダーゼ(POD)活性の試験
a. 抗ジゴキシゲニンPOD(Roche 1207733 0.15単位/μl)を泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、7.5単位/試験、0.75単位/試験及び0.075単位/試験に希釈することによって試料25μlを調製した。
a. 抗ジゴキシゲニンPOD(Roche 1207733 0.15単位/μl)を泳動緩衝剤で以下のレベル、すなわち、7.5単位/試験、0.75単位/試験及び0.075単位/試験に希釈することによって試料25μlを調製した。
b. テトラメチルベンジジン(TMB)基質混合物(Sigma T0565又はPierce #34028)5μlを試験片の試料パッド上に置いた。
c. 試料25μlを試料パッドに載せた。
結果:
図7は、Sigma基質及びPierce基質を用いて得られた結果である。陽性反応の信号である青紫色が、試料パッド、及び2つの異なるマトリックス(試料パッドと反応膜)の界面、すなわち信号域に蓄積した。(抗ジゴキシゲニンPODが存在しない)陰性対照は、信号を発生しなかった。陽性信号はすべて3分以内に出現した。
図7は、Sigma基質及びPierce基質を用いて得られた結果である。陽性反応の信号である青紫色が、試料パッド、及び2つの異なるマトリックス(試料パッドと反応膜)の界面、すなわち信号域に蓄積した。(抗ジゴキシゲニンPODが存在しない)陰性対照は、信号を発生しなかった。陽性信号はすべて3分以内に出現した。
本発明は、上で特に示した、また、記載したものに限定されないことを当業者は理解されたい。より正確に言えば、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって規定される。
Claims (20)
- 流体試料中の分析物の検出用に構成された試験片であり、
第1の流動マトリックスと第2の流動マトリックスの間に界面を形成するように順次配置された第1の流動マトリックスと第2の流動マトリックスを含み、前記第1の流動マトリックスは、マトリックスに移動可能に結合した検出組成物を含み、検出組成物は、分析物の存在下で少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成し、並びに第1及び第2の固体マトリックスは、流体試料が第1の流動マトリックスから第2の流動マトリックスに移動するときに、前記少なくとも1種類の検出可能な生成物を前記界面に蓄積するように選択される、試験片。 - 前記検出組成物の少なくとも1成分が、再溶解可能な乾燥形態で、前記第1のマトリックス上に堆積された、請求項1の片。
- 前記第1のマトリックスが、前記第2のマトリックスよりも高い空隙率である、請求項1の片。
- 第1のマトリックスを通る前記少なくとも1種類の検出可能な生成物の輸送率が、第2のマトリックスを通る前記少なくとも1種類の検出可能な生成物の輸送率よりも高い、請求項1の片。
- 第1のマトリックスがガラス繊維又はろ紙であり、並びに第2のマトリックスがニトロセルロース又はナイロン膜である、請求項1の片。
- 前記少なくとも1種類の生成物が、試料流体に不溶である、請求項1の片。
- 前記検出組成物が試料流体に可溶である、請求項1の片。
- 前記第1及び第2のマトリックスが、裏張り(backing)及び上部不透過性積層体に挟まれている、請求項1の片。
- 前記裏張り及び上部積層体の少なくとも一方が透明又は半透明である、請求項8の片。
- 前記分析物が酵素であり、並びに前記検出組成物が、前記酵素に特異的である発色基質試薬系を含む、請求項1の片。
- 流体試料中の酵素の検出用の片であり、
第1のマトリックスと第2のマトリックスの間に接合部を形成する、非吸収性固体支持体上に順次配置された第1のマトリックスと第2のマトリックスを含み、
第1のマトリックスが、移動可能に結合した酵素検出組成物を備え、組成物が、前記酵素に曝露されると少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成する成分の組合せを含み、並びに
前記第1及び第2のマトリックスが、流体試料が第1の流動マトリックスから第2の流動マトリックスに移動するときに、前記少なくとも1種類の検出可能な生成物を前記接合部に蓄積するように選択される、片。 - 前記検出可能な生成物が試料流体に不溶である、請求項11の片。
- 前記酵素検出組成物が、前記酵素の発色基質を含む、請求項11の片。
- 前記酵素検出組成物が色増強剤を更に含む、請求項13の片。
- 前記基質がインドキシル基を含む、請求項13の片。
- 酵素検出組成物がテトラゾリウム塩を更に含む、請求項15の片。
- 前記酵素検出組成物が、前記酵素の基質及び色素生産性試薬を含み、前記色素生産性試薬が、酵素及び酵素基質間の酵素反応の存在下で、検出可能な着色生成物を生成する、請求項11の片。
- 前記色素生産性試薬が電子供与体又は電子受容体である、請求項17の片。
- 流体試料中の分析物を検出する方法であり、
請求項1から10のいずれかに記載の試験装置を用意する段階、
前記試験装置を流体試料に曝露する段階、並びに
変色の出現を観察する段階
を含み、識別される変色の出現が前記流体試料中の分析物の存在を示す、方法。 - 流体試料中の分析物を検出するようになされた試験装置を製造する方法であり、
分析物を検出するための検出組成物を選択する段階(前記検出組成物は、前記分析物に曝露されると、少なくとも1種類の検出可能な生成物を生成するように選択される。)、
特性の異なる第1及び第2の流動マトリックスを選択する段階(前記第1及び第2の流動マトリックスは、試料が第1のマトリックスから第2のマトリックスに移動するときに、前記少なくとも1種類の検出可能な生成物を前記第1及び第2のマトリックスの界面に保持するように選択される。)、
前記第1及び第2のマトリックスを、その間に界面を形成するように、非吸収性支持体上に順次配置する段階、並びに
第1のマトリックスに所定量の前記検出組成物を供給する段階
を含む、方法。
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