JPH11502717A - 逆ツーハイブリッドシステム - Google Patents

逆ツーハイブリッドシステム

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JPH11502717A JP8531174A JP53117496A JPH11502717A JP H11502717 A JPH11502717 A JP H11502717A JP 8531174 A JP8531174 A JP 8531174A JP 53117496 A JP53117496 A JP 53117496A JP H11502717 A JPH11502717 A JP H11502717A
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Abstract

(57)【要約】 分子間の相互作用（たとえば、蛋白質／蛋白質、蛋白質／DNA、蛋白質／RNA、またはRNA／RNA間の相互作用）を同定する方法について開示する。本発明に含まれる全ての方法は、逆選択法および少なくとも２つのハイブリッド分子を用いるものである。相互作用する分子は、転写因子を再構成し、レポーター遺伝子の発現を指向するため、続いてこの発現について解析する。本発明の方法の実施に有用な遺伝子構築物についても開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 逆ツーハイブリッドシステム 連邦政府の助成研究である旨の記述 本発明は、少なくとも部分的に、連邦政府の助成金を受けて行われたものであ るため、政府は、本発明において一定の権利を有する。 発明の背景 本発明は、分子（たとえば、蛋白質および／またはRNA分子）間の相互作用の 特徴付けをインビボで行うための方法に関する。 非常に多くの生物学的に重要な機能が、DNA分子と蛋白質、RNA分子と蛋白質、 ２つ以上の蛋白質もしくはRNA分子、またはリガンドとレセプターとの間の、一 過性の相互作用に関与している。たとえば、細胞周期のほとんどの段階で、腫瘍 抑制遺伝子産物であるpRbは転写因子であるE2Fに結合しその活性を抑制する。E2 F活性は、少なくとも７個の蛋白質を含むファミリーによりもたらされる。ある サブファミリー（E2F-1、-2、-3、-4および-5）のメンバーは他のサブファミリ ー（DP-1および-2）のメンバーとヘテロダイマーを形成する。これらのヘテロダ イマーは標的遺伝子のプロモーターに結合し、細胞周期の特定の段階においてそ の転写を活性化する。 E2F/DP複合体の転写活性は、「ポケット」蛋白質と呼ばれる機能的に関連のあ るいくつかの蛋白質のいずれによっても抑制される。p107、p130およびpRb（網 膜芽腫蛋白質）と呼ばれる蛋白質がこの範囲に含まれる。ポケット蛋白質はE2F/ DP複合体と直接相互作用することによりその転写阻害活性を発揮する。E2F活性 が必要とされる、細胞周期のG1期からS期への移行期において、ポケット蛋白質 がリン酸化され、それによりpRbとE2Fとの解離が起こり、E2F転写因子が活性化 される。 E2Fとポケット蛋白質との間の、およびE2FとDPファミリーのメンバーとの間の 相互作用の生理学的な関連が、いくつかの観察により支持されている：(i)様々 な腫瘍において、RB遺伝子の両方のコピーが機能的変異を失っており、野生型の RB遺伝子の再導入により腫瘍形成能が低下する；(ii)実験的な系でE2F-1を過剰 発現させると、悪性形質転換が起こる；(iii)pRbキナーゼの正調節サブユニット であるサイクリンDをコードする遺伝子であるPRAD1は、染色体の再構成の結果と して 、多くの腫瘍において過剰発現する；(iv)ある種のDNA腫瘍ウイルスの腫瘍形成 活性には、E2Fと蛋白質との相互作用の破壊が必要である。アデノウイルスのE1A、 SV40のラージ(large)T抗体、およびヒトパピローマ（Papilloma）ウイルスのE7 などの腫瘍形成蛋白質は、pRbを介したE2Fの抑制を排除することができ、その結 果宿主細胞が不適切に細胞周期に入る。pRbとE2Fとの相互作用に影響を与えるこ となく、腫瘤形成ウイルス蛋白質とpRbとの相互作用を不安定化させることので きる化合物は、これらのウイルスに関係した癌を治療または予防するのに治療的 に利用できる。 制御蛋白質間の相互作用についての先行する研究により、蛋白質がどのように 相互作用するかについて重要なパラダイムが明らかになっている。たとえば、蛋 白質／蛋白質相互作用の研究により、いくつかの構造的モチーフ（たとえば、ヘ リックス-ループ-ヘリックスモチーフ、SH2およびSH3ドメイン、ならびにロイシ ンジッパー）が同定された。E2F、Dp、およびポケット蛋白質の一次アミノ酸配 列はこれらの既知のモチーフのいずれとも類似していない。従って、この新規の 制御蛋白質ファミリーに関する蛋白質／蛋白質相互作用の詳細な研究を可能にす る簡便な方法があれば、蛋白質／蛋白質相互作用のための新しいモチーフが明ら かになると考えられる。E2F-1/Dp-1相互作用ドメインはE2F-1の第120〜310アミ ノ酸およびDp-1の第205〜277アミノ酸に位置決定されている。対照的に、E2F-1/ pRb相互作用ドメインはE2F-1の第409〜427アミノ酸に位置決定されている。よっ て、E2F-1上にあるDp-1およびpRb結合部位は重複していない。従って、うまく変 異を起こせばE2F-1のpRbへの結合能に影響を与えることなくE2F-1のDP-1への結 合能を変えることができると考えられる。同様に、ある種の化学物質も、E2F-1 のpRbへの結合能に影響を与えることなくE2F-1のDP-1への結合能を変えることが できると考えられる。 逆選択マーカー：選択マーカーとは、特定の状況下で選択マーカーを発現する 細胞のみの増殖を促進するために用いるものであるが、逆選択マーカーは、特定 の状況下で、逆選択マーカーを失った細胞のみの増殖を促進するために用いられ るものである。逆選択マーカーは、プラスミド上に存在するときには、そのプラ スミドを失った細胞を選択するのに用いることができ、この方法はプラスミド「 シャッフリング(Shuffling)」と呼ばれる（たとえば、シコルスキ(Sikorski)お よびブーケ(Boeke)、1991，Meth．in Enzymol．194:302）。例えば、オロチジン -5'リン酸をコードするura3遺伝子の発現は、5-フルオロ-オロト酸(5-FOA)含有 培地の存在下では致死的である。URA3を発現する細胞は、ウラシル非含有培地で 培養することにより正の選抜ができ、したがって、培養条件次第でURA3は正また は負のいずれの条件にも利用できる。α-アミノアジピン酸リダクターゼをコー ドするLYS2遺伝子も、逆選択に用いることができる；LYS2を発現する酵母細胞は 、一次窒素源としてα-アミノアジピン酸を含む培地上では増殖しない。同様に 、α-アミノアジピン酸を含む培地上でのLYS5の発現は致死的である。リジンの 生合成に関与するこれらの遺伝子は、リジンを含まない培地で正の選択が可能で ある。もう一つの逆選択レポーター遺伝子は、アルギニン透過酵素をコードする CAN1遺伝子である。アルギニン非存在下、およびカナバニン存在下でのこの遺伝 子の発現は致死的である。同様に、シクロヘキシミド存在下における逆選択遺伝 子CYH2の発現は致死的である。逆選択レポーター遺伝子の発現は、転写を活性化 する能力を阻害するエストロゲンレセプターの活性化ドメインにおける変異を同 定するのに利用されている（ピーラット(Pierrat)ら、1992，Gene 119:237〜245 ）。 発明の概要 本発明者らは、逆選択を用いる遺伝学的なスクリーニング・システムが、分子 的な相互作用の特徴を双方向的な形で調べるための便利な方法を提供することを 発見した。したがって、本発明は、２つの分子（例えば、蛋白質、RNA分子、ま たはDNA分子）が相互作用するか否かを判定するために用いることができる。さ らに、逆選択を用い、また、レポーター遺伝子の発現レベルを測定することによ って、２つの分子がどの程度相互作用するのかを判定するために、本発明を用い ることができる。したがって、本発明に係る方法は、いずれも、逆選択法を用い 、本発明の態様のほとんどが、２つ以上のハイブリッド蛋白質を用いるために、 これらの方法は逆ツー・ハイブリッドシステムと名づけられている。本発明は、 （i）２つの蛋白質が、２つの別個の核酸ライブラリー（例えば、両方向組合せ ライブラリー）から発現されうる場合に、第一の分析用蛋白質が第二の分析用蛋 白質と相互作用することができるか否かを判定するための方法で、原則として、 この方 法によって、所定のゲノムにおけるすべての蛋白質／蛋白質相互作用を同定する ことができるようになる方法、（ii）ある化合物が蛋白質／蛋白質相互作用を阻 害できるか否かを判定するための方法、（iii）第一の分析用蛋白質が第二の分 析用蛋白質と相互作用することができ、かつ、第三の蛋白質とは相互作用できな いことを判定するための方法、（iv）分析用蛋白質が分析用RNA分子と相互作用 することができるか否かを判定するための方法、（v）第一の分析用RNA分子が第 二の分析用RNA分子と相互作用することができるか否かを判定するための方法、 （vi）蛋白質／蛋白質相互作用に影響する突然変異を同定する（２段階選抜）た めの方法、（vii）蛋白質／蛋白質相互作用に影響する、蛋白質の条件的な遺伝 子座を同定するための方法、（viii）蛋白質／蛋白質相互作用に影響する補償変 異(compensatory mutations)を同定するため（二価遺伝学）の方法、および（ix ）蛋白質／DNA相互作用を同定するための方法を提供する。本発明は、また、開 示された方法を用いて、分子の相互作用を同定するために有用な、酵母菌株とい くつかの遺伝子構築物を特徴とする。 本発明は、一つの局面において、第一の分析用蛋白質が第二の分析用蛋白質と 相互作用できるか否かを判定するための方法を特徴とする。この方法には、以下 の段階が含まれる： （ａ）第一の集団の複数の細胞が（i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的 に結合した選択用／逆選択用レポーター遺伝子と、（ii）DNA結合蛋白質認識部 位に特異的に結合できるDNA結合部分に共有結合した第一の分析用蛋白質を含む 第一のハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子を含む接合受容能のあ る細胞（接合コンピテント細胞）の第一の集団を提供する段階、 （ｂ）第二集団の複数の細胞が（i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に 結合した選択用／逆選択用レポーター遺伝子と、（ii）遺伝子活性化部分に共有 結合した第二の分析用蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第二 の融合遺伝子とを含む、接合コンピテント細胞の第二の集団を提供する段階、 （ｃ）逆選択用レポーター遺伝子の発現が該細胞の増殖を阻害するような条件 下で、接合コンピテント細胞の第一集団と第二集団を別個に維持する段階、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の第 一集団と第二集団を混合する段階、および （ｅ）第一の分析用蛋白質が第二の分析用蛋白質と相互作用できることを測定 する指標として、レポーター遺伝子の発現を検出する段階であり、このレポータ ー遺伝子は、第一の接合コンピテント細胞または第二の接合コンピテント細胞に 含まれている第一もしくは第二のレポーター遺伝子または別のレポーター遺伝子 であって、第一または第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合されている 。 本発明のこの局面において、第一および第二の分析用蛋白質のペプチド配列は 、意図的に設計したものでも、無作為に作製したものでもよい。必要に応じて、 ２つの分析用蛋白質のうちの１つの配列を意図的に設計し、もう１つを無作為に 作製してもよい。本発明のさらに別の態様において、蛋白質の一部分を意図的に 設計し、別の部分を無作為に作製してもよい。好ましくは、本発明のこの局面で 用いられる選択用／逆選択用レポーター遺伝子は、URA3、LYS2およびGAL1からな る群より選択される。必要に応じて、第一逆選択用レポーター遺伝子および第二 逆選択用レポーター遺伝子は同一のものであってもよく（例えば、逆選択用遺伝 子が２つともURA3であってもよい）、２つの異なる逆選択用レポーター遺伝子を 用いてもよい（例えば、URA3とLYS2）。 第二の局面において、本発明は、分析用化合物が、第一の分析用蛋白質と第二 の分析用蛋白質との間の結合を阻害または妨害できるか否かを判定するための方 法を特徴とする。この方法には、以下の段階が含まれる。すなわち、 （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子を含み、（ii）DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分に 共有結合した第一の分析用蛋白質を含む第一のハイブリッド蛋白質を発現させる 第一の融合遺伝子を含み、また、（iii）分析用化合物の非存在下で第一の分析 用蛋白質に結合する遺伝子活性化部分に共有結合した第二の分析用蛋白質を含む 第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子を含む細胞を提供する 段階、 （ｂ）逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の増殖が阻害されるよ うな条件下で、この細胞と分析用化合物とを接触させる段階、 （ｃ）この化合物が、第一の分析用蛋白質と第二の分析用蛋白質との間の結合 を阻害または妨害できることを示す指標として、逆選択用レポーター遺伝子の発 現の阻害を検出すること。 本発明のこの局面において、第一の分析用蛋白質および第二の分析用蛋白質は 、分析用化合物が存在しないときには、互いに作用し合うことが分かっていなけ ればならない。分析用蛋白質の適切な組み合わせには、例えば、cFosとcJun、cJ unとcJun、およびE2F1とpRbが含まれる。分析する化合物は、小さな有機分子ま たは蛋白質（例えば、核酸ライブラリーの核酸によってコードされている蛋白質 または無作為に作製されたペプチド配列）など、いかなる分子でもよい。分析用 化合物として用いられる、好ましい蛋白質の例には、アデノウイルスのE1A、SV4 0のラージＴ抗原、およびヒト・パピローマウイルスのE7が含まれる。細胞の増 殖を測定することによって、通常は、逆選択用レポーター遺伝子が発現されると 細胞毒性となるような化合物の存在下で、逆選択用レポーター遺伝子の発現が阻 害されたことを検出することができる。本発明のこの態様において、適切な逆選 択用レポーター遺伝子には、URA3、LYS2、GAL1、CYH2およびCAN1が含まれる。 本発明は、また、第一の分析用蛋白質が、第二の分析用蛋白質と相互作用する ことができ、第三の分析蛋白質とは相互作用できないことを判定するための方法 を特徴とする。この方法には、以下の段階が含まれる。すなわち、 （ａ）（i）遺伝子活性化部分に共有結合した第一の分析用蛋白質を含む第一 のハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子、 （ii）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合したレポーター遺伝子、 （iii）第一のDNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合することはできるが、第 二のDNA結合蛋白質認識部位には特異的に結合することができないDNA結合部分に 共有結合した第二分析用蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第 二の融合遺伝子、 （iv）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター 遺伝子、および （v）第二のDNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合することができるが、第一 のDNA結合蛋白質認識部位には特異的に結合することができない第二のDNA結合部 分に共有結合した第三の分析用蛋白質を含む第三のハイブリッド蛋白質を発現さ せる第三の融合遺伝子 を含む細胞を提供する段階、 （ｂ）レポーター遺伝子の発現を検出することができ、その発現によって、細 胞の増殖は阻害されないが、逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の 増殖が阻害されるような条件下で、細胞を維持する段階、ならびに （ｃ）第一の分析用蛋白質が第二の分析用蛋白質と相互作用できることを示し 、また、第一の分析用蛋白質が第三の分析用蛋白質とは相互作用できないことを 示す指標として、細胞の増殖と選択用レポーター遣伝子の発現とを検出すること 。 必要に応じて、ポリペプチド、核酸、または有機小分子などの分析用化合物の 存在下で、第一の分析用蛋白質が、第二の分析用蛋白質と相互作用することがで き、第三の分析蛋白質とは相互作用できないことを測定することができる。ポリ ペプチドが、分析用化合物として作用するとき、このポリペプチドは、無作為に 作製されたポリペプチド配列でも、意図的に設計されたポリペプチド配列でも、 核酸ライブラリーの中に含まれている核酸によってコードされているものでもよ い。さらに、分析用蛋白質はいずれも、無作為に作製されたポリペプチド配列ま たは好ましい蛋白質を突然変異させたものを含むことができる。有用な逆選択用 レポーター遺伝子には、URA3、LYS2、GAL1、CYH2およびCAN1が含まれる。好まし いレポーター遺伝子には、LEU2、TRP1、HIS3およびLacZが含まれる。 本発明は、さらに、分析用RNA分子が分析用蛋白質と相互作用することができ るか否かを判定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）第一の集団の複数の細胞が、 （i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合された選択用／逆選択用 レポーター遺伝子、 （ii）分析用RNA分子が無作為でないRNA分子に共有結合している第一のハイ ブリッドRNA分子を発現させる第一の融合遺伝子、および （iii）第一のDNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分で 、無作為でないRNA分子に特異的に結合することができるRNA結合部分に共有結合 したDNA結合部分を有する第一のハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺 伝子 を含む、接合コンピテント細胞の第一集団を提供する段階、 （ｂ）第二の集団の複数の細胞が、 （i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用／逆選択用レ ポーター遺伝子、および （ii）遺伝子活性化部分に共有結合した分析用蛋白質を発現させる第三融合 遺伝子を含む接合コンピテント細胞の第二の集団を提供する段階、 （ｃ）選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現が集団の細胞の増殖を阻害す るような条件下で、接合コンピテント細胞の第一集団と第二集団を別個に維持す る段階、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の第 一集団と第二集団を混合する段階、ならびに （ｅ）分析用RNA分子が分析用蛋白質と相互作用できることを測定する指標と して、選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出することを含む。 必要に応じて、分析用RNA分子および／または分析用蛋白質には、無作為に作 製したヌクレオチドもしくはアミノ酸配列が含まれていてもよく、または分析用 RNA分子および／または分析用蛋白質を、意図的に設計することもできる。選択 的に、蛋白質（例えば、意図的に設計された蛋白質または無作為に作製された蛋 白質、核酸ライブラリーの核酸によってコードされている蛋白質）のような分析 用化合物（例えば、相互作用の解離因子または安定化因子）の存在下で、分析用 RNA分子と分析用蛋白質とが相互作用できることを測定することができる。好ま しい選択用／逆選択用レポーター遺伝子には、URA3、LYS2およびGAL1が含まれる 。 本発明は、さらに、第一の分析用RNA分子が第二の分析用RNA分子と相互作用す ることができるか否かを判定するための方法を特徴とする。この方法は、 （ａ）第一集団の複数の細胞が、 （i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合された選択用／逆選択用 レポーター遺伝子、 （ii）第一の無作為でないRNA分子に共有結合した第一の分析用RNA分子を含 む第一のハイブリッドRNA分子を発現させる第一の融合遺伝子、および （iii）第一のDNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分で 、 第一の無作為でないRNA分子に特異的に結合できる第一のRNA結合部分に共有結合 したDNA結合部分を含む、第一ハイブリッド蛋白質を発現させる第二融合遺伝子 を含む、接合コンピテント細胞の第一集団を提供する段階、 （ｂ）第二集団の複数の細胞が、 （i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用／逆選択用レ ポーター遺伝子、 （ii）第二の無作為でないRNA分子に共有結合した第二の分析用RNA分子を含 む第二のハイブリッドRNA分子を発現させる第三融合遺伝子、および （iii）第二の無作為でないRNA分子に特異的に結合することができる第二の RNA結合部分に共有結合した遺伝子活性化部分を発現させる第四の融合遺伝子を 含む接合コンピテント細胞の第二集団を提供する段階、 （ｃ）選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の増殖が阻害 されるような条件下で、接合コンピテント細胞の第一集団と第二集団とを別個に 維持する段階、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の第 一集団と第二集団とを混合する段階、および （ｅ）第一の分析用RNA分子が、第二の分析用蛋白質と相互作用できることを 測定する指標として、逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出することを含む。 必要に応じて、第一および／または第二の分析用RNA分子は、無作為に作製し たRNA配列を含むことができる。分析用化合物として用いられる蛋白質またはRNA 分子のアミノ酸配列またはRNA配列は、意図的に設計することも、無作為に作製 することもできる（例えば、核酸ライブラリーの中に含まれている核酸によって コードされているもの）。本発明のこの局面において、好ましい選択用／逆選択 用レポーター遺伝子には、URA3、LYS2およびGAL1が含まれる。好ましくは、第一 のRNA結合部分は、第二の無作為でないRNA分子に結合せず、第二のRNA結合部分 は、第一の無作為でないRNA分子に結合しない。 別の局面において、本発明は、分析用DNA分子が、分析用蛋白質と相互作用で きるか否かを判定するための方法を特徴とする。この方法には、 （ａ）（i）分析用DNA分子に機能的に結合した逆選択用レポーター遺伝子、お よび（ii）遺伝子活性化部分に共有結合した分析用蛋白質を発現させる融合遺伝 子、を含む細胞を提供する段階、ならびに （ｂ）該分析用DNA分子が該分析用蛋白質と相互作用することができることを 示す指標として、該逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出することが含まれる 。 必要に応じて、DNAを無作為に作製することができ、および／または蛋白質は 、無作為に作製したペプチド配列を含むことができる。 さらに別の局面において、本発明は、参照用蛋白質が分析用蛋白質と相互作用 する能力に影響するような、参照用蛋白質における突然変異を同定するための方 法を特徴とする。この方法は、 （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用レポーター遺伝子 、 （iii）第一の分析用蛋白質を含む第一のハイブリッド蛋白質を発現させる 第一の融合遺伝子、および （iv）参照用蛋白質をコードする遺伝子の変異遺伝子の核酸ライブラリーの 中にコードされている候補変異参照蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発 現する第二の融合遺伝子を含み、さらに、第一または第二のハイブリッド蛋白質 の一方が、DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分も含み、第 一または第二のハイブリッド蛋白質の他方が、遺伝子活性化部分も含んでいる細 胞を提供する段階、ならびに （ｂ）参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じか、それよりも高いレベルで 逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、細胞の増殖が阻害されるが、参照用 蛋白質で得られる発現レベルよりも低いレベルで逆選択用レポーター遺伝子を発 現させると、細胞の増殖が阻害されないような条件下で、細胞を維持する段階、 （ｃ）別の段階において、逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の 増殖が阻害されないような条件下で、細胞を維持し、第一の分析用蛋白質が、変 異参照用候補蛋白質と相互作用できることを示す指標として、選択用レポーター 遺伝子の発現を検出することを含む。 必要に応じて、本方法は、参照用蛋白質が第一の分析用蛋白質と相互作用する 能力に影響する、参照用蛋白質における突然変異を示すために、候補となる変異 参照用蛋白質の配列を参照用蛋白質の配列と比較することを含めることができる 。必要に応じて、第二の融合遺伝子は、機能的C末端タグをコードすることがで き、また、本明細書で説明されているように、選択用レポーター遺伝子の発現を 検出するか、別の方法（例えば、UV光によるGFPの検出）によって、候補となる 変異蛋白質のＣ末端が存在することを示すC末端タグの存在を測定することがで きる。 別の局面において、本発明は、第一の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互 作用する能力が低下するが、第二の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互作用 することができるような、参照用蛋白質の条件的突然変異を同定するための方法 を特徴とする。この方法は、 （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用レポーター遺伝子 、 （iii）参照用蛋白質をコードする遺伝子の変異遺伝子の核酸ライブラリー の中にコードされている変異参照用候補蛋白質を含む、第一のハイブリッド蛋白 質を発現させる第一の融合遺伝子、および （iv）第二の蛋白質を含む第二ハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合 遺伝子を含む細胞を提供する段階、ここで 第一のハイブリッド蛋白質または第二のハイブリッド蛋白質の一方が、DNA結 合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分も含み、第一のハイブリッ ド蛋白質または第二のハイブリッド蛋白質のもう一方が、遺伝子活性化部分も含 んでいる、 （ｂ）参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じか、それよりも高いレベルで 逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、細胞の増殖が阻害されるが、参照用 蛋白質で得られる発現レベルよりも低いレベルで逆選択用レポーター遺伝子を発 現させると、細胞の増殖が阻害されないような条件下で、細胞を維持する段階、 （ｃ）別の段階において、逆選択用レポーター遺伝子の発現によって細胞の増 殖が阻害されないような条件下で細胞を維持する段階、および変異参照用候補蛋 白質が第二の蛋白質と相互作用することができることを示す指標として、選択用 レポーター遺伝子の発現を検出する段階、ならびに （ｄ）別の段階において、一つのパラメータ以外は、段階（ｃ）と同じ条件で 細胞を維持し、変異参照用候補蛋白質が第二の蛋白質と相互作用することができ ることを示す指標として、選択用レポーター遺伝子の発現を検出する段階、（段 階（ｃ）の条件下では、選択用レポーター遺伝子が発現するが、段階（ｄ）の条 件下では、選択用レポーター遺伝子が発現しなければ、条件的変異体であること が示される）。 必要に応じて、本方法は、第一の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互作用 する能力が低下するが、第二の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互作用する ことができるという、参照用蛋白質の変異体を同定するための方法として、変異 参照用候補蛋白質の配列を参照用蛋白質の配列と比較することを含むことができ る。 段階（ｂ）で細胞が維持される条件と、段階（ｃ）で細胞が維持される条件と は、実施者が希望するままに、いかようにも変更することができる。例えば、第 一の増殖条件と第二の増殖条件とを、温度および／または薬物の存在（例えば、 ホルムアミドまたは重水素）によって変えることができる。 本発明は、また、第一および第二の変異参照蛋白質が互いに相互作用できるよ うになるが、それぞれ、第二および第一の参照蛋白質とは相互作用できない、第 一および第二の参照蛋白質における補償変異(compensatory mutation)を同定す るための方法を特徴とする。本方法は、 （ａ）第一の集団の複数の細胞が、 （i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第一の逆選択用レポーター 遺伝子、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第一の選択用レポーター 遺伝子、 （iii）遺伝子活性化部分に共有結合し、第一の参照用蛋白質の変異遺伝子 の核酸ライブラリーの中にコードされている第一の候補変異参照用蛋白質を含む 第一のハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子、および （iv）第一の逆選択用マーカーを含み、DNA結合部分に共有結合した第二の 参 照用蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子を含 むプラスミドを含む接合コンピテント細胞の第一の集団を提供する段階、 （ｂ）第二の集団の複数の細胞が、 （i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の逆選択用レポーター 遺伝子、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の選択用レポーター 遺伝子、 （iii）DNA結合部分に共有結合し、第二の参照用蛋白質の変異遺伝子の核酸 ライブラリーの中にコードされている第二の候補変異参照用蛋白質を含む第三の ハイブリッド蛋白質を発現させる第三の融合遺伝子、および （iv）第二の逆選択用マーカーを含み、DNA結合部分に共有結合した第一の 参照用蛋白質を含む第四のハイブリッド蛋白質を発現させる第四の融合遺伝子を 含むプラスミド を含む接合コンピテント細胞の第二の集団を提供する段階、 （ｃ）第一および第二の参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じか、それよ りも高いレベルで逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、細胞の増殖が阻害 されるが、参照用蛋白質で得られる発現レベルよりも低いレベルで逆選択用レポ ーター遺伝子を発現させると、細胞の増殖を阻害するような条件下で、別個に、 第一および第二の接合コンピテント細胞集団を維持する段階、 （ｄ）逆選択用マーカーの発現によって、細胞の増殖が阻害されるような条件 下で、第一および第二の接合コンピテント細胞集団を維持する段階、 （ｅ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の第 一集団と第二集団を維持する段階、 （ｆ）第一および第二の候補蛋白質が互いに相互作用するが、第一および第二 の参照用蛋白質とは相互作用しないことを測定する指標として、選択用レポータ ー遺伝子の発現を検出することを含む。 必要に応じて、本方法は、第一および第二の参照用蛋白質における補償変異(c ompensatory mutation)を同定するための方法として、互いに相互作用する第一 および第二の候補変異蛋白質の配列を、第一および第二の参照用蛋白質の配列と 比 較することを含むことができる。 本発明は、さらに、本発明のさまざまな局面を実施する上で有用ないくつかの 遺伝子構築物を特徴とする。一つの局面において、この遺伝子構築物には、（i ）酵母の複製開始点、（ii）選択マーカー、（iii）酵母のプロモーター、（iv ）核局在をコードするシグナル配列、および（v）細菌の複製開始点が含まれる 。核局在をコードする好ましいシグナル配列は、SV40のラージＴ抗原の核局在を コードするシグナル配列である。好ましいプロモーターは、ADH1プロモーターで あり、好ましい遺伝子構築物は、プラスミドp2.5である。 別の局面において、遺伝子構築物には、（i）酵母の複製開始点、（ii）選択 マーカー、（iii）プロモーター、（iv）細菌の複製開始点、（v）逆選択マーカ ー、および（vi）DNA結合部分を発現させる配列が含まれる。好ましくは、遺伝 子構築物は、プラスミドp97.CYH2である。 さらに別の局面において、遺伝子構築物には、（i）酵母の複製開始点、（ii ）選択マーカー、（iii）プロモーター、（iv）細菌の複製開始点、（v）逆選択 マーカー、および（vi）遺伝子活性化部分を発現させる配列が含まれる。好まし くは、遺伝子構築物は、pMV257である。 より一般的には、本発明は、上流域の抑制配列と、逆選択用レポーター遺伝子 の転写を媒介することができるDNA結合部分（例えば、天然の、または再構成さ れた転写因子）に対するDNA結合蛋白質認識部位を含むプロモーターに機能的に 結合した逆選択用レポーター遺伝子を有する何らかの遺伝子構築物（例えば、プ ラスミドまたは染色体）を特徴とする。好ましいプロモーターには、SPO13プロ モーターが含まれ、好ましい逆選択用レポーター遺伝子には、URA3遺伝子が含ま れる。好ましいDNA結合蛋白質認識部位は、Gal14に対する結合部位である。した がって、好ましい遺伝子構築物はSPAL:URA3である。 さらに、本発明は、 （i）上流域の抑制配列と、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位、とを含むプロモーターに機能的に結合してい る逆選択用レポーター遺伝子をゲノムに組み込んだ酵母細胞を特徴とするが、こ の酵母細胞は、 （i）逆選択用レポーター遺伝子によってコードされている蛋白質と実質的に 同一の天然に存在する蛋白質、および （ii）天然に存在する蛋白質で、それが発現すると、それを有する細胞が増殖 する上で有利になるような蛋白質を１個ももたないものである。このような酵母 細胞には、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋白質に対するDN A結合蛋白質認識部位を含むSPO13プロモーターが含まれうる。好ましい酵母細胞 には、MaV103、MaV203およびMaV99が含まれる。 本発明の前述した各局面の好ましい態様において、細胞集団の細胞は、酵母細 胞であり、好ましくは、この酵母とは、サッカロマイセス・セレビシアエ（Sacc haromyces cerevisiae）である。必要に応じて、測定対象の２つの分子の相互作 用を解離または安定させる化合物を同定する方法において、分析用化合物の存在 下で、２個以上の分子が相互作用する能力を測定することができる。従来の遺伝 子発現法を用いて、分析用化合物を細胞の中で発現させることができる。または 分析用化合物を培地に加えるだけにすることもできる。本発明において用いられ る酵母菌株を、化合物の取り込みを向上させるために化学処理する（例えば、ポ リミキシンＢの９残基ペプチド）ことができる（例えば、ボグスラウスキ（Bogu slawski）ら、Mol.Gen．Genet．199:401〜405 およびAntimicrob．Agents and T herapies 29:330〜332 参照）。分析用化合物を増殖培地に加えるときには、外 来化合物の比較的高率な取り込みレベルを示す酵母変異株である、erg6、ise1、 ISE2、およびsrb1などのサッカロマイセス・セレビシアエの変異株が特に有用で ある。接合細胞を作出するために、接合コンピテント酵母細胞の２つの集団を用 いるときには、これら２集団は、親和性のある接合型の接合コンピテント細胞を 含んでいなければならない（例えば、MATaとMATα）。 必要に応じて、本発明に係る方法を、蛋白質またはRNA分子を変異させるため の方法と組み合わせることができる。蛋白質、および／またはRNA分子の相互作 用の原因となるアミノ酸残基またはヌクレオチドを同定するためにである。例え ば、２つの蛋白質の一方または両方における変異で、２つの蛋白質が相互作用で きなくなるような変異は、それらの位置にあるアミノ酸が、野生型の蛋白質の相 互作用能力に寄与していることを示す。同様に、２つの相互作用する蛋白質にお ける 補償変異(compensatory mutation)によって、これに対応する野生型蛋白質の相 互作用能力の原因となる重要なアミノ酸が明らかになる。本発明は、また、蛋白 質／蛋白質、蛋白質／RNA、蛋白質／DNA相互作用、またはRNA／RNA相互作用に影 響する条件的アレルを同定するための方法を提供する。いったん同定されれば、 条件的アレルにより、蛋白質またはRNA分子の機能の特徴を調べるために用いる ことのできる検出可能な表現形質が提供される。相互作用分子の１つに突然変異 を起こさせ、一定の条件（例えば、許容的条件）では、その野生型パートナーと 相互作用できるが、別の条件（例えば、制約的条件）では相互作用できないよう な変異体を同定することによって、このような対立遺伝子を同定することができ る。 好ましくは、各レポーター遺伝子は、遺伝子活性化部分が存在しないと転写を 阻害するような抑制配列を有するフロモーターに機能的に結合されている。した がって、レポーター遺伝子は、その発現が、転写因子の存在または不在に対して 高度に反応するような位置に置かれなければならない。例えば、URA3遺伝子が用 いられるときには、この対立遺伝子は、転写因子がないときには、Ura-Foarとい う表現型を付与し、転写因子があるときには、Ura+Foasという表現型を付与する 。SPO13など、一定のプロモーターは、当然、上流域にある抑制配列を含んでい る。従来からのクローニング法を用いて、このような配列を別のプロモーターに 組み込むことができる。逆選択用レポーター遺伝子を用いると、細胞の増殖阻害 を検出することによって、この遺伝子の発現を検出することができる。 １個以上のレポーター遺伝子を用いるときは、これらのレポーター遺伝子を、 必要に応じて、DNA結合蛋白質認識部位だけで互いに同一のプロモーターに連結 させることができる。好ましくは、レポーター遺伝子は、滴定可能な選択を考慮 した遺伝子であり、これによって、条件の範囲の中で、細胞の増殖を測定するこ とができる（例えば、5-FOA濃度）。 さまざまなDNA結合部分と遺伝子活性化部分が、本発明のさまざまな局面にお いて使用するのに適している。一般的に、転写因子のDNA結合ドメインまたは遺 伝子活性化ドメインを用いることができる。必要に応じて、VP16の遺伝子活性化 ドメインを用いることができる。DNA結合蛋白質認識部位、遺伝子活性化部分お よびDNA結合部分はすべて、同一の転写因子に対応することもできるし、別個の 転写因 子に対応することもできる。有用な結合部位には、酵母の蛋白質であるGAL4、細 菌の蛋白質であるLexA、酵母の金属結合因子Ace1に対する結合部位が含まれる。 これらの結合部位は、抑制されたプロモーターとともに、容易に用いることがで きる（例えば、SPO13プロモーターを、GAL、LEX、およびACE1DNA結合部位と組み 合わせて、それぞれ、SPAL、SPEX、およびSPACEプロモーターの基礎として用い ることができる）。その他の有用な転写因子には、サッカロマイセス・セレビシ アエのGCN4蛋白質（例えば、ホープ(Hope)およびシュトルール(Struhl)1986，Ce ll 46:885〜894を参照）、およびサッカロマイセス・セレビシアエのADR1蛋白質 （例えば、クマール（Kumar）ら、1986,Cell 51:941〜951を参照）が含まれる。 DNA結合蛋白質認識部位は、用いられる転写因子のDBに対する結合部位を１個以 上含まなければならい。用いることのできるDNA結合蛋白質認識部位の数には制 限はないが、結合部位の数は、好ましくは、１個から100個の間で、より好まし くは、１個から20個であるが、さらに好ましくは、結合部位の数は１個から16個 の間である。結合部位の数は、測定法の望ましい感度等の要因によって調整する ことができる。 必要に応じて、レポーター遺伝子に対する遺伝子（例えば、SPALX:URA3）を、 半数体または２倍体の細胞のゲノムの中に組み込むことができる。必要に応じて 、遺伝子を組み合わせて用いることもできる。例えば、SPALX:URA3をゲノムの中 に置き、SPEX:URA3をプラスミド上に置くことができる。また、SPALX:URA3をプ ラスミドから発現させて、SPACEX:URA3を染色体上に置くこともできる。 「解離化合物」とは、２つの分子が結合するのを妨害したり阻害する何らかの 分子を意味する。解離化合物（本明細書においては、「解離因子」ともいわれる ）の実施例は、ポリペプチド、核酸、および小さな有機分子（すなわち、１ KD 以下の分子量を有する分子）である。 「レポーター遺伝子」とは、その発現を、２つの分析用分子が相互作用するこ とができるか（すなわち、蛋白質／蛋白質、蛋白質／RNA、RNA／RNA、または蛋 白質／DNA相互作用）を測定する指標として測定できる遺伝子を意味する。有用 なレポーター遺伝子は、そのプロモーターの中に、再構成された転写因子が結合 するか、調査の対象であるDNA結合蛋白質が結合するDNA結合蛋白質認識部位を有 する 。このような遺伝子には、制限はないが、lacZ、アミノ酸生合成遺伝子（例えば 、酵母のLEU2、HIS3、LYS2、またはTRP1）、URA3遺伝子、核酸生合成遺伝子、バ クテリアのクロラムフェニコール・トランスアセチラーゼ（cat）遺伝子、およ びバクテリアのgus遺伝子などが含まれる。また、これらに含まれるものには、 緑色蛍光蛋白質遺伝子のような、蛍光マーカーをコードする遺伝子がある。一定 の遺伝子が、後述されるように、「選択用」、「逆選択用」、または「選択用／ 逆選択用」レポーター遺伝子であるとみなされている。 「分析用」蛋白質、RNA分子、またはDNA分子は、本発明に係る方法によって、 その機能（すなわち、別の分子と相互作用する能力）の特徴を調べられている分 子を意味する。 「DNA結合」蛋白質とは、核酸と特異的に相互作用することができる多数の蛋 白質の何れかを意味する。例えば、本発明で用いられているDNA結合蛋白質は、 遺伝子のプロモーターの中の塩基配列と特異的に相互作用する転写因子の一部で もよい。またはDNA結合蛋白質は、天然の、または人工的にレポーター遺伝子の プロモーターの中に挿入された配列と特異的に相互作用する何らかの蛋白質であ ってもよい。蛋白質／DNA相互作用の特徴が分かっていれば、DNA結合蛋白質が、 選ばれたレポーター遺伝子のプロモーターの中にある部位に結合することによっ て、レポーター遺伝子の転写を活性化するために、DNA結合蛋白質を遺伝子活性 化部分に共有結合させることもできる。 「選択用」マーカーとは、ある遺伝子が発現すると、それを含む細胞が増殖す る上で有利になるようにする遺伝子を意味する。選択用マーカーの例には、制限 はないが、LEU2、TRP1、およびHIS3が含まれる。本明細書で説明されている一定 の選択用マーカーは、選択用マーカーを含むプラスミドを有する細胞の増殖を促 進するために用いることができる。プラスミド上に位置している選択用マーカー に機能的に結合しているプロモーターは、そのマーカーにとって本来のプロモー ターでもよいし、またはこのマーカーは、本来機能的に結合しているプロモータ ー以外のプロモーターに工学的に操作できるように結合しているものでもよい。 一般的に、本発明で用いられているプラスミド（例えば、相互作用する分子また は解離因子を発現させるために用いられるプラスミド）の上に位置している選択 用マーカーに機能的に結合しているプロモーターは、調査の対象である分子相互 作用を測定するために用いられるレポーター遺伝子のプロモーターの中に含まれ ているDNA結合蛋白質認識部位と機能的に同一のDNA結合蛋白質認識部位を含まな い。言い換えると、レポーター遺伝子の転写に介在するDNA結合蛋白質は、選択 用マーカーの転写にも介在するものであってはならず、選択用マーカーの転写に 介在するDNA結合蛋白質は、レポーター遺伝子の転写にも介在してはならない。 「スクリーニングできる」レポーター遺伝子とは、細胞に選択的な増殖有利性 を付与するという方法以外の方法によって、細胞の中で、その発現を検出できる 遺伝子を意味する。スクリーニングできるレポーター遺伝子の実施例は、lacZ遺 伝子である。必要に応じて、スクリーニングできるレポーター遺伝子は、酵母細 胞のゲノムの中に組み込むこともできる。スクリーニングできるレポーター遺伝 子のプロモーターを、その細胞の中で用いられる他のレポーター遺伝子とは別の ものにすることは、必須ではないが、好ましい。スクリーニングできるレポータ ー遺伝子は、２つの分子が相互作用して転写因子を再構成できるかを測定するた めに、本発明において用いることができる。このように、スクリーニングできる レポーター遺伝子に機能的に結合しているプロモーターは、再構成された転写因 子、または遺伝子活性化部分に融合したDNA結合蛋白質が結合できるDNA結合蛋白 質認識部位を含んでいるはずである。 「逆選択用」マーカーとは、それが発現されると、それを含む細胞の増殖が阻 害される遺伝子を意味する。逆選択レポーター遺伝子の実施例には、URA3、LYS2 、GAL1、CYH2、およびCAN1が含まれる。これらのマーカーはプラスミドを除去す るために用いることができる。 「選択用」レポーター遺伝子とは、ある一定の条件下で発現されると、それを 含む細胞が、増殖上有利になるようなレポーター遺伝子を意味する。 「逆選択用」レポーター遺伝子とは、ある一定の条件下で発現されると、それ を含む細胞の増殖が阻害されるようなレポーター遺伝子を意味する。逆選択レポ ーター遺伝子の実施例には、URA3、LYS2、GAL1、CYH2、およびCAN1が含まれる。 「選択用／逆選択用」レポーター遺伝子とは、ある一定の条件下で発現される と、それを含む細胞が致死になるが、別の条件下で発現されると、それを含む細 胞の増殖が選択的に有利になるようなレポーター遺伝子を意味する。したがって 、１個の遺伝子を、選択用レポーター遺伝子と、逆選択用レポーター遺伝子の両 方に用いることができる。選択用／逆選択用レポーター遺伝子の例には、URA3、 LYS2、およびGAL1が含まれる。選択用／逆選択用レポーター遺伝子が用いられる 本発明の局面のすべてにおいて、選択用レポーター遺伝子と逆選択用レポーター 遺伝子を組み合わせたものを、１個の選択用／逆選択用レポーター遺伝子の代わ りに用いることができる。例えば、本発明の第一の局面において、各接合コンピ テント細胞には、（i）選択用レポーター遺伝子、および（ii）逆選択用レポー ター遺伝子を備えさせることができる。このような２個の遺伝子が、１個の選択 用／逆選択用レポーター遺伝子の代わりをするときには、これらのレポーター遺 伝子は、同一のプロモーターに機能的に結合されていることが好ましい。特に、 レポーター遺伝子は、同一のDNA結合蛋白質認識部位を有するプロモーターに機 能的に結合されているのが好ましい。 「DNA結合蛋白質認識部位」とは、所定のポリペプチド（すなわち、DNA結合蛋 白質）と特異的に相互作用するのに必要十分なDNA分節を意味する。 「共有結合した」とは、２つの分子が、直接的にせよ、間接的にせよ、共有結 合によって連結していることを意味する。例えば、「共有結合した」蛋白質また は蛋白質部分同士は、直接的に隣接しているか、同じハイブリッド蛋白質の中の １個以上のアミノ酸のつながりによって隔てられている。 「蛋白質」とは、天然のポリペプチドまたはペプチドの全部または一部を構成 するか、天然には存在しないポリペプチドまたはペプチドを構成するアミノ酸配 列を意味する。 「DNA結合部分」とは、特異的なポリペプチドが、特定のDNA配列（すなわち、 DNA結合蛋白質認識部位）に結合するようにさせることができるアミノ酸のつな がりを意味する。 「RNA結合部分」とは、特異的なポリペプチドが、特定のRNA配列（すなわち、 RNA結合蛋白質認識部位）に結合するようにさせることができるアミノ酸のつな がりを意味する。 「ハイブリッド」蛋白質、RNA分子、またはDNA分子とは、２個以上の共有結合 したポリペプチド、RNA分子、またはDNA分子のキメラを意味する。 「遺伝子活性化部分」とは、アミノ酸のつながりで、それが結合している調節 領域（すなわち、プロモーター）を有する遺伝子の発現を誘導することができる ものを意味する。 「機能的に結合した」とは、適当な分子(例えば、転写活性化蛋白質または転 写活性化ドメインを含む蛋白質)が制御配列に結合すると、遺伝子が発現できる ような様式で、遺伝子および制御配列（例えば、プロモーター）が連結している ことを意味する。 「無作為に作製された」配列とは、予め決定された配列をもたない配列を意味 する。すなわち、これは、合成される前に決定されているDNA、RNAまたは蛋白質 の配列またはモチーフを有する「意図的に設計された」配列とは対照的なもので ある。無作為に作製された配列は、核酸ライブラリーに由来することもある。 「変異した」とは、部位特異的なまたはランダムな突然変異誘発のいずれかに よって、配列が変化することを意味する。変異した配列は、点突然変異、挿入突 然変異、欠失突然変異、または転位突然変異を含む。 「プロモーター」とは、転写を行わせることができる最小限の配列を意味する が、このような要素は、もとの遺伝子の5'または3'側領域に位置しうる。 「抑制」配列とは、一定の条件下で、それに連結している遺伝子の発現を阻害 するDNA配列を意味する。 核酸「ライブラリー」とは、５個以上のDNA分子のセットを意味する。このよ うなライブラリーには、異なるDNA分子が、何百、何千、何百万と入っているこ とがある。 「両方向組合せライブラリー」とは、２つの別個の親となる発現ライブラリー から作製した、相互作用するハイブリッド分子の組合せの非常に大きなセットを 意味する。典型的には、このセットの規模は、ほぼ、それぞれの親ライブラリー の複雑さの所産である。 「補償(compensatory)」変異とは、相互作用する一組の分子（例えば、蛋白質 ）における突然変異で、これらの分子が互いに相互作用できるようにさせるが、 野生型の分子とは相互作用できない突然変異を意味する。 「集団接合(mass mating)」とは、非常に多数の接合細胞を作出するために、 相補的な接合型を有する酵母の接合コンピテント細胞懸濁液を混合することを意 味する。典型的には、1010から1012個までの接合細胞が作出される。好ましくは 、細胞の懸濁液は、１：１の比率（細胞数：細胞数）で混合される。 「機能的C末端タグ」とは、分析用蛋白質のC末端に位置するアミノ酸のつなが りを意味し、全長の蛋白質が検出可能なレベルで発現していることを示す分析用 蛋白質のカルボキシ末端が元のままであることを確認するために、それが存在す ることを測定することができるものを意味する。例えば、機能的C末端タグは、 別の蛋白質（例えば、pRb、p107またはp130）と相互作用できる配列（例えば、E 2F1のポケット結合ドメイン）でありうる。必要に応じて、機能的C末端タグは、 別の蛋白質の結合がなくとも検出できる配列でもよい。例えば、GFP（緑色蛍光 蛋白質）は、機能的C末端タグとして有用であり、UV光によって検出することが できる。 本発明は、いくつかの特徴および利点を提供する。例えば、本発明によって、 ペプチドまたはRNA分子をコードするcDNAクローンの２つのライブラリーを同時 にスクリーニングすることができるようになる。「集団接合(mass mating)」法 を用いて、所与のシステムにおけるすべての分子の組合せについて、同一の条件 下で、さまざまな分子の機能的な関係を調べる反応を１回だけ行なう。さらに、 相互作用する分子は、いずれも事前に同定されている必要はない。本発明は、1 ×1013もの相互作用を発生させたり、スクリーニングしたりするのを容易にする 。したがって、本発明によって、分子の多数の組合せのスクリーニングが容易に なり、相対的に稀な会合作用や解離作用を検出できる可能性が高くなる。本発明 を大規模に用いて、調査の対象である２つのライブラリーで起こる相互作用のす べて、または大部分についての、蛋白質／蛋白質結合マップを作成することがで きる。相互作用する分子の組合せで可能なもののを一つずつ含む酵母細胞を、分 子の相互作用をカタログ化する方法で、プレートの上に組織だって培養すること ができる。例えば、調査の対象である蛋白質をコードするDNAをプローブとして 用いて、固体担体（例えば、ニトロセルロースフィルター）に並べられた酵母コ ロニーから抽出したDNAに対してハイブリダイゼーションを行なうことができる 。調査の対 象であるDNAがハイブリダイズする酵母コロニーを同定することによって、調査 の対象であるDNAによってコードされている調査の対象である蛋白質と相互作用 する分子を含む酵母菌株が直ちに同定される。そして、ハイブリダイゼーション で陽性を示したコロニーに由来する酵母細胞から、相互作用する分子をコードす る遺伝子をいくつかクローニングすることができる。 本発明は、比較的稀な会合作用を検出するために高感度で用いることもできる 。したがって、本発明は、組合せライブラリーの構築に当たって最も重大な問題 の一つである、相互作用する可能性のある分子の大規模な集団から、相互作用す るいくつかの組合せを同定するという問題に取り組む。 また、本発明により、望ましくない相互作用を分離または阻害するが、望まし い相互作用を分離または阻害しない分子を同定することができるようになる。例 えば、本発明は、ウイルス蛋白質が宿主細胞の分子に結合するのを分離または阻 害するが、宿主細胞の分子が好ましい分子に結合するのには影響を与えない化合 物を同定することを容易にする。さらに、本発明によって、１種類の培地上（例 えば、１枚のプレート上）でこれらの解離化合物が同定できるようになり、治療 用化合物のスクリーニングが、迅速で簡便な処理となる。化合物があるところで 、レポーター遺伝子の発現の増加を測定することによって、分子の相互作用を安 定させる化合物を迅速かつ簡便に同定することもできる。 本発明は、また、調査の対象である薬物（例えば、解離因子または安定化因子 ）の標的で、関連する分子の相互作用が未知の標的を同定するためにも用いるこ とができる。この方法は、酵母細胞の集団を用いるが、集団の各細胞は、両方向 組合せライブラリーから採った、相互作用する分子を一組ずつ含んでいる。集団 の各細胞を、調査の対象である薬物に曝し、薬物があると、レポーター遺伝子を さまざまなレベルで（例えば、高いレベルまたは低いレベルで）発現させるコロ ニーは、調査の対象である薬物の標的となるハイブリッド蛋白質を含む細胞であ ることを示している。これらの細胞の中にコードされているハイブリッド蛋白質 は、従来の方法によって同定することができる。 本発明では、低コピー数のプラスミドを用いることができるため、調査の対象 である蛋白質、およびRNA分子を、生理学的に適当なレベルで発現させることが で きる。低コピー数のプラスミドから、調査の対象である分子を発現させると、実 施者は、相互作用分子のさまざまな組合せの間の僅かな違いを検出することがで きるはずである。遺伝子を多コピー数プラスミドから過剰発現させると、相互作 用する分子の組合せで、似ていないもの同士も、時として、レポーター遺伝子の 発現レベルが同じように見えるため、蛋白質の組合せの間の差異を検出すること が難しくなる傾向にある。別個の酵母細胞におけるハイブリッド蛋白質の発現レ ベルに関する再現性は、低コピー数プラスミドを用いて、至適化することができ る。 本発明の一定の態様は、偽陽性の４つのタイプが発生することを（別のシステ ムで得られる発生率に較べると）抑える。偽陽性として分類される相互作用には 、 （i）（a）同じ細胞型において、（b）同じ細胞内区分において、または（c） 同じ発生段階において発現されないため、生理的条件下では明らかに相互作用す ることができない蛋白質、 （ii）生物学的に適当でない、不正なオープンリーディングフレームの発現に よってできた蛋白質、または （iii）特異的な相互作用するパートナーを必要としないで、独力で、レポー ター遺伝子の転写に介在する蛋白質の間の相互作用が含まれる。これらの偽陽性 の出現は、高度にプロモーター依存的である（バーテル（Bartel）ら、1993，Bi ofeedback 14:920〜924）。さらに、大腸菌からの無作為な配列の0.1％は、真核 細胞中のDBに融合させると、（つまり、ADの機能として）転写を活性化させるこ とができることが示されている（マ(Ma)およびプタシュネ(Ptashne)、1987，Cel l51:113〜119）。 生理学的に適正なレベルで、ハイブリッド蛋白質の発現レベルを維持すること によって、本発明は、最初の２つに分類された偽陽性が回収されるのを防止する ことができる。必要に応じて、本発明を実施するにあたり、「三重選択法」を用 いることによって、偽陽性を拾う機会を減少させることもできる。三重選択では 、３つのレポーター遺伝子が、DNA結合蛋白質認識部位以外は異なった配列を有 するプロモーターに機能的に結合されている（図１）。３つの異なるプロモータ ー に機能的に結合した３つのレポーター遺伝子を用いることによって、３番目の分 類の偽陽性を回収する可能性が除去される。 本発明が、抗原へのモノクローナル抗体の結合を検出するために用いられると きには、本発明は、以下の特徴を提供する。免疫システムと同じように、本発明 は、本来、組合せを扱うものであるため、本発明で用いられる集団接合(mass ma ting)法によって、相互作用する分子の多数の組合せを解析するのが容易になる 。さらに、本発明およびPCR突然変異誘発法、ならびに本明細書で説明されてい る滴定可能な選択法によって、免疫システムの体細胞の純化能力を合成的に再現 することができる。 本発明は、また、蛋白質またはRNA分子の突然変異遺伝子を単離するための簡 便な方法を提供する。従来の突然変異遺伝子単離法は、ある分子の特定の領域（ 例えば、関連する分子間で保存されているドメイン）が前もって示唆されている ことに基づいて行われるが、本発明は、その分子に関する事前の知識がない状態 でも、また、突然変異誘発法に見られる偏りなしに、多数の突然変異遺伝子を作 出し、スクリーニングすることを可能にする。 本発明は、分子間（例えば、蛋白質／蛋白質）の相互作用の構造と調節に関す る情報を提供するための手段として用いることができる。本発明を用いて調べる ことができる、特に興味深い分子間の相互作用には、ウイルスと宿主細胞の構成 成分との間における蛋白質／蛋白質の相互作用が含まれる。これらの相互作用を 阻止または防止できる解離化合物は、ウイルスの病原性を抑制するための治療薬 として用いることができる。 詳細な説明 まず、図面について簡単に説明する。 図1は、DNA結合蛋白認識配列を除いて異なる配列を有するプロモーターと機能 的に結合した3種類のレポーター遺伝子を図示したものである。 図2は、プラスミドp2.5のマップである。 図3は、細胞にSPAL5:URA3対立遺伝子を導入して、細胞にFoas表現型を付与す ることができることを示す酵母細胞の写真である。対照株は野生型URA3（各々の 枠の右側に位置する2つの斑状領域）およびura3-53変異株（各々の枠の左側に位 置 する2つの斑状領域）である。細胞は図示した通り、ロイシンおよびトリプトフ ァンを含まない合成の完全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含まない合成の完全培地 （Sc-ura）、またはロイシンおよびトリプトファンを含まず、5-FOAを含有する 合成完全培地（Sc-L-T+FOA）のいずれかの中で増殖させた。 図4は、DB-cFos、AD-cJun、DB-pRb、およびAD-E2F1を発現させるために用いた 遺伝子構築物を図示したものである。 図5は、GAL4転写因子と種々の相互作用性蛋白質とを細胞内で再構成した酵母 細胞の写真である。再構成によってSPAL5:URA3対立遺伝子の発現が誘導され、細 胞にFoasが付与される。対照株は野生型URA3（各々の枠の右側に位置する２つの 斑状領域）およびura3-53変異株（各々の枠の左側に位置する２つの斑状領域） である。これらの実験には、逆選択が可能なレポーター遺伝子SPAL9:URA3を含む 酵母株MaV103を用いた。細胞は図示した通り、ロイシンおよびトリプトファンを 含まない合成完全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含まない合成完全培地（Sc-ura） 、またはロイシンおよびトリプトファンを含まず、5-FOAを含有する合成完全培 地（Sc-L-T+FOA）のいずれかで増殖させた。 図6は、転写因子を再構成する種々の相互作用性蛋白質に関する5-FOAの増殖閾 値の限界を規定する酵母細胞の写真である。すなわち、cFos/cJun（0.05％）、p Rb/E2F1（0.1％）、およびcJun/cJun（0.2％）であった。対照株は野生型URA3（ 各々の枠の右側に位置する2つの斑状領域）およびura3-53変異株（各々の枠の左 側に位置する2つの斑状領域）である。細胞は、ロイシンおよびトリプトファン を含まない合成完全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含まない合成完全培地（Sc-ura ）、またはロイシンおよびトリプトファンを含まずに5-FOAを図示した濃度で含 有する合成完全培地（Sc-L-T+FOA）のいずれかで増殖させた。 図7は、解離因子の非存在下において転写因子を再構成する分子を発現してい る細胞内において、解離化合物を発現させるために細胞プラスミドp2.5が使用可 能であることを示す酵母細胞の写真である。対照株は野生型URA3（各々の枠の右 側に位置する2つの斑状領域）およびura3-53変異株（各々の枠の左側に位置する ２つの斑状領域）である。細胞は図示した通り、ロイシンおよびトリプトファン を含まない合成完全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含まない合成完全培地（Sc-ura ）、 またはロイシンおよびトリプトファンを含まずに5-FOAを含有する合成完全培地 （Sc-L-T+FOA）のいずれかの中で増殖させた。Rb#1およびRb#2はRbをコードする 2つの独立した単離物である。 図8は、いくつかの異なる増殖条件下において、種々のハイブリッド蛋白質の いずれかを発現している酵母MaV103株のさまざまな表現型を示す写真である。3A Tとして示した図面は、Sc-L-T-H（ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジ ンを含まない）でのものである。X-galとして示した図面は、Sc-L-T培地を含み 、β-ガラクトシダーゼの基質として機能する5-ブロモ-3-クロロ-3-インドリル- β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）を20mg/ml含むものである。 図9は、相互作用性分子の収集物（すなわち、両方向組合せライブラリー（BCL ））を作製するために用いた逆ツーハイブリッド法（reverse two-hybrid metho d）の一例を図示したものである。 図10Aは、逆選択可能なCYH2マーカーを挿入したプラスミドを図示したもので ある。図10Bは、GAL4-ADまたはGAL4-DBとのハイブリッド蛋白質を作成するため に用いたプラスミドを図示したものである。 図11は、MaV103を用いて実施した一方向性の（すなわち、古典的な）ツーハイ ブリッド・スクリーニングの結果をまとめた図である。通常のツーハイブリッド 系と比較すると、陽性例の数は相対的に少ない。「再試験」とは、3つの表現型 に対して陽性であったクローンを意味する。X→Yとは、Y蛋白質が同定されたXク ローンの数である。 図12は、2つの自己活性化クローンを含む合成ライブラリーを含有する酵母細 胞の写真である。左下の図面は、Sc-L-T-H培地を含み、3ATを含むプレートの写 真である。右下の図面に示したプレートで増殖している細胞は、Sc-LからSC-l+5 -FOA、SC-L-T-H+3ATにレプリカ平板培養したものである。陰性対照として、Sc-L プレートのヒスチジンを含まない3ATプレートへの直接レプリカ培養も実施し、 結果として得られた細胞を左下の図面に示した。各々のプレートの右側にある大 きな斑状領域は対照細胞を示す。対照は、上から順にpPC97/pPC86、Db-pRb/AD-E 2F1、Fos/Jun、および非処理Gal4である。 図13は、合成ライブラリーとの間に観察された相互作用をまとめた図である。 図14は、AD-E2F1およびDB-pRb、またはAD-E2F1およびDB-p107のハイブリッド 分子のいずれかを発現している細胞において、E1Aが過剰発現している酵母細胞 の写真である。対照株は野生型URA3（各々の枠の右側に位置する2つの斑状領域 ）およびura3-53変異株（各々の枠の左側に位置する2つの斑状領域）である。細 胞は図示した通り、ロイシンおよびトリプトファンを含まない合成完全培地（Sc -L-T）、ウラシルを含まない合成完全培地（Sc-ura）、またはロイシンおよびト リプトファンを含まず、5-FOAを含有する合成完全培地（Sc-L-T+FOA）のいずれ かの中で増殖させた。E1a#2およびE1a#4は、それぞれ30〜132位のアミノ酸、な らびに30〜86位および120〜139位のアミノ酸を意味する。 図15は、変異株pRbΔ22がE2F1と相互作用する能力を持たないことを本発明の 方法によって検出することができることを示す、酵母細胞の写真である。対照株 は野生型URA3（各々の枠の右側に位置する2つの斑状領域）およびura3-53変異株 （各々の枠の左側に位置する2つの斑状領域）である。細胞は図示した通り、ロ イシンおよびトリプトファンを含まない合成完全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含 まない合成完全培地（Sc-ura）、またはロイシンおよびトリプトファンを含まず 、5-FOAを含有する合成完全培地（Sc-L-T+FOA）のいずれかの中で増殖させた。 図16は、DP1と相互作用する能力を媒介するE2F1中の残基を同定するために用 いた二段階選抜法を図示したものである。 図17は、GAL1:HIS3およびSPAL9:URA3レポーター遺伝子によって「滴定可能な 」表現型が付与されることを示す酵母細胞の写真である。 図18Aおよび18Bは、PCR変異誘発およびインビボギャップ修復のために用いた 方策を図示したものである。 図19は、二段階選抜法の第1および第2の段階における酵母細胞の増殖を示す一 連の写真である。それぞれの段階において、レプリカ平板培養（RP）によって生 存コロニーを移し変えた。対照株は野生型URA3（各々の枠の右側に位置する２つ の斑状領域）およびura3-53変異株（各々の枠の左側に位置する2つの斑状領域） である。細胞は図示した通り、ロイシンおよびトリプトファンを含まない合成完 全培地（Sc-L-T）、ウラシルを含まない合成完全培地（Sc-ura）、またはロイシ ンおよびトリプトファンを含まず、5-FOAを含有する合成完全培地（Sc-L-T+FOA ）の いずれかの中で増殖させた。 図20は、二段階選抜法の第2の段階において得られたE2F1対立遺伝子の表現型 を示す一連の写真である。 図21は、二段階選抜法によって得られたマークボックス2(Marked Box 2)ドメ インおよび種々の変異を図示したものである。 図22は、E2F1およびそれに関してすでに記載された機能的ドメインを図示した ものである。 図23Aは、二段階選抜法をまとめた図である。図23Bは、条件アレル（すなわち 、CATS）を同定するための2段階法を図示したものである。 図24は、DB-FosおよびAD-Junの条件アレルを発現している酵母細胞の一連の写 真である。この図は、Junの条件アレルが、30℃ではAD-JunおよびDR-Fosの相互 作用を防止するが、36℃では防止しないことを示している。 図25は、抗原/抗体相互作用を同定するために有用な方策を図示したものであ る。 略号 本明細書中で用いた略号には以下のものが含まれる： AA アミノ酸 AD 活性化ドメイン DB、DBD DNA結合ドメイン 5-FOA 5-フルオロ-オロチン酸 GBS GAL4結合配列 ORF オープンリーディングフレーム URS 上流抑制配列 Prom プロモーター Term ターミネーター CEN 動原体 ARS 酵母複製起点 RP レプリカ培養 2 mu 酵母2μプラスミド複製起点 ORI 細菌複製起点 3AT 3-アミノトリアゾール 本発明の詳細な実施例を提供する前に本発明のいくつかの要素を説明する。 標準的ツーハイブリッドシステム：酵母ツーハイブリッド系は、一対の蛋白質 の会合を検出するために使用されてきた（例えば、フィールズ(Fields)ら、米国 特許第5,283,173号を参照）。この方法は、1つの転写因子の2つの分離可能なド メインのインビボでの再構成を含む。この転写因子のDNA結合ドメイン（DB）は 、選択されたプロモーターの認識のために必要である。活性化ドメイン（AD）は 、細胞の転写装置のその他の要素との接触のために必要である。この系において 、転写因子は複数のハイブリッド蛋白質を用いることによって再構成される。一 つのハイブリッド体は、ADおよび対象となる第1の蛋白質を含む。第2のハイブリ ッド体は、DBおよび対象となる第2の蛋白質を含む。対象の第1および第2の蛋白 質が相互作用する場合には、ADおよびDBが物理的に非常に近接し、それによって 転写因子が再構成される。蛋白質の会合は、再構成された転写因子がレポーター 遺伝子の転写を活性化する能力を解析することによって測定することができる。 有用なレポーター遺伝子は、DBによって特異的に認識されるプロモーターと機 能的に結合したものである。ツーハイブリッド系では典型的には、パン酵母サッ カロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)、およびその発現を適切 な条件において選択することができるレポーター遺伝子を用いる。このツーハイ ブリッドシステムは、第2のあらかじめ選択した蛋白質と相互作用する蛋白質を コードする遺伝子をクローニングするための便利な方法を提供する。このような 実験では、無作為に作製した配列を油と融合させ、対象となる蛋白質をDBと融合 させるために、cDNAライブラリーが構築される。この「一方向性の」スクリーニ ング法では、クローンの一つのライブラリーから発現された蛋白質が、あらかじ め選択された対象となる蛋白質と相互作用する能力を試験する。2つのライブラ リーを用いる方法（一つはADと融合させたもの、もう一つはDBと融合させたもの ）は記載されていない。 レポーター遺伝子：本明細書に記載したレポーター遺伝子は、プラスミド上に 位置させることもでき、一倍体または二倍体の細胞のゲノムに組み込むこともで きる。その発現が解析の対象となるレポーター遺伝子は、そのレポーター遺伝子 の転写を指向する配列を有するプロモーターと機能的に結合している。このレポ ーター遺伝子は、転写因子の遺伝子活性化部分がその遺伝子と近接した場合に（ 例えば、転写因子を再構成するためにハイブリッド蛋白質を用いること、または DNA結合蛋白質の遺伝子活性化部分と共有結合することによって）、発現するよ うな位置に置かれている。また、このレポーター遺伝子は、転写因子の存在また は存在しないことに対してそれを高度に反応させる調節配列と機能的に結合させ ることもできる。例えば、特異的な転写因子が存在しない場合に、高度に反応性 のURA3対立遺伝子は、細胞にUra-Foar表現型を付与する。特異的な転写因子の存 在下では、高度に反応性のURA3対立遺伝子は、細胞にUra+Foas表現型を付与する 。レポーター遺伝子を有する細胞（すなわち、形質転換を受けた酵母細胞）は通 常、遺伝子の野生型のコピー（例えば、URA3遺伝子）を含むが、外来性レポータ ー遺伝子をゲノムに組み込み、野生型遺伝子と置換することもできる。レポータ ー遺伝子をプロモーターと連結し、そのレポーター遺伝子を細胞に導入するため には、従来の方法および基準を用いることができる。 プロモーター：レポーター遺伝子の発現のために適切なプロモーターは、その レポーター遺伝子と結合した場合に、適切な分子（すなわち、転写活性化ドメイ ンを有する蛋白質）の存在下においてその発現を指向することができ、転写活性 化ドメインの非存在下では、そのレポーター遺伝子の転写を指向しないものであ る。有用なプロモーターの一例は、酵母SPO13プロモーターである。その他の有 用なプロモーターには、上流抑制配列を含むプロモーター（例えば、バイダル(V idal)ら、1995．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:2370〜2374）、および転写活 性化ドメインの非存在下においてレポーター遺伝子の発現を抑制するものが含ま れる。プロモーターがレポーター遺伝子の転写を指向する能力は、遺伝子発現を 解析する従来の方法（例えば、遺伝子産物もしくはそのmRNAの検出、または細胞 の増殖のためにそのレポーター遺伝子の発現が必要な条件下における、細胞増殖 の検出）によって測定することができる。 一つまたはそれ以上のDNA結合蛋白質認識部位を含むプロモーターの誘導物を 構築するためには、従来の分子生物学の技法を用いることができる。例えば、SP Oプ ロモーターを操作して、GAL4結合配列（GBS）の一つまたはそれ以上のコピーを 含むようにすることができる。GAL4に対する天然型のプロモーターにおけるDNA 結合部位の特徴は詳細に解明されているため、比較的高い親和性でGAL4が結合す る合成配列を作成することが可能である。SPO13プロモーターと機能的に結合し たURA3対立遺伝子を、SPO13/GAL/URA3の代わりにSPALX:URA3と呼ぶ。ここで、X はプロモーターに存在するGBSの数を示す。その他の有用なDNA結合蛋白質認識部 位には、LexAおよびAce1結合部位が含まれる。このほか、ある蛋白質があるDNA 配列と結合する能力を測定する場合には、DNA結合蛋白質認識部位は野生型のDNA 結合蛋白質認識部位でもよく、そのDNA配列が蛋白質と相互作用する能力を試験 するための、対象となる任意の人為的に設計された配列であっても無作為に作成 された配列であってもよい。 酵母菌株：本発明に用いる酵母菌株は、標準的な方法を用いて増殖および保管 を行うことができる。サッカロマイセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisia e)は、本発明において特に有用である。本発明の特定の面においては、接合能力 を有する2つの酵母細胞を接合させることが望ましい。例えば、ある方法におい ては、接合能力を有する1つの細胞内で活性化ドメインを含むハイブリッド蛋白 質を発現させ、接合能力を有する第2の細胞内でDNA結合ドメインを含むハイブリ ッド蛋白質を発現させる。このような場合、転写因子は、第1および第2の接合能 力を有する細胞を接合させることによって再構成される。明らかに、この2つの 接合能力を有する細胞の接合型には適合性が必要である。例えば、接合能力を有 する1つの細胞はMATa接合型であり、接合能力を有するもう一方の細胞はMATαで あることができる。どちらの細胞型でどちらのハイブリッド蛋白質が発現される かは問題とはならない。 分子相互作用の特徴分析のために好ましい酵母細胞は、(i)上流抑制配列、お よび(ii)DNA結合蛋白質認識部位を有するプロモーターと機能的に結合した逆選 択可能なレポーター遺伝子がそのゲノム内に組み込まれたものである。好ましい 酵母細胞は、(i)逆選択可能なレポーター遺伝子によってコードされる蛋白質と 実質的に同一な天然型の蛋白質、および(ii)発現した場合（例えば、プラスミド から）に、それを含む細胞に増殖面での利点を付与する少なくとも一つの天然型 の蛋白 質、を含まない。さらに、酵母細胞は、ゲノムに組み込まれた形で、選択可能な マーカー（例えば、HIS3）および／またはその発現をスクリーニングすることが できる遺伝子（例えば、lacZ）を含むことができる。このような3つの遺伝子（ すなわち、逆選択可能なレポーター遺伝子、選択可能なマーカー、およびスクリ ーニングが可能なマーカー）が細胞のゲノムに組み込まれている場合、この3つ の遺伝子のプロモーターは、DNA結合蛋白質認識部位を除いて、別個であること が好ましい（図1）。別個のプロモーターを用いることにより、偽陽性が得られ る確率は低下する。 本発明者らは、以下の特徴を有する一連の酵母菌株を構築した：(i)ツーハイ ブリッド体を発現し、ヒスチジンを含まない培地上でGAL1:HIS3に対する依存性 を示す2つのプラスミドの選択のための一連の非復帰性の栄養要求性変異株:leu2 、trp1、およびhis3、(ii)プラスミドシャッフリングを促進するための2つの劣 性薬物耐性変異株（can1およびcyh2）、および(iii)3つの組み込まれたGAL4で誘 導可能なレポーター遺伝子（Gal1:HIS3、Gal1:lacZ、およびSPAL:URA3、図1）。 これらの特徴を有する、両方の接合型（MATαおよびMATa）の酵母菌株を作製し た。 本発明において特に用いるものは、以下に説明する酵母菌株MaV103およびMaV2 03である。被験化合物（例えば、解離因子の可能性のあるもの）の取り込みが必 要に応じて、化合物の取り込み能力が比較的高いため、erg6変異株が特に有用で ある。酵母細胞の透過性化処理のためのその他の方法を用いてもよい。これらに は、ポリミキシンBノナペプチドなどの化学物質による処理が含まれる。 プラスミドp2.5の構築：本発明者らは、本発明において試験することができる 解離化合物（例えば、蛋白質またはRNA分子）を合成するために有用な、p2.5と 命名した新規なプラスミドを設計した（図2）。さらに一般的には、このプラス ミドは、酵母細胞において好ましい遺伝子を発現させるために用いることができ る。このプラスミドは、解離化合物をコードするcDNAライブラリーの作成を可能 とし、以下の特徴を提供する：(i)プラスミドの多数のコピーの維持を可能とと するための2μmの配列、(ii)プラスミドを好ましくは、本発明に用いるハイブリ ッド単御悪またはハイブリッドRNA分子をコードする遺伝子構築物（すなわち、 複数のプラスミド）とは独立に選択することができるようにする選択可能なマー カー、(i ii)強力な構成性プロモーターである酵母ADH1プロモーター、(iv)GAL4認識部位 、(v)ポリリンカーの上流に位置し、コードされたポリペプチドの宿主細胞の核 への輸送を促進する核局在化シグナル、および(vi)細菌複製起点。プラスミドp2 .5は、ADH1プロモーターを含むpPC86のXhoI-XhoI断片を、pRS323のXhoI部位に挿 入し、続いて、ポリリンカーおよびADH1ターミネーターを含むpPC86のSalI-BamH I断片をpRS323のSalI-BamHI部位に挿入することによって作製した（シコルスキ( Sikorski)ら、1989，Genetics 122:19〜27）。 ハイブリッド蛋白質の産生のためのプラスミドの構築：プラスミドp97.CYH2お よびpMV257は、本発明において、対象となる可能性のある相互作用性分子と融合 させたGAL4-DBまたはADをそれぞれ有するハイブリッド蛋白質を産生するために 有用である（図10B）。これらのプラスミドは、CTH2をコードする配列をpPC97（ DBプラスミドの場合）、またはpPC97（ADプラスミドの場合）に挿入することに よって産生される（図10A）。p97.CYH2およびpMV257はいずれも、(i)酵母ARS4複 製起点、(ii)酵母CEN6動原体配列、(iii)選択可能なマーカー（例えば、pPC97に ついてはLEU2、pPC86についてはTRP1）、(iv)酵母ADH1プロモーターおよびター ミネーター、(v)GAL4-DB（pPC97の場合）またはGAL4-AD（pPC86の場合）、(vi) 核シグナル配列をコードし、DBまたはADドメインのフレームに位置したSV40ラー ジT抗原配列、(vii)細菌複製起点、および(viii)CYH2逆選択可能マーカー、を有 する。当業者には、ハイブリッド蛋白質を産生するために多数の同様のプラスミ ドを用いることができることは周知である。例えば、（単純ヘルペスウイルスか らの）VP16またはAce1のDBまたはADを含むハイブリッド蛋白質は、GML4-DBまた は-ADの位置に、代わりにVP16またはAce1 DBもしくはAce1 ADをコードする配列 を有するプラスミドを用いて産生することができる。同様に、Leu2およびTrp1以 外の選択可能なマーカーを用いることもできる。これらのプラスミドは、従来の 分子生物学的方法を用いて構築することができる。一般に、これらのプラスミド の一つを含む酵母細胞を選択するためには、この酵母細胞はプラスミドの非存在 下では、選択可能なマーカーに対応する機能的遺伝子産物を発現しない必要があ る。例えば、p97.CYH2による形質転換を受ける酵母細胞は、leu2変異を有する必 要がある。これにより、p97.CYH2を含む形質転換株を、ロイシンを含まない培地 上で選択する ことができる。酵母菌株MaV103およびMaV203は、p97.CYH2およびpMV257とともに 用いる場合に特に有用である。 蛋白質/蛋白質相互作用の解析：本発明は、蛋白質/蛋白質相互作用を同定する ための便利な方法を提供する。この方法は、接合能力を有する2つの細胞（例え ば酵母）の集団を用いる。選択可能な／逆選択可能なレポーター遺伝子（例えば 、URA3遺伝子）を、DNA結合蛋白（例えば、GAL4などの転写因子）に対する認識 部位を少なくとも一つ含むプロモーター（例えば、SPO13プロモーター）と機能 的に結合させるためには、従来のクローニング法を用いることができる。必要に 応じて、選択可能な／逆選択可能なレポーター遺伝子を酵母細胞のゲノムに組み 込むために従来の方法を用いることができる。 蛋白質／RNA相互作用の解析：酵母細胞において種々の蛋白質またはRNA分子を 発現させるために、従来のクローニング法を用いることができる。RNA結合部分 およびそれが結合する非ランダムRNA分子には制限はない。一般に、RNA結合部分 は50アミノ酸未満で構成されることが好ましい。好ましくは、この非ランダムRN A分子は長さ10〜1000ヌクレオチドの範囲であり、さらに好ましくは、この非ラ ンダムRNA分子は長さ10〜100ヌクレオチドの範囲である。適切なRNA結合部分お よびそれが結合する非ランダムRNA分子の一例は、鉄反応要素結合蛋白質および 鉄反応要素である。 RNA ／RNA相互作用の解析：本発明の逆ツーハイブリッド系を用いて、多数のRN A／RNA相互作用を同定することができる。本発明のこの面において用いるために 適した発現プラスミドの構築は、一般に知られたクローニング法を用いることに よって達成することができる。蛋白質／RNA相互作用の同定に有用な非ランダムR NA分子およびRNA結合部分は、RNA／RNA相互作用の同定にも有用である。 DNA ／蛋白質相互作用の解析：本発明は、蛋白質／DNA相互作用の特徴分析のた めに用いることもできる。本発明のこの面において、対象となるDNA配列（「被 験DNA配列」）は、逆選択可能なレポーター遺伝子と機能的に結合したプロモー ターの内部に含まれる。この意味において、被験DNA配列は、DNA結合蛋白質認識 部位として作用する。対象となる蛋白質（「被験蛋白質」）が、その被験DNA配 列と結合する能力を検討する。本発明のこの面において、「被験蛋白質」は、遺 伝子活 性化部分を有するハイブリッド蛋白質として産生され、ハイブリッド蛋白質の被 験DNA配列との結合によって逆選択可能なレポーター遺伝子の転写が活性化され る。必要に応じて、この被験DNA配列および／または被験蛋白質配列は、意図的 に設計されたものでも、無作為に作製されたものでも、または意図的に設計され た部分と無作為に作製された部分の両方を含むものでもよい。必要に応じて、被 験DNA配列および／または被験蛋白質をコードする遺伝子は、核酸ライブラリー に由来することができる。したがって、両方向組合せライブラリーを作成し、本 発明のこの面におけるスクリーニングを行うことができる。本明細書に記載した 、蛋白質／蛋白質相互作用の特徴分析のための方法、ならびに蛋白質／蛋白質相 互作用に影響を及ぼす化合物および変異を同定するための方法は、適切な変更を 施すことにより、蛋白質／DNA相互作用の特徴分析のために用いることができる 。 解離化合物の同定：可能性のある解離化合物は、培養系に対してそれを単純に 添加することによって細胞に導入することができる。可能性のある解離化合物の 多くは十分に低分子であるため、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ る。また、解離化合物がRNA分子または蛋白質であれば、希望するRNAまたは蛋白 質を発現するDNA構築物によって細胞に形質転換を施すことによって細胞内で産 生することができる。解離化合物は、再構成された転写因子を有する細胞を、再 構成された転写因子が逆選択可能なレポーター遺伝子の発現を指向するような条 件下において、固形培地にまず平板培養することによって迅速に同定することが できる。この方法により、培地上に非増殖性細胞の層が作られる。 続いて、検査対象の化合物を、非増殖性細胞の層の上に、秩序だった様式（例 えば、格子状などのパターンを形作るように）で付着させる。固形培地に溶液と して添加された化合物は、徐々に培地全体に拡散し、培地中に化合物の一定の濃 度勾配が作られる。解離化合物は、細胞増殖を防止する逆選択可能なレポーター 遺伝子の発現が転写因子の解離によって抑制されるため、化合物が付着した部分 で細胞が増殖することによって同定することができる。解離化合物の添加に反応 して増殖した細胞も勾配を形成すると考えられる。つまり、解離化合物が添加さ れたプレート上の位置では最も多くの細胞が増殖する可能性が高いと考えられる 。増殖している細胞の最も中心の位置には、高濃度の化合物の毒性のためにリン グ状の非増殖性部分が生じる可能性もある。この増殖に関するリングの直径は、 解離化合物の強度を反映するとともに、解離のために必要な化合物の濃度を反映 する。 感受性の最適化：典型的には、解離因子がそれとして同定される以前には、相 互作用する一対の分子のいずれか一方に対するその相対的親和性は未知である。 したがって、解離因子を同定するために好ましい条件は、レポーター遺伝子の転 写活性のわずかな低下でも認識可能なものである必要がある。最大感度が得られ る条件は、プロモーター内のDNA結合蛋白認識部位の数を最小にし、宿主細胞に 薬物感受性（例えばFoas）表現型を付与するために十分な、最低の濃度の薬物（ 例えば5-FOA）を用いることによって確立することができる。 本発明者らは、本発明のその他の態様を実践するための指標となる、本発明の 種々の面に関するいくつかの実施例を以下に説明する。 レポーター遺伝子の誘導可能な発現：本発明において用いるレポーター遺伝子 の発現を、転写因子によって誘導することができることを示すために、本発明者 らは、再構成されたGAL4蛋白質がSPALX:URA3対立遺伝子の発現を誘導する能力を 測定した。この実施例において、本発明者らは5つのGBSを有するSPAL5:URA3対立 遺伝子を用いた。本発明者らは、(i)全長の野生型GAL4蛋白質、または(ii)同一 細胞において2つの別々の分子として発現されるGAL4-DB（第1〜147アミノ酸）お よびGAL4-AD（第768〜881アミノ酸）、の存在下において付与されるUraおよび5- FOA表現型を分析した。全長のGAL4転写因子を発現した形質転換株は、強力かつ 堅固に調節されたUra+およびFoas表現型を示したが、GAL4-DBおよびGAL4-ADを2 つの別々の分子おとして発現した形質転換株は、転写因子を再構成する能力を有 する分子を欠いているために、強力かつ堅固に調節されたUra-およびFoar表現型 を示した。Foas表現型の強度は、形質転換を受けていない野生型の対照株と同程 度であった（図３）。予想された通り、URA3のヌル(null)対立遺伝子（ura3-52 ）を含む細胞には、いずれの蛋白質（GAL4、GAL4-DB、またはGAL4-AD）とも効果 はみられなかった（図3）。 転写因子を再構成するための2つのハイブリッド分子の使用：ここでは、本発 明者らは、レポーター遺伝子の発現を誘導するために2つのハイブリッド分子を 用い ることが可能であることを示す。本発明者らは、このことを2つの異なる一対の 蛋白質について示す。各々の対の蛋白質は相互作用することが知られている。第 1の蛋白質の対は、cFosおよびcJunであり、両者は比較的高い親和性で相互作用 する。第2の蛋白質の対はpRbおよびE2F1であり、これらは比較的低い親和性で相 互作用する。本発明者らは、GAL4転写因子の再構成を示すために、これらの2対 の蛋白質およびSPALX:URA3対立遺伝子を用いた。これらの実験では、合計4種の ハイブリッド分子を使用した。第1の蛋白質の対については、cFosの相互作用ド メインをGAL4-DBと共有結合させ（すなわち、融合させ）、cJunの相互作用ドメ インをGAL4-ADと共有結合させた。第2の蛋白質の対については、pRbの相互作用 ドメインをGAL4-DBと融合させ、E2F1の相互作用ドメインをGAL4-ADと融合させた （図4）。 これらの融合蛋白質のそれぞれをコードするDNA分子を、ADH1プロモーターお よび選択可能なマーカーを含む動原体プラスミドを用いて作製した。この場合に 、DBを発現しているプラスミドは選択可能なマーカーとして酵母LEU2遺伝子を有 し、ADを発現しているプラスミドは選択可能なマーカーとして酵母Trp1遺伝子を 有する。陰性対照として、cFos、cJun、pRb、またはE2F1の相互作用ドメインの 非存在下において、GAL4-DBおよびGAL4-ADを別々に発現させた。Foas表現型が、 感受性の高い転写測定手段を提供することを示すために、本発明者らは、それら の蛋白質がFoaA表現型を誘導する能力と、それらがGAL4で誘導可能なGAL1:lacZ レポーター遺伝子に由来するβガラクトシダーゼ活性の発現を誘導する能力とを 比較した。 本発明者らは、cFosおよびcJunの相互作用ドメイン、ならびにpRbおよびE2F1 の相互作用ドメインが、インビボにてGAL4転写因子を再構成することができるこ とを見いだした。DB-cFosハイブリッド体およびAD-cJunハイブリッド体を発現す る細胞培養系も、GAL1:lacZに由来する著しいレベルのβガラクトシダーゼ活性 を示した。同様に、GAL4-DB-pRbハイブリッド体およびGAL4-AD-E2F1ハイブリッ ド体を発現する細胞培養系も、GAL1:lacZに由来する著しいレベルのβガラクト シダーゼ活性を示した。DB-cFosおよびAD-cJun、ならびにDB-E2F1およびAD-pRb が転写因子を再構成する能力に関する定量的な評価を提供するために、これらの ハイブリッド分子を用いてGAL4を再構成することによって得たβガラクトシダー ゼ活性のレ ベルと、本来の全長のGAL4蛋白質によって得たレベルとを比較した（図5）。本 来のGAL4蛋白質によって誘導されたGAL1:lacZレポーター遺伝子の転写では、比 活性3,000単位のβガラクトシダーゼが産生された。DB-cFosおよびAD-cJunによ って再構成されたGAL4蛋白質では、比活性100単位のβガラクトシダーゼが得ら れた。DB-pRbおよびAD-E2F1によって再構成されたGAL4蛋白質では、比活性わず か0.5単位のβガラクトシダーゼが得られたのみであった。これらのデータは、c FosとcJunとの相互作用が比較的強いことを示すとともに、pRbとE2F1との相互作 用は比較的弱いとはいえ、解析で検出することができることを示している（図5 ）。 増殖閾値の限界の決定：必ずしも必要ではないが、2つの分子の相互作用にわ ずかな影響しか及ぼさないような化合物または変異を検出する理想的な条件下に おいて、逆選択法を実施するためには、「増殖閾値の限界」を決定することが有 用である。増殖閾値の限界とは、最小数のGBSとともに用いた場合に、細胞の増 殖を防止するために必要な、薬物（例えば、5-FOA）の最低濃度のことである。 必要な薬物の濃度が高いほど、転写因子を再構成する2つの分子間の相互作用は 強い。必要に応じて、本発明に用いるGBSの数を変えることもできる。 本発明者らは、GAL4転写因子を再構成する、以下の3種の異なった相互作用性 蛋白質の対について、増殖閾値の限界を規定した：(i)cFos/cJun、(ii)cJun/cJu n、および(iii)pRb/E2F1。SPO13:URA3プロモーター内にGBSを含まない対照細胞 は、GAL4蛋白質の存在下においても5-FOAに対する感受性を示さなかった。同様 に、GAL4-DBまたはGAL4-ADを発現する細胞も、それらを会合させるポリペプチド （すなわち、相互作用ドメイン）の非存在下において、GBSの数にかかわらず、5 -FOAに対して耐性であった。これに対して、cFos/cJun、cJun/cJun、またはpRb/ E2F1によって再構成されたGAL4は、5-FOA感受性の表現型を呈した。 この例において、転写因子の再構成にかかわる相互作用の相対的な強度は以下 の通りである：cFos/cJun＞cJun/cJun＞pRb/E2F1。それぞれの相互作用に関して 検討した5-FOAの濃度の範囲では、GBSの数が増加するに従って、種々の濃度の5- FOAに関する5-FOA感受性の勾配が観察された。これらのデータは、5-FOAに関す る増殖閾値の限界が、cFos/cJunについては0.05％、pRb/E2F1については0.1％、 cJun/cJunについては0.2％であることを示している（図6）。 プラスミドp2.5の解析：プラスミドp2.5の操作性に関する証拠を提供するため 、本発明者らは、このプラスミドが転写に誤った影響を及ぼさないことを確認し た。本発明者らは、pRbを発現するがADを発現しない、p2.5の誘導物を構築した （p2.5pRb）。生来のGAL4を発現している酵母細胞にp2.5pRbを導入した場合、こ のプラスミドは、宿主細胞のUraまたはFoa表現型に影響を及ぼさず、このプラス ミドがGAL4依存的な転写機能に影響を及ぼさないことが示された。この結果は、 pRbがSPAL:URA3の発現に陽性の効果を及ぼさないことを示している。細胞内にお けるこのプラスミドの発現により、DB-pRbおよびAD-E2F1を発現している細胞にF oas表現型が付与される結果、このプラスミドは著明な量のpRbを産生した（図7 ）。本発明者らは、ウェスタンブロット分析により、ハイブリッド分子の発現レ ベルがp2.5pRbプラスミドを含む細胞で変化しないことを示している。これらの 所見は、本発明に関して検討の対象となる解離化合物の候補を発現させるために 、p2.5プラスミドが有用であることを示している。 SPAL:URA3 対立遺伝子を含む酵母菌株の構築：SPO13:URA3構築物は、プラスミ ドpPL128から入手した（R.ストリッチ(Strich)およびR.エスポシト(Esposito)、 刊行物????による）。この構築物は、完全に機能するSPO13プロモーター、およ びSP013の最初の15アミノ酸と、最初のメチオニンコドンを除く全長のUra3蛋白 質とが融合した融合蛋白質をコードするORFを含む。GAL4結合部位（GBS）を挿入 する前に、SmaI-BamHI二重消化によってSPO13:URA3断片をpPL128から切り出し、 ClaIで消化し、クレノウ酵素で処理し、続いてBamHIで消化したpBSKプラスミド （ストラタジーン社(Stratagene)）にクローニングした。その結果得られたプラ スミドpMV252は、SPO13プロモーター内部の-170位および-368位に2つのEcoRI部 分を持ち、-213位にユニークなHindIII部位を有する。GBSは、プラスミドGAL4-5 /E1bCAT（リリー(Lillie)ら、1989，Nature 338:39〜44）に由来する。HindIII- XbaI二重消化により、このプラスミドから5つのGBSを含む断片を切り出し、続い てクレノウ酵素で処理してこの断片を平滑末端化した。本発明者らは、配列決定 およびPCR分析により、2種のプラスミドpMV262-11およびpMV262-12が、それぞれ GBSを5個および15個含むことを同定した。 SPAL:URA3構築物は、ura3-52遺伝子座における組み込み型組換えにより、ポリ メラーゼ連鎖反応の産物との相同組換えによって（すなわち、ギャップ修復法に よって）酵母ゲノムに導入し、それぞれのSPAL:URA3対立遺伝子を作製した。5' ブライマーは、プロモーターの上流に位置するURA3配列の40ヌクレオチド（-257 〜-218位）とSPOプロモーターの20ヌクレオチド（-370〜-351位）とが融合した （5'-GAAGGTTAATGTGGCTGTGGTTTCAGGGTCCATAAAGCTTGTCCTGGAAGTCTCATGGAG-3'；配 列番号：1）を含むJB516である（ローゼ(Rose)ら、1984 Gene 29:113〜124；バ ッキンガム(Buckingham)ら、1990，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:9406〜9410 ）。3'プライマーは、3'URA3（URA3の+656〜+632ヌクレオチド）（5'-TCAGGATCC CTAGGTTCCTTTGTTACTTCTTCCG-3'；配列番号：2）である（ローゼ(Rose)ら、1984 Gene 29:113〜124）。テンプレートとしてpMV262-11またはpMV262-12を用いる標 準的なPCR反応条件により、それぞれ、希望するサイズ（1,000bp）の産物、また は1,000〜1,300bpの範囲の産物の混合物が産生される。 このPCR産物は酵母株MaV82に直接形質転換のために導入され、形質転換株はウ ラシルを含まない培地上で選択される。酵母株MaV82は、GAL4を発現するプラス ミド、pCL1による形質転換を受けたMaV52である（フィールズ(Fields)ら、1989 ，Nature 340:245〜246）。MaV52（MATa ura3-52 leu2-3，112 trpl-901 hisΔ2 00 ade2-101 gal4Δgal80ΔGAL1:lacZ GAL1:HIS@lys2 can1Rcyh2R）は、（GAL1: lacZ@URA3を除去するための）5-FOAによる選択、および引き続きY153のCan選択 を行うことによって入手した（ブーケ(Boeke)ら、1984，Mol．Gen．Gen．197:34 5〜346、およびダルフィー(Durfee)ら、1993，Genes and Development 7:555〜5 69）。PCR産物の5'端の40ヌクレオチド、およびura3-52のTy挿入部とPCR産物の3 '端の間の320ヌクレオチドを用いることにより、ura3-52遺伝子座における二重 相同組換え事象または遺伝子変換事象が期待される（ロシュタイン(Rothstein) ，1983,Methods Enzymol．101:202〜211；バウディン(Baudin)ら、1993，Nuclei c Acids Research 21:3329〜3330、およびロゼ(Rose)ら、1984，Mol．Gen．Gene t．193:557〜560）。 pCLプラスミドの損失による試験では、形質転換株のほぼ50％が、期待されたG AL4-依存性のUra+表現型を呈した。SPAL:URA3対立遺伝子の組み込みが確認され 、ゲノムDNAをテンプレートとして用いるPCR反応においてGBSの数を推定した。 種々 の形質転換株のうち、MaV99は10個のGBSを含み、したがってSPAL10:URA3である 。5'プライマーはJB536である（URA3配列の-298〜-276ヌクレオチド；5'-GCGAGG CATATTTATGGTGAAGG-3'；配列番号：3）。3'プライマーは13-5である（SPO13アン チセンス配列の-124〜-145ヌクレオチド；5'-CATTTCCGTGCAAGGTACTAAC-3'；配列 番号：4）（バッキンガム(Buckingham)ら、1990，Proc．Natl.Acad．Sci．USA 8 7:9406〜9410）。MaV108株（GAL1:HIS3融合体を含まないMATa）、MaV103株（GAL 1:HIS3融合体を含むMATa）、およびMaV203株（GAL1:HIS3融合体を含まないMATα ）。MaV103およびMaV203は、MaV99とPCY2との間の接合体の減数***性分離個体 である（シャブレイ(Chevray)ら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5789 〜5793）。 プラスミドの構築：cFosおよびcJunのハイブリッド蛋白質（DB-cFos、AA 132 〜211（pPC76）；DB-Jun、AA 250〜334（pPC75）；AD-cJun、AA 250〜334（pPC7 9））は、以前に記載されている（シャブレイ(Chevray)ら、1992，Proc．Natl． Acad．Sci．USA 89:5789〜5793）。その他の蛋白質は、それらがGAL4-DB（AA 1 〜147）またはGAL4-AD（AA 768〜881）、プラスミドpPC97（GMA-DBの場合）（pP C97はpPC86のポリリンカーを含むpPC62である）、またはpPC86（GAL4-ADの場合 ）とともに同じフレームに位置するようにPCR産物をクローニングすることによ って作製した（シャブレイ(Chevray)ら、1992，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89 :5789〜5793）。野生型の配列を有する蛋白質を産生するためには、同じくPCR産 物をp97.CYH2にクローニングした。このプラスミドのCYH2遺伝子は、プラスミド シャッフリングおよび細胞からのプラスミドの除去を促進する。DB-pRbはpRbのA A 302〜928を含み、DB-pRbΔ22はエクソン22に欠失がある変異型pRbのAA 281〜8 94を含み、DB-p107はp107のAA 372〜10678を含み、AD-E2F1はAA411のチロシンが システインに変異した変異型E2F1のAA 342〜437を含み、AD-E2F4はE2F4のAA 1〜 413を含む（ヒーベルト(Hiebert)ら、1992，Genes & Development 6:177〜185； ホワイト(Whyte)ら、1988，Nature 334:124〜129；ヘリン(Helin)ら、1993，Mol ．Cell．Biol．13:6501〜6508；サルデット(Sardet)ら、1995，Proc．Natl．Aca d．Sci）。 p2.5誘導体は、PCR産物をp2.5にクローニングすることによって作製した。E1A #2はE1AのAA 30〜132を含み、E1A#4はE1AのAA 30〜86および120〜139を含み、E1 A-CR1はE1AのAA 1〜120を含み、pRBはpRbのAA 302〜928を含み、E1A-CR2はE1Aの AA 76〜139を含む。DB-DP1と相互作用する能力を持ち、宿主細胞に対して有毒で ないAD-E2F1ハイブリッド体を単離するために、本発明者らは、DB-DP1ハイブリ ッド体を発現している酵母細胞のcDNAライブラリーのスクリーニングを実施した 。その他の可能性のある相互作用性分子の中から、本発明者らは、E2F1のAA 159 〜437を含むAD-E2F1融合体を単離した。 変異誘発性ギャップ修復法：ポリメラーゼ連鎖反応（RCR）を用いる変異誘発 性ギャップ修復法は、選択した配列に変異を誘発させる便利な方法を提供する（ ミュールラッド(Muhlrad)ら、1992，Yeast 8:79〜82）。この方法では、変異を 生じさせたい配列をコードするDNAを、DNA分子への不正確なヌクレオチドの編入 が起こりやすい条件下でPCR反応系において増殖させる。このような条件には、 比較的高いマンガンレベルおよび／または種々のヌクレオチドの不均等な混合が ある。この方法において使用するPCRプライマーは、線状化された発現プラスミ ドの一部と相同な配列を両端に有する直線状のPCR産物を生じる。続いて酵母細 胞に、直線化されたプラスミドおよびPCR産物による同時形質転換を施す。直線 化されたプラスミドのインビボでの修復により、高い頻度で、変異を生じた配列 を含む安定な環状プラスミドが形成される。 補償変異：補償変異とは、変異を生じた分子同士は相互作用するが、それぞれ の対応する野生型の蛋白質またはRNA分子とは相互作用しないような、相互作用 性分子（例えば、RNA分子または蛋白質）の対における変異である。補償変異の 例には、互いに接触する荷電残基の逆転を引き起こす変異が含まれる。例えば、 2つの野生型の蛋白質（XおよびY）において、相互作用性分子Xの正に荷電した残 基と相互作用性分子Yの負に荷電した残基との接触が起こるとする。このXおよび Yにおける補償変異の一つは、Xが負に荷電した残基を含むように変異し、Yの相 互作用部位が正に荷電した残基を含むように変異するものである。補償変異は、 分子の相互作用ドメインのサイズの変化を含んでもよい。例えば、相互作用のパ ートナーであるXの一部が相互作用性分子Yの内腔領域と適合する場合には、Xに 生じた補償変異によって相互作用ドメインのサイズが大きくなり、Yに生じた補 償変異によって、Xの拡大した相互作用ドメインに順応するように相互作用のた めの内腔が拡大 する場合が考えられる。 相互作用性分子における補償変異に関して知っておくことは、これらの変異が 2つの分子の相互作用に不可欠な部分で起こることが多いため、科学者にとって 有意義である。補償変異は、相互作用性分子の適切な折りたたみに関して重要な 接触性残基、アミノ酸またはリボヌクレオチドなどの、分子間相互作用に関与す る重要な残基を規定すると考えられている。今日までに蛋白質における補償変異 が同定され、蛋白質のX線結晶構造が判明しているものでは、結晶構造によって 同定された相互作用性残基と、補償変異に関して同定された相互作用残基との間 に明らかな相関が示されている。分子の機能においてこのような極めて重要な役 割を有する残基を同定することは、蛋白質および／またはRNA分子の間の好まし くない（すなわち、疾患に関連した）相互作用を遮断することによって機能する 治療的化合物を合理的に設計するために非常に重要である。 条件変異株：蛋白質およびRNA分子の構造および機能の研究は、対象となる分 子に関する条件変異株を同定することによって容易となる。これらの条件対立遺 伝子は、許容しうる条件下では野生型の機能を果たすことが可能であるが、細胞 を制限的な条件下に移行させた場合には、分子が機能する能力に検出可能な変化 を生じる。条件対立遺伝子の単離においては、その結果生じる構造的および／ま たは機能的な変化が軽微であることが多いとの事実のために、その頻度がかなり 低いことが妨げとなる。多くの古典的な方法では、広範囲の欠失または部位指定 変異のいずれかの作成を指向する方法を用いて、相互作用性分子をコードする遺 伝子にインビトロで改変を加える。このような方法には長い時間がかかると思わ れる。さらに、古典的な方法では、(i)許容的であると指定された条件下で機能 を有する、および(ii)制限的であると指定された条件下で機能を持たない、対立 遺伝子を選択することはできない。 合成ライブラリ中にコードされる蛋白質を用いた 蛋白質／蛋白質相互作用の同定 合成ライブラリを含む酵母菌株の構築：本発明者らは、酵母菌株MaV103の表現 型の特徴付けを行い、この菌株を用いておよびMaV203と様々なハイブリッド蛋白 質とを用いてリバース・ツーハイブリッド法を試みた（図８）。本発明のリバー ス・ツーハイブリッド法の機能性を示すために、本発明者らは、限られた数の未 知のパラメーターを有する２つの合成ライブラリを用いて(i)双方向ライブラリ における頻度が10-6である相互作用の同定に集団接合法(mass mating method)が 利用できるか否か、および(ii)接合細胞(mated cells)の形成に先立って、自己 活性化接合能を有するクローンを排除するために用いる逆選択法の効率、を判定 するために設計した再構築（すなわち、再構成）実験を行った。この「双方向組 み合わせライブラリ」(BCL)を作成するのに用いた方法の概略を図９に示す。 合成ライブラリの構築：DNA結合部分と融合したポリペプチドを有するクロー ンのライブラリには、GAL4-DBを用いた（図10）。本発明者らは、pRb、p107、p1 30、p21、サイクリンD2、cFos、cJun、DCC1、またはdE2Fの様々な形態を含む15 のハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドを作成するために、GAL4-DBベク ターを用いた（図11）。15のハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドを希釈 するために、様々なプラスミド各１ngおよびGAL4-DBのみを（すなわち、別のポ リペプチドとのハイブリッド蛋白質としてではなく）発現するプラスミド１μg を含むDNA混合液を調製した。これらはそれぞれ内生のADを含むため、GAL4-ADと 融合したポリペプチドが存在しなくても、DB-DCC1およびdE2Fをコードするハイ ブリッド蛋白質の両者とも、レポーター遺伝子の転写を活性化できる。これらの ハイブリッドは両者とも、3AT耐性（ヒスチジン非存在下）および5-FOA感受性の 表現型をMaV103細胞に付与することができる。この解析では、これらの偽陽性を 検出し除外するために、これらのハイブリッド蛋白質を対照として用いた。 GAL4-ADベクターを用いて、活性化ドメインと融合したポリペプチドを有する ハイブリッド蛋白質の合成ライブラリのアッセンブルを行った（図10）。様々な 形態のcdk2、cJUN，E2F-1、E2F-2、E2F-3、またはE2F-4を含む、ハイブリッド蛋 白質のライブラリを作成するのに15のポリペプチドを用いた（図11）。ADハイブ リッド蛋白質のライブラリには、自己活性化するクローン（すなわち、偽陽性） はひとつも含まれていなかった。様々なハイブリッド蛋白質をコードするプラス ミドを希釈するために、本発明者らは様々なプラスミド各１ngおよびGAL4-ADの みを発現するプラスミド（すなわち、別のポリペプチドとのハイブリッド蛋白質 としてではない）１μgを含むDNA混合液を調製した。 ADおよびDB分子をコードするプラスミドの混合物を用いて、レポーター遺伝子 の同一のセットを含む酵母菌株を別々に形質転換した。プラスミドの合成ライブ ラリのひとつを用いて、MATα株のひとつであるMaV203を形質転換させた。プラ スミドの他の合成ライブラリは、MATα株のひとつであるMaV103に導入した。２ つの交換可能な接合型(mating type)の酵母がこれら２つのライブラリに用いら れていれば、どのライブラリをどの接合型の細胞に形質転換させてもかまわない 。形質転換された酵母細胞は、ロイシンまたはトリプトファンのいずれかを欠く 寒天培地上に置き、それぞれLEU2またはTRP1マーカーを用いて形質転換体を選抜 する。MATa Leu+の形質転換体はGAL4-DBに融合したポリペプチドのライブラリを 用いて得られる半数体のクローンであり、またMatα Trp+の形質転換体はGAL4-A Dに融合したポリペプチドのライブラリを用いて得られた半数体のクローンであ った。 逆選択：それぞれ独立して転写を活性化することのできる接合能を有するクロ ーンを排除するために、逆選択法を用いた。第１の選択段階で得られたLeu+およ びTrp+のコロニーは、別々に、0.2％の5-FOAを含む培地で直接レプリカ培養した （図12）。この培地上では、非活性化クローンに対応するコロニーのみがさらに 増殖した。必要に応じて、逆選択の段階を繰り返すこともでき、この場合は、２ 回行った。図12に示すとおり、不適切に転写が活性化されたクローンは全て、5- FOAを用いた逆選択により完全に排除された（プレートの右側にある細胞の大き な区分は、この実験で用いた対照を表す；5-FOA非存在下における逆選択で回収 したコロニーの数（下方左のパネル）と5-FOA逆選択で得られた数（下方右のパ ネル）とを比較されたい）。5-FOA逆選択を２回行った後には、ヒスチジンを欠 き3ATを含む培地上で自己活性化能を有するクローンは検出されなかった。 集団接合法(Mass-mating method)：非活性化クローンを含むことを示す、逆選 択段階で生き残った細胞を採集し、液体培地に再懸濁した。２つの細胞系の各々 から約1010個の細胞を、109細胞／mLの濃度となるよう、別々に10mLの培地に再 懸濁した。次に、２種の細胞懸濁液を混合し、接合細胞の形成（すなわち接合） に適した条件下で一晩培養した。この場合には、接合能を有する細胞の混合物を 、YEPDを含む15cmのプレート上、栄養豊富な培地に塗布し、得られた接合細胞を ロイシンおよびトリプトファンの両方を欠く培地で再び培養した。本発明者らの デ ータから、接合効率は約10％であることが示された。本発明者らは、これらのデ ータに基づき、懸濁液の量を数リットルにまで増加させた場合、1013個までの接 合細胞がこの集団接合法(mass mating method)で選択できる、との結論を得た。 これらのデータにより、反応液量を数リットルにスケールアップすることにより 、1013組の相互作用蛋白質が生成され、スクリーニングされることが示唆される 。 選択：集団接合法で得られた接合細胞を、ADおよびDBをコードするプラスミド の存在について選択する固形培地上で培養した。本明細書では、ロイシンおよび トリプトファンの両方を欠く培地を用いた。これらのプレート上で増殖するコロ ニーを、ロイシン、トリプトファンおよびヒスチジンを欠き20mMの3ATを含む培 地上でレプリカ培養した。 陰性対照として、別のポリペプチドと融合させることなく、GAL4-DBまたはGAL 4-ADをコードするプラスミドでのみ形質転換した半数体細胞からの２倍体細胞の 形成を誘導した。陰性対照から得られた5ｘ105個の２倍体細胞のうち、ロイシン およびトリプトファンの両方を欠く培地上で生き残ったものはひとつもなく、擬 陽性がひとつも得られないことが示された。 陽性対照として、DB-FosまたはAD-cJunのいずれかのハイブリッド蛋白質を発 現する細胞の合成ライブラリを２つ構築した。これらのライブラリを1：100に希 釈し、２倍体細胞を形成させ、ロイシン、トリプトファン、およびヒスチジンを 欠くプレート上で選択した。この条件下では、生き残る細胞は約10-4の期待頻度 で得られた（約50,000の２倍体細胞から12個の3AT耐性コロニーが得られた）。 対照的に、この手順を用いて、合成ライブラリを含む細胞からは、3AT含有培 地上で積極的に増殖するコロニーが得られた。試験した5ｘ106個の２倍体のうち 、400個の3AT耐性コロニーが回収された。この実施例における２倍体細胞を、ロ イシンおよびトリプトファンを欠乏する培地で培養し、つぎに、ロイシン、ヒス チジン、およびトリプトファンを欠き3ATを含む培地で培養した。必要に応じて 、接合細胞を、3ATを含みロイシン、ヒスチジン、およびトリプトファンを欠く 培地で直接培養することもできる。 回収された400個のコロニーを、URA3遺伝子の発現の指標としての5-FOAに対す る感受性について調べた。またX-gal含有培地上でβ-ガラクトシダーゼ活性につ いても調べた。試験したクローンの約95％がURA3およびlacZ遺伝子を発現してい た。これらのコロニーのうち、120個についてさらに解析した。これらのコロニ ーからプラスミドを抽出し、大腸菌内で増幅した後抽出した。相互作用蛋白質の 80対をコードするプラスミドの挿入断片を塩基配列解析により同定した。塩基配 列解析で得られたデータ（図13）により、(i)期待される相互作用のほとんどが この方法により検出されること；および(ii)cFos/cJun相互作用が、おそらくは これらのポリペプチドをコードするDNAの大きさが比較的小さいために、高い頻 度で再構成されること、が示された。従って、本発明により、蛋白質-蛋白質相 互作用を同定するための、簡便で効果的な方法が提供される。 分子間相互作用を破壊する化合物の同定 再構成した転写因子の解離：本発明者らは、２つの分子の相互作用を破壊する （すなわち、その相互作用を妨げる、または解離を引き起こす）化合物により阻 害が起こるような、レポーター遺伝子の転写阻害を本発明により検出可能か否か を試験した。この方法は２つのハイブリッド分子が相互作用して転写を媒介する 能力を破壊する化合物（すなわち、解離因子(dissociators)）の同定に用いるこ とができる。有効な化合物は、レポーター遺伝子（たとえば、SPALX:URA3）の発 現の低下を引き起こす。たとえば、レポーター遺伝子がURA3である場合、解離因 子はFoar表現型を宿主細胞に付与する。したがって、本発明は蛋白質／蛋白質相 互作用を破壊する分子を同定するための簡便な方法を提供する。 本発明者らは、２つの相互作用蛋白質のうち、DBまたはADを欠くいずれかひと つを細胞内で過剰発現させることにより、この系において転写がブロックされる ことを見いだした。過剰発現したDBまたはADを欠く相互作用蛋白質は、２つのハ イブリッド分子と競合してレポーター遺伝子の転写活性化を妨げる。これらのデ ータは、解離化合物は細胞内で生産され、本発明で同定できることの証拠となる 。 本発明により、２つの相互作用分子の解離が検出できるもう一つの例として、 本発明者らは第３の蛋白質、E1Aを、AD-E2FおよびDB-pRb、またはAD-E2FおよびD B-p107のハイブリッド分子のいずれかを発現する細胞内で過剰発現させた。本発 明者らは、アデノウイルスE1A蛋白質の、pRbおよびp107に結合してpRb/E2Fおよ びp107/E2F4を解離させる能力について測定した。これらの研究において、簡便 なクローニング法を用いてE1Aのコード配列をプラスミドp2.5のポリリンカーに 挿入することにより、AD-E2FおよびDB-pRbまたはDB-p107のいずれかを発現する 酵母細胞内で、E1Aが発現された。本発明者らは、酵母菌株におけるE1Aの発現に より、Foas表現型が保護されることを見いだし（図14）、これは本発明がDB-pRb /AD-E2FおよびDB-p107/AD-E2F相互作用の両者についてその解離を検出できるこ とを示す。 いくつかの観察結果から、E1Aに媒介される解離が特異的であることが示唆さ れる：(i)E1Aの過剰発現は、様々なハイブリッド蛋白質の定常状態のレベルには 影響しなかった；(ii)E1A蛋白質の発現は、DB-DP1/AD-E2F相互作用の結果である Foas表現型に何ら影響を与えなかった；(iii)哺乳類細胞においてpRb/E2Fの解離 に必須であることが知られている保存領域II（CR2）は、Foas表現型に必須であ った；および(iv)DB配列のいずれも存在しないとき、pRbの過剰発現により、DB- pRb/AD-E2F1を発現する細胞においてE1Aと同程度にFoas表現型が保護されるが、 DB-p107/AD-E2F4のFoas表現型は保護されなかった（図14）。 解離化合物の力を強める：必要に応じて、薬物（たとえば、5-FOA）の致死を 引き起こす濃度範囲にわたって、２つの相互作用ハイブリッド分子（たとえば、 蛋白質）を解離する化合物の能力を調べることにより、解離因子の力を特徴づけ ることができる。たとえば、最初の解析は、比較的弱い解離化合物を同定するた めに、比較的低い5-FOA濃度（すなわち、増殖しきい値に近い濃度）、および少 数のGBSsを用いて行うことができる。２回目の解析では、5-FOAの濃度および／ またはGBSsの数を高め、より強力な解離因子を同定する。解析は繰り返して行う ことができる。この方法は、解離化合物の設計にも有用である。弱い解離化合物 がひとたび同定されれば、それを改変して（たとえば、標準的な技術により行う ことのできる、アミノ酸、ヌクレオチド、または化学基の置換）、次の解析で試 験することができる。改変によって強められた解離化合物は、もとの分子と比較 してより厳密な条件下（たとえば、より高濃度の5-FOA）で、細胞の増殖を促進 する（すなわち、相互作用を阻害する）能力により同定できる。 解離化合物の同定のための２倍体酵母菌株の使用：必要に応じて、レポーター 遺伝子の２コピーを有する酵母の２倍体菌株を用いて解離化合物を同定すること ができる。たとえば、SPALX:URA3の２コピーを有する２倍体株を用いることによ り、Foas表現型が自然に復帰変異してFoarクローンが出現する可能性を減らすこ とができる。従って、２倍体株を用いることにより、この方法の感度が高まる。 解離化合物は半数体または２倍体のいずれを用いても同定できるが、２倍体を使 用するのが好ましい。 本発明者らは、Foas表現型が復帰する原因となる変異が、SPAL:URA3レポータ ー遺伝子に結合したシスに作用する変異に相当することを見いだした。理論上、 シスおよびトランスに作用する変異は両者ともにFoas表現型の復帰につながる。 シスに作用する変異はSPALX:URA3アレルのプロモーターにある反復GBSsの欠失に 関与している可能性が高く、一方トランスに作用する変異は、プラスミドの配列 間の遺伝子変換現象、または相互作用分子のコード配列におけるノックアウト変 異である可能性が高い。 Foas表現型の復帰につながる自然変異の性質を特徴付けるために、本発明者ら は２つのレポーター遺伝子（GAL1:HIS3およびGAL1:lacZ）の発現がFoarコロニー において変化した（すなわち、自然変異体）か否かを調べた。本発明者らのデー タから、HIS3およびlacZの発現はこれらの細胞内で変化がないことが示され、こ の復帰変異はSPALX:URA3プロモーターに結合したシスに作用する変異であること が示唆される。従って、２コピーのSPALX:URA3レポーター遺伝子を含む酵母の２ 倍体株は、自然復帰変異体が出現する頻度を減少させると考えられる。この頻度 は10-6×10-6=10-12と計算される。自然復帰変異の頻度は、cFos/cJunハイブリ ッド蛋白質を発現する半数体細胞からFoarコロニーが得られる割合を、２倍体細 胞から得られる割合と比較することにより、実験的に得ることもできる。 分子間相互作用の特徴付けのための変異の使用 変異を起こした相互作用分子の同定：本発明者らはまた、本発明により、相互 作用を無効にする生理学的に関連した変異が検出できるか否かについて試験した 。本発明の重要な指針のひとつは、相互作用分子を解離させるような変異により 、DNA結合蛋白質の認識部位に機能的に結合したレポーター遺伝子の発現を、検 出可能な程度にまで減少させられることである。たとえば、pRb/E2F1相互作用対 の 網膜芽腫蛋白質で変異が起こると、その変異が２つの分子の相互作用に関わる残 基に関係した変異であるならば、細胞はFoarの表現型を示すはずである。本発明 によりレポーター遺伝子の転写の減少を検出できるか否かを試験するために、本 発明者らはエクソン22を欠失しているためにE2F1と会合できないpRbアレルを用 いた。この形のpRbをGAL4-DBとのハイブリッド蛋白質として発現させ、これをハ イブリッド蛋白質DB-pRbΔ22と名付けた。E2F1はGAL4-ADとのハイブリッド蛋白 質として発現された。本発明者らは、これらの蛋白質が酵母で発現することによ り、DB-pRbΔ22の発現レベルが野生型のpRbの発現レベルに匹敵するものであっ ても、Foar表現型を生じることを見出した（図15）。本発明者らはまた、pRbと 結合できないE2F1の変異アレル（AD-E2FY411C）を有するハイブリッド蛋白質に よる相互実験も行った。この変異アレルの発現によっても、Foar表現型となる（ 図15）。これらのデータから、本発明の逆ツーハイブリッドシステムが、２つの 分子の会合を妨げる変異の検出に用いることができるということのさらなる証拠 が提供される。 構造的および機能的に重要な残基を決定する微妙な変異を同定するための二段 階選抜法の使用 ：本発明者らは、DP1と相互作用する能力を媒介するE2F1内の残 基を同定するために、二段階選抜法を用いた。この方法は、図16に概略を示した 計略に基づいている。まず、DP1とE2F1とが互いに結合する能力に影響を及ぼす 変異を同定し、第２段階で、これらの蛋白質間の相互作用を完全には止めないよ うな変異を同定した。この方法は、DP1と相互作用するE2F1の能力を完全に破壊 するような変異は、蛋白質の大きさを変えてしまう変異（たとえば、ナンセンス 変異、欠失、または挿入）などの、無益な変異であるかもしれない、という前提 に基づいている。この方法により、蛋白質／蛋白質相互作用を穏やかに変化させ るようなアレル（たとえば、アレルのライブラリから選択されるアレル）の同定 が容易になる。 この二段階選抜法の実施例において、本発明者らは、GAL1:HIS3レポーター遺 伝子（ダルフィー(Durfee)ら、1993,Genes & Dev．7:555〜569）を用いた。この レポーター遺伝子は、His表現型の程度が判定できる、すなわち、His表現型を、 HIS3酵素活性の特異的阻害物質である3ATの濃度を広範囲に変えて判定できるこ とか ら、本法に特に適している（図17）。GAL1:HIS3を発現する細胞は、ヒスチジン を欠き高濃度の3ATを含む培地上で増殖する。この場合、DB-DP1/AD-E2F1の発現 により、細胞は最高100mMの3ATを含む培地上で増殖できるようになった（図17） 。この二段階選抜法では、最初の選択は0.1％の5-FOAで行い、第２の選択は10mM の3AT（ヒスチジン欠乏培地上）で行った。 これらの実験において、DB-DP1ハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドで 、SPAL10:URA3アレルを含む酵母菌株MaV103を形質転換した。形質転換体は、ロ イシン欠乏培地で選択した。E2F1の配列は、AD-E2F1（E2F1のAA 159〜437）をコ ードするプラスミドを鋳型として用いPCRで増幅した。用いた5'側のプライマー は、ADのコード配列内に位置する配列に対応している。このプライマーの配列は 、ADおよびE2F1の最初のアミノ酸（AA 159）のつなぎ目の約100塩基対上流に位 置していた。用いた3'側のプライマーは、E2F1のORFの停止コドンに隣接した配 列に対応している。これらのプライマーおよびこのE2F1の鋳型を用いて、増幅さ れる配列に変異を誘発するために、様々な条件で何度かPCR増幅反応を行った。 これらの何度かの反応において、PCRを用いて配列中に変異を誘発するため、マ ンガン濃度および／またはヌクレオチドの相対的濃度を従来の方法に従って変化 させた。変異誘発の最適条件は増幅断片の長さと配列とに依存するが、適切な条 件を選択することにより、単一のペトリ皿で事実上スクリーニングできる程多く の酵母コロニーから変異株を検出するのに十分高い頻度で、かつ増幅配列中に複 数の変異が起こるのを回避するのに十分低い頻度で変異を誘発できる。 ギャップ修復法：変異を起こした配列をプラスミドに組み込むため、ギャップ 修復法を用いた(図18Aおよび18B)。この場合、AD-E2F1プラスミドを、E2F1配列 の中ほどに位置する単一のBglII部位で制限酵素消化して線状化した。別の方法 としては、E2F1の増幅のためのPCRプライマーが、プラスミドの配列およびPCR断 片の配列に対応している場合には、ポリリンカー内で線状化した「空の」ADプラ スミドを用いることができる。 ギャップの修復のために、100ngの増幅したPCR断片および100ngの線状化した プラスミドで、DB-DP1を発現する酵母細胞を、酢酸リチウム法により共形質転換 した。この実施例では、形質転換体はロイシンおよびトリプトファンを欠く増殖 培 地上で選択した。栄養豊富な増殖培地上で２日間増殖させた後、形質転換体をロ イシンおよびトリプトファンを欠き0.1％の5-FOAを含む培地（Sc-L-T+5FOA培地 ）上でレプリカ培養することにより、第一段階の選択を行った（図19）。プレー ト上のコロニーの数およびマンガン濃度およびヌクレオチドの組成（すなわち変 異誘発の程度）の間に相関が見いだされた。5-FOAを含みロイシンおよびトリプ トファンを欠く培地上で増殖するコロニーを回収するために、ロイシンおよびト リプトファンを欠くプレート上でレプリカ培養した（図19）。 選択の第二段階として、これらのプレート上のコロニーを、ロイシン、トリプ トファン、およびヒスチジンを欠き、低濃度の3ATを含むプレート上でレプリカ 培養した。これらのプレート上で増殖するコロニーは、DP-1と相互作用するE2F1 の能力に弱い影響を与える変異がE2F1内に起こっていることが予測された（図19 ）。二段階選抜法で得られたデータを代表するデータを表１に示す。 選択法の第二段階で増殖したコロニーの表現型を確認するために、まずそれら のコロニーを、単一コロニーを得るためつついてSc-L-Tプレートにストリークす ることにより精製した。次に、精製したコロニー4個をSc-L-Tプレートにパッチ し、つづいてヒスチジンを欠き0.1％の5-FOA、10mMの3AT、およびX-galを含む培 地でレプリカ培養した。この条件下でも増殖するコロニーのみをさらに解析した 。最初に選択したコロニーの約90％が、この追加試験を通過した。これらの細胞 から抽出したDNAを用いて大腸菌細胞を形質転換し、形質転換された細胞をアン ピシリン含有培地で選択した。得られたコロニーは、DB-DP1またはAD-E2F1のい ずれかのハイブリッド蛋白質をコードするプラスミドを含んでいた。AD-E2F1を コードす るプラスミドは、形質転換された大腸菌細胞から得たDNAを制限処理解析するこ とにより同定した。 AD-E2F1をコードするプラスミドは、GAL1:HIS3およびSPAL10:URA3アレルを含 み、DB-DP1を発現する酵母細胞に再び導入した。形質転換された細胞はSc-L-T培 地で選択した。４個の形質転換体をSc-L-T培地にパッチし、つぎにロイシン、ト リプトファン、およびヒスチジンを欠き0.1％の5-FOA、10mMの3AT、およびX-gal を含む培地でレプリカ培養した（図20）。陽性対照として、野生型のDB-E2F1ア レルをGAL1:HIS3およびSPAL10:URA3アレル（図20、下列）を含む細胞に再導入し 、および空のADプラスミドであるpPC86（すなわち、E2F1を欠くプラスミド）を 陰性対照として用いた。 AD-E2F1-34アレルは、変異アレルで期待される表現型を再試験していないプラ スミドの例を示す。言い換えれば、AD-E2F1-34の増殖およびβ-gal表現型は、野 生型のAD-E2F1と区別できなかった。AD-E2F1-34が野生型のアレルと同一である との仮説は、AD-E2F1-34の配列に何ら変異がないことが示された、AD-E2F1-34の 塩基配列解析により、確認された。野生型のアレルのなかには大腸菌へのシャッ フリングの過程で回収されたものもあるが、回収されたアレルの約90％は、期待 通り、変異株であった。 12個のAD-E2F1アレルの塩基配列決定を行い、12のアレルのうちの11において 、E2F1をコードする1.2kbの配列中に単一のヌクレオチド置換が検出された。こ れらのアレルのうち6個で、変異はマークボックス2(Marked Box 2)（MB2）ドメ インと呼ばれるドメインに位置していた（図21）。MB2ドメインは、18アミノ酸 が伸長したものである。変異がこの18アミノ酸領域内に集中していることから、 MB2ドメインはE2F1のDP1との結合に必要であることが示唆される。５個のヒトE2 F蛋白質間で、蛋白質のこの領域内で高度な相同性があるという観察からも、MB2 ドメインがこの役割を果たしているという推測がさらに支持される（図21、上） 。 さらに、(i)この方法で作製され同定されたさまざまな変異と、(ii)検出され たさまざまな表現型（図20）との間に相関があるという観察結果からも、二段階 選抜法の有用性がさらに支持される。たとえば、E2F1とDp1との相互作用に強く 影響する（すなわち、このアレルを発現する細胞は5-FOAに対して高度の耐性を 示した （図20））E2F1-31アレルは、MB2ドメインの小さなインフレームの欠失に関与し ていた（図21）。対照的に、２つの変異を有するアレルであるE2F1-30は、相互 作用に比較的穏やかな影響を与えた；このアレルを含む細胞は5-FOA上でほとん ど増殖しない。このアレルでは２つの変異が見つかっているが、両方ともE2Fフ ァミリーの異なるメンバーの間では完全には保存されていないMB2ドメインの中 に位置しており（図21、上端および下端）、このことからこれらの残基は相互作 用にはそれほど重要ではないことが示唆される。保存的変異を有するアレルが相 互作用および増殖表現型に中程度の影響を及ぼしたという事実は、これらのデー タに一致している。これらのアレル（E2F1-20、-32、および-65）においては、 変異によって第284アミノ酸のイソロイシンがスレオニンまたはアスパラギンの いずれかに置換されていた。必要に応じて、変異遺伝子産物の機能をさらに調べ るために、これらの変異アレルを酵母細胞に再導入することができる。 二段階選抜法による比較的強度な変異の単離：本発明者らは、二段階選抜法の 第１段階において、DP1との相互作用能を失ったE2F1の8個のアレルを単離し、塩 基配列決定した（図19）。これらのアレルをそれそれ塩基配列決定したところ、 E2F1蛋白質が短くなる原因となりうるナンセンス変異、欠失、または挿入が明ら かとなった。短くなった変異体の選択を避けるため、二段階選抜法の変法を用い て、DP1との結合能を失っているが、pRbとの相互作用能は保持しているようなE2 F1変異アレルの同定を行った。このアプローチの基盤となる原理は、pRb結合部 位がE2F1アレルのＣ末端ドメインに位置しているため（結合部位はE2F1の第159 〜437アミノ酸の第409〜427アミノ酸を含む）、蛋白質を短くすることなくE2F1 のDP1への結合が排除される変異（すなわち、pRbとの結合に影響する）は、容易 に同定することができるというものである（図22）。本発明者らは、DB-pRbハイ ブリッド蛋白質を発現するプラスミドを構築した（pRbの第302〜928アミノ酸を 用いた）。 選択法の第一段階として、細胞をSc-L-T培地で２日間増殖させ、Sc-L-T+5-FOA （0.1％）培地でレプリカ培養した（図19の通り）。DB-DP1を発現するプラスミ ドは、非選択的培地上での細胞の増殖により排除され、DB-DP1プラスミドを失い AD-E2F1プラスミドを保持している細胞は、レプリカ培養した後、適当な選択培 地に おけるその増殖能を検定することにより同定される。DB-DP1プラスミドを失った コロニーを同定するための別の方法は、DB-DP1プラスミド上の逆選択マーカーを 発現させ、逆選択マーカーの発現が致死的となるような培地上で細胞を増殖させ ること（プラスミド・シャッフリング）である。たとえば、DB-DP1をコードする プラスミドを、CYH2遺伝子を発現するよう操作し、DB-DP1を発現する細胞を、シ クロヘキシミド含有培地で排除することができる。選択の第２段階において、AD -E2F1含有細胞を、寒天プレート上でローン（lawn）を形成させ、DB-pRbプラス ミドを含む細胞と接合させ、選択可能なレポーター遺伝子の発現を測定した。次 に、得られた接合細胞について、ヒスチジン、ロイシン、およびトリプトファン を欠き10mMの3ATを含む培地上で試験した。この解析で陽性であったクローンは 、変異が起こっているが、短くなってはいないE2F1アレルを有することを示す。 試験した350のFoarのコロニーのうち、12個のコロニーがpRbを含む細胞との接合 後に陽性であると評価された。 この方法の別の態様において、定法を用いてE2F1以外の蛋白質をADに融合させ ることができる。必要に応じて、変異を起こしたい蛋白質をADではなくDBと融合 することもできる。この方法で再構成される転写因子はGAL4以外のものでもよい （たとえば、LexAまたはAce1が使用できる）。加えて、レポーター遺伝子の組み 合わせにより第１段階における逆選択および第２段階における正の選択（好まし くは、測定可能な表現型で）ができるのであれば、URA３およびHIS3以外のレポ ーター遺伝子を使用できる。 機能的C末端タグ：この二段階選抜法で特徴づけられる変異蛋白質が、単に野 生型蛋白質が短くなっただけではないようにするため、機能的Ｃ末端タグを、上 記のクローンで発現される任意の蛋白質のＣ末端に共有結合させることができる 。このような機能的Ｃ末端タグは、上記に開示した実施例のpRb結合ドメインと 同様に機能すると考えられる。機能的Ｃ末端タグは蛋白質との結合ドメインを含 む一連のアミノ酸である。pRb結合ドメインは、長さが18アミノ酸であり、特徴 的な蛋白質の構造を劇的に変化させる可能性が低いため、特に有用である。変異 蛋白質のカルボキシ末端の有無について解析するために、機能的Ｃ末端タグに特 異的に結合する蛋白質を、DB（または変異蛋白質がDBと融合している場合にはAD ）との ハイブリッド蛋白質として細胞に導入する。次に、このプラスミドから発現され るハイブリッド蛋白質およびハイブリッドとして存在する変異蛋白質が転写因子 を再構成できるか否かを解析できる。全長蛋白質を保持する細胞を選択するため に、適当な培地上での正の選択を用いることができる。 二段階選抜法における強力な変異を同定するための、同様ではあるが別の方法 としては、GAL4-AD-E2F1-GFP（緑色蛍光蛋白質）を含むトリブリッド蛋白質の構 築が含まれる（チャルフィー(Chalfie)ら、1994、Science 263:802〜805）。こ の方法において、緑色蛍光蛋白質が機能的Ｃ末端タグとして作用し、得られる融 合蛋白質のアレルであるAD-E2F1-GreenについてDB-DP1との相互作用能を解析す ることができる。緑色の蛍光蛋白質を発現し、ハイブリッド蛋白質がその内部で 相互作用するような細胞は、それらの有する、3AT耐性、Foa耐性、β-gal陽性の 表現型により同定できる。加えて、緑色蛍光蛋白質を発現する細胞は、UVライト の下で蛍光を発する。よって、この緑色蛍光蛋白質は、変異アレルの選択に使用 することができる。強度のおよび軽度の変異の選択において、全長を有する相互 作用蛋白質（たとえば、E2F1）の正常レベルでの発現は、細胞抽出物のウェスタ ンブロット解析により確認できる。 新たに単離されたアレルが同様の表現型を示すか否かを決定するために、蛋白 質結合解析を用いることができる。たとえば、各E2Fアレルについて、様々なE2F アレルをコードする配列をPCRで増幅する、インビトロ結合解析で試験できる。 適当な5'プライマーの例としては、ファージのT7ポリメラーゼプロモーター配列 に対応する25塩基を有するもの、および活性化ドメインのなかでも活性化ドメイ ンとE2F1の第159アミノ酸（すなわち、E2F1の最初のアミノ酸）との境の近傍に 対応する20塩基を有するものがある。適当な3'プライマーとしては、E2F1配列の 3'末端に対応するものがある。この配列を増幅したPCR産物は、インビトロ転写 ／翻訳系に用いて対応する蛋白質を生成させることができる。変異蛋白質は、グ ルタチオン-S-トランスフェラーゼに結合した野生型DP1を有するハイブリッド蛋 白質と結合できる。相互作用する蛋白質の組はグルタチオンアガロースビーズで 精製され、ビーズから遊離され、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解 析される。 補償変異（compensatory mutations）の同定：二段階選抜法で同定される変異 についての情報はさらに、２つの蛋白質（本明細書ではE2F1およびDP-1）の相互 作用を復活させる野生型のパートナー（例としてDP-1）の変異を作りだし、同定 することにより得られる。たとえば、この方法では、E2F1結合ドメインをコード するDP-1の配列は、PCRにより増幅し変異を導入することができる。ギャップ修 復法と同様に、PCR産物で次に特異的なAD-E2F1変異プラスミドを含む酵母細胞を 、対応する領域内で線状化したDB-DP-1と共に共形質転換する。形質転換体を次 に3ATを含みヒスチジンを欠く培地でレプリカ培養し、生き残ったコロニーをさ らに解析した。各アレルを大腸菌内で増幅し、塩基配列決定し、酵母に再導入し て、変異体の対が相互作用していることをその表現型で確かめる。この過程を様 々な変異を有する多くのアレルについて行うことにより、蛋白質／蛋白質相互作 用を示す遺伝地図を構築できる。 「二価遺伝学(bivalent genetics)」による補償変異対の比較的大きなセット の単離 ：二段階選抜法および双方向組み合わせライブラリの構築までのスキーム は、本明細書で「二価遺伝学(bivalent genetics)」と呼ぶ遺伝的方法が実行可 能であることを示唆している。この方法を用いれば、相互作用分子をコードする 遺伝子内で起こった補償変異の対を数多く選択することが可能である。接合型の 異なる酵母菌株で行った２回の独立した実験では、相互作用を変化させる変異の ライブラリはまず「二段階選抜法」のやり方に従って作成される。第２段階で、 これら２つの変異アレルのライブラリを集団接合法により互いに反応させ、組み 合わせライブラリ（combinatorial library）の構築で行うのと同様の一連の段 階において補償変異（相互作用が復活される）を選択する。 特に、「二価遺伝学(bivalent genetics)」は、比較的大きな補償変異の対の セットを回収することができる方法を意味し、「二段階選抜法」は、決まった様 式で起こる分子間相互作用を変化させる有益な変異を回収することができる方法 を意味する。 条件アレル(conditional alleles)の単離：また本発明により、相互作用分子 の条件アレルの生産および同定が容易となる。本発明は多数の変異アレル（約1010 ）のスクリーニングに便利な方法を提供するため、本発明を用いれば比較的ま れ な条件アレルの検出が容易に行える。二段階選抜法における条件アレル(Conditi onal Alleles in a Two-Step Selection)（CATS）と名付けられたこの方法では 、２つの相互作用分子のうちの１つに変異を起こすことにより、特定の条件（す なわち、許容的条件）下では相手、つまり野生型のアレルと相互作用するが、他 の条件（すなわち、制限的条件）下では相互作用しない、条件変異アレルを単離 する。多数の条件のうち、実験者が選択したいかなる条件も、許容的条件または 制限的条件として使用できる。温度の違いで許容的条件と制限的条件との違いを 特徴づけることが多いが、本発明では温度変化の利用のみに限定されない。たと えば、薬物の存在または非存在により許容的条件と制限的条件との違いを決定す ることもできる。 CATS法は、選択可能／逆選択可能なレポーター遺伝子を用いた逆選択法の利用 に依存し、この方法はより一般的な、上述の二段階選抜法に類似している。CATS 法に用いた方法の概略を図23Bに示した。この方法では、目的とする相互作用分 子を、転写因子のDBおよびADに別々に融合し、選択可能な／逆選択可能なレポー ター遺伝子（たとえば、URA3遺伝子）を含む酵母菌株に融合する。PCR変異導入 法（上述）を用いて相互作用する相手のひとつを変異させ、そのPCR産物をギャ ップ修復のための情報により細胞に導入した。ADおよびDBを発現するプラスミド 上にある選択可能なマーカーを用いて、ギャップが修復され、野生型の相互作用 分子をコードするプラスミドが維持されているものを選択することができる。 得られた形質転換体は、次に、逆選択可能なレポーター遺伝子を発現する細胞 の増殖を阻害する薬物（たとえば、5-FOA）を含む培地上でレプリカ培養し、形 質転換体を制限的条件下で培養する。様々な形質転換体のうち、目的とする分子 の相互作用に影響する変異アレルを含む細胞のみが、この最初の（負の）選択段 階で選ばれる。 第二の選択段階で、許容的条件下で機能する変異アレルが選択される。最初の 段階で生き残った細胞は、選択可能な／逆選択可能な遺伝子を発現する細胞を正 に選択するような培地に移す（たとえば、レプリカ培養により）。相互作用する 分子の一方の条件アレルを含む細胞が増殖するはずである。 次に変異アレルの回収および特徴付けを、プラスミドDNAの抽出および細菌内 で の増幅、続いて定法によるDNAおよびコードされている蛋白質の特徴付けにより 行う。本発明で同定される条件アレルは、相互作用する２つの分子の能力を変化 させることから、これらの条件アレルは相互作用に必須の残基または塩基を示し ている。すでに述べた通り、分子内の相互作用ドメインの同定は、医薬品の合理 的な設計および生物学的プロセスの詳細な理解のために非常に重要である。 本発明者らはCATSを用いて、cJunの、36℃ではcFosと相互作用するが30℃では 相互作用しない条件アレルの単離を行った（図24）。これらのデータは、36℃で は、cFosおよび変異cJunによりGAL4転写因子が再構成され、URA3を発現させて5- FOA上で増殖する細胞を死に至らしめることを示している。対照的に、条件アレ ルを発現する細胞は制限的な温度で増殖し、相互作用は妨げられて、細胞は5-FO A上で増殖できる。よって、これらのデータから、本発明が、普遍的な技術によ りさらに特徴付けを行える分子の条件アレルを単離および同定するための簡便な 方法を提供することが示された。 その他の態様 RNA分子、DNA分子または蛋白質のいろいろな相互作用を、本発明により測定で きる。たとえば、本発明で解析できる相互作用には、抗体と抗原との、レセプタ ーとリガンドとの、制限酵素とその切断するDNA部位との、およびウイルス蛋白 質と宿主の蛋白質との相互作用も含まれる。たとえば、本発明は、HIVプロウイ ルスで起こる蛋白質／蛋白質相互作用の同定に利用できる。この方法では、HIV 蛋白質はADおよびDBハイブリッド蛋白質の形で別々に発現されるので、HIV蛋白 質が完全な転写因子を再構成する能力について解析する。したがって、本発明に より、全ゲノム上にコードされている全ての蛋白質／蛋白質相互作用の同定に便 利な方法が提供される。HIVの蛋白質／蛋白質相互作用の同定ができれば、蛋白 質／蛋白質相互作用の破壊により、治療面での有効性を付与する化合物の発見が 容易になる。同様の方法で、本発明はHIV蛋白質およびヒトT細胞を活性化する蛋 白質間の相互作用の同定を行うこともできる。 本発明はまた、モノクローナル抗体の単離および特徴付けにも使用できる。こ の方法では、抗原／抗体結合反応を用いて転写因子の再構成を行う。この方法で は、抗原およびDNA結合部分（たとえば、GAL4のDB）がハイブリッド蛋白質とし て 発現される；イムノグロブリン重鎖および遺伝子活性化部分（たとえば、GAL4の AD）がハイブリッド蛋白質として発現される；そして、イムノグロブリン軽鎖が 核局在化配列との融合蛋白質として発現される（図25）。抗原と結合する抗体の 能力を、レポーター遺伝子の発現を検出することにより解析する。免疫系の性質 が組み合わせによるものであることから考えて、組み合わせ的な性質をもち精製 が可能な本発明は、抗体／抗原相互作用の同定に特に適している。 必要に応じて、自己活性化能を有するハイブリッド蛋白質をコードするプラス ミドを、「シャッフリング」逆選択マーカーを含むDBおよびADベクターを用いて 、細胞から除去することができる。これらの遺伝子により、ハイブリッド蛋白質 をコードする遺伝子が組み込まれてDBまたはADプラスミドのいずれかが失われた 細胞を選択することが可能となる。シャッフリングの際には、逆選択可能なレポ ーター遺伝子の発現を、DBまたはADプラスミドを含まないものを選択する条件下 で試験することができるので、この解析で陽性を示すクローンを以降の解析段階 から除外することができる。本発明で使用した蛋白質およびRNA分子の発現に用 いたプラスミドに、選択可能なマーカーを付与することにより、このプラスミド が細胞内で保持されていることを確認することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ボイク ジェフ ディー. アメリカ合衆国 メリーランド州 バルチ モア ウェスト ユニバーシティー パー クウェイ 835 (72)発明者 ハロウ エド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 ボ ストン ユニティー コート 20

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．第一の分析用蛋白質が第二の分析用蛋白質と相互作用できるか否かを判定 するための、以下を含む方法： （ａ）第一の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が （i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第一の逆選択用レポ ーター遺伝子と、 （ii）該DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分に共有結 合した該第一分析用蛋白質を含む第一ハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融 合遺伝子とを含む、接合コンピテント細胞の該第一集団を提供すること、 （ｂ）第二の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の逆選択用レポ ーター遺伝子と、 （ii）遺伝子活性化部分に共有結合した第二分析用蛋白質を含む第二ハイブ リッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子とを含む、接合コンピテント細胞の 該第二集団を提供すること、 （ｃ）該選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現が該細胞の増殖を阻害する ような条件下で、接合コンピテント細胞の該第一集団と該第二集団とを別個に維 持すること、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の該 第一集団と該第二集団とを混合すること、および （ｅ）該第一接合コンピテント細胞、該第二接合コンピテント細胞、または該 接合細胞に含まれている該第一レポーター遺伝子もしくは該第二レポーター遺伝 子、または別のレポーター遺伝子であり、該第一または該第二のDNA結合蛋白質 認識部位のいずれかに機能的に結合されている該レポーター遺伝子の発現を、該 第一分析用蛋白質が該第二分析用蛋白質と相互作用できることを示す指標として 検出すること。 ２．第一分析用蛋白質が、無作為に作成されたペプチド配列を含む、請求項１ 記載の方法。 ３．第二分析用蛋白質が、無作為に作成されたペプチド配列を含む、請求項１ 記載の方法。 ４．第一分析用蛋白質が、意図的に設計された配列を含む、請求項１記載の方 法。 ５．第二分析用蛋白質が、意図的に設計された配列を含む、請求項１記載の方 法。 ６．細胞集団が酵母細胞である、請求項１記載の方法。 ７．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）である、請求 項６記載の方法。 ８．細胞集団の一つがMATa接合型であり、該細胞集団の他方がMATα接合型で ある、請求項７記載の方法。 ９．第一および第二の逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、およびGAL1 からなる群より選択される、請求項１記載の方法。 １０．DNA結合部分が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋 白質のDNA結合ドメインを含む、請求項１記載の方法。 １１．遺伝子活性化部分が、GAL4、VP16、およびAce1からなる群より選択され る蛋白質の転写活性化ドメインを含む、請求項１記載の方法。 １２．第一および第二のDNA結合蛋白質認識部位が、GAL4、LexA、およびAce1 からなる群より選択される蛋白質に対する結合部位を少なくとも１個含む、請求 項１記載の方法。 １３．第一および第二のDNA結合蛋白質認識部位のそれぞれの数が１個から20 個の間である、請求項１記載の方法。 １４．逆選択用遺伝子が、接合コンピテント細胞または接合細胞のゲノム中に 組み込まれている、請求項１記載の方法。 １５．逆選択用レポーター遺伝子が、上流域に抑制配列を有するプロモーター に機能的に結合されている、請求項１記載の方法。 １６．逆選択用レポーター遺伝子が、SPO13プロモーターに機能的に結合され ている、請求項１５記載の方法。 １７．逆選択用レポーター遺伝子の発現が、細胞増殖の阻害として検出される 、請求項１記載の方法。 １８．分析用化合物が、第一の分析用蛋白質と第二の分析用蛋白質との間の結 合を阻害できるか否かを判定するための、以下を含む方法： （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子と、 （ii）該DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分に共有結 合した該第一分析用蛋白質を含む第一ハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融 合遺伝子と、 （iii）該分析用化合物の非存在下において該第一分析用蛋白質に結合する 該第二分析用蛋白質で、遺伝子活性化部分に共有結合した該第二分析用蛋白質を 含む第二ハイブリッド蛋白質を発現させる第二融合遺伝子とを含む細胞を提供す ること、 （ｂ）該逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の増殖が阻害される ような条件下で、該細胞を該分析用化合物と接触させること、および （ｃ）該化合物が、該第一分析用蛋白質と該第二分析用蛋白質との間の該結合 を阻害できることを示す指標として、該逆選択用レポーター遺伝子の発現の阻害 を検出すること。 １９．細胞の増殖を検出することによってレポーター遺伝子の発現が検出され る、請求項１８記載の方法。 ２０．分析用化合物が蛋白質である、請求項１８記載の方法。 ２１．核酸にコードされている該蛋白質が、核酸ライブラリーの中に含まれて いる、請求項２０記載の方法。 ２２．蛋白質が、無作為に作成されたペプチド配列を含む、請求項２０記載の 方法。 ２３．第一分析用蛋白質がcJunであり、該第二分析用蛋白質がcFosおよびcJun からなる群より選択される、請求項１８記載の方法。 ２４．第一分析用蛋白質がE2F1であり、該第二分析用蛋白質がpRBである、請 求項１８の方法。 ２５．細胞が酵母細胞である、請求項１８記載の方法。 ２６．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）である、請 求 項２５記載の方法。 ２７．細胞が、分析用化合物を取り込む能力を高めるよう処理されている、請 求項１８記載の方法。 ２８．細胞が、分析用化合物を取り込む能力を高めるような変異を起こしてい る、請求項１８記載の方法。 ２９．細胞がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）のerg6変異 株である、請求項２８記載の方法。 ３０．細胞がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）のise1変異 株である、請求項２８記載の方法。 ３１．細胞がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）のISE2変異 株である、請求項２８記載の方法。 ３２．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）のsrb1変異 株である、請求項２８記載の方法。 ３３．逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、GAL1、CYH2およびCAN1から なる群より選択される、請求項１８記載の方法。 ３４．逆選択用レポーター遺伝子が、上流域に抑制配列を有するプロモーター に機能的に結合されている、請求項１８記載の方法。 ３５．逆選択用レポーター遺伝子が、SPO13プロモーターに機能的に結合され ている、請求項３４記載の方法。 ３６．DNA結合蛋白質認識部位が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選 択される蛋白質に対する結合部位を少なくとも１個含む、請求項１８記載の方法 。 ３７．DNA結合蛋白質認識部位の数が１個から20個の間である、請求項１８記 載の方法。 ３８．DNA結合部分が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋 白質のDNA結合ドメインを含む、請求項１８記載の方法。 ３９．遺伝子活性化部分が、GAL4、VP16、およびAce1からなる群より選択され る蛋白質の転写活性化ドメインを含む、請求項１８記載の方法。 ４０．第一の分析用蛋白質が、第二の分析用蛋白質と相互作用することができ 、かつ第三の分析蛋白質とは相互作用できないことを判定するための、以下を含 む方法： （ａ）（i）遺伝子活性化部分に共有結合した該第一分析用蛋白質を含む第一 のハイブリッド蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子と、 （ii）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合されたレポーター遺伝 子と、 （iii）該第一DNA結合蛋白質認識部位には特異的に結合できるが、第二のDN A結合蛋白質認識部位には特異的に結合することができない第一のDNA結合部分に 共有結合した該第二分析用蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる 第二の融合遺伝子と、 （iv）該第二DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポータ ー遺伝子と、 （v）該第二DNA結合蛋白質認識部位には特異的に結合できるが、該第一DNA 結合蛋白質認識部位には結合できない第二のDNA結合部分に共有結合した該第三 分析用蛋白質を含む第三のハイブリッド蛋白質を発現させる第三の融合遺伝子と を含む細胞を提供すること、 （ｂ）該レポーター遺伝子の発現によって、該細胞の増殖は阻害されないが、 該逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、該細胞の増殖が阻害されるような 条件下で、該細胞を維持すること、および （ｃ）該第一分析用蛋白質が、該第二分析用蛋白質と相互作用できかつ該第三 分析用蛋白質とは相互作用できないことを示す指標として、該細胞の増殖と該選 択用レポーター遺伝子の発現とを検出すること。 ４１．第一分析用蛋白質が、該第二分析用蛋白質とは相互作用できかつ該第三 分析用蛋白質とは相互作用できないことを、分析用化合物の存在下で測定する、 請求項４０記載の方法。 ４２．第一分析用蛋白質が、無作為に作成されたペプチド配列を含む、請求項 ４０記載の方法。 ４３．細胞が酵母細胞である、請求項４０記載の方法。 ４４．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）である、請 求項４３記載の方法。 ４５．逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、GAL1、CYH2およびCAN1から なる群より選択される、請求項４０記載の方法。 ４６．レポーター遺伝子が、LEU2、TRP1、HIS3、およびLacZからなる群より選 択される、請求項４０記載の方法。 ４７．逆選択用レポーター遺伝子が、上流域に抑制配列を有するプロモーター に機能的に結合されている、請求項４０記載の方法。 ４８．逆選択用レポーター遺伝子が、SPO13プロモーターに機能的に結合され ている、請求項４０記載の方法。 ４９．DNA結合蛋白質認識部位が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選 択される蛋白質に対する結合部位を少なくとも１個含む、請求項４０記載の方法 。 ５０．第一および第二のDNA結合蛋白質認識部位の各々の数が１個から20個の 間である、請求項４０記載の方法。 ５１．DNA結合部分が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋 白質のDNA結合ドメインを含む、請求項４０記載の方法。 ５２．遺伝子活性化部分が、GAL4、VP16、およびAce1からなる群より選択され る蛋白質の転写活性化ドメインを含む、請求項４０記載の方法。 ５３．第一の分析用RNA分子が分析用蛋白質と相互作用することができるか否 かを判定するための、以下を含む方法： （ａ）第一の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合された第一の選択用／逆 選抜用レポーター遺伝子と、 （ii）第一の無作為でないRNA分子に共有結合した該分析用RNA分子を含む第 一のハイブリッドRNA分子を発現させる第一の融合遺伝子と、 （iii）該DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分で、無 作為でない該RNA分子に特異的に結合できるRNA結合部分に共有結合したDNA結合 部分を含む該第一ハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子とを含む、 接合コンピテント細胞の第一の集団を提供すること、 （ｂ）第二の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の選択用／逆選 択用レポーター遺伝子と、 （ii）遺伝子活性化部分に共有結合した該分析用蛋白質を発現させる第三融 合遺伝子とを含む、接合コンピテント細胞の第二の集団を提供すること、 （ｃ）該選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現が、該集団の細胞の増殖を 阻害するような条件下で、接合コンピテント細胞の該第一集団と該第二集団とを 別個に維持すること、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の該 第一集団と該第二集団とを混合すること、および （ｅ）該分析用RNA分子が、該分析用蛋白質と相互作用できる能力を測定する 指標として、該選択用／逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出すること。 ５４．分析用RNA分子が、無作為に作製されたRNA配列を含む、請求項５３記載 の方法。 ５５．分析用蛋白質が、無作為に作成されたペプチド配列を含む、請求項５３ 記載の方法。 ５６．能力が、分析用化合物の存在下で測定される、請求項５３記載の方法。 ５７．細胞集団の細胞が酵母細胞である、請求項５３記載の方法。 ５８．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ(S．cerevisiae)である、請求 項５７記載の方法。 ５９．細胞集団の一つがMATa接合型であり、細胞集団の他方がMATα接合型で ある、請求項５８記載の方法。 ６０．第一および第二の逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、およびGA L1からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。 ６１．DNA結合部分が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋 白質のDNA結合ドメインを含む、請求項５３記載の方法。 ６２．遺伝子活性化部分が、GAL4およびAce1からなる群より選択される蛋白質 の転写活性化ドメインを含む、請求項５３記載の方法。 ６３．第一および第二のDNA結合蛋白質認識部位が、GAL4、LexA、およびAce1 からなる群より選択される蛋白質に対する結合部位を少なくとも１個含む、請求 項５３記載の方法。 ６４．DNA結合蛋白質認識部位の各々の数が１個から20個の間である、請求項 ５３記載の方法。 ６５．逆選択用レポーター遺伝子が、上流域に抑制配列を有するプロモーター に機能的に結合されている、請求項５３記載の方法。 ６６．逆選択用レポーター遺伝子が、SPO13プロモーターに機能的に結合され ている、請求項６５記載の方法。 ６７．逆選択用レポーター遺伝子の発現が、細胞増殖の阻害として検出される 、請求項５３記載の方法。 ６８．第一の分析用RNA分子が第二の分析用RNA分子と相互作用できるか否かを 判定するための、以下を含む方法： （ａ）第一の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）第一のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合された第一の選択用／逆 選抜用レポーター遺伝子と、 （ii）第一の無作為でないRNA分子に共有結合した該第一分析用RNA分子を含 む、第一のハイブリッドRNA分子を発現させる第一の融合遺伝子と、 （iii）該DNA結合蛋白質認識部位に特異的に結合できるDNA結合部分で、該 第一の無作為でないRNA分子に特異的に結合できる第一のRNA結合部分に共有結合 したDNA結合部分を含む第一ハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子 とを含む、接合コンピテント細胞の第一集団を提供すること、 （ｂ）第二の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）第二のDNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の選択用／逆選 択用レポーター遺伝子と、 （ii）第二の無作為でないRNA分子に共有結合した該第二分析用RNA分子を含 む第二のハイブリッドRNA分子を発現させる第三の融合遺伝子と、 （iii）該第二の無作為でないRNA分子に特異的に結合することができる第二 のRNA結合部分に共有結合した遺伝子活性化部分を発現させる第四の融合遺伝子 とを含む、接合コンピテント細胞の第二集団を提供すること、 （ｃ）該逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、細胞の増殖が阻害される ような条件下で、接合コンピテント細胞の該第一集団と該第二集団とを別個に維 持すること、 （ｄ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の該 第一集団と該第二集団とを混合すること、および （ｅ）該第一分析用RNA分子が、該第二分析用RNA分子と相互作用できることを 測定する指標として、該逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出すること。 ６９．第一分析用RNA分子が、無作為に作製されたRNA配列を含む、請求項６８ 記載の方法。 ７０．第二分析用RNA分子が、無作為に作製されたRNA配列を含む、請求項６８ 記載の方法。 ７１．第一および第二のRNA分子が相互作用できることが、分析用化合物の存 在下で測定される、請求項６８記載の方法。 ７２．細胞集団の細胞が酵母細胞である、請求項６８記載の方法。 ７３．酵母がサッカロマイセス・セレビシアエ（S．cerevisiae）である、請 求項７２記載の方法。 ７４．細胞集団の一つがMATa接合型であり、細胞集団の他方がMATα接合型で ある、請求項７３記載の方法。 ７５．第一および第二の逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、およびGA L1からなる群より選択される、請求項６８記載の方法。 ７６．DNA結合部分が、GAL4、LexA、およびAce1からなる群より選択される蛋 白質のDNA結合ドメインを含む、請求項６８記載の方法。 ７７．遺伝子活性化部分が、GAL4、VP16、およびAce1からなる群より選択され る蛋白質の転写活性化ドメインを含む、請求項６８記載の方法。 ７８．第一および第二のDNA結合蛋白質認識部位が、GAL4、LexA、およびAce1 からなる群より選択される蛋白質に対する結合部位を少なくとも１個含む、請求 項６８記載の方法。 ７９．DNA結合蛋白質認識部位の数が１個から20個の間である、請求項６８記 載の方法。 ８０．逆選択用レポーター遺伝子が、上流域に抑制配列を有するプロモーター に機能的に結合されている、請求項６８記載の方法。 ８１．逆選択用レポーター遺伝子が、SPO13プロモーターに機能的に結合され ている、請求項８０記載の方法。 ８２．逆選択用レポーター遺伝子の発現が、細胞増殖の阻害として検出される 、請求項６８記載の方法。 ８３．分析用DNA分子が、分析用蛋白質と相互作用できるか否かを判定するた めの、以下を含む方法： （ａ）（i）該分析用DNA分子に機能的に結合した逆選択用レポーター遺伝子と 、 （ii）遺伝子活性化部分に共有結合した該分析用蛋白質を発現させる融合遺 伝子とを含む細胞を提供すること、および （ｂ）該分析用DNA分子が該分析用蛋白質と相互作用できることを示す指標と して、該逆選択用レポーター遺伝子の発現を検出すること。 ８４．（i）分析用DNAの配列が、無作為に作製されたものであり、（ii）蛋白 質が、無作為に作製されたペプチド配列を含む、請求項８３記載の方法。 ８５．参照用蛋白質が分析用蛋白質と相互作用する能力に影響するような、参 照用蛋白質における突然変異を同定するための、以下を含む方法： （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子と、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用レポーター遺伝子 と、 （iii）該分析用蛋白質を含む第一のハイブリッド蛋白質を発現させる第一 の融合遺伝子と、 （iv）該参照用蛋白質をコードする遺伝子の変異アレルの核酸ライブラリー 中にコードされている候補変異参照蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発 現する第二の融合遺伝子とを含み、 該第一および該第二のハイブリッド蛋白質の一方が、DNA結合蛋白質認識部位 に特異的に結合できるDNA結合部分をさらに含み、該第一および該第二のハイブ リッド蛋白質の他方が、遺伝子活性化部分をさらに含む細胞を提供すること、 （ｂ）該参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じか、それよりも高いレベル で該逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、該細胞の増殖を阻害するが、該 参照用蛋白質で得られる発現レベルよりも低いレベルで該逆選択用レポーター遺 伝子を発現させると、該細胞の増殖が阻害されないような条件下で、細胞を維持 すること、ならびに （ｃ）別の段階において、該逆選択用レポーター遺伝子の発現によって、該細 胞の増殖が阻害されないような条件下で該細胞を維持し、かつ該第一分析用蛋白 質が、候補となる変異参照用蛋白質と相互作用できる能力を示す指標として、該 選択用レポーター遺伝子の発現を検出すること。 ８６．参照用蛋白質が第一分析用蛋白質と相互作用できる能力に影響を与える ような、参照用蛋白質における突然変異を示すものとして、該変異候補蛋白質の 配列を、該参照用蛋白質の配列と比較することをさらに含む、請求項８５記載の 方法。 ８７．第二融合遺伝子が機能的C末端タグをコードし、該選択用レポーター遺 伝子の発現が該機能的C末端タグの存在を示すものとして測定される、請求項８ ５記載の方法。 ８８．機能的C末端タグが、pRBに対する結合部位を含む、請求項８７記載の方 法。 ８９．第一の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互作用する能力が低下する が、第二の一連の条件下では、第二の蛋白質と相互作用することができるような 、参照用蛋白質の条件的突然変異を同定するための、以下を含む方法： （ａ）（i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した逆選択用レポーター遺 伝子と、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した選択用レポーター遺伝子 と、 （iii）参照用蛋白質をコードする遺伝子の変異アレルの核酸ライブラリー 中にコードされている、候補となる変異参照用蛋白質を含む第一のハイブリッド 蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子と、 （iv）該第二蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融 合遺伝子とを含み、 該第一または該第二のハイブリッド蛋白質の一方が、該DNA結合蛋白質認識部 位に特異的に結合できるDNA結合部分を含み、かつ 該第一または該第二のハイブリッド蛋白質の他方が、遺伝子活性化部分を含む 細胞を提供すること、 （ｂ）該参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じかそれよりも高いレベルで 該逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、該細胞の増殖を阻害するが、該参 照用蛋白質で得られる発現レベルよりも低いレベルで該逆選択用レポーター遺伝 子を発現させると、該細胞の増殖が阻害されないような条件下で、該細胞を維持 すること、 （ｃ）別の段階において、該逆選択用レポーター遺伝子の発現によって該細胞 の増殖が阻害されないような条件下で該細胞を維持し、かつ該候補変異蛋白質が 該第二蛋白質と相互作用できることを示す指標として、該選択用レポーター遺伝 子の発現を検出すること、ならびに （ｄ）段階（ｃ）の条件下での該選択用レポーター遺伝子の発現と、段階（ｄ ）の条件下での該選択用レポーター遺伝子の非発現とにより、条件的変異体であ ることが示されるような、別の段階において、一つのパラメータ以外は段階（ｃ ）と同じ条件で該細胞を維持し、該候補変異蛋白質が該第二蛋白質と相互作用す ることができることを示す指標として、該選択用レポーター遺伝子の発現を検出 すること。 ９０．第一の一連の条件下では該第二蛋白質と相互作用する能力が低下するが 、第二の一連の条件下では該第二蛋白質と相互作用できるような該参照用蛋白質 の変異体を同定するための手段として、該候補変異蛋白質の配列を該参照用蛋白 質の配列と比較することをさらに含む、請求項８９記載の方法。 ９１．パラメータが、（i）温度、および（ii）薬物の存在からなる群より選 択される、請求項８９記載の方法。 ９２．第一および第二の変異参照用蛋白質が、互いに相互作用できるが、それ ぞれ第二および第一の参照蛋白質とは相互作用できないような、第一および第二 の参照用蛋白質における補償変異(compensatory mutation)を同定するための、 以下を含む方法： （ａ）第一の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第一の逆選択用レポーター 遺伝子と、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第一の選択用レポーター 遺伝子と、 （iii）遺伝子活性化部分に共有結合し、該第一参照用蛋白質の変異アレル の核酸ライブラリー中にコードされている該第一変異候補蛋白質を含む第一のハ イブリッド蛋白質を発現させる第一の融合遺伝子と、 （iv）第一の逆選択用マーカー、およびDNA結合部分に共有結合した該第二 参照用蛋白質を含む第二のハイブリッド蛋白質を発現させる第二の融合遺伝子を 含むプラスミドとを含む、接合コンピテント細胞の第一集団を提供すること、 （ｂ）第二の接合コンピテント細胞集団の細胞の大多数が、 （i）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の逆選択用レポーター 遺伝子と、 （ii）DNA結合蛋白質認識部位に機能的に結合した第二の選択用レポーター 遺伝子と、 （iii）DNA結合部分に共有結合し、該第二参照用蛋白質の変異アレルの核酸 ライブラリー中にコードされている該第二変異参照用候補蛋白質を含む第三のハ イブリッド蛋白質を発現させる第三の融合遺伝子と、 （iv）第二の逆選択用マーカー、および遺伝子活性化部分に共有結合した該 第一参照用蛋白質を含む第四のハイブリッド蛋白質を発現させる第四の融合遺伝 子を含むプラスミドとを含む、接合コンピテント細胞の第二集団を提供すること 、 （ｃ）該第一および該第二の参照用蛋白質で得られる発現レベルと同じかそれ よりも高いレベルで該逆選択用レポーター遺伝子を発現させると、該細胞の増殖 が阻害されるような条件下で、別個に、該第一および該第二の接合コンピテント 細胞集団を維持すること、 （ｄ）該逆選択用マーカーの発現によって、該細胞の増殖が阻害されるような 条件下で、該第一および該第二の接合コンピテント細胞集団を維持すること、 （ｅ）接合細胞の形成を促進するような条件下で、接合コンピテント細胞の該 第一集団と該第二集団とを維持すること、 （ｆ）該第一および該第二の候補変異蛋白質は互いに相互作用できるが、該第 一および該第二の参照用蛋白質とは相互作用できないことを示す指標として、該 選択用レポーター遺伝子の発現を検出すること。 ９３．第一および該第二の参照用蛋白質における補償変異(compensatory muta tion)を同定するための手段として、互いに相互作用する該第一および該第二の 候補変異蛋白質の配列を、該第一および該第二の参照用蛋白質の配列と比較する ことをさらに含む、請求項９２記載の方法。 ９４．（i）上流域の抑制配列と（ii）DNA結合蛋白質認識部位とを含むプロモ ーターに機能的に結合している逆選択用レポーター遺伝子を、ゲノム中に組み込 んだ酵母細胞において、 （i）該逆選択用レポーター遺伝子によってコードされている蛋白質と実質的 に同一な、天然の蛋白質、および （ii）それが発現するとその蛋白質を有する細胞に増殖上の利点が付与される ような、少なくとも１個の天然の蛋白質を、含まない酵母細胞。 ９５．逆選択用レポーター遺伝子が、URA3、LYS2、GAL1、CYH2およびCAN1から なる群より選択される、請求項９４記載の酵母細胞。 ９６．プロモーターがSPO13プロモーターで、該プロモーターが、GAL4、LexA 、およびAce1からなる群より選択される蛋白質に対するDNA結合蛋白質認識部位 を少なくとも１個含む、請求項９４記載の酵母細胞。 ９７．MaV103である、請求項９６記載の酵母細胞。 ９８．MaV203である、請求項９６記載の酵母細胞。 ９９．MaV99である、請求項９６記載の酵母細胞。 １００．（i）酵母の複製開始点、（ii）選択マーカー、（iii）酵母のプロモ ーター、（iv）核局在をコードするシグナル配列、および（v）細菌の複製開始 点を含む遺伝子構築物。 １０１．p2.5である、請求項100記載の遺伝子構築物。 １０２．（i）酵母の複製開始点、（ii）選択マーカー、（iii）プロモーター 、（iv）細菌の複製開始点、（v）逆選択マーカー、および（vi）DNA結合部分を 発現させる配列を含む遺伝子構築物。 １０３．p97.CYH2である、請求項102記載の遺伝子構築物。 １０４．（i）酵母の複製開始点、（ii）選択マーカー、（iii）プロモーター 、（iv）細菌の複製開始点、（v）逆選択マーカー、および（vi）遺伝子活性化 部分を発現させる配列を含む遺伝子構築物。 １０５．pMV257である、請求項104記載の遺伝子構築物。 １０６．（i）上流域の抑制配列および（ii）DNA結合蛋白質認識部位を含むプ ロモーターに機能的に結合された逆選択用レポーター遺伝子を含む遺伝子構築物 。 １０７．SPAL:URA3である、請求項106記載の遺伝子構築物。
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CA (1) CA2217545A1 (ja)
DE (1) DE69636866D1 (ja)
NZ (2) NZ502795A (ja)
WO (1) WO1996032503A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007075107A (ja) * 1995-04-11 2007-03-29 General Hospital Corp 逆ツーハイブリッドシステム
US10188691B2 (en) 2016-05-27 2019-01-29 Synthex, Inc. Protein interfaces
US11780881B2 (en) 2017-11-22 2023-10-10 Synthex, Inc. Compounds for selective disruption of protein-protein interactions

Families Citing this family (107)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830751A (en) * 1996-05-01 1998-11-03 The Johns Hopkins University Genetic assays and strains using human TP53
US6083693A (en) 1996-06-14 2000-07-04 Curagen Corporation Identification and comparison of protein-protein interactions that occur in populations
US6897017B1 (en) * 1997-01-31 2005-05-24 Odyssey Thera Inc. Vivo library-versus-library selection of optimized protein-protein interactions
CA2205888A1 (en) 1997-07-11 1999-01-11 John J. Priatel Complementation trap
US5885779A (en) * 1997-09-09 1999-03-23 University Of British Columbia Repressed trans-activator system for characterization of protein-protein interactions
AU748358B2 (en) 1997-11-10 2002-06-06 General Hospital Corporation, The Detection systems for registering protein interactions and functional relationships
US6905818B1 (en) 1997-11-27 2005-06-14 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderungder Wissenschaften Method for the identification and characterization of interacting molecules by automated interaction mating
WO1999028744A1 (en) * 1997-11-27 1999-06-10 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Identification and characterization of interacting molecules
EP1053347B1 (en) * 1998-01-09 2007-02-28 Phylogica Limited Peptide detection method
US6309817B1 (en) * 1998-09-30 2001-10-30 Boston Medical Center Corporation Identification of virulence determinants activators in prokaryotic pathogens
US6063578A (en) * 1998-10-22 2000-05-16 Signal Pharmaceuticals, Inc. Dual reporter system and methods of use therefor
US6203986B1 (en) 1998-10-22 2001-03-20 Robert H. Singer Visualization of RNA in living cells
EP1792989A1 (en) 1999-04-12 2007-06-06 Agensys, Inc. 13 Transmembrane protein expressed in prostate cancer
IL145775A0 (en) 1999-04-12 2002-07-25 Agensys Inc 13 transmembrane protein expressed in prostate cancer
WO2000066722A1 (en) * 1999-04-30 2000-11-09 Hybrigenics S.A. Collection of prokaryotic dna for two hybrid systems helicobacter pylori protein-protein interactions and application thereof
DE60041333D1 (de) 1999-08-12 2009-02-26 Agensys Inc Hen prostatkrebs exprimiert wird, und deren verwendungen
ES2371212T3 (es) 1999-10-05 2011-12-28 Agensys, Inc. Receptor acoplado a proteína g regulado positivamente en el cáncer de próstata y usos del mismo.
US6790607B1 (en) 1999-10-07 2004-09-14 Hybrigen, Inc. Adjustable sensitivity, genetic molecular interaction systems, including protein-protein interaction systems for detection and analysis
US6893818B1 (en) 1999-10-28 2005-05-17 Agensys, Inc. Gene upregulated in cancers of the prostate
DE19957065B4 (de) * 1999-11-26 2005-01-05 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Screening-Verfahren für Arzneistoffe
AU2001245584B2 (en) * 2000-03-08 2007-02-08 Phylogica Limited Improved reverse n-hybrid screening method
DE60120942T2 (de) * 2000-03-08 2007-02-01 Phylogica Ltd., Northbridge Verbessertes verfahren für reverses n-hybrid-screening
US20030211495A1 (en) * 2000-03-08 2003-11-13 Richard Hopkins Reverse n-hybrid screening method
WO2001088197A2 (en) * 2000-05-16 2001-11-22 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
US7029847B2 (en) 2000-05-16 2006-04-18 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for interaction trap assays
US6902882B2 (en) 2000-05-23 2005-06-07 Kerong Gu Methods of monitoring production of gene products and uses thereof
US6406863B1 (en) * 2000-06-23 2002-06-18 Genetastix Corporation High throughput generation and screening of fully human antibody repertoire in yeast
DE60138465D1 (de) 2000-07-12 2009-06-04 Agensys Inc Neues tumor antigen das für diagnose und therapie von blasen-, eierstock-, lungen- und nierenkrebs verwendet werden kann
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
CA2420990C (en) 2000-08-28 2010-08-17 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 85p1b3 useful in treatment and detection of cancer
US6787321B1 (en) 2000-10-13 2004-09-07 The Regents Of The University Of California Mammalian two-hybrid system for screening for modulators of the accumulation of metabolic products
WO2002040632A2 (en) * 2000-11-17 2002-05-23 Wise John G Creation and identification of proteins having new dna binding specificities
EP1975620A3 (en) 2001-03-02 2008-12-24 GPC Biotech AG Three hybrid assay system
CA2439532A1 (en) * 2001-03-02 2002-09-26 Mds Proteomics Inc. Methods and reagents for regulating apoptosis
US6924358B2 (en) 2001-03-05 2005-08-02 Agensys, Inc. 121P1F1: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
US7271240B2 (en) 2001-03-14 2007-09-18 Agensys, Inc. 125P5C8: a tissue specific protein highly expressed in various cancers
US20030191073A1 (en) 2001-11-07 2003-10-09 Challita-Eid Pia M. Nucleic acid and corresponding protein entitled 161P2F10B useful in treatment and detection of cancer
WO2002083921A2 (en) 2001-04-10 2002-10-24 Agensys, Inc. Nuleic acids and corresponding proteins useful in the detection and treatment of various cancers
US6841352B2 (en) 2001-06-29 2005-01-11 Myriad Genetics, Inc. Mating-based method for detecting protein—protein interaction
EP1485707B1 (en) 2001-07-16 2009-01-14 caprotec bioanalytics GmbH Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
US6833441B2 (en) * 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
AU2002332598A1 (en) * 2001-08-22 2003-03-10 Shengfeng Li Compositions and methods for generating antigen-binding units
ES2532757T3 (es) 2001-09-06 2015-03-31 Agensys, Inc. Ácido nucleico y proteína correspondiente denominados STEAP-1 útiles en el tratamiento y la detección de cáncer
US7175983B2 (en) * 2001-11-02 2007-02-13 Abmaxis, Inc. Adapter-directed display systems
AU2002352602A1 (en) * 2001-11-07 2003-05-19 Curagen Corporation General screening method for ligand-protein interactions
US20040161753A1 (en) * 2001-11-16 2004-08-19 Wise John G. Creation and identification of proteins having new dna binding specificities
DE60325847D1 (de) * 2002-03-11 2009-03-05 Caprotec Bioanalytics Gmbh Verbindungen und verfahren für die analyse des proteoms
US20040067532A1 (en) * 2002-08-12 2004-04-08 Genetastix Corporation High throughput generation and affinity maturation of humanized antibody
WO2004016733A2 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
DE602004030212D1 (de) * 2003-01-16 2011-01-05 Caprotec Bioanalytics Gmbh Verfahren zur identifizierung von auf arzneimittel nicht-zielgerichteten proteinen
JP2007524361A (ja) 2003-02-10 2007-08-30 アジェンシス， インコーポレイテッド 膀胱癌及びその他の癌の治療及び検出に有用な名称１５８ｐ１ｄ７の核酸及び対応タンパク質
JP2006525817A (ja) * 2003-05-09 2006-11-16 ヘルス　リサーチ　インコーポレイテッド タンパク質の相互作用の決定のための改良法
ATE541052T1 (de) 2003-05-30 2012-01-15 Agensys Inc Varianten des prostata-stammzellen-antigens (psca) und teilsequenzen davon
US20060286600A1 (en) * 2003-06-30 2006-12-21 Albertha Walhout High throughput one-hybrid system
WO2005054438A2 (en) 2003-12-01 2005-06-16 Invitrogen Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
JP2007526337A (ja) 2004-03-02 2007-09-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド Ａｌｋ７およびミオスタチン阻害剤ならびにその使用
CA2567449C (en) 2004-05-28 2014-03-11 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to psca proteins
US8034553B2 (en) 2004-06-24 2011-10-11 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Biomarkers for wound healing
EP1771470B1 (en) 2004-07-23 2013-06-26 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
FR2877010B1 (fr) * 2004-10-25 2007-03-16 Aventis Pharma Sa Systeme double-hybride base sur la mise sous silence de genes par interference transcriptionnelle
CA2603093A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Agensys, Inc. Antibodies and related molecules that bind to 161p2f10b proteins
KR20190006086A (ko) 2005-11-23 2019-01-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒⅱａ 길항제 및 골 성장을 촉진하기 위한 이들의 용도
CN105582521A (zh) 2006-12-18 2016-05-18 阿塞勒隆制药公司 活化素-actrii拮抗剂及在提高红细胞水平中的用途
EP2111229B1 (en) 2007-02-01 2013-04-10 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists for use in preventing or treating breast cancer metastasis or breast cancer related bone loss
TWI548647B (zh) 2007-02-02 2016-09-11 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2120999B1 (en) 2007-02-09 2012-08-29 Acceleron Pharma, Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists and use thereof in preventing or treating multiple myeloma
US7932030B2 (en) * 2007-04-05 2011-04-26 The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College System for pulling out regulatory elements using yeast
US8877688B2 (en) 2007-09-14 2014-11-04 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CA2964398C (en) 2007-09-14 2023-03-07 Adimab, Llc Rationally designed, synthetic antibody libraries and uses therefor
CN103877564A (zh) 2007-09-18 2014-06-25 阿塞勒隆制药公司 活化素-actriia拮抗剂和减少或抑制fsh分泌的用途
JP5773868B2 (ja) 2008-06-26 2015-09-02 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａのアンタゴニストおよび赤血球レベルを高めるためのその使用
LT3750552T (lt) 2008-08-14 2023-06-26 Acceleron Pharma Inc. Gdf gaudyklės
US20100075326A1 (en) * 2008-09-12 2010-03-25 Cornell University Yeast surface two-hybrid system for quantitative detection of protein-protein interactions
EP3702001A1 (en) 2009-03-30 2020-09-02 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
BRPI1010587A2 (pt) 2009-06-08 2019-04-09 Acceleron Pharma Inc. métodos para aumentar adipócitos termogênicos
RU2642302C1 (ru) 2009-08-13 2018-01-24 Акселерон Фарма Инк. Комбинированное применение ловушек gdf и активаторов рецепторов эритропоэтина для повышения содержания эритроцитов
US20110070233A1 (en) 2009-09-09 2011-03-24 Acceleron Pharma Inc. Actriib antagonists and dosing and uses thereof
CA2779472C (en) 2009-11-03 2021-03-16 Acceleron Pharma Inc. The use of a composition comprising an activin type iib receptor polypeptide in the treatment of fatty liver disease
US8710016B2 (en) 2009-11-17 2014-04-29 Acceleron Pharma, Inc. ActRIIB proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
WO2011119956A1 (en) 2010-03-26 2011-09-29 Integratech Proteomics, Llc Controlled release hybrid systems
DK3336225T3 (da) 2010-07-16 2020-03-30 Adimab Llc Antistofbiblioteker
WO2013036829A1 (en) 2011-09-09 2013-03-14 Genentech, Inc Treatment of th17 mediated inflammatory diseases
BR122019023166B1 (pt) 2011-10-17 2021-02-23 Acceleron Pharma, Inc Uso de um polipeptídeo para a fabricação de um medicamento paratratar anemia associada à mielofibrose
US8903454B2 (en) * 2011-11-07 2014-12-02 Alcatel Lucent Base station and radio unit for creating overlaid sectors with carrier aggregation
MX366336B (es) 2012-11-02 2019-07-05 Celgene Corp Antagonistas de activina - actrii y usos para el tratar trastornos oseos y otros.
EP3705498A1 (en) 2013-08-22 2020-09-09 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta receptor type ii variants and uses thereof
BR112016024319B1 (pt) 2014-04-18 2024-01-23 Acceleron Pharma Inc USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM ANTAGONISTA DE ActRII PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAR OU PREVINIR UMA COMPLICAÇÃO DE ANEMIA FALCIFORME
BR122023023170A2 (pt) 2014-06-13 2024-02-20 Acceleron Pharma Inc. Uso de um antagonista de actrii no tratamento ou prevenção de úlcera cutânea associada com beta-talassemia
MA41052A (fr) 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
AU2015358469B2 (en) 2014-12-03 2021-05-27 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for treating anemia
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
KR20170141215A (ko) 2015-04-06 2017-12-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 싱글-암 유형 i과 유형 ii 수용체 융합 단백질들 및 이들의 용도
MA53400A (fr) 2015-04-06 2021-08-04 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk7: actriib et leurs utilisations
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
US11013781B2 (en) 2015-07-01 2021-05-25 Alk-Abelló As Peptide combinations and uses thereof for treating grass allergy
US9884900B2 (en) 2015-08-04 2018-02-06 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating Janus kinase-associated disorders by administering soluble transforming growth factor beta type II receptor
CA3005975A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
ES2646388B1 (es) * 2016-05-11 2018-10-15 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Método de doble híbrido en reverso para la identificación de mutaciones missense
PL3496739T3 (pl) 2016-07-15 2021-10-11 Acceleron Pharma Inc. Kompozycje zawierające polipeptydy actriia do stosowania w leczeniu nadciśnienia płucnego
MX2019001043A (es) 2016-07-27 2019-09-26 Acceleron Pharma Inc Metodos y composiciones para el tratamiento de la mielofibrosis.
CN109996817A (zh) 2016-09-15 2019-07-09 艾科赛扬制药股份有限公司 扭转原肠胚形成多肽及其用途
EP3522934A4 (en) 2016-10-05 2020-04-15 Acceleron Pharma Inc. COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF RENOPATHY
AU2017338916B2 (en) 2016-10-05 2022-03-24 Acceleron Pharma Inc. Variant ActRIIB proteins and uses thereof
DK3628049T3 (da) 2017-05-04 2023-08-14 Acceleron Pharma Inc Tgf-beta-receptortype-ii-fusionsproteiner og anvendelser deraf
WO2019099678A1 (en) * 2017-11-16 2019-05-23 Synthex, Inc. Selective modulation of protein-protein interactions
JP6920978B2 (ja) * 2017-12-18 2021-08-18 浜松ホトニクス株式会社 画像取得装置及び画像取得方法
EP3969592A4 (en) 2019-05-15 2023-01-04 Synthex, Inc. SELECTIVE PROTEIN DEGRADATION

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5283173A (en) * 1990-01-24 1994-02-01 The Research Foundation Of State University Of New York System to detect protein-protein interactions
AU650677B2 (en) * 1990-09-24 1994-06-30 General Hospital Corporation, The Screening assays
AT395385B (de) 1990-12-13 1992-12-10 Voest Alpine Krems Tauchrohr fuer vorrichtungen zum auftrennen von stoffgemengen
US5192238A (en) * 1992-07-14 1993-03-09 Brown John B Self-activated man overboard recovery system
EP0672131B1 (en) * 1992-10-30 2003-12-17 The General Hospital Corporation A novel cell cycle control protein
US5512473A (en) * 1993-01-29 1996-04-30 Brent; Roger Max-interacting proteins and related molecules and methods
US5525490A (en) * 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US6770446B1 (en) 1994-06-14 2004-08-03 Wyeth Cell systems having specific interaction of peptide binding pairs
US5989808A (en) 1994-06-14 1999-11-23 American Cyanamid Company Identification of compounds affecting specific interaction of peptide binding pairs
US5695941A (en) * 1994-06-22 1997-12-09 The General Hospital Corporation Interaction trap systems for analysis of protein networks
DE69532127T2 (de) * 1994-07-20 2004-08-26 Genetics Institute, Inc., Cambridge Interaktions-fullensysteme zum nachweis von protein-interaktionen
JPH11506301A (ja) * 1994-07-22 1999-06-08 ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト ２ハイブリッド系
US5610015A (en) * 1995-03-23 1997-03-11 Wisconsin Alumni Research Foundation System to detect protein-RNA interactions
JPH11502717A (ja) 1995-04-11 1999-03-09 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション 逆ツーハイブリッドシステム
US5989909A (en) * 1997-09-26 1999-11-23 Millennium Biotherapeutics, Inc. Huchordin and uses thereof

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007075107A (ja) * 1995-04-11 2007-03-29 General Hospital Corp 逆ツーハイブリッドシステム
US10188691B2 (en) 2016-05-27 2019-01-29 Synthex, Inc. Protein interfaces
JP2022119883A (ja) * 2016-05-27 2022-08-17 シンセックス， インコーポレイテッド タンパク質界面
US11780881B2 (en) 2017-11-22 2023-10-10 Synthex, Inc. Compounds for selective disruption of protein-protein interactions

Also Published As

Publication number Publication date
JP2007075107A (ja) 2007-03-29
ATE352638T1 (de) 2007-02-15
CA2217545A1 (en) 1996-10-17
AU716893B2 (en) 2000-03-09
AU5541296A (en) 1996-10-30
US5965368A (en) 1999-10-12
US20030068612A1 (en) 2003-04-10
EP0830459B1 (en) 2007-01-24
DE69636866D1 (en) 2007-03-15
US20020197627A1 (en) 2002-12-26
WO1996032503A1 (en) 1996-10-17
NZ502795A (en) 2001-09-28
NZ306767A (en) 2000-03-27
US7033768B2 (en) 2006-04-25
US5955280A (en) 1999-09-21
US20030124538A1 (en) 2003-07-03
US20050053913A1 (en) 2005-03-10
US20060223089A1 (en) 2006-10-05
EP0830459A4 (en) 2002-02-27
US7601533B2 (en) 2009-10-13
EP0830459A1 (en) 1998-03-25

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Publication Publication Date Title
JPH11502717A (ja) 逆ツーハイブリッドシステム
Umezu et al. Genetic analysis of yeast RPA1 reveals its multiple functions in DNA metabolism
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