JPH11500918A - 細菌系内で修飾組換えタンパク質を発現させるための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、そのタンパク質を修飾するための特異的酵素をコード化するヌクレオチド配列の両方をタンデムに含む単一ベクターを使用して、修飾組換えタンパク質を宿主細胞内で生産するための方法を提供する。更に、本発明は、特に、ヒトタンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、そのタンパク質のリン酸化のための特異的なヒトキナーゼをコード化するヌクレオチド配列をタンデムに含む単一ベクターを使用して、細菌系内で組換えリン酸化ヒトタンパク質を生産する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌系内で修飾組換えタンパク質を発現させるための方法 技術分野 本発明は、細菌系内で修飾組換えタンパク質を生産するための新規の方法に係 わる。この方法は、外来性タンパク質と、そのタンパク質をインビボで修飾する ことが可能な酵素をコード化するヌクレオチド配列を有する単一ベクターを調製 することと、宿主細胞中でこのベクターを発現させて修飾タンパク質を生産する ことを含む。本発明の１つの側面は、プロモーターと、その後に続くタンパク質 コード化配列と、更にその後に続く酵素コード化配列とを含む、単一ベクターに 係わる。発明の背景 人乳が人間の乳幼児のための最良の栄養源であることが一般に認められている 。人乳は、発達中の乳幼児にとって理想的な栄養物であるばかりでなく、様々な 生物による感染から乳幼児を保護する免疫グロブリンと非免疫因子の両方も含む 。更に、人乳は乳幼児によって容易に消化され、牛乳を主成分とする乳幼児用調 合乳よりもアレルギー反応を引き起こす可能性が低い。 人乳は、牛乳及び他の哺乳動物種の乳とは様々な点で異なっ ている。総タンパク質含量とタンパク質の種類は、人乳と牛乳との間で異なって いる。４つの主要なウシカゼインが既に同定されている。牛乳は、２つのαカゼ イン、βカゼイン、及び、κカゼインを含むが、人乳はβカゼインとκカゼイン しか含まない。更に、人乳タンパク質のアミノ酸配列は、他の哺乳動物の乳タン パク質とは異なっている。 人乳の有利な特性の幾つかを有し、且つ、乳幼児によるアレルギー反応と不完 全消化のような、牛乳を主成分とする乳幼児用調合乳に関連した欠点を克服する 乳幼児用調合乳を開発する努力がこれまで行われてきた。これを実現するための 直感的に望ましい方法は、人乳タンパク質をその自然形態で含む既知の人乳構成 要素の幾つかを調合乳に添加することである。ウシ及び他の哺乳動物の乳タンパ ク質のアミノ酸配列とは異なったアミノ酸配列を有するヒトカゼインは、その自 然形態で乳幼児用調合乳に添加される場合に、調合乳の栄養的価値を増大させる 働きをし且つ非人乳タンパク質の固有の欠点を低減させることが可能な、重要な 物質である。 乳幼児の成長と発達に求められるタンパク質の合成に必要なアミノ酸の供給源 であることに加えて、人乳は、他の重要な生 物学的機能を有するタンパク質（カゼインを含む）を含むことが知られている。 βカゼインは、乳腺内で合成される最も豊富な乳タンパク質の１つである。ゴル ジ装置中での翻訳後修飾の後に、βカゼインが、ミセルと呼ばれる大きなカルシ ウム依存性凝集体として分泌される。βカゼインは単一の実体ではなく、泌乳刺 激ホルモンに反応した乳分泌時に分泌されるリンタンパク質の混成グループであ る。ヒトβカゼインの一次構造は、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ ｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５９：５１３２−５１３８ ，１９８４）によって決定された。この構造は、アミノ末端付近に位置する特定 のセリル残基とトレオニル残基とにリン酸化部位を有するリン酸化タンパク質で あることが明らかにされた。ヒトβカゼインとウシβカゼインの比較によって、 ４７％の同一性が確認された。ヒトβカゼインの配列は、Ｂｒｉｇｎｏｎ他（Ｆ ｅｄｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃ ｉｅｔｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８８：４８−５４，１９８５）によって決定 された。βカゼインはリン酸化され、一方、κカゼインはグルコシル化されてい る。 人乳カゼインには幾つかの生物学的効果があり、こうした効 果は、 （１）カルシウム吸収の強化、 （２）アンギオテンシンＩ変換酵素の阻害、 （３）オピオイドアゴニズム、並びに、 （４）免疫刺激及び免疫調節作用 を含む。 ヒトカゼインは、多量（＞８０％）のβ形と、より少ない量のκ形とから構成 される（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他）。自然βカゼインは、２５ｋＤａタンパク質で ある。人乳中では、βカゼイン分子は、ポリペプチド鎖１つ当たり０個から５個 までのリン酸基の範囲内で様々な度合いの翻訳後リン酸化を示す（Ｇｒｅｅｎｂ ｅｒｇ他，１９８４、及び、Ｈａｎｓｓｏｎ他，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ４：３７３−３８１，１９９３ ）。自然タンパク質のリン酸基は、アミノ末端付近のセリン残基とトレオニン残 基とに結合している（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ他，１９８４）。 細菌細胞中の外来性遺伝子の発現は、組換え真核生物タンパク質を生産するた めの有効な方法を提供する。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌は、翻訳後修飾 を行うために必要な内因性 酵素を持たないので、多くの真核生物タンパク質に必要とされる翻訳後修飾を生 じさせることが不可能である。従って、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産される真核生物タ ンパク質には、真核細胞中で生じる可能性がある特定の翻訳後修飾（例えば、グ リコシル化、リン酸化、アセチル化、又は、アミド化）が欠如している。 適切なクローニング手法が開発される前は、化学試薬を使用して、キナーゼに よる精製タンパク質のリン酸化がインビトロで行われた。このプロセスでは、タ ンパク質基質とキナーゼ酵素とを精製することが必要であり、これは、工業目的 では非効率であり、費用有効性が低い。更に、工業化のためにプロセスの大規模 化が求められる場合には、インビトロのプロセスは非効率的である。従って、タ ンパク質をインビボでリン酸化するために微生物を遺伝子操作するための方法を 開発することが必要とされている。 カナダ特許出願Ｎｏ．２，０８３，５２１（Ｐａｗｓｏｎ他）は、宿主細胞内 でリン酸化外因性タンパク質を生産する方法を開示する。Ｐａｗｓｏｎ他の方法 では、細菌細胞中に２つのベクターを導入することが必要である。一方のベクタ ーは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインによってリン酸化されることが 可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を有する。他方のベク ターは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインをコード化するヌクレオチド配列を 有する。これらの両方のベクターをＥ．ｃｏｌｉ中に導入し、外因性タンパク質 をリン酸化するように、外因性タンパク質の生産とタンパク質キナーゼ触媒ドメ インの生産とを誘導する。その後で、細菌細胞を溶解し、標準的な単離方法を使 用して、外因性リン酸化タンパク質を単離する。 カナダ特許出願Ｎｏ．２，０８３，５２１は、本発明の方法を示唆も開示もし ていない。本発明は、基質とキナーゼ酵素の両方を発現させる単一のベクターを 使用する。Ｐａｗｓｏｎ他の方法では、２つのベクターを使用することが必要で ある。本明細書で開示する発現系は、ホスホセリンに対する抗体によって判定さ れるような外因性タンパク質の特異的なリン酸化を生じさせ、一方、Ｐａｗｓｏ ｎ他の発現系は、宿主タンパク質と外因性タンパク質の両方の非特異的リン酸化 を生じさせる。これは、工業的用途のための大規模化作業において宿主細菌の増 殖に悪影響を与えるだろう。本発明は、Ｐａｗｓｏｎ他の方法とは違って、工業 的生産に適したリン酸化組換えタンパク質の 高レベルの生産を可能にする。 Ｓｉｍｃｏｘ他，Ｓｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌ ｏｇｙ ７（３）：６８−６９（１９９４）は、チロシンキナーゼプラスミドを 含む２つのＥ．ｃｏｌｉ菌株を作成した。これらのＴＫ（チロシンキナーゼ）菌 株を使用して、リン酸化標的ドメイン又はタンパク質をコード化する配列を含む プラスミドで形質転換することによって、リン酸化タンパク質を産生することが 可能である。上記Ｅ．ｃｏｌｉ菌株は両方とも誘導性チロシンキナーゼ遺伝子を 有する。一方の菌株であるＴＫＢ１を、Ｔ７プロモーターによってその発現が方 向付けられる遺伝子を発現させるために使用することが可能である。Ｓｉｍｃｏ ｘ他によって開発された系は、２つの構築物、即ち、チロシンキナーゼを含むプ ラスミドと、リン酸化されるべきタンパク質又はドメインをコード化する遺伝子 を含むプラスミドベクターとを必要とするという点で、本発明とは異なっている 。 ヒトβカゼインの構造と機能をより適切に理解するために、且つ、ヒトβカゼ インの合成と分泌の調節に影響を与える因子の調査研究を可能にするために、こ のタンパク質をコード化す るｃＤＮＡをクローニングして配列決定し（Ｌｏｅｎｎｅｒｄａｌ他，Ｆｅｄｅ ｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔ ｉｅｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２６９：１５３−１５６，１９９０）、人乳βカゼイ ンをＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉとＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ との中で生産した（Ｈａｎｓｓｏｎ他，１９９３）。Ｈａｎｓｓｏ ｎ他は、ｐＹＥＳ ２．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａ ｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して、組換えヒトβカゼインが酵母Ｓ．ｃｅｒｅ ｖｉｓｉａｅ 中で発現させられることを実証した。生産レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉ 中で得られる生産の約１０％であると推定された。しかし、タンパク質をリン酸 化することが可能な内因性酵素を有する真核細胞であるＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ ｅ から得られた組換えβカゼインは、リン酸化されたが、自然状態ではタンパク 質をリン酸化する能力を持たない原核細胞であるＥ．ｃｏｌｉによって生産され たタンパク質は、リン酸化されなかった。更に、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産され且つＥ．ｃｏｌｉ から精製される組換えヒトカゼインキナーゼＩＩ（ｒｈＣＫＩＩ） がインビトロでタンパク質基質をリン酸化することが可能であ ることが明らかにされた（Ｓｈｉ他,Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎ ａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ ９１：２ ７６７−２７７１，１９９４）。本発明の１つの特定の実施様態では、Ｅ．ｃｏ ｌｉ を形質転換して、リン酸化βカゼインを生産するために、単一の構築物内に おいてβカゼインコード化ヌクレオチド配列と共に組換えヒトカゼインキナーゼ ＩＩコード化ヌクレオチド配列を使用する。発明の要約 本明細書では、外因性タンパク質とその外因性タンパク質を修飾することが可 能な酵素の両方をコード化する単一ベクターを調製することを含む、宿主細胞中 で修飾組換えタンパク質を生産するための方法を開示する。本発明のプロセスに よって修飾されることが可能な外因性タンパク質の代表的な例は、非限定的に、 ヒトカゼイン（βカゼインを含む）、細胞受容体タンパク質、脂肪アシル化タン パク質（パルミトイル化タンパク質を含む）、哺乳動物筋肉タンパク質、レトロ ウイルスのｇａｇポリタンパク質、及び、レトロウイルスｓｒｃキナーゼの標的 となる哺乳動物タンパク質を含む。合成後に共有結合パルミチン酸基を獲得する 貫膜糖タンパク質は、インスリン、β２−ア ドレナリン性受容体、及び、トランスフェリン受容体を含む。細胞表面受容体、 チロシンキナーゼ、セリン／トレオニンキナーゼ、その基質、ホスファターゼ、 Ｇタンパク質、及び、Ｃａ²⁺として機能するタンパク質が、脂肪アシル化される ことが知られている。宿主細胞内の特定の外因性タンパク質に官能基を転移させ る能力を有する本発明で使用可能な代表的な酵素は、非限定的に、キナーゼ（例 えば、チロシンキナーゼ、又は、カゼインキナーゼ）、トランスフェラーゼ（例 えば、哺乳動物及び酵母パルミトイルトランスフェラーゼ）、及び、レトロウイ ルスのｓｒｃ遺伝子によってコード化されるキナーゼを含む。本発明で使用可能 なプロモーターの代表的な例は、誘導プロモーター（例えば、Ｔ７、πＰＬ、π Ｐ_R、及び、Ｔａｃ）、及び、構成的プロモーター（例えば、ｂｌａ及びｓｐａ ）を含む。形質転換によって修飾タンパク質を発現させることが可能な宿主細胞 の代表的な例は、非限定的に、細菌細胞であるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２及びＥ． ｃｏｌｉ Ｂ 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、及び、Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ 種、並びに、酵母細胞又は哺乳動物細胞のような真核 細胞を含む。 外因性タンパク質は、それを生産する生物の外に起源を有するタンパク質であ る。この術語は、形質転換された宿主生物によって生産される組換えタンパク質 を意味するものとして、ＤＮＡクローニング関連文献で使用されることもある。 或いは、ＤＮＡクローニング方法を使用して生産する外因性タンパク質を、組換 えタンパク質と呼ぶこともあり得る。これらの術語は、関連文献中で区別されず に使用されることが多く、従って、本明細書では同義の術語として使用する。し かし、本発明の開示内容に関する説明では、術語「組換え」を、形質転換生物に よって生産されるタンパク質を表すものとして使用し、術語「外因性の」を、自 然非組換えタンパク質、又は、そのタンパク質をコード化するヌクレオチド配列 を表す場合に使用する。 本明細書で開示するのは、宿主細胞内で修飾組換えタンパク質を生産するため の方法であり、この方法は、プロモーター配列と、外因性タンパク質配列と、そ の外因性タンパク質を修飾することが可能な酵素をコード化するヌクレオチド配 列とを有する単一ベクターを調製する段階と、上記ベクターで上記宿主細胞を形 質転換する段階と、生産される組換えタンパク質を生産される酵素が修飾するよ うに上記宿主細胞内でベクターを発 現させる段階と、生産された修飾組換えタンパク質を単離する段階とを含む。本 発明の更に特定の実施様態では、宿主細胞内でリン酸化組換えタンパク質を生産 するための方法を開示し、この方法は、プロモーター配列と、その後に続く、タ ンパク質キナーゼによってリン酸化されることが可能な外因性タンパク質をコー ド化するヌクレオチド配列と、更にその後に続く、外因性タンパク質をリン酸化 することが可能なタンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列とを有す る単一ベクターを調製する段階と、上記宿主細胞を上記ベクターで形質転換する 段階と、生産されるタンパク質キナーゼが、生産される組換えタンパク質をリン 酸化するように、上記ベクターを上記宿主細胞内で発現させる段階と、リン酸化 されたタンパク質を単離する段階とを含む。 更に明確に述べれば、本発明は、細菌発現系内で修飾組換えヒトタンパク質を 生産するための新規の方法を提供する。ヒトカゼインキナーゼのアルファ及びベ ータサブユニットをそれぞれ発現させる２つのヒトカゼインキナーゼコード化配 列の組合せを使用した時に、Ｅ．ｃｏｌｉ内で組換えリン酸化ヒトβカゼインの インビボ生産が得られた。ヒトカゼインキナーゼＩＩ コード化配列を、βカゼインコード化配列とタンデムに配置し、その結果として 、Ｅ．ｃｏｌｉ内で生産される組換えβカゼインの大部分が人乳の場合と同様に リン酸化された。更に、形質転換された宿主細胞内における組換えタンパク質の インビボの特異的なグリコシル化、アミド化もしくはアセチル化を生じさせるた めに、又は、形質転換宿主細胞内において適切な組換えタンパク質基質に脂肪酸 を転移させるために、本発明の方法を使用することも可能である。 本発明の特定の実施様態では、ヒトカゼインキナーゼＩＩ（ｈＣＫＩＩ βα ）をコード化するヌクレオチド配列が、細菌発現系内において、ヒトβカゼイン コード化ヌクレオチド配列と共に単一の構築物内で同時発現させられ、組換えヒ トβカゼインの適切なセリン残基及びトレオニン残基の効率的なインビボリン酸 化を実現する。ｈＣＫＩＩ βαコード化ヌクレオチド配列とヒトβカゼインコ ード化ヌクレオチド配列とを単一の誘導発現ベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉ中 で同時発現させた実験によって、組換えｈＣＫＩＩ βαが組換えβカゼインを インビボでリン酸化する能力があることが実証された。これは予想外の非自明な 結果であり、実験と創意とが求められた。初期 の対照実験では否定的な結果が得られたように、本明細書で開示する発明の結果 は非予測的であった。本明細書の方法は、有益なヒトタンパク質を栄養物製品と 調剤製品とに添加することを可能にする有効で有益な結果を生じさせる。図面の簡単な説明 図１は、Ｅ．ｃｏｌｉ内での誘導細胞内発現のために作成した発現ベクターｐ Ｓ６３７及びｐＲＪＢ−６の物理的地図を示す。１９１塩基対をｐＳ６３７から 除去し、ＰＲＪＢ−６を生産した。 図２は、発現ベクターｐＲＪＢ−６及びｐＲＪＢ−９の物理的地図を示し、ど のようにｐＲＪＢ−６を切断し、ＣＫＩＩ βαにライゲーションさせ、ｐＲＪ Ｂ−９を形成したかを説明する。 図３は、発現ベクターｐＳ６３７及びｐＲＪＢ−７の物理的地図を示し、どの ようにｐＳ６３７を切断し、ＣＫＩＩ βαにライゲーションさせ、ｐＲＪＢ− ７を形成したかを説明する。ｐＲＪＢ−７は、βカゼイン遺伝子とカゼインキナ ーゼ遺伝子の両方の前にＴ７プロモーターを有する。 図４は、誘導発現を生じさせ且つＥ．ｃｏｌｉ内での細胞内 局在性タンパク質の生産を仲介するために作成した、発現ベクターｐＳ７５０の 物理的地図を示す。 図５は、ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβαを使用してＥ ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株内で生産し、クーマシーブリリアントブルーで染色し たＭｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ及び他の細菌で はタンパク質合成がアミノ酸のメチオニンで開始するので、プラスミドｐＳ７５ ０の作成において、メチオニン（Ｍｅｔ）のコドンをβカゼインコード化配列の 前に置いた。これは、ポリペプチド鎖の成長のための出発点をリボソームが認識 することを可能にする。細胞内組換えβカゼインの生産は、生産されるべきタン パク質をコード化する配列の前にＭｅｔが挿入される場合にだけ可能である。レ ーン１： 分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色、相対分子量１０６、８０ 、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）、レーン２： 非リン酸化 組換えβカゼイン、レーン３： ５Ｐ−βカゼイン、レーン４： ＢＬ２１（Ｄ Ｅ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン５： ＢＬ２１（ＤＥ３）中 のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン６ ： ＢＬ２１（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン７： ＢＬ２１（ＤＥ３ ）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン８： ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰＴＧで誘導したｐ Ｓ７５０、レーン９： ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧで誘導 したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン１０： ５個の結合 リン酸基を有する自然βカゼイン（５Ｐ−βカゼイン）。矢印はβカゼインのバ ンドを示す。 図６は、 ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαを使用し てＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１菌株内で生産し、Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ で染色した、Ｍｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レーン１： ５個 の結合リン酸基を有する自然βカゼイン（５Ｐ−βカゼイン）、レーン２： Ｂ Ｌ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ細胞中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ− １１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン３： ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥ中のＩＰ ＴＧで誘導したｐＳ７５０、 レーン４： ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中の ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン５： ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中のＩＰＴ Ｇで誘導したｐＳ７５０、レーン６： ＢＬ２１（ＤＥ３）中のＩＰＴＧで誘導 したｐＳ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン７： ＢＬ２１（ＤＥ ３）中のＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン８： ５Ｐ−βカゼイン、レー ン９： 非リン酸化組換えβカゼイン、レーン１０： 分子量マーカー（Ｂｉｏ −Ｒａｄ、前染色、相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、 １８．５ｋＤａ）。矢印はリン酸化βカゼインのバンドを示し、このバンドはオ リジナルの写真では緑色のバンドとして見える。 図７は、 ベクターｐＳ７５０及びｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩを使用してＥ． ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内で生産し、Ｅｔｈｙｌ Ｓｔａ ｉｎｓ−Ａｌｌで染色した、Ｍｅｔ−βカゼインのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レ ーン１： 分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色）、レーン２： 非誘導ｐ Ｓ７５０、レーン３： ＩＰＴＧで誘導したｐＳ７５０、レーン４： 非誘導ｐ Ｓ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩβα、レーン５： ＩＰＴＧで誘導したｐ Ｓ７５０／ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン６： 非誘導ｐＥＴ−１１ ｄ−ＣＫＩＩ βα、 レーン７： ＩＰＴＧで誘導したｐＥＴ −１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、レーン８： 天然５Ｐ−βカゼイン、レーン９： 組換えβカゼイン、レーン１０： 分子量マーカー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、前染色、 相対分子量１０６、８０、４９．５、３２．５、２７．５、１８．５ｋＤａ）。 矢印はリン酸化βカゼインのバンドを示し、このバンドはオリジナルの写真では 緑色のバンドとして見える。 図８は、ヒトβカゼインに対する抗体を使用するウェスタンイムノブロット分 析を示す。レーン１： 分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４３ ．１、２９．２、１８．８、１６．５、６．４ｋＤａ）、レーン２： 天然ヒト βカゼイン５０ｎｇ、レーン３： 非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ ｐＲＪＢ−７）、レーン４： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪ Ｂ−７）、 レーン５： 非誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ− １１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン６： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓ Ｓ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン７： 非誘導ＨＭＳ１７４（Ｄ Ｅ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン８： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）。 図９は、ホスホセリンに対する抗体を使用するウェスタンイ ムノブロット分析を示す。レーン１： 低分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ 、相対分子量４４、２８．７、１８．５、１４．７、５．８、２．９ｋＤａ）、 レーン２： 天然ヒトβカゼイン１μｇ、レーン３： 天然ヒトβカゼイン２μ ｇ、レーン５： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−Ｃ ＫＩＩ βα）、レーン６： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪ Ｂ−９）、レーン７： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−７ ）、レーン８： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レー ン１０： 組換えヒトβカゼイン１μｇ、レーン１１： 組換えヒトβカゼイン ２μｇ。 図１０は、ヒトβカゼインに対する抗体を使用するイムノブロット分析を示す 。レーン１： 分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４４、２８． ９、１８．５、１４．７、５．８ｋＤａ）、レーン２： 自然ヒトβカゼイン１ μｇ、レーン３： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、 レーン４： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン５ ： 誘導ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα ）、レーン６： 組 換えヒトβカゼイン。 図１１は、ホスホセリンに対する抗体を使用するイムノブロット分析を示す。 レーン１： 分子量マーカー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、相対分子量４４、２８．９ 、１８．５、１４．７、５．８、２．９ｋＤａ）、レーン２： 自然ヒトβカゼ イン１μｇ、レーン３： 自然ヒトβカゼイン５００ｎｇ、レーン４： 誘導Ｈ ＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＲＪＢ−９）、レーン５： 誘導ＨＭＳ１ ７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＳ６３７）、レーン６： 誘導ＨＭＳ１７４（Ｄ Ｅ３）ｐＬｙｓＳ（ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα）、レーン７： 組換えヒ トβカゼイン１μｇ、レーン８： 組換えヒトβカゼイン５００ｎｇ。発明の詳細の説明 上記のように、本発明は、宿主細胞内で修飾組換えタンパク質を生産するため の方法に係わる。更に特定の実施様態では、本発明は、細菌細胞内でリン酸化ヒ トタンパク質を生産するための方法に係わる。この方法は、タンパク質キナーゼ によってリン酸化されることが可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオ チド配列と、適切なタンパク質キナーゼをコード化するヌクレオチド配列との両 方を有する単一ベクターを調製する 段階と、生産される組換えタンパク質を生産されるキナーゼがリン酸化するよう に、上記宿主細胞内で上記ベクターを発現させる段階と、リン酸化組換えタンパ ク質を単離する段階とを含む。本発明は、更に、リン酸化すべきタンパク質をコ ード化するヌクレオチド配列と、上記キナーゼをコード化するヌクレオチド配列 とを、プロモーターと共に単一構築物内にタンデムに置くことによって、高レベ ルの特異的なリン酸化が得られると同時に、抗生物質耐性遺伝子をマーカーとし て使用する必要といった多重ベクターに関連した不利な特徴を取り除くことが可 能になるという予想外の発見を提供する。単一構築物系の使用は、工業用に使用 するために手順を大規模化することを容易にする。外因性タンパク質を発現させ ることが可能なあらゆる宿主細胞系で本発明の方法が有効であることが意図され ている。適切な宿主細胞は、細菌のような原核生物の細胞と、酵母や哺乳動物の ような真核生物の細胞とを含む。 本発明の好ましい実施様態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。幾つかの異 なった発現フォーマットのβカゼインコード化ヌクレオチド配列を、Ｅ．ｃｏｌ ｉ 菌株内での組換えβカゼインの発現に関して評価した。単一構築物の中にヒト カゼイン キナーゼＣＫＩＩ βαコード化配列と共にヒトβカゼインコード化配列を置い た場合に、組換えヒトβカゼインが効率的にリン酸化されたことを、一連の実験 の後に確認した。１つのプラスミド内に両方の遺伝子をタンデムに置いた場合の リン酸化の効率は、２つのベクター内に別々にキナーゼコード化配列とβカゼイ ンコード化配列とを置いた実験系のリン酸化効率に比較して、劣ってはいなかっ た。材料と方法 実施例１から実施例５で説明する検査において次の材料と方法を使用した。更 に別の材料及び／又は方法を、必要に応じて個々の実験に関して説明する。プラスミド 図１に示すプラスミド構築物ｐＳ６３７は、１９位の追加のグルタミン（Ｇｌ ｎ）アミノ酸残基をコード化することを除いて、本明細書に引例として組み入れ ているＨａｎｓｓｏｎ他（１９９３）において作成され説明されているｐＳ２６ と同一である。当初の発現ベクターｐＳ２６を修飾して、ヒト集団に見い出され る最も多い変異型と同一である組換えβカゼインタンパク質を生産するｐＳ６３ ７を生じさせた。 本明細書に引例として組み入れているカゼインキナーゼＩＩコード化ヌクレオ チド配列（Ｓｈｉ他、１９９４）を同時発現させるために、２つのキナーゼサブ ユニットｂ及びａをコード化するＣＫＩＩ βαコード化ヌクレオチド配列をカ セットとしてβカゼインコード化ヌクレオチド配列の下流に置くことによって作 成物ｐＳ６３７を調製した。３シストロンタンデム発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫＩＩ βαは、Ｓｈｉ他（１９９４）によって産生されたＣＫＩＩ βα を含むプラスミドである。最初に、ｐＳ６３７を、βカゼインコード化配列の下 流の２つの部位で切断し、再ライゲーションさせた。これらの２つの切断部位の 間の１９１塩基を失った図１に示すプラスミドｐＲＪＢ−６を単離した。ｐＲＪ Ｂ−６の中に挿入するためにキナーゼＣＫＩＩ βαを調製した。挿入後に得た 作成物（図２に示す）をｐＲＪＢ−９と名付けた。ｐＲＪＢ−９は、リン酸化β カゼインの生産を仲介するように設計した単一構築物である。ｐＳ６３７を修飾 し、プラスミドｐＳ７５０及びｐＲＪＢ−７を作成したが、これらのプラスミド については下記で更に詳細に説明する。宿主細胞 下記の本発明の特定の実施様態では、上記ベクターで形質転換した宿主生物はＥ．ｃｏｌｉ だった。本発明の方法で使用可能な他の代表的な生物は、Ｂａｃｉ ｌｌｕｓ 種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ 種を含む。プロモーター 下記の本発明の特定の実施様態では、Ｔ７プロモーターを使用した。本発明の 方法で使用可能な他の代表的なプロモーターは、誘導プロモーターπＰ_L、πＰ_R 、及び、Ｔａｃと、構成的プロモーターｂｌａ及びｓｐａとを含む。細菌発現のためのプラスミドの作成：詳細な方法 発現ベクターＳ６３７ 発現ベクターｐＳ６３７は、βカゼインコード化配列の１９位のグルタミン（ Ｇｌｎ）アミノ酸残基をコード化するヌクレオチドトリプレットを含むので、Ｈ ａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているｐＳ２６と異なっている。このヌ クレオチド配列を、ｐＳ２６配列よりも一般的にヒト集団中に見い出されるヒト ｃＤＮＡ変異型から単離した。２つの合成オリゴヌクレ オチドを、ボリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅のために合成した。この合成オ リゴヌクレオチドは、細菌によって優先的に使用されるアミノ酸のための利便性 が高い制限部位と取込みコドンとを与える。次の配列を有する２つのオリゴヌク レオチドを、ＳＹＭ４１７４（配列番号：１）とＳＹＭ４１７５（配列番号：２ ）と名付けた。 Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９２）で説明されている通りにＰＣＲ増幅 を行い、増幅断片をＰｓｔＩとＡｖａＩＩとで消化し、８５ｂｐ断片を産生した 。Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているプラスミドｐＳ２１を、Ｅｃ ｏ ＲＶとＡｃｃＩとで消化し、３２８ｂｐ断片をゲル電気泳動で単離した。単離 した断片を、電気溶出によってアガロースゲルから精製し、ＡｖａＩＩで消化し た。これによって、１９７ｂｐ ＡｖａＩＩ／ＡｃｃＩ断片が得られ、この断片 を精製した。８５ｂｐ ＰｓｔＩ／ＡｖａＩＩ消化ＰＣＲ増幅断 片と１９７ｂｐ ＡｖａＩＩ／ＡｃｃＩ断片とを、Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３ ）で説明されているプラスミドであるＰｓｔＩ／ＡｃｃＩ消化ｐＳ２５の中にラ イゲーションさせた。その結果得たプラスミド作成物を配列決定し、ｐＳ６３６ と名付けた。６４４ｂｐ ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ制限断片をｐＳ６３６から単 離し、Ｈａｎｓｓｏｎ他（１９９３）で説明されているプラスミドであるＮｄｅ Ｉ／ＢａｍＨＩ消化ベクターｐＳ２６の中に導入した。その結果得た発現ベクタ ーをｐＳ６３７と名付けた。発現ベクターｐＲＪＢ−９ Ｓｈｉ他（１９９４）によって産生されたＣＫＩＩ βαコード化配列を含む ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαプラスミドを、組換えβカゼインとの同時発現 のために調製した。最初に、βカゼインコード化配列から下流の２つのＥｃｏＲ Ｉ部位を切断し、ｐＳ６３７を再ライゲーションさせることによって、１９１塩 基対（ｂｐ）をｐＳ６３７から除去した。プラスミドｐＲＪＢ−６（図１）を単 離し、このプラスミドは、上記２つの部位の間の１９１ｂｐを失っていたが、β カゼインコード化配列の３′末端から１３２ｂｐ離れた位置にある単一ＥｃｏＲ ｖ 部位を保持していた。ＣＫＩＩ βαコード化配列を含むプラスミドｐＥＴ−１ １ｄ−ＣＫＩＩ βαを、ＣｌａＩで切断し、その部位をクレノウ酵素（Ｓｔｒ ａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ）で補填し、平滑末端を生じさせた。補填したＣｌａＩ切 断ＣＫＩＩコード化配列を、βカゼインコード化配列から下流に、ｐＲＪＢ−６ の中に挿入し、その結果得た作成物をｐＲＪＢ−９と名付け、図２に示す。発現ベクターｐＲＪＢ−７ βカゼインコード化配列の直後にＣＫＩＩ βαコード化配列を置くことによ って、組換えβカゼインとＣＫＩＩ βαキナーゼとの同時発現を生じさせるた めの作成物ｐＳ６３７を調製した。ＣＫＩＩ βαコード化配列を、ｐＳ６３７ のＢａｍＨＩ部位の中にＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ断片として置き、ｐＲＪＢ−７ と名付けた。この断片は、その当初のベクターｐＥＴ−ＩＩｄ−ＣＫＩＩ βα からのＴ７プロモーターを含んでいた。従って、図３に示すように、ｐＲＪＢ− ７は２つのＴ７プロモーターを含み、その一方はβカゼインコード化配列の前に 位置し、他方はＣＫＩＩ βαコード化配列の前に位置する。発現ベクターｐＳ７５０ アンピシリン耐性からカナマイシン耐性に選択マーカーを変化させるために、 プラスミドｐＳ６３７をＰｖｕＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理し 、平滑末端を産生した。直線化ベクターを単離し、ＨｉｎｃＩＩカナマイシン耐 性ｇｅｎｂｌｏｃｋ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）と ライゲーションさせた。その結果得た発現ベクターをｐＳ７５０と名付けた（図 ４）。組換えヒトカゼインキナーゼＩＩのための発現ベクター 発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（Ｓｈｉ他，１９９４）は、ｔ ｈｅ Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡの Ｃ．Ｗａｌｓｈ博士によって提供された。 Ｓｔｕｄｉｅｒ他（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５： ６０−８９，１９９０）によって説明されている通りに発現実験を行った。カル ベニシリンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるｐＥＴ−１１ｄ −ＣＫＩＩ βαの場合には、カルベニシリン５０μｇ／ｍＬを含むルリアブイ ヨン（ＬＢ培地）の中で細菌を増殖させ、カナマイシ ンに対する耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるベクターｐＳ７５０の場 合にはカナマイシン５０μｇ／ｍＬを含むルリアブイヨンの中で細菌を増殖させ た。クロラムフェニコールに対する耐性を与えるｐＬｙｓプラスミドを含む菌株 を使用した時には、上記培地にクロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを加えた。 Ｔ７発現系の誘導のために、培養をＯＤ６００＝約０．５の密度に増殖させ、そ の後で、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）０．４ｍＭ を加えた。誘導約９０分後に細胞を収集した。組換えβαカゼインの電気泳動と検出 遠心分離によって細胞をペレット化し、培養１ｍＬからのペレットを、Ｔｒｉ ｓ、グリセロール、ＳＤＳ、ジチオトレオトール（ＤＴＴ）及びブロモフェノー ルブルーを含む試料緩衝液１００μＬ中に溶解した。Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕ ｒｅ ２２７：６８０−６８５，１９７０）に記述されている通りにＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥによってタンパク質を分離させた。勾配ゲルを形成し、Ｐｒｏｔｅａｎ（ Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）電気泳動装置内の不連続緩衝液系中 で泳動させた。Ｌａｅｍｍｌｉの記述の通りにゲルを染色した。装置の製造者（ Ｂ ｉｏ−Ｒａｄ）の仕様書に従ってイムノブロットを行った。修飾タンパク質の単離のための手順 当業者に公知の標準的な手順のいずれかによって修飾タンパク質を単離するこ とが可能である。こうした標準的手順の代表的な例は次の通りである。 標準的な物理的又は化学的手順によって細胞を収集し破裂させる。その後で細 胞を緩衝液中に懸濁させ、均質化し、遠心し、上清液を取り除く。その結果得た 不溶性ペレットを再懸濁させ、上清液を取り除く。洗浄した不溶性ペレットを得 、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び６Ｍ 尿素（ｐＨ８．２）中に懸濁させ、均質化する 。βカゼイン上清液Ｉを取り除き、不溶性抽出物を得、この抽出物を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び６Ｍ 尿素（ｐＨ８．２）中に再懸濁させ、均質化する。βカゼ イン上清液１１を取り除き、上清液Ｉと上清液ＩＩをプールする。残留する不溶 性抽出物を除去する。プールした上清液を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ及び（ｐＨ８． ２）で１：１に希釈し、３Ｍ 尿素で処理し、βカゼインを抽出する。５０ｍＭ エタノールアミン及び１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９．５）に対してβカゼイ ン尿素抽出物を透析し、遠心し、５０ｍＭ エタノールアミン及び１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ９．５）中で５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度に希釈することによ って、最終的なβカゼイン溶液を得る。ペレットを取り除く。実施例 実施例１と実施例２に説明する実験は、βカゼインコード化ヌクレオチド配列 とカゼインキナーゼコード化ヌクレオチド配列を別々に含む２つのベクターによ って細菌を同時形質転換する場合に、組換えβカゼインの生産に悪影響が生じな いことを示す。更に、これらの実施例は、組換えリン酸化βカゼインを細菌系内 のこれら２つのベクターを使用して生産することが可能であることも実証する。 実施例４は、プロモーターと、転写及びリン酸化されるべきタンパク質をコー ド化するヌクレオチド配列とキナーゼをコード化するヌクレオチド配列の両方と を含む単一構築物を細菌菌株の形質転換に使用した系を説明する。実施例４では 、単一プラスミドを使用する組換えリン酸化βカゼインの生産を示した。ヒト自 然βカゼインと同一である細胞外局在性組換えリン酸化βカゼインの発現のため の単一構築物系を、実施例５で説明する。実施例１： Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ内でのβαカゼインの生産： 細胞内局在性組換 えＭｅｔ− カゼインのリン酸化： ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株 細菌発現系内でインビボで組換えβカゼインをリン酸化する組換えヒトＣＫＩ Ｉ（ｒｈＣＫＩＩ）の能力を分析するために、２つの誘導発現ベクターを使用し てＥ．ｃｏｌｉ内で実験を行った。発現ベクターｐＳ７５０を、単独で、又は、 発現ベクターｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαと組み合わせて、Ｔ７宿主菌株で あるＢＬ２１（ＤＥ３）、ＢＬ２１ （ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、及び、ＢＬ２１（ ＤＥ３）ｐＬｙｓＥの中に形質転換した。ＤＥ３は、ｌａｃＩリプレッサーと、 イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘導可能なｌａｃ ＵＶ５プロモーターと、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼをコード化する遺伝子 とを含むλファージから誘導されるＤＮＡ断片である。誘導物質の存在下で、Ｔ ７ ＲＮＡポリメラーゼを生産し、外因性遺伝子の転写を生じさせる。プラスミ ドｐＬｙｓＳはクロラムフェニコール耐性を与えるが、外因性タンパク質の増殖 速度と生産に対してはほとんど影響しない。このプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ中 でのプラスミドの安定性を増大させ且つ凍結と 解凍による細胞の分解を可能にするＴ７リゾチームを含む。 図５に示す結果は、高レベルの組換えヒトＭｅｔ−βカゼインがＥ．ｃｏｌｉ 内で生産されたことと、組換えヒトＣＫＩＩβαの同時生産によってはそのカゼ インの生産量が影響されなかったことを示している。タンパク質の電気泳動分離 とリン酸基染色との後では、ＣＫＩＩ βαが組換えヒトＭｅｔ−βカゼインを インビボでリン酸化したことが明らかである。これは図６に示され、２つのベク ターを有する細菌系内でリン酸化βカゼインを生産することが可能であることを 示している。実施例２： Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２内でのβカゼインの生産：細胞内局在性組 換えＭｅｔ−βカゼインのリン酸化： ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）菌株 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２菌株ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３ ）ｐＬｙｓＳ、及び、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＥを、組換えヒトＭｅｔ −βカゼインの生産のための宿主として評価し、ｐＳ７５０で形質転換した。Ｈ ＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳによって最も高効率の生産が得られた。ｐＳ７ ５０とｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαとを使用した同時発現実験は、組換えヒ トＭｅｔ−βカゼイン生産の強力な誘 導を示し、これは、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαの存在とは無関係だった。 リン酸基染色（図７）によって、組換えヒトＣＫＩＩとのインビボ同時生産の場 合にＭｅｔ−βカゼインの効率的なリン酸化が得られることが明らかになった。 ２プラスミド系は、宿主細胞内でのそのプラスミドの存在が発酵プロセス中に監 視可能であるようにプラスミドの各々が抗生物質マーカーを含まなければならな いので、本発明の単一プラスミド系よりも本質的に劣っている。これは、増殖培 地中での２つの抗生物質の使用を必要とし、細菌増殖を妨げる。実施例３： Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２内でのヒトβカゼインの生産： βカゼイ ンコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を含む構築物 ＲＪＢ−７ ： βカゼインコード化配列の前のＴ７プロモーター： ＣＫＩＩ βαコード 化配列の前のＴ７プロモーター Ｔ７プロモーターがその前に位置するβカゼイン遺伝子と、Ｔ７プロモーター がその前に位置するＣＫＩＩ βα遺伝子とを含む作成物ｐＲＪＢ−７を、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの中に形質転換した 。使用した形質転換手順と誘導手順は、実施例４で説明する通りのＮｏ ｖａｇｅｎ ｐＥＴ ｓｙｓｔｅｍ ｍａｎｕａｌの形質転換手順と誘導手順だ った。ウェスタンブロット分析 分離、転移、ブロッキング及び抗体の手順を、実施例４で説明する。図８は、 ４つの異なった作成物を含むＥ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ 細胞によるβカゼインの生産を比較するイムノブロットを示す。誘導細胞培地と 非誘導培地の両方からのライゼートを分析する。細胞は、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫ ＩＩ βα（ＣＫＩＩ βコード化配列とβカゼインコード化配列の両方を有す るプラスミド）、ｐＲＪＢ−９（βカゼインコード化配列と、ＣＫＩＩ βαコ ード化配列と、βカゼインコード化配列だけの前のＴ７プロモーターとを有する ハイブリッド作成物）、又は、ｐＲＪＢ−７（βカゼインコード化配列と、ＣＫ ＩＩ βαコード化配列と、βカゼインコード化配列及びＣＫＩＩ βαコード 化配列の両方の前のＴ７プロモーターとを有するハイブリッド作成物）を含む。 ｐＲＪＢ−７による細胞の形質転換は、細胞増殖の著しい減少となった。Ｅ．ｃ ｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞は、１つのＴ７プロモーターだ けしか含まない作成物であるｐＲＪＢ −９で形質転換した同一の菌株の倍加時間の約２倍の倍加時間を有した。図８に 示すウェスタンブロットは、ｐＲＪＢ−９を含む細胞と比較した場合に、ｐＲＪ Ｂ−７を含む誘導細胞による組換えβカゼインの生産が減少したことを明らかに している。これは、レーン４（誘導ｐＲＪＢ−７）とレーン８（誘導ｐＲＪＢ− ９）との比較から明らかである。ｐＲＪＢ−７とｐＲＪＢ−９は両方ともｐＳ６ ３７から誘導されるが、ｐＲＪＢ−９だけがその親作成物と同等の量のβカゼイ ンを生産した。ハイブリッド作成物内でＣＫＩＩ遺伝子の前に追加のＴ７プロモ ーターが存在することが、細胞増殖の減少と、従って組換えタンパク質生産の減 少という結果をもたらした。 図９は、ライゼートをリン酸化タンパク質を検出するためにホスホセリン抗体 で展開したウェスタンブロット分析を示す。ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα、 ｐＲＪＢ−９（１つのＴ７プロモーターとを有するハイブリッド作成物）、ｐＲ ＪＢ−７（２つのＴ７プロモーターを有するハイブリッド作成物）、又は、ｐＳ ６３７（βカゼインコード化配列を含むがＣＫＩＩ βαコード化配列は含まな い）を含む誘導Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を、リン 酸化組換えβカゼイ ンの生産に関して比較した。リン酸化βカゼインは、ｐＲＪＢ−９を含む細胞（ レーン６）内でしか生産されなかった。ｐＲＪＢ−７を含む細胞のライゼートを 含むレーン７では、リン酸化タンパク質は全く検出できなかった。 ２つのＴ７プロモーターを有する作成物においてリン酸化タンパク質を検出で きなかったことは、適切に修飾した組換えタンパク質を微生物内で発現させるた めの本明細書で開示する単一作成物系を開発するために創意と実験の両方が必要 だったことを示している。タンパク質コード化ヌクレオチド配列とキナーゼコー ド化ヌクレオチド配列とを含む単一作成物内で２つのＴ７プロモーターを使用し た実験では否定的な結果を得たが、異なった実験条件下では、１つ以上のプロモ ーター配列の使用を排除すべきではない。２つの異なったプロモーターを使用す ることが好ましいと考えられる状況が、本発明の範囲内に含まれる。実施例４： Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２内でのヒトβカゼインの生産： βカゼイ ンコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を含む作成物ｐＲＪＢ−９ 本発明は、特異部位に対する官能基の転移のための情報と修 飾されるべきタンパク質との両方を発現させるために、単一の作成物を使用する 。本発明の特定の実施様態では、転移させられる官能基はリン酸基である。この 転移を、インビボでヒトβカゼイン上の特異部位のリン酸化を仲介することが実 証されているキナーゼによって生じさせる。本発明は、ヒトβカゼインをＥ．ｃ ｏｌｉ によってインビボで特異的にリン酸化することが可能であるばかりでなく 、βカゼインコード化配列の前に位置したプロモーターを有し且つ単一の作成物 系の利点を有する単一作成物がこの機能を適切に仲介することも示す。Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３） ｐＬｙｓＳ内への形質転換 βカゼイン遺伝子とＣＫＩＩ βα遺伝子とを含む作成物ｐＲＪＢ−９を、Ｅ ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２宿主ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ内へ形質転換した 。使用した形質転換手順は、Ｎｏｖａｇｅｎ ｐＥＴ ｓｙｓｔｅｍ ｍａｎｕ ａｌ（４ｔｈ ｅｄ，ＴＢ Ｎｏ．５５，Ｊｕｎｅ，１９９４）の手順だった。発現の誘導 プラスミドｐＲＪＢ−９（図２）、ｐＳ６３７（図１）、又 は、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（Ｓｈｉ他，１９９４）を含むＥ．ｃｏｌ ｉ ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ宿主細胞を３０℃で増殖させ、ＯＤ６０ ０＝０．５−０．６の密度にした。誘導物質ＩＰＴＧ １ｍＭを加える前と、加 えてから６時間後に、培養試料を採取した。２つの１ｍＬアリコートをマイクロ 遠心機内での遠心によってペレット化した。ゲル電気泳動のための試料ローディ ング緩衝液中に細胞を再懸濁させ、その後で、各々のアリコートから５００βＬ の上清液を収集した。使用済みの溶媒培地をＭｉｃｒｏｃｏｎ １０ ｓｐｉｎ ｆｉｌｔｅｒ（Ａｍｉｃｏｎ）で１０，０００ｘＧで３５分間濃縮した。１， ０００ｘＧで３分間スピニングした後に保持物質を収集し、等量の倍濃度の試料 緩衝液を加えた。ウェスタンブロット分析 １０％−２０％勾配を使用してＳＤＳ−Ｐｏｌｙａｃｒｙｌ ａｍｉｄｅ ｐ ｒｅ−ｃａｓｔ Ｇｅｌ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｓ ｙｓｔｅｍ）上で細胞ライゼートを分離し、セミドライブロッターでＩｍｍｏｂ ｉｌｏｎ−Ｐ メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に転 移させた。Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ Ｔｒａｎｓｆｅ ｒ Ｃｅｌｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＶＤＦ ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で、４５分間、定電流（０．８ｍＡ／ｃ ｍ２）でゲルをエレクトロブロッティングをした。転移緩衝液は、４８ｍＭ Ｔ ｒｉｓ、３９ｍＭ グリシン、１．３ｍＭ ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム） 、及び、２０％メタノールを含んだ。転移前に、フィルターを最初にメタノール 中に浸し、その後で転移緩衝液中に浸した。ウェスタンブロット分析を行うため に、上記メンブランを、ＴＢＳ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．１５４Ｍ ＮａＣｌ 、ｐＨ７．４）中の３％ウシ血清アルブミン及び０．２％ Ｔｗｅｅｎの中でブ ロッキングした。βカゼインに対する一次抗体と、二次抗体であるアルカリ性ホ スファターゼヤギ抗ウサギ抗体とを、ブロッキング緩衝液中で１：８０００に希 釈した。ホスホセリンを検出するために追加の抗体を使用した。ＴＢＳ中の２％ 増幅グレードブタ皮膚含有ゼラチン（Ｕ．Ｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の中 で２時間２５−２６℃でブロッキングと抗体反応を生じさせた。その後でブロッ トをＴＢＳで３０分間洗浄した。一次抗体であるマウスモノクローナル抗ホスホ セリン（Ｓｉｇｍａ）を２％ゼラチンブロッカー中で１：２００ 又は１：１００に希釈し、２時間インキュベートした。ＴＢＳ中で５分間のブロ ット洗浄を２回行った。二次抗体であるヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼ （Ｓｉｇｍａ）を、上記ゼラチンブロッカー中で１：４，０００に希釈し、１時 間インキュベートし、上記と同様にＴＢＳ中で洗浄した。ニトロブルーテトラゾ リウムと５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスファートを、発色のため の基質として使用した。 図１０は、異なった３つの作成物を含むＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＨＭＳ１７ ４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞によるβカゼインの生産を比較するイムノブロット を示す。細胞は、ｐＳ６３７（βカゼインコード化配列を有するプラスミド）、 ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βα（ＣＫＩＩ βコード化配列とβカゼインコー ド化配列の両方を有するプラスミド）、又は、ｐＲＪＢ−９（βカゼインコード 化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列の両方を有するハイブリッド作成物）を含 む。レーン３とレーン４の比較から、ｐＲＪＢ−９がそれから誘導され且つＣＫ ＩＩ βαコード化配列を含まないｐＳ６３７のβカゼイン生産量に等しい量の βカゼインを、ハイブリッド作成物ｐＲＪＢ−９が生産していることが明らかで ある。ｐＲＪＢ−９とｐＳ ６３７の両方が、この宿主細胞中で４００ｍｇ／ｍＬから５００ｍｇ／ｍＬまで のβカゼインを生産した。この実験は、ＣＫＩＩ βαコード化配列とタンデム にβカゼインコード化配列を置くことがβカゼインの生産を大きく変化させない ことを示している。 図１１は、ライゼートをリン酸化タンパク質を検出するためにホスホセリン抗 体で展開するウェスタンブロット分析を示す。図８のライゼートに加えて、増加 量の自然ヒトβカゼインと非リン酸化組換えβカゼインを試験した。ＣＫＩＩ βαプラスミドからのライゼートを含むレーン６では、細菌タンパク質のリン酸 化は検出されず、このことは、リン酸化が特異的であることを示している。βカ ゼインコード化配列とＣＫＩＩ βαコード化配列をタンデムに有するｐＲＪＢ −９を含むレーン４の細胞ライゼートは、上記抗体と交差反応する強いバンドを 示す。レーン４のバンドは、レーン２及びレーン３に見られるような電気泳動分 析による自然人乳βカゼインの分子量と同一の分子量を有する。レーン７及びレ ーン８の場合のように精製された組換え非リン酸化ヒトβカゼインに対する交差 反応性、又は、レーン５の場合のようにｐＳ６３７によってインビボで発 現された組換え非リン酸化ヒトβカゼインに対する交差反応性は存在しなかった 。この実験は、単一作成物を使用する、細菌系内におけるＥ．ｃｏｌｉ Ｋ−１ ２内でのインタクトな組換えヒトβカゼインの特異的で高レベルのリン酸化が得 られることを実証する。実施例５： Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２内でのβカゼインの生産：細胞外局在性組 換えβカゼインのリン酸化： Ｅ．ｃｏｌｉリーダー配列、プロモーター、 カ ゼインコード化配列、ｐＥＴ−１１ｄ−ＣＫＩＩ βαを含む作成物 この実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２を形質転換させ且つ細胞外局在性リ ン酸化βカゼインの生産を仲介するために使用する単一プラスミドの作成を開示 する。細菌細胞の細胞周辺腔に対してリン酸化タンパク質を分泌するように設計 した単一作成物を形成するために、βカゼインコード化配列を、タンパク質輸送 を細胞周辺腔に方向付けるリーダー配列を含む発現ベクターの中に入れる。これ らの手順で得られるクローンを標的ＤＮＡとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）を行う。Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）で合成されたプライマーであ るＲＯ−４： ５′−ＴＧＴ ＡＡＡ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＣＴ−３′（配列番 号：３）、及び、ＲＯ−２９： ５′−ＧＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＴＡＣ ＧＣＧ ＴＧＡ ＡＡＣ−３′（配列番号：４）をＰＣＲで使用すること が可能である。ＲＯ−２９の下線付きの塩基は、タンパク質合成のための細菌の 開始コドンであるメチオニンを除去するようにβカゼインコード化配列の末端にＭｌｕＩ 部位を生じさせるための、単一塩基改変を含む。改変は、その結果得ら れるタンパク質がヒトβカゼインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する ように行う。その後でＰＣＲ断片を精製する。非修飾の上記コード化配列の３′ 末端をＢａｍＨＩで切断する。５′平滑末端と３′ＢａｍＨＩ末端とを含むこの 断片を、Ｔ７プロモーターを含むｐＥＴ−２６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓ ｏｎ，ＷＩ）内にクローニングし、ＭｓｃＩとＢａｍＨＩとで平滑末端において 切断する。ここで説明する作成物はＴ７プロモーターを含むが、他のプロモータ ー配列を使用することも可能である。ＣＫＩＩβαコード化配列を、ｐＲＪＢ− ９に関して上記で説明した通りに挿入する。実施例４で説明した手順に従って、 発現を誘導し、ウェスタンブロット分析を行う。 ホスホセリンに対する抗体と交差反応し且つ自然βカゼインと同様に泳動する 、細菌細胞の細胞周辺腔から単離したタンパク質を同定するために、ウェスタン ブロットを行う。この実験は、異種翻訳開始及びシグナル配列に融合した配列に よってコード化される組換えヒトβカゼインのリン酸化を実証し、この配列の前 にはプロモーター配列が位置し、リン酸化されるべき配列が、ＣＫＩＩ βαの ようなキナーゼコード化配列を含むプラスミド内に置かれる。現在まで、細胞外 局在性リン酸化タンパク質の生産は、１ベクター系又は２ベクター系のどちらの 形でも開示されてはいない。 生産されるリン酸化タンパク質が細胞外に局在することが細胞内に局在するこ とよりも有利な点は、そのタンパク質の精製の容易さにある。細菌細胞の細胞周 辺腔内に含まれる異物の量は、その細胞の内部に含まれる異物の量よりも少なく 、従って、精製タンパク質の単離が容易に行える。これは、工業的生産において 特に有利である。 本発明は、微生物内でのリン酸化組換え哺乳動物タンパク質の生産を工業規模 で行うことを可能にするだろう。本発明の方法を、非限定的に組換えヒトβカゼ インを含む組換え外因性タ ンパク質を大量生産するために使用することが可能である。バイオリアクター内 でのβカゼインのリン酸化は、自然ヒトβカゼインと同等の組換えβカゼインを 発酵槽内で大規模に合成することを可能にする。これは、ヒトβカゼインをその 自然リン酸化状態で含む乳幼児用調合乳の生産を容易化するだろう。本発明の方 法を、リン酸化及び脱リン酸化によって調節され従って細胞代謝においてシグナ ルとして働く受容体を含む、細胞タンパク質のリン酸化のためにも使用すること も可能である。本発明は、ペプチド受容体をリン酸化するためのコスト効率が高 い方法を提供し、調剤薬剤の製造に有益だろう。 組換えリン酸化ヒトβカゼインのような発酵タンパク質の工業生産のためは、 単一プラスミド系が２プラスミド系よりも好ましい。増殖培地中の抗生物質によ って与えられる選択プレッシャーなしに組換えタンパク質を大規模に生産するこ とは、上記プラスミドを含む細胞が１つのプラスミドだけを含む又はプラスミド を全く含まない細胞を上回る選択上の利点を持たないばかりでなくそのプラスミ ドの存在による増殖速度の低下という悪影響も被るので、発酵プロセス中にプラ スミド損失を生じさせる。しかし、発酵中に細菌内に２つのプラスミドを維持す るのに必要な選択プレッシャーを得るために複数の抗生物質を使用することは、 細菌の増殖を妨げ、所期の組換え産物の収量の低下を生じさせる場合が多い。従 って、工業目的では、本明細書で開示する単一プラスミド系は、従来開示されて いる２プラスミド系よりも著しく有利である。 本明細書に開示するように、自然ヒトβカゼインの特徴に類似した又はこの特 徴と同一の特徴を有する組換えリン酸化ヒトβカゼインを生産するための新規の 方法の発見は、乳幼児の発達のための重要な利点を有する人乳に乳幼児用調合乳 をより一層近づけるために、乳幼児用調合乳にこのタンパク質を加えることを容 易化する。更に、組換え修飾ヒトタンパク質を細菌系中で生産するための方法の 開示は、他の食品製品及び調剤製品に対するこうしたヒトタンパク質の添加を容 易化する。 上記では、本発明の特定の好ましい実施様態を、添付の実施例と図面とを参照 しながら説明したが、本発明はこれらの具体的な実施様態に限定されないという ことと、添付クレームで定義する通りの本発明の思想又は範囲から逸脱すること なく当業者によって様々な変更と変形とが行われることが可能であるということ が明らかだろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:46） (72)発明者 ハンソン，エル・ステイーク スウエーデン国、エス−907・38・ウーメ オ、ビヨルクベーゲン・50

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 宿主細胞内で修飾組換えタンパク質を生産するための方法であって、 （ａ）プロモーター配列と、翻訳後修飾が可能な外因性タンパク質をコード化 するヌクレオチド配列と、前記外因性タンパク質を修飾することが可能な酵素を コード化するヌクレオチド配列とを有する単一ベクターを調製する段階、 （ｂ）前記ベクターで前記宿主細胞を形質転換する段階、 （ｃ）前記宿主細胞内で前記ベクターを発現させて、生産された前記組換えタ ンパク質を生産された前記酵素で修飾する段階、及び、 （ｄ）修飾組換えタンパク質を単離する段階 を含む前記方法。 ２． 宿主細胞内でリン酸化組換えタンパク質を生産するための方法であって、 （ａ）プロモーター配列と、その後に続く、タンパク質キナーゼによってリン 酸化されることが可能な外因性タンパク質をコード化するヌクレオチド配列と、 更にその後に続く、前記外 因性タンパク質をリン酸化することが可能なタンパク質キナーゼをコード化する ヌクレオチド配列とを有する単一ベクターを調製する段階、 （ｂ）前記宿主細胞を前記ベクターで形質転換する段階、 （ｃ）前記ベクターを前記宿主細胞内で発現させて、生産された前記組換えタ ンパク質を生産された前記タンパク質キナーゼでリン酸化する段階、及び、 （ｄ）リン酸化組換えタンパク質を単離する段階 を含む前記方法。 ３． 前記宿主細胞が原核細胞である請求項２に記載の方法。 ４． 前記原核細胞を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２、Ｅｓｃ ｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ 、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ ｌｕｓ 種、及び、Ｓｔｒｅｔｏｃｏｃｃｕｓ種から成るグループから選択する請 求項３に記載の方法。 ５． 前記プロモーター配列が、Ｔ７、πＰＬ、πＰＲ、及び、Ｔａｃから成る グループから選択する誘導プロモーターである請求項２に記載の方法。 ６． 前記プロモーター配列が、ｂｌａ及びｓｐａから成るグ ループから選択する構成的プロモーターである請求項２に記載の方法。 ７． 前記酵素がタンパク質キナーゼ又はパルミトイルトランスフェラーゼであ る請求項１に記載の方法。 ８． 前記タンパク質キナーゼを、セリンキナーゼ、トレオニンキナーゼ、及び 、チロシンキナーゼから成るグループから選択する請求項２に記載の方法。 ９． 前記タンパク質キナーゼがカゼインキナーゼである請求項２に記載の方法 。 １０． 前記カゼインキナーゼがＣＫＩＩ βαである請求項９に記載の方法。 １１． 前記組換えタンパク質が哺乳動物タンパク質である請求項２に記載の方 法。 １２． 前記組換えタンパク質がヒトタンパク質である請求項２に記載の方法。 １３． 前記ヒトタンパク質がβカゼインである請求項１２に記載の方法。 １４． 生産される前記βカゼインを細胞内に局在させる請求項１３に記載の方 法。 １５． 生産される前記βカゼインを細胞外に局在させ、前記宿主細胞の細胞周 辺腔内で確認する請求項１３に記載の方法。 １６． 前記ベクターが図２で説明する通りのｐＲＪＢ−９である請求項２に記 載の方法。 １７． ヒトβカゼイン、細胞受容体タンパク質、脂肪アシル化タンパク質、哺 乳動物筋肉タンパク質、レトロウイルスｇａｇ遺伝子ポリペプチド、及び、レト ロウイルスｓｒｃキナーゼの標的となる哺乳動物タンパク質から成るグループか ら選択される、請求項１に記載の方法で生産されるタンパク質。 １８． 前記タンパク質がβカゼインである請求項２に記載の方法で生産される タンパク質。 １９． 請求項１に記載の通りに生産される修飾タンパク質を含む栄養物製品。 ２０． 請求項１に記載の通りに生産される修飾タンパク質を含む調剤製品。