JPH11500920A - 修飾された組換えタンパク質を細菌系において発現させるプラスミド - Google Patents
修飾された組換えタンパク質を細菌系において発現させるプラスミドInfo
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、プロモーター列と、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、外因性タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配列とを含むプラスミドを提供する。本発明の特定実施態様においては、コードされている外因性タンパク質がヒトβ−カゼインであり、コードされている酵素が細菌系中で組換えβ−カゼインをリン酸化し得るヒトキナーゼである。
Description
【発明の詳細な説明】
修飾された組換えタンパク質を細菌系において
発現させるプラスミド 技術的分野
本発明は、修飾された組換えタンパク質を細菌系において産生させる新規な方
法に関する。この方法は、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と該
タンパク質をin vivoで修飾し得る酵素とを有する単一ベクターを作製す
る段階と、修飾されたタンパク質を産生させるために宿主細胞中でベクターを発
現させる段階とから成る。1つの特徴によれば本発明は、プロモーターと、タン
パク質をコードする配列と、酵素をコードする配列とを順次に含む単一ベクター
に関する。修飾されたタンパク質が天然型ヒトタンパク質と同じ生物活性を有す
ることを証明するデータを提示する。発明の背景
ヒトの母乳がヒトの乳児の最良の栄養源であることは普遍的に認識されている
。ヒトの母乳は、発育中の乳児にとって理想的な栄養源であるだけでなく、乳児
を種々の生物による感染から保護する免疫グロブリン及び非免疫性因子の双方を
含有して
いる。ヒトの母乳はまた、乳児によって消化され易く、牛乳を主成分とする乳児
用調合乳よりもアレルギー反応を起し難い。
ヒトの母乳は、牛乳及び他の哺乳動物種の乳に比べると、種々の違いを有して
いる。先ず、ヒトの母乳と牛乳とを比較すると、タンパク質の総含量及びタンパ
ク質の種類が違っている。牛乳中には主要な4種類のウシカゼインが同定されて
いる。牛乳は2種類のα−カゼインに加えてβ−カゼインとκ−カゼインとを含
むが、ヒトの母乳はβ−カゼイン及びκ−カゼインのみを含む。更に、ヒトの母
乳のタンパク質のアミノ酸配列は他の哺乳類の乳タンパク質のアミノ酸配列とは
異なっている。
ヒトの母乳の有利な特性をいくつか有しており、しかも牛乳を主成分とする乳
児用調合乳に関連した欠点、例えば乳児のアレルギー応及び消化不良、などが除
去された乳児用調合乳を開発する努力が続けられてきた。このための望ましい方
法が、天然形態のヒト母乳タンパク質のようなヒト母乳の数種類の既知の成分を
調合乳に添加する方法であることは直観的に判ることである。牛乳及び他の哺乳
類の乳とは異なるアミノ酸配列をもつヒトのカゼインは重要な物質であり、天然
形態で乳児用調合乳に添加するならば、調合乳の栄養価を高め、同時に、ヒト
以外の動物の乳タンパク質に固有の欠点を軽減するであろう。
ヒトの母乳は、乳児の成長及び発育に必要なタンパク質の合成に必要なアミノ
酸の供給源となるだけでなく、カゼインも含めて他の重要な生物学的機能を有す
るタンパク質を含有すると認識されている。β−カゼインは哺乳類の乳腺で最も
豊富に合成される乳タンパク質の1種である。このタンパク質は、ゴルジ装置で
翻訳後修飾された後、ミセルと呼ばれるカルシウム依存性の大凝集体として放出
される。β−カゼインは単一物質ではなく、催乳ホルモンに応答して授乳中に分
泌されるリンタンパク質の不均一なグループである。ヒトのβ−カゼインの一次
構造は、Greenbergら(Journal of Biological Chemistry
259:5132−5138,1984)によって決定
された。これは、アミノ末端近傍に存在する特異的なセリル残基及びトレオニル
残基にリン酸化部位をもつリン酸化タンパク質であることが判明した。ヒト及び
ウシのβ−カゼインの比較は47%の一致を示した。ヒトのκ−カゼインの配列
は、Brignonら(Federation of European Bi ologicalSocieties Letters
188:48−54,
1985)によって決定された。β−カゼインはリン酸化されているが、κ−カ
ゼインはグリコシル化されている。
いくつかの生物学的効果はヒト母乳のカゼインに帰すべきであると考えられて
おり、このような効果としては、(1)カルシウム吸収の増進、(2)アンギオ
テンシンI変換酵素の阻害、(3)アヘン様作用、及び、(4)免疫促進及び免
疫調節効果、がある。
ヒトカゼインは、大部分(>80%)のβ−形と少量のκ−形とから成る(G
reenbergら,1984)。天然型β−カゼインは25kDaのタンパク
質である。ヒトの母乳中で、β−カゼイン分子は、ポリペプチド鎖あたりリン酸
基0〜5個の範囲の種々の程度の翻訳後リン酸化を示す(Greenbergら
,1984;Hanssonら,Protein Expression an d Purification
4:373−381,1993)。天然型タン
パク質中のリン酸基はアミノ末端の近傍に存在するセリン残基及びトレオニン残
基に結合している(Greenbergら,1984)。
細菌細胞中の外因性遺伝子の発現は、組換え真核生物タンパク質を産生するた
めの有用な方法を提供する。しかしながら、
大腸菌のような細菌は、必要な内在性酵素を有していないので、多くの真核生物
タンパク質が要求するような翻訳後修飾物を生じさせることができない。従って
、大腸菌中で産生される真核生物タンパク質では、グリコシル化、リン酸化、ア
セチル化またはアミド化のような真核細胞内部で生じるはずの特異的翻訳後修飾
が欠如している。
適当なクローニング技術が開発される以前は、精製タンパク質のキナーゼによ
るリン酸化は化学的試薬を用いてin vitroで行われていた。この方法で
は、タンパク質基質とキナーゼ酵素とを精製する必要があり、これは効率が悪く
、商品化を目的としたときには採算が合わない。in vitroの方法はまた
、工業化のために規模拡大が望まれる場合には役に立たない。従って、タンパク
質をin vivoでリン酸化する微生物の遺伝子操作方法を開発することが必
要である。
Pawsonらのカナダ特許出願第2,083,521号は、リン酸化された
外因性タンパク質を宿主細胞中で産生する方法を教示している。Pawsonら
の方法では、細菌細胞に2種類のベクターを導入する必要がある。一方のベクタ
ーは、タンパク質キナーゼの触媒ドメインによってリン酸化され得る外因
性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を有している。他方のベクターは、
タンパク質キナーゼ触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を有している。
双方のベクターを大腸菌に導入し、外因性タンパク質及びタンパク質キナーゼ触
媒ドメインの産生を誘発し、外因性タンパク質をリン酸化する。次に、細菌細胞
を溶解し、リン酸化された外因性タンパク質を標準単離技術を用いて単離する。
カナダ特許出願第2,083,521号は、本発明方法を示唆するものでも開
示するものでない。本発明は、基質及びキナーゼ酵素の双方を発現する単一ベク
ターを提供する。Pawsonらの方法では2種類のベクターの使用が必要であ
る。本文中に開示された発現系は、ホスホセリンに対する抗体によって測定され
るように外因性タンパク質を特異的にリン酸化させるが、Pawsonらの発現
系は、宿主タンパク質及び外因性タンパク質の双方を非特異的にリン酸化する。
これは、工業的応用を目的とした規模拡大計画の対象として宿主細菌を増殖させ
る場合には欠点となるであろう。本発明は、Pawsonらの発明と違って、商
業生産に好適なリン酸化組換えタンパク質の高レベル産生方法を提供する。
Simcoxら,Strategies in molecular bio logy
7(3):68−69(1994)は、チロシンキナーゼプラスミド
を含む2種類の大腸菌株を構築した。これらのTK(チロシンキナーゼ)菌株は
、リン酸化標的ドメインまたはタンパク質をコードする配列を含むプラスミドに
よって形質転換されると、リン酸化タンパク質を産生するために使用できる。双
方の大腸菌株が誘導チロシンキナーゼの遺伝子を含む。一方の菌株TKB1は、
その発現がT7プロモーターによって指令される遺伝子を発現させるために有用
である。Simcoxらによって開発された系は、チロシンキナーゼ含有プラス
ミドと、リン酸化されるべきタンパク質またはドメインをコードする遺伝子を含
むプラスミドベクターとから成る2種類の構築物を必要とする点に本発明の系と
の違いを有している。
ヒトβ−カゼインの構造及び機能をより十分に理解し且つその合成及び分泌の
調節に影響を与える因子を研究するために、このタンパク質のcDNAをクロー
ニングし、配列決定し(L
pean Biological Societies Le tters
269:153−156,1990)、ヒト母乳のβ−カゼインを
大腸菌Escherichia coli及びパン酵母Saccharomyc
es cerevisiaeで産生させた(Hanssonら,1993)。H
anssonらは、pYES 2.0ベクター(InvitrogenCorp
.,San Diego,CA)を用いて、組換えヒトβ−カゼインがパン酵母
S.cerevisiae中で発現することを示した。産生レベルは大腸菌で検
出された産生の約10%であると算定された。しかしながら、タンパク質をリン
酸化し得る内在性酵素を有する真核細胞であるS.cerevisiaeから得
られた組換えβ−カゼインはリン酸化されたが、自生状態ではリン酸化能力が欠
如している原核細胞である大腸菌によって産生されたタンパク質はリン酸化され
ていなかった。その後、大腸菌中で産生され大腸菌から精製された組換えヒトカ
ゼインキナーゼII(rhCKII)が、タンパク質基質をin vitroでリン
酸化できることが示された(Shiら,Proceeding of the NationalAcademy of Sciences,USA
91:2
767−2771,1994)。本発明の1つの特定実施態様
は、大腸菌を形質転換させリン酸化β−カゼインを産生させるために、組換えヒ
トカゼインキナーゼIIをコードするヌクレオチド配列をβ−カゼインをコードす
るヌクレオチド配列と共に単一構築物中で使用する。発明の概要
ここに、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法が開示さ
れている。この方法は、外因性タンパク質と外因性タンパク質を修飾し得る酵素
との双方をコードする単一ベクターの作製から成る。本発明方法によって修飾さ
れ得る外因性タンパク質の非限定的代表例としては、β−カゼインのようなヒト
カゼイン、細胞の受容タンパク質、パルミトイル化タンパク質のような脂肪アシ
ル化タンパク質、哺乳動物の筋肉タンパク質、レトロウイルスのgagポリタン
パク質、及び、レトロウイルスのsrcキナーゼによって標的とされる哺乳動物
のタンパク質がある。合成後に共有結合パルミテートをもたらすトランスメンブ
ラン糖タンパク質としては、インスリン、アドレナリンβ2受容体及びトランス
フェリン受容体がある。細胞表面受容体として機能するタンパク質、チロシン及
びセリン/トレオニンキナーゼ、それらの基質、ホスファターゼ、G−
タンパク質及びCa2+は、脂肪アシル化されることが知られている。宿主細胞中
で官能基を特異的外因性タンパク質に転移させる能力を有するという理由で本発
明に有用な酵素の非限定的代表例としては、チロシンキナーゼ、カゼインキナー
ゼのようなキナーゼ類、哺乳動物及び酵母のパルミトイルトランスフェラーゼの
ようなトランスフェラーゼ類、レトロウイルスのsrc遺伝子によってコードさ
れるキナーゼ類がある。本発明で有用なプロモーターの代表例は、T7、λPL
、λPR及びTacのような誘導プロモーター、bla及びspaのような構成
プロモーターある。形質転換されることができ次いで修飾されたタンパク質を発
現することができる宿主細胞の非限定的代表例としては、大腸菌K−12及び大
腸菌B、バチルス種、ラクトバチルス種及びストレプトコッカス種のような細菌
細胞、酵母細胞または哺乳類細胞のような真核細胞がある。
外因性タンパク質とは、当該タンパク質を産生する生物の外部に起原を有する
タンパク質を意味する。関連するDNAクローニング文献の分野で、この用語は
ときには、形質転換されたレシピエント生物によって産生された組換えタンパク
質を意味するために使用される。または、DNAクローニング技術を用
いて産生される外因性タンパク質が組換えタンパク質と呼ばれることもある。文
献では両者が区別されないことも多いので、本文中ではこの用語を互換的に使用
する。しかしながら、開示された発明に関する記載においては、形質転換された
生物によって産生されるタンパク質を意味するときは「組換え」なる用語を使用
し、天然型の非組換えタンパク質または該タンパク質をコードするヌクレオチド
配列を意味するときは「外因性」なる用語を使用する。
本発明は、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法を開示
している。この方法は、プロモーター配列と、外因性タンパク質配列と、外因性
タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配列とを有する単一ベク
ターを作製する段階と、宿主細胞をこのベクターによって形質転換させる段階と
、産生された酵素が産生された組換えタンパク質を修飾するように宿主細胞中で
このベクターを発現させる段階と、産生され修飾された組換えタンパク質を単離
する段階とから成る。本発明はまた、より特定的な実施態様として、リン酸化さ
れた組換えタンパク質を宿主細胞中で産生する方法を開示している。この方法は
、プロモーター配列と、タンパク質キナーゼによっ
てリン酸化され得る外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、外因性
タンパク質をリン酸化し得るタンパク質キナーゼをコードするヌクレオチド配列
とを順次に含む単一ベクターを作製する段階と、宿主細胞をこのベクターによっ
て形質転換させる段階と、産生されたタンパク質キナーゼが産生された組換えタ
ンパク質をリン酸化するように宿主細胞中このでベクターを発現させる段階と、
リン酸化されたタンパク質を単離する段階とから成る。
より特定的には本発明は、修飾された組換えヒトタンパク質を細菌性発現系中
で産生させる新規な方法を提供する。この方法で得られる組換えヒトタンパク質
は、ヒト細胞に対するインフルエンザ菌H.influenzaeの付着の阻害
、及びヒト小児中耳炎の予防及び治療に有用である。キナーゼのアルフアサブユ
ニット及びベータサブユニットを夫々が発現する2種類のヒトカゼインキナーゼ
をコードする配列の組合せを使用すると、これらの配列が組換えリン酸化ヒトβ
−カゼインを大腸菌中でin vivoで産生することが示された。ヒトカゼイ
ンキナーゼIIをコードする配列を、β−カゼインをコードする配列とタンデム配
置すると、その結果として、大腸菌中で産生
された組換えβ−カゼインの有意な部分がヒト母乳中と同様にリン酸化されてい
た。本発明方法はまた、形質転換宿主細胞中で組換えタンパク質をin viv
oで特異的グリコシル化、アミド化もしくはアセチル化するため、または、形質
転換宿主細胞中で適当な組換えタンパク質基質に脂肪酸を転移するために使用で
きる。
本発明の特定実施態様においては、ヒトカゼインキナーゼII(hCK11βα)
をコードするヌクレオチド配列を、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド
配列と共に単一構築物として細菌発現系で同時発現させ、組換えヒトβ−カゼイ
ンの適正なセリン残基及びトレオニン残基の効率的なin vivoリン酸化を
達成する。hCKIIβαをコードするヌクレオチド配列と、ヒトβ−カゼインを
コードするヌクレオチド配列とを、単一の誘導発現ベクターを用いて大腸菌中で
同時発現させる実験は、組換えhCKIIβαが組換えβ−カゼインをin vi
voでリン酸化する能力を有することを示した。これは、実験及び創意を必要と
する自明でない予想外の結果であった。初期の調節実験で得られた陰性結果によ
って示されたように、開示された発明は予想外の結果を示した。本発明方法は、
有益なヒ
トタンパク質を栄養製品及び医薬製品に添加できるという有用な且つ有益な結果
を生じる。
本発明方法を用いて産生されたリン酸化β−カゼインは、ヒト咽頭細胞へのイ
ンフルエンザ菌H.influenzaeの付着を阻害する能力によって示され
たように天然型のヒトβ−カゼインと同じ生物活性を有することが示された。図面の簡単な説明
図1は、大腸菌中の誘導性細胞内発現のために構築された発現ベクターpS6
37及びpRJB−6の物理的地図を示す。pRJB−6を作製するためにpS
637から191塩基対を除去した。
図2は、発現ベクターpRJB−6及びpRJB−9の物理的地図を示してお
り、pRJB−9を形成するためにpRJB−6をどのように切断してCKIIβ
αに結合させるかを示している。
図3は、発現ベクターpS637及びpRJB−7の物理的地図を示しており
、pRJB−7を形成するためにpS637をどのように切断してCKIIβαに
結合するかを示している。pRJB−7は、β−カゼイン遺伝子及びカゼインキ
ナーゼ遺
伝子の双方の上流にT7プロモーターを有している。
図4は、誘導性発現のため及び大腸菌の細胞内に局在するタンパク質の産生を
媒介するために構築された発現ベクターpS750の物理的地図を示す。
図5は、ベクターpS750及びpET−11d−CKIIβαを用いて大腸菌
BL21株中で産生されクーマシーブリリアントブルーで染色されたMet−β
−カゼインのSDS−PAGEを示す。大腸菌及び他の細菌中ではそれらのタン
パク質の合成はアミノ酸メチオニンで開始されるので、プラスミドpS750の
構築中にメチオニン(Met)のコドンをβ−カゼインをコードする配列の上流
に配置した。このため、リボソームがポリペプチド鎖の増殖起点を認識し得る。
産生すべきタンパク質をコードする配列の上流にMetが挿入されているときに
だけ細胞内組換えβ−カゼインが産生され得る。レーン1:分子量マーカー(B
io−Rad予備染色、相対分子量106、80、49.5、32.5、27.
5、18.5kDa);レーン2:非リン酸化組換えβ−カゼイン;レーン3:
5P−β−カゼイン;レーン4:BL21(DE3)中のIPTG誘導pS75
0;レーン5:BL21(DE3)中のIPTG誘導
pS750/pET−11d−CKIIβα;レーン6:BL21(DE3)pL
ysS中のIPTG誘導pS750;レーン7:BL21(DE3)pLysS
中のIPTG誘導pS750/pET−11d−CKIIβα;レーン8:BL2
1(DE3)pLysE中のIPTG誘導pS750;レーン9:BL21(D
E3)pLysE細胞中のIPTG誘導pS750/pET−11d−CKIIβ
α;レーン10:5個のリン酸基が結合した天然型β−カゼイン(5P−β−カ
ゼイン)。矢印は、β−カゼインバンドを示す。
図6は、いずれもベクターpS750及びpET−11d−CKIIβαを用い
てEthyl Stainsで染色した大腸菌BL21株中で産生されたMet
−β−カゼインのSDS−PAGEを示す。レーン1:5個のリン酸基が結合し
た天然型β−カゼイン(5P−β−カゼイン);レーン2:BL21(DE3)
pLysE細胞中のIPTG誘導pS750/pET−11d−CKIIβα;レ
ーン3:BL21(DE3)pLysE中のIPTG誘導pS750;レーン4
:BL21(DE3)pLysS中のIPTG誘導pS750/pET−11d
−CKIIβα;レーン5:BL21(DE3)pLysS中のIP
TG誘導pS750;レーン6:BL21(DE3)中のIPTG誘導pS75
0/pET−11d−CKIIβα;レーン7:BL21(DE3)中のIPTG
誘導pS750;レーン8:5P−β−カゼイン;レーン9:非リン酸化組換え
β−カゼイン;レーン10:分子量マーカー(Bio−Rad予備染色、相対分
子量106、80、49.5、32.5、27.5、18.5kDa)。矢印は
、リン酸化β−カゼインバンドを示す。これは原写真では緑色のバンドとして観
察される。
図7は、いずれもベクターpS750及びpT−11d−CKIIβαを用いて
Ethyl Stainsで染色した大腸菌HMS174(DE3)pLysS
中で産生されたMet−β−カゼインのSDS−PAGEを示す。レーン1:分
子量マーカー(Bio Rad予備染色);レーン2:非誘導pS750;レー
ン3:IPTG誘導pS750;レーン4:非誘導pS750/pET−11d
−CKIIβα;レーン5:IPTG誘導pS750/pET−11d−CKIIβ
α;レーン6:非誘導pET−11d−CKIIβα;レーン7:IPTG誘導p
ET−11d−CKIIβα;レーン8:天然型5P−β−カゼイン;レーン9:
組換えβ−カゼイン;:レーン10:分子量
マーカー(Bio−Rad予備染色、相対分子量106、80、49.5、32
.5、27.5、18.5kDa)。矢印はリン酸化されたβ−カゼインバンド
を示す。これは原写真では緑色のバンドとして観察される。
図8は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたウエスタンイムノブロット分
析を示す。レーン1:分子量マーカー(Gibco BRL、相対分子量43.
1、29.2、18.8、16.5、6.4kDa);レーン2:50ngの天
然型ヒトβ−カゼイン;レーン3:非誘導HMS174(DE3)pLysS(
pRJB−7);レーン4:誘導HMS174(DE3)pLysS(pRJB
−7);レーン5:非誘導HMS174(DE3)pLysS(pET−11d
−CKIIβα);レーン6:誘導HMS174(DE3)pLysS(pET−
11d−CKIIβα);レーン7:非誘導HMS174(DE3)pLysS(
pRJB−9);レーン8:誘導HMS174(DE3)pLysS(pRJB
−9)。
図9は、ホスホセリンに対する抗体を用いたウエスタンイムノブロット分析を
示す。レーン1:低分子量マーカー(Gibco BRL、相対分子量44、2
8.7、18.5、14.
7、5.8、2.9kDa);レーン2:1μgの天然型ヒトβ−カゼイン;レ
ーン3:2μgの天然型ヒトβ−カゼイン;レーン5:誘導HMS174(DE
3)pLysS(pET−11d−CKIIβα);レーン6:誘導HMS174
(DE3)pLysS(pRJB−9);レーン7:誘導HMS174(DE3
)pLysS(pRJB−7);レーン8:誘導HMS174(DE3)pLy
sS(pS637);レーン10:1μgの組換えヒトβ−カゼイン;レーン1
1:2μgの組換えヒトβ−カゼイン。
図10は、ヒトβ−カゼインに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す
。レーン1:分子量マーカー(Gibco BRL、相対分子量44、28.9
、18.5、14.7、5.8kDa);レーン2:天然型ヒトβ−カゼイン;
レーン3:誘導HMS174(DE3)pLysS(pRJB−9);レーン4
:誘導HMS174(DE3)pLysS(pS637);レーン5:誘導HM
S174(DE3)pLysS(pET−11d−CKIIβα);レーン6:組
換えヒトβ−カゼイン。
図11は、ホスホセリンに対する抗体を用いたイムノブロット分析を示す。レ
ーン1:分子量マーカー(Gibco BR
L、相対分子量44、28.9、18.5、14.7、5.8、2.9kDa)
;レーン2:1μgの天然型ヒトβ−カゼイン;レーン3:500ngの天然型
ヒトβ−カゼイン;レーン4:誘導HMS174(DE3)pLysS(pRJ
B−9);レーン5:誘導HMS174(DE3)pLysS(pS637);
レーン6:誘導HMS174(DE3)pLysS(pET−11d−CKIIβ
α);レーン7::1μgの組換えヒトβ−カゼイン;レーン8:500ngの
組換えヒトβ−カゼイン。発明の詳細な説明
本発明は、修飾された組換えタンパク質を宿主細胞中で産生させる方法に関す
る。より特定的な実施態様において本発明は、リン酸化ヒトタンパク質を細菌細
胞中で産生させる方法に関する。方法は、タンパク質キナーゼによってリン酸化
され得る外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、適正なタンパク質
キナーゼをコードするヌクレオチド配列との双方を有する単一ベクターを作製す
る段階と、産生されたキナーゼが産生された外因性タンパク質をリン酸化するよ
うに宿主細胞中でベクターを発現させる段階と、リン酸化された組換えタンパク
質を単離する段階とから成る。本発明は、リン酸化されるべきタ
ンパク質をコードするヌクレオチド配列とキナーゼをコードするヌクレオチド配
列とを単一構築物中にプロモーターと共にタンデムに配置することによって、高
レベルの特異的リン酸化が達成され、しかも多数ベクターに伴う不利な特徴、例
えば抗生物質耐性遺伝子をマーカーとして使用する必要性が除去されるという予
想外の発見を提供する。単一構築物系の使用は、工業利用を目的とした処理手順
の規模拡大を容易にする。本発明方法は外因性タンパク質を発現させ得る任意の
宿主細胞系で有用であることが理解されよう。適当な宿主細胞としては、細菌の
ような原核細胞と酵母及び動物細胞のような真核細胞との双方がある。
本発明の好ましい実施態様では、宿主細胞が大腸菌である。いくつかの異なる
発現フォーマットでβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列を用い、大腸菌
の菌株中での組換えヒトβ−カゼインの発現を試験した。一連の実験後、ヒトβ
−カゼインをコードする配列がヒトカゼインキナーゼCKIIβαをコードする配
列と単一構築物中に配置されているときに、組換えヒトβ−カゼインが有効にリ
ン酸化されるという結論が得られた。双方の遺伝子が1つのプラスミド中にタン
デムに配置されてい
るときのリン酸化効率は、キナーゼをコードする配列とβ−カゼインをコードす
る配列とが異なる2つのベクター中に配置されている実験系に比べて低下しては
いなかった。材料及び方法
実施例1から5に記載の試験では以下の材料及び方法を使用した。追加の材料
及び/または方法に関しては、個々の実験で必要に応じて記載する。実施例6で
使用した材料及び方法に関しては別に記載する。プラスミド
図1に示すプラスミド構築物pS637は、追加のアミノ酸であるグルタミン
(Gln)を19位にコードしている以外は、Hanssonら(1993)に
よって構築され記載されたpS26に等しい。この文献は参照によって本発明に
含まれるものとする。出発発現ベクターpS26を修飾し、ヒト集団中に最も多
く見出される変異体に等しい組換えβ−カゼインタンパク質を産生するpS63
7を作製した。
構築物pS637は、参照によって本発明に含まれるカゼインキナーゼIIをコ
ードするヌクレオチド配列(Shiら,1994)と同時発現するように、β−
カゼインをコードするヌク
レオチド配列の下流に2つのカゼインキナーゼサブユニットβ及びαをコードす
るCKIIβαをコードするヌクレオチド配列をカセット形態で配置することによ
って作製した。3つのシストロンがタンデム配置された発現ベクターpET−1
1d−CKIIβαは、Shiら(1994)によって作製されたCKIIβαを含
むプラスミドである。先ず、β−カゼインをコードする配列の下流の2つの部位
でpS637を切断し再結合した。2つの切断部位の間の191塩基が欠失した
図1に示すプラスミドpRJB−6を単離した。pRJB−6に挿入するための
キナーゼCKIIβαを作製した。挿入後に得られた構築物をpRJB−9と命名
し、図2に示す。pRJB−9は、リン酸化β−カゼインの産生を媒介するよう
に設計された単一構築物である。更に、pS637を修飾して、プラスミドpS
750及びpRJB−7を構築した。これらのプラスミドに関しては詳細に後述
する。宿主細胞
後述する本発明の特定実施態様では、記載されたベクターによって形質転換さ
れた宿主生物は大腸菌であった。本発明方法で使用できる他の代表的生物として
は、バチルス、ラクトバチ
ルス及びストレプトコッカスの種がある。プロモーター
後述する本発明の特定実施態様においてはT7プロモーターを使用した。本発
明方法で使用できる他の代表的プロモーターとしては、誘導プロモーターλPL
、λPR及びTac、構成プロモーターbla及びspaがある。細菌発現用プラスミドの構築 詳細な方法 発現ベクターpS637
発現ベクターpS637は、β−カゼインをコードする配列の19位のアミノ
酸残基としてグルタミン(Gln)をコードするヌクレオチドトリプレットを含
むので、Hanssonら(1993)に記載のpS26とは違っている。pS
26の配列よりも頻繁にヒト集団中に見出されるヒトcDNA変異体からこのヌ
クレオチド配列を単離した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅のために2つの
合成オリゴヌクレオチドを合成した。合成オリゴヌクレオチドは、適当な制限部
位を提供し、細菌によって優先的に使用されるアミノ酸のコドンを取込んでいた
。2つのオリゴヌクレオチドをSYM4174(配列1)及びS
YM4175(配列2)と命名し、以下に示す:
SYM4174:5′−CGCTGCAGCATATGCGTGAAACCAT
CGAATC−3′
SYM4175:5′−CGGGATCCTGGTCCTCGTGTTTAAC
TTTTTCAACTTTCTGTTTGTATTCGGTGATCGATTC
−3′
Ausubelら,(eds.)Current Protocols in Molecular Biology
,Vol.2,Supp.16.15.
0.3−15.1.17(1991)に記載の手順でPCR増幅を実施し、増幅
フラグメントをPStI及びAvaIIで消化して85bpのフラグメントを作製
した。Hanssonら(1993)によって記載されたプラスミドpS21を
EcoRV及びAccIによって消化し、328bpのフラグメントをケル電気
泳動によって単離した。単離したフラグメントを電気溶出によってアガロースゲ
ルから精製し、AvaIIで消化した。この結果として得られた197bpのAv
aII/AccIフラグメントを単離した。PstI/AvaII消化しPCR増幅
した85bpのフラグメント及び197bpのAvaII/AccIを、PstI
/AccI
消化したpS25(Hanssonらに記載のプラスミド)に結合した。得られ
たプラスミド構築物を配列決定し、pS636と命名した。644bpのNde
I及びBamHI制限フラグメントをpS636から単離し、Ndel/Bam
HI消化したベクターpS26(Hanssonらに記載のプラスミド)に導入
した。得られた発現ベクターをpS637と命名した。発現ベクターpRJB−9
Shiら(1994)によって作製されたCKIIβαをコードする配列を含む
pET−11d−CKIIβαプラスミドを、組換えβ−カゼインと同時発現する
ように操作した。先ず、pS637のβ−カゼインをコードする配列の下流の2
つのEcoR1部位を切断し再結合することによって、pS637から191塩
基対(bp)を除去した。上記2つの部位の間の191bpを欠失しており、β
−カゼインをコードする配列の3′端から132塩基離れた位置に単一のEco
RV部位を保持しているプラスミドpRJB−6(図1)を単離した。CKIIβ
αをコードする配列を含むプラスミドpET−11d−CKIIβαをClaIで
切断し、この部位をクレノウ酵素(Stra
tagene,CA)で埋戻して平滑末端を作製した。ClaIで切断し埋戻し
たCKIIβαをコードする配列を、pRJB−6のβ−カゼインをコードする配
列の下流に挿入し、得られた構築物をpRJB−9と命名し、図2に示す。発現ベクタ−pRJB−7
組換えβ−カゼインとCKIIβαキナーゼとを同時発現させるためにpS63
7を操作し、CKIIβαをコードする配列をβ−カゼインをコードする配列の直
後に配置した。CKIIβαをコードする配列をBglII/BamHIフラグメン
トとしてpS637のBamHI部位に挿入し、pRJB−7と命名した。この
フラグメントはその出発ベクターpET−11D−CKIIβαに由来のT7プロ
モーターを含んでいた。従って、図3に示すように、pRJB−7は2つのT7
プロモーターを含み、一方はβ−カゼインをコードする配列の上流、他方はCK
IIβαをコードする配列の上流に位置する。発現ベクターpS750
選択マーカーをアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更するために、プ
ラスミドpS637をPvuIによって消化し、T4 DNAポリメラーゼによ
って処理して平滑末端を作
製した。直鎖化したベクターを単離し、HincIIカナマイシン耐性genbl
ock(Pharmacia,Uppsala,Sweden)に結合した。得
られた発現ベクターをpS750と命名した(図4)。組換えヒトカゼインキナーゼIIの発現ベクター
発現ベクターpET−11d−CKIIβα(Shiら,1994)は、Har
vard Medical School,Boston,MAのDr.C.W
alshによって提供された。
Studierら(Methods in Enzymology 185:
60−89,1990)によって記載された手順で発現実験を実施した。カルベ
ニシリンに耐性を与える遺伝子を含むプラスミドであるpET−11d−CKII
βαの場合には50μg/mlのカルベニシリンを含有するルリアブイヨン(L
B培地)で細菌を培養し、カナマイシンに耐性を与える遺伝子を含むプラスミド
であるベクターpS750の場合には、50μg/mlのカナマイシンを含有す
るルリアブイヨン(LB培地)で細菌を培養した。クロラムフェニコールに耐性
を与えるpLysプラスミドを含む菌株を使用したときは、培
地に30μg/mlのクロラムフェニコールを補充した。T7発現系を誘導する
ために、培養物を約OD600=0.5の密度まで増殖させ、0.4mMのイソ
プロピルβ−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を添加した。誘導の約9
0分後に細胞を採集した。組換えβ−カゼインの電気泳動及び検出
細胞を遠心によってペレット化し、1mlの培養物から得られたペレットを1
00μlのサンプルバッファに溶解した。サンプルバッファはTris,グリセ
ロール、SDS、ジチオトレイトール(DTT)及びブロモフェノールブルーを
含有していた。Laemmli(Nature 227:680−685,19
70)によって記載された手順でタンパク質をSDS−PAGEによって分離し
た。Protean(Bio−Rad,Richmond,CA)電気泳動装置
中で不連続バッファ系に勾配ゲルを流し込み、処理した。Laemmliによっ
て記載された手順でゲルを染色した。製造業者(Bio−Rad)の使用説明書
に従って免疫ブロッティングを実施した。修飾タンパク質の単離手順
修飾されたタンパク質は当業界で公知の任意の標準手順によ
って単離され得る。代表的な標準手順を以下に示す。
標準的な機械的及び化学的手順によって細胞を採集し、破壊する。次に、細胞
をバッファに懸濁させ、均質化し、遠心し、上清を廃棄する。得られた不溶性ペ
レットを再懸濁させ、上清を廃棄する。この結果として洗浄された不溶性ペレッ
トが得られる。得られたペレットを50mMのTris及び6Mの尿素にpH8
.2で懸濁させ、均質化する。β−カゼイン上清Iを除去すると、不溶性抽出物
が得られるので、この抽出物を50mMのTris及び6Mの尿素にpH8.2
で再度懸濁させ、均質化する。β−カゼイン上清IIを除去し、上清I及びIIをプ
ールする。残りの不溶性抽出物を廃棄する。プールした上清を50mMのTri
s及びpH8.2で1:1に希釈し、3Mの尿素で処理して、β−カゼインを抽
出する。β−カゼインの尿素抽出物を50mMのエタノールアミン、100mM
のNaCl,pH9.5に透析し、遠心し、50mMのエタノールアミン、10
0mMのNaCl,pH9.5でタンパク質濃度が5mg/mlになるまで希釈
することによって、最終β−カゼイン溶液を得る。ペレットを廃棄する。実施例
実施例1及び2に記載の実験は、β−カゼインをコードするヌクレオチド配列
及びカゼインキナーゼをコードするヌクレオチド配列を夫々含む2つのベクター
によって細菌を同時形質転換させたときにも、組換えβ−カゼインの産生に不利
な影響が及ばないことを示す。これらの実験はまた、これらの2つのベクターを
細菌系で使用することによって組換えリン酸化β−カゼインを産生できることを
示す。
実施例4は、プロモーターを含み、同時に、転写されリン酸化されるべきタン
パク質をコードするヌクレオチド配列とキナーゼをコードするヌクレチド配列と
の双方を含む単一構築物を細菌株の形質転換に使用した系を記載している。実施
例4では、単一プラスミドを用いる組換えリン酸化β−カゼインの産生を示した
。実施例5は、ヒト天然型β−カゼインに等しい組換えリン酸化β−カゼインを
細胞外に局在する形態で発現させる単一構築物系を記載している。実施例6は、
本発明のプラスミドの指令下で作成された天然型ヒトβ−カゼイン及び組換えヒ
トβ−カゼインの6つのリン形態のヒト咽頭細胞へのH.influenzae
の付着を阻害する能力の比較を示す。実施例1
:大腸菌B中のβ−カゼインの産生:細胞内に局在する組換えMet− β−カゼインのリン酸化
:BL21(DE3)菌株
細菌発現系中で組換えβ−カゼインをin vivoでリン酸化する組換えヒ
トβα(rhCKII)の能力を分析するために、2つの誘導性発現ベクターを用
いて大腸菌中で実験を行った。発現ベクターpS750を単独でまたは発現ベク
ターpET−11d−CKIIβαと組合わせて、T7宿主菌株BL21(DE3
)、BL21(DE3)pLysS及びBL21(DE3)pLysEを形質転
換した。DE3は、lac1リプレッサーとイソプロピルβ−D−チオガラクト
ピラノシド(IPTG)によって誘導されるlacUV5プロモーターとT7R
NAポリメラーゼ遺伝子とを含むラムダファージ由来のDNAフラグメントであ
る。インデューサーの存在下で、T7 RNAポリメラーゼが産生され、その結
果として、外因性遺伝子が転写される。プラスミドpLysSはクロラムフェニ
コール耐性を与え、外来タンパク質の増殖速度及び産生には殆ど影響を及ぼさな
い。このプラスミドは、大腸菌中のプラスミドの安定性を増加し、凍結及び解凍
によって細胞を溶解させ得るT7
リゾチームを含んでいる。
図5に示す結果は、大腸菌中で高レベルの組換えヒトMet−β−カゼインが
産生され、組換えヒトCKIIβαの同時産生が産生量に影響を及ぼさないことを
示している。タンパク質の電気泳動分離及びリン酸塩染色によって、CKIIβα
が組換えヒトMet−β−カゼインをin vivoでリン酸化したことが観察
される。実施例2
:大腸菌K−12中のβ−カゼインの産生:細胞内に局在する組換えM et−β−カゼインのリン酸化
:HMS174(DE3)菌株
組換えヒトMet−β−カゼインを産生させる宿主として、大腸菌K−12株
HMS174(DE3)、HMS174(DE3)pLysS及びHMS174
(DE3)pLysEを試験するために、pS750によって形質転換させた。
最も効率的な産生はHMS174pLysSによって得られた。pS750及び
pET−11d−CKIIβαを用いる同時発現実験は、組換えヒトMet−β−
カゼイン産生の強力な誘導を示し、この誘導がpET−11d−CKIIβαの存
在に無関係であることを示した。リン酸塩染色(図7)は、組換えヒトCKIIと
共
にin vivoで同時産生されたときのMet−β−カゼインの効率的なリン
酸化を示した。本質的には2プラスミド系は、本発明の単一プラスミド系よりも
望ましくない。その理由は、宿主細胞中の各プラスミドの存在を発酵過程でモニ
ターできるようにプラスミドの各々が抗生物質マーカーを含んでいなければなら
ないからである。このため、増殖培地に2種類の抗生物質を使用する必要があり
細菌増殖が遅くなる。実施例3
:ヒトβ−カゼイン大腸菌K−12の産生:β−カゼインをコードする 配列とCKIIβαをコードする配列との双方を含む構築物pRJB−7
:β−カ ゼインをコードする配列の上流のT7プロモーター
;CKIIβαをコードする配 列の上流のT7プロモーター
β−カゼインを含みまた各遺伝子がその上流にT7プロモーターを含む構築物
pRJB−7で、大腸菌K−12宿主HMS174(DE3)LysSを形質転
換させた。形質転換及び誘導の手順は、実施例4に記載するようなNovage
n pET系マニュアルの手順に準拠した。ウエスタンブロット分析
分離及び転移、ブロッキング及び抗体の手順については実施
例4に記載する。図8は、4つの異なる構築物を含む大腸菌HMS174(DE
3)LysS細胞によるβ−カゼインの産生を比較するイムノブロットを示す。
誘導及び非誘導の細胞培養物に由来の溶菌液を分析する。細胞は、pET−11
d−CKIIβα(CKIIβ及びCKIIαをコードする配列を含むプラスミド)、
pRJB−9(CKIIβ−カゼイン及びCKII CKIIβαをコードする配列の
双方を含みβ−カゼインをコードする配列だけがその上流にT7プロモーターを
含むハイブリッド構築物)、または、pRJB−7(β−カゼイン及びCKIIβ
αをコードする配列の双方を含みβ−カゼイン及びCKIIβαをコードする配列
の各々が上流にT7プロモーターを含むハイブリッド構築物)を含む。pRJB
−7による細菌の形質転換の結果として細菌増殖が顕著に減速した。大腸菌HM
S174(DE3)LysSは、T7プロモーターを1つしか含まない構築物で
あるpRJB−9で形質転換された同じ菌株に比べてほぼ2倍の倍加時間を要し
た。図8に示すウエスタンブロットは、pRJB−9を含む細胞に比較してpR
JB−7を含む誘導細胞による組換えCKIIβ−カゼインの産生低下を示す。こ
れはレーン4(誘導pRJB−7)とレーン8(誘導pRJB−9)
との比較によって明らかである。pRJB−7及びpRJB−9の双方がpS6
37に由来するが、pRJB−9だけが親構築物に等しい量のCKIIβ−カゼイ
ンを産生した。ハイブリッド構築物中のCKII遺伝子の上流の追加のT7プロモ
ーターの存在は、細胞増殖を減速させ、従って組換えタンパク質の産生を低下さ
せるという結果を示した。
図9は、リン酸化タンパク質を検出するために溶菌液をホスホセリン抗体と共
に展開したウエスタンブロット分析を示す。pET−11d−CKIIβα、pR
JB−9(1つのT7プロモーターをもつハイブリッド構築物)、pRJB−7
(2つのT7プロモーターをもつハイブリッド構築物)またはpS637(β−
カゼインをコードする配列を含むがCKIIβαをコードする配列を含まない)を
含む誘導された大腸菌HMS174(DE3)LysS細胞によるリン酸化組換
えβ−カゼインの産生を比較した。リン酸化β−カゼインは、pRJB−9を含
む細胞中でだけ産生された(レーン6)。pRJB−7を含む細胞の溶解液を含
むレーン7ではリン酸化タンパク質は全く検出されなかった。
2つのT7プロモーターを有する構築物中でリン酸化タンパ
ク質が検出されなかったことは、微生物中で適正に修飾された組換えタンパク質
を発現するための本発明で開示された単一構築物を開発するために、創意及び実
験の双方が必要であったことを示す。タンパク質をコードするヌクレオチド配列
とキナーゼをコードするヌクレオチド配列とを含む単一構築物中で2つのT7プ
ロモーターを用いた実験は陰性結果を与えたが、異なる実験条件下では2つ以上
のプロモーター配列の使用が排除されないことも有り得る。2つの異なるプロモ
ーターを使用するのが好ましいという状況も本発明の範囲内に維持される。実施例4
:大腸菌K−12中のヒトβ−カゼインの産生:β−カゼインをコード する配列とCKIIβαをコードする配列との双方を含む構築物pRJB−9
本発明は、官能基を特異的部位に転移させる情報と修飾すべきタンパク質との
双方を発現する単一構築物を使用する。本発明の特定実施態様においては、転移
される官能基はリン酸基である。転移は、組換えヒトβ−カゼインの特異的部位
のin vivoリン酸化を媒介することが証明されたキナーゼによって行われ
る。本発明は、ヒトβ−カゼインが大腸菌によってinvivoで特異的にリン
酸化されることを証明するだけでなく、
β−カゼインをコードする配列の上流に配置されたプロモーターを有しており単
一構築物系であるという利点を有している単一構築物がこの機能を適確に媒介す
ることを示す。大腸菌K−12 HMS174(DE3)pLysSの形質転換
β−カゼイン遺伝子とCKIIβα遺伝子とを含む構築物pRJB−9によって
大腸菌K−12宿主HMS174(DE3)LysSを形質転換した。形質転換
手順はNovagen pET系マニュアル(第4版、TB No.55,19
94年6月)に記載の手順に準拠した。発現の誘導
プラスミドpRJB−9(図2)、pS637(図1)、またはpET−11
d−CKIIβα(Shiら,1994)を含む大腸菌HMS174(DE3)L
ysS宿主細胞を30℃でOD600=0.5−0.6の密度まで増殖させた。
1mMのインデューサーIPTGの添加前及び添加の6時間後に培養サンプルを
採取した。2つの1mlアリコート中の細胞を微小遠心管で遠心することによっ
てペレット化した。細胞をゲル電気泳動用のサンプルローディングバッファに再
懸濁させた後、各
アリコートから500μlの上清を採集した。使用済みの培養培地を、Micr
ocon 10スピンフィルター(Amicon)内で10,000×Gで35
分間濃縮した。1.000×Gで3分間旋回させた後、残留液(retenta
te)を収集し、2倍の濃度の等量のサンプルバッファを添加した。ウエスタンブロット分析
10−20%勾配のSDS−ポリアタリルアミドプレキャストゲル(Inte
grated Separations System)で細胞溶解液を分離し
、半乾燥ブロッターによってImmobilon−P膜(Millipore,
Bedford,MA)に移した。Trans−Blot SD Transf
er Cell(Bio−Rad)を用いて定電流(0.8mA/cm2)を45
分間流してゲルをImmobilon PVDFフィルター(Millipor
e)に電気ブロットした。転移バッファは、48mMのTris、39mMのグ
リシン、1.3mMのSDS(ドデシル硫酸ナトリウム)及び20%のメタノー
ルを含有していた。転移に先立って、フィルターを、先ずメタノール、次いで転
移バッファに浸漬した。ウエスタンブロット分析のために、膜をTBS(25m
MのTris,0.
154MのNaCl,pH7.4)中の3%ウシ血清アルブミン及び0.2%T
ween中でブロックした。β−カゼインに対する一次抗体及びアルカリ性ホス
ファターゼヤギ抗ウサギ抗体から成る二次抗体を、ブロッキングバッファで1:
8000に希釈した。ホスホセリンを検出するために追加の抗体を使用した。ブ
ロッキング反応及び抗体反応は、TBS中に増幅グレードのブタ皮膚(U.S.
Biochemicals)を含む2%ゼラチン中で25−26℃で2時間行っ
た。次いで、ブロットをTBSで30分間洗浄した。マウスモノクローナル抗ホ
スホセリン(Sigma)から成る一次抗体を、2%ゼラチンブロッカーで1:
200または1:100に希釈し、2時間インキュベートした。ブロットをTB
Sで5分間ずつ2回洗浄した。ヤギ抗マウスアルカリ性ホスファターゼ(Sig
ma)から成る二次抗体をゼラチンブロッカー中で1:4000に希釈し、1時
間インキュベートして、TBS中で上記同様に洗浄した。発色用基質としてはニ
トロブルーテトラゾリウム及び5−ブロモ−4−クロロ−3−インドイルホスフ
ェートを使用した。
図10は、3つの異なる構築物を含む大腸菌K−12 HMS174(DE3
)LysS細胞によるβ−カゼインの産生を
比較するイムノブロットを示す。細胞は、pS637(β−カゼインをコードす
る配列を含むプラスミド)、pET−11d−CKIIβα(CKIIβ及びαをコ
ードする配列を含むプラスミド)またはpRJB−9(β−カゼイン及びCKII
βαの双方の配列をコードするハイブリッド構築物)を含む。レーン3及びレー
ン4の比較は、ハイブリッド構築物pRJB−9が、その誘導起原であるCKII
βαをコードする配列を含まないpS637と等しい量のβ−カゼインを産生す
ることを示す。この宿主細胞中でpRJB−9及びpS637の双方が400−
500mg/リットルのβ−カゼインを産生した。この実験は、β−カゼインを
コードする配列をCKIIβαをコードする配列とタンデムに配置してもβ−カゼ
インの産生量が有意に変化しないことを示す。
図11は、リン酸化タンパク質を検出するために、溶菌液をホスホセリン抗体
と共に展開させたウエスタンブロット分析を示す。図8の溶菌液以外に、増加量
の天然型ヒトβ−カゼインと非リン酸化組換えβ−カゼインとを試験した。CK
IIβαプラスミドに由来の溶菌液を含むレーン6では細菌タンパク質のリン酸化
は観察されない。これは、リン酸化が特異的であるこ
とを示す。β−カゼインとCKIIβαをコードする配列とをタンデムに含むpR
JB−9を含むレーン4の細胞溶解液は、抗体と交差反応する強力なバンドを示
す。レーン4のバンドは、レーン2及び3に示す電気泳動分析によれば天然型ヒ
ト母乳β−カゼインと同じ分子量を有している。レーン7及び8に示すように精
製された組換え非リン酸化ヒトβ−カゼインに対して、または、レーン5に示す
ようにpS637によってin vivoで発現された組換え非リン酸化ヒトβ
−カゼインに対して、交差反応性は存在しなかった。この実験は、単一構築物を
用いた細菌系の形態の大腸菌K−12中で完全形ヒトβ−カゼインの特異的な高
レベルリン酸化が生じることを示している。実施例5
:大腸菌K−12中のβ−カゼインの産生:細胞外に局在する組換えβ −カゼインのリン酸化
:大腸菌リーダー配列とプロモーターとβ−カゼインをコ ードする配列とpET−11d−CKIIβαとを含む構築物
この実施例では、大腸菌K−12を形質転換し、細胞外に局在するリン酸化β
−カゼインの産生を媒介するために使用される単一プラスミドの構築を開示する
。細菌細胞のペリプラズム空間にリン酸化タンパク質を分泌するように設計され
た単一構
築物を作製するために、β−カゼインをコードする配列を、細胞形質へのタンパ
ク質輸送を指令するリーダー配列を含む発現ベクターに導入する。これらの手順
から得られたクローンを標的DNAとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR
)を実施する。Midland Certified ReagentCo.(
Midland,TX)で合成された以下のプライマーをPCRに使用し得る:
RO−4:5′−TGT AAA ACG GCC ACT−3′(配列3)及
びRO−29:5′−GGG GAT CCG TAC GCG TGA AA
C−3′(配列4)。RO−29の下線を付けた塩基は、細菌のタンパク質合成
開始コドンであるメチオニンを除去するために、β−カゼインをコードする配列
の末端にMluI部位を生じさせるべく取込まれた単一塩基変異である。この変
異取込みの目的は、得られるタンパク質がヒトβ−カゼインのアミノ酸配列に等
しいアミノ酸配列をもつようにすることである。次いでPCRフラグメントを精
製する。修飾されていないコード配列の3′端をBamHIで切断する。5′平
滑末端と3′BamHI端とを有するこのフラグメントを、T7プロモーターを
含む発現ベクターpET−26b(Novagen,Madiso
n,WI)にクローニングし、平滑末端をMscI及びBamHIで切断する。
ここに記載の構築物はT7プロモーターを含むが、他のプロモーター配列の使用
も可能である。CKIIβαをコードする配列を、pRJB−9の場合に上述した
ように挿入する。実施例4に記載の手順に従って発現を誘導し、ウエスタンブロ
ット分析を実施する。
ホスホセリンに対する抗体と交差反応し天然型β−カゼインと同様に泳動する
タンパク質を同定するために、ウエスタンブロットを実施し、細菌細胞のペリプ
ラズム空間から単離する。この実験は、組換えヒトβ−カゼインが異種の翻訳開
始及びシグナル配列に融合した配列によってコードされており、このコード配列
が上流にプロモーター配列を有しており、且つ、リン酸化されるべき該コード配
列がCKIIβαのようなキナーゼをコードする配列を含むプラスミド中に配置さ
れているときは、組換えヒトβ−カゼインがリン酸化されることを示す。細胞外
に局在するリン酸化タンパク質の産生は、1ベクター系においても2ベクター系
においてもこれまで開示されたことはない。
産生されるリン酸化タンパク質が細胞内に局在する場合に比べて細胞外に局在
するときの利点は、その精製が容易なことで
ある。細菌細胞のペリプラズム空間は細胞内よりも異物が少ないので精製された
タンパク質の単離を速やかに行うことができる。このことは商業生産には特に有
利である。実施例6
:天然型及び組換えヒトβ−カゼインの抗付着生物活性の比較
ヘモフィルスHaemophilusは、リポ多糖−タンパク質細胞壁をもつ
小さいグラム陰性桿菌であり、ヒト及び動物種の粘膜に存在する偏性寄生菌であ
る。全部ではないにしても多くのHaemophilus influenza
eの菌株の表面は、多糖カプセルで被覆されている。カプセル被覆されない分類
不能なH.influenzaeの菌株は生後数カ月以内に殆どの個体の上気道
に転移増殖し、これらの種は中耳炎及び副鼻腔炎などのいくつかの疾病に最も関
連が深い(Murrayら,Medical Microbiology,2n
d ed.,p.260,1994)。また慢性気管支炎を悪化させたりする。
ヒト咽頭細胞に対するH.influenzaeの付着を阻害する活性につい
て、天然型ヒトβ−カゼインと、pRJB−9を含む細胞中で合成された組換え
ヒトβ−カゼインとの比較
アッセイを実施した。0−5個のリン酸基をもつリン酸化タンパク質の比較を行
った。細胞及び細菌株
Detroit 562ヒト咽頭癌細胞(DT562)をAmerican
Type Culture Collection(Rockville,MD
)から入手した。H.influenzaeの分類不能な菌株をオハイオ州立大
のDr.Lauren Bakaletzから入手した。細胞培養物
96ウエルのプレート(Costar,Cambridge,MA)に、ウエ
ルあたり20,000−25,000細胞の密度で播種したDT 562細胞を
、10%ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone,Logan,UT)を補充
したダルベッコの改質イーグル培地(GIBCO,Grand Island,
NY)で培養した。95%空気及び5%二酸化炭素の湿潤雰囲気中で37℃で細
胞をインキュベートした。細胞が90%以上の集密度に到達したときに実験を行
った。細胞を含むプレートを200μlのハンクス平衡塩類溶液(HBSS)(
GIBCO)で3回洗浄することによって細菌添加に先立って血
清タンパク質を除去した。天然型ヒトβ−カゼイン
ヒトの母乳から単離したβ−カゼインをSymbicomAB,P.O.Bo
s 1451,S−902 24 Umea,Swedenから購入した。リン形態の分離
7000×gで40℃で10分間遠心することによって細胞を収集した。上清
を除去し、ペレット化した細胞をJohnsonら(Bio/Technolo gy
,1994年12月,pp.1357−1360)に記載の凍結/解凍方法
で処理して、組換えβ−カゼインを遊離させた。0.45μの膜で濾過した後、
β−カゼインを含有するサンプルを、アニオン交換カラム(Mono Q 10
/10,Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden
)に充填した。種々のリン形態を、20mMのエタノールアミン、6Mの尿素,
pH9.5中の0−0.5MのNaClの直線勾配で50分間処理して分離した
。
組換えβ−カゼインの種々のリン形態を、夫々の溶出時間と精製された天然型
ヒト母乳β−カゼインの溶出時間との比較に
よって同定した。細菌の放射性標識
H.influenzaeを少ない継代数の凍結アリコートからチョコレート
寒天プレートに画線培養し、95%空気及び5%二酸化炭素の湿潤雰囲気下に3
7℃で18時間インキュベートして対数増殖期培養物を得た。採取した細菌を、
0.05%のウシ血清アルブミン(BSA)を補充した燐酸塩緩衝生理食塩水(
PBS)中で遠心し、等容のPBS/BSAに再懸濁させると、波長600nm
の光学密度(OD600)2.4が得られた。111インジウム−オキシン(111I
n)(Amersham,Arlington Heights,IL)を使用
して細菌を放射性標識した。50μCiの111In溶液を2.5mlの細菌懸濁
液に添加し、37℃で20分間インキュベートした。放射性標識した細菌を10
mlのHBSSで2回洗浄し、未結合の111Inを除去し、30nMのHEPE
Sバッファ(N−2−ヒドロキシエチルピペラジン−N′−2−エタンスルホン
酸)を補充した5mlのHBSSに再懸濁させた。111In標識した25μlの
細菌懸濁液を25μlの試験物質と共に96ウエルのポリプロピレンプレート中
で37℃で15分
間プレインキュベートして試験物質を細菌に結合させた。付着の定量
放射性標識した細菌と天然型ヒトβ−カゼインまたは組換えβ−カゼインとを
含む25μlのプレインキュベーション混合物を、DT562細胞を含むアッセ
イプレートの各ウエルにピペット注入した。細菌が細胞単層に付着するようにア
ッセイプレートを37℃で20分間インキュベートした。プレートをHBSSで
3回洗浄することによって未付着の細菌を除去した。細胞単層及び付着性H.i
nfluenzaeを破壊するために、100μlの0.05Nの水酸化ナトリ
ウムを添加することによってアッセイを終了した。各ウエルの内容物をCobr
aポリエチレン管に入れ、Cobraガンマーカウンター(Packard,M
eriden,CT)でカウントした。4つの重複サンプルの結果を平均化する
ことによって結果を計算した。結果を、試験物質を含まない対照ウエル中の細菌
付着に比較したときの異なる6段階のリン酸化レベルの天然型ヒトまたは組換え
(pRJB−9)β−カゼインに対する細菌付着の阻害パーセントで示す。結果
抗付着活性が終始観察されたのは、β−カゼインが3、4または5個のリン酸
基でリン酸化されているときだけであった。より低いリン酸化レベルでは、天然
型ヒトβ−カゼインまたは組換えβ−カゼインのいずれの場合にも抗付着活性は
全くまたは殆ど観察されなかった。しかしながら、β−カゼインが3、4または
5個のリン酸基を有するより高度なリン形態の場合にも、天然型ヒトβ−カゼイ
ンまたは組換え(pRJB−9)ヒトβ−カゼインの間で抗付着生物活性の違い
は本質的に存在しなかった。これらの結果は、ヒト咽頭細胞に対するH.inf
luenzaeの付着を阻害するβ−カゼインの生物活性がリン酸化のレベルに
依存することを示す。非リン酸化または極めて低リン酸化のβ−カゼインは効力
がない。ヒト咽頭細胞に対するH.influenzaeの付着を阻害するため
には3、4または5個のリン酸基の付着が必要である。本発明のプラスミドによ
って産生されたリン酸化組換えβ−カゼインは、H.influenzaeの付
着を阻害するために天然型ヒトβ−カゼインと同程度の効力がある。これらの結
果を表1にまとめる。
表1
中耳炎の原因因子としてH.influenzaeが同定された(Murra
yら,1994)。本発明のプラスミドの指令下で少なくとも3つの部位でリン
酸化された組換えヒトβ−カゼインがヒト細胞に対するH.influenza
eの付着を阻害することは前述の実験で証明されたので、上述のようなリン酸化
組換えヒトβ−カゼインが、ヒト、特に小児の中耳炎の予防及び治療に使用でき
るという結論が得られる。
治療効果は、本文中に開示された3個以上のリン酸基を有するリン酸化組換え
ヒトβ−カゼインを治療有効量で含む乳児用調合乳のような腸溶性液体栄養製品
を小腸内供給するかまたは摂取させることによって与えられる。また、ヒトの口
腔咽頭細胞に対するH.influenzaの付着は、治療有効量のリン酸化組
換えヒトβ−カゼインを含む製剤を鼻腔経由または咽喉噴霧剤として投与するこ
とによって阻害できる。このような経鼻腔投与される製剤は点鼻剤または噴霧剤
のいずれの形態でもよい。ヒトβ−カゼインとの相互作用は、β−カゼインの摂
取及び消化後よりも上咽頭での直接接触によって生じると考えられるので、経腸
、咽喉噴霧及び経鼻腔製品の投与が有効であ
ると考えられる。
本発明によれば、リン酸化された組換え哺乳類タンパク質を微生物中で商業的
規模で生産し得る。本発明方法は、組換えヒトβ−カゼインを非限定例とする組
換え外因性タンパク質を大量生産するために使用できる。バイオリアクター中の
β−カゼインのリン酸化によって、天然型ヒトβ−カゼインと等価の組換えβ−
カゼインを発酵槽で大規模に合成することが可能になる。これは、天然型のリン
酸化状態のヒトβ−カゼインを含む乳児用調合乳の産生を容易にする。本発明方
法はまた、リン酸化及び脱リン酸化によって調節され細胞物質代謝のシグナルと
して作用する受容体のような細胞タンパク質をリン酸化するために使用できる。
本発明は、ペプチド受容体をリン酸化するための費用効果的な方法を提供し、医
用薬剤の製造に有用であろう。
組換えリン酸化ヒトβ−カゼインのような発酵タンパク質の工業生産には2プ
ラスミド系よりも1プラスミド系のほうが好ましい。増殖培地中の抗生物質によ
って与えられる選択圧力を用いずに組換えタンパク質を大量生産するときは、発
酵プロセス中にプラスミドの損失が生じる。その理由は、複数のプラス
ミドを含む細胞がプラスミドを1つだけ含むかまたは全く含まない細胞に比べて
選択的な利点がなく、逆にプラスミドの存在が負担になって増殖が遅くなるから
である。しかしながら、発酵過程で細菌中に双方のプラスミドを維持するために
必要な選択圧力を与えるべく複数の抗生物質を使用すると、細菌増殖の遅滞が頻
発し、所望の組換え産物の収率が低下する。従って、工業目的には、本文中に開
示した単一プラスミド系か従来から開示されていた2プラスミド系よりもはるか
に好ましい。
3−5個のリン酸基を有するリン酸化された組換えヒトβ−カゼインは、任意
の標準的または特定の経腸液体栄養製品に組込むことができる。このような製品
の非限定例としては、牛乳もしくはヤギ乳のようなヒト以外の哺乳動物の乳に由
来のタンパク質または大豆もしくは稲のような植物源に由来のタンパク質を含む
乳児用調合乳、並びに、その他の小児用飲料がある。3−5個のリン酸基を有す
るリン酸化された組換えヒトβ−カゼインを添加した製品は、ヒト細胞に対する
H.influenzaeの付着を阻害し、ヒトの小児中耳炎を子防するために
有用である。
本文中に開示された天然型ヒトβ−カゼインの特性に類似の
特性または同一の特性を有する組換えリン酸化ヒトβ−カゼインを産生する新規
な方法の発見は、このタンパク質の添加によってヒトの母乳により近く、従って
乳児の発育により有利な乳児用調合乳の調製を可能にする。また、修飾された組
換えヒトタンパク質を細菌系において産生する方法の開示は、他の食物及び医薬
品へのヒトタンパク質の添加を可能にする。
添付の実験及び図面を参照しながら本発明の好ましい特定実施態様を上記に説
明してきたが、本発明がこれらの個々の実施態様に限定されないこと、本発明の
請求の範囲に定義された発明の要旨または範囲を逸脱することなく多くの変更及
び変形が当業者によって可能であることは明らかであろう。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
A61K 38/17 AED A61K 37/16 ABA
(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12P 21/02
C12R 1:19)
(31)優先権主張番号 08/554,642
(32)優先日 1995年11月6日
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),CA,FI,JP,NO,N
Z
(72)発明者 ハンソン,レナート
スウエーデン国、エス−907・38・ウーメ
ア、ビヨルクベーゲン、50
(72)発明者 バクスター,ジエフリー・ハリス
アメリカ合衆国、オハイオ・43021、ガレ
ナ、ビツグ・ウオルナツト・ロード・6515
(72)発明者 ハーズ,ロバート・ジヨージ
アメリカ合衆国、オハイオ・43015、デラ
ウエア、メイナード・ロード・4575
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.(a)プロモーターと、 (b)下流の、外因性タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、 (c)下流の、外因性タンパク質を修飾し得る酵素をコードするヌクレオチド配 列とから成るプラスミド。 2.プロモーターが、T7プロモーター、λPLまたはλPRプロモーター、及び Tacプロモーターから成る誘導プロモーターのグループから選択されることを 特徴とする請求項1に記載のプラスミド。 3.プロモーターが、bla及びspaから成る構成プロモーターのグループか ら選択されることを特徴とする請求項1に記載のプラスミド。 4.外因性タンパク質がヒトタンパク質であることを特徴とする請求項1に記載 のプラスミド。 5.外因性タンパク質がヒトβ−カゼインであることを特徴とする請求項1に記 載のプラスミド。 6.コードされている酵素がキナーゼであることを特徴とする 請求項1に記載のプラスミド。 7.コードされている酵素がCKIIβαであることを特徴とする請求項1に記載 のプラスミド。 8.(a)誘導性T7プロモーターと、 (b)下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列と、 (c)下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素CKIIβαをコードする ヌクレオチド配列とから成るプラスミド。 9.少なくとも3個のリン酸基を含む組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 10.(a)プロモーターと、 (b)下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配列と、 (c)下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチ ド配列とから本質的に構成されるプラスミドの指令下に合成された請求項9に記 載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 11.(a)プロモーターと、 (b)下流の、ヒトβ−カゼインをコードするヌクレオチド配 列と、 (c)下流の、ヒトβ−カゼインをリン酸化し得る酵素をコードするヌクレオチ ド配列とから本質的に構成されるプラスミドの指令下に合成された少なくとも3 個のリン酸基を含む組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 12.プラスミドのプローターが、T7プロモーター、λPLまたはλPRプロモ ーター、及びTacプロモーターから成る誘導プロモーターのグループから選択 されることを特徴とする請求項11に記載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。 13.プラスミドのプロモーターか、bla及びspaから成る構成プロモータ ーのグループから選択されることを特徴とする請求項11に記載の組換えリン酸 化ヒトβ−カゼイン。 14.プラスミドの指令下にコードされている酵素がCKIIβαであることを特 徴とする請求項11に記載の組換えリン酸化ヒトβ−カゼイン。
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