【発明の詳細な説明】
偽ペプチドおよび非ペプチドブラジキニンレセプターアンタゴニスト 技術分野
本発明は、ブラジキニンB2レセプターへの結合について天然ブラジキニンと特
異的に競合する化合物、およびブラジキニンB1レセプターについてdes Arg9-ブ
ラジキニンと特異的に競合する化合物に関する。本発明はまた、この化合物を使
用する、ヒトを含む哺乳動物においてブラジキニンの効果に拮抗する薬学的組成
物および方法に関する。
さらに詳細には、本発明は、疎水性有機部分とβターンコンホメーション(β-
turn conformation)を模倣する部分とに隣接する、２つの正に荷電した部分を、
適切な空間配置に有する化合物に関する。これらの化合物は、天然ブラジキニン
の結合と特異的に競合するように、ブラジキニンB2レセプターと相互作用する。
分子の一端で正に荷電した部分を欠く、対応する化合物は、des Arg9-ブラジキ
ニンの結合と特異的に競合するように、ブラジキニンB1レセプターと相互作用す
る。背景技術
ブラジキニン(BK)は、ほとんどの組織および体液に存在するタンパク分解酵素
群であるカリクレインのキニノーゲンに対する活性の結果として、ヒトおよび他
の哺乳動物において内因的に産生される直鎖状のノナペプチドである。一旦、遊
離されると、キニンは、末梢においてＣ線維およびＡ線維を刺激することにより
、疼痛および痛覚過敏を含む多くの生理学的反応を生じる。キニンが炎症反応に
寄与しているというかなりの証拠もまた存在する。
天然ブラジキニンは下に示されるアミノ酸構造を有する：
ブラジキニン、ならびにその生理学的に重要な関連ペプチドであるカリジン(k
alladin)(Lys-ブラジキニン)およびMet-Lys-ブラジキニンは、それらを炎症反応
、低血圧状態、および疼痛のメディエイターとしてみなす生理学的作用を示す。
ブラジキニンは、病理的状態(例えば、敗血性ショック、アナフィラキシー、鼻
炎、喘息、炎症性腸疾患)および特定の他の状態(急性膵炎、胃切除後のダンピン
グ症候群、カルチノイド症候群、片頭痛、および血管神経性浮腫を含む)におい
て過剰産生される。血漿からのブラジキニンの産生は、病理的状態の部位で疼痛
を生じ、そして過剰産生はその疼痛を、直接的またはアラキドン酸経路のブラジ
キニン誘導活性化によって増強する。アラキドン酸経路の活性化は、炎症のより
遠位の、より実際のメディエイターであるプロスタグランジン類およびロイコト
リエン類を産生する。
炎症前効果(proinflammatory effect)に加えて、ブラジキニンは血管拡張物質
である。ブラジキニンは、血圧を低下させるという随伴性能力のために、いくつ
かのショック症候群、特に敗血性ショックまたはエンドトキシン性ショックの病
因に関連づけられている。ブラジキニンはまた、動物および喘息の被験体におけ
る強力な気管支収縮物質であり、そしてそれは、アレルギー性喘息および鼻炎の
ような気道炎症状態の病因に寄与するものとして関連づけられている。
ブラジキニンレベルの増加は、多くの病理的状態において役割を演じ得るとい
う密接な関係の結果として、かなりの研究が、強力な治療薬剤としてのブラジキ
ニンレセプターアンタゴニストの誘導を目指している。ブラジキニンレセプター
アンタゴニストは、例えば、疼痛および炎症、敗血性ショック、喘息のような気
道疾患、灼熱痛、膵炎、血管性浮腫、ある神経系障害、リュウマチ様関節炎およ
び炎症性腸疾患のような慢性炎症、鼻炎、ならびにアレルギーの治療において、
多くの所望の生物学的効果を有すると期待される。
ブラジキニンの１種またはそれ以上の生物学的活性の、いくつかの非ペプチド
の非特異的で非選択的なアンタゴニストが、鎮痛薬および抗炎症物質と同じくら
い多様な化合物中に記載されている。これらのアンタゴニストは、プロスタグラ
ンジン系を介して作用し、そしてブラジキニンレセプターに直接作用しない。こ
れらの化合物は、抗ヒスタミン剤、ブラジキニン抗体、ベンゾジアゼピン誘導体
、
高分子量エチレンオキシドポリマー、没食子酸エステル、およびセロトニンイン
ヒビターである。これらの化合物または化合物のクラスはいずれも、ブラジキニ
ンの効果を特異的に阻害しない。
種々のアミノ酸含有物質(例えば、単一の塩基アミノ酸、ジペプチドPhe-Gly、
およびブラジキニンのＣ末端ペプチドフラグメント(すなわち、Pro-Phe-Arg)の
アナログ)のヘプチルエステルは、抗ブラジキニン物質として報告されている。
ブラジキニンアッセイ系で試験されるとき、これらは、用量に依存して、ブラジ
キニン作用を阻害する特異性のほとんどない、弱い部分的なアゴニスト/アンタ
ゴニストであることがわかる。
いくつかの研究グループがブラジキニンレセプターアンタゴニストを調製した
。ブラジキニンの最初のアンタゴニストは、StewartおよびVavrekにより見いだ
された。米国特許第4,801,613号および第4,693,993号(本明細書中でこれらの全
体を参考として援用する)は、一連のブラジキニンアンタゴニストを開示してい
る。これらのブラジキニンアンタゴニストでは、ペプチドホルモンブラジキニン
またはブラジキニンの他の置換アナログの７位のL-Proが、ブラジキニンアゴニ
ストをブラジキニンアンタゴニストに変換する、Ｄ型の芳香族アミノ酸で置換さ
れている。特定のL-Pro置換基は、D-Nal、D-PNF、D-Phe、D-Tyr、D-Pal、D-OMT
、D-Thi、D-Ala、D-Trp、D-His、D-ホモ-Phe、D-Phe、pCl-D-Phe(CDF)、D-Phg、
D-Val、D-Ile、D-Leu、およびMDYからなる群より選択される。代表的には、これ
らブラジキニンアンタゴニストペプチドは、モルモット回腸において20〜80nMの
範囲のKi値を有した(Stewartら、Bradykinin Antagonists（1991）Burch,R.M.、
Marcel Dekker、New York)。
続いて、モルモット回腸標本で、600〜1000倍強い効力を有するいくつかのク
ラスのブラジキニンアンタゴニストペプチドが開示された。Hoechst A.G.の公開
欧州特許出願第0413277A1号は、７位に芳香族アミノ酸D-Pheを含有し、８位に増
大した効力を与える非天然アミノ酸を含有するブラジキニンアンタゴニストを開
示する。
Hoechst A.G.の公開欧州特許出願第0370453A2号は、７位にD-アミノ酸(D-Tic)
を含有するブラジキニンアンタゴニストを開示する。
より最近の一連のブラジキニンレセプターアンタゴニストペプチドは、より初
期に記載された内因性神経ペプチドのアンタゴニストの活性に重要であると考え
られていた７位のD-芳香族アミノ酸を欠いている。公開PCT出願WO92/18156およ
びWO92/18155(本明細書中で全体を参考として援用する)に記載のように、このグ
ループの化合物は、一般的なブラジキニンアンタゴニスト構造を有する。この構
造では、７位のL-Proは、ヒドロキシプロリンエーテルおよびチオエーテル誘導
体(D-Hypeと呼ぶ)で置換され、そして８位のL-Pheはヒドロキシプロリンエーテ
ルおよびチオエーテル誘導体(Hype)、Tic、またはOicでさらに置換され得る。
上記に言及したブラジキニンアンタゴニストペプチドは、ブラジキニンB2レセ
プターをブロックすることによりその活性を示す。第２のブラジキニンレセプタ
ーであるB1レセプターは、健康な組織ではかなりの程度までは発現しないが、そ
の発現は、持続性炎症性痛覚過敏の間で上昇制御される。このレセプターは、de
s Arg9-カリジン、およびブラジキニンのタンパク質分解性分解産物であるdes A
rg9-ブラジキニンにより活性化される。それは、慢性炎症状態における痛覚過敏
の維持において重要な役割を演じると考えられている(Dray,A.およびPerkins,M.
、TINS(1993)16(3):99-103)。上記のタイプのブラジキニンB2レセプターアンタ
ゴニストペプチドの[des-Arg9]アナログは、B1レセプターと結合し、そして持続
性炎症性痛覚過敏の動物モデルにおいて痛覚過敏症を逆転させるかまたは防止す
ることが示されている。一方、対応するB2レセプターアンタゴニストは、これら
のモデルにおいて無効果かまたは活性が弱かった(Perkinsら、Pain(1993)53:191
-197)。
現在までに公知のブラジキニンアンタゴニストペプチドの１つの限界は、非経
口投与を必要とすることである。これらの化合物のペプチド的性質のために、こ
れらは経口投与では活性がなさそうである。さらに、ペプチドは、一般に、その
迅速な代謝分解の結果として、比較的短い作用持続時間を有する傾向がある。そ
の結果、ペプチドの限界を欠く非ペプチドまたは偽ペプチドのブラジキニンレセ
プターアンタゴニストが意義のある治療的利点を提供する。発明の開示
本発明は、以下に同定する新規な偽ペプチド化合物が強力なブラジキニンレセ
プターアンタゴニストであるという発見にある。この化合物は、炎症疾患、喘息
、敗血性ショック、および灼熱痛を含む種々の疾患の治療に有用である。本発明
には、本発明の化合物を含有する薬学的組成物およびこの化合物をブラジキニン
レセプターアンタゴニストとして使用する方法が含まれる。
B2レセプターと相互作用する本発明の化合物は、式：
X-Y-Z
を有し、ここで、
Xは、正味の正電荷を有する部分であり；
Yは、X-Y接合部に窒素原子、Y-Z接合部にカルボニル基、135Å3〜300Å3の範囲
の原子容、および約5.0ű1.5Åの、隣接する窒素原子とカルボニル原子との間
の末端間距離を有する疎水性有機部分であり；
Zは、βターンコンホメーションを本質的にとり、そして遠位端近傍に正電荷を
有する、原子配置である。
式X-Y-Zの好ましい化合物は、本明細書中で記載するアッセイ手順を使用する
、膜結合ヒトブラジキニンB2レセプターについて、500nm未満、より好ましくは1
00nm未満の結合親和性定数(Ki)を有する化合物である。
別の実施態様において、本発明は、ブラジキニンB1レセプターに結合し得る偽
ペプチド化合物に関する。これらの化合物は、B1レセプターを介する痛覚過敏を
ブロックする能力のために、慢性炎症に関連する状態の治療に有用である。特に
、これらの化合物は、Z基の遠位端で正に荷電した部分を欠くことを除いて、上
記のB2レセプターアンタゴニストについて示した構造と同じ構造を有する。
本発明の化合物は、従来のペプチドのブラジキニンアンタゴニストより多くの
利点を有する。最も顕著な利点は、ブラジキニン様構造からの多くの(または全
ての)アミド結合の消失である。この化合物のペプチド的性質の減少または消失
は、増加した作用持続時間を有する化合物を導く。本発明の化合物は、従来のペ
プチドのブラジキニンアンタゴニストより長く持続し、そして多様な投与様式を
有する(例えば、必ずしも非経口投与を要求せず、経口投与でも活性を有し得る)
。
本発明の化合物はまた、ペプチドのブラジキニンアンタゴニストに比べて、より
安価に調製できる。
本発明の別の実施態様には、ブラジキニンレセプターアンタゴニストとして有
用な薬学的組成物であって、薬学的キャリアおよび有効量の本発明の化合物を含
む薬学的組成物が含まれる。本発明はまた、哺乳動物において、ブラジキニンレ
セプター活性に拮抗するプロセスであって、有効量の新規化合物を被験体に投与
してブラジキニンレセプター活性に拮抗させる工程を包含するプロセスを含む。
さらなる実施態様には、火傷、創傷、切り傷、皮疹および他のこのような外傷
に由来する局所的疼痛および炎症、ならびに動物によるブラジキニンまたは関連
するキニンの産生により引き起こされる病理的状態を治療するための薬学的調製
物であって、有効量の、ブラジキニンと拮抗するに十分な新規化合物を、適切な
薬学的キャリアと共に投与する工程を包含する薬剤調製物が含まれる。本発明の
別の局面は、局所的疼痛および炎症を治療するためのプロセスであって、有効量
の薬剤調製物を、それを必要とする動物に投与する工程を包含するプロセスを含
む。本発明を実施するための態様
ブラジキニンB2レセプターへの結合に関して天然ブラジキニンと特異的に競合
し得る本発明の化合物は、以下の構造およびその薬学的受容可能な塩を有する：
X-Y-Z
ここで、
Xは、正に荷電したアミノ酸および有機基を包含する群から選択される正味の正
電荷を有する部分である；
Yは、以下の特徴を有する疎水性有機部分である；
a.X-Y接合部に窒素原子；
b.Y-Z接合部にカルボニル基；
c.窒素原子とカルボニル基との間の疎水性有機部分が炭素環式の、複素環式の
、および直鎖状の有機部分からなる群より選択される；
d.135Å3〜300Å3の範囲の原子容；
e.隣接する窒素原子とカルボニル原子との間の末端間距離が約5.0ű1.5Åで
あるようなコンホメーション；
f.但し、Yは天然に存在するアミノ酸からはなり得ない；
Zは、βターンコンホメーションを本質的にとり、遠位端近傍に正電荷を有する
原子配置である。
ブラジキニンB1レセプターへの結合に関してdes Arg9-ブラジキニンと特異的
に競合する、本発明の化合物は、以下の構造およびその薬学的に受容可能な塩を
有する：
X-Y-Z'
ここで、XおよびYは、上に定義されるものであり、そしてZ'は、βターンコンホ
メーションを本質的にとり、遠位端近傍に正電荷を欠く原子配置である。
Ａ．好ましいX部分
Xは、正味の正電荷を有する部分である。好ましくは、Xは、正に荷電したアミ
ノ酸および有機基を含む。あるいは、Xは、正に荷電したアミノ酸と有機基の両
方を含み得る。Xが正に荷電したアミノ酸を含む場合、それは、好ましくは、Arg
、Gln、Asn、Lys、Sar、N-ε-アセチル-Lys、NG-p-トシル-Arg-NG-ニトロ-Arg、
アセチル-Arg、およびシトルリンのL-およびD-異性体からなる群より独立して選
択されるモノペプチド、ジペプチド、またはトリペプチドである。最も好ましく
は、XはD-Arg-Argである。基Yが式２(下記)に記載のものである場合、Xはまた、
好ましくは、アミノ酸ＩおよびIIがArg、Gln、Asn、Lys、Sar、N-ε-アセチル-L
ys、NG-p-トシル-Arg-NG-ニトロ-Arg、アセチル-Arg、およびシトルリンのL-お
よびD-異性体からなる群より独立して選択され、そしてアミノ酸IIIがPro、4Hyp
およびOicからなる群より選択されるトリペプチド(Ｉ-II-III)であり得る。Xを
表す好ましいトリペプチドは、Yが式２で表されるとき、D-Arg-Arg-Proである。
Xが有機部分である場合、それは、トリアゾール、８-グアニジノオクタン酸、
10-アミノデカン酸およびN-[(5-グアニジノ)ペンチル]-Argを含み得るが、それ
らに限定されない。これらの有機部分において、アルキル架橋は、置換、分枝、
直線状、環状、飽和または不飽和であり得る。
Ｂ．好ましいY部分
Yは、以下の特徴を有する疎水性有機部分である：
a.X-Y接合部に窒素原子；
b.Y-Z接合部にカルボニル基；
c.窒素原子とカルボニル基との間の疎水性有機部分が炭素環式の、複素環式の
、および直鎖状の有機部分からなる群より選択される；
d.135Å3〜300Å3の範囲の原子容；
e.隣接する窒素原子とカルボニル原子との間の末端間距離が約5.0ű1.5Åで
あるようなコンホメーション；
f.但し、Yは天然に存在するアミノ酸からはなり得ない；
この疎水性有機部分Yは、少なくとも２つの要素の基準を満足しなければなら
ない。第１の基準は、単離されるこの部分のコンホメーション的に許される末端
間長度に関連し、そして第２の基準は、原子容に関連する。
完全な分子(X-Y-Z)からの単離を考慮する場合、Yは、約5.0ű1.5ÅのＮ-末
端からＣ-末端の距離をとり得なければならない。隣接する窒素原子とカルボニ
ル原子との間の、約5.0ű1.5Åの末端間距離は、固有の柔軟性または固有の剛
直性のいずれかにより達成される。この幾何学的な束縛は、例えば、不飽和化ま
たは環状化によって与えられるいくつかの固有の構造的剛直性の関数であり得る
。あるいは、この好ましい幾何学的構造(geometry)は、フラグメントYが固有の
柔軟なコンホメーション変化によって末端間距離を満足し得、達成可能な構造で
あり得る。このコンホメーション変化は、室温でのコンホメーション状態のボル
ツマン分布に基づいて可能になる。
さらに、受容可能なYは、Pearlstein,R.A.の数値積分法(学位論文、Departmen
t of Macromolecular Science、Case Western Reserve University、Cleveland
、OH、1983)により測定される場合、135Å3以上そして300Å3を超えない原子容
を有する。好ましくは、Yは、炭素環式の、複素環式の、多環式の、および直鎖
状(飽和および不飽和)の有機分子からなる群より選択される。Yは、天然アミノ
酸を含み得ない。基準の両方の要素(すなわち長さおよび容量)を満足しないY部
分は、本発明の化合物におけるYとして受け入れられない。
本発明により特異的に定義されるいくつかの疎水性のスペーサー基(Y)は：
1,2-ベンゾ-4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4.5]デカン-3-アルカン酸、
1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール-9-アルカン酸(β-カル
ボリン-アルカン酸)、
1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-b]インドール-5-アルカン酸(γ-カル
ボリン-アルカン酸)、
アミノ-2-キノリノン-1-アルカン酸、
アミノ-6-(5H)フェナントリジノン-5-アルカン酸、
1-(4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロン-3-アルカン酸、
N-(アミノフェニル)-N-ベンゾイルグリシン-N-アルカン酸、
ω-アミノアルカン酸、
置換ω-アミノアルカン酸、
オレフィン性ω-アミノアルケン酸、および
4-ケト-1,3,8-トリアザスピロ[4.5]デカン-3-アルカン酸
を含むが、これらに限定されない。
本発明の種々の実施態様において、Y基は、以下の式１、式２および式３より
選択されるいずれかの式を有する：式１
ここで、R1は、置換または非置換のアリール基、１〜６個の炭素原子の直鎖状
、分枝鎖状、飽和または不飽和の低級アルキル鎖、およびシクロアルキル環が３
〜６個の炭素原子を含むシクロアルキルまたはシクロアルキルメチルからなる群
より選択され；そして、R2は、１〜８個の炭素原子からなる飽和または不飽和の
アルキレン架橋であって、任意にベンジル基またはナフチル(napthyl)基で置換
されるか、あるいは架橋の炭素原子の１個が二基置換(disubstituted)されて３
〜６個の炭素原子からなるシクロアルキル環を形成するアルキレン架橋である。
式１において、R1は、好ましくは、C1〜C2の低級アルキル基、C1〜C4のアルコ
キシ基またはハロゲンで任意に置換される、シクロヘキシル基、フェニル基、ナ
フチル基、ベンジル基またはナフチルメチル基からなる群より選択される。さら
に好ましくは、R1は、フェニル、4-メチルフェニル、4-メトキシフェニル、4-フ
ルオロフェニル、4-クロロフェニル、ベンジル、1-ナフチル、2-ナフチル、シク
ロヘキシル、シクロヘキシルメチル、n-プロピル、n-ペンチルおよびネオペンチ
ルからなる群より選択される。最も好ましくは、R1は、フェニル、4-メチルフェ
ニル、シクロヘキシル、シクロヘキシルメチルおよびn-プロピルからなる群より
選択される。
式１において、R2は好ましくは、ベンジル基またはナフチル基で任意に置換さ
れる、１〜８個の炭素原子からなる飽和または不飽和のアルキレン架橋基である
。さらに好ましくは、R2は、１〜４個の炭素原子からなる、飽和または不飽和の
アルキレン架橋基である。最も好ましくは、R2は、xが１から４までの整数であ
る(CH2)xである。式２
ここで、R3は、2-ピロリジニル、pro、4Hyp、Oic、デヒドロPro、Tic、Aoc、L
-アゼチジン-2-カルボン酸、Eac、Gly、Thz、およびAibからなる群より選択され
；R4は、直接結合およびイミノ(-NH-)基からなる群より選択され；R5およびR6は
、独立して、直接結合、C3〜C8の炭素環、および２〜５個の、任意に環状系(cyc
lic system)中に組み込まれ得る二重結合を含む、C2〜C18のモノオレフィンまた
はC4〜C18のポリオレフィンからなる群より選択され；R7は、水素、ヒドロキシ
メチル、C1〜C6のアルキル、ベンジル、チオフェニルメチル、およびフラニルメ
チルからなる群より選択され；そして、m、n、およびoは、独立して、０から12
までの整数であり、但し、それらの合計は12を超えない。
式２において、R3は、好ましくは、2-ピロリジニル、pro、4HypおよびOicから
なる群より選択される。より好ましくは、R3は、2-ピロリジニルおよびOicから
選択される。
式２の好ましいY基は、R5が、直接結合、C3〜C8の炭素環、および２〜５個の
、任意に環状系中に組み込まれ得る二重結合を含む、C2〜C18のモノオレフィン
またはC4〜C18のポリオレフィンからなる群より選択され；R6が、直接結合およ
びC2〜C18のモノオレフィンからなる群より選択され；R7が、水素およびベンジ
ルからなる群より選択され；そして、m、n、およびoが、独立して、０から６ま
での整数であるものを含む。
R5およびR6に組み込まれる好ましい環系には、
が含まれる。
R3が直接結合である式２の好ましいY基には、
4-アミノ-2-ブテノイル；
3-[2-(アミノメチル)フェニル]-2-プロペノイル；
3-[2-(アミノメチル)フェニル]-2-プロパノイル；
3-[3-(アミノメチル)フェニル]-2-プロペノイル；
3-[3-(アミノメチル)フェニル]-2-プロパノイル；
4-[2-(アミノメチル)フェニル]-3-ブテノイル；
3-[2-(アミノエチル)フェニル]-2-プロペノイル；
6-アミノ-4,5-(1,2-シクロヘキシル)-2-ヘキセノイル；
式３
ここで、R5、R6、m、n、およびoは、式２に対する前の定義と同じである。
Yに対する上記の規準を満足する、他の疎水性スペーサー基(Y)の例は、以下の
通りである(これらは、例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定する意
図はない)
上式において、Zは、１から３までの整数である。
上記の保護された疎水性スペーサー部分(Y)(これらは、公知のカップリング技
術による、本発明の偽ペプチドまたは非ペプチドのブラジキニンアンタゴニスト
への組み込みに適している)の合成経路の例を下記のスキームＩ〜XIVに示す。
本発明のブラジキニンアンタゴニストに、これらのアミノアシル基を組み込む
ために、アミノ官能性を、例えば、Boc(tert-ブトキシカルボニル)基またはFMOC
(9-フルオレニルメトキシカルボニル)基を用いて保護する必要がある。必要なＮ
保護アミノ酸は、一般に、アミノ酸スペーサー基のエステルへのアミン保護基の
付加を包含する順序、続いてエステルの加水分解によって誘導される。ほとんど
の場合で、必要なエステルは、アミドまたはアミド様前駆体とアルキルハロアル
カノエートとのアルキル化(スキームＩ〜Ｖを参照)によって得られる。適切な保
護基とのアシル化に続き、保護されたアミノ−エステルは、保護されたアミノ酸
に加水分解される。アミドまたはアミド様の出発物質は、先に記載されているか
、市販されているか、または当業者に周知の従来の化学合成手順により調製され
る。
スキームＩに示されるように、オキシインドールとビス−クロロエチルメチル
アミンとのビス−アルキル化により、スピロ−ピペリジンが得られる。これは、
メチルブロモアセテートを用いてアルキル化される。誘導されたアセテートのそ
の後のN-脱メチル化、Boc保護、およびエステル加水分解は、N-Boc-1,2-ベンゾ-
4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4.5]デカン-3-酢酸を提供する。
Bocで保護した1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール-9-アルカ
ン酸は、同様のBoc保護、次いで、エチルブロモアセテートまたはエチル3-ブロ
モプロピオネートとのアルキル化およびエステル加水分解によって、1,2,3,4-テ
トラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール(1,2,3,4-テトラヒドロ-β-カルボリン
(Aldrich Chemical Company、Milwaukee、WI))から誘導される。
スキームIIに示されるように、N-Boc-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-
b]インドール-9-酢酸は、Fischerインドール合成におけるN-カルベトキシ4-ピペ
リドンおよびフェニルヒドラジン縮合、次いで、カルベトキシアルキル化、Boc
保護、および加水分解により誘導される。
7-(9-FMOC-アミノ)-4-メチル-2-キノリノン-1-酢酸(7-(9-FMOC-amino)-4-meth
yl-2-quinolion-1-aceticacid)は、スキームIIIに示すような関連するアルキル
化、Ｎ-保護、加水分解順序において、7-アミノ-4-メチル-2-キノリノン(Chilin
ら、J ．Org．Chem.（1991）56:980-983)から誘導される。
Boc-保護3-アミノ-6(5H)フェナントリジノン-6-酢酸は、3-ニトロ-6(5H)フェ
ナントリジノン(Rare Chemical Collection、Aldrich Chemical Company、Milwa
ukee、WI)からスキームIVに概説するように、メチルブロモアセテートのアルキ
ル化、ニトロ基の還元、アミン保護、およびエステルの加水分解によって、調製
される。
スキームＶに示すように、同様の手順を用いることにより、Boc保護N-アミノ
フェニル-N-ベンゾイルグリシン-N-酢酸が調製される。
Bocで保護された1-(4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾリノン-3-酢酸(Boc-pr
otected 1-(4-piperidinyl)-2-benzimidazolinon-3-acetic acid)は、1-(4-ピペ
リジニル)-2-ベンズイミダゾリノン(Aldrich Chemical Company、Milwaukee、WI
)からエチルヨードアセテートとのアルキル化、次いで、Bocアシル化、およびエ
ステルの加水分解によって誘導される。
Bocで保護されたω−アルカン酸ならびにこれらの置換誘導体およびオレフィ
ン性誘導体、および置換された4-ケト-1,3,8-トリアザスピロ[4.5]デカン-3-ア
ルカン酸は、共有の同時係属中の米国特許出願に記載のようにして得られる。
ここで、R1およびR2は、式１についての定義の通りであり；R8は、CH3、C2H5
、またはベンジル(Bn)である。
式２の疎水性のスペーサー(Y)(ここで、R4は、イミノ基である)を本発明の偽
ペプチドに導入するための、N-Bocで保護された置換ω−アミノアルカン酸の調
製は、スキームVII(ここで、Bnはベンジルを表す)に概説されるように、N-Boc-5
-アミノ-2-ベンジル-3-ペンテン酸(10)の合成によって示される。
従って、ジエチルベンジルマロネート(１)を、水素化リチウムアルミニウムで
還元して2-ベンジル-1,3-プロパンジオール(２)を得る。これは、当モル量のter
t-ブチルジメチルシリルクロライドで処理されて一保護(monoprotected)アルコ
ール３を得る。３のSwern(ジメチルスルホキシド/塩化オキサリル)酸化はアルデ
ヒド４を提供し、このアルデヒドを、Wittig試薬であるメチル(トリフェニルホ
スホニリデン)アセテートで縮合して６を得る。アルコール６のメシレート７へ
の変換に続くアジド置換は８を提供し、その後、これを還元し、そしてBoc保護
して９を得る。tert-ブチルジメチルシリルエーテル９のJones酸化は、Bocで保
護された置換ω−アミノアルケン酸10を提供する。
マロネート出発物質のベンジル置換基の変更によって、式２の一般構造の基R7
は変化し得る。アルデヒド、例えば、４を用いるWittig縮合に使用される試薬の
改変は、本発明の偽ペプチドに導入される、式２のアミノアルケノイル基のR5、
R6、m、n、およびoのバリエーションを可能にする。
R3が2-ピロリジニルであり、そして残りのY基がアルケノイル基であるフラグ
メントを本発明の偽ペプチドに導入するためのモノオレフィンおよびポリオレフ
ィン置換ω-(2-ピロリジニル)アルケン酸を調製するために利用される一般的方
法は、スキームVIIIに概説されるような(2S-2S-ベンジル-7-(2S-ピロリジニル)-
6-ヘプテン酸(18)の合成によって示される。置換ω-(2-ピロリジニル)アルカン
酸19は、スキームVIII(ここで、Bnはベンジル基を表す)に示されるように、オレ
フィン前駆体の触媒的水素化によって得られる。
この順序における最初の工程は、先に記載された方法論[Fehrentz,J.A.および
Castro,B.、Synthesis(1983)676-678；Hocart,S.J.ら、J.Med.Chem.(1988)31:19
20-1824；Nahm,S.およびWeinreb,S.M.、Tet.Lettr.(1981)22:8315-3818]に従っ
て、Bocで保護されたL(S)-プロリン(11)を、Bocで保護されたN-メトキシル-N-メ
チル-L-プロリンアミド(N-methoxyl-N-methyl-L-prolinamide)(12)を経て、2-ピ
ロリジンカルボキシアルデヒド(13)へ変換することを包含する。Corey,H.S.,Jr.
ら[J.Am.Chem.Soc.(1964)86:1884]の一般的方法に従って6-ブロモヘキサン酸
およびトリフェニルホスフィンから誘導されたWittig試薬を用いる、13の縮合は
、Bocで保護された7-(2-ピロリジニル)-6-ヘプテン酸(14)を生成した。これを、
先に記載の一般的手順[Mavunkel,B.J.ら、Tet.Lettr.(1993)14;2225]に従って、
キラルアミド15を経て立体選択的にベンジル化して16を生成する。ベンジルアル
コールを用いるこのアミドのアルコーリシスによりエステル17が得られ、これは
、Evans,D.R.ら[J.Org.Chem.(1985)50:1930-1835]の手順に従って、18に加水分
解される。18の水素化は、飽和ベンジル-置換ω-(2-ピロリジニル)アルカン酸19
を生じる。
本発明のブラジキニンアンタゴニストへの組み込みのための式３の疎水性スペ
ーサー基(Y)の調製をスキームIX〜XIVに示す。
Ｃ．好ましいZおよびZ'部分
Zは、βターンコンホメーションを本質的にとり、かつ遠位端近傍に正電荷を
有する原子配置である。Zは、天然に生じるアミノ酸または天然に生じないアミ
ノ酸の群であり得るか、あるいは、それは、非アミノ酸の有機部分であり得る。
Zが、アミノ酸を含有する部分である場合、それは好ましくは、以下の式を有し
、
E-F-G-H-Cn
ここで、
Eは、直接結合であるか、またはSer、Thr、Gly、N-BnGly、Val、Ala、Cys、およ
びTyrからなる群より選択され；
Fは、D-芳香族アミノ酸およびD-Hypeからなる群より選択され；
Gは、Oic、Aoc、Thz、オクタヒドロ-1H-イソインドール-1-カルボン酸、ピペコ
リン酸、Pro、4Hyp、アゼチジン-2-カルボン酸、Aib、Leu、Ile、Val、ならびに
Phe、Thi、Tic、インドリン-2-カルボン酸、ホモPhe、Trp、Tyr、およびNalであ
る芳香族アミノ酸、ならびにHypeからなる群より選択され；
Hは、Arg、Orn、Asp、Gln、およびLysからなる群より選択され；
Cnは、ヒドロキシル基、またはカルボキシアミド、アルコキシ、酸性脂肪族、塩
基性脂肪族、または中性脂肪族、芳香族、あるいはD型またはL型の環状アミノ酸
残基からなる群より選択される、Ｃ末端伸長部である。
最も好ましくは、
Eは、直接結合であるか、またはSer、Gly、およびValからなる群より選択され；
Fは、D-Phe、D-Tic、およびD-Hypeからなる群より選択され；
Gは、Phe、Oic、Aoc、Tic、およびHypeからなる群より選択され；
HはArgであり；そして
Cnが、ヒドロキシル基、アミド基、およびアルコキシ基からなる群より選択され
る。
好ましいZ'部分は、遠位端で正に荷電した基、通常は窒素を含有する部分を欠
く点を除いて、好ましいZ部分に対応する。Z'がアミノ酸を含有する部分である
場合、それは好ましくは、式E-F-G-Cn(ここで、E、F、およびG、ならびにCnは、
上記と同様である)を有する。
多くのアミノ酸を含有しないβターン模擬体(mimetic)が知られている。これ
らの分子は、-F-G-の代わりに本発明の化合物にこの基を組み込むために利用さ
れ得る。本明細書に記載した技術による、本発明のブラジキニンアンタゴニスト
化合物への組み込みを容易にするために、βターン模擬体はアミノ末端およびカ
ルボキシル末端を有するべきである。このようなβターン模擬体のいくつかは先
に記載の化合物によって例示されるが、それらに限定されない。これらには、フ
ェノキサチイン環系、例えば、１(M.Feigel、J Am.Chem.Soc.(1986)108:181-182
)、二環状ジペプチド、例えば、(3S,6S,9R)-2-オキソ-3-アミノ-7-チア-1-アザ
ビシクロ[4.3.0]ノナン-9-カルボン酸２(K.SatoおよびU.Nagui、J.Chem.Soc.Per
kin Trans.(1986)1231-1234)およびいくつかのその誘導体(U.NaguiおよびK.Sato
、Tet.Lettr.
(1985)26:647-650；U.NaguiおよびK.Sato：Deber,C.M.;Hruby,V.J.、
およびKopp1e,K.D.(編)Peptides ：Structure and Function，Proceedings of th e 9th American Peptide Symposition
、Pierce Chemical Co.、Rockford、IL、1
985、p.465)、９員-(例えば、３、G.L.Olsonら、J.Am.Chem.Soc.(1990)112:323-
333)、10員-(例えば、４、D.S.KempおよびW.E.Stites、Tet Lettr(1988)40:5057
-5060)およびSoc.(1988)110:1638-1639)の適度に束縛された環、ピペリジン(pip
erdine)環、例えば、3-アミノ-2-ピペリジン-6-カルボン酸６(D.S.KempおよびP.
E.McNamara、J.Org.Chem.(1984)49:2286-2288；D.S.KempおよびP.E.McNamara、J .Org.Chem.
(1985)50:5834-5838；D.S.KempおよびE.T.Sun、Tet Lettr.(1982)23:
3759-3760；D.S.KempおよびP.McNamara、Tet.Lettr.(1982)23:3761-3764)、スピ
ロサイクリック環系、例えば、1,δ-ジアザ-7-オキソスピロ[5.4]デカン-δ-酢
酸７(M.J.Ceninら、J.Org.Chem.(1993)51:860-866)および関連する化合物(M.G.H
indsら、J.Med.Chem.(1991)34:1777-1789)、ならびに5H-6-オキソ-2,3,4,4a,7,7
a-ヘキサヒドロピラノ[2,3-b]ピロール、例えば、８(J.L.Krstenanskyら、Bioch em.Biophys.Res.Commun.
(1982)109:1368-1374； J.L.Krstenanskyら、J.Heteroc yclic Chem.
(1992)29:707-711)を有する部分が含まれる。
本明細書および請求の範囲で使用される以下の用語をさらに定義する：
「オレフィン性アミノアルケノニル」とは、少なくとも１つの二重結合を含有
する２個〜18個の炭素の炭素鎖であり、ここで、２個〜４個の炭素は、必要に応
じて、アミノ酸結合（すなわち、N-末端アミノ基およびC-末端カルボニル基）を
有する環式構造に組み込まれる。このオレフィン性アミノアルケノニルのアルケ
ニル部分は、好ましくは炭化水素鎖であるが、炭素の置換（例えば、窒素による
置換）もまた包含し得る。
「Hype」は、本明細書において以下の構造を有するように定義される：
ここで、Ｒは、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ2〜Ｃ8アルケ
ニル、Ｃ2〜Ｃ8シクロアルキル、Ｃ3〜Ｃ8シクロアルキル置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル
、アリール基、置換アリール基（ここで、この置換基は、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1
〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン、またはトリフルオロメチルである）、アリールア
ルキル基、および式R1NHC(O)の基（ここで、R1はＣ1〜Ｃ6アルキルまたはアリー
ルである）からなる群から選択され、そしてここで、Ｘは SOnまたは酸素のいず
れかであり、ｎ＝０、１、または２である；
「カルボシル(carbocyle)」および「シクロアルキル」は、本明細書において
飽和環式炭化水素構造（例えば、シクロヘキシル、シクロプロピル、シクロブチ
ル、シクロペンチル、およびシクロヘプチル）として互いに交換可能に定義され
、この定義にはモノ−および多環式構造が包含される；
「オレフィン」および「シクロアルケニル」は、本明細書において少なくとも
１つの二重結合を含有する環式炭化水素構造として定義され、そして置換アリー
ル基（例えば、1,2-、1,3-および1,4-フェニレン、ベンジル、フェニル、シクロ
ヘキセニル、シクロヘキサジエニル、シクロペンタジエニル）を包含する。ナフ
チルのような多環構造もまたこの定義に包含される；
「偽ペプチド」は、部分的にアミノ酸（ペプチド性）の性質を有し、そして部
分的には有機化学物の性質を有するものである。最少２つのペプチド結合が取り
除かれ、そして有機分子により置換される。これらの有機分子は、それにより置
換される本発明の偽ペプチド中のアミノ酸の機能を保持する能力を有する；
「アルケニル」および「オレフィン」は、本明細書において少なくとも１つの
二重結合を含有する炭化水素構造として互いに交換可能に定義され、適切なアル
ケニルはまた、多数の二重結合を含有する炭化水素構造であり得、この二重結合
は、必要に応じて、環式構造（例えば、シクロアルケニル）に組み込まれ得る；
「アミノ酸結合」は、N-末端アミノ基およびC-末端カルボニル基を有する部分
により例示される；
「アルキル」は、パラフィン性炭化水素基であり、これは、アルカンより、そ
の式から１個の水素を引き抜くことにより、誘導され得、例えば、メチル、エチ
ル、プロピル、イソプロピル、ブチルなどがある；
「置換Ｃ1〜Ｃ6アルキル」は、メチルブチルのような分枝鎖アルキルである；
「アリール」は、フェニル、ナフチルのような芳香族環化合物である；
「置換アリール」は、置換芳香族環であり、これには、限定されないが、ニト
ロ置換、またはハロゲン置換が包含される；そして
「アラルキル」は、１個〜６個の炭素を含有する直鎖または分枝鎖アルキルを
通じて結合したアリール（例えば、フェニルプロピル基）である。
「直接結合」は、隣接するアミノ酸の間の特定のアミノ酸化合物を置換する結
合であり、このアミノ酸はまた、用語「ヌル(null)」により、非存在として示さ
れる。
表現「適切なアミン保護基」とは、反応からアミン部分を保護し、そして分子
の他の部分に影響しないように、穏やかな条件下で除去され得る基（例えば、Bo
c(t-ブチロキシカルボニル-)である。
本明細書で使用されるアミノ酸の略号の定義は以下の通りである：
「アミノ酸」は、アミノ基、カルボキシル基、水素原子、および炭素原子に結
合する特定のＲ基（側鎖）からなるタンパク質の基本構造単位である。天然に存
在する 20 種のアミノ酸があり、これらは以下の略号を有する：Ala がアラニ
ン；Argがアルギニン；Asnがアスパラギン；Aspがアスパラギン酸；Cysがシステ
イン；Glnがグルタミン；Gluがグルタミン酸；Glyがグリジン；Hisがヒシチジン
；Ileがイソロイシン；Leuがロイシン；Lysがリジン；Metがメチオニン；Phe が
フェニルアラニン；Pro がプロリン；Ser がセリン；Thr がトレオニン；Trp が
トリプトファン；Tyr がチロシン；そして Val がバリンである。また、多くの
周知の非天然に存在するアミノ酸も存在しており、それらには、限定されないが
、以下のものが包含される：Aibが2-アミノイソ酪酸(2-aminoisobytyric acid)
；Aocが(S,S,S)-2-アザビシクロ［3.3.0］オクタン-3-カルボン酸；Eac がε-ア
ミノカプロン酸；Nal がβ-2-ナフチルアラニン；Orn がオルニチン；デヒドロP
roが3,4-デヒドロプロリン；ホモPheがホモフェニルアラニン；4Hypが4-ヒドロ
キシプロリン；Sar がサルコシン；Thi がβ-2-チエニルアラニン；Thzがチオア
ゾリジン-4-カルボン酸；フェニルGlyが2-フェニルグリジン；Tic がテトラヒド
ロイソキノリン-3-カルボン酸(tetrahydroisquinoline-3-carboxylic acid)；Oi
c が(2S,3aS,7aS)-オクタヒドロ-1H-インドール-2-カルボン酸；プレニルが3-メ
チル-2-ブテニル基である。
「芳香族アミノ酸」は、１つまたはそれ以上の不飽和炭素環を有する天然また
は非天然に存在するアミノ酸であり、これには、限定されないが、Phe、Tic、Th
i、n-ベンジル Gly、ホモ Phe、Tyr、Trp、インドリン-s-カルボン酸、Nal が包
含される。
D-Hype(トランス-プロピル)は、4S-D-プロリルプロピルエーテルであり、そし
て以下で表される：
D-Hype(トランス-チオフェニル)は、4S-D-プロリルフェニルチオエーテルであ
り、D-4-ヒドロキシプロリントランスフェニルチオエーテルとしても、D-HypS(
トランス-フェニル)としても知られており、そして以下で表される：
D-Hype(トランス-フェニルプロピル)は以下で表される：
D-Hype(トランス-2-メチルブチル)は以下で表される：
D-Hype(トランス-エチル)は以下で表される：
D-Hype(トランス-メチル)は以下で表される：
Aoc は、V．Teetz，R．Geiger、および H．Gau1，Tetrahedron Lett.(1984):4
479の方法により調製され得る。Tic は、Bachem Biosciences から市販
されており、または K．Hayashi，Y．Ozaki，K．Nunami、および N．Yoneda,Che m ．Pharm Bull.
（1983）31:312の方法により調製され得る。
GlyおよびSerを除き、本明細書に記載の全てのアミノ酸残基は、好ましくは、
他に指示がなければ、L-配置である。しかし、７位のアミノ酸および誘導体はい
つも D-配置でなければならないが、８位のアミノ酸および誘導体は D-配置また
は L-配置のいずれかであり得ることが理解される。７位でヒドロキシプロリン
エーテルは、好ましくは、トランス配置であるに対して、８位でヒドロキシプロ
リンエーテルはシスまたはトランス配置のいずれかであり得る。アミノ酸、それ
らの誘導体、および保護基、ならびにペプチドおよびそれらの塩のために使用さ
れる符号または略号は、ペプチド化学で慣用のものである。（Biochem ．J.(1972
)126: 773を参照せよ）、この雑誌の内容は、本明細書中で参考として援用され
ている。
保護されたアミノ酸残基の誘導化、活性化、およびカップリングを含む本発明
のペプチドの合成、およびそれらの精製、ならびに同定および純度決定の分析方
法は、Houben Weyl Methoden der Organischen Chemie（1974）16 巻、液相合成
に関する部分ＩおよびII、ならびにSolid Phase Peptide Systhesis，(1984)、S
tewartおよびYoungにより、Merrifie1dの固相法による合成について記載されて
いるように、ペプチド化学の知識の一般内容に包含される。
ペプチド合成分野で熟練の化学者は、標準の溶液法により、もしくは手動でま
たは自動固相法により、本発明のペプチドを合成し得る。
７位または８位で使用される適切なヒドロキシプロリン置換基は、PCT 公報 W
O92/18155 号および WO 92/18156 号に記載されているプロセスにより調製され
、これらは、本明細書中で参考として援用されている。出発物質は市販されてお
り、そして周知の手法により調製され得る。シスおよびトランス立体異性体の両
方は、これらの手段により調製され得、そして本発明の範囲内にある。産業上の利用可能性
新規なブラジキニンアンタゴニストの治療用途は、動物によるブラジキニンま
たは関連のキニンの産生についての治療だけでなく、咬傷および刺創の結果とし
ての動物へのブラジキニンと関連するペプチドの注射をも包含する。本発明のブ
ラジキニンアンタゴニストの局所的利用単独または皮下利用との組み合わせは、
痛み、炎症、および腫脹を起こすブラジキニンと関連するペプチドの効果を治療
するために使用され得る。
本発明のブラジキニンアンタゴニストの治療用途は、ブラジキニンによって媒
介されるか、またはブラジキニンの過剰生産によって悪化されることが知られて
いる他の外傷性炎症状態または病理的状態についても成し遂げれられ得る。これ
らの状態は、炎症性障害（例えば、ショック、全身性炎症性反応症候群、膵炎、
および血管性水腫）、関節炎および炎症性腸疾患、痛みおよび炎症の全身的治療
、局所的外傷（例えば、創傷、熱傷、発疹）、気道疾患（例えば、喘息、鼻炎お
よびアレルギー）、ならびに神経系疾患（例えば、脊髄損傷、卒中、出血、外傷
、腫瘍、膿瘍および脳炎）を包含する。Ｂ1レセプターアンタゴニストである本
発明の化合物は、単独でまたはＢ2レセプターアンタゴニストとの組み合わせで
、持続性炎症性痛覚過敏症（例えば、慢性関節リウマチ）と関連する状態の治療
に対して有用である。
本発明の新規な化合物および組成物の非経口投与では、この化合物は水性注射
液に処方され得る。この注射液は、酸化防止剤、緩衝液、静菌薬などを含有し得
る。即時調合注射液は、無菌の丸剤、顆粒剤、または錠剤から調製され得る。こ
れらは希釈剤、分散剤および界面活性剤、バインダーならびに潤滑剤を含有し得
、これらの物質は当業者に周知である。
経口投与の場合、この化合物の微粉末または微粒剤が、希釈剤および分散剤な
らびに界面活性剤とともに処方され得、そして水またはシロップ、乾燥状態のカ
プセルまたはカシェ剤あるいは非水性懸濁液（ここで、懸濁剤が含有され得る）
中で調製され得る。この化合物は、任意のバインダーおよび潤滑剤とともに錠剤
の形態で、あるいは水またはシロップあるいはオイルの懸濁液、もしくは水／油
エマルジョンで投与され得、そして芳香剤、保存剤、懸濁剤、増粘剤、および乳
化剤を含有し得る。経口投与用の顆粒剤または錠剤はコートされ得るか、または
他の薬学的受容可能な製剤および処方物が利用され得る。これらは、薬学分野の
当業者に周知である。
固体または液体キャリアもまた使用され得る。固体キャリアは、デンブン、ラ
クトース、硫酸カルシウム二水和物、テラアルバ、スクロース、タルク、ゼラチ
ン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステア
リン酸を包含する。液体キャリアは、シロップ、ピーナツオイル、オリーブオイ
ル、生理食塩水、および水を包含する。軟膏剤およびクリームは、種々の周知の
親水性基剤および疎水性基剤を用いて調製される。局所的リザーバーは、所望の
放出特性を与えるのに選択される公知のポリマー性材料（例えば、種々のアクリ
ルベースのポリマー）を用いて適切に調製される。坐剤は、標準の基剤（例えば
、ポリエチレングリコールおよびココアバター）から調製される。
本発明による治療方法は、被検体に有効量の活性化合物を内服的または局所的
に投与することを包含する。本発明の方法における活性化合物およびそれを含有
する薬学的組成物の用量は、活性化合物の 0.01〜500mg/kg、好ましくは、0.1〜
50mg/kg の範囲から選択される、効果的、非毒性の量である。当業者は、慣用の
臨床試験を用いて、治療される特定の病気に最適な用量を決定し得る。所望の用
量は、毎日１〜６回またはそれ以上で、静脈内、経口、直腸、腸管外、局所、ま
たは吸入により、被検体に投与される。
ブラジキニンレセプターアンタゴニストとしての本発明の化合物の効果は、本
明細書に記載のブラジキニン結合および組織アッセイを用いて測定され得る。こ
れらのアッセイの結果は、この新規な化合物が強力で、選択性のあるブラジキニ
ンレセプターアンタゴニストであることを示す。
以下の実施例は、本発明の調製方法および化合物の好ましい実施態様を例示す
るが、本発明を限定すると理解されるべきではない。
本発明のブラジキニンアンタゴニストへの取り込みに有用な種々の特異的疎水
性スペーサー基(Ｙ)の調製を、以下の実施例１〜７に示す。
実施例１ 1,2- ベンゾ-8-tert-ブトキシカルボニル-4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4,5]デカン-
3- 酢酸
(1) 1,2-ベンゾ-4-ケト-8-メチル-3,8-ジアザスピロ[4.5]デカンの調製
オキシインドール6.65g(50mmol)のテトラヒドロフラン 100ml の攪拌溶液を−
78℃まで冷却し、そしてテトラヒドロフラン中のビス(トリメチルシリル)アミド
ナトリウムの 1M 溶液 250ml(250mmol)を滴下した。この混合物を−78℃で 30
分間攪拌し、次いで、塩酸N-メチルビス(2-クロロエチル)アミン9.63g(50mmol)
を加えた。この混合物を−78℃で 30 分間攪拌した後、これを周囲温度にし、そ
して攪拌を18時間続けた。水(100ml)を加え、そしてこの混合物をエーテルで３
回抽出した。エーテル抽出物をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃
縮した。クロマトグラフィー(シリカゲル、塩化メチレン中のメタノールの５〜5
0％グラジエントで溶出)により残渣を分離して、褐色結晶として、7.17g(66%)の
生成物（融点200〜205℃(分解)）を得た。
(2) メチル1,2-ベンゾ-8-メチル-4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4.5]デカン-3-ア
セテートの調製
水素化ナトリウム（1.60g、40mmol、鉱油中の 60％分散物）のジメチルホルム
アミド10 ml の攪拌懸濁液に、7.07g(32.7mmol)の1,2-ベンゾ-4-ケト-8-メチル-
3,8-ジアザスピロ[4.5]デカンのジメチルホルムアミド50ml の溶液を滴下した。
この混合物を０℃で30分間攪拌した後、メチルブロモアセテート3.8ml を加え、
次いで、この混合物を周囲温度で５時間攪拌した。
この混合物を水500ml に注ぎ、そして５部のエーテルで抽出した。エーテル抽
出物を水、次いで、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。ク
ロマトグラフィー(シリカゲルカラムにおいて、塩化メチレン中のメタノールの
１〜25％グラジエントで溶出)により残渣を分離して、結晶として、7.93g(84％)
の生成物(融点100〜103℃)を得た。
(3) メチル 1,2-ベンゾ-8-tert-ブトキシカルボニル-4-ケト-3,8-ジアザスピ
ロ[4.5]デカン-3-アセテートの調製
メチル 1,2-ベンゾ-8-メチル-4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4.5]デカン-3-アセテ
ート 3.26 ｇ(11.3mmol)、2,2,2-トリクロロエチルクロロホルメート7.5ml(45.1
mmol)、およびトルエン 100ml の混合物を攪拌し、そして18時間還流した。周囲
温度まで冷却した後、この混合物をエーテル200ml で希釈し、水で洗浄し、Na2S
O4で乾燥させ、そして濃縮した。残渣のオイルを酢酸 30ml に溶解させ、そして
亜鉛粉末10g を加えた。最初の発熱反応が収まった後、反応混合物を１時間攪拌
し、塩化メチレン 50ml を加え、そしてこの混合物をケイソウ土で濾過した。濾
液を水 50ml で希釈し、０℃まで冷却し、そして濃アンモニア水でアルカリ性に
した。分層を行い、水相を塩化メチレンで抽出した。合わせた有機溶液をブライ
ンで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。残渣をジオキサン50ml に溶
解させた。この溶液を０℃まで冷却し、ジオキサン 10ml 中のジ-tert-ブチルジ
カーボネートの溶液を加えた。25℃で 16 時間攪拌した後、反応混合物をエーテ
ル 100ml および水 25ml で希釈した。分層を行い、水相をエーテルで３回抽出
した。合わせた有機抽出物を水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そ
して濃縮した。クロマトグラフィー(シリカゲルカラムにおいて、塩化メチレン
中のメタノールの０〜５％グラジエントで溶出)により残渣を分離して、無色結
晶として、3.82g(90.3％)の生成物(融点135〜136℃)を得た。
(4) 1,2-ベンゾ-8-tert-ブトキシカルボニル-4-ケト-3,8-ジアザスピロ[4.5]
デカン-3-酢酸の調製
メチル 1,2-ベンゾ-8-tert-ブトキシカルボニル-4-ケト-3,δ-ジアザスピロ[4
.5]デカン-3-アセテート 3.76 ｇ(10mmol)、炭酸ナトリウム 4.24g(40mmol)、
メタノール 50ml、および水 50ml の攪拌混合物を２時間加熱還流した。メタノ
ール溶媒を蒸留で除去し、得られた溶液を水で希釈し、０℃まで冷却し、そして
5N の塩酸で酸性にした。この混合物を酢酸エチルで５回抽出した。抽出物をブ
ラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。エタノールから残渣を再
結晶化させることにより、結晶として 2.67g（74.2％）の生成物（融点 225〜22
8℃(分解)）を得た。
実施例２ 5-[2-(tert- ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-b]イン ドール]酢酸
(1) 2-カルボエトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-b]インドール
の調製
アルゴン下で、1-カルボエトキシ-4-ピペリドン 5.2g(30mmol)および塩酸フェ
ニルヒドラジン 4.34g(30mmol)のピリジン9 ml の攪拌混合物を 110〜115℃の油
浴で 18 時間加熱した。25℃まで冷却した後、この反応混合物を水で希釈し、そ
して酢酸エチルで抽出した。抽出物を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃
縮した。残渣をクロマトグラフィー（シリカゲルカラムにおいて、ヘキサン中の
酢酸エチルの０〜30％グラジエントで溶出)にかけ、無色結晶として 80％の生成
物(融点126〜127℃)を得た。
(2) メチル5-[2-カルボエトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-b]イ
ンドール]アセテートの調製
アルゴン下で５℃にて、水素化ナトリウム 264mg(11mmol)のジメチルホルムア
ミド 15 ml の攪拌懸濁液に、2-カルボエトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリ
ド[4,3-b]インドール2.44g(10mmol)のジメチルホルムアミド 15ml の溶液を滴下
した。この混合物を 25℃で 30 分間攪拌した後、メチルブロモアセテート1.53g
(10mmol)を加え、そして攪拌を 25℃で 24 時間続けた。反応混合物を、飽和塩
化アンモニウム水溶液 100ml の添加によってクエンチした。この混合物を酢酸
エチルで抽出した。抽出物を水で洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。
残渣をクロマトグラフィー(シリカゲルにおいて、ヘキサン中の酢酸エチルの０
〜30％グラジエントで溶出)にかけて、オイル状の生成物(67％)を得た。
(3) 5-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3
-b]インドール]酢酸の調製
メチル 5-[2-カルボエトキシ-1,2,3,4-テトラヒドロ-5H-ピリド[4,3-b]インド
ール]アセテート 1.63 ｇ(mmol)、10％の水酸化カリウム水溶液 5.2ml、および
エタノール 20ml の混合物を攪拌し、そして 20 時間還流した後、これを 25℃
まで冷却し、1N の塩酸の添加により、pH を９に調節し、ジ-tert-ブチルジカー
ボネート 1.5g(6.9mmol)を加え、そして攪拌をさらに 18 時間続けた。この混合
物を濃縮してエタノールを除去し、次いで、これを酢酸エチルで抽出した。抽出
物をNa2SO4で乾燥させ、そして濃縮した。固体残渣を酢酸エチルから再結晶化さ
せることにより、結晶状の固体として 1.1g の生成物(64％)(融点 202〜203℃)
を得た。
実施例３ 3-[9-[2-(tert- ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b] インドール]-プロパン酸
(1) 2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]
インドールの調製
水 120ml 中のジ-tert-ブチルジカーボネート(14.5ml、61.2mmol)を、25℃で
、1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール 10.1g(57.5mmol)および
炭酸ナトリウム6.17g(58.1mmol)、ならびに2-プロパノール 100mlの攪拌混合物
に加えた。25℃で 16 時間攪拌した後、この混合物を水 100ml で希釈し、そし
て酢酸エチルで抽出した。抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥さ
せ、そして濃縮した。固体残渣を酢酸エチル-ヘキサンから再結晶化させること
により、無色結晶として 15.36g(98％)の生成物(融点 150〜151℃)を得た。
(2) エチル3-[9-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-
ピリド[3,4-b]インドール]］プロパノエートの調製
アルゴン下で、鉱油中の水素化ナトリウム 80％分散物 0.4g(13.3mmol)のジメ
チルホルムアミド 50ml の攪拌懸濁液に、2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,
4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール 3.0g(11.0mmol)を分けて加えた。
この混合物を25℃で 30 分間攪拌した後、エチル3-ブロモプロパノエート1.6ml(
12.5mmol)を加えた。得られた混合物を周囲温度で16時間攪拌し、次いで、
これを 5N の塩酸でコンゴーレッドになるまで酸性化した。この混合物を酢酸エ
チルで抽出した。抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そし
て濃縮して、オイル状の粗生成物を得た。
(3) 3-[9-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[
3,4-b]インドール]］プロパン酸の調製
先に記載されるように調製した粗エチル 3-[9-[2-(tert-ブトキシカルボニル)
-1,2,3,4-テトラヒドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール]プロパノエートを、メタ
ノール 20ml に溶解させた。このメタノール溶液に、水酸化ナトリウム(3N、7.5
ml、2.25mmol)を加え、そして混合物を周囲温度で 16 時間攪拌した。この反応
混合物を水で希釈した後、これをエーテルで抽出した。水相を、5N の塩酸でpH
4にした。この混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥
させ、そして濃縮した。残渣固体をメタノール-酢酸エチルから再結晶化して、
微細な結晶として2.81g(74％)の生成物(融点 152〜153.5℃)を得た。
エチル 3-ブロモプロパノエートの代わりに、エチルブロモアセテートを用い
る本実施例の方法により、9-[2-(tert-ブトキシカルボニル)-1,2,3,4-テトラヒ
ドロ-9H-ピリド[3,4-b]インドール]酢酸を調製して、無色結晶(融点 80℃(分解)
)を得た。
実施例４ 7-(9- フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)-4-メチル-2-キノリノン-1-酢酸
(1) tert-ブチル7-アミノ-4-メチル-2-キノリノン-1-アセテートの調製
水素化ナトリウム(鉱油中の 80％分散物 450mg、15mmol)を、アルゴン下で０
℃にて、7-アミノ-4-メチル-2-キノロン(7-amino-4-methyl-2-quinoione)(J ．Or g.Chem．
(1991)56:980−983)2.5g(14.3mmol)のジメチルホルムアミド40ml の攪
拌溶液に加えた。この混合物を 25℃で 30 分間攪拌した後、tert-ブチルブロモ
アセテート 3g(15.4mmol)を加え、そして攪拌を 24 時間続けた。この混合物を
水200ml に注ぎ、塩化メチレンで３回抽出した。抽出物を水で洗浄し、Na2SO4で
乾燥させ、そして濃縮した。固体残渣を酢酸エチルから再結晶化させることによ
り、結晶として 2.6g(70％)の生成物(融点 191〜193℃)を得た。
(2) tert-ブチル7-(9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)-4-メチル-2-
キノリノン-1-アセテートの調製
9-フルオレニルメトキシカルボニルクロライド(2g、7.74mmol)を、tert-ブチ
ル 7-アミノ-4-メチル-2-キノリノン-1-アセテート 2g(6.94mmol)のジオキサン6
0ml の攪拌溶液に加えた。重炭酸ナトリウム0.84g の水 10ml の溶液を添加した
後、この混合物を 25℃で３時間攪拌した。次いで、9-フルオレニルメトキシカ
ルボニルクロライド 0.5g をさらに加え、そして攪拌を 25℃でさらに 20 時間
続けた。残渣を塩化メチレンに懸濁させ、そして濾過した。濾液を濃縮し、固体
残渣を塩化メチレン-酢酸エチルにより再結晶化して、結晶として 1.75g(32.8％
)の生成物(融点223〜224℃)を得た。
(3) 7-(9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)-4-メチル-2-キノリノン-
1-酢酸の調製
tert-ブチル7-(9-フルオレニルメトキシカルボニルアミノ)-4-メチル-2-キノ
リノン-1-アセテート 2g(3.92mmol)のトリフルオロ酢酸および塩化メチレンの１
：１混合物 60ml の溶液を 25℃で 24 時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、
そして残渣をクロロホルム-テトラヒドロフランにより再結晶化して、無色結晶
として 75g(93.5％)の生成物(融点256〜267℃)を得た。
実施例５
5-(3-tert- ブトキシカルボニルアミノ-6(5H)フェナントリジノン)酢酸
(1) メチル5-(3-ニトロ-6(5H)フェナントリジノン)アセテートの調製
アルゴン下で０℃にて、鉱油中の水素化ナトリウム80％分散物0.3g(10mmol)の
ジメチルホルムアミド 40ml の攪拌した混合物に、3-ニトロ-6(5H)フェナントリ
ジノン(Rare Chemlcal Collection，Aldrich Chemical Co.，Milwaukee,WI)2.0g
(8.3mmol)を分けて加えた。混合物を 30 分間攪拌し、次いで、メチルブロモア
セテート0.95ml(10mmol)を加え、そして攪拌を25℃で20時間続けた。沈澱した生
成物を濾過し、水で洗浄し、そして減圧デシケーター中の五酸化リンにより乾燥
させた。固体生成物をさらに精製することなく、さらなる反応に用いた。
(2) メチル 5-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-6(5H)フェナントリジノン
)アセテートの調製
パー装置(Parr apparatus)中、25℃および60psi の初期水素圧力で、上記のよ
うに調製したメチル 5-(3-ニトロ-6(5H)フェナントリジノン)アセテートの粗固
体 1.70g(5.4mmol)、10％の炭素担持パラジウム触媒 100mg、およびエタノール1
00ml の混合物を 24 時間水素化した。この混合物を濾過し、そして濾液を減圧
下で濃縮した。この残渣、ジ-tert-ブチルジカーボネート 2.38g(10mmol)、炭酸
ナトリウム 0.87g、2-プロパノール 20ml、および水 20ml の混合物を 25℃で 4
8時間攪拌した後、これを 5N の塩酸でpH ３になるまで調節し、そして酢酸エチ
ルで抽出した。抽出物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、そして
減
圧下で濃縮した。この残渣をカラムクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチ
ル：ヘキサン＝１：４)にかけることにより、オイル状の生成物 0.45g(22％)を
得た。
(3) 5-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-6(5H)フェナントリジノン)-酢酸
の調製
メチル 5-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-6(5H)フェナントリジノン)アセ
テート 0.88g(2.3mmol)および炭酸ナトリウム 1.0g(9.4mmol)のメタノール 25ml
および水 25ml の攪拌混合物を２時間加熱還流した。メタノール性溶媒を蒸留で
除去し、次いで、反応混合物を5N の塩酸でpH ３になるまで調節した。沈澱した
固体を酢酸エチル-ヘキサンにより再結晶化して、黄色結晶としての生成物(融点
259〜261℃)を得た。
実施例６ 1-(tert- ブトキシカルボニル-4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロン-3-酢酸
(1) 1-(1-tert-ブトキシ-4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロンの調製
1-(4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロン 5.13g(23.1mmol)、炭酸ナトリウ
ム 3.71g(35mmol)、およびジ-tert-ブチルジカーボネート 5.5ml(23.9mmol)の水
40ml および2-プロパノール40ml の混合物を 25℃で 16 時間攪拌した。この混
合物を酢酸エチルで抽出した後、合わせた抽出物をブラインで洗浄し、そして硫
酸ナトリウムで乾燥させた。溶媒を除去することにより、固体残渣を得た。この
残渣を酢酸エチルにより再結晶化して、無色結晶として 6.20g(92％)の生成物(
融点162〜163℃)を得た。
(2) エチル 1-(1-tert-ブトキシカルボニル-4-ピペリジニル)-2-ベンズイミ
ダゾロン-3-アセテートの調製
アルゴン下で、水素化ナトリウム0.76g(25.3mmol)のテトラヒドロフラン 85ml
の攪拌懸濁液に、1-(1-tert-ブトキシカルボニル-4-ピペリジニル)-2-ベンズイ
ミダゾロン 5.08g(16.0mmol)を加えた。この混合物を周囲温度で 30 分間攪拌し
た後、エチルヨードアセテート 2.1ml(17.4mmol)を滴下した。得られた混合物を
還流温度で５時間、そして周囲温度で 16 時間攪拌し、次いで、これを減圧下で
濃縮した。残渣の酢酸エチル溶液を 0.1N の塩酸、飽和重炭酸ナトリウム水溶液
およびブラインで連続的に洗浄した後、これを硫酸ナトリウムで乾燥させ、そし
て濃縮した。この残渣をフラッシュクロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチ
ル：ヘキサン＝１：１)にかけることにより、無定形固体として 4.41g(68％)の
生成物を得た。
(3) 1-(1-tert-ブトキシカルボニル-4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロン
-3-酢酸の調製
エチル 1-(1-tert-ブトキシカルボニル-4-ピペリジニル)-2-ベンズイミダゾロ
ン-3-アセテート4.20g(10.4mmol)のメタノール30mlの攪拌溶液に、3N の水酸化
ナトリウム5.8ml(17.4mmol)を滴下した。得られた混合物を 25℃で 16 時間攪拌
した後、水を加え、そしてこれをエーテルで抽出した。水相を 5N の塩酸でコン
ゴーレッドになるまで酸性化し、混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物を硫酸
ナトリウムで乾燥させ、そして濃縮した。この残渣を酢酸エチル-メタノールに
より再結晶化して、無色の結晶として3.60g(93％)の生成物(融点208〜210℃)を
得た。
実施例７
N- ベンゾイル-N-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノフェニル)グリジン
(1) N-ベンゾイル-3-ニトロアニリンの調製
25℃でアルゴン下にて、3-ニトロアニリン 5.0g(35.5mmol)およびトリエチル
アミン 6.0ml(452.6mmol)の塩化メチレン 100ml の攪拌混合物に、塩化ベンゾイ
ル(5.0ml、43.1mmol)を滴下した。得られた混合物を周囲温度で16時間攪拌し、1
N の塩酸、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、およびブラインで連続的に洗浄し、Na2
SO4で乾燥させ、そして濃縮した。残渣を塩化メチレンにより再結晶化して、微
細な結晶として6.59g(77％)の生成物(融点 154〜155℃)を得た。
(2) エチルN-ベンゾイル-N-(3-ニトロフェニル)グリシネートの調製
25℃でアルゴン下にて、鉱油中の水素化ナトリウムの 80％分散物0.93g(31mmo
l)のジメチルホルムアミド 75ml の攪拌懸濁液に、N-ベンゾイル-3-ニトロアニ
リン5.0g(20.6mmol)を分けて加えた。この混合物を25℃で30分間攪拌した後、エ
チル2-ブロモアセテート 3.5ml(31mmol)を滴下し、そして攪拌を３時間続けた。
この混合物を飽和塩化アンモニウム水溶液 100ml でクエンチし、そして酢酸エ
チルで３回抽出した。抽出物をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、そして濃
縮した。クロマトグラフィー(シリカゲル、酢酸エチル：ヘキサン＝
１：３)により、残渣を分離して、淡黄色のオイルとして 6.35g(94％)の生成物
を得た。
(3) エチル N-ベンゾイル-N-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノフェニル)
グリシネートの調製
パー装置において、25℃および 60psi の初期水素圧力で、エチル N-ベンゾイ
ル-N-(3-ニトロフェニル)グリシネート 3.01g(9.0mmol)、ジ-tert-ブチルジカー
ボネート 3.0ml(12.7mmol)、10％の炭素担持パラジウム触媒 0.6g、およびエタ
ノール 100ml の混合物を 24 時間水素化した。混合物を濾過し、そして濾液を
濃縮した。酢酸エチル-ヘキサンから、結晶状の残渣を再結晶化させることによ
り、白色の結晶として3.32g(92％)の生成物(融点 129.5〜131.5℃)を得た。
(4) N-ベンゾイル-N-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノフェニル)グリジン
の調製
エチル N-ベンゾイル-N-(3-ベンジルオキシカルボニルアミノフェニル)グリシ
ネート 1.3g(3.3mmol)のメタノール 15ml の攪拌溶液に、3N の水酸化ナトリウ
ム2.5ml(7.5mmol)を加えた。この混合物を25℃で 16 時間攪拌し、次いで、メタ
ノール溶媒を蒸留で除去した。得られた溶液を、5N の塩酸でpH ３になるまで調
節し、そして得られた混合物を酢酸エチルで抽出した。抽出物をNa2SO4で乾燥さ
せ、そして濃縮して固体残渣を得た。酢酸エチル-ヘキサンからこの固体を再結
晶化させることにより、微細な結晶として 0.9g(74％)の生成物(融点 170〜171.
6℃)を得た。
実施例８
Ｂ2レセプターアンタゴニスト化合物の合成
標準固相法およびt-Boc化学を用いて、表Ｉに示される化合物を手動で合成し
た。
１．この目的のために、Boc-Arg(Tos)-PAM 樹脂を使用した。アミノ酸および
スキームＩ〜XIV、または実施例１〜７に記載され、あるいは共有の、共に係属
中の特許出願に教示されるように調製した疎水性有機部分(Ｙ)のBoc 保護の誘導
体が、化合物の順番に従って導入された。
２．脱保護：N-末端の t-Boc 保護は、トリフルオロ酢酸／塩化メチレン(１：
１)で樹脂-aa／樹脂-ペプチドを２分間処理し、次いで、30 分間の同様の処理に
より達成された。
３．次いで、この樹脂を塩化メチレンおよびエタノールで洗浄し、そして10％
のトリエチルアミン／塩化メチレンまたは 10％のジイソプロピルエチルアミン
／塩化メチレンで中和させた。
４．カップリング：
全てのカップリングを、アミノ酸の活性エステルを用いて行った。個々のアミ
ノ酸の活性エステルを、固相合成への導入の前に生成した。この目的のために、
０℃で、ジメチルホルムアミドまたは塩化メチレン／ジメチルホルムアミド(１
：１)中で、５当量（樹脂上の第１のアミノ酸の負荷に対して）のアミノ酸、ヒ
ドロキシベンゾトリアゾール水和物およびジシクロヘキシルカルボジイミドまた
はジイソプロピルカルボジイミドを 30 分間インキュベートした。樹脂上に遊離
のアミンが検出されなくなるまで、定性ニンヒドリン分析(Kaiser test)を用い
てカップリングを続けた。異なる非天然のアミノ酸は、ニンヒドリン分析の際に
、異なった行動をとり、そして樹脂の色(脱保護およびカップリングの後)は、使
用される特定のアミノ酸に依存する。
５．カップリングの後、この合成の他のサイクルの開始の前に、樹脂-ペプチ
ドをジメチルホルムアミドおよび塩化メチレンで洗浄した。
６． 10％のアニソール(スカベンジャー)の存在下で、HF(10mL/g樹脂)を用い
て、仕上げたペプチジル-樹脂をこの樹脂から切断した。HF を除去した後、この
ペプチド樹脂をエーテルで洗浄し、そしてこのペプチドを 0.1％TFA または0.2
％酢酸で抽出した。凍結乾燥により、粗ペプチドを生じ、この段階で、通常、断
片状の黄色固体を得た。
７．この粗ペプチドを、Ｃ18カラムにて、水／アセトニトリル(共に 0.1％ト
リフルオロ酢酸または 0.2％酢酸を含有する)のグラジエントを用いる逆相高速
液体クロマトグラフィーを用いて精製した。純粋な画分を、Vydac C18カラムに
て、水／アセトニトリル(共に 0.1％トリフルオロ酢酸を含有する)のグラジエン
トを用いる分析用の HPLC により測定し、一緒にプールし、そして凍結乾燥させ
て、断片状の白色固体を得た。
８．ペプチドを、Vydac C18カラムにて、水／アセトニトリル(共に 0.1％のト
リフルオロ酢酸を含有する)のグラジエントを用いる分析用の逆相 HPLC、および
高速原子衝撃質量分析により分析した。
実施例９
Ｂ1レセプターアンタゴニスト化合物の合成
実施例８で調製した化合物(ここでは、C-末端アルギニンが削除されている)に
対応するＢ1レセプターアンタゴニストは、類似の方法で調製される。固相合成
は、商業的供給者(Advanced Chemtech，Louisville，KY)から得られる Boc-Oic-
PAM 樹脂を用いて開始される。
実施例１０
ブラジキニン結合手順 モルモット回腸結合
3H-ブラジキニンの結合を、D．C．Manning，R．Vavrek，J．M．Stewartおよび
S．H．Snyder，J ．Pharmacol．Exp．Ther.,（1986）237: 504 の方法を用いて行
った。結合アッセイで使用する組織は、雄 Hartley モルモット(150〜350g)から
の末端回腸であった。解剖の後、組織を、20 容量の氷冷緩衝液Ａ(0.2g/1 の1,1
0 フェナントロリンを含有する 25mM TES、水酸化アンモニウムで pH6.8 に調製
した)中に置き、そしてPloytron Tissumizer を用いて、セッティング６で15秒
間均質化した。ホモジェネートを、50,000×ｇで 10 分間遠心分離し、上清を捨
て、そしてペレットを、Polytron を用いる均質化により、氷冷の緩衝液Ａに再
懸濁させた。各組織を３回、均質化および遠心分離した。最終のペレットを、最
終容量が、170ml／最初の組織の重量(g)、になるまで、ウシ血清アルブミン(1g/
l)およびバシトラシン(Bacitracin)(0.14g/1)を含有する緩衝液Ａに再懸濁させ
た。この結合アッセイは、12×75 mm ポリプロピレンチューブ中の 1mM(3H-ブラ
ジキニン(20,000 dpm、最終のアッセイ容量では約 0.3 nM)50 μ l、緩衝液Ａ中
の置換剤 100 μ l、および組織ホモジェネート 750 μl)からなる。各トレー
には、最大の結合を測定するための、薬剤を添加していないチューブ、および特
異的結合を測定するための、ブラジキニン(最終濃度１μ M)を添加したチューブ
がある。特異的結合は、全結合の 96〜98％を占めた。チューブを周囲温度で 90
分間インキュベートした。アッセイを、ポリエチレンイミン(2g/l)で２時間予め
処理した WhatmanGF/B ガラス繊維フィルター上、Brandel Tissue Harvester を
用いる濾過により、続いて、氷冷の 50mM Tris(pH7.4)の４×１ ml のアリコー
トで洗浄することにより、終わらせた。液体シンチレーションスペクトロメトリ
による定量の前に、フィルターを、Ready-Safe Flour(Beckman)に少なくとも 90
分間溶解させた。Ｋd値を、飽和結合を用い、そして EBDA(G．A．MacPherson，J.Pharmcol ．Methods
（1985）213)に続く LIGAND(P．J．Munson．D．Rodbard,A nal ．Biochem.
（1980）220)による分析により測定した。Ｋi値を、競合性の分析
に続いてEBDAおよびLIGANDを用いることにより測定した。ヒトブラジキニンレセプター結合
ヒトブラジキニンＢ2レセプターを、Hess ら(Biochem ．Biophys．Res．Comm.(
1992)184: 260−268)によりクーロン化した。ヒトブラジキニンＢ2レセプターを
、CHO/K 細胞で発現した。要するに、ヒト子宮λ gt10 cDNA ライブラリー(Clon
tech Laboratories; Palo Alto，CA)からの約２×106のプラークを、ラットＢ2
レセプターのコード領域を含有する PCR フラグメントを用いてスクリーニング
した。プローブは、α[32P]dATP の存在下で、ランダムプライム合成(random-pr
imed systhesis)により生成した。二つのフィルターを、1M NaCl、50mM Tris pH
7.5、５Ｘ Denhardt's、200 μg/ml サケ*** DNA、１％SDS、および20％ホルム
アミド中で 42℃にて、一晩ハイブリダイズした。これらのフィルターを、65℃
で、１Ｘ SSC および１％SDS 中にて洗浄した。２つのフィルターで一致して陽
性にハイブリダイズしているプラークを精製し、そして同じプローブおよびスト
リンジェンシーな条件で再スクリーニングした。配列決定のために、陽性クーロ
ンの EcoRI フラグメントを、Bluescript／KSII＋ベクター(Stratagene；La Jol
la，CA)に挿入した。
クーロン化されたヒトＢ2レセプターのヌクレオチド配列を、二本鎖 DNA およ
びジデオキシ鎖終止法を用いて決定した。このクーロンの 5'非翻訳末端から 3'
非翻訳末端にあるBglII 部位までのヌクレオチド配列を同定するために、既知の
ラット配列および配列決定されたヒト配列の両方からの市販のＴ３およびＴ７オ
リゴヌクレオチド(USB；Cleveland、OH)、および合成 21-mer オリゴヌクレオチ
ド(DNA/RNA Synthesizer; Applied Biosystems Inc.; Palo Alto，CA)を使用し
た。哺乳動物の細胞株で発現するために、１つの全長のクーロンであるHindIII/
XbaI フラグメント 126A を pcDNAI neo ベクター(Invitrogen；San Diego，CA)
に挿入した。
CHO/K 細胞を、６ウェルプレートあたり２ ml の成長培地(10％FBS を有するH
am's F12)にプレートし、そしてこれらが 60％の集密になるまで、37℃、５％CO2
でインキュベートした。各ウェルについて、４、12、および16μｇのDNAを、10
0μｌのOpti-MEMＩの減少血清培地(Gibco/BRL；Gaithersburg，MD)に希釈した。
12μｌの TransfectASE 試薬(Gibco/BRL)を、100μｌのOpti-MEM Ｉの別のアリ
コートに希釈した。この DNA および TransfectASE 溶液を組み合わせ、穏やか
に混合し、そして25℃で15分間インキュベートした。次いで、Opti-MEMＩで、こ
の溶液を 1ml になるまで希釈した。各ウェルを Opti MEMＩで２回洗浄し、そし
て各ウェルに、DNA/TransfectAse の複合物 1ml を加えた。37℃および５％CO2
で５時間のインキュベーションの後、各ウェルに、20％FBS を含む 1ml の Ham'
sF12を加え、そして細胞を一晩インキュベートした。培地を成長培地で置き換え
、そしてさらに24時間インキュベートした。
細胞を、トリプシン処理により回収し、そして選択培地(Ham's F12，10％FBS
および 500 μ g/ml Geneticin(Gibco/BRL))に再プレートした。培地を、２週間
の間、48 時間毎に置き換えた。選択後に残る任意のコロニーを、別の 10cm 皿
に移し、集密になるまで成長させ、そして3H-NPC17731（Burch ら(DuPont Biote
ch update（1992）4:127−140)に記載されているブラジキニンアンタゴニストペ
プチド）の結合により、陽性クーロンを決定した。このレセプターを発現するコ
ロニーを、限定希釈で取り出した。細胞を増殖させ、そして陽性クーロンを、先
のように同定した。H2O.2 と命名された細胞株を用いて、本発明の化合物のヒト
ブラジキニンＢ2レセプターへの結合を定量した。放射線リガンド結合アッセイ
このアッセイは、トリチウム標識ブラジキニンまたはトリチウム標識NPC17731
(Ｂ2レセプターに結合し、そしてブラジキニンアンタゴニストとして作用するこ
とが知られているブラジキニンアナログ)で、ヒトＢ2レセプターへの結合につい
て競合するブラジキニンアンタゴニスト化合物の能力を測定する。
H2O.2細胞を、10％FBSおよび500μg/ml のGeneticinを含有する Ham's F12培
地で、集密になるまで成長させた。成長培地を吸い出し、そして単層を、Ca++お
よび Mg++を含有しない Dulbecco's PBS で１回洗浄した。細胞を、Dulbecco'sP
BS でかきとり、そして 2,000×gで 10 分間遠心分離した。ペレットを、25mM T
ES、1mM 1,10-フェナントロリン pH6.8 緩衝液に再懸濁させ、そして Polytron
を用いて、セッティング５で 10 秒間均質化した。BioRad タンパク質アッセイ
キットを用いるタンパク質決定のために、アリコートを取った。膜を、４℃で48
,000×ｇにて 10 秒間遠心分離した。ペレットを、0.1％BSA および 0.014％バ
シトラシンを含有する TES緩衝液に再懸濁させた。0.5ml アリコートを液体N2で
凍結し、そして−80℃で２週間まで貯蔵した。
先に調製した H2O.2 細胞からの膜を 37℃でとかし、そして BSA およびバシ
トラシンを含有する、25mM TES、１μM 1,10-フェナントロリン(pH6.8)に希釈し
た。飽和結合アッセイのために、濃度が増加する3H-ブラジキニン(3HBK)または3
H-NPC17731(Ｂ2レセプターに結合し、そしてアミノ酸配列を有する既知のブラジ
キニンアンタゴニスト)を、同じ緩衝液３ ml の全容量中の膜タンパク質 16.5
μｇと共にインキュベートした。非特異的結合を、１μMブラジキニンで測定し
た。このチューブを、25℃で 90 分間インキュベートし、そしてアッセイを、0.
2％PEI で３時間予め濡らしたWhatmanGF/B フィルター上への速やかな真空濾過
により、続いて、２×３ ml アリコートの氷冷 50mM Tris(pH7.4)により終わら
せた。放射活性を、ベックマンシンチレーションカウンター(Beckman scintilla
tion counter)で計数した。全細胞結合アッセイ
24-ウェルプレートに成長させた、ヒトＢ2レセプター(7,000fmol/レセプター/
mg)を発現するトランスフェクト細胞の集密単層への結合を、４℃で、細胞を、1
0-10M 3H-ブラジキニンおよび種々の濃度の非標識アナログを含有する１ ml 細
胞
結合緩衝液(PBS/Ca/Mg、１％BSA、0.14mg/mlバシトラシン)に４〜10時間インキ
ュベートすることにより測定した。細胞を細胞結合緩衝液で３回洗浄し、そして
0.1N NaOH で溶解させた。溶解物のアリコートを計数して、結合された放射活性
を測定した。
実施例１１
モルモット回腸収縮アッセイ
モルモットの腸を取り出し、Tyrodes溶液を含有するPetri皿に置き、そして３
〜４cmのセグメントに切断した。コットンアプリケーター(cotton applicator)
を用いて、基本環状筋（underlying circular muscle）から縦走筋を分離した(P
atonおよびZar，J ．Physiol.（1968）194: 13)。筋ストリップを、フィジオグラ
フ(physiograph)とつないだ等力-変位トランスデェーサー(isometric force-dis
placement transducers)(GrassまたはGou1d)に連結させ、そして37℃で、Tyrode
's溶液を含有する組織バスに置いた。各調製物を、２ｇの静止張力下で懸濁させ
た。
この組織の平衡の後、適切な容量のブラジキニン溶液を、10ml 組織バスに少
量ずつ加えて、各単独の用量の後で流出させずに、このバス中のブラジキニン濃
度を段階的に増加させた。より高い濃度を、進んでいる収縮が安定な値に達成し
た後でのみ加えた。次の濃度工程が収縮をさらに増加させなかったとき、最大の
効果が得られたと仮定し、組織をブラジキニンを除去するために洗浄し、そして
15分間回復させた。アンタゴニストの存在に対するブラジキニン反応の拮抗作用
を、この組織がこのアンタゴニストに５分間曝された後に、ブラジキニンの少量
ずつの添加工程を繰り返すことにより測定した。アンタゴニストの３つまたは４
つの異なる濃度を、同じ調製物で連続的に研究した。反応を、アンタゴニストの
非存在下で、ブラジキニンにより引き出された最大濃度のパーセントとして表現
した。pA2値をSchild分析により計算した。アッセイの結果
表Ｉは、本発明の種々のブラジキニンアンタゴニスト化合物について、先に記
載された種々のアッセイで得られた結果を例挙する。また、多くの化合物のＹ部
分についての原子容量(立方オングストロームで表す)は、先に記載されたPearls
teinの方法に従って計算され、そして表Ｉに示されている。
実施例１２
Ｂ1レセプターアンタゴニスト活性の測定
インビボで炎症反応に介在するＢ1レセプターと拮抗する本発明の偽ペプチド
の能力は、リポ多糖で予め処理したウサギにおけるdes Arg9-ブラジキニンが誘
導する低血圧症を阻害するこの偽ペプチドの能力を試験することにより確認され
得る。Ｂ1レセプターは、リポ多糖およびインターロイキン-1を含む炎症誘導物
質の存在下で、上昇制御され、そして des Arg9-ブラジキニンに反応して、低血
圧症を含む炎症反応を生じることが知られている。
雄ニュージーランド白ウサギ(1.5〜2.0Kg)を、フェノバルビタールナトリウム
(i.v.)で麻酔する５時間前に、新たに作成したLPS溶液(10μg/100ml)で予め処理
する。平均動脈血圧を記録するために、左頸動脈にカニューレ挿入を行い、そし
てdes Arg9-ブラジキニン(1μg/kg)および試験される偽プチドのために、左頸静
脈にカニューレ挿入を行う。動物を、des Arg9-ブラジキニン(３ｘ)の巨丸剤(bo
lus)で、５分間の間隔でパルスして、基礎低血圧反応を生じる。次いで、試験の
偽ペプチドを、des Arg9-ブラジキニンの前に、巨丸剤として投与し、そしてＢ1
-介在の低血圧反応を拮抗するその能力（阻害率(％)で表す）を測定する。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ０７Ｄ 215/38 Ｃ０７Ｄ 471/10 １０１
221/12 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ
471/04 １０２ ＡＢＥ
471/10 １０１ ＡＡＨ
(31)優先権主張番号 ０８／１１８，９８１
(32)優先日 1993年９月９日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／１１９，３４１
(32)優先日 1994年９月９日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／２８１，９０４
(32)優先日 1994年７月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／２８１，９０６
(32)優先日 1994年７月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／２８１，９０７
(32)優先日 1994年７月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(31)優先権主張番号 ０８／２８１，９０８
(32)優先日 1994年７月28日
(33)優先権主張国 米国（ＵＳ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ
(72)発明者 ル，ジジアン
アメリカ合衆国 ニュージャージィ
07076，スコッチ プレインズ，カントリ
ー クラブ レーン 225