JPH11341984A - Hhv―8感染と関連する疾患の診断と治療 - Google Patents
Hhv―8感染と関連する疾患の診断と治療Info
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- JPH11341984A JPH11341984A JP11107279A JP10727999A JPH11341984A JP H11341984 A JPH11341984 A JP H11341984A JP 11107279 A JP11107279 A JP 11107279A JP 10727999 A JP10727999 A JP 10727999A JP H11341984 A JPH11341984 A JP H11341984A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】HHV-8感染及びHHV-8によって直接または間接に
引き起こされる疾患の診断及び治療に対する新規な手段
の提供。 【解決手段】本発明は、タンパク質カポシンまたはその
誘導体の抗原決定基(エピトープ)に特異的に結合し認
識可能なモノクローナル抗体に向けられている。この抗
体を用いて、HHV-8感染に関する疾患の診断及び治療が
可能である。
引き起こされる疾患の診断及び治療に対する新規な手段
の提供。 【解決手段】本発明は、タンパク質カポシンまたはその
誘導体の抗原決定基(エピトープ)に特異的に結合し認
識可能なモノクローナル抗体に向けられている。この抗
体を用いて、HHV-8感染に関する疾患の診断及び治療が
可能である。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、タンパク質カポシ
ンまたはその誘導体の抗原決定基(エピトープ)を特異
的に認識可能で、それらに結合可能なモノクローナル抗
体、上記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系、カポシンタンパク質またはその誘導体に対して
向けられた抗体と同様にカポシンタンパク質またはその
誘導体の存在の検出のための診断システム、生物学的サ
ンプル中のカポシンタンパク質またはその誘導体の発現
の検出法、カポシンタンパク質またはその誘導体に対し
て向けられた抗体の検出法、本発明にしたがって提供さ
れるモノクローナル抗体の使用、及び診断及び治療のそ
れぞれにおけるカポシンタンパク質またはその誘導体の
使用に向けられている。
ンまたはその誘導体の抗原決定基(エピトープ)を特異
的に認識可能で、それらに結合可能なモノクローナル抗
体、上記モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系、カポシンタンパク質またはその誘導体に対して
向けられた抗体と同様にカポシンタンパク質またはその
誘導体の存在の検出のための診断システム、生物学的サ
ンプル中のカポシンタンパク質またはその誘導体の発現
の検出法、カポシンタンパク質またはその誘導体に対し
て向けられた抗体の検出法、本発明にしたがって提供さ
れるモノクローナル抗体の使用、及び診断及び治療のそ
れぞれにおけるカポシンタンパク質またはその誘導体の
使用に向けられている。
【0002】
【従来の技術】ヒトヘルペスウイルス8は、全ての形態
のカポジ肉腫、初期滲出リンパ腫(PEL)、キャッスルマ
ン病、血管肉腫、移植を経験した患者の皮膚病変、プラ
スマ細胞腫、サルコイドーシス、同様に健康な対象患者
において検出されている(Chang et al.,1994;Boshoff a
nd Weiss,1997)。血清疫学的研究により、北部及び中央
ヨーロッパにおいてHHV-8は危険群に実質的に制限され
ており、地理及び年齢に関して大きな差異が存在するこ
とが示されている。
のカポジ肉腫、初期滲出リンパ腫(PEL)、キャッスルマ
ン病、血管肉腫、移植を経験した患者の皮膚病変、プラ
スマ細胞腫、サルコイドーシス、同様に健康な対象患者
において検出されている(Chang et al.,1994;Boshoff a
nd Weiss,1997)。血清疫学的研究により、北部及び中央
ヨーロッパにおいてHHV-8は危険群に実質的に制限され
ており、地理及び年齢に関して大きな差異が存在するこ
とが示されている。
【0003】さらにこれらの研究は、カポジ肉腫を有す
る患者において、HHV-8に対するセロコンバージョンが
カポジ肉腫の診断の前数ヶ月か数年間で検出可能であ
り、HHV-8は性的交渉を介して一次的に転移するようで
あることを示すことができた。今日では初期HHV-8感染
の臨床上の兆候は未知である。全てのカポジ肉腫のほぼ
100%でのHHV-8の検出、HHV-8の発生を有する局部的な血
清有病率とカポジ肉腫の発生の前のセロコンバージョン
の相関関係のため、HHV-8は少なくともKSの腫瘍形成に
おけるコファクターを表すことが今日考えられている。
今までのところ、上記記載の他の疾患におけるHHV-8の
役割は明らかではなく、HHV-8が他の今まで非同定のの
疾患に関与しているかどうかの疑問が今だ答えられてい
ない。
る患者において、HHV-8に対するセロコンバージョンが
カポジ肉腫の診断の前数ヶ月か数年間で検出可能であ
り、HHV-8は性的交渉を介して一次的に転移するようで
あることを示すことができた。今日では初期HHV-8感染
の臨床上の兆候は未知である。全てのカポジ肉腫のほぼ
100%でのHHV-8の検出、HHV-8の発生を有する局部的な血
清有病率とカポジ肉腫の発生の前のセロコンバージョン
の相関関係のため、HHV-8は少なくともKSの腫瘍形成に
おけるコファクターを表すことが今日考えられている。
今までのところ、上記記載の他の疾患におけるHHV-8の
役割は明らかではなく、HHV-8が他の今まで非同定のの
疾患に関与しているかどうかの疑問が今だ答えられてい
ない。
【0004】分類学的に、配列ホモロジーに基づいて、
HHV-8はガンマヘルペスウイルス亜科に属し、EBV及びHe
rpesvirus saimiriに非常に関連している。HHV-8ゲノム
はサイズにおいて140kbであり、およそ800bpの長さを有
するいくつかの繰り返し配列が並んでいる(Russo et a
l.,1996)。HHV-8は約80のタンパク質をコードしてお
り、その内の10は細胞遺伝子産物とホモロジーを有する
(Neipel et al.,1997)。全ての他のヘルペスウイルスと
同様に、HHV-8は溶解性感染を引き起こし、それから潜
伏感染となる。潜伏期においては、少なくとも2のウイ
ルス転写産物が発現される:v-サイクリン、v-フリップ
及びLANAタンパク質、同様にT0.7をコードする異なって
スプライスされるmRNAであり、T0.7は長さにおいて0.7k
bの短いRNAであり、今までのところ機能は未知である(Z
hong et al.,1996)。ウイルス転写産物T0.7は潜伏期に
発現される最もたくさんあるRNAであり、60,35及び47ア
ミノ酸に相当する3のオープンリーディングフレームを
有する。
HHV-8はガンマヘルペスウイルス亜科に属し、EBV及びHe
rpesvirus saimiriに非常に関連している。HHV-8ゲノム
はサイズにおいて140kbであり、およそ800bpの長さを有
するいくつかの繰り返し配列が並んでいる(Russo et a
l.,1996)。HHV-8は約80のタンパク質をコードしてお
り、その内の10は細胞遺伝子産物とホモロジーを有する
(Neipel et al.,1997)。全ての他のヘルペスウイルスと
同様に、HHV-8は溶解性感染を引き起こし、それから潜
伏感染となる。潜伏期においては、少なくとも2のウイ
ルス転写産物が発現される:v-サイクリン、v-フリップ
及びLANAタンパク質、同様にT0.7をコードする異なって
スプライスされるmRNAであり、T0.7は長さにおいて0.7k
bの短いRNAであり、今までのところ機能は未知である(Z
hong et al.,1996)。ウイルス転写産物T0.7は潜伏期に
発現される最もたくさんあるRNAであり、60,35及び47ア
ミノ酸に相当する3のオープンリーディングフレームを
有する。
【0005】今までのところHHV-8感染は、HHV-8-特異
的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応によって検出されている。この直接的な検出法
は、(i)たくさんの労力と費用を必要とする(約5から10
回について血清学的検出の価格)、(ii)不純物のために
擬陽性の結果の疑いがある、(iii)急性の感染のみを検
出しより早いものは検出できない、及び(iv)末梢血液を
用いた場合全ての(急性)感染患者の50%で検出される
のみであるという欠点を有する。
的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ
連鎖反応によって検出されている。この直接的な検出法
は、(i)たくさんの労力と費用を必要とする(約5から10
回について血清学的検出の価格)、(ii)不純物のために
擬陽性の結果の疑いがある、(iii)急性の感染のみを検
出しより早いものは検出できない、及び(iv)末梢血液を
用いた場合全ての(急性)感染患者の50%で検出される
のみであるという欠点を有する。
【0006】今まで開発された血清学的検出法は、HHV-
8感染細胞系の使用または組換えウイルスタンパク質の
それぞれに基づく。免疫蛍光によるHHV-8-ポジティブ細
胞系上のHHV-8に対して向けられた抗体を検出するアッ
セイは、(i)その再生産性が低い(すなわちHHV-8細胞系
に対する培養条件を絶対的に一定にキープすることは不
可能なため)、(ii)その評価は機械によって実施され
ず、そのためアッセイをより大きい数の試験に不適切に
する、及び(iii)他のウイルスに対する抗体の交差反応
を排除することは部分的に困難であるという欠点を有す
る。組換えウイルスタンパク質に基づくアッセイの全て
の一般的な問題は、その低感受性である。この問題は、
抗体が該ウイルスの特定のタンパク質に対してのみ生産
され、異なる患者は異なるタンパク質に対する抗体を部
分的に生産するという事実に基づく。血清学的な診断に
おいてその利用性のため今日試験されるウイルスタンパ
ク質は、30から80%の間のみの感受性しか有しない。図
1は例示的に、マイナーキャプシドタンパク質VP23に対
する抗体が、KSタンパク質のわずか30%のみで検出され
うることを示す(図1)。一つのウイルスタンパク質以
上の使用がより感受性なアッセイを開発するために必要
であるようである。
8感染細胞系の使用または組換えウイルスタンパク質の
それぞれに基づく。免疫蛍光によるHHV-8-ポジティブ細
胞系上のHHV-8に対して向けられた抗体を検出するアッ
セイは、(i)その再生産性が低い(すなわちHHV-8細胞系
に対する培養条件を絶対的に一定にキープすることは不
可能なため)、(ii)その評価は機械によって実施され
ず、そのためアッセイをより大きい数の試験に不適切に
する、及び(iii)他のウイルスに対する抗体の交差反応
を排除することは部分的に困難であるという欠点を有す
る。組換えウイルスタンパク質に基づくアッセイの全て
の一般的な問題は、その低感受性である。この問題は、
抗体が該ウイルスの特定のタンパク質に対してのみ生産
され、異なる患者は異なるタンパク質に対する抗体を部
分的に生産するという事実に基づく。血清学的な診断に
おいてその利用性のため今日試験されるウイルスタンパ
ク質は、30から80%の間のみの感受性しか有しない。図
1は例示的に、マイナーキャプシドタンパク質VP23に対
する抗体が、KSタンパク質のわずか30%のみで検出され
うることを示す(図1)。一つのウイルスタンパク質以
上の使用がより感受性なアッセイを開発するために必要
であるようである。
【0007】その頻度に関して、カポジ肉腫は臓器移植
の後生ずる腫瘍の第三の地位にあり、現在の知見にした
がってその発生はHHV-8感染と密接に関連しているた
め、さらに臓器ドナー及び可能であれば血液産物も、例
えば現在実施されているHIV、B型肝炎及びC型肝炎に対
する強制的試験と同様にHHV-8に対しても試験されるで
あろうことが予想される。
の後生ずる腫瘍の第三の地位にあり、現在の知見にした
がってその発生はHHV-8感染と密接に関連しているた
め、さらに臓器ドナー及び可能であれば血液産物も、例
えば現在実施されているHIV、B型肝炎及びC型肝炎に対
する強制的試験と同様にHHV-8に対しても試験されるで
あろうことが予想される。
【0008】部分的に、KSの地位は非常に可変的であ
る。皮膚を通じて生じないKSは、免疫欠損患者にほぼ極
端に制限されており、一般的に悪性の経過を有する。そ
れは化学療法(リポソーム化ドクソルビシンのよう
な)、手術または放射線療法によって治療されるが、穏
やかな回復しか見込めない。回想的な研究により、殺ウ
イルス剤Foscarnet及びGancyclovirが有効であることが
示されている。KSに対する殺ウイルス剤の有効性に関す
るより大きく期待される研究は、今日まで発表されてい
ない。また現在まで見過ごされていることは、HHV-8が
検出されているB細胞リンパ腫に対する均一の治療スケ
ジュールである。化学療法のスケジュールは広く用いら
れており、非ホジキンリンパ腫の治療において一般的に
用いられた。
る。皮膚を通じて生じないKSは、免疫欠損患者にほぼ極
端に制限されており、一般的に悪性の経過を有する。そ
れは化学療法(リポソーム化ドクソルビシンのよう
な)、手術または放射線療法によって治療されるが、穏
やかな回復しか見込めない。回想的な研究により、殺ウ
イルス剤Foscarnet及びGancyclovirが有効であることが
示されている。KSに対する殺ウイルス剤の有効性に関す
るより大きく期待される研究は、今日まで発表されてい
ない。また現在まで見過ごされていることは、HHV-8が
検出されているB細胞リンパ腫に対する均一の治療スケ
ジュールである。化学療法のスケジュールは広く用いら
れており、非ホジキンリンパ腫の治療において一般的に
用いられた。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】それ故、HHV-8感染及
びHHV-8によって直接または間接に引き起こされる疾患
の診断及び治療に対する新規な手段を提供することが、
本発明の目的である。
びHHV-8によって直接または間接に引き起こされる疾患
の診断及び治療に対する新規な手段を提供することが、
本発明の目的である。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明にしたがって、こ
の目的は請求項1に特徴付けされたモノクローナル抗
体、同様に従属クレームにより詳細に特徴付けされたハ
イブリドーマ細胞系、診断システム、検出方法、及び使
用によって達成される。本発明の好ましい実施態様は、
従属クレームから明らかである。
の目的は請求項1に特徴付けされたモノクローナル抗
体、同様に従属クレームにより詳細に特徴付けされたハ
イブリドーマ細胞系、診断システム、検出方法、及び使
用によって達成される。本発明の好ましい実施態様は、
従属クレームから明らかである。
【0011】本発明にしたがって、カポシンタンパク質
またはその誘導体のエピトープを特異的に認識し、上記
エピトープに結合するモノクローナル抗体が提供され
る。本発明にしたがった「エピトープ」とは、モノクロ
ーナル抗体によって認識され、モノクローナル抗体が結
合しうるカポシンペプチドまたはタンパク質またはその
誘導体の抗原決定基を意味するように企図される。
またはその誘導体のエピトープを特異的に認識し、上記
エピトープに結合するモノクローナル抗体が提供され
る。本発明にしたがった「エピトープ」とは、モノクロ
ーナル抗体によって認識され、モノクローナル抗体が結
合しうるカポシンペプチドまたはタンパク質またはその
誘導体の抗原決定基を意味するように企図される。
【0012】カポシンペプチドの誘導体には、カポシン
ペプチド誘導体の一つのエピトープに向けられた抗体が
HHV-8感染を特異的に検出するのに有用であるという条
件で、一つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及
び/または化学的修飾によって形成されている上記カポ
シンペプチドの一つのアミノ酸配列が含まれる。
ペプチド誘導体の一つのエピトープに向けられた抗体が
HHV-8感染を特異的に検出するのに有用であるという条
件で、一つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及
び/または化学的修飾によって形成されている上記カポ
シンペプチドの一つのアミノ酸配列が含まれる。
【0013】本発明によって提供されるモノクローナル
抗体は、カポシンペプチドまたはその誘導体の細胞質領
域または細胞外領域に存在するエピトープを認識する。
抗体は、カポシンペプチドまたはその誘導体の細胞質領
域または細胞外領域に存在するエピトープを認識する。
【0014】本発明で用いられるモノクローナル抗体
は、以下のペプチドの一つのエピトープに対して特異的
に向けられている: (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG。
は、以下のペプチドの一つのエピトープに対して特異的
に向けられている: (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG。
【0015】さらなる実施態様には、表1のペプチド15
及び16よりなる以下の配列、QRGPVAFRTRVAもまた含む。
及び16よりなる以下の配列、QRGPVAFRTRVAもまた含む。
【0016】本発明のもう一つの実施態様として、モノ
クローナル抗体は少なくとも5,少なくとも6,または
少なくとも7のアミノ酸の長さを有するそのペプチド断
片(誘導体)に対して向けられている。
クローナル抗体は少なくとも5,少なくとも6,または
少なくとも7のアミノ酸の長さを有するそのペプチド断
片(誘導体)に対して向けられている。
【0017】本発明にしたがった「カポシンタンパク
質」は、図3に示されたアミノ酸配列を有するタンパク
質、または該タンパク質の部分的配列(ペプチド)を意
味することが企図される。本発明によって含まれるもの
はまた、上記記載のペプチド、及び該誘導体がHHV-8感
染の特異的な検出に有用であるという条件で、及び/ま
たはモノクローナル抗体がHHV-8感染の及び疾患の診断
及び/または治療に対して有用な、カポシンペプチドの
誘導体に対して向けられたカポシンペプチド誘導体の一
つのエピトープに向けられているという条件で、一つ以
上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化
学的修飾によって形成されている一つのアミノ酸配列を
有するその誘導体である。
質」は、図3に示されたアミノ酸配列を有するタンパク
質、または該タンパク質の部分的配列(ペプチド)を意
味することが企図される。本発明によって含まれるもの
はまた、上記記載のペプチド、及び該誘導体がHHV-8感
染の特異的な検出に有用であるという条件で、及び/ま
たはモノクローナル抗体がHHV-8感染の及び疾患の診断
及び/または治療に対して有用な、カポシンペプチドの
誘導体に対して向けられたカポシンペプチド誘導体の一
つのエピトープに向けられているという条件で、一つ以
上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化
学的修飾によって形成されている一つのアミノ酸配列を
有するその誘導体である。
【0018】また本発明は、上記のように詳細に特性指
摘されるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系に関する。
摘されるモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系に関する。
【0019】本発明にしたがって、キットの形態の診断
システムもまた提供される。これらの診断システムは、
2の実施態様において存在する。
システムもまた提供される。これらの診断システムは、
2の実施態様において存在する。
【0020】
【発明の実施の形態】第一の実施態様として、診断シス
テムは上記定義されているカポシンタンパク質またはそ
の誘導体の検出のために機能する。該診断システムは、
上記詳細に定義されている少なくとも一つのモノクロー
ナル抗体を容器内に含む。典型的には該キットシステム
は、ラベル化または非ラベル化形態の抗体、必要なイン
キュベーションを実施するための試薬、及び用いられる
ラベリングに依存して用いられるであろう基質または誘
導化試薬を含む。
テムは上記定義されているカポシンタンパク質またはそ
の誘導体の検出のために機能する。該診断システムは、
上記詳細に定義されている少なくとも一つのモノクロー
ナル抗体を容器内に含む。典型的には該キットシステム
は、ラベル化または非ラベル化形態の抗体、必要なイン
キュベーションを実施するための試薬、及び用いられる
ラベリングに依存して用いられるであろう基質または誘
導化試薬を含む。
【0021】生物学的サンプルにおけるカポシンタンパ
ク質またはその誘導体の存在または発現のそれぞれの検
出は、例えば以下のように実施される:該サンプルを上
記記載のモノクローナル抗体と接触させ、該抗体が該サ
ンプルの抗原構成要素に結合し得るような条件下でそれ
を実施する;それから該サンプル中の抗原構成要素に結
合する抗体の割合を測定する。
ク質またはその誘導体の存在または発現のそれぞれの検
出は、例えば以下のように実施される:該サンプルを上
記記載のモノクローナル抗体と接触させ、該抗体が該サ
ンプルの抗原構成要素に結合し得るような条件下でそれ
を実施する;それから該サンプル中の抗原構成要素に結
合する抗体の割合を測定する。
【0022】サンプルとして、例えば体液、生きた細
胞、細胞抽出物、または組織が用いられるであろう。該
抗体の結合の割合は例えば、免疫細胞化学的染色または
免疫組織化学的染色によって測定される。
胞、細胞抽出物、または組織が用いられるであろう。該
抗体の結合の割合は例えば、免疫細胞化学的染色または
免疫組織化学的染色によって測定される。
【0023】本発明の第二の実施態様として該診断シス
テムは、体液、生きた細胞、細胞抽出物または組織のよ
うなサンプル中に存在するモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体を検出することが可能なようにデザインさ
れる。この目的のため、上記定義され及び請求項1のカ
ポシンペプチドまたはその誘導体は、適切な容器内に適
切な形態で提供され、該タンパク質またはその誘導体は
検出されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いた免疫学的反応を実施することが可能である。該サ
ンプルは、カポシンペプチドまたはその誘導体に対して
向けられたサンプル中に存在するまたは存在すると推定
される抗体の結合を可能にするのに適した条件下で、カ
ポシンペプチドまたはその誘導体と接触される;さらに
カポシンペプチドまたはその誘導体に対するサンプル中
の抗体の結合の割合が測定される。
テムは、体液、生きた細胞、細胞抽出物または組織のよ
うなサンプル中に存在するモノクローナルまたはポリク
ローナル抗体を検出することが可能なようにデザインさ
れる。この目的のため、上記定義され及び請求項1のカ
ポシンペプチドまたはその誘導体は、適切な容器内に適
切な形態で提供され、該タンパク質またはその誘導体は
検出されるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を
用いた免疫学的反応を実施することが可能である。該サ
ンプルは、カポシンペプチドまたはその誘導体に対して
向けられたサンプル中に存在するまたは存在すると推定
される抗体の結合を可能にするのに適した条件下で、カ
ポシンペプチドまたはその誘導体と接触される;さらに
カポシンペプチドまたはその誘導体に対するサンプル中
の抗体の結合の割合が測定される。
【0024】それ故、本発明の方法は特に、モノクロー
ナル抗体を用いて処理されるサンプルのインキュベーシ
ョン、または逆にカポシンペプチドまたはその誘導体に
対して向けられたモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を含むことが推定される、処理されるサンプル
とそのカポシンペプチドのインキュベーションを含む。
本発明にしたがって「インキュベーション」とは、抗体
とサンプル物質を接触するいかなる他の手段をもいう。
適用される上記イムノアッセイを実施する多くの考え得
る基本的な方法が周知である。これらの方法には、例え
ばRIA、ELISA、沈降法、凝集法、相補的固定法、及び免
疫蛍光法が含まれる。モノクローナル抗体もしくはカポ
シンペプチドまたはその誘導体は、ラベル化された形態
で存在する。抗体またはタンパク質のラベル化形態の調
製に用いられるラベルには、ラジオラベル及び蛍光色素
のような直接的に検出可能な基、同様に検出のために反
応または誘導化しなければならない酵素のような基が含
まれる。ラジオラベルは、いかなる周知の方法によって
も検出される。酵素ラベリングは、本質的に周知である
いかなる熱量測定法、分光測定法、蛍光分光測定法、ま
たは気体測定法によって検出される。該酵素は、カルボ
ジイミド、ペリオダート、ジイソシアナート、グルタル
アルデヒドのような架橋分子を介して抗体に結合され
る。これらの方法においては、本質的に周知の多くの酵
素が用いられる。例としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グル
コシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グ
ルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、及び酸性
ホスファターゼがある。用いられる蛍光物質としては、
例えばフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及び
その誘導体、オーラミン、ルシフェリン、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチ
ーム、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが含
まれる。抗体は本質的に周知の方法によってこれらのラ
ベルに結合される。結合試薬の例としては、上記記載の
フルオレセイン、化学発光試薬及び酵素ラベルを提供す
るために、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミ
ド、イミダート、スクシンイミドがある。
ナル抗体を用いて処理されるサンプルのインキュベーシ
ョン、または逆にカポシンペプチドまたはその誘導体に
対して向けられたモノクローナル抗体またはポリクロー
ナル抗体を含むことが推定される、処理されるサンプル
とそのカポシンペプチドのインキュベーションを含む。
本発明にしたがって「インキュベーション」とは、抗体
とサンプル物質を接触するいかなる他の手段をもいう。
適用される上記イムノアッセイを実施する多くの考え得
る基本的な方法が周知である。これらの方法には、例え
ばRIA、ELISA、沈降法、凝集法、相補的固定法、及び免
疫蛍光法が含まれる。モノクローナル抗体もしくはカポ
シンペプチドまたはその誘導体は、ラベル化された形態
で存在する。抗体またはタンパク質のラベル化形態の調
製に用いられるラベルには、ラジオラベル及び蛍光色素
のような直接的に検出可能な基、同様に検出のために反
応または誘導化しなければならない酵素のような基が含
まれる。ラジオラベルは、いかなる周知の方法によって
も検出される。酵素ラベリングは、本質的に周知である
いかなる熱量測定法、分光測定法、蛍光分光測定法、ま
たは気体測定法によって検出される。該酵素は、カルボ
ジイミド、ペリオダート、ジイソシアナート、グルタル
アルデヒドのような架橋分子を介して抗体に結合され
る。これらの方法においては、本質的に周知の多くの酵
素が用いられる。例としては、ペルオキシダーゼ、アル
カリホスファターゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グル
コシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グ
ルコースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、ガラク
トースオキシダーゼプラスペルオキシダーゼ、及び酸性
ホスファターゼがある。用いられる蛍光物質としては、
例えばフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及び
その誘導体、オーラミン、ルシフェリン、セイヨウワサ
ビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチ
ーム、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが含
まれる。抗体は本質的に周知の方法によってこれらのラ
ベルに結合される。結合試薬の例としては、上記記載の
フルオレセイン、化学発光試薬及び酵素ラベルを提供す
るために、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミ
ド、イミダート、スクシンイミドがある。
【0025】抗体及びラベル化抗体及びここで生産され
るペプチドは、患者においてB細胞リンパ腫のようなHHV
-8によって直接または間接に引き起こされる疾患を検出
するために、及び/または該疾患の状態をモニターする
ために用いられる。この目的のため、質的または量的な
イムノアッセイ法のそれぞれが用いられる。該アッセイ
法には、直接的及び間接的な検出法が含まれる。もし該
サンプルが例えばカポジ肉腫細胞を含んでいたならば、
ラベル化抗体はこれらの細胞に結合するであろう。非結
合ラベル化抗体を除去するための組織または細胞の洗浄
に引き続き、該サンプルをラベル化免疫複合体について
調べる。間接的検出法においては、組織または細胞サン
プルまたは体液を、非ラベル化モノクローナル抗体を用
いて処理する。それから該サンプルを、モノクローナル
抗体に対して向けられたラベル化抗体を用いて処理し、
洗浄し、三成分の複合体の存在を調べる。
るペプチドは、患者においてB細胞リンパ腫のようなHHV
-8によって直接または間接に引き起こされる疾患を検出
するために、及び/または該疾患の状態をモニターする
ために用いられる。この目的のため、質的または量的な
イムノアッセイ法のそれぞれが用いられる。該アッセイ
法には、直接的及び間接的な検出法が含まれる。もし該
サンプルが例えばカポジ肉腫細胞を含んでいたならば、
ラベル化抗体はこれらの細胞に結合するであろう。非結
合ラベル化抗体を除去するための組織または細胞の洗浄
に引き続き、該サンプルをラベル化免疫複合体について
調べる。間接的検出法においては、組織または細胞サン
プルまたは体液を、非ラベル化モノクローナル抗体を用
いて処理する。それから該サンプルを、モノクローナル
抗体に対して向けられたラベル化抗体を用いて処理し、
洗浄し、三成分の複合体の存在を調べる。
【0026】診断目的のために、該抗体及びカポシンペ
プチドも典型的にはキットの形態で存在するであろう。
プチドも典型的にはキットの形態で存在するであろう。
【0027】該抗体の治療上の使用の説明 in vivoでの治療において、本抗体は患者に対して治療
上の有効量(すなわちHHV-8によって直接または間接に
引き起こされる疾患を消失させるまたは緩和する量)で
投与される。これは一般的に、非経口的経路または静脈
内経路によってなされる。投与量及び処方は、治療され
る疾患と患者の性質に依存する。
上の有効量(すなわちHHV-8によって直接または間接に
引き起こされる疾患を消失させるまたは緩和する量)で
投与される。これは一般的に、非経口的経路または静脈
内経路によってなされる。投与量及び処方は、治療され
る疾患と患者の性質に依存する。
【0028】本発明にしたがって用いられるカポシンペ
プチドの誘導体、または本発明にしたがって検出される
カポシンペプチドの誘導体は好ましくは、一つ以上のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化学的修
飾によって形成されるカポシンペプチドのアミノ酸配列
を含む。しかしながら上記タイプの誘導化方法の最終産
物は常に、HHV-8感染またはHHV-8感染によって誘導化さ
れる疾患の特異的な検出を可能にするようにデザインさ
れる。
プチドの誘導体、または本発明にしたがって検出される
カポシンペプチドの誘導体は好ましくは、一つ以上のア
ミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化学的修
飾によって形成されるカポシンペプチドのアミノ酸配列
を含む。しかしながら上記タイプの誘導化方法の最終産
物は常に、HHV-8感染またはHHV-8感染によって誘導化さ
れる疾患の特異的な検出を可能にするようにデザインさ
れる。
【0029】本発明において、カポシンペプチドまたは
その誘導体はそれぞれ、カポシンペプチドまたはその誘
導体の細胞内領域及び細胞外領域に存在するエピトープ
を含む。該ペプチドは以下のアミノ酸配列を有する: (a) AIPPLVCLLA;または (b) QRGPVAFRTRVATG。
その誘導体はそれぞれ、カポシンペプチドまたはその誘
導体の細胞内領域及び細胞外領域に存在するエピトープ
を含む。該ペプチドは以下のアミノ酸配列を有する: (a) AIPPLVCLLA;または (b) QRGPVAFRTRVATG。
【0030】さらなる実施態様は以下の配列を示す: (c) QRGPVAFRTRVA。
【0031】カポシンペプチドの断片は、少なくとも
5,少なくとも6または少なくとも7のアミノ酸を長さ
を有する。本発明にしたがって提供されるモノクローナ
ル抗体は、カポシンペプチドまたは上記詳細に記載され
るカポシンペプチドの誘導体に対して向けられている。
5,少なくとも6または少なくとも7のアミノ酸を長さ
を有する。本発明にしたがって提供されるモノクローナ
ル抗体は、カポシンペプチドまたは上記詳細に記載され
るカポシンペプチドの誘導体に対して向けられている。
【0032】本発明は、HHV-8を用いた感染によって直
接または間接に引き起こされる疾患の診断及び治療にお
いて用いられる。これらには例えば、カポジ肉腫、AIDS
疾患及びB細胞リンパ腫が含まれる。
接または間接に引き起こされる疾患の診断及び治療にお
いて用いられる。これらには例えば、カポジ肉腫、AIDS
疾患及びB細胞リンパ腫が含まれる。
【0033】また、本発明によって提供されるカポシン
ペプチド、または上記詳細に特徴付けされるカポシンペ
プチドの誘導体は、HHV-8感染、AIDS疾患、カポジ肉腫
及びB細胞リンパ腫の診断及び治療に用いられる。
ペプチド、または上記詳細に特徴付けされるカポシンペ
プチドの誘導体は、HHV-8感染、AIDS疾患、カポジ肉腫
及びB細胞リンパ腫の診断及び治療に用いられる。
【0034】(実施例)潜伏期の方法でHHV-8によって
感染された細胞は、少なくとも2のウイルス転写産物を
発現する。潜伏期の最もたくさんのウイルスmRNA、T0.7
は、0.7kbの長さを有し、3の短いオープンリーディング
フレーム(ORF)を有する。今までいかなるこれらのORFの
翻訳も示されていない。第一のORFは、わずか60アミノ
酸に相当する長さを有する。たくさんの文献において、
二つのみの膜貫通タンパク質が記載されており、それら
は14kdより小さく(ponticulin及びL-selectin)、これは
T0.7が全て翻訳されるかどうか、または同時に発見され
たT1.1/nut-1転写産物(長さにおいて62アミノ酸のORF
を等しくコードする)に似たそれが調節機能を有してい
るかどうかが明白でないためである。本出願は、「カポ
シン」と呼ばれるT0.7の第一のORFの以下の研究に基づ
いている。
感染された細胞は、少なくとも2のウイルス転写産物を
発現する。潜伏期の最もたくさんのウイルスmRNA、T0.7
は、0.7kbの長さを有し、3の短いオープンリーディング
フレーム(ORF)を有する。今までいかなるこれらのORFの
翻訳も示されていない。第一のORFは、わずか60アミノ
酸に相当する長さを有する。たくさんの文献において、
二つのみの膜貫通タンパク質が記載されており、それら
は14kdより小さく(ponticulin及びL-selectin)、これは
T0.7が全て翻訳されるかどうか、または同時に発見され
たT1.1/nut-1転写産物(長さにおいて62アミノ酸のORF
を等しくコードする)に似たそれが調節機能を有してい
るかどうかが明白でないためである。本出願は、「カポ
シン」と呼ばれるT0.7の第一のORFの以下の研究に基づ
いている。
【0035】1.HHV-8感染細胞におけるT0.7転写産物
(「カポシン」)の第一のORFの発現 出願人は、T0.7転写産物の第一のオープンリーディング
フレーム、「カポシン」がHHV-8感染細胞において実際
に翻訳されていることを示すことができた。第一のORF
の配列は、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)
融合タンパク質の形態で大腸菌において発現され、アフ
ィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。該
組換え融合タンパク質を、モノクローナル抗体(mab)の
調製のために用いた。この目的のため、Lou/Cラットを
免疫化し、標準的な方法にしたがって脾臓細胞をミエロ
ーマ細胞系P3C63Ag8.653を用いて融合した。該抗体をEL
ISAによって組換え融合タンパク質を用いてスクリーニ
ングし、組換えGSTを用いて再スクリーニングした。kap
5C4 mabはウエスタンブロットにおいて組換えカポシン
融合タンパク質を認識するが、GSTは認識しない。ペプ
チドマッピングによって、kap5C4 mabは、C末端でペプ
チド配列QRGPVAFRTRVAを認識することが見出された。HH
V-8感染細胞系の細胞溶解物において、タンパク質はウ
エスタンブロット、免疫沈降、及び引き続く該配列を基
礎に予想される6kdの長さを有する表面ビオチン化によ
って同定することができた(図3a)。
(「カポシン」)の第一のORFの発現 出願人は、T0.7転写産物の第一のオープンリーディング
フレーム、「カポシン」がHHV-8感染細胞において実際
に翻訳されていることを示すことができた。第一のORF
の配列は、GST(グルタチオン-S-トランスフェラーゼ)
融合タンパク質の形態で大腸菌において発現され、アフ
ィニティークロマトグラフィーを用いて精製された。該
組換え融合タンパク質を、モノクローナル抗体(mab)の
調製のために用いた。この目的のため、Lou/Cラットを
免疫化し、標準的な方法にしたがって脾臓細胞をミエロ
ーマ細胞系P3C63Ag8.653を用いて融合した。該抗体をEL
ISAによって組換え融合タンパク質を用いてスクリーニ
ングし、組換えGSTを用いて再スクリーニングした。kap
5C4 mabはウエスタンブロットにおいて組換えカポシン
融合タンパク質を認識するが、GSTは認識しない。ペプ
チドマッピングによって、kap5C4 mabは、C末端でペプ
チド配列QRGPVAFRTRVAを認識することが見出された。HH
V-8感染細胞系の細胞溶解物において、タンパク質はウ
エスタンブロット、免疫沈降、及び引き続く該配列を基
礎に予想される6kdの長さを有する表面ビオチン化によ
って同定することができた(図3a)。
【0036】2.細胞表面上のカポシンの発現 カポシンは、HHV-8感染細胞系の表面に発現されること
が免疫蛍光によって示された(図3b及びc)。図3b
は、カポシンが固定化され浸透化されたBCBL-1細胞(初
期滲出リンパ腫から確立されたHHV-8ポジティブ、EBVネ
ガティブ細胞系)においてkap5C4 mabによって認識され
る。さらに該図は、カポシンが非浸透化細胞においても
検出可能であり、それ故細胞表面上に位置しているに違
いないことを示す。免疫蛍光により、細胞表面分子に対
して典型的な周縁での染色が示される。図3cは、kap5
C4またはMHCクラス1に対するコントロール抗体を用い
て染色されたBCBL-1細胞のフローサイトメトリー分析を
示す。kap5C4 mabを用いた発現はネガティブコントロー
ルよりも約1log高く明らかにポジティブであることが
明白である。kap5C4はカポシンのC末端を認識するの
で、該結果はカポシンがタイプIIタンパク質(N末端が
細胞質に位置している)であることを一つの方法として
説明しているに違いない。
が免疫蛍光によって示された(図3b及びc)。図3b
は、カポシンが固定化され浸透化されたBCBL-1細胞(初
期滲出リンパ腫から確立されたHHV-8ポジティブ、EBVネ
ガティブ細胞系)においてkap5C4 mabによって認識され
る。さらに該図は、カポシンが非浸透化細胞においても
検出可能であり、それ故細胞表面上に位置しているに違
いないことを示す。免疫蛍光により、細胞表面分子に対
して典型的な周縁での染色が示される。図3cは、kap5
C4またはMHCクラス1に対するコントロール抗体を用い
て染色されたBCBL-1細胞のフローサイトメトリー分析を
示す。kap5C4 mabを用いた発現はネガティブコントロー
ルよりも約1log高く明らかにポジティブであることが
明白である。kap5C4はカポシンのC末端を認識するの
で、該結果はカポシンがタイプIIタンパク質(N末端が
細胞質に位置している)であることを一つの方法として
説明しているに違いない。
【0037】3.多数のHHV-8感染細胞におけるカポシ
ンの発現 出願人によって研究されたVP23マイナーキャプシドタン
パク質のような溶解性タンパク質は、ホルボールエステ
ル及び/またはn-ブチラートを用いた誘導の後のみでHH
V-8+細胞系によって発現される。免疫組織化学により、
KS組織のほとんどにおいて、紡錘細胞のほんの少量の部
分のみが、VP23に対してvp4G2 mabを用いてポジティブ
である(図4)。対照的にHHV-8+細胞系は、以前の誘導
なしで構成的な方法でカポシンを発現する。細胞系及び
染色方法に依存して、ポジティブ細胞のパーセンテージ
は10から80%より大きい数字の間で変化する。免疫組織
化学もまた、kap5C4 mabによって染色された細胞の数
は、vp4G2ポジティブ細胞よりもずっと大きい。おそら
くより感受性の染色法を用いると、全ての紡錘細胞の主
要な部分が、カポシンに対してポジティブであろう。
ンの発現 出願人によって研究されたVP23マイナーキャプシドタン
パク質のような溶解性タンパク質は、ホルボールエステ
ル及び/またはn-ブチラートを用いた誘導の後のみでHH
V-8+細胞系によって発現される。免疫組織化学により、
KS組織のほとんどにおいて、紡錘細胞のほんの少量の部
分のみが、VP23に対してvp4G2 mabを用いてポジティブ
である(図4)。対照的にHHV-8+細胞系は、以前の誘導
なしで構成的な方法でカポシンを発現する。細胞系及び
染色方法に依存して、ポジティブ細胞のパーセンテージ
は10から80%より大きい数字の間で変化する。免疫組織
化学もまた、kap5C4 mabによって染色された細胞の数
は、vp4G2ポジティブ細胞よりもずっと大きい。おそら
くより感受性の染色法を用いると、全ての紡錘細胞の主
要な部分が、カポシンに対してポジティブであろう。
【0038】4.KS患者及びKS危険群の血清によるカポ
シンの認識 カポシン融合タンパク質はKS患者及びKSのないHIV感染
患者のそれぞれの血清によって認識される。HIV感染者
(危険群:ホモセクシャル)の血清の比較的高いパーセ
ンテージ(およそ80%)が、他のウイルスタンパク質/
ペプチドに比較してカポシンと反応することが示され
た。これは、潜伏ウイルス膜タンパク質としてのカポシ
ンが、溶解性タンパク質より速い感染の検出についてよ
り適していることを示す。ペプチド-ELISAによって、大
まかなマッピングがこれらの血清によって認識されるエ
ピトープを決定するために実施された。アミノ酸配列AI
PPLVCLLAを有する疎水性ペプチドがほとんどの血清によ
って認識されることが示された(表1)。
シンの認識 カポシン融合タンパク質はKS患者及びKSのないHIV感染
患者のそれぞれの血清によって認識される。HIV感染者
(危険群:ホモセクシャル)の血清の比較的高いパーセ
ンテージ(およそ80%)が、他のウイルスタンパク質/
ペプチドに比較してカポシンと反応することが示され
た。これは、潜伏ウイルス膜タンパク質としてのカポシ
ンが、溶解性タンパク質より速い感染の検出についてよ
り適していることを示す。ペプチド-ELISAによって、大
まかなマッピングがこれらの血清によって認識されるエ
ピトープを決定するために実施された。アミノ酸配列AI
PPLVCLLAを有する疎水性ペプチドがほとんどの血清によ
って認識されることが示された(表1)。
【0039】従来技術に対する利点及び潜在的な有用性 上記記載のように、HHV-8感染を示すために用いられる
検出法は、多くの欠点に苦しんでいる。この時点で、HH
V-8に対して特異的に向けられた治療は存在しない。こ
こに記載されるウイルスタンパク質カポシンは、今まで
用いられたウイルスタンパク質に対して以下のような利
点を有する: 1. 細胞表面での発現 2. 多くのHHV-8感染細胞での発現 3. カポシンは最もよく発現を示す潜伏的なHHV-8タンパ
ク質であること 4. 他のタンパク質(ウイルスも)に対するホモロジー
が今日まで周知でないこと。
検出法は、多くの欠点に苦しんでいる。この時点で、HH
V-8に対して特異的に向けられた治療は存在しない。こ
こに記載されるウイルスタンパク質カポシンは、今まで
用いられたウイルスタンパク質に対して以下のような利
点を有する: 1. 細胞表面での発現 2. 多くのHHV-8感染細胞での発現 3. カポシンは最もよく発現を示す潜伏的なHHV-8タンパ
ク質であること 4. 他のタンパク質(ウイルスも)に対するホモロジー
が今日まで周知でないこと。
【0040】潜在的な使用は、本データにしたがって大
多数のHHV-8感染細胞によってよく表される信頼できる
感染または腫瘍マーカーとしてのカポシンの機能から明
らかとなる。それ故、カポシンは(i)HHV-8感染の検出に
対する新規な診断法、及び(ii)HHV-8に対して特異的に
向けられた治療薬の開発に対して有用である。診断の分
野において、例えば血清学的な検出のためのELISAまた
はウエスタンブロットにおける組換えカポシンの使用、
または免疫組織化学におけるHHV-8感染細胞の検出のた
めのカポシンに対するmabの使用が企図される。信頼可
能な血清学的アッセイは、応用の以下の可能性を有す
る: ・HHV-8感染の診断; ・HIV感染患者、移植の後の患者及び免疫抑制患者にお
けるKS肉腫の発達に対する予後マーカー; ・カポジ肉腫の治療におけるコースパラメーター; ・特定のB細胞リンパ腫の診断; ・今までのところ未知の腫瘍の診断における可能性(例
えば臓器移植に引き続く「二次腫瘍」と呼ばれるもの)
及び今までのところHHV-8と結びついていない他の疾患
の可能性; ・これらのHHV-8関連疾患におけるコースパラメータ
ー。
多数のHHV-8感染細胞によってよく表される信頼できる
感染または腫瘍マーカーとしてのカポシンの機能から明
らかとなる。それ故、カポシンは(i)HHV-8感染の検出に
対する新規な診断法、及び(ii)HHV-8に対して特異的に
向けられた治療薬の開発に対して有用である。診断の分
野において、例えば血清学的な検出のためのELISAまた
はウエスタンブロットにおける組換えカポシンの使用、
または免疫組織化学におけるHHV-8感染細胞の検出のた
めのカポシンに対するmabの使用が企図される。信頼可
能な血清学的アッセイは、応用の以下の可能性を有す
る: ・HHV-8感染の診断; ・HIV感染患者、移植の後の患者及び免疫抑制患者にお
けるKS肉腫の発達に対する予後マーカー; ・カポジ肉腫の治療におけるコースパラメーター; ・特定のB細胞リンパ腫の診断; ・今までのところ未知の腫瘍の診断における可能性(例
えば臓器移植に引き続く「二次腫瘍」と呼ばれるもの)
及び今までのところHHV-8と結びついていない他の疾患
の可能性; ・これらのHHV-8関連疾患におけるコースパラメータ
ー。
【0041】原則として、カポシンの治療上の有用性も
また企図され、例えばTリンパ球とHHV-8+腫瘍細胞の架
橋によって免疫応答のターゲット化された活性化を導
き、それ故腫瘍細胞の除去を導く二重特異性抗体が用い
られる。今日までHHV-8感染細胞が移植されうる機能は
未知であるため、潜伏タンパク質としてのカポシンは原
因試薬として関与する。もしこれが真実であると証明さ
れれば、カポシンの阻害を導く治療上の介在が治療上の
利益を生むであろう。
また企図され、例えばTリンパ球とHHV-8+腫瘍細胞の架
橋によって免疫応答のターゲット化された活性化を導
き、それ故腫瘍細胞の除去を導く二重特異性抗体が用い
られる。今日までHHV-8感染細胞が移植されうる機能は
未知であるため、潜伏タンパク質としてのカポシンは原
因試薬として関与する。もしこれが真実であると証明さ
れれば、カポシンの阻害を導く治療上の介在が治療上の
利益を生むであろう。
【0042】細胞系 用いられる細胞系BCBL-1(HHV-8+,EBV-)(Don Ganemによ
って提供される腎;UCSF,USA)及び細胞系721(EBV+リン
パ芽球細胞系)は、20%の熱不活性化胎児ウシ血清、100I
U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2
mM L-グルタミン、及び0.05mM 2-メルカプトエタノール
(Sigma,St.Louis,USA)を用いて補われるRPMI(Life Tech
nologies,Paisley,UK)で培養された。
って提供される腎;UCSF,USA)及び細胞系721(EBV+リン
パ芽球細胞系)は、20%の熱不活性化胎児ウシ血清、100I
U/mlのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシン、2
mM L-グルタミン、及び0.05mM 2-メルカプトエタノール
(Sigma,St.Louis,USA)を用いて補われるRPMI(Life Tech
nologies,Paisley,UK)で培養された。
【0043】組換えHHV-8融合タンパク質の調製 T0.7の第一のORFの配列は、PCRによってBCBL-1細胞の抽
出DNAから増幅され、pGEX-4Tベクター内にクローン化さ
れ(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、GST(グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ)融合タンパク質として大腸菌で発
現され、そして標準的な方法にしたがったアフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製された(Ausubel et
al.,1992)。
出DNAから増幅され、pGEX-4Tベクター内にクローン化さ
れ(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、GST(グルタチオン-S-
トランスフェラーゼ)融合タンパク質として大腸菌で発
現され、そして標準的な方法にしたがったアフィニティ
ークロマトグラフィーによって精製された(Ausubel et
al.,1992)。
【0044】カポシンに対するモノクローナル抗体の調
製 モノクローナル抗体は以前に記載された標準的な方法に
したがって調製された(Kremmer et al.,1995)。Lou/Cラ
ットを、全部で三回、組換え融合タンパク質及びアジュ
バントとしてジミコール酸トレハロース/モノホスホリ
ルリピドA/スクアレン/Tween 80(Antibody Multiplie
r ABM-S,Linaris,Bettingen,Germany)を用いて3週の間
隔で免疫化した。免疫化されたラットの脾臓細胞をP3C6
3Ag8.653ミエローマ細胞系と融合し、ハイブリドーマ上
清を1μg/ウェルの濃度で組み換えタンパク質を用いて
コートされたミクロタイタープレート上でELISA(固相
酵素免疫検定法)によって試験した。該上清を1時間イ
ンキュベートし、結合抗体をラットイムノグロブリンに
対するペルオキシダーゼ接合二次抗体を用いて検出し
た。その後、o-フェニレンジアミンを基質として加え、
ELISAリーダーにおいて吸光度を測定した(Tecan,Readin
g,UK)。全体として、抗体Kap5C4を二度クローン化し
た。
製 モノクローナル抗体は以前に記載された標準的な方法に
したがって調製された(Kremmer et al.,1995)。Lou/Cラ
ットを、全部で三回、組換え融合タンパク質及びアジュ
バントとしてジミコール酸トレハロース/モノホスホリ
ルリピドA/スクアレン/Tween 80(Antibody Multiplie
r ABM-S,Linaris,Bettingen,Germany)を用いて3週の間
隔で免疫化した。免疫化されたラットの脾臓細胞をP3C6
3Ag8.653ミエローマ細胞系と融合し、ハイブリドーマ上
清を1μg/ウェルの濃度で組み換えタンパク質を用いて
コートされたミクロタイタープレート上でELISA(固相
酵素免疫検定法)によって試験した。該上清を1時間イ
ンキュベートし、結合抗体をラットイムノグロブリンに
対するペルオキシダーゼ接合二次抗体を用いて検出し
た。その後、o-フェニレンジアミンを基質として加え、
ELISAリーダーにおいて吸光度を測定した(Tecan,Readin
g,UK)。全体として、抗体Kap5C4を二度クローン化し
た。
【0045】ウエスタンブロッティング 非刺激化BCBL-1及び721細胞の細胞溶解物を18% SDS PAG
Eで分離し、ニトロセルロース上にブロットした(Schlei
cher and Scuell,Dassel,Germany)。その後該ブロット
を、TBS(トリス緩衝生理食塩水)/0.02% Tween-20中
で5%粉ミルク(Merck,Darmstadt,Germany)を用いてブロ
ックし、kap5C4 mabを用いてインキュベートした。TBS/
0.02% Tween-20における3回の洗浄工程に引き続き、該
ブロットを1:1000の希釈でアルカリホスファターゼ接合
二次抗体(Dianova,Hamburg,Germany)を用いて1時間イ
ンキュベートし、再び洗浄し、最後に製造者の説明書に
したがってWestern Blue(Promega,Madison,USA)を用い
てインキュベートした。
Eで分離し、ニトロセルロース上にブロットした(Schlei
cher and Scuell,Dassel,Germany)。その後該ブロット
を、TBS(トリス緩衝生理食塩水)/0.02% Tween-20中
で5%粉ミルク(Merck,Darmstadt,Germany)を用いてブロ
ックし、kap5C4 mabを用いてインキュベートした。TBS/
0.02% Tween-20における3回の洗浄工程に引き続き、該
ブロットを1:1000の希釈でアルカリホスファターゼ接合
二次抗体(Dianova,Hamburg,Germany)を用いて1時間イ
ンキュベートし、再び洗浄し、最後に製造者の説明書に
したがってWestern Blue(Promega,Madison,USA)を用い
てインキュベートした。
【0046】免疫蛍光 細胞内染色のため、非誘導BCBL-1細胞をアセトン内に固
定し、0.2%サポニンを用いて浸透化した。非処理BCBL-1
細胞を表面染色のため用いた。BCBL-1細胞を非希釈Kap5
C4ハイブリドーマ細胞カルチャー上清を用いて最初にイ
ンキュベートし、それからCy-3-ラベル化二次抗体(Sigm
a,St.Louis,USA)を用いてインキュベートした。分析の
ために、該細胞をpori-L-リシンコート化スライド(Mari
enfeld,Bad Mergentheim,Germany)上に固定化し、Leica
TNT共焦点レーザー顕微鏡(leica,Bensheim,Germany)に
よって分析した。フローサイトメトリーにおけるコント
ロールのために、MHCクラスIに対するW6/32 mabを一次
抗体として用いた。分析をFACSscaliburフローサイトメ
ーター(Becton Dickinson,Mountain View,USA)上で実施
した。
定し、0.2%サポニンを用いて浸透化した。非処理BCBL-1
細胞を表面染色のため用いた。BCBL-1細胞を非希釈Kap5
C4ハイブリドーマ細胞カルチャー上清を用いて最初にイ
ンキュベートし、それからCy-3-ラベル化二次抗体(Sigm
a,St.Louis,USA)を用いてインキュベートした。分析の
ために、該細胞をpori-L-リシンコート化スライド(Mari
enfeld,Bad Mergentheim,Germany)上に固定化し、Leica
TNT共焦点レーザー顕微鏡(leica,Bensheim,Germany)に
よって分析した。フローサイトメトリーにおけるコント
ロールのために、MHCクラスIに対するW6/32 mabを一次
抗体として用いた。分析をFACSscaliburフローサイトメ
ーター(Becton Dickinson,Mountain View,USA)上で実施
した。
【0047】ELISA ミクロタイタープレートを1μgの組換えVP23を用いて
コートし、PBS/0.1% Tween-20によってブロックした。1
9のHIVネガティブコントロールドナーの血清、19のKSを
有しないHIVポジティブ患者の血清、及び36のKSを有す
るHIVネガティブ患者の血清を、凍結乾燥大腸菌を用い
てプレインキュベートし、その後ミクロタイタープレー
ト上で室温で2時間1:50の希釈液でインキュベートし
た。4回の洗浄工程の後、二次ペルオキシダーゼ接合抗
体、引き続きABTS基質(Boehringer,Mannheim,Germany)
を加えた。
コートし、PBS/0.1% Tween-20によってブロックした。1
9のHIVネガティブコントロールドナーの血清、19のKSを
有しないHIVポジティブ患者の血清、及び36のKSを有す
るHIVネガティブ患者の血清を、凍結乾燥大腸菌を用い
てプレインキュベートし、その後ミクロタイタープレー
ト上で室温で2時間1:50の希釈液でインキュベートし
た。4回の洗浄工程の後、二次ペルオキシダーゼ接合抗
体、引き続きABTS基質(Boehringer,Mannheim,Germany)
を加えた。
【0048】そのN末端でSGSGスペーサーに結合したペ
プチドを、ペプチドELISAを実施するために用い、ビオ
チン化した。各ペプチドのストック溶液(100% DMSO中に
1μモル/mlの濃度)をPBS/5% Tween-20において1:400に
希釈し、ストレプタビジンコート化ミクロタイタープレ
ートに結合させた。kap5C4 mabハイブリドーマ上清の1:
200、及びKS患者血清の1:50のそれぞれの希釈液を用い
たインキュベーションに引き続き、ラットIgG(kap5C4)
またはヒトIgGに対するペルオキシダーゼ接合二次抗体
を、1:10,000の希釈液中で用いた。二次抗体を用いた反
応の後、該ミクロタイタープレートをABTS基質を用いて
インキュベートし、それから492nmの波長でELISAリーダ
ーを用いて測定した。HHV-8感染患者における抗体が向
けられているエピトープを同定するために、カポジ肉腫
に苦しんでいるHIVポジティブ患者(<10)の血清プールを
用いた。
プチドを、ペプチドELISAを実施するために用い、ビオ
チン化した。各ペプチドのストック溶液(100% DMSO中に
1μモル/mlの濃度)をPBS/5% Tween-20において1:400に
希釈し、ストレプタビジンコート化ミクロタイタープレ
ートに結合させた。kap5C4 mabハイブリドーマ上清の1:
200、及びKS患者血清の1:50のそれぞれの希釈液を用い
たインキュベーションに引き続き、ラットIgG(kap5C4)
またはヒトIgGに対するペルオキシダーゼ接合二次抗体
を、1:10,000の希釈液中で用いた。二次抗体を用いた反
応の後、該ミクロタイタープレートをABTS基質を用いて
インキュベートし、それから492nmの波長でELISAリーダ
ーを用いて測定した。HHV-8感染患者における抗体が向
けられているエピトープを同定するために、カポジ肉腫
に苦しんでいるHIVポジティブ患者(<10)の血清プールを
用いた。
【0049】免疫組織化学 第一に、切片をパラフィンから取り出し、それから1:10
の希釈液でvp4G2 mabを用いてインキュベートした。結
合抗体をEnVisionTMシステム(Dako,Hamburg,Germany)を
用いて検出した。
の希釈液でvp4G2 mabを用いてインキュベートした。結
合抗体をEnVisionTMシステム(Dako,Hamburg,Germany)を
用いて検出した。
【0050】参考文献: Ausubel,F.M., R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.
G.Seidmann, J.A.Smith,and K.Struhl,eds. (1992). Cu
rrent protocols in molecular biology. JohnWiley an
d Sons, New York Boshoff,C. and Weiss,R.A.(1997). Aetiology of Kapo
si's sarcoma: currentunderstanding and implication
s for therapy. Mol.Med.today 488-494 Chang,Y., Cesarman,E., Pessin,M.S., Lee,F., Culpep
per,J., Knowles,D.M.,and Moore,P.S. (1994). Identi
fication of herpesvirus-like DNA sequencesin AIDS-
associated Kaposi's sarcoma. Science 266,1865-1869 Kremmer,E., Kranz,B.R., Hille,A., Klein,K., Eulit
z,M., Hoffmann-Fezer,G., Feiden,W., Hermann,K., De
lecluse,H.-J., Delsol,G., Bornkamn,G.W., Mueller-L
antzsch,N., and Graesser,F.A. (1995). Rat monoclon
al antibodies diffentiating between the Epstein-Ba
rr Virus nuclesr antigens 2A (EBNA 2A)and 2B (EBNA
2B). Virology 208,336-342. Neipel,F., Albrecht,J.-C., and Fleckenstein,B. (19
97). Cell-homologous genes in the Kaposi's sarcoma
-associated rhadinovirus human herpesvirus 8: dete
rminants of its pathogenicity? J.Virol.71,4187-419
2. Russo,J.J., Bohenzky,R.A., Chien,M.-C., Chen,J., Y
an,M., Maddalena,D., Parry,J.P., Peruzzi,D., Edelm
an,I.S., Chang,Y., and Moore,P. (1996). Nucleotide
sequence of the Kaposi's sarcoma-associated herpe
svirus (HHV8). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,14862-148
67. Zhong,W., Wang,H., Herndier,B., and Ganem,D. (199
6). Restricted expression of Kaposi sarcoma-associ
ated harpesvirus (human herpesvirus 8) genesin Kap
osi sarcoma. Proc,Natl,Acad,Sci.USA 93,6641-6646.
G.Seidmann, J.A.Smith,and K.Struhl,eds. (1992). Cu
rrent protocols in molecular biology. JohnWiley an
d Sons, New York Boshoff,C. and Weiss,R.A.(1997). Aetiology of Kapo
si's sarcoma: currentunderstanding and implication
s for therapy. Mol.Med.today 488-494 Chang,Y., Cesarman,E., Pessin,M.S., Lee,F., Culpep
per,J., Knowles,D.M.,and Moore,P.S. (1994). Identi
fication of herpesvirus-like DNA sequencesin AIDS-
associated Kaposi's sarcoma. Science 266,1865-1869 Kremmer,E., Kranz,B.R., Hille,A., Klein,K., Eulit
z,M., Hoffmann-Fezer,G., Feiden,W., Hermann,K., De
lecluse,H.-J., Delsol,G., Bornkamn,G.W., Mueller-L
antzsch,N., and Graesser,F.A. (1995). Rat monoclon
al antibodies diffentiating between the Epstein-Ba
rr Virus nuclesr antigens 2A (EBNA 2A)and 2B (EBNA
2B). Virology 208,336-342. Neipel,F., Albrecht,J.-C., and Fleckenstein,B. (19
97). Cell-homologous genes in the Kaposi's sarcoma
-associated rhadinovirus human herpesvirus 8: dete
rminants of its pathogenicity? J.Virol.71,4187-419
2. Russo,J.J., Bohenzky,R.A., Chien,M.-C., Chen,J., Y
an,M., Maddalena,D., Parry,J.P., Peruzzi,D., Edelm
an,I.S., Chang,Y., and Moore,P. (1996). Nucleotide
sequence of the Kaposi's sarcoma-associated herpe
svirus (HHV8). Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,14862-148
67. Zhong,W., Wang,H., Herndier,B., and Ganem,D. (199
6). Restricted expression of Kaposi sarcoma-associ
ated harpesvirus (human herpesvirus 8) genesin Kap
osi sarcoma. Proc,Natl,Acad,Sci.USA 93,6641-6646.
【0051】 表1:kap5C4モノクローナル抗体及びKS患者のエピトープマッピング 名前 ペプチド配列 反応性 反応性 (N→C) kap5C4 mab KA患者血清 1. K12A MDRGLTVFVA − − 2. K12A2 LTVFVAVHVP − − 3. K12A3 VAVHVPDVLL − − 4. K12A4 HVPDVLLNGW − − 5. K12A5 DVLLNGWRWR − − 6. K12A6 LNGWRWRLGA − − 7. K12B WRWRLGAIPP − − 8. K12C RLGAIPPLVC − − 9. K12D AIPPLVCLLA − +++ 10. K12D2 PLVCLLAISV − − 11. K12D3 CLLAISVVPP − − 12. K12D4 AISVVPPSGQ − − 13. K12D5 VVPPSGQRGP − − 14. K12D6 PSGQRGPVAF − − 15. K12E QRGPVAFRTR +++ − 16. K12F GPVAFRTRVA +++ − 17. K12G VAFRTRVATG − − 18. K12H FRTRVATGAH − −
【0052】示されたペプチドを、そのN末端でSGSGス
ペーサーに結合し、ビオチン化する。それぞれのペプチ
ドのストック溶液(100% DMSO中に1μモル/mlの濃度)を
PBS/5% Tween-20中で1:400に希釈し、ストレプタビジン
コート化ミクロタイタープレートに結合させた。1:200
のkap5C4 mabハイブリドーマ上清及び1:50のKs患者血清
のそれぞれの希釈液とのインキュベーションに引き続
き、ラットIgG(kap5C4)またはヒトIgGに対するペルオキ
シダーゼ接合二次抗体を、1:10,000の希釈液で用いた。
該二次抗体との反応の後、ミクロタイタープレートをAB
TS基質と共にインキュベートし、それから492nmの波長
でELISAプレートリーダーを用いて測定した。HHV-8感染
患者における該抗体が向けられるエピトープを同定する
ために、カポジ肉腫に苦しんでいるHIVポジティブ患者
(<10)の血清プールを用いた。
ペーサーに結合し、ビオチン化する。それぞれのペプチ
ドのストック溶液(100% DMSO中に1μモル/mlの濃度)を
PBS/5% Tween-20中で1:400に希釈し、ストレプタビジン
コート化ミクロタイタープレートに結合させた。1:200
のkap5C4 mabハイブリドーマ上清及び1:50のKs患者血清
のそれぞれの希釈液とのインキュベーションに引き続
き、ラットIgG(kap5C4)またはヒトIgGに対するペルオキ
シダーゼ接合二次抗体を、1:10,000の希釈液で用いた。
該二次抗体との反応の後、ミクロタイタープレートをAB
TS基質と共にインキュベートし、それから492nmの波長
でELISAプレートリーダーを用いて測定した。HHV-8感染
患者における該抗体が向けられるエピトープを同定する
ために、カポジ肉腫に苦しんでいるHIVポジティブ患者
(<10)の血清プールを用いた。
【0053】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> GSF - Gesellschaft fur Umwelt und Gesundheit GmbH <120> Diagnostics and Therapy of Diseases Associated with HHV-8 Infections. <130> P10214 <140> DE 198 16 732.6 <141> 1999-04-15 <150> DE 198 16 732.6 <151> 1998-04-15 <160> 24 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 60 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 1 Met Asp Arg Gly Leu Thr Val Phe Val Ala Val His Val Pro Asp Val 1 5 10 15 Leu Leu Asn Gly Trp Arg Trp Arg Leu Gly Ala Ile Pro Pro Leu Val 20 25 30 Cys Leu Leu Ala Ile Ser Val Val Pro Pro Ser Gly Gln Arg Gly Pro 35 40 45 Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala Thr Gly Ala His 50 55 60 <210> 2 <211> 26 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 2 Met Asp Arg Gly Leu Thr Val Phe Val Ala Val His Val Pro Asp Val 1 5 10 15 Leu Leu Asn Gly Trp Arg Trp Arg Leu Gly 20 25 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 3 Ala Ile Pro Pro Leu Val Cys Leu Leu Ala Ile Ser Val Val Pro Pro 1 5 10 15 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 4 Ser Gly Gln Arg Gly Pro Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala Thr Gly 1 5 10 15 Ala His <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 5 Met Asp Arg Gly Leu Thr Val Phe Val Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 6 Leu Thr Val Phe Val Ala Val His Val Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 7 Val Ala Val His Val Pro Asp Val Leu Leu 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 8 His Val Pro Asp Val Leu Leu Asn Gly Trp 1 5 10 <210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 9 Asp Val Leu Leu Asn Gly Trp Arg Trp Arg 1 5 10 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 10 Leu Asn Gly Trp Arg Trp Arg Leu Gly Ala 1 5 10 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 11 Trp Arg Trp Arg Leu Gly Ala Ile Pro Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 12 Arg Leu Gly Ala Ile Pro Pro Leu Val Cys 1 5 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 13 Ala Ile Pro Pro Leu Val Cys Leu Leu Ala 1 5 10 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 14 Pro Leu Val Cys Leu Leu Ala Ile Ser Val 1 5 10 <210> 15 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 15 Cys Leu Leu Ala Ile Ser Val Val Pro Pro 1 5 10 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 16 Ala Ile Ser Val Val Pro Pro Ser Gly Gln 1 5 10 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 17 Val Val Pro Pro Ser Gly Gln Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 18 Pro Ser Gly Gln Arg Gly Pro Val Ala Phe 1 5 10 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 19 Gln Arg Gly Pro Val Ala Phe Arg Thr Arg 1 5 10 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 20 Gly Pro Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala 1 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 21 Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 22 Phe Arg Thr Arg Val Ala Thr Gly Ala His 1 5 10 <210> 23 <211> 14 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 23 Gln Arg Gly Pro Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala Thr Gly 1 5 10 <210> 24 <211> 12 <212> PRT <213> Human Herpes Virus 8 (HHV-8) <400> 24 Gln Arg Gly Pro Val Ala Phe Arg Thr Arg Val Ala 1 5 10
【図1】図1は、組換えマイナーキャプシドタンパク質
VP23に対する、カポジ肉腫に苦しんでいる患者の血清の
反応性を示す図である。(a)HHV-8のマイナーキャプシド
タンパク質VP23を大腸菌においてGST-タグ化タンパク質
として発現し、グルタチオンセファロースによるアフィ
ニティークロマトグラフィーを介して精製し、患者血清
における抗VP23抗体の検出のためのELISAにおいて用い
た。(b)ミクロタイタープレートを1μgの組換えVP23を
用いてコートし、PBS/0.1% Tween 20によってブロック
した。19のHIVネガティブコントロールドナーの血清、1
9のKSを有しないHIVポジティブ患者の血清、及び36のKS
を有するHIVネガティブ患者の血清を、凍結乾燥大腸菌
を用いてプレインキュベートし、それからミクロタイタ
ープレート上で室温で2時間1:50の希釈においてインキ
ュベートした。4の洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ接
合二次抗体を加え、その後ABTS基質を加えた。HIVポジ
ティブKS患者の血清は、VP23に対して明らかな反応性を
示した(Wilcoxon試験 P<0.0024)が、約1/3の該血清のみ
がOD 0.2のカットオフより高かった。それ故該アッセイ
は、HHV-8感染の検出に対してほとんど使用できないで
あろう。
VP23に対する、カポジ肉腫に苦しんでいる患者の血清の
反応性を示す図である。(a)HHV-8のマイナーキャプシド
タンパク質VP23を大腸菌においてGST-タグ化タンパク質
として発現し、グルタチオンセファロースによるアフィ
ニティークロマトグラフィーを介して精製し、患者血清
における抗VP23抗体の検出のためのELISAにおいて用い
た。(b)ミクロタイタープレートを1μgの組換えVP23を
用いてコートし、PBS/0.1% Tween 20によってブロック
した。19のHIVネガティブコントロールドナーの血清、1
9のKSを有しないHIVポジティブ患者の血清、及び36のKS
を有するHIVネガティブ患者の血清を、凍結乾燥大腸菌
を用いてプレインキュベートし、それからミクロタイタ
ープレート上で室温で2時間1:50の希釈においてインキ
ュベートした。4の洗浄工程の後、ペルオキシダーゼ接
合二次抗体を加え、その後ABTS基質を加えた。HIVポジ
ティブKS患者の血清は、VP23に対して明らかな反応性を
示した(Wilcoxon試験 P<0.0024)が、約1/3の該血清のみ
がOD 0.2のカットオフより高かった。それ故該アッセイ
は、HHV-8感染の検出に対してほとんど使用できないで
あろう。
【図2】図2は第一のT0.7 RNA ORF(「カポシン」)の
アミノ酸配列を示す図である。カポシンアミノ酸配列に
おいて、推定の膜貫通領域(暗い囲みで示されてい
る)、kap5C4 mabの結合部位(格子の囲みで示されてい
る)及び今まで未知の機能を有する第二の疎水性領域
(明るい囲みで示されている)が示されている。エピト
ープマッピングに対して用いられるペプチド(表1も参
照)が、図の下の部分に示されている。
アミノ酸配列を示す図である。カポシンアミノ酸配列に
おいて、推定の膜貫通領域(暗い囲みで示されてい
る)、kap5C4 mabの結合部位(格子の囲みで示されてい
る)及び今まで未知の機能を有する第二の疎水性領域
(明るい囲みで示されている)が示されている。エピト
ープマッピングに対して用いられるペプチド(表1も参
照)が、図の下の部分に示されている。
【図3】図3はkap5C4 mabを用いたHHV-8+細胞系BCBL-1
におけるカポシン発現の検出を示す図である。(a)非誘
導HHV-8+ BCBL-1細胞においてはウエスタンブロットに
よってカポシンの検出が可能だが、EBV+コントロール細
胞系721では不可能であることを示す図である。(b)免疫
蛍光及び共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価による、固
定化/浸透性(上部パネル)及び非浸透性(下部パネ
ル)BCBL-1細胞におけるカポシンの検出を示す図であ
る。両者の左のパネルにおいては、右に対する免疫蛍光
によって示された細胞が位相差写真によって示されてい
る。非誘導BCBL-1細胞は、最初にkap5C4ハイブリドーマ
の非希釈細胞カルチャー上清を用いて反応され、それか
らCy-3-ラベル化二次抗体を用いて反応された。(c)フロ
ーサイトメーターにおける上記示されたkap5C4-染色細
胞の評価を示す図である(太い曲線)。ポジティブコン
トロールとして、MHCクラス1に対して向けられた抗体W
6/32が用いられた(点線)。ネガティブコントロールに
おいて、二次抗体のみとのインキュベーションが実施さ
れた(実線)。
におけるカポシン発現の検出を示す図である。(a)非誘
導HHV-8+ BCBL-1細胞においてはウエスタンブロットに
よってカポシンの検出が可能だが、EBV+コントロール細
胞系721では不可能であることを示す図である。(b)免疫
蛍光及び共焦点レーザー顕微鏡を用いた評価による、固
定化/浸透性(上部パネル)及び非浸透性(下部パネ
ル)BCBL-1細胞におけるカポシンの検出を示す図であ
る。両者の左のパネルにおいては、右に対する免疫蛍光
によって示された細胞が位相差写真によって示されてい
る。非誘導BCBL-1細胞は、最初にkap5C4ハイブリドーマ
の非希釈細胞カルチャー上清を用いて反応され、それか
らCy-3-ラベル化二次抗体を用いて反応された。(c)フロ
ーサイトメーターにおける上記示されたkap5C4-染色細
胞の評価を示す図である(太い曲線)。ポジティブコン
トロールとして、MHCクラス1に対して向けられた抗体W
6/32が用いられた(点線)。ネガティブコントロールに
おいて、二次抗体のみとのインキュベーションが実施さ
れた(実線)。
【図4】図4は溶解性HHV-8 VP32タンパク質に対するma
bを用いたKS組織の免疫組織化学染色を示す図である。
カポジ肉腫のホルマリン固定及びパラフィン埋没薄層切
片を、HHV-8に対するvp4G2 mabを用いて染色した。最初
に該切片を、熱することによってパラフィンから取り出
し、その後vp4G2 mabの1:10希釈を用いてインキュベー
トした。結合抗体を、EnVisionTMシステム(Dako,Hambur
g)を用いて検出した。
bを用いたKS組織の免疫組織化学染色を示す図である。
カポジ肉腫のホルマリン固定及びパラフィン埋没薄層切
片を、HHV-8に対するvp4G2 mabを用いて染色した。最初
に該切片を、熱することによってパラフィンから取り出
し、その後vp4G2 mabの1:10希釈を用いてインキュベー
トした。結合抗体を、EnVisionTMシステム(Dako,Hambur
g)を用いて検出した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI C07K 7/08 C07K 7/08 16/18 ZNA 16/18 ZNA C12N 5/10 C12P 21/08 C12P 21/08 G01N 33/569 H G01N 33/569 33/577 B 33/577 C12N 5/00 B (72)発明者 エリーザベト・クレマー ドイツ・D−85354・フライジング・ウン テレ・ハウプトシュトラーセ・28 (72)発明者 シュテファニー・クリーチェ ドイツ・D−81369・ミュンヘン・ヤーヘ ナウアー・シュトラーセ・6
Claims (21)
- 【請求項1】 モノクローナル抗体であり、上記抗体は
以下のカポシンペプチド (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG; (c) QRGPVAFRTRVA の一つまたはその誘導体のエピトープを特異的に認識
し、それらに結合するモノクローナル抗体。 - 【請求項2】 上記誘導体が、カポシンペプチド誘導体
の一つのエピトープに向けられた抗体がHHV-8感染を特
異的に検出するのに有用であるという条件で、一つ以上
のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化学
的修飾によって形成されている上記カポシンペプチドの
一つのアミノ酸配列を含む請求項1記載のモノクローナ
ル抗体。 - 【請求項3】 上記抗体が、少なくとも5のアミノ酸の
長さを有するそのカポシンペプチドの上記誘導体の一つ
を認識し、それらに結合する請求項1記載のモノクロー
ナル抗体。 - 【請求項4】 請求項1記載のモノクローナル抗体を生
産するハイブリドーマ細胞系。 - 【請求項5】 キットの形態で存在する診断システムで
あり、上記診断システムはカポシンタンパク質またはそ
の誘導体の存在の検出のための容器に入った請求項1記
載の少なくとも一つのモノクローナル抗体を含む診断シ
ステム。 - 【請求項6】 キットの形態で存在する診断システムで
あり、上記診断システムは請求項1記載のカポシンペプ
チドまたはその誘導体を含み、そこで上記ペプチドはカ
ポシンタンパク質またはその誘導体に対して向けられた
モノクローナルまたはポリクローナル抗体と免疫応答を
実行可能である診断システム。 - 【請求項7】 上記誘導体が、HHV-8感染を特異的に検
出するのに有用であるという条件で、一つ以上のアミノ
酸の欠失、置換、挿入、付加及び/または化学的修飾に
よって形成されているアミノ酸配列を含む請求項5また
は6記載の診断システム。 - 【請求項8】 上記誘導体が、少なくとも5のアミノ酸
の長さを有するペプチド断片である請求項5または6記
載の診断システム。 - 【請求項9】 生物学的サンプル中のカポシンタンパク
質またはその誘導体の存在の検出法であり、請求項1記
載のモノクローナル抗体がサンプル中の抗原構成要素に
結合し得、該サンプル中の抗原構成要素に対する該抗体
の結合が測定されるように、上記サンプルが上記抗体と
接触する検出法。 - 【請求項10】 上記サンプルが液体、生きた細胞、細
胞抽出物または組織である請求項9記載の方法。 - 【請求項11】 上記抗体の結合の割合が、免疫細胞化
学的または免疫組織化学的染色によって測定される請求
項9記載の方法。 - 【請求項12】 生物学的サンプルにおけるカポシンタ
ンパク質またはその誘導体に対して向けられた抗体の検
出法であり、上記方法は上記カポシンタンパク質または
その誘導体に対して向けられた上記サンプル中に存在す
る上記抗体に対する以下のペプチド (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG; (c) QRGPVAFRTRVA の一つまたはその誘導体を含むカポシンタンパク質と上
記サンプルを接触することを含む方法。 - 【請求項13】 上記サンプルが液体、生きた細胞、細
胞抽出物または組織である請求項12記載の方法。 - 【請求項14】 上記誘導体が、HHV-8感染を特異的に
検出するのに有用であるという条件で、上記カポシンタ
ンパク質または一つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿
入、付加及び/または化学的修飾によって形成されてい
るペプチドのアミノ酸配列を含む請求項9から12のい
ずれか一項記載の方法。 - 【請求項15】 上記誘導体が、少なくとも5のアミノ
酸の長さを有するペプチド断片である請求項12記載の
方法。 - 【請求項16】 HHV-8を用いた感染によって直接的に
または間接的に引き起こされる疾患の診断及び治療に対
する請求項1記載のモノクローナル抗体の使用。 - 【請求項17】 上記モノクローナル抗体が、カポジ肉
腫、AIDS疾患及びB細胞リンパ腫の診断及び治療におい
て用いられる請求項16記載の使用。 - 【請求項18】 HHV-8を用いた感染によって直接的に
または間接的に引き起こされる疾患の診断及び治療のた
めの以下の配列 (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG; (c) QRGPVAFRTRVA を有するカポシンペプチドまたはその誘導体の使用。 - 【請求項19】 上記カポシンペプチドの誘導体が、HH
V-8感染を特異的に検出するのに有用であるという条件
で、一つ以上のアミノ酸の欠失、置換、挿入、付加及び
/または化学的修飾によって形成されているアミノ酸配
列a)またはb)またはc)を含む請求項18記載の使用。 - 【請求項20】 カポシンペプチドの上記誘導体が、少
なくとも5のアミノ酸の長さを有するペプチド断片であ
る請求項18記載の使用。 - 【請求項21】 以下の配列 (a) AIPPLVCLLA; (b) QRGPVAFRTRVATG; (c) QRGPVAFRTRVA の一つを有するカポシンペプチド。
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---|---|---|---|
DE19816732.6 | 1998-04-15 | ||
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---|---|---|---|
JP11107279A Withdrawn JPH11341984A (ja) | 1998-04-15 | 1999-04-14 | Hhv―8感染と関連する疾患の診断と治療 |
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---|---|
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JP (1) | JPH11341984A (ja) |
DE (1) | DE19816732A1 (ja) |
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---|---|---|---|---|
CA2328904C (en) | 1998-05-29 | 2009-10-27 | Octavian Schatz | Novel (poly)peptides which represent the epitopes of the human herpesvirus type 8 |
US6653465B2 (en) * | 2000-12-08 | 2003-11-25 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Spliced gene of KSHV / HHV8, its promoter and monoclonal antibodies specific for LANA2 |
US20100055718A1 (en) * | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Kwangyeol Lee | Nanoplate dye platform and methods of making and using the same |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5604126A (en) * | 1992-04-06 | 1997-02-18 | Northwestern University | Murine hybridoma 4A11 and diagnostic antibody produced thereby |
US5861240A (en) * | 1996-02-28 | 1999-01-19 | The Regents Of The University Of California | Isolated human herpesvirus type 8 sequences and uses thereof |
CA2328904C (en) | 1998-05-29 | 2009-10-27 | Octavian Schatz | Novel (poly)peptides which represent the epitopes of the human herpesvirus type 8 |
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1998
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-
1999
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- 1999-04-14 JP JP11107279A patent/JPH11341984A/ja not_active Withdrawn
- 1999-04-14 US US09/291,803 patent/US6319667B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2001
- 2001-05-16 US US09/860,276 patent/US6503513B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-05-16 US US09/860,395 patent/US6541253B2/en not_active Expired - Fee Related
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US6541253B2 (en) | 2003-04-01 |
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