JPH11332571A - New gene and protein encoded by the same - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a new protein which can regulate the growth of hair and is useful for hair restoring agent, hair growing agent or the like by consisting of a specific amino acid sequence. SOLUTION: This protein contains (A) the amino acid sequence of formula I or (B) the amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added to the amino acid sequence of formula I and has the function regulating the growth of hair. Further, the DNA containing the base sequence of formula II or the DNA which hybridizes with the DNA of formula II under stringent conditions and codes for the protein having the function regulating the growth of hair is preferably used to search pharmacologically active substances showing hair facilitative effect.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術】本発明は、毛髪の成長を調節する
機能を有する新規蛋白質ＤＥＲＰ（dermal papilla der
ived protein）２、ならびに該蛋白質をコードする遺伝
子ｄｅｒｐ２に関するものである。The present invention relates to a novel protein, DERP ( der mal papilla der), having a function of regulating hair growth.
ived p rotein) 2, and to a gene derp2 encoding the protein.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ヒト毛髪の毛包には、角化細胞、毛乳頭
細胞、繊維芽細胞および脂腺細胞等の様々な上皮系およ
び真皮系の細胞が存在しており、毛周期（毛髪の成長サ
イクル）は、これらの細胞間相互作用を介して調節され
ている。2. Description of the Related Art Various epithelial and dermal cells such as keratinocytes, papillary cells, fibroblasts and sebaceous cells are present in the hair follicle of human hair, and the hair cycle (the growth cycle of the hair) ) Are regulated through these cell-cell interactions.

【０００３】これらの細胞の中で、毛髪繊維を産生する
のは毛包角化細胞であるが、この細胞の増殖と分化の調
節に中心的な役割を担っているのは毛乳頭細胞であると
考えられている。すなわち、毛乳頭細胞が毛周期のコン
トローラーとして機能すると考えられている。以上の背
景から、現在、毛乳頭を中心とした毛周期調節機構の解
析が盛んに行われているが、毛髪成長の分子メカニズム
はまだほとんど明らかにされていない。[0003] Among these cells, hair follicle keratinocytes produce hair fibers, and hair papilla cells play a central role in regulating the proliferation and differentiation of these cells. It is believed that. That is, it is thought that the hair papilla cells function as a controller of the hair cycle. From the above background, the analysis of the hair cycle regulation mechanism centering on the dermal papilla is currently being actively conducted, but the molecular mechanism of hair growth has not yet been elucidated.

【０００４】男性型脱毛症は、毛包にアンドロジェンが
過剰に作用することにより進展することが知られてい
る。アンドロジェンは毛の成長を調節する最も重要な因
子であるが、その作用メカニズムはまだ解明されていな
い。[0004] Male pattern baldness is known to progress due to excessive action of androgens on hair follicles. Androgens are the most important factors regulating hair growth, but their mechanism of action has not yet been elucidated.

【０００５】毛乳頭細胞はアンドロジェン受容体および
テストステロン代謝酵素である５α-リダクターゼを高
発現していること、さらに毛乳頭細胞におけるアンドロ
ジェン受容体の発現量が発毛部より禿頭部において高い
ことから、毛包におけるアンドロジェンの主なターゲッ
ト細胞は毛乳頭細胞であると考えられている。すなわ
ち、アンドロジェンは、毛乳頭に作用し、毛乳頭細胞由
来の因子等の産生量を変化させることにより、毛髪の成
長を調節すると考えられている。[0005] Hair papilla cells express high levels of the androgen receptor and 5α-reductase, a testosterone metabolizing enzyme, and the expression level of the androgen receptor in hair papilla cells is higher in the bald area than in the hair growth area. Therefore, it is considered that the main target cell of androgen in the hair follicle is a hair papilla cell. That is, it is thought that androgens act on the dermal papilla and regulate the growth of hair by altering the production of factors derived from the dermal papilla cells.

【０００６】以上の様な知見から、アンドロジェンによ
り産生量が変化する毛乳頭由来の因子が、毛髪の成長に
重要な役割を果たしていることが予測されているが、こ
の因子が何なのかはまだ明らかにされていない。[0006] From the above findings, it is predicted that a factor derived from the dermal papilla whose production is changed by androgen plays an important role in the growth of hair. Not yet revealed.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】上述のように、毛乳頭
由来の毛髪の成長に関与する因子、特に蛋白性因子は、
毛髪促進作用を示す生理活性物質の探索に極めて有用で
ある。本発明は、発毛に関する分子機構を解明する過程
で、この様な毛髪の成長を調節することのできる新規な
蛋白質とその遺伝子を提供することにある。As described above, factors involved in the growth of hair derived from the dermal papilla, particularly protein factors, include:
It is extremely useful for searching for a physiologically active substance having a hair promoting action. An object of the present invention is to provide a novel protein capable of regulating such hair growth and a gene thereof in the process of elucidating the molecular mechanism relating to hair growth.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】本発明者らは毛髪の成長
に関与する因子の同定を目的とし、ヒト毛乳頭細胞で高
発現している遺伝子の中から、所望の蛋白質を把握する
べく鋭意研究の結果、新規蛋白質ＤＥＲＰ２の存在と、
それをコードする遺伝子ｄｅｒｐ２の単離に成功し、本
発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention aimed to identify factors involved in hair growth and eagerly identified desired proteins from genes highly expressed in human papillary cells. As a result of the study, the existence of a novel protein, DERP2,
The gene derp2 encoding it was successfully isolated, and the present invention was completed.

【０００９】即ち、本発明は、（ａ）配列番号：１に記
載のアミノ酸配列からなる蛋白質、または（ｂ）配列番
号：１のアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ
酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からな
り、かつ毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質に関
するものである。さらに本発明は、（ｃ）配列番号：２
に記載のＤＮＡからなる遺伝子、または、（ｄ）配列番
号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダ
イズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質
をコードするＤＮＡからなる遺伝子に関するものであ
る。That is, the present invention relates to (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or (b) one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 deleted, substituted or added. The present invention relates to a protein comprising the amino acid sequence of the present invention and having a function of regulating hair growth. Further, the present invention provides (c) SEQ ID NO: 2.
Or (d) a gene consisting of a DNA encoding a protein that hybridizes with the DNA of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions and has a function of regulating hair growth. is there.

【００１０】本発明であるＤＥＲＰ２は、配列番号１に
示すように全３４５アミノ酸残基からなる分子量３７キ
ロダルトン（ｋｄ）の蛋白質である。そのアミノ酸配列
上の特徴として、疎水性アミノ酸に富む領域が複数箇所
で認められることから、膜蛋白質の一種であると推察さ
れる。[0010] DERP2 of the present invention is a protein having a molecular weight of 37 kilodalton (kd) consisting of all 345 amino acid residues as shown in SEQ ID NO: 1. As a feature of the amino acid sequence, a region rich in hydrophobic amino acids is observed at a plurality of locations, and thus it is presumed to be a type of membrane protein.

【００１１】また、もう一つの本発明であるｄｅｒｐ２
は、配列番号２に示すように１０３５塩基対（ｂｐ）か
らなる遺伝子である。[0011] Further, another of the present invention, derp2
Is a gene consisting of 1035 base pairs (bp) as shown in SEQ ID NO: 2.

【００１２】[0012]

【発明の実施の形態】遺伝子ｄｅｒｐ２は、ヒト毛乳頭
細胞由来のｃＤＮＡライブラリーから、該遺伝子を含ん
だｃＤＮＡ断片として単離することができる。本発明者
らが使用したｃＤＮＡライブラリーは、Messengerらの
方法(Br. J. Dermatol. 114, 425, 1986)に従って分離
したヒト毛乳頭細胞から一般的な方法に従って抽出した
ｍＲＮＡを基に調製したものであるが、クローンテック
社から市販されているヒト大脳皮質のｍＲＮＡを元にし
ても同様にｃＤＮＡを調製することができる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The gene derp2 can be isolated as a cDNA fragment containing the gene from a cDNA library derived from human dermal papilla cells. The cDNA library used by the present inventors was prepared based on mRNA extracted according to a general method from human dermal papilla cells isolated according to the method of Messenger et al. (Br. J. Dermatol. 114, 425, 1986). However, cDNA can be prepared in the same manner based on human cerebral cortex mRNA commercially available from Clonetech.

【００１３】ヒト毛乳頭細胞で高発現している遺伝子を
識別する方法として、大久保らの方法（Okubo et al.,N
ature Genet.,2, p173, 1992）による、遺伝子の発現頻
度を解析する方法を用いることができる。具体的には、
以下の手順による。As a method for identifying a gene highly expressed in human dermal papilla cells, the method of Okubo et al. (Okubo et al., N.
Nature Genet., 2, p173, 1992) can be used to analyze the frequency of gene expression. In particular,
The following procedure is used.

【００１４】ヒト毛乳頭細胞由来のｍＲＮＡを鋳型と
し、適当な制限酵素で開環させたベクタープラスミドの
一端にオリゴｄＴを結合させたものをプライマーとして
ｃＤＮＡ合成を行った後、制限酵素ＭｂｏＩと制限酵素
ＢａｍＨＩで切断する。当該ベクターはｄａｍメチラー
ゼ陽性の大腸菌を宿主として調製されたため、ＭｂｏＩ
の認識配列である「ＧＡＴＣ」のＡ残基がメチル化され
ている。従ってＭｂｏＩは、新たに合成されたｃＤＮＡ
部分のみを切断する。当該ベクターは、オリゴｄＴを結
合させた末端とは反対側の末端近傍にＢａｍＨＩ切断部
位を１ヶ所だけ有しているので、本酵素は当該ベクター
を１ヶ所切断し、さらに新たに合成されたｃＤＮＡ部分
にもしＢａｍＨＩ認識配列が存在すれば、その部位も切
断する。ＢａｍＨＩとＭｂｏＩは「ＧＡＴＣ」なる配列
からなる、同一の付着端を生ぜしめるため、両酵素で切
断した後、ＤＮＡリガーゼを作用させれば、プラスミド
を閉環することができる。このようにして調製したプラ
スミドを用いて、大腸菌を形質転換することで３’末端
ｃＤＮＡライブラリーを構築した。従って当該ライブラ
リーは、各ｍＲＮＡの３’端のポリＡ部位から、その
５’側部分のうち最初にＧＡＴＣなる塩基配列が出現す
る部位までの領域を含んでいる。当該３’末端ｃＤＮＡ
ライブラリーから無作為に適当個数の組換え体を選択
し、各組換え体中のｃＤＮＡ断片の全塩基配列を決定す
る。このようにして決定された特定配列を有するｃＤＮ
Ａ断片が、無作為に選択された組み換え体の中から幾つ
確認されるかをもって、臓器特異的遺伝子及び高発現遺
伝子を識別することができる。CDNA is synthesized using, as a primer, a vector plasmid that has been opened with an appropriate restriction enzyme and that has oligo dT bound thereto, using mRNA derived from human dermal papilla cells as a template, and then restriction with MboI. Cleavage with the enzyme BamHI. Since this vector was prepared using dam methylase-positive E. coli as a host, MboI
A residue of "GATC", which is a recognition sequence of, is methylated. Therefore, MboI is the newly synthesized cDNA
Cut only part. Since the vector has only one BamHI cleavage site near the end opposite to the end to which oligo dT is bound, the enzyme cuts the vector at one site and further synthesizes newly synthesized cDNA. If a BamHI recognition sequence is present in a portion, the site is also cut. BamHI and MboI are composed of the sequence "GATC" and generate the same cohesive end. To cut the plasmid with both enzymes, and then to allow DNA ligase to act, the plasmid can be closed. Using the plasmid thus prepared, Escherichia coli was transformed to construct a 3′-end cDNA library. Therefore, the library includes a region from the poly A site at the 3 ′ end of each mRNA to the site where the base sequence GATC first appears in the 5 ′ side thereof. The 3 'end cDNA
An appropriate number of recombinants are randomly selected from the library, and the entire nucleotide sequence of the cDNA fragment in each recombinant is determined. CDN having the specific sequence thus determined
An organ-specific gene and a high-expressing gene can be identified based on how many A fragments are found in randomly selected recombinants.

【００１５】上記の高発現遺伝子を識別する方法では、
無作為に選択する組み換え体の総数は数百から千程度が
適当であるが、必要ならばそれ以上の個数の組み換え体
を処理すればよい。In the above method for identifying a highly expressed gene,
The total number of recombinants selected at random is suitably several hundred to 1,000, but if necessary, more recombinants may be processed.

【００１６】本発明者らは上記方法を実施し、７８９個
の組み換え体中のｃＤＮＡ断片の塩基配列を全て決定
し、その中から、同一の配列を有するｃＤＮＡとしての
出現頻度が３／７８９であったｃＤＮＡ断片を、ヒト毛
乳頭細胞で高発現している遺伝子のＤＮＡ断片の候補と
して選別した。The present inventors carried out the above-mentioned method and determined all the nucleotide sequences of the cDNA fragments in the 789 recombinants, and among them, the frequency of appearance of a cDNA having the same sequence was 3/789. The existing cDNA fragment was selected as a candidate for a DNA fragment of a gene highly expressed in human dermal papilla cells.

【００１７】上記ｃＤＮＡ断片は前述したとおり、ｍＲ
ＮＡの３’端の一部の領域しか含んでいない。そこで本
発明者らは当該領域（以下３’断片）の塩基配列情報を
元にして、全鎖長ｃＤＮＡを取得した。[0017] As described above, the above cDNA fragment is composed of mR
It contains only a part of the 3 'end of NA. Therefore, the present inventors obtained a full-length cDNA based on the nucleotide sequence information of the region (hereinafter, 3 ′ fragment).

【００１８】クローンテック社から市販されているヒト
大脳皮質ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、上記３’断
片内の配列を有する適当な長さのオリゴヌクレオチドと
ベクター中の配列を有する同程度の長さのオリゴヌクレ
オチドをそれぞれ合成し、これらをプライマーとしてＰ
ＣＲを行った。その結果、約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を
増幅することができた。この際、ヒト培養毛乳頭細胞か
ら常法に従って抽出したｍＲＮＡを鋳型とし、クローン
テック社またはギブコ社の５’ＲＡＣＥキットを用いる
ことによっても行うことができる。さらにこれはまた、
上記３’断片をプローブとして、上記ヒト大脳皮質また
は毛乳頭細胞ｃＤＮＡライブラリーを、コロニーハイブ
リダイゼーションまたはプラークハイブリダイゼーショ
ンで、常法に従ってスクリーニングすることによっても
行うことができる。Using a human cerebral cortex cDNA library commercially available from Clonetech as a template, an oligonucleotide of an appropriate length having a sequence in the above 3 ′ fragment and an oligonucleotide of a similar length having a sequence in a vector are used. Oligonucleotides were synthesized, and these were used as primers for P
CR was performed. As a result, a DNA fragment of about 1.5 kb could be amplified. At this time, it can also be performed by using a 5'RACE kit from Clontech or Gibco using mRNA extracted from human cultured dermal papilla cells according to a conventional method as a template. In addition this also
The above 3 ′ fragment can be used as a probe to screen the above human cerebral cortex or dermal papilla cell cDNA library by colony hybridization or plaque hybridization according to a conventional method.

【００１９】上記方法によって増幅したｃＤＮＡ断片
は、プロメガ社から市販されているベクターpGEM-Tに組
み込み、全塩基配列を決定した。この際、組換えＤＮＡ
を独立に２クローン取得して、それぞれのｃＤＮＡ断片
の塩基配列を決定することにより、配列の確認を行っ
た。この配列中に一つの蛋白質翻訳領域（Open Reading
Flame、ＯＲＦ）を見いだし、この遺伝子をｄｅｒｐ
２、該遺伝子にコードされる蛋白質をＤＥＲＰ２と命名
した。The cDNA fragment amplified by the above method was incorporated into a vector pGEM-T commercially available from Promega, and the entire nucleotide sequence was determined. At this time, the recombinant DNA
Were independently obtained, and the nucleotide sequence of each cDNA fragment was determined to confirm the sequence. In this sequence, one protein translation region (Open Reading
Flame, ORF) and derp this gene
2. The protein encoded by the gene was designated as DERP2.

【００２０】遺伝子ｄｅｒｐ２は、適当な宿主ベクター
系による一般的な遺伝子組み換え技術によって、組み換
え遺伝子とすることができる。適当なベクターとして
は、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＵ
Ｃ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵ
Ｂ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来のプラスミド
（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテリオファージ
やレトロウィルスやワクシニアウィルス等の動物ウィル
ス等が利用できる。組み換えに際しては、適当な合成Ｄ
ＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コド
ンを付加することも可能である。さらに該遺伝子を発現
させるために、遺伝子の上流に適当な発現プロモーター
を接続する。使用するプロモーターは、宿主に応じて適
宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌である場合に
は、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプ
ロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主がバチル
ス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモーター等が、宿主
が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞
である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィ
ルスプロモーター等が、それぞれ使用できる。The gene derp2 can be made into a recombinant gene by a general gene recombination technique using an appropriate host vector system. Suitable vectors include plasmids derived from E. coli (eg, pBR322, pU
C118 and others, plasmids derived from Bacillus subtilis (eg, pU
B110, pC194 and others), yeast-derived plasmids (eg, pSH19 and others), and bacteriophages, animal viruses such as retroviruses and vaccinia viruses, and the like can be used. When recombining, use appropriate synthetic D
It is also possible to add a translation start codon and a translation stop codon using an NA adapter. In order to further express the gene, an appropriate expression promoter is connected upstream of the gene. The promoter to be used may be appropriately selected according to the host. For example, when the host is Escherichia coli, a T7 promoter, a lac promoter, a trp promoter, a λPL promoter and the like are used. When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an SPO promoter is used. A promoter, a GAP promoter, an ADH promoter and the like can be used, and when the host is an animal cell, an SV40-derived promoter and a retrovirus promoter can be used, respectively.

【００２１】また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチ
オンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡその他）との
融合蛋白質として発現させることも可能である。このよ
うにして発現させた融合型ＤＥＲＰ２は、適当なプロテ
アーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すこと
が可能である。The gene can also be expressed as a fusion protein with another protein (eg, glutathione S-transferase, protein A, etc.). The fused DERP2 expressed in this manner can be excised using an appropriate protease (eg, thrombin or the like).

【００２２】ＤＥＲＰ２の発現の際に利用できる宿主と
しては、エシェリヒア属菌であるEscherichia coliの各
種菌株、バチルス属菌であるBacillus subtilisの各種
菌株、酵母としてはSaccharomyc es cerevisiaeの各種菌
株、動物細胞としてはＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞等が
利用できる。上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、常法または各宿主細胞に対
して一般に用いられる形質転換方法が適用できる。[0022] As the host available upon expression of DERP2, various strains of Escherichia coli is a bacterium of the genus Escherichia, various strains of Bacillus subtilis is Bacillus, various strains of Saccharomyc es cerevisiae as yeast, as animal cells Can be COS-7 cells, CHO cells and the like. As a method for transforming a host cell using the above-mentioned recombinant vector, a conventional method or a transformation method generally used for each host cell can be applied.

【００２３】尚、本発明においては、配列番号２に示し
た塩基配列の他に、該配列とハイブリダイズしかつ毛髪
の成長を調節する機能を有する蛋白質をコードするＤＮ
Ａも、本発明の範囲内である。In the present invention, in addition to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2, DN which codes for a protein which hybridizes with the sequence and has a function of regulating hair growth is used.
A is also within the scope of the present invention.

【００２４】すなわち、遺伝子ｄｅｒｐ２の全長配列に
おいて、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導
入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によ
るＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤ
ＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異
体が遺伝子ｄｅｒｐ２とストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を有す
る蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示
したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内の
ものである。That is, the full-length sequence of the gene derp2 is partially modified by various artificial treatments such as site-directed mutagenesis, random mutation by treatment with a mutagen, mutation, deletion, and ligation of DNA fragments by restriction enzyme cleavage. To D
Even if the DNA sequence is altered, if these DNA mutants hybridize with the gene derp2 under stringent conditions and encode a protein having a function of regulating hair growth, the DNA mutant has SEQ ID NO: 2 are within the scope of the present invention irrespective of differences from the DNA sequence shown in FIG.

【００２５】上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｄｅｒ
ｐ２のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するもので
あれば許容範囲内である。また、遺伝子ｄｅｒｐ２とハ
イブリダイズする程度としては、通常の条件下（例えば
DIG DNA Labeling kit、ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1175033）でプローブをラベルした場合に、３２
℃のDIG Easy Hyb溶液（ベーリンガー・マンハイム社製
Cat No.1603558）中でハイブリダイズさせ、５０℃の
０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％［ｗ／ｖ］ＳＤＳを含
む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．
１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム
である）でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子
ｄｅｒｐ２にハイブリダイズする程度であればよい。The degree of the DNA mutation is determined by the gene der
Those having 90% or more homology with the DNA sequence of p2 are within the allowable range. The degree of hybridization with the gene derp2 may be determined under normal conditions (for example,
DIG DNA Labeling kit, Boehringer Mannheim
Cat No. 1175033), 32
° C DIG Easy Hyb solution (Boehringer Mannheim)
Cat No. 1603558), and washing the membrane in a 0.5 × SSC solution (containing 0.1% [w / v] SDS) at 50 ° C. (1 × SSC is 0.1 × SSC).
15H NaCl and 0.015M sodium citrate) may be sufficient to hybridize to the gene derp2.

【００２６】また、上記のごとく遺伝子ｄｅｒｐ２と相
同性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であっ
て、毛髪の成長を調節する機能を有する蛋白質もまた、
本発明の範囲内のものである。As described above, a protein encoded by a mutant gene having high homology to the gene derp2 and having a function of regulating hair growth is also provided.
It is within the scope of the present invention.

【００２７】すなわち、新規蛋白質ＤＥＲＰ２のアミノ
酸配列の１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換もし
くは付加された変異体であっても、該変異体が毛髪の成
長を調節する機能を有する蛋白質であれば、該変異体は
本発明の範囲内のものである。 蛋白質の構成要素とな
るアミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおい
てそれぞれ異なるものであるが、実質的に蛋白質全体の
３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないとい
う意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物
理化学的な実測により知られている。例えば、アミノ酸
残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン
（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン
（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌ
ｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌ
ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓ
ｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、
Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙ
ｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。[0027] That is, even if a mutant in which one or more amino acids of the amino acid sequence of the novel protein DERP2 is deleted, substituted or added, the mutant has a function of regulating hair growth. If so, the variants are within the scope of the invention. The side chains of amino acids that are the constituents of proteins differ in hydrophobicity, charge, size, etc., but do not substantially affect the three-dimensional structure (also called three-dimensional structure) of the entire protein. Some highly conservative relationships are known empirically and by physicochemical measurements. For example, for substitution of amino acid residues, glycine (Gly) and proline (Pro), Gly and alanine (Ala) or valine (Val), leucine (Leu) and isoleucine (Il)
e), glutamic acid (Glu) and glutamine (Gl)
n), aspartic acid (Asp) and asparagine (As
n), cysteine (Cys) and threonine (Thr),
Thr and serine (Ser) or Ala, lysine (Ly)
s) and arginine (Arg).

【００２８】従って、配列番号１に示した新規蛋白質Ｄ
ＥＲＰ２のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による
変異蛋白質であっても、その変異がＤＥＲＰ２蛋白質の
３次元構造において保存性が高い変異であって、その変
異蛋白質がＤＥＲＰ２と同様に毛髪の成長を調節する機
能を有する蛋白質であれば、これらは本発明の範囲内に
あるものと言うことができる。変異の程度としては、配
列番号１に示したアミノ酸配列との相同性が、９０％以
上のものが許容し得る範囲である。Therefore, the novel protein D shown in SEQ ID NO: 1
Even if the mutant protein is a mutation due to substitution, insertion, deletion, or the like on the amino acid sequence of ERP2, the mutation is a highly conserved mutation in the three-dimensional structure of the DERP2 protein, and the mutant protein is similar to DERP2 in hair. As long as the proteins have a function of regulating growth, they can be said to be within the scope of the present invention. The degree of mutation is within a range in which homology with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is 90% or more.

【００２９】[0029]

【発明の効果】ＤＥＲＰ２が毛髪の成長を調節する機能
を有していることから、遺伝子ｄｅｒｐ２の発現異常や
ＤＥＲＰ２の活性発現異常は、毛髪の成長に影響を与え
るものと推測される。そのため、当該遺伝子の発現を調
節する物質やＤＥＲＰ２の機能を調節する物質は、発毛
剤または育毛剤として期待され得るものであり、遺伝子
ｄｅｒｐ２や蛋白質ＤＥＲＰ２は、この様な生理活性物
質の探索に利用することができる。例えば、遺伝子ｄｅ
ｒｐ２の転写発現系中に被験物質を同時に存在させ、遺
伝子ｄｅｒｐ２の発現量をＰＣＲ等の適当な方法で検出
することにより、被験物質の遺伝子発現に与える影響を
調べることができる。また、ＤＥＲＰ２に直接作用し
て、ＤＥＲＰ２の毛髪の成長を調節する機能を制御する
生理活性蛋白質の検索も行うことができる。EFFECT OF THE INVENTION Since DERP2 has a function of regulating hair growth, it is presumed that abnormal expression of gene derp2 and abnormal expression of DERP2 activity affect hair growth. Therefore, a substance that regulates the expression of the gene or a substance that regulates the function of DERP2 can be expected as a hair growth agent or a hair restorer, and the gene derp2 and the protein DERP2 can be used to search for such a physiologically active substance. Can be used. For example, the gene de
By causing a test substance to be present in the rp2 transcription expression system at the same time and detecting the expression level of the gene derp2 by an appropriate method such as PCR, the effect of the test substance on gene expression can be examined. It is also possible to search for a bioactive protein that directly acts on DERP2 and controls the function of DERP2 to regulate hair growth.

【００３０】[0030]

【実施例】以下実施例を挙げて詳述する。尚、以下特に
断らない限り、実施例で示す各種実験方法、例えば組み
換え体ｃＤＮＡの抽出やｃＤＮＡの塩基配列の決定等
は、いずれも当業者にとって自体公知の各種方法（Mole
cular Cloning、2nd.ed.,ColdSpring Harbor Lab.Press、
1989、その他当業者にとって標準的な方法を紹介した技
術解説書等に記載の方法）により行った。The present invention will be described in detail below with reference to examples. Unless otherwise noted below, various experimental methods shown in the examples, such as extraction of recombinant cDNA and determination of the nucleotide sequence of cDNA, are all methods known per se to those skilled in the art (Mole
cular Cloning, 2nd.ed., ColdSpring Harbor Lab.Press,
1989, and other methods described in technical manuals that introduce standard methods for those skilled in the art.

【００３１】＜１．毛乳頭細胞の分離と培養＞ヒト毛乳
頭細胞は、健常人男性（３０才）の発毛部頭皮の毛包か
らMessengerらの方法(Br. J. Dermatol. 114, 425, 198
6)に従って分離し、培養した。毛包下部から毛乳頭を取
り出し、１２％牛胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＭＥＭ
培地を入れたシャーレに設置し、５％ＣＯ₂／９５％ａ
ｉｒ、３７℃のＣＯ₂インキュベーター中で７日間培養
した。毛乳頭からアウトグロウスしてきた細胞を、０．
０５％トリプシン−０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液を用い
て回収した。分離した毛乳頭細胞は同培地で継代培養を
行い、継代４回目および５回目の細胞を実験に用いた。<1. Isolation and culture of hair papilla cells> Human hair papilla cells were obtained from the hair follicles of the hair growth part scalp of a healthy male (30 years old) by the method of Messenger et al. (Br. J. Dermatol. 114, 425, 198).
The cells were separated and cultured according to 6). The dermal papilla was removed from the lower part of the hair follicle and MEM supplemented with 12% fetal bovine serum (FBS)
Installed in a Petri dish containing medium, 5% CO ₂ /95% a
ir, and cultured in a CO ₂ incubator at 37 ° C. for 7 days. Cells that have outgrown from the dermal papilla are
Recovery was performed using a 05% trypsin-0.53 mM EDTA solution. The separated hair papilla cells were subcultured in the same medium, and the cells at the fourth and fifth passages were used in the experiment.

【００３２】＜２．遺伝子ｄｅｒｐ２のクローニング＞ １）遺伝子の部分配列の決定 ヒト毛乳頭細胞由来のｍＲＮＡを鋳型として、大久保ら
の方法（Okubo et al.Nature Genet.,1992、2、p173）に
従い、３’末端ｃＤＮＡライブラリーを作成した。当該
ライブラリーから無作為に７８９個の組換え体を選択
し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列を決定した。配列決定には
ＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM377）と同社製反
応キットを用いた。７８９個の組み換え体中の各ＤＮＡ
断片の発現頻度を解析した結果、図１に示す配列（配列
−１）を有する遺伝子の発現頻度が３／７８９であっ
た。<2. Cloning of gene derp2> 1) Determination of partial sequence of gene Using mRNA derived from human dermal papilla cells as a template, 3'-end cDNA library was prepared according to the method of Okubo et al. (Okubo et al. Nature Genet., 1992, 2, p173). Created a rally. 789 recombinants were randomly selected from the library, and the nucleotide sequence of the cDNA portion was determined. For sequencing, a DNA sequencer (PRISM377, manufactured by ABI) and a reaction kit manufactured by the company were used. Each DNA in 789 recombinants
As a result of analyzing the expression frequency of the fragment, the expression frequency of the gene having the sequence (sequence-1) shown in FIG. 1 was 3/789.

【００３３】２）配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクロー
ニング 配列−１を含むｃＤＮＡ断片のクローニングを以下の方
法により行った。まず、配列−１の一部分と逆相補鎖と
なるオリゴヌクレオチド（図１の配列−２）を、ＤＮＡ
合成機（ABI社製380B）で合成した。次いで、ラムダフ
ァージクローニングベクター（λＤＲ２）のｃＤＮＡ挿
入部位近傍の配列を有するオリゴヌクレオチド（図１の
配列−３）を、同様に合成した。λＤＲ２をクローニン
グベクターとする、Human Brain cerebral cortex 5'-S
TRETCH cDNA library（クロンテックラボラトリーズ社
製)を鋳型とし、配列−２のオリゴヌクレオチドと配列
−３のオリゴヌクレオチドをプライマーとし、さらにタ
カラLA PCR Kit Ver.2とＰＣＲサーマルサイクラーＭＰ
（いずれも宝酒造製）を用いて、以下のＰＣＲ操作を行
った。2) Cloning of cDNA Fragment Containing Sequence-1 The cDNA fragment containing Sequence-1 was cloned by the following method. First, an oligonucleotide (sequence-2 in FIG. 1) which is a reverse complementary strand to a part of sequence-1 was ligated to DNA
It was synthesized with a synthesizer (ABI 380B). Next, an oligonucleotide having a sequence near the cDNA insertion site of the lambda phage cloning vector (λDR2) (sequence-3 in FIG. 1) was similarly synthesized. Human Brain cerebral cortex 5'-S using λDR2 as a cloning vector
Using the TRETCH cDNA library (manufactured by Clontech Laboratories) as a template, the oligonucleotides of sequence-2 and sequence-3 as primers, and TAKARA LA PCR Kit Ver.2 and PCR Thermal Cycler MP
(Both manufactured by Takara Shuzo), the following PCR operation was performed.

【００３４】 cDNA library(≧10⁸pfu/ml) 5μl 10×PCRバッファー(25mM Mg⁺⁺を含む) 5μl 2.5mM dNTP 1μl 10μM 配列−２ 2μl 10μM 配列−３ 2μl 水 34.5μlLA Taqホ゜リメラーセ゛ 0.5μl 総量 50 μl ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分保持後、９８℃で２０
秒間反応させ、６８℃まで−１℃／２秒の速度で冷却
し、６８℃で３分保持し、更に７２℃で１０分間保持を
３０回繰り返して行った。CDNA library (≧ 10 ⁸ pfu / ml) 5 μl 10 × PCR buffer (including 25 mM Mg ⁺⁺ ) 5 μl 2.5 mM dNTP 1 μl 10 μM sequence-2 2 μl 10 μM sequence-3 2 μl water 34.5 μl LA Taq polymerase 0.5 μl A 50 μl PCR cycle is performed at 98 ° C. for 20 minutes after holding at 94 ° C. for 2 minutes.
The reaction was performed for 2 seconds, cooled to 68 ° C. at a rate of −1 ° C./2 seconds, kept at 68 ° C. for 3 minutes, and further kept at 72 ° C. for 10 minutes 30 times.

【００３５】上記方法により、配列−１を有するＤＮＡ
断片（約１．５ｋｂ）を特異的に増幅させた（図２）。According to the above method, DNA having sequence-1
The fragment (about 1.5 kb) was specifically amplified (FIG. 2).

【００３６】３）塩基配列決定用ベクターへのサブクロ
ーニング ２）で増幅したＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度１％）で分画した。ゲルをエチジウムブロマ
イドで染色した後、紫外光照射して目的とするバンドを
含むゲルを切り出した。アガロースゲルからのＤＮＡ断
片の抽出と精製は、GENECLEAN II Kit（バイオ １０１
社製）を用いて行った。3) Subcloning into base sequence determination vector The DNA fragment amplified in 2) was fractionated by agarose gel electrophoresis (gel concentration: 1%). The gel was stained with ethidium bromide, and then irradiated with ultraviolet light to cut out a gel containing a target band. Extraction and purification of DNA fragments from agarose gels were performed using the GENECLEAN II Kit (Bio 101
(Manufactured by Sharp Corporation).

【００３７】この抽出精製したＤＮＡ断片を、塩基配列
決定用ベクターpGEM-T（プロメガ社製）にサブクローニ
ングした（図３）。Ligation溶液はタカラDNA Ligation
KitVer.2（宝酒造製）を用い、以下の組成で１６℃で
１．５時間反応させた。The extracted and purified DNA fragment was subcloned into a base sequence determination vector pGEM-T (promega) (FIG. 3). Ligation solution is Takara DNA Ligation
Using KitVer.2 (manufactured by Takara Shuzo), the reaction was carried out at 16 ° C. for 1.5 hours with the following composition.

【００３８】 抽出精製したＤＮＡ断片 1μl(50ng) pGEM-T 1μl(17ng) 水 3μl Ligation溶液 5μl 総量 10μl 上記反応後の溶液を用いて、大腸菌Ｋ１２株ＤＨ５の形
質転換を行った。形質転換体をアンピシリン（Ａｍｐ）
５０μｇ／ｍｌ、5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside４０μｇ／ｍｌ、Isopropyl-β-D-Thio-Galac
topyranoside１００μＭを含有するＬＢ寒天培地にプレ
ーティングし、３７℃で一晩培養した。Extracted and purified DNA fragment 1 μl (50 ng) pGEM-T 1 μl (17 ng) Water 3 μl Ligation solution 5 μl Total volume 10 μl Escherichia coli K12 strain DH5 was transformed using the solution after the above reaction. Transformants were transformed into ampicillin (Amp)
50 μg / ml, 5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-β-D-ga
lactoside 40 μg / ml, Isopropyl-β-D-Thio-Galac
The cells were plated on LB agar medium containing 100 μM of topyranoside, and cultured at 37 ° C. overnight.

【００３９】上記プレートに出現したコロニーを５０μ
ｇ／ｍｌのＡｍｐを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種し
て３７℃で一晩培養し、遠心分離によって菌体を集めた
後、QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit（キアゲン社
製）で組換えＤＮＡを精製した。The colonies appearing on the plate were
After inoculating 10 ml of LB liquid medium containing g / ml of Amp and culturing at 37 ° C. overnight and collecting cells by centrifugation, recombinant DNA was purified using QIAprep Spin Plasmid Miniprep Kit (Qiagen). .

【００４０】４）ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 塩基配列決定にはＤＮＡシークエンサー（ABI社製PRISM
377）を用い、ダイターミネーター法を用いた。決定さ
れた塩基配列を元にしてオリゴヌクレオチドを合成し、
プライマーウオーキング法で両鎖の全塩基配列を決定し
た（図４）。当該クローンのｃＤＮＡの全塩基配列を配
列番号３に示す。当該塩基配列が配列−２及び配列−１
のうち配列−２の上流領域を含んでいたことから、目的
とする遺伝子ｄｅｒｐ２がクローニングされたことを確
認した。4) Determination of base sequence of DNA fragment For base sequence determination, use a DNA sequencer (PRISM manufactured by ABI).
377) and the die terminator method was used. Synthesize an oligonucleotide based on the determined base sequence,
The entire nucleotide sequences of both strands were determined by the primer walking method (FIG. 4). SEQ ID NO: 3 shows the entire nucleotide sequence of the cDNA of the clone. The base sequence is sequence-2 and sequence-1
Contained the upstream region of sequence-2, it was confirmed that the target gene derp2 was cloned.

【００４１】当該ｃＤＮＡは３４５残基より成る蛋白質
（ＤＥＲＰ２）をコードするＯＲＦを含んでいる（配列
番号３）。該蛋白質の開始コドンであるメチオニン残基
の上流域に同じreading frameで終止コドンが出現した
ことから、当該ｃＤＮＡ断片がコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列は配列番号３に示したものが唯一のものである
ことが確認された。The cDNA contains an ORF encoding a protein (DERP2) consisting of 345 residues (SEQ ID NO: 3). Since a stop codon appeared in the same reading frame upstream of the methionine residue as the start codon of the protein, the only amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA fragment is that shown in SEQ ID NO: 3. It was confirmed that.

【００４２】＜３．抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体の調製＞
抗ペプチド抗体は、細胞工学別冊抗ペプチド抗体実験プ
ロトコール（大海忍、辻村邦夫著、秀潤社）に従って作
成した。ＤＥＲＰ２のアミノ酸配列の一部を含むペプチ
ド（図１の配列−４）を、ペプチドシンセサイザー（AB
I社製）を用いて合成し、これをキャリア蛋白質へモシ
アニンにマレイミド法で架橋して抗原とした。この抗原
０．５ｍｇをウサギ（Ｋｂｌ：ＪＷ、１０齢, オス）の
背部皮下に注入した。初回免疫後１４、２８、４２日後
に同量の抗原を用いて更に免疫を行い、初回免疫から５
２日目に全血を採取した。抗血清から、硫酸アンモニウ
ム塩析法により粗ＩｇＧ画分を調製し、さらにプロテイ
ンＡセファロースカラム、続いて抗原ペプチド固定化カ
ラムを用いてアフィニティー精製を行い、抗原特異的な
抗体を取得した。この抗体は、in vitro 転写翻訳シス
テム（プロメガ社製）を用いて翻訳合成したＤＥＲＰ２
に特異的に結合した。また、毛乳頭細胞を１ｍＭ ＳＤ
Ｓ溶液に溶解して調製した蛋白質溶液に存在する３７ｋ
ｄの蛋白質と特異的に結合した。<3. Preparation of anti-DERP2 peptide antibody>
The anti-peptide antibody was prepared according to the Cell Engineering Separate Volume Anti-Peptide Antibody Experimental Protocol (written by Shinobu Okai and Kunio Tsujimura, Shujunsha). A peptide containing a part of the amino acid sequence of DERP2 (sequence-4 in FIG. 1) was converted to a peptide synthesizer (AB
(Manufactured by I company), and this was cross-linked to the carrier protein hemocyanin by the maleimide method to obtain an antigen. 0.5 mg of this antigen was subcutaneously injected into the back of a rabbit (Kbl: JW, 10-year-old, male). At 14, 28 and 42 days after the first immunization, further immunization was carried out using the same amount of antigen, and 5 days after the first immunization.
On day 2, whole blood was collected. From the antiserum, a crude IgG fraction was prepared by the ammonium sulfate salting-out method, and further subjected to affinity purification using a protein A sepharose column, followed by an antigen peptide-immobilized column to obtain an antigen-specific antibody. This antibody was derived from a translationally synthesized DERP2 using an in vitro transcription / translation system (Promega).
Specifically bound. In addition, hair papilla cells were treated with 1 mM SD
37k present in protein solution prepared by dissolving in S solution
d specifically bound to the protein.

【００４３】＜４．毛乳頭細胞の抗体染色＞１．で分離
培養した毛乳頭細胞を、８穴チャンバースライド（Nun
c）に１．５ｘ１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように
播種し、１２％ＦＢＳを添加したＭＥＭ培地中で、一晩
培養した。培地を除去し、細胞を４％パラホルムアルデ
ヒド−０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて室温で１５分
間固定した。これを抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体５μｇ／
ｍｌで４℃、一晩処理し、更にビオチン化抗ラビットＩ
ｇＧ抗体を反応させた後、AEC staining kit（シグマ社
製）で発色させた。その結果を図５に示した。毛乳頭細
胞の核周辺のオルガネラ（ER-Golgiの領域）が強く染色
された。<4. Antibody staining of hair papilla cells> 1. The dermal papilla cells isolated and cultured in the above were placed in an 8-well chamber slide (Nun
C) was seeded at 1.5 × 10 ⁴ cells / well and cultured overnight in a MEM medium supplemented with 12% FBS. The medium was removed and cells were fixed with 4% paraformaldehyde-0.25% Tween 20 for 15 minutes at room temperature. This was added to the anti-DERP2 peptide antibody 5 μg /
and treated overnight at 4 ° C with biotinylated anti-rabbit I
After the reaction with the gG antibody, the color was developed using an AEC staining kit (manufactured by Sigma). The results are shown in FIG. Organelles around the nucleus of the dermal papilla cells (ER-Golgi region) were strongly stained.

【００４４】＜５．毛乳頭細胞におけるｄｅｒｐ２の発
現＞１．で分離培養した健常人男性（３０才）発毛部由
来の毛乳頭細胞、および同様の方法で分離した男性型脱
毛症患者男性（３４才）禿頭部由来の毛乳頭細胞から、
常法により全ＲＮＡを抽出した。各全ＲＮＡ１μｇを、
DNaseI(Gibco BRL)１ユニット（Ｕ）で処理した後、Oli
go(dT)_12-18 Primer(GIBCO BRL)およびSuperscriptII(G
IBCO BRL)を用いて、SuperscriptII添付のプロトコール
に従い、ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡ合成機（ABI社製380B）で合成したｄｅｒｐ
２特異的なプライマー（図１の配列−５および６）を用
いて、全量４０μｌとして以下のＰＣＲを行った。<5. Expression of derp2 in hair papilla cells> 1. Hair papilla cells derived from the hair growth part of a healthy male (30 years old) isolated and cultured in the above, and hair papilla cells derived from a male baldness patient (34 years old) bald isolated in the same manner,
Total RNA was extracted by a conventional method. 1 μg of each total RNA
After treatment with 1 unit (U) of DNaseI (Gibco BRL), Oli
go (dT) _12-18 Primer (GIBCO BRL) and Superscript II (G
Using IBCO BRL), cDNA was synthesized according to the protocol attached to SuperscriptII. Using this cDNA as a template, derp synthesized with a DNA synthesizer (380B manufactured by ABI)
The following PCR was performed using two specific primers (sequences -5 and 6 in FIG. 1) in a total volume of 40 μl.

【００４５】 cDNA 40ng Ex taq buffer (Takara) ×1 dNTPs (Takara) 0.16mM [α-32P]-dCTP (NEN) 590kBq Ex Taq (Takara) 2 U 配列−５ 0.2μM 配列−６ 0.2μM ＰＣＲサイクルは、９４℃で２分間加熱後、９４℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分を１８サイクル繰り返し
た。CDNA 40 ng Ex taq buffer (Takara) × 1 dNTPs (Takara) 0.16 mM [α-32P] -dCTP (NEN) 590 kBq Ex Taq (Takara) 2 U sequence-5 0.2 μM sequence-6 0.2 μM PCR cycle After heating at 94 ° C for 2 minutes,
Second, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 minute were repeated 18 cycles.

【００４６】この反応液６μｌを、１２％ポリアクリル
アミドゲルを用いて電気泳動し、ゲルを乾燥後、BAS−2
000II（フジフィルム）にて、増幅されたｄｅｒｐ２断
片に取り込まれた放射能を測定した。ｄｅｒｐ２ｍＲＮ
Ａ量は、測定した放射能を増幅産物中のdCTP含量で補正
後、内部標準として用いたLibosomal protein S26に対
する相対値として表した。その結果を図６に示す。6 μl of this reaction solution was subjected to electrophoresis using a 12% polyacrylamide gel, and the gel was dried.
The radioactivity incorporated in the amplified derp2 fragment was measured using 000II (Fujifilm). derp2mRN
The amount of A was expressed as a relative value to Libosomal protein S26 used as an internal standard after correcting the measured radioactivity with the dCTP content in the amplification product. FIG. 6 shows the result.

【００４７】男性型脱毛症患者禿頭部由来の毛乳頭細胞
では、健常人発毛部由来の毛乳頭細胞と比較して、ｄｅ
ｒｐ２ｍＲＮＡの発現が高かった。In the hair papilla cells derived from the bald head of a male pattern baldness patient, compared to the hair papilla cells derived from a normal human hair growth part,
The expression of rp2 mRNA was high.

【００４８】＜６．テストステロン処理による遺伝子ｄ
ｅｒｐ２の発現変化＞１．と同様の方法で、男性型脱毛
症患者男性（３８才）発毛部由来の毛乳頭細胞を分離培
養した。継代５回目の細胞を、２Ｘ１０⁵ｃｅｌｌｓ／
６ｃｍシャーレにとなるように播種し、コンフルエント
に達するまで培養した。その後、培地をテストステロン
添加培地（０、１０、５０、２５０ｎＭ）と交換して、
２４〜７２時間さらに培養した。培地を除去後、細胞を
ＰＢＳ（−）で洗浄し、全ＲＮＡを抽出した。５．と同
様にして調製したｃＤＮＡ４０ｎｇを鋳型とし、配列−
５および配列−６をプライマーとして、全量２０μｌで
以下のＰＣＲを行った。<6. Gene d by testosterone treatment
Change in expression of erp2> 1. In the same manner as described above, hair papilla cells derived from the hair growth part of a male (38-year-old) male pattern baldness patient were separated and cultured. The cells at passage 5 were subjected to 2 × 10 ⁵ cells /
The cells were seeded so as to form a 6 cm petri dish and cultured until they reached confluence. Thereafter, the medium was replaced with a testosterone-supplemented medium (0, 10, 50, 250 nM),
Further culturing was performed for 24 to 72 hours. After removing the medium, the cells were washed with PBS (-) to extract total RNA. 5. Using 40 ng of cDNA prepared in the same manner as
5 and Sequence-6 were used as primers and the following PCR was carried out in a total volume of 20 μl.

【００４９】 cDNA 40ng Ex taq buffer (Takara) 1x dNTPs (Takara) 0.5mM Ex Taq (Takara) 1U 配列−５ 0.5μM 配列−６ 0.5μM ＰＣＲサイクルは、９５℃で２分間加熱後、９５℃３０
秒、６０℃３０秒、７２℃１分を２３サイクル繰り返し
た。CDNA 40 ng Ex taq buffer (Takara) 1x dNTPs (Takara) 0.5 mM Ex Taq (Takara) 1U Sequence-5 0.5 μM Sequence-6 0.5 μM The PCR cycle consists of heating at 95 ° C. for 2 minutes, and then heating at 95 ° C. for 30 minutes.
Second, 60 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 1 minute were repeated 23 cycles.

【００５０】この反応液を、２％アガロースゲルを用い
て電気泳動し、エチジウムブロマイドにて染色した。結
果を図７に示す。５０ｎＭ以上のテストステロンを添加
した培養により、毛乳頭細胞における遺伝子ｄｅｒｐ２
の発現量が増加することが確認された。The reaction solution was subjected to electrophoresis using a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide. FIG. 7 shows the results. By culturing with the addition of 50 nM or more testosterone, the gene
Was confirmed to increase in the expression level.

【００５１】[0051]

【配列表】 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：３４５残基 配列の型 ：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser Arg 5 10 15 Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys Asn 20 25 30 Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu Tyr 35 40 45 Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile Phe 65 70 75 Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala Ala 80 85 90 Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser Asn 95 100 105 Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr Val 110 115 120 Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser Ile 125 130 135 Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro Val 140 145 150 Leu Met Asn Phe Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly Val 155 160 165 Thr Phe Ala Ala Met Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser Ile 170 175 180 Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu Leu 185 190 195 His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile Leu 200 205 210 Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly Ile 215 220 225 Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu Lys 230 235 240 Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu Val 245 250 255 Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr Val 260 265 270 Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu Val 275 280 285 Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile Lys 290 295 300 Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp Pro 305 310 315 Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile Phe 320 325 330 Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys Lys 335 340 345 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ：１０３５塩基 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 10 20 30 40 50 60 ATGTTGGCTG CAAGGCTGGT GTGTCTCCGG ACACTACCTT CTAGGGTTTT CCACCCAGCT 60 TTCACCAAGG CCTCCCCTGT TGTGAAGAAT TCCATCACGA AGAATCAATG GCTGTTAACA 120 CCTAGCAGGG AATATGCCAC CAAAACAAGA ATTGGGATCC GGCGTGGGAG AACTGGCCAA 180 GAACTCAAAG AGGCAGCATT GGAACCATCG ATGGAAAAAA TATTTAAAAT TGATCAGATG 240 GGAAGATGGT TTGTTGCTGG AGGGGCTGCT GTTGGTCTTG GAGCATTGTG CTACTATGGC 300 TTGGGACTGT CTAATGAGAT TGGAGCTATT GAAAAGGCTG TAATTTGGCC TCAGTATGTC 360 AAGGATAGAA TTCATTCCAC CTATATGTAC TTAGCAGGGA GTATTGGTTT AACAGCTTTG 420 TCTGCCATAG CAATCAGCAG AACGCCTGTT CTCATGAACT TCATGATGAG AGGCTCTTGG 480 GTGACAATTG GTGTGACCTT TGCAGCCATG GTTGGAGCTG GAATGCTGGT ACGATCAATA 540 CCATATGACC AGAGCCCAGG CCCAAAGCAT CTTGCTTGGT TGCTACATTC TGGTGTGATG 600 GGTGCAGTGG TGGCTCCTCT GACAATATTA GGGGGTCCTC TTCTCATCAG AGCTGCATGG 660 TACACAGCTG GCATTGTGGG AGGCCTCTCC ACTGTGGCCA TGTGTGCGCC CAGTGAAAAG 720 TTTCTGAACA TGGGTGCACC CCTGGGAGTG GGCCTGGGTC TCGTCTTTGT GTCCTCATTG 780 GGATCTATGT TTCTTCCACC TACCACCGTG GCTGGTGCCA CTCTTTACTC AGTGGCAATG 840 TACGGTGGAT TAGTTCTTTT CAGCATGTTC CTTCTGTATG ATACCCAGAA AGTAATCAAG 900 CGTGCAGAAG TATCACCAAT GTATGGAGTT CAAAAATATG ATCCCATTAA CTCGATGCTG 960 AGTATCTACA TGGATACATT AAATATATTT ATGCGAGTTG CAACTATGCT GGCAACTGGA 1020 GGCAACAGAA AGAAA 1035 配列の数：１ 配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：３ 配列の長さ：１２６８塩基 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 AACTGCGAGG CGAAGGTGAC CGGGGACCGA GCATTTCAGA TCTGCTCGGT AGACCTGGTG 60 CACCACCACC ATG TTG GCT GCA AGG CTG GTG TGT CTC CGG ACA CTA CCT TCT 112 Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser 1 5 10 AGG GTT TTC CAC CCA GCT TTC ACC AAG GCC TCC CCT GTT GTG AAG 157 Arg Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys 15 20 25 AAT TCC ATC ACG AAG AAT CAA TGG CTG TTA ACA CCT AGC AGG GAA 202 Asn Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu 30 35 40 TAT GCC ACC AAA ACA AGA ATT GGG ATC CGG CGT GGG AGA ACT GGC 247 Tyr Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly 45 50 55 CAA GAA CTC AAA GAG GCA GCA TTG GAA CCA TCG ATG GAA AAA ATA 292 Gln Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile 60 65 70 TTT AAA ATT GAT CAG ATG GGA AGA TGG TTT GTT GCT GGA GGG GCT 337 Phe Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala 75 80 85 GCT GTT GGT CTT GGA GCA TTG TGC TAC TAT GGC TTG GGA CTG TCT 382 Ala Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser 90 95 100 AAT GAG ATT GGA GCT ATT GAA AAG GCT GTA ATT TGG CCT CAG TAT 427 Asn Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr 105 110 115 GTC AAG GAT AGA ATT CAT TCC ACC TAT ATG TAC TTA GCA GGG AGT 472 Val Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser 120 125 130 ATT GGT TTA ACA GCT TTG TCT GCC ATA GCA ATC AGC AGA ACG CCT 517 Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro 135 140 145 GTT CTC ATG AAC TTC ATG ATG AGA GGC TCT TGG GTG ACA ATT GGT 562 Val Leu Met Asn Phe Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly 150 155 160 GTG ACC TTT GCA GCC ATG GTT GGA GCT GGA ATG CTG GTA CGA TCA 607 Val Thr Phe Ala Ala Met Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser 165 170 175 ATA CCA TAT GAC CAG AGC CCA GGC CCA AAG CAT CTT GCT TGG TTG 652 Ile Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu 180 185 190 CTA CAT TCT GGT GTG ATG GGT GCA GTG GTG GCT CCT CTG ACA ATA 697 Leu His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile 195 200 205 TTA GGG GGT CCT CTT CTC ATC AGA GCT GCA TGG TAC ACA GCT GGC 742 Leu Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly 210 215 220 ATT GTG GGA GGC CTC TCC ACT GTG GCC ATG TGT GCG CCC AGT GAA 787 Ile Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu 225 230 235 AAG TTT CTG AAC ATG GGT GCA CCC CTG GGA GTG GGC CTG GGT CTC 832 Lys Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu 240 245 250 GTC TTT GTG TCC TCA TTG GGA TCT ATG TTT CTT CCA CCT ACC ACC 877 Val Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr 255 260 265 GTG GCT GGT GCC ACT CTT TAC TCA GTG GCA ATG TAC GGT GGA TTA 922 Val Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu 270 275 280 GTT CTT TTC AGC ATG TTC CTT CTG TAT GAT ACC CAG AAA GTA ATC 967 Val Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile 285 290 295 AAG CGT GCA GAA GTA TCA CCA ATG TAT GGA GTT CAA AAA TAT GAT 1012 Lys Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp 300 305 310 CCC ATT AAC TCG ATG CTG AGT ATC TAC ATG GAT ACA TTA AAT ATA 1057 Pro Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile 315 320 325 TTT ATG CGA GTT GCA ACT ATG CTG GCA ACT GGA GGC AAC AGA AAG 1102 Phe Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys 330 335 340 AAA TGA AGTGACT CAGCTTCTGG CTTCTCTGCT ACATCAAATA TCTTGTTTAA 1155 Lys 345 TGGGGCAGAT ATGCATTAAA TAGTTTGTAC AAGCAGCTTT CGTTGAAGTT TAGAAGATAA 1215 GAAACATGTC ATCATATTTA AATGTTCCGG TAATGTGATG CCTCAGGTCT GCC 1268[Sequence List] Number of sequences: 1 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 345 residues Sequence type: amino acid Topology: linear Sequence type: protein sequence Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser Arg 5 10 15 Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys Asn 20 25 30 Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu Tyr 35 40 45 Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly Gln 50 55 60 Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile Phe 65 70 75 Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala Ala 80 85 90 Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser Asn 95 100 105 Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr Val 110 115 120 Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser Ile 125 130 135 Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro Val 140 145 150 Leu Met Asn Phe Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly Val 155 160 165 Thr Phe Ala Ala Me t Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser Ile 170 175 180 Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu Leu 185 190 195 His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile Leu 200 205 210 Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly Ile 215 220 225 Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu Lys 230 235 240 Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu Val 245 250 255 Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr Val 260 265 270 Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu Val 275 280 285 Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile Lys 290 295 300 Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp Pro 305 310 315 Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile Phe 320 325 330 Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys Lys 335 340 345 Number of sequences: 1 Sequence number (SEQ ID NO): 2 Length of sequence: 1035 bases Sequence type: Number of nucleic acid strands: Double strand Logistics -: linear sequence type: cDNA-to mRNA sequence 10 20 30 40 50 60 ATGTTGGCTG CAAGGCTGGT GTGTCTCCGG ACACTACCTT CTAGGGTTTT CCACCCAGCT 60 TTCACCAAGG CCTCCCCTGT TGTGAAGAAT TCCATCACGA AGAATCAATG GCTGTTAACA 120 CCTAGCAGGG AATATGCCAC CAAAACAAGA ATTGGGATCC GGCGTGGGAG AACTGGCCAA 180 GAACTCAAAG AGGCAGCATT GGAACCATCG ATGGAAAAAA TATTTAAAAT TGATCAGATG 240 GGAAGATGGT TTGTTGCTGG AGGGGCTGCT GTTGGTCTTG GAGCATTGTG CTACTATGGC 300 TTGGGACTGT CTAATGAGAT TGGAGCTATT GAAAAGGCTG TAATTTGGCC TCAGTATGTC 360 AAGGATAGAA TTCATTCCAC CTATATGTAC TTAGCAGGGA GTATTGGTTT AACAGCTTTG 420 TCTGCCATAG CAATCAGCAG AACGCCTGTT CTCATGAACT TCATGATGAG AGGCTCTTGG 480 GTGACAATTG GTGTGACCTT TGCAGCCATG GTTGGAGCTG GAATGCTGGT ACGATCAATA 540 CCATATGACC AGAGCCCAGG CCCAAAGCAT CTTGCTTGGT TGCTACATTC TGGTGTGATG 600 GGTGCAGTGG TGGCTCCTCT GACAATATTA GGGGGTCCTC TTCTCATCAG AGCTGCATGG 660 TACACAGCTG GCATTGTGGG AGGCCTCTCC ACTGTGGCCA TGTGTGCGCC CAGTGAAAAG 720 TTTCTGAACA TGGGTGCACC CCTGGGAGTG GGCCTGGGTC TCGTCTTTGT GTCCTCATTG 780 GGATCTATGT TTCTTCCACC TACCACCGTG GCTGGTGCCA CTCTTTACTC AGTGGCAATG 840 TACGGTGGAT TAGTTCTTTT CAGCATGTTC CTTCTGTATG ATACCCAGAA AGTAATCAAG 900 CGTGCAGAAG TATCACCAAT GTATGGAGTT CAAAAATATG ATCCCATTAA CTCGATGCTG 960 AGTATCTACA TGGATACATT AAATATATTT ATGCGAGTTG CAACTATGCT GGCAACTGGA 1020 GGCAACAGAA AGAAA 1035 Number of sequences: 1 SEQ ID NO: (SEQ ID NO): 3 sequence Length: 1268 Nucleotide sequence type: Number of nucleic acid strands: Double strand Topology: Linear type of sequence: cDNA to mRNA sequence AACTGCGAGG CGAAGGTGAC CGGGGACCGA GCATTTCAGA TCTGCTCGGT AGACCTGGTG 60 CACCACCACC ATG TTG GCT GCA AGG CTG GTG TGT CTC CGG ACA CTACT Met Leu Ala Ala Arg Leu Val Cys Leu Arg Thr Leu Pro Ser 1 5 10 AGG GTT TTC CAC CCA GCT TTC ACC AAG GCC TCC CCT GTT GTG AAG 157 Arg Val Phe His Pro Ala Phe Thr Lys Ala Ser Pro Val Val Lys 15 20 25 AAT TCC ATC ACG AAG AAT CAA TGG CTG TTA ACA CCT AGC AGG GAA 202 Asn Ser Ile Thr Lys Asn Gln Trp Leu Leu Thr Pro Ser Arg Glu 30 35 40 TAT GCC ACC AAA ACA AGA AGA ATT GGG ATC CGG CGT GGG AGA ACT GGC 247 Tyr Ala Thr Lys Thr Arg Ile Gly Ile Arg Arg Gly Arg Thr Gly 45 50 55 CAA GAA CTC AAA GAG GCA GCA TTG GAA CCA TCG ATG GAA AAA ATA 292 Gln Glu Leu Lys Glu Ala Ala Leu Glu Pro Ser Met Glu Lys Ile 60 65 70 TTT AAA ATT GAT CAG ATG GGA AGA TGG TTT GTT GCT GGA GGG GCT 337 Phe Lys Ile Asp Gln Met Gly Arg Trp Phe Val Ala Gly Gly Ala 75 80 85 GCT GTT GGT CTT GGA GCA TTG TGC TAC TAT GGC TTG GGA CTG TCT 382 Ala Val Gly Leu Gly Ala Leu Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Leu Ser 90 95 100 AAT GAG ATT GGA GCT ATT GAA AAG GCT GTA ATT TGG CCT CAG TAT 427 Asn Glu Ile Gly Ala Ile Glu Lys Ala Val Ile Trp Pro Gln Tyr 105 110 115 GTC AAG GAT AGA ATT CAT TCC ACC TAT ATG TAC TTA GCA GGG AGT 472 Val Lys Asp Arg Ile His Ser Thr Tyr Met Tyr Leu Ala Gly Ser 120 125 130 ATT GGT TTA ACA GCT TTG TCT GCC ATA GCA ATC AGC AGA ACG CCT 517 Ile Gly Leu Thr Ala Leu Ser Ala Ile Ala Ile Ser Arg Thr Pro 135 140 145 GTT CTC ATG AAC TTC ATG ATG AGA GGC TCT TGG GTG ACA ATT GGT 562 Val Leu Met Asn Ph e Met Met Arg Gly Ser Trp Val Thr Ile Gly 150 155 160 GTG ACC TTT GCA GCC ATG GTT GGA GCT GGA ATG CTG GTA CGA TCA 607 Val Thr Phe Ala Ala Ala Met Val Gly Ala Gly Met Leu Val Arg Ser 165 170 175 ATA CCA TAT GAC CAG AGC CCA GGC CCA AAG CAT CTT GCT TGG TTG 652 Ile Pro Tyr Asp Gln Ser Pro Gly Pro Lys His Leu Ala Trp Leu 180 185 190 CTA CAT TCT GGT GTG ATG GGT GCA GTG GTG GCT CCT CTG ACA ATA 697 Leu His Ser Gly Val Met Gly Ala Val Val Ala Pro Leu Thr Ile 195 200 205 TTA GGG GGT CCT CTT CTC ATC AGA GCT GCA TGG TAC ACA GCT GGC 742 Leu Gly Gly Pro Leu Leu Ile Arg Ala Ala Trp Tyr Thr Ala Gly 210 215 220 ATT GTG GGA GGC CTC TCC ACT GTG GCC ATG TGT GCG CCC AGT GAA 787 Ile Val Gly Gly Leu Ser Thr Val Ala Met Cys Ala Pro Ser Glu 225 230 235 AAG TTT CTG AAC ATG GGT GCA CCC CTG GGA GTG GGC CTG GGT CTC 832 Lys Phe Leu Asn Met Gly Ala Pro Leu Gly Val Gly Leu Gly Leu 240 245 250 GTC TTT GTG TCC TCA TTG GGA TCT ATG TTT CTT CCA CCT ACC ACC 877 Val Phe Val Ser Ser Leu Gly Ser Met Phe Leu Pro Pro Thr Thr 255 26 0 265 GTG GCT GGT GCC ACT CTT TAC TCA GTG GCA ATG TAC GGT GGA TTA 922 Val Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Ser Val Ala Met Tyr Gly Gly Leu 270 275 280 GTT CTT TTC AGC ATG TTC CTT CTG TAT GAT ACC CAG AAA GTA ATC 967 Val Leu Phe Ser Met Phe Leu Leu Tyr Asp Thr Gln Lys Val Ile 285 290 295 AAG CGT GCA GAA GTA TCA CCA ATG TAT GGA GTT CAA AAA TAT GAT 1012 Lys Arg Ala Glu Val Ser Pro Met Tyr Gly Val Gln Lys Tyr Asp 300 305 310 CCC ATT AAC TCG ATG CTG AGT ATC TAC ATG GAT ACA TTA AAT ATA 1057 Pro Ile Asn Ser Met Leu Ser Ile Tyr Met Asp Thr Leu Asn Ile 315 320 325 TTT ATG CGA GTT GCA ACT ATG CTG GCA ACT GGA GGC AAC AGA AAG 1102 Phe Met Arg Val Ala Thr Met Leu Ala Thr Gly Gly Asn Arg Lys 330 335 340 AAA TGA AGTGACT CAGCTTCTGG CTTCTCTGCT ACATCAAATA TCTTGTTTAA 1155 Lys 345 TGGGGCAGAT ATGCATTAAT TAGTTTGTAC ATGATCATGATCGATCATGATCGATCATGAC

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】配列−１は、ヒト毛乳頭細胞から大久保らの方
法により得られる３’末端ｃＤＮＡライブラリーから、
３／７８９の頻度で確認されるＤＮＡ断片の塩基配列を
表わす。配列−２は、配列−１の一部分の逆相補鎖の配
列を示す。配列−３は、ラムダファージクローニングベ
クターのｃＤＮＡ挿入部近傍の配列を有するオリゴヌク
レオチドの配列を示す。配列−４は、抗ＤＥＲＰ２ペプ
チド抗体を調製するために使用した、ＤＥＲＰ２の部分
配列を含む抗原ペプチドの配列を示す。配列−５は、ｄ
ｅｒｐ２をＰＣＲで増幅するための部分配列である。配
列−６は、ｄｅｒｐ２をＰＣＲで増幅するための部分配
列である。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows that the sequence-1 was obtained from a 3′-end cDNA library obtained from human hair papilla cells by the method of Okubo et al.
This represents the base sequence of the DNA fragment confirmed at a frequency of 3/789. Sequence-2 shows the sequence of the reverse complement of a part of sequence-1. Sequence-3 shows the sequence of an oligonucleotide having a sequence near the cDNA insertion site of the lambda phage cloning vector. Sequence-4 shows the sequence of the antigen peptide containing the partial sequence of DERP2 used for preparing the anti-DERP2 peptide antibody. Sequence-5 is d
This is a partial sequence for amplifying erp2 by PCR. Sequence-6 is a partial sequence for amplifying derp2 by PCR.

【図２】配列−１を含むｃＤＮＡライブラリーに対する
ＰＣＲを示す。FIG. 2 shows PCR on a cDNA library containing Sequence-1.

【図３】クローニングベクターpGEM Tに遺伝子ｄｅｒｐ
２を組み換えるスキームを示す。FIG. 3 shows the gene derp in the cloning vector pGEMT.
2 shows a scheme for rearranging 2.

【図４】プライマーウォーキング法の概略を示す。FIG. 4 shows an outline of a primer walking method.

【図５】抗ＤＥＲＰ２ペプチド抗体を用いて、分離培養
した毛乳頭細胞を免疫染色した図を示す。FIG. 5 shows a diagram in which hair papilla cells separated and cultured are immunostained using an anti-DERP2 peptide antibody.

【図６】健常人男性発毛部由来の毛乳頭細胞および男性
型脱毛症患者禿頭部由来の毛乳頭細胞での、遺伝子ｄｅ
ｒｐ２の発現量を比較した図を示す。FIG. 6 shows the gene de in hair papilla cells derived from the hair growth region of a healthy male male and hair papilla cells derived from the bald area of a male pattern baldness patient
The figure which compared the expression level of rp2 is shown.

【図７】各種濃度のテストステロンの存在下での、遺伝
子ｄｅｒｐ２の発現を示した図を示す。FIG. 7 shows a diagram showing the expression of the gene derp2 in the presence of various concentrations of testosterone.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 釣谷 克樹 東京都豊島区高田３丁目24番地１号 大正 製薬株式会社内 (72)発明者 荒瀬 誠治 徳島県徳島市南矢三町３丁目９番15号Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI (C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Katsuki Katsuki 3--24-1, Takada, Toshima-ku, Tokyo Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. (72 ) Inventor Seiji Arase 3-9-115 Minamiyasancho, Tokushima City, Tokushima Prefecture

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質； （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる蛋白
質； （ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなり、かつ毛髪の成長を調節する機能を有す
る蛋白質。1. A protein of the following (a) or (b): (a) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (b) one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A protein comprising an amino acid sequence in which is deleted, substituted or added, and having a function of regulating hair growth. 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ （ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ （ｂ）配列番号：２のＤＮＡとストリンジェントな条件
でハイブリダイズし、かつ毛髪の成長を調節する機能を
有する蛋白質をコードするＤＮＡ。2. A DNA of the following (a) or (b): (a) a DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2; (b) a DNA hybridizing with the DNA of SEQ ID NO: 2 under stringent conditions; DNA encoding a protein having a function of regulating hair growth.