JPH0523182A - Bovine transglutaminase - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To stably obtain a large amount of bovine transglutaminase by a genetic engineering method. CONSTITUTION:A bovine transglutaminase was cloned and its base sequence and the amino acid sequence estimated therefrom were clarified. Pure bovine transglutaminase can stably produced in large amount by using the above findings.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明はウシトランスグルタミナ
ーゼをコードするＤＮＡをクローニングし、それを使用
してウシトランスグルタミナーゼを遺伝子工学的手法を
用いて効率よく生産する方法およびウシトランスグルタ
ミナーゼに関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for cloning bovine transglutaminase-encoding DNA, and using the cloned DNA to efficiently produce bovine transglutaminase using a genetic engineering technique, and a bovine transglutaminase.

【０００２】[0002]

【従来の技術】トランスグルタミナーゼはタンパク質の
翻訳後修飾酵素の一つであり、ペプチド鎖中のグルタミ
ン残基のγ−カルボキシアミド基をアシル供与体とし、
タンパク質やペプチド鎖中のリジン残基のε−アミノ基
を受容体とするアシル転移反応を触媒する酵素である。
このアシル転移反応にはグルタミン残基へのアミン化合
物の付加反応や、タンパク質間架橋反応、或いはアミン
基質非存在下でのグルタミン残基のグルタミン酸残基へ
の脱アミド化反応が含まれる。トランスグルタミナーゼ
は哺乳動物の肝臓、血清、血小板、毛のう、表皮等に存
在し、上記反応中のタンパク質間架橋反応によって、血
液凝固カスケード反応の最終ステップであるフィブリン
モノマーの架橋重合による安定化、表皮組織の角質層に
おける不溶性タンパク質の形成、毛タンパクの架橋形成
などに関与している。トランスグルタミナーゼは上記の
ような生理機能の他にも、細胞の増殖、分化との関係や
肝疾患等の診断に利用し得ることも言われており、この
酵素を多量に入手する方法の開発が望まれている。2. Description of the Related Art Transglutaminase is one of the post-translational modification enzymes for proteins. It uses the γ-carboxamide group of the glutamine residue in the peptide chain as an acyl donor,
It is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction using the ε-amino group of a lysine residue in a protein or peptide chain as an acceptor.
This acyl transfer reaction includes an addition reaction of an amine compound to a glutamine residue, a protein-protein crosslinking reaction, or a deamidation reaction of a glutamine residue to a glutamic acid residue in the absence of an amine substrate. Transglutaminase is present in mammalian liver, serum, platelets, hair follicles, epidermis, etc., and is stabilized by cross-linking polymerization of fibrin monomer which is the final step of blood coagulation cascade reaction due to inter-protein cross-linking reaction in the above reaction, It is involved in the formation of insoluble proteins in the stratum corneum of epidermal tissues and the cross-linking of hair proteins. It is said that transglutaminase can be used for the diagnosis of relations with cell proliferation and differentiation, liver diseases and the like in addition to the above-mentioned physiological functions, and development of a method for obtaining a large amount of this enzyme has been developed. Is desired.

【０００３】現在、トランスグルタミナーゼの良質な供
給源としてはモルモットの肝臓が用いられている。しか
しながら、これは質的には良好であるものの取得出来る
量が限られており、更に精製法が非常に複雑であり、収
率が極めて悪い上、モルモット自体が非常に高価で、よ
り効率的な方法の開発が望まれていた。そこで、遺伝子
工学技術を用いてモルモット肝トランスグルタミナーゼ
を大量に安定して得ようとする試みが導入され、モルモ
ット肝トランスグルタミナーゼ遺伝子のクローニング、
このクローニングされた遺伝子の塩基配列の解明、該塩
基配列を含有するベクターを保持する形質転換体を培養
するモルモット肝トランスグルタミナーゼの製造法が既
に提案されている（特開平１−３００８８９号）。更
に、ヒトケラチノサイトトランスグルタミナーゼ遺伝子
のクローニング、該遺伝子の塩基配列の解明〔プロシー
ジングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．）ＵＳＡ，８ ７，９３３３−９３３７（１９９
０）〕やファクターXIIIａの遺伝子のクローニング、該
遺伝子の塩基配列の解明〔プロシージングス・オブ・ザ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ，８３，８
０１９−８０２３（１９８６）〕も為されている。Currently, guinea pig liver is used as a good source of transglutaminase. However, although this is qualitatively good, the amount that can be obtained is limited, and further, the purification method is very complicated, the yield is extremely poor, and the guinea pig itself is very expensive and more efficient. Development of a method was desired. Therefore, an attempt to stably obtain a large amount of guinea pig liver transglutaminase using genetic engineering technology was introduced, and cloning of the guinea pig liver transglutaminase gene was conducted.
A method for elucidating the nucleotide sequence of this cloned gene and a method for producing guinea pig liver transglutaminase by culturing a transformant carrying a vector containing the nucleotide sequence has already been proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 1-300889). Furthermore, cloning of the human keratinocyte transglutaminase gene and elucidation of the nucleotide sequence of the gene [Procedures of the National Academy of
Science (Proc. Natl. Acad. Sc
i. ) USA, 8 7, 9333-9337 ( 199
0)] and cloning of the gene of Factor XIIIa and elucidation of the nucleotide sequence of the gene [Procedures of the National Academy of Science (Pro
c. Natl. Acad. Sci. ) USA, 83 , 8
019-8023 (1986)].

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】モルモットやヒト以外
の哺乳動物から遺伝子工学的手法を用いて、大量に良質
なトランスグルタミナーゼを安定して得ようとするもの
である。The present invention intends to stably obtain a large amount of good quality transglutaminase from guinea pigs and mammals other than humans using genetic engineering techniques.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】先にウシ頚動脈血管内皮
細胞に存在するレチノール誘導タンパク質をウシトラン
スグルタミナーゼと同定する報告が出されていたが〔ザ
・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(T
HE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY) ２６４，Ｎｏ．
３２，１９３０８〕、このたび本発明者は上記のモルモ
ットやヒト以外の哺乳動物として、このウシ頚動脈血管
内皮細胞トランスグルタミナーゼ（以下ＢＴＧａｓｅと
略称する）遺伝子のクローニングを行ない、次いでこの
クローニングした遺伝子の塩基配列を解明することに成
功し、本発明に到達したものである。すなわち本発明
は、（ｉ）ＢＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを含有する
ＤＮＡ、（ii）該ＤＮＡを発現用ベクターに、ＢＴＧａ
ｓｅを発現させるように構築した組み換えＤＮＡ、（ii
i）該組み換えＤＮＡを保持する形質転換体、および（i
v）該形質転換体を培養し、培養物中にＢＴＧａｓｅを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするＢＴ
Ｇａｓｅの製造法に関するものである。[Means for Solving the Problems] Previously, it was reported that the retinol-inducible protein present in bovine carotid vascular endothelial cells was identified as bovine transglutaminase [The Journal of Biological Chemistry (T
HE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY) 264 , No.
32, 19308], the present inventor has cloned this bovine carotid artery endothelial cell transglutaminase (hereinafter abbreviated as BTGase) gene as a mammal other than the above-described guinea pig and human, and then cloned the base of this cloned gene. The inventors have succeeded in elucidating the sequences and arrived at the present invention. That is, the present invention provides (i) a DNA containing a DNA encoding BTGase, (ii) an expression vector containing the DNA, and BTGa
recombinant DNA constructed to express se, (ii
i) a transformant carrying the recombinant DNA, and (i
v) A BT characterized in that the transformant is cultured, BTGase is produced and accumulated in the culture, and this is collected.
The present invention relates to a method for manufacturing Gase.

【０００６】ＢＴＧａｓｅのアミノ酸配列はモルモット
肝トランスグルタミナーゼとは８３％の相同性、ヒトケ
ラチノサイトトランスグルタミナーゼ、ヒトファクター
ＸIIIａとは３７％の相同性を有するが、新規なアミノ
酸配列であり、又塩基配列も当然のことながら上記３種
の既知のトランスグルタミナーゼとは異なり、新規なも
のである。The amino acid sequence of BTGase has 83% homology with guinea pig liver transglutaminase and 37% homology with human keratinocyte transglutaminase and human factor XIIIa, but is a novel amino acid sequence and also has a base sequence. Naturally, unlike the above-mentioned three known transglutaminases, it is a novel one.

【０００７】本発明におけるＢＴＧａｓｅをコードする
塩基配列を有するＤＮＡを含有する発現型ベクターは、
例えば、（ｉ）ＢＴＧａｓｅ産生細胞、例えばウシ頚動
脈血管内皮細胞からの全ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化
し、（ii）該ＤＮＡ断片をファージまたはプラスミドに
組み込み、（iii）得られた組み換えファージまたはプ
ラスミドで宿主を形質転換し、（iv）得られた形質転換
体を培養後、形質転換体から適当な方法、例えばＢＴＧ
ａｓｅの一部をコードするＤＮＡプローブとのハイブリ
ダイゼーションにより目的とするＤＮＡを含有するファ
ージあるいはプラスミドを単離し、（v）その組み換え
ＤＮＡから目的とするクローン化ＤＮＡを切り出し、
（vi）該クローン化ＤＮＡまたはその一部を発現ベクタ
ー中のプロモーターの下流に連結する、ことにより製造
することができる。ＢＴＧａｓｅをコードするＤＮＡに
ついては、全合成あるいは半合成によっても製造するこ
とができ、この際、図１に示したような配列に基いて合
成することができる。ＢＴＧａｓｅのｃＤＮＡの制限酵
素による消化に当っては、Ｅｃｏ ＲＩ、Ｓａｌ Ｉ、Ｂ
ａｍ ＨＩ等の制限酵素が用いられる。An expression vector containing a DNA having a nucleotide sequence encoding BTGase in the present invention is
For example, (i) total genomic DNA from BTGase-producing cells such as bovine carotid artery endothelial cells is digested with a restriction enzyme, (ii) the DNA fragment is incorporated into a phage or plasmid, and (iii) the resulting recombinant phage or plasmid is obtained. After transforming the host with (iv) the resulting transformant is cultured, the transformant can be transformed by an appropriate method such as BTG.
The phage or plasmid containing the target DNA is isolated by hybridization with a DNA probe encoding a part of the case, and (v) the target cloned DNA is excised from the recombinant DNA,
(Vi) It can be produced by ligating the cloned DNA or a part thereof downstream of a promoter in an expression vector. The BTGase-encoding DNA can be produced by total synthesis or semi-synthesis, and at this time, it can be synthesized based on the sequence shown in FIG. For digestion of BTGase cDNA with a restriction enzyme, Eco RI, Sal I, B were used.
A restriction enzyme such as am HI is used.

【０００８】消化されて得られたＤＮＡ断片を組み込む
プラスミドとしては、たとえば大腸菌由来のｐＡＣＹＣ
１７７，ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ８，ｐＵＣ９，ｐＢ
Ｒ３２２，ｐＩＮIIIＡ１，ｐＫＫ２３３−２などが挙
げられるが、その他のものであっても、宿主内で複製増
殖されるものであれば、いずれをも用いることができ
る。またＤＮＡ断片を組み込むファージベクターとして
は、たとえばＭ１３ファージｍｐ９，Ｍ１３ファージｍ
ｐ８，λｇｔ１１，λＥＭＢＬ３，Ｃｈａｒｏｎ４など
が挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖
できるものであれば用いることができる。The plasmid into which the DNA fragment obtained by digestion is incorporated is, for example, pACYC derived from Escherichia coli.
177, pACYC184, pUC8, pUC9, pB
R322, pINIIIA1, pKK233-2 and the like can be mentioned, but any of them can be used as long as they can be replicated and propagated in the host. Examples of the phage vector incorporating the DNA fragment include M13 phage mp9 and M13 phage m.
Examples include p8, λgt11, λEMBL3, and Charon4, but any other one can be used as long as it can grow in the host.

【０００９】ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドまたは
ファージベクターは適当な宿主たとえばエシェリキア(E
scherichia)属菌（大腸菌），バチルス(Bacillus)属菌
（枯草菌），ストレプトマイセス(Streptomyces)属菌
（放線菌），サッカロマイセス（Saccharomyces)属菌
（酵母菌），および動物細胞たるmonkey ＣＯＳ cellな
どに導入する。上記エシェリキア属菌の例としては、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株，ＵＴ４８１株，Ｊ
Ｍ１０３株，ＪＭ８３株，ＪＭ１０９株，ＮＭ５２２
株，ＭＶ１３０４株、バチルス属菌の例としてはバチル
ス サチリス(Bacillus subtilis)，ストレプトマイセス
属菌の例としてはストレプトマイセス コェリカラー（S
treptomyces coelicolor)，サッカロマイセス属菌の例
としてはサッカロマイセス セレビシェ（Saccharomyces
cerevisiae)などが挙げられる。このようにして得られ
た形質転換体から、目的とするＤＮＡを含有するファー
ジあるいはプラスミド等のベクターを単離する方法とし
ては、例えばＢＴＧａｓｅの一部をコードするオリゴヌ
クレオチドをプローブとして用いたコロニーハイブリダ
イゼーション、プラークハイブリダイゼーション等によ
るハイブリダイゼーションにより行われる。単離された
ファージあるいはプラスミドから目的とするクローン化
ＤＮＡを切り出し、ＢＴＧａｓｅをコードするＤＮＡの
塩基配列を、適当な制限サイトがある場合はそれを利用
して、ない場合はＤＮａｓｅ Ｉを用いた欠除体(deleti
on体）を調製しＭ１３ファージを用いたダイデオキシ法
によるなどして、決定する。このダイデオキシ法で決定
したＤＮＡの塩基配列と、その塩基配列から判明したア
ミノ酸配列を図１に示す。A plasmid or phage vector into which a DNA fragment has been incorporated is a suitable host such as Escherichia (E.
genus scherichia (E. coli), genus Bacillus (bacillus subtilis), genus Streptomyces (actinomycete), genus Saccharomyces (yeast), and monkey COS cell as an animal cell Etc. As an example of the Escherichia bacterium,
E. coli XL1-Blue strain, UT481 strain, J
M103 strain, JM83 strain, JM109 strain, NM522
Strain, MV1304 strain, Bacillus subtilis as an example of Bacillus, and Streptomyces corellicolor (S as an example of Streptomyces.
treptomyces coelicolor), Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces)
cerevisiae) and the like. As a method for isolating a vector such as a phage or a plasmid containing the target DNA from the transformant thus obtained, for example, colony high using an oligonucleotide encoding a part of BTGase as a probe is used. It is carried out by hybridization such as hybridization or plaque hybridization. The desired cloned DNA was excised from the isolated phage or plasmid, and the nucleotide sequence of the BTGase-encoding DNA was utilized by utilizing the appropriate restriction site, if there was no, using DNase I. Deleti
(on body) is prepared and determined by the dideoxy method using M13 phage. The DNA base sequence determined by this dideoxy method and the amino acid sequence found from the base sequence are shown in FIG.

【００１０】上記のようにしてクローン化されたＢＴＧ
ａｓｅをコードするＤＮＡは目的によりそのまま、また
は所望により制限酵素で消化して使用することが出来
る。クローン化されたＤＮＡから発現させたい領域を切
り出し、発現に適したビークル（ベクター）中のプロモ
ーターの下流に連結して発現型ベクターを得ることがで
きる。該ＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンとして
のＡＴＧを有し、また３’末端には翻訳終止コドンとし
てのＴＡＡ，ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。
これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合
成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。さ
らに該ＤＮＡを発現させるにはその上流にプロモーター
を接続する。ベクターとしては、上記のエシェリキア属
菌由来のプラスミド（例、ｐＡＣＹＣ１８４，ｐＵＣ
９，ｐＫＫ２３３−２，ｐＡＣＹＣ１７７，ｐＡＣＹＣ
１８４，ｐＵＣ８，ｐＢＲ３２２，ｐＩＮIIIＡ１），
バチルス属菌由来のプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ，サ
ッカロマイセス属菌由来のプラスミドｐＢＴＩ−１，ス
トレプトマイセス属菌のプラスミドＰＩＪ６１，monkey
ＣＯＳ cell のプラスミドｐＳＶＬなどが挙げられ
る。BTG cloned as described above
The DNA encoding the ase can be used as it is, or if desired, digested with a restriction enzyme before use. The region to be expressed can be excised from the cloned DNA and ligated downstream of the promoter in a vehicle (vector) suitable for expression to obtain an expression type vector. The DNA may have ATG as a translation initiation codon at its 5 ′ end and TAA, TGA or TAG as a translation stop codon at its 3 ′ end.
These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adaptor. Furthermore, in order to express the DNA, a promoter is connected upstream thereof. As the vector, a plasmid derived from the above Escherichia bacterium (eg, pACYC184, pUC
9, pKK233-2, pACYC177, pACYC
184, pUC8, pBR322, pINIIIA1),
Bacillus-derived plasmid pHY300PLK, Saccharomyces-derived plasmid pBTI-1, Streptomyces-derived plasmid PIJ61, monkey
Examples include COS cell plasmid pSVL.

【００１１】本発明で用いられるプロモーターとして
は、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモ
ーターであればいかなるものでもよい。形質転換する際
の宿主がエシェリキア属菌である場合はｌａｃ，ｔａ
ｃ，ｔｒｐ，ｌｐｐ，ｐｈｏＡ等のプロモーター、バチ
ルス属菌の場合はＳＰ０２，α−アミラーゼ等のプロモ
ーター、サッカロマイセス属菌の場合はＰACD１（アル
コールデヒドロゲナーゼプロモーター）、ＰCYC１（チ
トクロームＣ プロモーター）、monkey ＣＯＳ cell の
場合はＳＶ４０アーリーおよびレイトプロモーターなど
が、その例として挙げられる。このようにして構築され
たＢＴＧａｓｅをコードするＤＮＡを含有するベクター
を用いて、形質転換体を製造する。The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression. If the host for transformation is a bacterium of the genus Escherichia, lac, ta
c, trp, lpp, phoA and other promoters, Bacillus genus SP02, α-amylase and other promoters, Saccharomyces genus PACD1 (alcohol dehydrogenase promoter), PCYC1 (cytochrome C promoter), monkey COS cell In this case, the SV40 early and late promoters are examples. A transformant is produced using the vector containing the DNA encoding BTGase thus constructed.

【００１２】宿主としては、たとえばエシェリキア属
菌、バチルス属菌、ストレプトマイセス属菌、サッカロ
マイセス属菌、monkey ＣＯＳ cell などが挙げられ
る。上記エシェリキア属菌、バチルス属菌、ストレプト
マイセス属菌、サッカロマイセス属菌、monkey ＣＯＳ
cell の具体例としては、前記したものと同様のものが
挙げられる。このようにして、ＢＴＧａｓｅをコードす
るＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質
転換体が得られる。本発明において形質転換体を培養す
る際、培養に使用される培地としては、通常のものでよ
いが、ＬＢ培地、Ｍ９培地、Ｔ培地などが挙げられる。
培地のｐＨは約６〜９、好ましくは７前後である。培養
時間、温度、培養方法等は適宜選択できるが、振盪培
養、培養温度２５℃前後、好ましくは25℃より若干低め
がよく、特に好ましい組合せとしては、25℃、24時間、
ＩＰＴＧ １ｍＭを含むＬＢ培地（ｐＨ7.2)での振盪培
養が挙げられる。上記培養物からＢＴＧａｓｅを分離精
製するには、例えば下記の方法により行なうことができ
る。ＢＴＧａｓｅを培養菌体あるいは細胞から抽出する
に際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を
集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、オスモテ
ィック ショック、リゾチームおよび／または凍結融解
などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分
離やろ過によりＢＴＧａｓｅの前駆体たんぱくや成熟ペ
プチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝
液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのたんぱく変性剤
や、トリトンＸ-100などの界面活性剤が含まれていても
よい。培養液中に前駆体たんぱくや成熟ペプチドが分泌
される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌
体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。この
ようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含ま
れる前駆体たんぱくや成熟ペプチドは、自体公知の分離
・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。こ
れらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法
などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲ
ルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオ
ン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方
法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親
和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィー
などの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法な
どの等電点の差を利用する方法、抗体カラムクロマトグ
ラフィーを利用する方法などが挙げられる。Examples of the host include Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, monkey COS cell and the like. Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Saccharomyces, monkey COS
Specific examples of the cells include the same as those mentioned above. Thus, a transformant transformed with the expression vector containing the DNA encoding BTGase can be obtained. When the transformant is cultured in the present invention, the medium used for the culture may be a conventional medium, and examples thereof include LB medium, M9 medium and T medium.
The pH of the medium is about 6-9, preferably around 7. Culturing time, temperature, culturing method and the like can be appropriately selected, but shaking culturing, culturing temperature of around 25 ° C, preferably slightly lower than 25 ° C, and particularly preferable combination is 25 ° C, 24 hours,
Examples include shaking culture in LB medium (pH 7.2) containing 1 mM of IPTG. Separation and purification of BTGase from the above culture can be performed, for example, by the following method. When extracting BTGase from cultured bacterial cells or cells, after culturing, the bacterial cells or cells are collected by a known method, suspended in an appropriate buffer, and subjected to ultrasonic wave, osmotic shock, lysozyme and / or freeze-thawing. A method of obtaining a crude extract of BTGase precursor protein or mature peptide by centrifuging or filtering after disrupting the bacterial cells or cells by, for example, can be appropriately used. The buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100. When the precursor protein or the mature peptide is secreted into the culture medium, after the completion of the culture, the bacterial cells or cells are separated from the supernatant by a method known per se, and the supernatant is collected. The thus obtained culture supernatant or precursor protein or mature peptide contained in the extract can be subjected to an appropriate combination of separation / purification methods known per se. As the known separation and purification methods thereof, a method utilizing solubility such as salting out or solvent precipitation method, a dialysis method, an ultrafiltration method, a gel filtration method, and an SDS-polyacrylamide gel electrophoresis method are mainly used. The difference in charge, the difference in charge such as ion exchange chromatography, the method using specific affinity such as affinity chromatography, and the difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography Examples include a method, a method utilizing a difference in isoelectric point such as an isoelectric focusing method, a method utilizing antibody column chromatography and the like.

【００１３】[0013]

【作用】本発明で得られたＢＴＧａｓｅをコードするＤ
ＮＡを組み込んだ形質転換体の培養により、ＢＴＧａｓ
ｅを大量に生産、精製する。[Function] D encoding BTGase obtained in the present invention
By culturing the transformant incorporating NA, BTGas
e is produced and purified in large quantities.

【００１４】本発明明細書および図面において、塩基や
アミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ
Ｂ Commision on Biochemical Nomenclature による略
号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであ
り、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＲＮＡ ：リボ核酸 ｍＲＮＡ：メッセンジャーリボ核酸 ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸 ｄＴＴＰ：デオキシチミジン三リン酸 ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸 ｄＣＴＰ：デオキシシチジン三リン酸 ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸 ＧｌｙまたはＧ ：グリシン ＡｌａまたはＡ ：アラニン ＶａｌまたはＶ ：バリン ＬｅｕまたはＬ ：ロイシン ＩｌｅまたはＩ ：イソロイシン ＳｅｒまたはＳ ：セリン ＴｈｒまたはＴ ：スレオニン ＣｙｓまたはＣ ：システイン ＭｅｔまたはＭ ：メチオニン ＧｌｕまたはＥ ：グルタミン酸 ＡｓｐまたはＤ ：アスパラギン酸 ＬｙｓまたはＫ ：リジン ＡｒｇまたはＲ ：アルギニン ＨｉｓまたはＨ ：ヒスチジン ＰｈｅまたはＦ ：フェニールアラニン ＴｙｒまたはＹ ：チロシン ＴｒｐまたはＷ ：トリプトファン ＰｒｏまたはＰ ：プロリン ＡｓｎまたはＮ ：アスパラギン ＧｌｎまたはＱ ：グルタミンIn the specification and drawings of the present invention, when an abbreviation is used for a base or amino acid, IUPAC-IU
It is based on the abbreviations by B Commision on Biochemical Nomenclature or the abbreviations commonly used in this field, and examples thereof are given below. When amino acids may have optical isomers, the L-form is shown unless otherwise specified. DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid mRNA: messenger ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine tri Phosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate Gly or G: Glycine Ala or A: Alanine Val or V: Valine Leu or L: Leucine Ile or I: Isoleucine Ser or S: Serine Thr or T: Threonine Cys or C: Cysteine Met or M: Methionine Glu or E: Glutamic acid Asp or D: Aspartic acid Lys or K: Lysine Arg or R: Arginine His The H: histidine Phe or F: Phenylalanine Tyr or Y: Tyrosine Trp or W: tryptophan Pro or P: Proline Asn or N: Asparagine Gln or Q: Glutamine

【００１５】[0015]

【実施例】以下の実施例により発明をより具体的に説明
するが、本発明はこれに限定されるものではない。な
お、以下の実施例で得られた形質転換体Ｅscherichia c
oli（エシェリキア・コリ）ＸＬ１／ｐＢＥＴＧ２０１
は平成３年５月３０日に通商産業省工業技術院微生物工
業技術研究所（ＦＲＩ）にブダペスト条約に基き受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−３４２８として寄託されている。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited thereto. The transformants Escherichia c obtained in the following examples
oli (Escherichia coli) XL1 / pBETG201
Was deposited on May 30, 1991 with the Research Institute for Microbial Technology (FRI), Ministry of International Trade and Industry, under the Budapest Treaty as deposit number FERMBP-3428.

【００１６】ウシ頚動脈由来の血管内皮細胞１０⁸個を
出発材料として、モノＱカラムによる陰イオン交換クロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィーにより、レチノール誘導タンパク質（Reti
nol-Induced Protein；ＲＩＰ）であるウシトランスグ
ルタミナーゼを精製した。この精製標品のトリプシン消
化により得られたペプチドフラグメントのモルモット肝
トランスグルタミナーゼ（ｇｐＴＧ）との比較によるア
ミノ酸分析の結果から、オリゴヌクレオチドプローブ
Ｉ，II，IIIを合成した。Using 10 ⁸ vascular endothelial cells derived from bovine carotid artery as a starting material, retinol-derived protein (Retiol-derived protein (Retiol-derived protein (Retiol-derived protein
Bovine transglutaminase, which is a nol-Induced Protein (RIP), was purified. Oligonucleotide probes I, II, and III were synthesized from the results of amino acid analysis of the peptide fragment obtained by digestion of this purified preparation with trypsin by comparison with guinea pig liver transglutaminase (gpTG).

【００１７】 ｇｐＴＧ(78-94) ：LSSAVEGGTWSASAVDQ ** * * * * * * ** フラグメント１ ：LSDATEEGAWAAVAADQ（配列番号２） ｇｐＴＧ(241-250) ：DNNYSDGVSP **** ** ** フラグメント２ ：DNNYADGISP（配列番号３） プローブII ：5'-AGGACATGGGGCTGACACCATCACTGTAGTTGTTGTCCCA-3'（配列 番号４） ｇｐＴＧ(156-165) ：QEYVLTQQGF ********** フラグメント３ ：QEYVLTQQGF（配列番号５） プローブＩ ：5'-GCCCTGGTAGATGAAGCCCTGTTGGGTGAGCACATACTCCTG-3'（配 列番号６） ｇｐＴＧ(580-586) ：DIYLENP ******* フラグメント４ ：DIYLENP（配列番号７） プローブIII ：5'-AGACCCGGATCTTGATTTCTGGATTCTCCAGGTAAATGT-3'（配列 番号８） 大腸菌Ｙ１０９０に、ウシ大動脈血管内皮細胞ｃＤＮＡ
ライブラリー（Clontech Laboratories Inc.）を感染さ
せてプレーティングし、プラークＤＮＡの一部をニトロ
セルロース膜に写し取り、³²Ｐで標識した前記のＤＮＡ
プローブとプラークハイブリダイゼーションを行なっ
た。１．３×１０⁵の組み換えファージ（λｇｔ１１）
をスクリーニングした結果、２５個の陽性クローンを得
た。しかしながら３つのプローブ全部にハイブリダイズ
するクローンはなく、プローブＩ及びIIにハイブリダイ
ズするλＢＥＴＧ１０と、プローブII及びIIIにハイブ
リダイズするλＢＥＴＧ１７という２つの長いクローン
を選び、プラスミド ブルースクリプト(plasmid Blues
cript) II ＳＫ~にサブクローニングし、プラスミドｐ
ＢＥＴＧ１０−１２，ｐＢＥＴＧ１７−６，ｐＢＥＴＧ
１７−５，ｐＢＥＴＧ１７−１を作成した（図２）。こ
れらのプラスミドで大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換
し、形質転換体であるエシェリキア コリ（Escherichia
coli）ＸＬ１／ｐＢＥＴＧ１０−１２等を得た。λＢ
ＥＴＧ１０とλＢＥＴＧ１７については、部分的にオー
バーラップしており、結局ウシ内皮細胞ＴＧａｓｅの
３’末端を含む３．５ｋｂを得たことになった。GpTG (78-94): LSSAVEGGTWSASAVDQ ** * * * * * * ** Fragment 1: LSDATEEGAWAAVAADQ (SEQ ID NO: 2) gpTG (241-250): DNNYSDGVSP **** ** ** Fragment 2: DNNYADGISP (SEQ ID NO: 3) Probe II: 5'-AGGACATGGGGCTGACACCATCACTGTAGTTGTTGTCCCA-3 '(SEQ ID NO: 4) gpTG (156-165): QEYVLTQQGF ********** Fragment 3: QEYVLTQQGF (SEQ ID NO: 5) Probe I: 5'-GCCCTGGTAGATGAAGCCCTGTTGGGTGAGCACATACTCCTG-3 '(SEQ ID NO: 6) gpTG (580-586): DIYLENP ******* Fragment 4: DIYLENP (SEQ ID NO: 7) Probe III: 5'-AGACCCGGATCTTGATTTCTGGATTCTCCAGGTAAATGT-3' (SEQ ID NO: 8) ) E. coli Y1090, bovine aortic endothelial cell cDNA
A library (Clontech Laboratories Inc.) was infected and plated, a part of the plaque DNA was transferred to a nitrocellulose membrane, and the above DNA was labeled with ³² P.
Plaque hybridization was performed with the probe. 1.3 × 10 ⁵ recombinant phage (λgt11)
As a result of screening, 25 positive clones were obtained. However, there are no clones that hybridize to all three probes, and two long clones, λBETG10 that hybridizes to probes I and II and λBETG17 that hybridizes to probes II and III, were selected, and plasmid bluescript (plasmid Bluescript
cript) II SK ~ subcloned into plasmid p
BETG10-12, pBETG17-6, pBETG
17-5 and pBETG17-1 were prepared (FIG. 2). Escherichia coli XL1-Blue was transformed with these plasmids, and Escherichia coli transformants (Escherichia coli) were transformed.
coli) XL1 / pBETG10-12 etc. were obtained. λB
ETG10 and λBETG17 partially overlapped with each other, so that 3.5 kb including the 3 ′ end of bovine endothelial cell TGase was eventually obtained.

【００１８】しかしながら翻訳開始点を含む５’末端が
欠けている為、同じライブラリーを再びλＢＥＴＧ１０
のＨｉｎｆＩフラグメントと新しく合成したオリゴヌク
レオチドプローブIV〔 5'-TCCTCCGTAG CATCGGACAG CCT
GAAGAGG GCCTTGGT-3'（配列番号９）〕でスクリーニン
グし、λＢＥＴＧ４０とλＢＥＴＧ４１を得た。これら
によりλＢＥＴＧ１０の５’側より２２４ｂｐ伸びた
が、翻訳開始コドンへは至らなかった（図２） そこで、更にウシゲノムＤＮＡライブラリーをλＢＥＴ
Ｇ４１の５’末端より合成したオリゴヌクレオチドプロ
ーブＶ〔 5'-GAGTCAGCCA GAAGGGCTGG CCCCGCCGCA CTAC
CAGC-3'（配列番号１０）〕でスクリーニングし、λＢ
ＧＴ１０５３を得た。このクローンはλＢＥＴＧ４１の
５’側よりさらに７９ｂｐ伸びたが、そこから上流はイ
ントロンになっており、翻訳開始コドンは含んでいなか
った。そこでもう一つウシ内皮細胞のｃＤＮＡライブラ
リーを作製した。ライブラリーをつくるに当って、ＢＴ
ＧａｓｅのｃＤＮＡの含量を増やすためにウシ頚動脈血
管内皮細胞をレチノール（１μＭ，９ｈ）で処理した。
得られたｃＤＮＡをファージベクターλＺＡＰIIに組み
込み、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅに感染させ先に用いたプ
ローブＶを用いてスクリーニングした。その結果、クロ
ーンλＢＥＴＧ２０１を得、塩基配列を決定したとこ
ろ、転写開始点を含むクローンであることがわかった
（形質転換体Ｅscherichia coli（エシェリキア・コ
リ）ＸＬ１／ｐＢＥＴＧ２０１：ＦＥＲＭ ＢＰ−３４
２８）。（図２） 図２において各クローンの上にある矢印は該クローンを
単離するために用いられたプローブの位置を示す。Ｉ、
II、III、IVおよびＶは合成オリゴヌクレオチドプロー
ブの番号を示し、Ｈは挿入されたλＢＥＴＧ１０ ｃＤ
ＮＡのＨｉｎｆＩフラグメントを示す。λＢＥＴＧ１
０、１７、４０および４１はウシ大動脈血管内皮細胞ｃ
ＤＮＡライブラリーのスクリーニングにより単離された
ものであり、λＢＧＴ１０５３はウシゲノムライブラリ
ーのスクリーニングにより単離されたものであり、そし
てλＢＥＴＧ２０１はウシ頚動脈血管内皮細胞ｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングにより単離されたもので
ある。λＢＧＴ１０５３において、黒塗りの四角は塩基
配列５７−２３６をコードする１８０ｂｐのエクソンを
表わし、破線はイントロンを表わす。白ぬきの四角はオ
ープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表わす。However, since the 5'end including the translation initiation point is missing, the same library was re-assembled into λBETG10.
HinfI fragment and newly synthesized oligonucleotide probe IV [5'-TCCTCCGTAG CATCGGACAG CCT
GAAGAGG GCCTTGGT-3 ′ (SEQ ID NO: 9)] to obtain λBETG40 and λBETG41. These extended 224 bp from the 5 ′ side of λBETG10, but did not reach the translation initiation codon (FIG. 2). Therefore, a bovine genomic DNA library was further added to λBET.
Oligonucleotide probe V [5'-GAGTCAGCCA GAAGGGCTGG CCCCGCCGCA CTAC synthesized from the 5'end of G41
CAGC-3 ′ (SEQ ID NO: 10)], λB
GT1053 was obtained. This clone extended 79 bp further from the 5 ′ side of λBETG41, but an intron was formed upstream from this, and it did not contain a translation initiation codon. Therefore, another bovine endothelial cell cDNA library was prepared. In making a library, BT
Bovine carotid artery vascular endothelial cells were treated with retinol (1 μM, 9 h) to increase the content of Gase cDNA.
The obtained cDNA was incorporated into the phage vector λZAPII, infected with E. coli XL1-Blue, and screened using the probe V used previously. As a result, clone λBETG201 was obtained, and its nucleotide sequence was determined. As a result, it was found to be a clone containing a transcription start point (transformant Escherichia coli XL1 / pBETG201: FERM BP-34.
28). (FIG. 2) The arrow above each clone in FIG. 2 indicates the position of the probe used to isolate the clone. I,
II, III, IV and V indicate the number of the synthetic oligonucleotide probe, H indicates the inserted λBETG10 cD
The HinfI fragment of NA is shown. λBETG1
0, 17, 40 and 41 are bovine aortic endothelial cells c
Was isolated by screening a DNA library, λBGT1053 was isolated by screening a bovine genomic library, and λBETG201 was bovine carotid artery endothelial cell cDNA.
It was isolated by screening the library. In λBGT1053, the black squares represent the 180 bp exon encoding the nucleotide sequence 57-236, and the broken line represents the intron. A white square represents an open reading frame (ORF).

【００１９】得られたｃＤＮＡの塩基配列をサンガーの
方法により決定し、この塩基配列及びそれより推定され
るＢＴＧａｓｅのアミノ酸配列を図１に示した。塩基配
列の６４１番目において、ポリモルフィズム〔λＢＥＴ
Ｇ１０ではＧＡＴ、λＢＥＴＧ２０１ではＧＡＣ〕が見
られるが、ウシによる個体差ではないかと考えられる。The nucleotide sequence of the obtained cDNA was determined by the Sanger method, and the nucleotide sequence and the amino acid sequence of BTGase deduced from it are shown in FIG. At the 641st position in the base sequence, polymorphism [λBET
GAT is observed in G10, and GAC] is observed in λBETG201, but it is considered that there are individual differences depending on the cow.

【００２０】[0020]

【効果】本発明で得られたＢＴＧａｓｅをコードするＤ
ＮＡは新規なものであり、このＤＮＡでＤＮＡ感染また
は形質転換した菌体や細胞では、天然物からでは困難で
あった純粋な、汚染されていないＢＴＧａｓｅ前駆体た
んぱくや成熟たんぱくを大量に生産、精製することがで
きる。ＢＴＧａｓｅを利用すれば蛋白質の生化学的研究
はもとより、トランスグルタミナーゼのもつＬｙｓとＧ
ｌｎを架橋する活性を利用して蛋白質の可塑性や流動性
を変化させたりアミノ酸組成の異なる蛋白質同志を架橋
することにより食品の栄養改善を行なうこともできる。
各種アミノ酸、例えば必須アミノ酸を導入することで栄
養性及び物性の改良された蛋白質や、生体適合性の優れ
た人口皮膚の開発や人工臓器用の蛋白質材料の強化に応
用できる。またＢＴＧａｓｅはウシ由来のものであるた
め他の動物のトランスグルタミナーゼに比べ、食品等に
添加する場合にも優れた効果が期待できる。食品として
は、ハム、ソーセージ、カマボコ等に添加し歯ざわりを
改良することもでき、また異種の機能性蛋白質を架橋す
ることにより有用なハイブリッド蛋白質を製造すること
もできる。[Effect] D encoding the BTGase obtained in the present invention
NA is a novel one, and in cells and cells infected or transformed with this DNA, large amounts of pure, uncontaminated BTGase precursor protein and mature protein, which were difficult to obtain from natural products, were produced. It can be purified. By using BTGase, not only biochemical studies of proteins but also Lys and G of transglutaminase
It is also possible to improve the nutrition of foods by changing the plasticity and fluidity of proteins by using the activity of crosslinking ln, or by cross-linking proteins having different amino acid compositions.
By introducing various amino acids, for example, essential amino acids, they can be applied to the development of proteins with improved nutritional properties and physical properties, the development of artificial skin with excellent biocompatibility, and the strengthening of protein materials for artificial organs. Since BTGase is derived from bovine, it can be expected to have an excellent effect when added to foods, etc., as compared with transglutaminase from other animals. As a food, it can be added to ham, sausage, clamshell, etc. to improve the texture, and a useful hybrid protein can be produced by crosslinking different functional proteins.

【００２１】[0021]

【配列表】配列番号：1 配列の長さ：3865 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：cDNA to mRNA 直接の起源 ライブラリー名 ウシ頚動脈血管内皮細胞 クローン名 λBETG201 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：47...2110 特徴を決定した方法 E TGCAGTGTCC TGCCACCAGT CCGAGGAGCA CAGCCACCAC CTGACC ATG GCC GAG 55 Met Ala Glu 1 GAG CTG GTC CTG GAG AGA TGT GAC CTG GAG CTG GAG GCC AAT GGC CGT 103 Glu Leu Val Leu Glu Arg Cys Asp Leu Glu Leu Glu Ala Asn Gly Arg 5 10 15 GAC CAC CAC ACA GCT GAC CTG TGC AGG GAA AGG CTG GTA GTG CGG CGG 151 Asp His His Thr Ala Asp Leu Cys Arg Glu Arg Leu Val Val Arg Arg 20 25 30 35 GGC CAG CCC TTC TGG CTG ACT CTG CAC TTT GAG GGC CGG AAC TAT GAG 199 Gly Gln Pro Phe Trp Leu Thr Leu His Phe Glu Gly Arg Asn Tyr Glu 40 45 50 GCC AGC GTG GAC AGC CTC ACC TTT TGT GCT GTG ACT GGC CCA GAC CCC 247 Ala Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Cys Ala Val Thr Gly Pro Asp Pro 55 60 65 AGT GAG GAG GCC GGG ACC AAG GCC CTC TTC AGG CTG TCC GAT GCT ACG 295 Ser Glu Glu Ala Gly Thr Lys Ala Leu Phe Arg Leu Ser Asp Ala Thr 70 75 80 GAG GAG GGG GCC TGG GCA GCG GTG GCA GCG GAC CAG CGA GAC AGC ACC 343Glu Glu Gly Ala Trp Ala Ala Val Ala Ala Asp G ln Arg Asp Ser Thr 85 90 95 CTC TCG CTG CAC CTC AGC ACC CCG GCC AAT GCC CCC GTT GGC CAT TAC 391 Leu Ser Leu His Leu Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val Gly His Tyr 100 105 110 115 CGC CTC AGC TTG GAG GCC TCC ACT GGC TAC CAG GGC TCC AGT TTC ATG 439 Arg Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Gly Tyr Gln Gly Ser Ser Phe Met 120 125 130 CTG GGT CAG TTC ACC CTG CTC TTC AAC AGC TGG TGT CCA GCG GAT GCT 487 Leu Gly Gln Phe Thr Leu Leu Phe Asn Ser Trp Cys Pro Ala Asp Ala 135 140 145 GTG TAC CTG GAC TCA GAT GAG GAG CGG CAA GAA TAC GTC CTT ACC CAG 535 Val Tyr Leu Asp Ser Asp Glu Glu Arg Gln Glu Tyr Val Leu Thr Gln 150 155 160 CAA GGC TTC ATC TAC CAG GGC TCA GCC AAG TTC ATC AAG AAC ATA CCT 583Gln Gly P he Ile Tyr Gln Gly Ser Ala Lys Phe Ile Lys Asn Ile Pro 165 170 175 TGG AAT TTT GGG CAG TTT GAA GAA GGG ATC CTA GAC ATC TGC CTG ATG 631 Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Glu Gly Ile Leu Asp Ile Cys Leu Met 180 185 190 195 CTC CTG GAT GTC AAC CCC AAG TTC CTG AGG AAT GCC GGC CGA GAC TGC 679 Leu Leu Asp Val Asn Pro Lys Phe Leu Arg Asn Ala Gly Arg Asp Cys 200 205 210 TCC CGC CGC AGT AGT CCG GTC TAT GTG GGC CGG GTG GTG AGC GGC ATG 727 Ser Arg Arg Ser Ser Pro Val Tyr Val Gly Arg Val Val Ser Gly Met 215 220 225 GTC AAC TGC AAC GAT GAC CAG GGC GTG CTG CTG GGG CGC TGG GAC AAC 775 Val Asn Cys Asn Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gly Arg Trp Asp Asn 230 235 240 AAC TAC GCA GAC GGC ATC AGC CCC ATG TCC TGG ATC GGC AGC GTG GAC 823Asn Tyr Ala Asp Gly Ile Ser P ro Met Ser Trp Ile Gly Ser Val Asp 245 250 255 ATC CTG CGG CGC TGG AAG AGA GAT GGC TGC CAG CGC GTC AAG TAC GGC 871 Ile Leu Arg Arg Trp Lys Arg Asp Gly Cys Gln Arg Val Lys Tyr Gly 260 265 270 275 CAG TGC TGG GTG TTC GCG GCT GTG GCC TGC ACC GTG CTG CGG TGC CTT 919 Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys Leu 280 285 290 GGC ATC CCT ACC CGA GTC GTG ACC AAC TAT AAC TCA GCC CAT GAC CAG 967 Gly Ile Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr Asn Ser Ala His Asp Gln 295 300 305 AAC AGC AAC CTG CTC ATC GAG TAC TTC CGC AAT GAG TTC GGG GAG ATC 1015 Asn Ser Asn Leu Leu Ile Glu Tyr Phe Arg Asn Glu Phe Gly Glu Ile 310 315 320 CAG AGT GAC AAG AGC GAG ATG ATC TGG AAC TTC CAC TGC TGG GTG GAG 1063 Gln Ser Asp Lys Ser Glu Met Ile Trp Asn Phe His Cys Trp Val Glu 325 330 335 TCG TGG ATG ACC AGG CCA GAC CTG CAG CCG GGG TAC GAG GGG TGG CAG 1111 Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro Gly Tyr Glu Gly Trp Gln 340 345 350 355 GCC CTC GAC CCC ACG CCC CAG GAG AAG AGC GAA GGG ACT TAC TGC TGT 1159 Ala Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Lys Ser Glu Gly Thr Tyr Cys Cys 360 365 370 GGC CCG GTT CCC GTT CGT GCC ATC AAG GAG GGT GAC CTG AGC ACC AAA 1207 Gly Pro Val Pro Val Arg Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu Ser Thr Lys 375 380 385 TAC GAC GCC CCT TTC GTC TTT GCC GAA GTC AAC GCT GAC GTG GTG GAC 1255 Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp Val Val Asp 390 395 400 TGG ATC CGG CAG GAC GAT GGG TCT CTG CAC AAA TCC ATC AAC CAC TCC 1303 Trp Ile Arg Gln Asp Asp Gly Ser Leu His Lys Ser Ile Asn His Ser 405 410 415 CTG GTG GTG GGG CTG AAG ATC AGC ACA AAG TGT GTG GGC AGA GAT GAT 1351 Leu Val Val Gly Leu Lys Ile Ser Thr Lys Cys Val Gly Arg Asp Asp 420 425 430 435 CGG GAG GAC ATC ACC CAC AGC TAC AAG TAC CCG GAG GGG TCC CCA GAG 1399 Arg Glu Asp Ile Thr His Ser Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Pro Glu 440 445 450 GAA AGG GAA GCC TTC ACA AGA GCC AAC CAT CTG AAC AAA CTG GTT AAC 1447 Glu Arg Glu Ala Phe Thr Arg Ala Asn His Leu Asn Lys Leu Val Asn 455 460 465 AAA GAG GAG ACA GGG GTG GCC ATG CGG ATC CGT GTG GGC GAG GGC ATG 1495 Lys Glu Glu Thr Gly Val Ala Met Arg Ile Arg Val Gly Glu Gly Met 470 475 480 AAC AGA GGC TGC GAC TTC GAC GTC TTT GCC CAC ATC ACC AAC AGC ACC 1543 Asn Arg Gly Cys Asp Phe Asp Val Phe Ala His Ile Thr Asn Ser Thr 485 490 495 CCT GAG GAG CAC ACT GGC CGC CTC CTG CTC TGT GCC CGC ACT GTC AGC 1591 Pro Glu Glu His Thr Gly Arg Leu Leu Leu Cys Ala Arg Thr Val Ser 500 505 510 515 TAC AAT GGG ATC CTG GGA CCT GAG TGC GGC ACC AAG GAT CTG CTC AGC 1639 Tyr Asn Gly Ile Leu Gly Pro Glu Cys Gly Thr Lys Asp Leu Leu Ser 520 525 530 CTT TCC CTG GAG CCC TAC TCT GAG AAG AGC ATT CCC CTT CGA ATC CTC 1687 Leu Ser Leu Glu Pro Tyr Ser Glu Lys Ser Ile Pro Leu Arg Ile Leu 535 540 545 TAC GAA AAG TAC TGT GAT TGC CTG ACC GAA TCG AAC CTT ATC AAG GTG 1735 Tyr Glu Lys Tyr Cys Asp Cys Leu Thr Glu Ser Asn Leu Ile Lys Val 550 555 560 CGG GGC CTC CTT ATT GAG CCA GCT GCC AAT AGC TAC CTG CTG GCC GAG 1783 Arg Gly Leu Leu Ile Glu Pro Ala Ala Asn Ser Tyr Leu Leu Ala Glu 565 570 575 AGG GAC ATC TAC CTG GAG AAC CCA GAA ATC AAG ATC CGG ATC CTG GGA 1831 Arg Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Pro Glu Ile Lys Ile Arg Ile Leu Gly 580 585 590 595 GAG CCC AAG CAG AAC CGC AAG CTG GTG GCT GAG ATA TCT CTG CAG AAC 1879 Glu Pro Lys Gln Asn Arg Lys Leu Val Ala Glu Ile Ser Leu Gln Asn 600 605 610 CCG CTC ACT GTG GCG CTG TCG GGC TGC ACC TTC ACT GTG GAG GGA GCA 1927 Pro Leu Thr Val Ala Leu Ser Gly Cys Thr Phe Thr Val Glu Gly Ala 615 620 625 GGC CTG ATT GAG GAG CAG AAG ACT GTG GAC GTC CCA GAY CCC GTG GAA 1975 Gly Leu Ile Glu Glu Gln Lys Thr Val Asp Val Pro Asp Pro Val Glu 630 635 640 GCA GGG GAG GAA GTC AAG GTG AGG GTG GAC CTG CTG CCT CTG TAC GTG 2023 Ala Gly Glu Glu Val Lys Val Arg Val Asp Leu Leu Pro Leu Tyr Val 645 650 655 GGC CGC CAC AAG CTG GTG GTG AAC TTC GAG AGC GAC AGG CTG AAG GCC 2071 Gly Arg His Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Ser Asp Arg Leu Lys Ala 660 665 670 675 GTG AAG GGC TTT AGG AAC GTC ATC GTT GGC CCC TCC TAA GGGGTCCCCG 2120 Val Lys Gly Phe Arg Asn Val Ile Val Gly Pro Ser * 680 685 TGCCAGCCCC ACCTCAGCCA CCGAGGGCCC CCACATTGAC CCCAATCTTT ATCCCAAGCT 2180 AATGAACAAA ACTTGCCCCT CCTTGGGCCC TGGACCTCAG GGCAGGGGTG GGCTGCCTGC 2240 GGGGGCCCTT TGGAATCGAA TGTACTTCCC GCCCACCTTG TCCCCCTGAG CCTGTCTCCC 2300 CACACCCCTC ACCTATGAGG GAGGCTCTGT GTCTGCACTG TGGGAGCTCT CCTCTTGGCT 2360 GACTGAGCCT GGAGGGTAGG CCATCTCCCC CTCCCTTCCC AGCCCAGAGG CCCCTTAAAA 2420 AGCCACTGAC CACCCACCAA ACTGATTGAT CGACATCAGA GCCCCTTTCC AGGAAGCAGG 2480 CAAAAAAAGT GTGCCCAGTG ACCAGATCAA GGAATTCAGC TCCCTAGAGT ACCCTGAACC 2540 CTTTCCCCAG GTTGAGCCCA GACCCTGGGG GCCCTCGGCA GAGCCTGAGC AGGTGCAGAT 2600 GGGGAGGGTC CCAGGAACAG ACCACACCCC AAATCCCCTC ACATCCCAGC AGCCCTGACC 2660 CAATACTTCC CCCACCCTCT CACAATGGCG AGGCGCCTAG TAAGTACCTG GCACTTCCTG 2720 GGCATACTGC TGCTCACACG CCCATCAGCC CATTCAGTCC CCATGGGAAA CTGCAAAGCG 2780 GGAGCTGAGG AGACTGGGCT CGGAGAAGGG AGGCAGCTGG CCCTGCTTCC GTGGGATCCT 2840 GGATATTTGC AAGGCTGGCT AATGCAGAGG AACAAGAAAG GAGCCCGGCT CTTCTGACTC 2900 TGAGTCCAGT GCCCCATCCA CCACTCCAGC CCTGACCTGG CTGCGTTCGA GAGGCCATTT 2960 GGAACCTGAT CAAAAAGGAT CCAATTAGGA CGAGGAGATG GGAAGGGCTT AGAGTCCTAG 3020 GTTCAAGGCC CAGGTCTGGC CAGCTACTGC CTTCCCCTCC TCTGGGCCTC AGTTTCCTCT 3080 TTAGTCACAG GGAGTGATTG AACCAGCTCA TCTCCAAGGC CCTCCCAGCT CTGCACTTCC 3140 GGTGCCTTGT ATGACCCAGC CTCGCCAATG ACAGCAGGTC CTCCTCCAGG GCTTCACAGA 3200 GCCTTGGGAC ACAGACCCAG GATGCTTCAA AGTGTGAGAC CATGACCGTG ACCACCTTCC 3260 TGTCCCCAGT CGTGTCTGGG TCCCCCCACC TGTGCCCAGG CATCTGCCTT CGGAGCCCAT 3320 TTATAGGGGG GAAGAGACCC CCCGAGAAAC CCCTGTCCTA ACCATGAGCC CGCCCACCGC 3380 AGTGCCTAGA CGTCACAATA GCCTTAGTTG CCTATGCTGA TCACCCAGCA ACAAGGCTGG 3440 CATCTTAGCC ATCTCCTCTT TGAAGAGCCA GAGTCCTGGA ACACAGCCCC TGCCCCCTGA 3500 CTAAGCTTGG GGACCCCACA AATTGCCATC TCTGACTTTA TTCCTCACTC TCTCCATGTG 3560 ACCAGGCTTC CCTCAGCCTG GAGGAGGGAA GTGGGAGAGA ATTCTGTGAG TGGGGTCAGA 3620 GCCTCCAGGG AGCCCCCAAG CCCCAGAGAG GGACTTGGGG AAAGTCACGC TTGATACACT 3680 TAGAACTTTC TGCTTTGCAC AAGGAGAAGC ACAAGATGAG CCAGTATATA TTCATTCTAT 3740 ATAAATTTTG CTCTGTTTCC CTATGGTTTT ATAAACGCTT TTGGGTTCCA AGCAAGCAGT 3800 AGATGTGCTT TTGAGCTACA AACAGCGAGC ACTGAAATAA AAGTTTATTT TTCACATTCA 3860 AAAAA 3865。[Sequence listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 3865 Sequence type: Nucleic acid chain number: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to mRNA Direct origin Library name Bovine carotid artery endothelial cell clone name λBET G201 Sequence characteristic symbol: mat peptide Location: 47 ... 2110 Method by which the feature was determined E TGCAGTGTCC TGCCACCAGT CCGAGGAGCA CAGCCACCAC CTGACC ATG GCC GAG 55 Met Ala Glu 1 GAG CTG GTC CTG GAG AGA TGT GAC CTG GAG CTG GAG GCC AAT GGC CGT 103 Glu Leu Val Leu Glu Arg Cys Asp Leu Glu Leu Glu Ala Asn Gly Arg 5 10 15 GAC CAC CAC ACA GCT GAC CTG TGC AGG GAA AGG CTG GTA GTG CGG CGG 151 Asp His His Thr Ala Asp Leu Cys Arg Glu Arg Leu Val Val Arg Arg 20 25 30 35 GGC CAG CCC TTC TGG CTG ACT CTG CAC TTT GAG GGC CGG AAC TAT GAG 199 Gly Gln Pro Phe Trp Leu Thr Leu His Phe Glu Gly Arg Asn Tyr Glu 40 45 50 GCC AGC GTG GAC AGC CTC ACC TTT TGT GCT GTG ACT GGC CCA GAC CCC 247 Ala Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Cys Ala Val Thr Gly Pro Asp Pro 55 60 65 AGT GAG GAG GCC GGG ACC AAG GCC CTC TTC AGG CTG TCC GAT GCT ACG 295 Ser Glu Glu Ala Gly Thr Lys Ala Leu Phe Arg Leu Ser Asp Ala Thr 70 75 80 GAG GAG GGG GCC TGG GCA GCG GTG GCA GCG GAC CAG CGA GAC AGC ACC 343 Glu Glu Gly Ala Trp Ala Ala Val Ala Ala Asp G ln Arg Asp Ser Thr 85 90 95 CTC TCG CTG CAC CTC AGC ACC CCG GCC AAT GCC CCC GTT GGC CAT TAC 391 Leu Ser Leu His Leu Ser Thr Pro Ala Asn Ala Pro Val Gly His Tyr 100 105 110 115 CGC CTC AGC TTG GAG GCC TCC ACT GGC TAC CAG GGC TCC AGT TTC ATG 439 Arg Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Gly Tyr Gln Gly Ser Ser Phe Met 120 125 130 CTG GGT CAG TTC ACC CTG CTC TTC AAC AGC TGG TGT CCA GCG GAT GCT 487 Leu Gly Gln Phe Thr Leu Leu Phe Asn Ser Trp Cys Pro Ala Asp Ala 135 140 145 GTG TAC CTG GAC TCA GAT GAG GAG CGG CAA GAA TAC GTC CTT ACC CAG 535 Val Tyr Leu Asp Ser Asp Glu Glu Arg Gln Glu Tyr Val Leu Thr Gln 150 155 160 CAA GGC TTC ATC TAC CAG GGC TCA GCC AAG TTC ATC AAG AAC ATA CCT 583 Gln Gly P he Ile Tyr Gln Gly Ser Ala Lys Phe Ile Lys Asn Ile Pro 1 65 170 175 TGG AAT TTT GGG CAG TTT GAA GAA GGG ATC CTA GAC ATC TGC CTG ATG 631 Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Glu Gly Ile Leu Asp Ile Cys Leu Met 180 185 190 195 CTC CTG GAT GTC AAC CCC AAG TTC CTG AGG AAT GCC GGC CGA GAC TGC 679 Leu Leu Asp Val Asn Pro Lys Phe Leu Arg Asn Ala Gly Arg Asp Cys 200 205 210 TCC CGC CGC AGT AGT CCG GTC TAT GTG GGC CGG GTG GTG AGC GGC ATG 727 Ser Arg Arg Ser Ser Pro Val Tyr Val Gly Arg Val Val Ser Gly Met 215 220 225 GTC AAC TGC AAC GAT GAC CAG GGC GTG CTG CTG GGG CGC TGG GAC AAC 775 Val Asn Cys Asn Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gly Arg Trp Asp Asn 230 235 240 AAC TAC GCA GAC GGC ATC AGC CCC ATG TCC TGG ATC GGC AGC GTG GAC 823 Asn Tyr Ala Asp Gly Ile Ser P ro Met Ser Trp Ile Gly Ser Val Asp 245 250 255 ATC CTG CGG CGC TGG AAG AGA GAT GGC TGC CAG CGC GTC AAG TAC GGC 871 Ile Leu Arg Arg Trp Lys Arg Asp Gly Cys Gln Arg Val Lys Tyr Gly 260 265 270 275 CAG TGC TGG GTG TTC GCG GCT GTG GCC TGC ACC GTG CTG CGG TGC CTT 919 Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu Arg Cys Leu 280 285 290 GGC ATC CCT ACC CGA GTC GTG ACC AAC TAT AAC TCA GCC CAT GAC CAG 967 Gly Ile Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr Asn Ser Ala His Asp Gln 295 300 305 AAC AGC AAC CTG CTC ATC GAG TAC TTC CGC AAT GAG TTC GGG GAG ATC 1015 Asn Ser Asn Leu Leu Ile Glu Tyr Phe Arg Asn Glu Phe Gly Glu Ile 310 315 320 CAG AGT GAC AAG AGC GAG ATG ATC TGG AAC TTC CAC TGC TGG GTG GAG 1063 Gln Ser Asp Lys Ser Glu Met Ile Trp Asn Phe His Cys Trp Val Glu 325 330 335 TCG TGG ATG ACC AGG CCA GAC CTG CAG CCG GGG TAC GAG GGG TGG CAG 1111 Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro Gly Tyr Glu Gly Trp Gln 340 345 350 355 GCC CTC GAC CCC ACG CCC CAG GAG AAG AGC GAA GGG ACT TAC TGC TGT 1159 Ala Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Lys Ser Glu Gly Thr Tyr Cys Cys 360 365 370 GGC CCG GTT CCC GTT CGT GCC ATC AAG GAG GGT GAC CTG AGC ACC AAA 1207 Gly Pro Val Pro Val Arg Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu Ser Thr Lys 375 380 385 TAC GAC GCC CCT TTC GTC TTT GCC GAA GTC AAC GCT GAC GTG GTG GAC 1255 Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Al a Glu Val Asn Ala Asp Val Val Asp 390 395 400 TGG ATC CGG CAG GAC GAT GGG TCT CTG CAC AAA TCC ATC AAC CAC TCC 1303 Trp Ile Arg Gln Asp Asp Gly Ser Leu His Lys Ser Ile Asn His Ser 405 410 415 CTG GTG GTG GGG CTG AAG ATC AGC ACA AAG TGT GTG GGC AGA GAT GAT 1351 Leu Val Val Gly Leu Lys Ile Ser Thr Lys Cys Val Gly Arg Asp Asp 420 425 430 435 CGG GAG GAC ATC ACC CAC AGC TAC AAG TAC CCG GAG GGG TCC CCA GAG 1399 Arg Glu Asp Ile Thr His Ser Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly Ser Pro Glu 440 445 450 GAA AGG GAA GCC TTC ACA AGA GCC AAC CAT CTG AAC AAA CTG GTT AAC 1447 Glu Arg Glu Ala Phe Thr Arg Ala Asn His Leu Asn Lys Leu Val Asn 455 460 465 AAA GAG GAG ACA GGG GTG GCC ATG CGG ATC CGT GTG GGC GAG GGC ATG 1495 Lys Glu Glu Thr Gly Val Ala Met Arg Ile Arg Val Gly Glu Gly Met 470 475 480 AAC AGA GGC TGC GAC TTC GAC GTC TTT GCC CAC ATC ACC AAC AGC ACC 1543 Asn Arg Gly Cys Asp Phe Asp Val Phe Ala His Ile Thr Asn Ser Thr 485 490 495 CCT GAG GAG CAC ACT GGC CGC CTC CTG CTC TGT GCC CGC ACT GTC AGC 1591 Pro Glu Glu His Thr Gly Arg Leu Leu Leu Cys Ala Arg Thr Val Ser 500 505 510 515 TAC AAT GGG ATC CTG GGA CCT GAG TGC GGC ACC AAG GAT CTG CTC AGC 1639 Tyr Asn Gly Ile Leu Gly Pro Glu Cys Gly Thr Lys Asp Leu Leu Ser 520 525 530 CTT TCC CTG GAG CCC TAC TCT GAG AAG AGC ATT CCC CTT CGA ATC CTC 1687 Leu Ser Leu Glu Pro Tyr Ser Glu Lys Ser Ile Pro Leu Arg Ile Leu 535 540 545 TAC GAA AAG TAC TGT GAT TGC CTG ACC GAA TCG AAC CTT ATC AAG GTG 1735 Tyr Glu Lys Tyr Cys Asp Cys Leu Thr Glu Ser Asn Leu Ile Lys Val 550 555 560 CGG GGC CTC CTT ATT GAG CCA GCT GCC AAT AGC TAC CTG CTG GCC GAG 1783 Arg Gly Leu Leu Ile Glu Pro Ala Ala Asn Ser Tyr Leu Leu Ala Glu 565 570 575 AGG GAC ATC TAC CTG GAG AAC CCA GAA ATC AAG ATC CGG ATC CTG GGA 1831 Arg Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Pro Glu Ile Lys Ile Arg Ile Leu Gly 580 585 590 595 GAG CCC AAG CAG AAC CGC AAG CTG GTG GCT GAG ATA TCT CTG CAG AAC 1879 Glu Pro Lys Gln Asn Arg Lys Leu Val Ala Glu Ile Ser Leu Gln Asn 600 605 610 CCG CTC ACT GTG GCG CTG TCG GGC TGC ACC TTC ACT GTG GAG G GA GCA 1927 Pro Leu Thr Val Ala Leu Ser Gly Cys Thr Phe Thr Val Glu Gly Ala 615 620 625 GGC CTG ATT GAG GAG CAG AAG ACT GTG GAC GTC CCA GAY CCC GTG GAA 1975 Gly Leu Ile Glu Glu Gln Lys Thr Val Asp Val Pro Asp Pro Val Glu 630 635 640 GCA GGG GAG GAA GTC AAG GTG AGG GTG GAC CTG CTG CCT CTG TAC GTG 2023 Ala Gly Glu Glu Val Lys Val Arg Val Asp Leu Leu Pro Leu Tyr Val 645 650 655 GGC CGC CAC AAG CTG GTG GTG AAC TTC GAG AGC GAC AGG CTG AAG GCC 2071 Gly Arg His Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Ser Asp Arg Leu Lys Ala 660 665 670 675 GTG AAG GGC TTT AGG AAC GTC ATC GTT GGC CCC TCC TAA GGGGTCCCCG P 2120he Ly Lys Gly Arg Asn Val Ile Val Gly Pro Ser * 680 685 TGCCAGCCCC ACCTCAGCCA CCGAGGGCCC CCACATTGAC CCCAATCTTT ATCCCAAGCT 2180 AATGAACAAA ACTTGCCCCT CCTTGGGCCC TGGACCTCAG GGCAGGGGTG GGCTGCCTGC 2240 GGGGGCCCTT TGGAATCGAA TGTACTTCCC GCCCACCTTG TCCCCCTGAG CCTGTCTCCC 2300 CACACCCCTC ACCTATGAGG GAGGCTCTGT GTCTGCACTG TGGGAGCTCT CCTCTTGGCT 2360 GACTGAGCCT GGAGGGTAGG CCATCTCCCC CTCCCTTCCC AGCCCAGAGG CCCCTTAA AA 2420 AGCCACTGAC CACCCACCAA ACTGATTGAT CGACATCAGA GCCCCTTTCC AGGAAGCAGG 2480 CAAAAAAAGT GTGCCCAGTG ACCAGATCAA GGAATTCAGC TCCCTAGAGT ACCCTGAACC 2540 CTTTCCCCAG GTTGAGCCCA GACCCTGGGG GCCCTCGGCA GAGCCTGAGC AGGTGCAGAT 2600 GGGGAGGGTC CCAGGAACAG ACCACACCCC AAATCCCCTC ACATCCCAGC AGCCCTGACC 2660 CAATACTTCC CCCACCCTCT CACAATGGCG AGGCGCCTAG TAAGTACCTG GCACTTCCTG 2720 GGCATACTGC TGCTCACACG CCCATCAGCC CATTCAGTCC CCATGGGAAA CTGCAAAGCG 2780 GGAGCTGAGG AGACTGGGCT CGGAGAAGGG AGGCAGCTGG CCCTGCTTCC GTGGGATCCT 2840 GGATATTTGC AAGGCTGGCT AATGCAGAGG AACAAGAAAG GAGCCCGGCT CTTCTGACTC 2900 TGAGTCCAGT GCCCCATCCA CCACTCCAGC CCTGACCTGG CTGCGTTCGA GAGGCCATTT 2960 GGAACCTGAT CAAAAAGGAT CCAATTAGGA CGAGGAGATG GGAAGGGCTT AGAGTCCTAG 3020 GTTCAAGGCC CAGGTCTGGC CAGCTACTGC CTTCCCCTCC TCTGGGCCTC AGTTTCCTCT 3080 TTAGTCACAG GGAGTGATTG AACCAGCTCA TCTCCAAGGC CCTCCCAGCT CTGCACTTCC 3140 GGTGCCTTGT ATGACCCAGC CTCGCCAATG ACAGCAGGTC CTCCTCCAGG GCTTCACAGA 3200 GCCTTGGGAC ACAGACCCAG GATGCTTCAA AGTGTGAGAC CATGACCGTG ACCACCTTCC 326 0 TGTCCCCAGT CGTGTCTGGG TCCCCCCACC TGTGCCCAGG CATCTGCCTT CGGAGCCCAT 3320 TTATAGGGGG GAAGAGACCC CCCGAGAAAC CCCTGTCCTA ACCATGAGCC CGCCCACCGC 3380 AGTGCCTAGA CGTCACAATA GCCTTAGTTG CCTATGCTGA TCACCCAGCA ACAAGGCTGG 3440 CATCTTAGCC ATCTCCTCTT TGAAGAGCCA GAGTCCTGGA ACACAGCCCC TGCCCCCTGA 3500 CTAAGCTTGG GGACCCCACA AATTGCCATC TCTGACTTTA TTCCTCACTC TCTCCATGTG 3560 ACCAGGCTTC CCTCAGCCTG GAGGAGGGAA GTGGGAGAGA ATTCTGTGAG TGGGGTCAGA 3620 GCCTCCAGGG AGCCCCCAAG CCCCAGAGAG GGACTTGGGG AAAGTCACGC TTGATACACT 3680 TAGAACTTTC TGCTTTGCAC AAGGAGAAGC ACAAGATGAG CCAGTATATA TTCATTCTAT 3740 ATAAATTTTG CTCTGTTTCC CTATGGTTTT ATAAACGCTT TTGGGTTCCA AGCAAGCAGT 3800 AGATGTGCTT TTGAGCTACA AACAGCGAGC ACTGA AATAA AAACATTATTATT.

【００２２】配列番号：2 配列の長さ：17 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型 中間部フラグメント 起源 生物名 ウシ頚動脈血管内皮細胞 配列の特徴 特徴を表す記号： peptide 存在位置：79...95 特徴を決定した方法 S 配列 Leu Ser Asp Ala Thr Glu Glu Gly Ala Trp Ala Ala Val Ala Ala Asp 1 5 10 15 Gln。SEQ ID NO: 2 Array length: 17 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type Middle fragment origin Organism Bovine carotid artery endothelial cell Sequence features Characteristic symbol: peptide Location: 79 ... 95 Method by which the characteristics were determined S Array Leu Ser Asp Ala Thr Glu Glu Gly Ala Trp Ala Ala Val Ala Ala Asp  1 5 10 15 Gln.

【００２３】配列番号：3 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型 中間部フラグメント 起源 生物名 ウシ頚動脈血管内皮細胞 配列の特徴 特徴を表す記号： peptide 存在位置：242...251 特徴を決定した方法 S 配列 Asp Asn Asn Tyr Ala Asp Gly Ile SerPro 配列番号：4 配列の長さ：40 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGACATGGG GCTGACACCA TCACTGTAGT TGTTGTCCCA 40。SEQ ID NO: 3 Array length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type Middle fragment origin Organism Bovine carotid artery endothelial cell Sequence features Characteristic symbol: peptide Location: 242 ... 251 Method by which the characteristics were determined S Array Asp Asn Asn Tyr Ala Asp Gly Ile SerPro SEQ ID NO: 4 Array length: 40 Sequence type: Nucleic acid Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AGGACATGGG GCTGACACCA TCACTGTAGT TGTTGTCCCA 40.

【００２４】配列番号：5 配列の長さ：10 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型 中間部フラグメント 起源 生物名 ウシ頚動脈血管内皮細胞 配列の特徴 特徴を表す記号： peptide 存在位置：１５７．．．１６６ 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 Gln Glu Tyr Val Leu Thr Gln Gln GlyPhe 1 5 10。SEQ ID NO: 5 Array length: 10 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type Middle fragment origin Organism Bovine carotid artery endothelial cell Sequence features Characteristic symbol: peptide Location: 157. ． ． 166 Method for determining the characteristics S Array Gln Glu Tyr Val Leu Thr Gln Gln GlyPhe 1 5 10.

【００２５】配列番号：6 配列の長さ：42 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCCCTGGTAG ATGAAGCCCT GTTGGGTGAG CACATACTCC TG 42。SEQ ID NO: 6 Array length: 42 Sequence type: Nucleic acid Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GCCCTGGTAG ATGAAGCCCT GTTGGGTGAG CACATACTCC TG 42.

【００２６】配列番号：7 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：ペプチド フラグメント型 中間部フラグメント 起源 生物名 ウシ頚動脈血管内皮細胞 配列の特徴 特徴を表す記号： peptide 存在位置：581...587 特徴を決定した方法 S 配列 Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Pro 1 5。SEQ ID NO: 7 Array length: 7 Sequence type: Amino acid Topology: linear Sequence type: Peptide Fragment type Middle fragment origin Organism Bovine carotid artery endothelial cell Sequence features Characteristic symbol: peptide Location: 581 ... 587 Method by which the characteristics were determined S Array Asp Ile Tyr Leu Glu Asn Pro 1 5.

【００２７】配列番号：8 配列の長さ：39 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGACCCGGAT CTTGATTTCT GGATTCTCCA GGTAAATGT 39。SEQ ID NO: 8 Array length: 39 Sequence type: Nucleic acid Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array AGACCCGGAT CTTGATTTCT GGATTCTCCA GGTAAATGT 39.

【００２８】配列番号：9 配列の長さ：38 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCCTCCGTAG CATCGGACAG CCTGAAGAGG GCCTTGGT 38。SEQ ID NO: 9 Array length: 38 Sequence type: Nucleic acid Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array TCCTCCGTAG CATCGGACAG CCTGAAGAGG GCCTTGGT 38.

【００２９】配列番号：10 配列の長さ：38 配列の型：核酸 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGTCAGCCA GAAGGGCTGG CCCCGCCGCA CTACCAGC 38。SEQ ID NO: 10 Array length: 38 Sequence type: Nucleic acid Topology: linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Array GAGTCAGCCA GAAGGGCTGG CCCCGCCGCA CTACCAGC 38.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】本発明でクローニングされたウシトランスグル
タミナーゼの塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列である。FIG. 1 shows the nucleotide sequence of bovine transglutaminase cloned in the present invention and the amino acid sequence deduced therefrom.

【図２】ウシトランスグルタミナーゼをコードする遺伝
子のクローニングおよび配列解析の経過を示す図であ
り、５つのｃＤＮＡ（λＢＥＴＧ１０，１７，４０，４
１およびλＢＥＴＧ２０１）の配列および全塩基配列を
有する１つのゲノムＤＮＡ（λＢＧＴ１０５３）クロー
ンを示している図である。FIG. 2 is a diagram showing the progress of cloning and sequence analysis of a gene encoding bovine transglutaminase, which shows five cDNAs (λBETG10, 17, 40, 4).
1 is a diagram showing one genomic DNA (λBGT1053) clone having the sequences of 1 and λBETG201) and the entire base sequence. FIG.

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ウシトランスグルタミナーゼ。1. Bovine transglutaminase. 【請求項２】ウシ血管内皮細胞由来のウシトランスグル
タミナーゼ。2. Bovine transglutaminase derived from bovine vascular endothelial cells. 【請求項３】図１のアミノ酸配列あるいはその一部を含
有するウシトランスグルタミナーゼ。3. A bovine transglutaminase containing the amino acid sequence of FIG. 1 or a part thereof. 【請求項４】ウシトランスグルタミナーゼをコードする
ＤＮＡを含有するＤＮＡ。4. A DNA containing a DNA encoding bovine transglutaminase. 【請求項５】図１の１位から３８６５位の塩基配列ある
いはその一部を含有する請求項４記載のＤＮＡ。5. The DNA according to claim 4, which contains the nucleotide sequence of positions 1 to 3865 of FIG. 1 or a part thereof. 【請求項６】図１の１位から２１１０位の塩基配列ある
いはその一部を含有する請求項４記載のＤＮＡ。6. The DNA according to claim 4, which contains the nucleotide sequence from positions 1 to 2110 of FIG. 1 or a part thereof. 【請求項７】図１の４７位から２１１０位の塩基配列あ
るいはその一部を含有する請求項４記載のＤＮＡ。7. The DNA according to claim 4, which contains the nucleotide sequence from the 47th position to the 2110th position in FIG. 1 or a part thereof. 【請求項８】ウシトランスグルタミナーゼをコードする
ＤＮＡがウシ血管内皮細胞由来のＤＮＡである、請求項
４、５、６または７記載のＤＮＡ。8. The DNA according to claim 4, 5, 6 or 7, wherein the DNA encoding bovine transglutaminase is DNA derived from bovine vascular endothelial cells. 【請求項９】請求項４、５、６、７または８記載のＤＮ
Ａを含有するベクター。9. The DN according to claim 4, 5, 6, 7 or 8.
A vector containing A. 【請求項１０】請求項９記載のベクターを保持する形質
転換体。10. A transformant carrying the vector according to claim 9. 【請求項１１】請求項１０記載の形質転換体を培養し、
培養物中にウシトランスグルタミナーゼを生成蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする、該ウシトランス
グルタミナーゼの製造法。11. A culture of the transformant according to claim 10,
A method for producing bovine transglutaminase, which comprises collecting and collecting bovine transglutaminase in a culture, and collecting the bovine transglutaminase.