JPH11322782A - ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル標識および精製 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】診断試薬に検出可能な標識を結合させる方法お
よび組成物を提供する。 【解決手段】本発明は、詳細には、診断用ハイブリダイ
ゼーション・アッセイで使用される化学発光性アクリジ
ニウムエステルによるヌクレオチド・プローブの標識お
よび精製に関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 これは、１９８７年１０月５日に提出された出願番号第
１０５０８０号の一部継続出願である。発明の分野 この発明は、診断用試薬に検出可能な標識を結合させる
方法および組成物に関するものである。さらに詳しく
は、この発明は、診断用ハイブリダイゼーション・アッ
セイで使用される化学発光性アクリジニウムエステルに
よるヌクレオチド・プローブの標識および精製に関する
ものである。発明の背景 先行技術 この２０年間、広範な種類の薬剤が臨床診断および研究
アッセイにおいて標識として使用されてきた。さらに最
近では、特有のポリヌクレオチド配列の存在を高感度で
検出するためのハイブリダイゼーション・アッセイが開
発されている。一般にそれらのアッセイでは、容易に検
出され得る原子または基によりヌクレオチド多量体（プ
ローブ）を標識する。ハイブリダイゼーション条件下、
標的ヌクレオチド配列を含む疑のある試料に標識プロー
ブを暴露すると、標的は前記標識プローブとハイブリッ
ド形成する。試料中の標的配列の存在は、通常ハイブリ
ッド形成および非ハイブリッド形成プローブを分離し、
次いでプローブハイブリッド中の標識の存在を測定する
か、または非ハイブリッド形成プローブ中の標識量を測
定して、ハイブリッド形成した標識プローブの量を測定
することにより、定性的または定量的に測定することが
できる。歴史的には放射性標識が用いられた。しかし、
健康上の危険性および取り扱い上の難点から、後になっ
て非放射性標識が開発された。このような標識には、存
在の測定が直接的に為されるものも間接的に為されるも
のも含まれる。直接標識の例としては、化学発光、蛍光
または分光的測定が可能な標識が含まれる。間接標識の
例としては、ビオチンのような化合物および適当な検出
可能標識とコンジュゲートした蛋白により検出できる様
々な抗原が含まれる。ヌクレオチド多量体プローブに標
識を導入する好ましい一方法は、酵素的または化学的合
成プローブにリンカー−アームを導入することであっ
た。例えば、４−チオ−ＵＴＰ（Ｈ．エシャフプア等、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、７巻、１４８５
頁、１９７９）をＤＮＡフラグメントの３’−末端に結
合し、続いてその求核性スルフヒドリル部分において標
識した。チェンによるＰＣＴ出願（国際出願第ＷＯ８６
／０００７４号、１９８６年１月３日公開）に開示され
ている別の方法は、ピリミジン塩基ヌクレオチドを脱ピ
リミジン化し、生成する糖環を開いて、そこにアミン担
持部分を結合させる技術を示している。さらに、Ｐ．
Ｒ．ランガー等（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ、７
８巻、６６３３頁、１９８１年）により開示された５−
アリルアミンウリジントリ燐酸類似体の前駆体は、標識
部位を提供するヌクレオチド多量体プローブへの求核性
アミンの取り込みに使用され得る。標識の化学的方法も
提案されたが、これはヌクレオチド多量体中の若干のヌ
クレオチドに標識を結合させるものである。その一方法
としては、核酸プローブのシトシン残基のＣ−４位にお
けるエチレンジアミンによる重亜硫酸触媒アミノ基転移
がある（Ｒ．Ｐ．ビシジ等、ジャーナル・オブ・クリニ
カル・バイオロジー、２３巻、３１１頁、１９８６）。
ヌクレオチド多量体、代表的にはオリゴヌクレオチドの
５’−または３’−末端に１個の標識のみを結合する他
の技術も報告されている。例えば、固相オリゴヌクレオ
チド合成における最終段階としてリンカー−アーム結合
させる末端標識方法が開示されている。このリンカー−
アームは、次に標識結合に使用される。例えば、Ｂ．
Ａ．コノリー、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１
３巻、４４８５頁（１９８５年）、Ｓ．アグラワル等、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１５巻、３１３１
頁（１９８７年）参照。また、標準自動的合成方法中に
おける合成オリゴヌクレオチドの選択された位置での第
１級アミン修飾ヌクレオチドの挿入に使用され得る化合
物が報告されている。このような化合物には、デオキシ
チミジンおよびデオキシアデニン、デオキシグアニンな
どの類似体がある（Ｇ．Ｂ．ドライヤー等、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズＵＳＡ、８２巻、９６８頁、１９８５、
Ｊ．Ｌ．ルス、ＰＣＴ出願第ＵＳ８４／００２７９号、
公開番号ＷＯ８４／０３２８５、１９８４年８月３０日
公開）。さらに、ヌクレオチド結合燐酸基のアルキルア
ミン誘導体も報告されており、そのアミノ官能基は続い
て標識され得る（Ｒ．Ｌ．レットシンガーおよびＭ．
Ｅ．ショット、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティー、１０３巻、７３９４頁、１９８
１年、Ｎ．杉本による特開昭６１−４４３５３（１９８
６年３月４日付）、６１−５７５９５（１９８６年３月
２４日付）、６１−４４３５２（１９８６年３月４日
付））。理論的には、これらの化合物は、標識ヌクレオ
チドを配列に沿った幾つかの部位に配置させ得るもので
あるため、多重標識の使用により検出感度が高められ得
る。しかしながら、リンカー−アーム部位には、特に多
重標識が存在するとき、標的配列により形成されたハイ
ブリッドの安定性を減じ得る場合もあるため、リンカー
−アーム位置の選択には注意を要する。上記リンカー−
アームに加えて、非ヌクレオチドに基づくリンカー−ア
ーム試薬を設計したが、これらはアーノルド等による２
つの継続中の特許出願、即ち「ヌクレオチドプローブ用
非ヌクレオチド結合試薬」と題するアメリカ合衆国出願
番号第０９９０５０号（１９８７年９月２１日付）（特
表平２−５０３１４６号）および「オリゴヌクレオチド
末端置換用非ヌクレオチド試薬」と題するアメリカ合衆
国出願番号第１０４３３０号（１９８７年１０月２日
付）（特表平２−５０２２８４号）に記載されている。
これらのリンカー−アーム試薬は、他の先行技術による
試薬の限界を克服するものであり、多様な部位における
リンカー−アームの結合およびヌクレオチド／非ヌクレ
オチドポリマーの構築を可能にする。既知非同位体標識
の中で最も高感度な種類の一つは、免疫診断アッセイで
使用される蛋白質およびホルモンへのアクリジニウムエ
ステルの結合に関する、キャンベル等（イギリス国特許
第２１１２７７９Ｂ号、１９８６年１０月１５日）およ
びリチャードソン等（「標識抗原として使用されるプロ
ゲステロン−アクリジニウムエステルによる、血しょう
プロゲステロンの化学発光免疫測定法」、クリニカル・
ケミストリー、３１巻、１６６４−１６６８頁、１９８
５年）により記載された化学発光性アクリジニウムエス
テルである。ヌクレオチドプローブ多量体へのアクリジ
ニウムエステルの結合は、蛋白質に関して記載された標
識および精製方法を用いても容易には達成されない。ア
クリジニウムエステルによるヌクレオチド多量体プロー
ブの標識は以前に提案されている。しかしながら、それ
らの提案は、標識および精製方法（ヤブサキ等、アメリ
カ合衆国特許第４５９９３０３号）を何等提供するもの
ではないか、または記載された方法の場合、ハイブリダ
イゼーション・アッセイで使用するには標識の範囲が狭
く、標識プローブの精製度合は不充分である（モック
等、１９８６年８月１５日付ＥＰＡ出願第８６３０６３
０５．３号、公開番号第０２１２９５１号）。例えば、
モックおよびセプテックにより記載された方法は、蛋白
質の標識および精製に関する手順（ウィークス等）と類
似した手順を示している。それらの方法は、アミン末端
リンカー−アームを含むオリゴヌクレオチドプローブを
顕著な程度に（≦１０％）標識するには不充分であるこ
とが見出された。さらに、アクリジニウムエステル標識
蛋白質の精製に使用されるゲルろ過方法は、標識および
非標識プローブを分離せず、非コンジュゲート標識の充
分な除去もしない。ハイブリダイゼーション診断アッセ
イで使用する場合、ハイブリダイゼーション反応におい
て非標識プローブは標識プローブと競合するため、顕著
な量の非標識プローブが存在しないこと、また非コンジ
ュゲート標識は、分離支持体に結合し、診断アッセイの
感度を大きく減ずる高い化学発光基底値を生ずるため、
精製試料は１％を越える非コンジュゲート標識を含まな
いことが必要である。要望されているのは、ヌクレオチ
ド多量体の標識手段および標識された多量体を本質的に
純粋な形態で精製する手段である。ここに記載している
発明は、それらの手段を提供するものである。発明の目的 この発明の一目的は、アクリジニウムエステルによりプ
ローブを標識し、標識された前記プローブを高純度に精
製することである。（１）アクリジニウムエステルによ
るヌクレオチドプローブの標識および前記標識プローブ
の精製、および（２）アクリジニウムエステルによる蛋
白質の標識および前記標識蛋白質の精製に関する先行技
術のシステムは、この目的にとって不満足なものである
ことが判った。特に、この先行技術は、低マイクロモル
濃度範囲でのアクリジニウムエステル試薬を用いたヌク
レオチドプローブの標識および通常のゲルろ過技術を用
いた精製を開示している。それらのマイクロモル濃度範
囲は低い程度（１０％またはそれ未満）のヌクレオチド
プローブの標識にのみ有用である。同じく、ゲルろ過を
含む先行技術による分離技術は、アクリジニウムエステ
ル標識プローブへの適用の場合実行不可能である。凝集
した遊離アクリジニウムエステル標識は、アクリジニウ
ムエステル標識プローブとボイドボリューム中において
共溶離することが見出された。さらに、遊離アクリジニ
ウムエステル標識は、プローブと非共有的に結合し、カ
ラム中のアクリジニウムエステル標識プローブと共に移
動した。結局、当業界で既知の方法は、非標識プローブ
からのアクリジニウムエステル標識プローブの分離には
不満足なものであった。従って、この発明の目的には、
高い効率でのアクリジニウムエステルによる核酸プロー
ブの標識方法が含まれる。この発明の別の目的は、未反
応並びに凝集および非共有結合したアクリジニウムエス
テルから前記標識プローブを高純度に分離する方法であ
る。この発明のさらに別の目的は、非標識プローブおよ
び標識プローブの分解生成物から前記標識プローブを分
離する方法である。この発明のさらに別の目的は、大量
の高純度アクリジニウムエステル標識オリゴマーを生産
することにより、診断アッセイに有用な前記標識プロー
ブを製造し得る効果的で迅速で再生可能な方法である。発明の要旨 アクリジニウムエステル、４−（２−スクシンイミジル
オキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート・フルオロスルホネ
ートは、アミン反応性スクシンイミジル基を含む高度化
学発光性化合物である。この化合物および類似化合物と
第１級アミン含有核酸プローブとの反応により、化学発
光性標識プローブが生成される。また関連反応系におい
ては、チオール含有核酸プローブ並びに他のアミンおよ
びチオール・コンジュゲーション・パートナーもアクリ
ジニウムエステルと反応して化学発光性標識プローブを
生成し得る。この発明は、アクリジニウムエステルによ
る第１級アミン含有プローブの構築、標識および後続の
精製方法であって、第１級アミン１個に対し１個のアク
リジニウムエステルを有するプローブの製法を述べてい
る。また、アクリジニウムエステルによるチオール基含
有プローブの構築、標識および後続の精製に関連したシ
ステムについても記載している。低マイクロモル濃度範
囲のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル標識
試薬を用いてプローブを標識するのは困難である。さら
に、ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル
標識は、一旦プローブに結合されると、アクリジニウム
エステルが特に不安定になるという事実があるため面倒
である。この発明は、プローブを含むアミンまたは水硫
基へのアクリジニウムエステルの新規結合方法を開示し
ている。これらの部分、特にアミンは、プローブの陰性
荷電燐酸基と相互作用するため、アクリジニウムエステ
ルにより標識しにくい。この発明によるアクリジニウム
エステルのプローブへの結合方法は、高アクリジニウム
エステル濃度（０．１〜５０ミリモル）の使用を要す
る。これらの高濃度は、全反応容量の２０％〜８０％の
濃度における有機溶媒の使用により達成され得る。ま
た、高いｐＨを用いることにより、求核性アミノまたは
チオール・コンジュゲーション・パートナーの有効濃度
を高めることができる。プローブの好ましい標識方法
は、有機溶媒による１−１０ミリモル濃度のアクリジニ
ウムエステルの使用である。そのような標識方法は、溶
液中、またはアクリジニウムエステルまたはプローブの
いずれか一方を溶液に懸濁させた状態で実施され得る。
すなわち構築された標識プローブは、この明細書に開示
されている本発明方法を用いて精製され得る。非標識プ
ローブおよび遊離アクリジニウムエステルからのアクリ
ジニウムエステル標識プローブの精製または分離は、ま
ず遊離アクリジニウムエステル標識の大部分をプローブ
から除去し、次いで実質的に残り全部の遊離標識をプロ
ーブから除去し、最後に標識プローブ、非標識プローブ
および標識プローブ分解生成物を分離することにより行
なわれる。これらの段階は連続的または同時に行なわれ
得る。プローブからの遊離標識の大部分の好ましい除去
方法は、核酸沈澱、イオン交換ＨＰＬＣおよび逆相ＨＰ
ＬＣを含む急速な分離技術であるが、これらに限定され
る訳ではない。残存する痕跡量のアクリジニウムエステ
ルをプローブから除去し、標識プローブと非標識プロー
ブを同時に分離する好ましい方法には、イオン交換、逆
相または水酸化リン灰石ＨＰＬＣの特異的適用が含まれ
る。この方法により、核酸プローブは、アクリジニウム
エステルにより標識され高純度に精製され得る。次に、
これらの標識および精製プローブは、診断アッセイ領域
における少量の特異標的物質の検出に使用され得る。ま
た、アクリジニウムエステル標識プローブの検出に使用
される試薬およびアッセイ・システムおよびキットもこ
の発明に含まれる。図面の簡単な記載 第１図は、アクリジニウムエステル反応式を図示したも
のである。第２図は、アクリジニウムエステルにより内
部標識されたプローブを図示したものである。第３図
は、アクリジニウムエステルによるプローブ標識におけ
るコンジュゲーション・パートナーおよび反応生成物お
よび条件を要約した表である第４図は、アクリジニウム
エステル標識プローブのイオン交換（４Ａ）および逆相
（４Ｂ）ＨＰＬＣプロフィールを図示したものである。
第５図は、アクリジニウムエステル標識プローブの検出
を図示したものである。好ましい態様の詳細な記載 定義 この明細書（請求の範囲を含む）において使用されてい
る下記の語の定義を行う。 アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル：４価窒素中心を有し、９位が誘導体化さ
れてフェニルエステル部分が形成されたアクリジニンの
誘導体、具体的には、４−（２−スクシンイミジルオキ
シカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジ
ニウム−９−カルボキシレート・フルオロスルホネー
ト。アクリジニウムエステルメトキシイミデート アクリジニウムエステル： 下記の一般的タイプの部分 Ｒ_１＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキ
ル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリ
ールオキシであるか、またはＸ＝ハロゲンの場合は存在
しない。Ｒ_２＝Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、
置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコ
キシ、アリールオキシ（Ｘ＝Ｎの場合のみあるとすれ
ば）。Ｒ_３＝Ｈ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロ
ゲン、ニトロ、アミノ、アミド、アセチル、アルキル、
アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、
置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリール
オキシ。Ｒ_４＝アルキル、アルケニル、アリール、置換
アルキル、置換アルケニル、置換アリール。Ｘ＝Ｏ、
Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換燐、置換硫黄、置換ほう素また
は置換ひ素。Ｙ＝Ｏ、ＳまたはＮＨ。Ｒ_１および／また
はＲ_２および／またはＲ_３および／またはＲ_４は化学的
コンジュゲーションを可能にする反応性部位を有する。 ヌクレオチド：燐酸基、５炭素糖および窒素含有塩基か
ら成る核酸のサブユニット。ＲＮＡにおいて、５炭素糖
はリボースである。ＤＮＡにおいて、それは２−デオキ
シリボースである。この語はまたそれらのサブユニット
の類似体を包含する。 ヌクレオチド多量体：ホスホジエステル結合により結合
されたヌクレオチドまたはその類似体の鎖。 オリゴヌクレオチド：一般に約１０〜約１００長のヌク
レオチドを有するが、長さが１００を越えるヌクレオチ
ドの場合もあり得るヌクレオチド多量体。それらは通
常、ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられる
が、酵素的手段によっても生成され得る。 デオキシリボリゴヌクレオチド：デオキシリボヌクレオ
チド・モノマーから成るオリゴヌクレオチド。 ポリヌクレオチド：一般に長さ約１００ヌクレオチドま
たはそれ以上のヌクレオチド多量体。これらは、通常生
物に由来するか、または酵素的手段により得られる。 ヌクレオチド多量体プローブ：第２ヌクレオチド多量
体、通常ポリヌクレオチド内に含まれる標的ヌクレオチ
ド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチ
ド多量体。通常、標的配列の対応する塩基に完全に相補
的であるプローブが選択される。しかし、プローブ中の
１個またはそれ以上のヌクレオチドが標的配列の対応す
る塩基に相補的でなくても適切またはさらに望ましい場
合もあり得る。一般的には、プローブは標識される。全
体を通じて簡略表示の「プローブ」は、この明細書で定
義されているヌクレオチド多量体プローブを指すものと
する。 ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー：ヌクレオチド
および非ヌクレオチドモノマー単位から成るポリマー。
プローブとして使用される場合、一般的には標識され
る。 ハイブリッド：相補的塩基間のワトソン−クリック塩基
対形成により２つのヌクレオチド多量体間に形成された
複合体。 懸濁液： 液体の混合物または液体内における固体の非
沈澱粒子の混合物。粒子（含有）液体、粒子は分散相で
あり、懸濁媒質は連続相である。アクリジニウムエステ
ル化学作用は、ウィークス等、「免疫検定における高比
活性標識としてのアクリジニウムエステル」、クリニカ
ル・ケミストリー、２９１８、１４７４−１４７９頁
（１９８３年）に概説されている。簡単に述べると、ア
クリジニウムエステルは、それらの対応する塩基と平衡
した状態で存在する。塩基形成は高ｐＨが好ましい。４
価窒素類の形成は低ｐＨが好ましい。化学発光反応は、
電子的に励起したＮ−メチルアクリドンの形成をもたら
す、アクリジニウム類のヒドロキシペルオキシド・イオ
ンによる攻撃を伴う。この反応は、添付図面の第１図に
図示されている。 １．アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシン
イミジル−エステルによる標識。 ａ．プローブの選択 好ましい態様では、標識されるべきプローブは第１級ア
ミンを含む。５’−末端が修飾（５’−アミノエチルホ
スフェート、「末端アミンリンカー−アーム」）、内部
修飾［非ヌクレオチドに基づく「内部アミンリンカー−
アーム」、１型（特許出願第０９９０５０号のＬ１参
照）、２型（特許出願第０９９０５０号のＬ３参照）、
Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７またはＬ８、塩基置換ま
たは塩基間挿入として使用されている］またはアミン修
飾塩基内部付加［アミノ（１２）ｄＵＴＰ、カルビオケ
ム、サンディエゴ、カリフォルニア］またはプローブの
３’−末端が修飾（５−アリルアミンＵＴＰ）されたア
ミンリンカー−アームにより、この方法は有効に実践さ
れた。さらに、この発明は、例えば燐酸バックボーンお
よび糖残基の標識に使用され得る。この発明により、こ
の明細書の先行技術の部分で述べたアミン・リンカー・
アーム・プローブ、チオールホスフェート含有プローブ
およびチオールウリジン含有プローブを含む（ただし、
これらに限定されない）、先行技術において既知の他の
修飾ヌクレオチド・プローブの使用も考えられる。添付
図面の第２図は、アクリジニウムエステルにより内部標
識されたプローブを示す。 ｂ．プローブの標識 １．ｐＨの選択 これはある程度アミン・リンカー・アームにより異なる
が、この化学反応に最適のｐＨは約８である。 ２．緩衝液の選択 最適ｐＨにおいて良好な緩衝液であることを要する。Ｈ
ＥＰＥＳ、燐酸、重炭酸の緩衝液が選択され得るが、こ
れらに限定される訳ではない。 ３．有機溶媒の選択 最終反応カクテルにおいて２０％〜８０％の範囲で使用
されるべきである。選択範囲には、ＤＭＳＯ、ＣＨ_２Ｃ
Ｎ、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、アセトン、メ
タノールが含まれるが、これらに限定される訳ではな
い。選択の必要条件は、プローブおよびアクリジニウム
エステルは選択された溶媒に高い可溶性を示さなけれぱ
ならないこと、並びにアクリジニウムエステルおよびプ
ローブは溶媒により過度に減成されないことである。 ４．アクリジニウムエステル濃度 選ばれた化学条件により異なるが、０．１ミリモル〜５
０ミリモルが許容され得る範囲である。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジル・エステル・コンジュゲーション・パ
ートナーの最適範囲は、使用されるアミン・、リンカー
−アーム化学作用により異なるが、約１−１０ｍＭのア
クリジニウムエステルである。反応の経過中における多
重付加により、最終的な標識程度は高められるが、精製
はさらに困難なものとなる。 ５．温度 １５−４０℃が最適である。 ６．反応の持続性 これは、リンカーアーム化学作用および他の反応パラメ
ーターに左右されるため、タイムーポイント・アリコー
ト分析により測定すべきである。この分析では、標識の
程度対アクリジニウムエステル−プローブ分解生成物の
出現を考察する。 ７．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−アクリジニウム
エステルの未反応親電子性コンジュゲーション・パート
ナーのクェンチング。同じ反応条件下でコンジュゲーシ
ョン・パートナー求核剤の簡単な類似体を加えるべきで
ある。第３図は、アミン、チオールを含む核酸プローブ
およびそれらの各コンジュゲーション・パートナーに対
するこの発明の反応生成物および条件を要約したもので
ある。 ｃ．標識されたプローブの精製。 ２段階方法が一般的にはさらに効果的である。まず、迅
速で簡単な方法を用いて遊離標識の大部分を除去すべき
である。これには、例えば沈澱、水酸化リン灰石、バイ
オービーズＳＭ−２、セプーパックまたは遊離標識は結
合するが標識プローブは結合しない（またはその逆）他
の固体支持体への遊離標識の結合、高速ゲルろ過、有機
相への遊離標識の抽出、ろ過（例、セントリコン）、高
速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを含む）ま
たは高速逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを含む）が
あるが、これらに限定される訳ではない。次に、プロー
ブに非共有結合しているアクリジニウムエステルを含む
残りの遊離標識および非標識プローブから標識プローブ
を非常に高い純度まで分離しなければならない。この場
合の選択はかなり制限されている。最も速く最も有効な
方法は、イオン交換、逆相および水酸化リン灰石による
ＨＰＬＣであるが、これらに限定される訳ではない。Ｈ
ＰＬＣほどではないにせよ適度に機能はするが、さらに
冗長で時間のかかる別の方法は、有機溶媒の存在下にお
けるゲルろ過（代表的にはホルムアミド中バイオゲルＰ
−１００またはＰ−２００を使用）である。また、精製
は、ＨＰＬＣを用い、精製すべき量が充分少量である場
合には有機溶媒中でのゲルろ過を用いる１段階方法で達
成され得る。この１段階方法は、一般に上記２段階方法
ほど有効ではない。 実施例 実施例１ エタノール沈澱、次いでイオン交換ＨＰＬＣによる様々
なアミン・リンカー・アーム・プローブの標識および精
製。 Ａ．アミン・リンカー・アーム・プローブの合成および
精製。 様々なアミン・リンカー・アーム化学による様々なデオ
キシオリゴヌクレオチド・プローブに対する本明細書記
載の方法および手順の有効な適用性を立証するために、
次のアミン・リンカー・アーム・プローブを製造した。 １．５’−アミン・リンカー−アーム・プローブ ５’−アミン・リンカー・アームをプローブに結合する
ために、２つの方法が採られた。一方は、アプライド・
バイオシステムズ、インコーポレイテッドにより市販さ
れている試薬「アミノリンク」の使用による方法であっ
た。他方は下記化合物の使用による方法であった。 この化合物については、末端アミン・リンカー・アーム
試薬と称する。この試薬を次の要領で合成した。６−ア
ミノヘキサノールを、無水酢酸エチル中Ｓ−エチルトリ
フルオロチオアセテートと反応させた。反応生成物を石
油エーテルにより沈澱させ、１０％ピリジン（水中）混
合物で１０分間処理することにより、形成された可能性
のあるＯ−トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム形
態で濃縮乾固した。次いで、この化合物を文献内の標準
プロトコルに従って（ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１２（１１）、４５３９（１９８４年）参照）ホス
フィチル化することにより、所望の化合物、すなわち末
端アミン・リンカー・アーム試薬（１）が生成された。
５’−アミン・リンカー・アーム（アミノリンクまたは
末端アミン・リンカー・アーム）を含むプローブについ
ては、次の要領で合成した。アプライド・バイオシステ
ムズ、インコーポレイテッドのモデル３８０Ａ ＤＮＡ
シンセサイザーを用いて、所望のヌクレオチド配列のプ
ローブを、３’−末端から５’−末端へプローブを構築
する標準ホスファーアミダイト化学作用により製造し
た。所望の配列が完成後、別のホスファーアミダイト・
ヌクレオシドの結合に関する場合と同じ方法で末端アミ
ン・リンカー・アーム試薬を使用するか、または製造会
社が記載した手順を用いてアミノリンクを使用すること
により、アミン・リンカー・アームを自動的にプローブ
の５’−ヒドロキシル基に結合させた。標準プロトコル
を用いて、次にこのプローブを固体支持体から開裂し、
ＮＨ_４ＯＨを用いて脱保護し、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、次いでセファデックスＧ−２５クロマトグラ
フィーにより精製した。この手順を用いて次のプローブ
を合成および精製した。 を表す］および２．内部アミノ・リンカー・アーム・プローブ。 アミン・リンカー・アームをプローブの内部に取り込ま
せるため、アーノルドらによるアメリカ合衆国特許出願
第０９９０５０号（１９８７年９月２１日提出、名称
「ヌクレオチド・プローブ用非ヌクレオチド結合試
薬」）に記載されている内部アミン・リンカー・アーム
試薬、１型または２型を用いた。同様に、標準ホスファ
ーアミダイト化学を用いてプローブを合成し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動およびセファデックスＧ−２５
クロマトグラフィーを用いて精製した。この方法により
次のプローブを合成した。 １．）エシェリヒア・コリに由来する１６Ｓサブユニッ
トのｒＲＮＡに相補的な３０量体。配列の１８位のアデ
ニン残基が内部アミン・リンカー・アーム１型により置
換されている。 また、チミジン、シチジンまたはグアノシン残基を内部
リンカー・アーム１型により置換する形でプローブを合
成した。 ２．）クラミジア・トラコマティスに由来する１６Ｓサ
ブユニットのｒＲＮＡに相補的な３３量体。配列の２１
位のアデニン残基を内部アミン・リンカー・アーム１型
により置換 または残基２１および２２の間にこれを挿入している。 ３．）クラミジア・トラコマティスに由来する２３Ｓサ
ブユニットのｒＲＮＡに相補的な２４量体。残基１５お
よび１６間に内部リンカー・アームＬ７型が挿入されて
いる。 Ｂ．アクリジニウムエステルのＮＨＳエステルによるア
ミン・リンカー・アーム・プローブの標識および後続の
精製。ＮＨＳエステルまたはアクリジニウムエステルの
２５ｍＭストック溶液を蒸留ＤＭＳＯ中で調製した。所
望量のプローブ（上記Ａ項において標識された種々のプ
ローブのリスト参照）を１．５ｍｌ円錐形ポリプロピレ
ン管において濃縮乾固した。下記成分を順に加えること
により、下記カクテルを構築した。 ３マイクロリットルのＨ_２Ｏ １マイクロリットルの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０） ４マイクロリットルのＤＭＳＯ（蒸留） ２マイクロリットルの２５ｍＭアクリジニウムエステル
のＮＨＳエステル（蒸留ＤＭＳＯ中）。 混合物を渦状に回し、２秒間小型遠心分離器中で回転さ
せ（管の底に内容物を集めるため）、３７℃で２０分間
インキュベーションした。次いで、下記成分を列挙した
順に反応カクテルに加えた。 ３．０マイクロリットルの２５ｍＭアクリジニウムエス
テルのＮ ＨＳエステル（蒸留ＤＭＳＯ中） １．５マイクロリットルのＨ_２Ｏ ０．５マイクロリットルの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．
０） 再びカクテルを渦状に回し、回転させ、３７℃でさらに
２０分間インキュベーションした。０．１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ８．０）、５０％ＤＭＳＯ中０．１２５Ｍ リ
ジン５マイクロリットルを加えることにより５倍過剰の
リジンを用いて未反応標識をクェンチングし、室温で５
分間インキュベーションした。次いで、次の方法を用い
てアクリジニウムエステル標識プローブを精製した。未
反応標識の大部分を除去するため、プローブを次の要領
でエタノール沈澱させた。２０マイクロリットルのクェ
ンチングされた反応混合物に、３０マイクロリットルの
３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、２４５マイクロリッ
トルのＨ_２Ｏおよび５マイクロリットルのグリコーゲン
を担体として加えた（グリコーゲンを前処理することに
より、ヌクレアーゼ活性を全て除去した）。試料を短時
間渦状に回し、６４０マイクロリットルの無水ＥｔＯＨ
を加えた。試料を短時間渦状に回し、氷上で５−１０分
間インキュベーションし、次いで５分間小型遠心分離器
中１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を注意深く除
去し、沈澱物を２０マイクロリットルの０．１ＭＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ５．０）、０．１％ＳＤＳに再溶解した。次
いで、下記の２つのＨＰＬＣシステムの一方法を用いる
ことにより、残存遊離標識、非標識プローブおよびＡＥ
標識プローブの分解生成物からＡＥ標識プローブを分離
した。イオン交換ＨＰＬＣ ＩＢＭ９５３３ＨＰＬＣシステムに搭載されたヌクレオ
ーゲン−ＤＥＡＥ６０−７イオン交換ＨＰＬＣカラムに
２０マイクロリットルの再溶解沈澱物を注入した。ＨＰ
ＬＣ用水、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）および酢酸ナ
トリウム（ＮａＯＡｃ）（フィッシャー・サイエンティ
フイックから）並びに試薬用氷酢酸（ＨＯＡＣ）および
ＬｉＣｌにより全ての緩衝液を調製した。使用前に全緩
衝液を０．４５マイクロモル孔サイズのナイロン−６６
フィルターによりろ過した。０．５ｍｌ／分の流速で２
５分間５５％の緩衝液Ａ、４５％の緩衝液Ｂから３０％
の緩衝液Ａ、７０％の緩衝液Ｂへの一次勾配により溶出
を行った。流出中、２６０ｎｍでの吸光度をモニターし
た。視野の範囲は１光学密度単位に等しかった。チャー
ト速度は２０ｃｍ／時であった。０．５ｍｌのフラクシ
ョンを１．５ｍｌのスクリュー・キャップ式エッペンド
ルフ管に集めた。結果を第４Ａ図に示す（この場合、プ
ローブは、上記Ａ項記載の末端アミン・リンカー・アー
ム含有２６量体であった。他のプローブは全て酷似した
プロフィールを示した。）。流出直後、５マイクロリッ
トルの１０％ＳＤＳを各管に加え、次いで各管を渦状に
回した（これは、アクリジニウムエステル標識プローブ
が管壁に付着していないことを確実にするために行なっ
た）。０．５マイクロリットルのアリコートをフラクシ
ョン２１−４２から除去し、１２×７５ｍｍ管中２００
マイクロリットルの水に加えた（各アリコートに対して
分離ピペット・チップを用いることにより、持ち越し問
題を回避した）。次いで、ベルトールド・クリニルマッ
トにおいて、２００マイクロリットルの０．２５Ｎ Ｈ
ＮＯ_３、０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１秒遅れで２００マイクロ
リットルの１Ｎ ＮａＯＨを自動的に注入し、続いて１
０秒間化学発光アウトプットを読み取ることにより、各
アリコートの化学発光度を測定した。次に、フラクショ
ン６４−６８を次の要領でＥｔＯＨ沈澱させた。各々５
マイクロリットルのグリコーゲンに加え、渦状に回し、
１ｍｌのＥｔＯＨを加え、渦状に回し、氷上で５−１０
分間インキュベーションし、小型遠心分離器中１５００
０ｒｐｍで５分間遠心分離した。各上清を注意深く除去
し、沈澱物を２０マイクロリットルの０．１Ｍ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ５、０．１％ＳＤＳに再溶解し、フラクショ
ンをプールした。逆相ＨＰＬＣ また、アクリジニウムエステル標識プローブを概ね上記
手順に従い精製した。例外として、バイダックＣ４逆相
カラムを使用し、緩衝液Ａは０．１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム（アプライド・バイオシステムズ、インコー
ポレイテッド、フォスター・シティー、カリフォルニ
ア）であり、緩衝液ＢはＣＨ_３ＣＮであった。流速１ｍ
ｌ／分で２５分間１０−１５％溶媒Ｂからの一次勾配を
用いて標識プローブを溶離した。吸光度を２６０ｎｍで
モニターした。０．５ｍｌのフラクションを集めた。次
いで、主たる化学発光ピークを確認し、上記の要領で後
処理した（ただし、ＥｔＯＨ沈澱前に４５マイクロリッ
トルの３Ｍ ＮａＯＡｃを各フラクションに加えた）。
添付図面の第４Ｂ図は、上記Ａ項記載の２４量体プロー
ブ（内部リンカー・アーム、Ｌ７型）の溶離プロフィー
ルを示す。他のプローブも全て非常に似たプローブを示
した。これらの手順の両方を用いることにより、この明
細書に記載されている全てのリンカー・アーム化学作用
について本質的に同等の結果で高純度アクリジニウムエ
ステル標識プローブが得られた。これらのプローブの比
活性は、プローブ１ピコモル当たり一般的に５−１０×
１０’化学発光カウント（ベルトールド・クリニルマッ
ト）であった。添付図面の第５図は、一旦精製されたそ
れらのプローブが検出され得る感度を示す。 Ｃ．アクリジニウムエステルのメトキシイミデート誘導
体によるアミン・リンカー・アームプローブの標識およ
び後続の精製。 この手順は概ね上記Ｂ項記載の手順に従い行ったが、異
なる点は次の通りであった。乾燥プローブを５０マイク
ロリットルの０．５モルＮａＣＯ_３、ｐＨ９および２５
マイクロリットルのジメチルホルムアミドに再溶解し
た。次に、０．２ｍｇのメトキシイミンアクリジニウム
エステル（ＭＩ−ＡＥ）を加え、混合物を渦状に回し、
室温で３０分間反応させた。さらに０．２ｍｇのＭＩ−
ＡＥを加え、室温でさらに３０分間反応を続行した。未
反応標識を０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９中５０ｍＭ
リジン１００マイクロリットルによりクェンチングした
（室温で１０分間インキュベーション）。次いでアクリ
ジニウムエステル標識プローブを上記Ａ項の記載に従い
エタノール沈澱させたが、ただし、４０マイクロリット
ルの３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、１０５マイクロ
リットルのＨ_２Ｏおよび７５０マイクロリットルの無水
ＥｔＯＨを使用した。次いで、Ｂ項の記載に従いイオン
交換ＨＰＬＣを用いてプローブをさらに精製した。 実施例２ アクリジニウムエステル標識プローブを用いた臨床環境
における標的ポリヌクレオチド配列の希釈系列の検出。
下記手順に従い、アクリジニウムエステルにより内部標
識したプローブ（３３量体、内部リンカー−アーム、１
型、アデノシン置換、実施例１参照）を、その標的ｒＲ
ＮＡ（この場合、クラミジア・トラコマティス）とハイ
ブリッド形成させた。ハイブリダイゼーション混合物 １６マイクロリットルの咽喉のスワブ（綿棒で採取した
試料）、３％ラウリル硫酸リチウム、３０ｍＭ燐酸緩衝
液（ＰＢ）ｐＨ６．８、１ミリモルＥＤＴＡ、１ミリモ
ルＥＧＴＡ中。 ２マイクロリットルの４．８モルＰＢ、ｐＨ４．７ １マイクロリットルのｒＲＮＡ（１０−^３、１０−^２、
１０−^１または０．３３マイクログラム） １マイクロリットルのプローブ（０．３３ピコモル） 対照混合物は、ｒＲＮＡの代わりに水を含むこと以外、
ハイブリダイゼーション混合物と同じであった。混合物
を６０℃で６０分間インキュベーションした。次いで、
次の要領で水酸化リン灰石（ＨＡＰ）を用いて非ハイブ
リッド形成プローブからハイブリッドを分離した。各ハ
イブリッドおよび対照混合物に、１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８（２％ＨＡＰ含有）
を加えた。生成した混合物を各々５秒間渦状に回し、６
０℃で５分間インキュベーションし、２０秒間渦状に回
し、次いで小型遠心分離器中１５０００ｒｐｍで３０秒
間遠心分離した。上清を除去し、１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８をＨＡＰ沈澱物に加
え、混合物を１０秒間渦状に回し、次いで、小型遠心分
離器中１５０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。上清
を除去し、この洗浄処理を正確に同じやり方でもう２回
反復した。残りのＨＡＰ沈澱物を１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８に再懸濁し、実施例
１の記載と全く同様に化学発光度を直接読み取った。 結果： 結果はデュプリケイト値の平均を表す。シグナルは数百
の相対光単位（ｒｌｕ’ｓ）として与えられた。対照シ
グナルは、約０．１％のインプットｒｌｕを表す。Ｓ：
Ｂは、シグナル対基底値の比、すなわち特定ｒＲＮＡ濃
度での化学発光度を対照の化学発光度で除した値であ
る。これらのデータは、この明細書の記載に従いアクリ
ジニウムエステル標識および精製されたプローブを用い
ることにより、標的ポリヌクレオチド配列を高感度で特
異的に検出することができることを立証している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ネルソン、ノーマン・チャールズ アメリカ合衆国92111 カリフォルニア サンディエゴ マースレタ・ドライブ 3639番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸プローブを標識化する方法であって、核酸プロ
   ーブがアクリジニウムエステル類に結合し得る第１のコ
   ンジュゲート部分を有し、アクリジニウムエステル標識
   試薬が該核酸プローブの該第１のコンジュゲート部分に
   結合し得る第２のコンジュゲート部分を有し、該プロー
   ブが溶媒中において高濃度のアクリジニウムエステル標
   識試薬により結合することを特徴とする核酸プローブを
   標識化する方法。 ２．該標識試薬の濃度が少なくとも０．１ｍＭ以上であ
   る、請求の範囲第１項に記載の核酸プローブを標識化す
   る方法。 ３．該標識試薬の濃度が０．１ｍＭ〜５０ｍＭである、
   請求の範囲第１項に記載の核酸プローブを標識化する方
   法。 ４．該核酸プローブを標識化する工程をｐＨ７〜９にお
   いて行う、請求の範囲第１〜３項のいずれかひとつに記
   載の核酸プローブを標識化する方法。 ５．該核酸プローブを標識化する工程を１５〜４０℃に
   おいて行う、請求の範囲第１〜４項のいずれかひとつに
   記載の核酸プローブを標識化する方法。 ６．溶媒が２０容量％〜８０容量％の有機溶媒濃度であ
   る、請求の範囲第１〜５項に記載の核酸プローブを標識
   化する方法。 ７．有機溶媒が、ＤＭＳＯ、ＣＨ_３ＣＮ、ジメチルホル
   ムアミド、ジオキサン、アセトン及びメタノールからな
   る群より選ばれる、請求の範囲第６項に記載の核酸プロ
   ーブを標識化する方法。 ８．溶媒中において核酸プローブを標識化する工程を、
   核酸プローブを含む溶液により行い、該標識試薬を溶液
   に懸濁させる、請求の範囲第１〜７項に記載の核酸プロ
   ーブをアクリジニウムエステル試薬で標識化する方法。 ９．溶媒中において核酸プローブを標識化する工程を、
   標準試薬を含む溶液により行い、核酸プローブを溶液に
   懸濁させる、請求の範囲第１〜８項に記載の核酸プロー
   ブを標識化する方法。 １０．核酸プローブを標識化する方法がさらに、未反応
   のアクリジニウムエステル標識試薬をクエンチングする
   ことを含有する、請求の範囲第１〜９項に記載の核酸プ
   ローブを標識化する方法。 １１．核酸プローブの第１のコンジュゲート部分及びア
   クリジニウムエステル標識試薬の第２コンジュゲート部
   分が各々下記のものである、請求の範囲第１〜１０項の
   いずれかに記載の核酸プローブをアクリジニウムエステ
   ル標識試薬で標識化する方法。 １２．該アクリジニウムエステル試薬がＮ−ヒドロキシ
   スクシンイミデ−アクリジニウムエステル試薬である、
   請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の核酸プロー
   ブを標識化する方法。 １３．アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プ
   ローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高
   純度で分離する方法であって、第１の緩衝液中で、イオ
   ン交換、逆相及びヒドロキシアパタイトからなる群から
   選ばれるＨＰＬＣカラムに該標識プローブを結合させ、
   ＨＰＬＣカラムを第２の緩衝液と接触、または、第１の
   緩衝液及び第２の緩衝液の勾配に接触させることによ
   り、標識プローブ、非標識プローブ及び遊離アクリジニ
   ウムエステル標識試薬の分別溶離を実現させることを含
   むアクリジニウムエステル標識プローブを非標識プロー
   ブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度
   で分離する方法。 １４．カラムがイオン交換であり、第１の緩衝液が２０
   ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮで
   あり、第２の緩衝液が２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ
   ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、１モルＬｉＣｌである、請
   求の範囲第１３項に記載のアクリジニウムエステル標識
   プローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエス
   テル標識試薬から高純度で分離する方法。 １５．カラムがイオン交換であり、２０ミリモルＮａＯ
   Ａｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．４５モルＬ
   ｉＣｌからなる第１の緩衝液から、２０ミリモルＮａＯ
   Ａｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．７モルＬｉ
   Ｃｌからなる第２の、緩衝液への勾配が使用される、請
   求の範囲第１３に記載のアクリジニウムエステル標識プ
   ローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエステ
   ル標識試薬から高純度で分離する方法。 １６．カラムが逆相であり、第１の緩衝液が０．１Ｍ酢
   酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０であり、第２の
   緩衝液がＣＨ_３ＣＮである、請求の範囲第１３に記載の
   アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プローブ
   及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度で
   分離する方法。 １７．カラムが逆相であり、０．１モル酢酸トリエチル
   アンモニウム、ｐＨ７．０、１０％ＣＨ_３ＣＮからなる
   第１の緩衝液から、０．１モル酢酸トリエチルアンモニ
   ウム、ｐＨ７．０、５０％ＣＨ_３ＣＮからなる第２の緩
   衝液への勾配が使用される、請求の範囲第１３項に記載
   のアクリジニウムエステル標識プローブを非標識プロー
   ブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度
   で分離する方法。 １８．アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プ
   ローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高
   純度で分離する方法であって、高速な分離手段を用いて
   標識プローブから遊離アクリジニウムエステル標識試薬
   の大部分を除去し、残存している実質的に全部の遊離ア
   クリジニウムエステル標識試薬をプローブから除去し、
   イオン交換、逆相またはヒドロキシアパタイトからなる
   群から選ばれるＨＰＬＣを用いて標識プローブを非標識
   プローブから分離することを含むアクリジニウムエステ
   ル標識プローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウ
   ムエステル標識試薬から高純度で分離する方法。 １９．高速な選択手段が、（１）核酸沈殿、（２）ヒド
   ロキシアパタイト、バイオ−ビーズＳＭ２、セプ−パッ
   ク又は標識が結合し遊離標識プローブが結合しないか、
   または標識プローブが結合し遊離標識が結合しない固体
   支持体に、遊離標識を結合、（３）高速ゲルろ過、
   （４）有機相への遊離アクリジニウムエステル標識試薬
   の抽出、（５）ろ過、（６）高速イオン交換クロマトグ
   ラフィー、（７）イオン交換ＨＰＬＣ、及び、（８）逆
   相ＨＰＬＣからなる群から選ばれる、請求の範囲第１８
   項に記載のアクリジニウムエステル標識プローブを非標
   識プローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬か
   ら高純度で分離する方法。 ２０．高速な分離手段がエタノール沈殿であり、ＨＰＬ
   Ｃがイオン交換であり、除去及び分離が、２０ミリモル
   ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．４５
   モルＬｉＣｌからなる第１の緩衝液から２０ミリモルＮ
   ａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．７モル
   ＬｉＣｌからなる第２の緩衝液への勾配の使用により達
   成される、請求の範囲第１８または１９項に記載のアク
   リジニウムエステル標識プローブを非標識プローブ及び
   遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度で分離
   する方法。 ２１．高速な分離手段がエタノール沈殿であり、ＨＰＬ
   Ｃが逆相であり、除去及び分離が、０．１ミリモル酢酸
   トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、１０％ＣＨ_３Ｃ
   Ｎからなる第１の緩衝液から０．１ミリモル酢酸トリエ
   チルアンモニウム、ｐＨ７．０、５０％ＣＨ_３ＣＮから
   なる第２の緩衝液への勾配の使用により達成される、請
   求の範囲第１８に記載のアクリジニウムエステル標識プ
   ローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエステ
   ル標識試薬から高純度で分離する方法。 ２２．高純度のアクリジニウムエステルで標識化された
   核酸プローブであって、該標識化核酸プローブが第１の
   コンジュゲート部分を有する核酸プローブを該核酸プロ
   ーブの該第１のコンジュゲート部分と結合可能な第２の
   コンジュゲート部分を有する高濃度のアクリジニウムエ
   ステル標識試薬で溶媒中で標識化し、緩衝液中で該標識
   化プローブをイオン交換、逆相及びハイドロキシアパタ
   イトからなる群より選ばれたＨＰＬＣカラムに結合さ
   せ、該アクリジニウムエステル標識化プローブを未標識
   化プローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬か
   ら分離することにより得られることを特徴とする高純度
   のアクリジニウムエステルで標識化された核酸プロー
   ブ。