JPH11322782A - Labeling of nucleotide probe with acridinium ester and purification thereof - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for labeling a specific nucleic acid probe by binding the nucleic acid probe with a highly concentrated acridinium ester labeling reagent in a solvent, capable of providing a highly purified labeled nucleic acid probe for diagnostic assays. SOLUTION: This method for labeling a nucleic acid probe comprises binding the nucleic acid probe with a highly concentrated acridinium ester labeling reagent in a solvent such as DMSO, CH3 CN or dioxane. Therein, the nucleic acid probe has the first conjugate portion, such as NH2 , capable of being bound to the acridinium ester, and the acridinium ester labeling regent has the second conjugate portion, such as a group of the formula, capable of being bound to the first conjugate portion of the nucleic acid probe. The labeling reagent preferably has a concentration of 0.1-50 mM, and the labeling process is preferably controlled to be at a pH of 7-9.

Description

【発明の詳細な説明】 これは、１９８７年１０月５日に提出された出願番号第
１０５０８０号の一部継続出願である。発明の分野 この発明は、診断用試薬に検出可能な標識を結合させる
方法および組成物に関するものである。さらに詳しく
は、この発明は、診断用ハイブリダイゼーション・アッ
セイで使用される化学発光性アクリジニウムエステルに
よるヌクレオチド・プローブの標識および精製に関する
ものである。発明の背景 先行技術 この２０年間、広範な種類の薬剤が臨床診断および研究
アッセイにおいて標識として使用されてきた。さらに最
近では、特有のポリヌクレオチド配列の存在を高感度で
検出するためのハイブリダイゼーション・アッセイが開
発されている。一般にそれらのアッセイでは、容易に検
出され得る原子または基によりヌクレオチド多量体（プ
ローブ）を標識する。ハイブリダイゼーション条件下、
標的ヌクレオチド配列を含む疑のある試料に標識プロー
ブを暴露すると、標的は前記標識プローブとハイブリッ
ド形成する。試料中の標的配列の存在は、通常ハイブリ
ッド形成および非ハイブリッド形成プローブを分離し、
次いでプローブハイブリッド中の標識の存在を測定する
か、または非ハイブリッド形成プローブ中の標識量を測
定して、ハイブリッド形成した標識プローブの量を測定
することにより、定性的または定量的に測定することが
できる。歴史的には放射性標識が用いられた。しかし、
健康上の危険性および取り扱い上の難点から、後になっ
て非放射性標識が開発された。このような標識には、存
在の測定が直接的に為されるものも間接的に為されるも
のも含まれる。直接標識の例としては、化学発光、蛍光
または分光的測定が可能な標識が含まれる。間接標識の
例としては、ビオチンのような化合物および適当な検出
可能標識とコンジュゲートした蛋白により検出できる様
々な抗原が含まれる。ヌクレオチド多量体プローブに標
識を導入する好ましい一方法は、酵素的または化学的合
成プローブにリンカー−アームを導入することであっ
た。例えば、４−チオ−ＵＴＰ（Ｈ．エシャフプア等、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、７巻、１４８５
頁、１９７９）をＤＮＡフラグメントの３’−末端に結
合し、続いてその求核性スルフヒドリル部分において標
識した。チェンによるＰＣＴ出願（国際出願第ＷＯ８６
／０００７４号、１９８６年１月３日公開）に開示され
ている別の方法は、ピリミジン塩基ヌクレオチドを脱ピ
リミジン化し、生成する糖環を開いて、そこにアミン担
持部分を結合させる技術を示している。さらに、Ｐ．
Ｒ．ランガー等（プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ、７
８巻、６６３３頁、１９８１年）により開示された５−
アリルアミンウリジントリ燐酸類似体の前駆体は、標識
部位を提供するヌクレオチド多量体プローブへの求核性
アミンの取り込みに使用され得る。標識の化学的方法も
提案されたが、これはヌクレオチド多量体中の若干のヌ
クレオチドに標識を結合させるものである。その一方法
としては、核酸プローブのシトシン残基のＣ−４位にお
けるエチレンジアミンによる重亜硫酸触媒アミノ基転移
がある（Ｒ．Ｐ．ビシジ等、ジャーナル・オブ・クリニ
カル・バイオロジー、２３巻、３１１頁、１９８６）。
ヌクレオチド多量体、代表的にはオリゴヌクレオチドの
５’−または３’−末端に１個の標識のみを結合する他
の技術も報告されている。例えば、固相オリゴヌクレオ
チド合成における最終段階としてリンカー−アーム結合
させる末端標識方法が開示されている。このリンカー−
アームは、次に標識結合に使用される。例えば、Ｂ．
Ａ．コノリー、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１
３巻、４４８５頁（１９８５年）、Ｓ．アグラワル等、
ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、１５巻、３１３１
頁（１９８７年）参照。また、標準自動的合成方法中に
おける合成オリゴヌクレオチドの選択された位置での第
１級アミン修飾ヌクレオチドの挿入に使用され得る化合
物が報告されている。このような化合物には、デオキシ
チミジンおよびデオキシアデニン、デオキシグアニンな
どの類似体がある（Ｇ．Ｂ．ドライヤー等、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシーズＵＳＡ、８２巻、９６８頁、１９８５、
Ｊ．Ｌ．ルス、ＰＣＴ出願第ＵＳ８４／００２７９号、
公開番号ＷＯ８４／０３２８５、１９８４年８月３０日
公開）。さらに、ヌクレオチド結合燐酸基のアルキルア
ミン誘導体も報告されており、そのアミノ官能基は続い
て標識され得る（Ｒ．Ｌ．レットシンガーおよびＭ．
Ｅ．ショット、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケ
ミカル・ソサエティー、１０３巻、７３９４頁、１９８
１年、Ｎ．杉本による特開昭６１−４４３５３（１９８
６年３月４日付）、６１−５７５９５（１９８６年３月
２４日付）、６１−４４３５２（１９８６年３月４日
付））。理論的には、これらの化合物は、標識ヌクレオ
チドを配列に沿った幾つかの部位に配置させ得るもので
あるため、多重標識の使用により検出感度が高められ得
る。しかしながら、リンカー−アーム部位には、特に多
重標識が存在するとき、標的配列により形成されたハイ
ブリッドの安定性を減じ得る場合もあるため、リンカー
−アーム位置の選択には注意を要する。上記リンカー−
アームに加えて、非ヌクレオチドに基づくリンカー−ア
ーム試薬を設計したが、これらはアーノルド等による２
つの継続中の特許出願、即ち「ヌクレオチドプローブ用
非ヌクレオチド結合試薬」と題するアメリカ合衆国出願
番号第０９９０５０号（１９８７年９月２１日付）（特
表平２−５０３１４６号）および「オリゴヌクレオチド
末端置換用非ヌクレオチド試薬」と題するアメリカ合衆
国出願番号第１０４３３０号（１９８７年１０月２日
付）（特表平２−５０２２８４号）に記載されている。
これらのリンカー−アーム試薬は、他の先行技術による
試薬の限界を克服するものであり、多様な部位における
リンカー−アームの結合およびヌクレオチド／非ヌクレ
オチドポリマーの構築を可能にする。既知非同位体標識
の中で最も高感度な種類の一つは、免疫診断アッセイで
使用される蛋白質およびホルモンへのアクリジニウムエ
ステルの結合に関する、キャンベル等（イギリス国特許
第２１１２７７９Ｂ号、１９８６年１０月１５日）およ
びリチャードソン等（「標識抗原として使用されるプロ
ゲステロン−アクリジニウムエステルによる、血しょう
プロゲステロンの化学発光免疫測定法」、クリニカル・
ケミストリー、３１巻、１６６４−１６６８頁、１９８
５年）により記載された化学発光性アクリジニウムエス
テルである。ヌクレオチドプローブ多量体へのアクリジ
ニウムエステルの結合は、蛋白質に関して記載された標
識および精製方法を用いても容易には達成されない。ア
クリジニウムエステルによるヌクレオチド多量体プロー
ブの標識は以前に提案されている。しかしながら、それ
らの提案は、標識および精製方法（ヤブサキ等、アメリ
カ合衆国特許第４５９９３０３号）を何等提供するもの
ではないか、または記載された方法の場合、ハイブリダ
イゼーション・アッセイで使用するには標識の範囲が狭
く、標識プローブの精製度合は不充分である（モック
等、１９８６年８月１５日付ＥＰＡ出願第８６３０６３
０５．３号、公開番号第０２１２９５１号）。例えば、
モックおよびセプテックにより記載された方法は、蛋白
質の標識および精製に関する手順（ウィークス等）と類
似した手順を示している。それらの方法は、アミン末端
リンカー−アームを含むオリゴヌクレオチドプローブを
顕著な程度に（≦１０％）標識するには不充分であるこ
とが見出された。さらに、アクリジニウムエステル標識
蛋白質の精製に使用されるゲルろ過方法は、標識および
非標識プローブを分離せず、非コンジュゲート標識の充
分な除去もしない。ハイブリダイゼーション診断アッセ
イで使用する場合、ハイブリダイゼーション反応におい
て非標識プローブは標識プローブと競合するため、顕著
な量の非標識プローブが存在しないこと、また非コンジ
ュゲート標識は、分離支持体に結合し、診断アッセイの
感度を大きく減ずる高い化学発光基底値を生ずるため、
精製試料は１％を越える非コンジュゲート標識を含まな
いことが必要である。要望されているのは、ヌクレオチ
ド多量体の標識手段および標識された多量体を本質的に
純粋な形態で精製する手段である。ここに記載している
発明は、それらの手段を提供するものである。発明の目的 この発明の一目的は、アクリジニウムエステルによりプ
ローブを標識し、標識された前記プローブを高純度に精
製することである。（１）アクリジニウムエステルによ
るヌクレオチドプローブの標識および前記標識プローブ
の精製、および（２）アクリジニウムエステルによる蛋
白質の標識および前記標識蛋白質の精製に関する先行技
術のシステムは、この目的にとって不満足なものである
ことが判った。特に、この先行技術は、低マイクロモル
濃度範囲でのアクリジニウムエステル試薬を用いたヌク
レオチドプローブの標識および通常のゲルろ過技術を用
いた精製を開示している。それらのマイクロモル濃度範
囲は低い程度（１０％またはそれ未満）のヌクレオチド
プローブの標識にのみ有用である。同じく、ゲルろ過を
含む先行技術による分離技術は、アクリジニウムエステ
ル標識プローブへの適用の場合実行不可能である。凝集
した遊離アクリジニウムエステル標識は、アクリジニウ
ムエステル標識プローブとボイドボリューム中において
共溶離することが見出された。さらに、遊離アクリジニ
ウムエステル標識は、プローブと非共有的に結合し、カ
ラム中のアクリジニウムエステル標識プローブと共に移
動した。結局、当業界で既知の方法は、非標識プローブ
からのアクリジニウムエステル標識プローブの分離には
不満足なものであった。従って、この発明の目的には、
高い効率でのアクリジニウムエステルによる核酸プロー
ブの標識方法が含まれる。この発明の別の目的は、未反
応並びに凝集および非共有結合したアクリジニウムエス
テルから前記標識プローブを高純度に分離する方法であ
る。この発明のさらに別の目的は、非標識プローブおよ
び標識プローブの分解生成物から前記標識プローブを分
離する方法である。この発明のさらに別の目的は、大量
の高純度アクリジニウムエステル標識オリゴマーを生産
することにより、診断アッセイに有用な前記標識プロー
ブを製造し得る効果的で迅速で再生可能な方法である。発明の要旨 アクリジニウムエステル、４−（２−スクシンイミジル
オキシカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアク
リジニウム−９−カルボキシレート・フルオロスルホネ
ートは、アミン反応性スクシンイミジル基を含む高度化
学発光性化合物である。この化合物および類似化合物と
第１級アミン含有核酸プローブとの反応により、化学発
光性標識プローブが生成される。また関連反応系におい
ては、チオール含有核酸プローブ並びに他のアミンおよ
びチオール・コンジュゲーション・パートナーもアクリ
ジニウムエステルと反応して化学発光性標識プローブを
生成し得る。この発明は、アクリジニウムエステルによ
る第１級アミン含有プローブの構築、標識および後続の
精製方法であって、第１級アミン１個に対し１個のアク
リジニウムエステルを有するプローブの製法を述べてい
る。また、アクリジニウムエステルによるチオール基含
有プローブの構築、標識および後続の精製に関連したシ
ステムについても記載している。低マイクロモル濃度範
囲のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性エステル標識
試薬を用いてプローブを標識するのは困難である。さら
に、ヌクレオチド・プローブのアクリジニウムエステル
標識は、一旦プローブに結合されると、アクリジニウム
エステルが特に不安定になるという事実があるため面倒
である。この発明は、プローブを含むアミンまたは水硫
基へのアクリジニウムエステルの新規結合方法を開示し
ている。これらの部分、特にアミンは、プローブの陰性
荷電燐酸基と相互作用するため、アクリジニウムエステ
ルにより標識しにくい。この発明によるアクリジニウム
エステルのプローブへの結合方法は、高アクリジニウム
エステル濃度（０．１〜５０ミリモル）の使用を要す
る。これらの高濃度は、全反応容量の２０％〜８０％の
濃度における有機溶媒の使用により達成され得る。ま
た、高いｐＨを用いることにより、求核性アミノまたは
チオール・コンジュゲーション・パートナーの有効濃度
を高めることができる。プローブの好ましい標識方法
は、有機溶媒による１−１０ミリモル濃度のアクリジニ
ウムエステルの使用である。そのような標識方法は、溶
液中、またはアクリジニウムエステルまたはプローブの
いずれか一方を溶液に懸濁させた状態で実施され得る。
すなわち構築された標識プローブは、この明細書に開示
されている本発明方法を用いて精製され得る。非標識プ
ローブおよび遊離アクリジニウムエステルからのアクリ
ジニウムエステル標識プローブの精製または分離は、ま
ず遊離アクリジニウムエステル標識の大部分をプローブ
から除去し、次いで実質的に残り全部の遊離標識をプロ
ーブから除去し、最後に標識プローブ、非標識プローブ
および標識プローブ分解生成物を分離することにより行
なわれる。これらの段階は連続的または同時に行なわれ
得る。プローブからの遊離標識の大部分の好ましい除去
方法は、核酸沈澱、イオン交換ＨＰＬＣおよび逆相ＨＰ
ＬＣを含む急速な分離技術であるが、これらに限定され
る訳ではない。残存する痕跡量のアクリジニウムエステ
ルをプローブから除去し、標識プローブと非標識プロー
ブを同時に分離する好ましい方法には、イオン交換、逆
相または水酸化リン灰石ＨＰＬＣの特異的適用が含まれ
る。この方法により、核酸プローブは、アクリジニウム
エステルにより標識され高純度に精製され得る。次に、
これらの標識および精製プローブは、診断アッセイ領域
における少量の特異標的物質の検出に使用され得る。ま
た、アクリジニウムエステル標識プローブの検出に使用
される試薬およびアッセイ・システムおよびキットもこ
の発明に含まれる。図面の簡単な記載 第１図は、アクリジニウムエステル反応式を図示したも
のである。第２図は、アクリジニウムエステルにより内
部標識されたプローブを図示したものである。第３図
は、アクリジニウムエステルによるプローブ標識におけ
るコンジュゲーション・パートナーおよび反応生成物お
よび条件を要約した表である第４図は、アクリジニウム
エステル標識プローブのイオン交換（４Ａ）および逆相
（４Ｂ）ＨＰＬＣプロフィールを図示したものである。
第５図は、アクリジニウムエステル標識プローブの検出
を図示したものである。好ましい態様の詳細な記載 定義 この明細書（請求の範囲を含む）において使用されてい
る下記の語の定義を行う。 アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシンイミ
ジルエステル：４価窒素中心を有し、９位が誘導体化さ
れてフェニルエステル部分が形成されたアクリジニンの
誘導体、具体的には、４−（２−スクシンイミジルオキ
シカルボニルエチル）フェニル−１０−メチルアクリジ
ニウム−９−カルボキシレート・フルオロスルホネー
ト。アクリジニウムエステルメトキシイミデート アクリジニウムエステル： 下記の一般的タイプの部分 Ｒ_１＝アルキル、アルケニル、アリール、置換アルキ
ル、置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリ
ールオキシであるか、またはＸ＝ハロゲンの場合は存在
しない。Ｒ_２＝Ｈ、アルキル、アルケニル、アリール、
置換アルキル、置換アルケニル、置換アリール、アルコ
キシ、アリールオキシ（Ｘ＝Ｎの場合のみあるとすれ
ば）。Ｒ_３＝Ｈ、アミノ、ヒドロキシ、チオール、ハロ
ゲン、ニトロ、アミノ、アミド、アセチル、アルキル、
アルケニル、アリール、置換アセチル、置換アルキル、
置換アルケニル、置換アリール、アルコキシ、アリール
オキシ。Ｒ_４＝アルキル、アルケニル、アリール、置換
アルキル、置換アルケニル、置換アリール。Ｘ＝Ｏ、
Ｎ、Ｓ、ハロゲン、置換燐、置換硫黄、置換ほう素また
は置換ひ素。Ｙ＝Ｏ、ＳまたはＮＨ。Ｒ_１および／また
はＲ_２および／またはＲ_３および／またはＲ_４は化学的
コンジュゲーションを可能にする反応性部位を有する。 ヌクレオチド：燐酸基、５炭素糖および窒素含有塩基か
ら成る核酸のサブユニット。ＲＮＡにおいて、５炭素糖
はリボースである。ＤＮＡにおいて、それは２−デオキ
シリボースである。この語はまたそれらのサブユニット
の類似体を包含する。 ヌクレオチド多量体：ホスホジエステル結合により結合
されたヌクレオチドまたはその類似体の鎖。 オリゴヌクレオチド：一般に約１０〜約１００長のヌク
レオチドを有するが、長さが１００を越えるヌクレオチ
ドの場合もあり得るヌクレオチド多量体。それらは通
常、ヌクレオチドモノマーから合成されると考えられる
が、酵素的手段によっても生成され得る。 デオキシリボリゴヌクレオチド：デオキシリボヌクレオ
チド・モノマーから成るオリゴヌクレオチド。 ポリヌクレオチド：一般に長さ約１００ヌクレオチドま
たはそれ以上のヌクレオチド多量体。これらは、通常生
物に由来するか、または酵素的手段により得られる。 ヌクレオチド多量体プローブ：第２ヌクレオチド多量
体、通常ポリヌクレオチド内に含まれる標的ヌクレオチ
ド配列と相補的なヌクレオチド配列を有するヌクレオチ
ド多量体。通常、標的配列の対応する塩基に完全に相補
的であるプローブが選択される。しかし、プローブ中の
１個またはそれ以上のヌクレオチドが標的配列の対応す
る塩基に相補的でなくても適切またはさらに望ましい場
合もあり得る。一般的には、プローブは標識される。全
体を通じて簡略表示の「プローブ」は、この明細書で定
義されているヌクレオチド多量体プローブを指すものと
する。 ヌクレオチド／非ヌクレオチドポリマー：ヌクレオチド
および非ヌクレオチドモノマー単位から成るポリマー。
プローブとして使用される場合、一般的には標識され
る。 ハイブリッド：相補的塩基間のワトソン−クリック塩基
対形成により２つのヌクレオチド多量体間に形成された
複合体。 懸濁液： 液体の混合物または液体内における固体の非
沈澱粒子の混合物。粒子（含有）液体、粒子は分散相で
あり、懸濁媒質は連続相である。アクリジニウムエステ
ル化学作用は、ウィークス等、「免疫検定における高比
活性標識としてのアクリジニウムエステル」、クリニカ
ル・ケミストリー、２９１８、１４７４−１４７９頁
（１９８３年）に概説されている。簡単に述べると、ア
クリジニウムエステルは、それらの対応する塩基と平衡
した状態で存在する。塩基形成は高ｐＨが好ましい。４
価窒素類の形成は低ｐＨが好ましい。化学発光反応は、
電子的に励起したＮ−メチルアクリドンの形成をもたら
す、アクリジニウム類のヒドロキシペルオキシド・イオ
ンによる攻撃を伴う。この反応は、添付図面の第１図に
図示されている。 １．アクリジニウムエステルのＮ−ヒドロキシスクシン
イミジル−エステルによる標識。 ａ．プローブの選択 好ましい態様では、標識されるべきプローブは第１級ア
ミンを含む。５’−末端が修飾（５’−アミノエチルホ
スフェート、「末端アミンリンカー−アーム」）、内部
修飾［非ヌクレオチドに基づく「内部アミンリンカー−
アーム」、１型（特許出願第０９９０５０号のＬ１参
照）、２型（特許出願第０９９０５０号のＬ３参照）、
Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７またはＬ８、塩基置換ま
たは塩基間挿入として使用されている］またはアミン修
飾塩基内部付加［アミノ（１２）ｄＵＴＰ、カルビオケ
ム、サンディエゴ、カリフォルニア］またはプローブの
３’−末端が修飾（５−アリルアミンＵＴＰ）されたア
ミンリンカー−アームにより、この方法は有効に実践さ
れた。さらに、この発明は、例えば燐酸バックボーンお
よび糖残基の標識に使用され得る。この発明により、こ
の明細書の先行技術の部分で述べたアミン・リンカー・
アーム・プローブ、チオールホスフェート含有プローブ
およびチオールウリジン含有プローブを含む（ただし、
これらに限定されない）、先行技術において既知の他の
修飾ヌクレオチド・プローブの使用も考えられる。添付
図面の第２図は、アクリジニウムエステルにより内部標
識されたプローブを示す。 ｂ．プローブの標識 １．ｐＨの選択 これはある程度アミン・リンカー・アームにより異なる
が、この化学反応に最適のｐＨは約８である。 ２．緩衝液の選択 最適ｐＨにおいて良好な緩衝液であることを要する。Ｈ
ＥＰＥＳ、燐酸、重炭酸の緩衝液が選択され得るが、こ
れらに限定される訳ではない。 ３．有機溶媒の選択 最終反応カクテルにおいて２０％〜８０％の範囲で使用
されるべきである。選択範囲には、ＤＭＳＯ、ＣＨ_２Ｃ
Ｎ、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、アセトン、メ
タノールが含まれるが、これらに限定される訳ではな
い。選択の必要条件は、プローブおよびアクリジニウム
エステルは選択された溶媒に高い可溶性を示さなけれぱ
ならないこと、並びにアクリジニウムエステルおよびプ
ローブは溶媒により過度に減成されないことである。 ４．アクリジニウムエステル濃度 選ばれた化学条件により異なるが、０．１ミリモル〜５
０ミリモルが許容され得る範囲である。Ｎ−ヒドロキシ
スクシンイミジル・エステル・コンジュゲーション・パ
ートナーの最適範囲は、使用されるアミン・、リンカー
−アーム化学作用により異なるが、約１−１０ｍＭのア
クリジニウムエステルである。反応の経過中における多
重付加により、最終的な標識程度は高められるが、精製
はさらに困難なものとなる。 ５．温度 １５−４０℃が最適である。 ６．反応の持続性 これは、リンカーアーム化学作用および他の反応パラメ
ーターに左右されるため、タイムーポイント・アリコー
ト分析により測定すべきである。この分析では、標識の
程度対アクリジニウムエステル−プローブ分解生成物の
出現を考察する。 ７．Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−アクリジニウム
エステルの未反応親電子性コンジュゲーション・パート
ナーのクェンチング。同じ反応条件下でコンジュゲーシ
ョン・パートナー求核剤の簡単な類似体を加えるべきで
ある。第３図は、アミン、チオールを含む核酸プローブ
およびそれらの各コンジュゲーション・パートナーに対
するこの発明の反応生成物および条件を要約したもので
ある。 ｃ．標識されたプローブの精製。 ２段階方法が一般的にはさらに効果的である。まず、迅
速で簡単な方法を用いて遊離標識の大部分を除去すべき
である。これには、例えば沈澱、水酸化リン灰石、バイ
オービーズＳＭ−２、セプーパックまたは遊離標識は結
合するが標識プローブは結合しない（またはその逆）他
の固体支持体への遊離標識の結合、高速ゲルろ過、有機
相への遊離標識の抽出、ろ過（例、セントリコン）、高
速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを含む）ま
たは高速逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを含む）が
あるが、これらに限定される訳ではない。次に、プロー
ブに非共有結合しているアクリジニウムエステルを含む
残りの遊離標識および非標識プローブから標識プローブ
を非常に高い純度まで分離しなければならない。この場
合の選択はかなり制限されている。最も速く最も有効な
方法は、イオン交換、逆相および水酸化リン灰石による
ＨＰＬＣであるが、これらに限定される訳ではない。Ｈ
ＰＬＣほどではないにせよ適度に機能はするが、さらに
冗長で時間のかかる別の方法は、有機溶媒の存在下にお
けるゲルろ過（代表的にはホルムアミド中バイオゲルＰ
−１００またはＰ−２００を使用）である。また、精製
は、ＨＰＬＣを用い、精製すべき量が充分少量である場
合には有機溶媒中でのゲルろ過を用いる１段階方法で達
成され得る。この１段階方法は、一般に上記２段階方法
ほど有効ではない。 実施例 実施例１ エタノール沈澱、次いでイオン交換ＨＰＬＣによる様々
なアミン・リンカー・アーム・プローブの標識および精
製。 Ａ．アミン・リンカー・アーム・プローブの合成および
精製。 様々なアミン・リンカー・アーム化学による様々なデオ
キシオリゴヌクレオチド・プローブに対する本明細書記
載の方法および手順の有効な適用性を立証するために、
次のアミン・リンカー・アーム・プローブを製造した。 １．５’−アミン・リンカー−アーム・プローブ ５’−アミン・リンカー・アームをプローブに結合する
ために、２つの方法が採られた。一方は、アプライド・
バイオシステムズ、インコーポレイテッドにより市販さ
れている試薬「アミノリンク」の使用による方法であっ
た。他方は下記化合物の使用による方法であった。 この化合物については、末端アミン・リンカー・アーム
試薬と称する。この試薬を次の要領で合成した。６−ア
ミノヘキサノールを、無水酢酸エチル中Ｓ−エチルトリ
フルオロチオアセテートと反応させた。反応生成物を石
油エーテルにより沈澱させ、１０％ピリジン（水中）混
合物で１０分間処理することにより、形成された可能性
のあるＯ−トリフルオロアセチルを加水分解し、ガム形
態で濃縮乾固した。次いで、この化合物を文献内の標準
プロトコルに従って（ヌクレイック・アシッズ・リサー
チ、１２（１１）、４５３９（１９８４年）参照）ホス
フィチル化することにより、所望の化合物、すなわち末
端アミン・リンカー・アーム試薬（１）が生成された。
５’−アミン・リンカー・アーム（アミノリンクまたは
末端アミン・リンカー・アーム）を含むプローブについ
ては、次の要領で合成した。アプライド・バイオシステ
ムズ、インコーポレイテッドのモデル３８０Ａ ＤＮＡ
シンセサイザーを用いて、所望のヌクレオチド配列のプ
ローブを、３’−末端から５’−末端へプローブを構築
する標準ホスファーアミダイト化学作用により製造し
た。所望の配列が完成後、別のホスファーアミダイト・
ヌクレオシドの結合に関する場合と同じ方法で末端アミ
ン・リンカー・アーム試薬を使用するか、または製造会
社が記載した手順を用いてアミノリンクを使用すること
により、アミン・リンカー・アームを自動的にプローブ
の５’−ヒドロキシル基に結合させた。標準プロトコル
を用いて、次にこのプローブを固体支持体から開裂し、
ＮＨ_４ＯＨを用いて脱保護し、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動、次いでセファデックスＧ−２５クロマトグラ
フィーにより精製した。この手順を用いて次のプローブ
を合成および精製した。 を表す］および２．内部アミノ・リンカー・アーム・プローブ。 アミン・リンカー・アームをプローブの内部に取り込ま
せるため、アーノルドらによるアメリカ合衆国特許出願
第０９９０５０号（１９８７年９月２１日提出、名称
「ヌクレオチド・プローブ用非ヌクレオチド結合試
薬」）に記載されている内部アミン・リンカー・アーム
試薬、１型または２型を用いた。同様に、標準ホスファ
ーアミダイト化学を用いてプローブを合成し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動およびセファデックスＧ−２５
クロマトグラフィーを用いて精製した。この方法により
次のプローブを合成した。 １．）エシェリヒア・コリに由来する１６Ｓサブユニッ
トのｒＲＮＡに相補的な３０量体。配列の１８位のアデ
ニン残基が内部アミン・リンカー・アーム１型により置
換されている。 また、チミジン、シチジンまたはグアノシン残基を内部
リンカー・アーム１型により置換する形でプローブを合
成した。 ２．）クラミジア・トラコマティスに由来する１６Ｓサ
ブユニットのｒＲＮＡに相補的な３３量体。配列の２１
位のアデニン残基を内部アミン・リンカー・アーム１型
により置換 または残基２１および２２の間にこれを挿入している。 ３．）クラミジア・トラコマティスに由来する２３Ｓサ
ブユニットのｒＲＮＡに相補的な２４量体。残基１５お
よび１６間に内部リンカー・アームＬ７型が挿入されて
いる。 Ｂ．アクリジニウムエステルのＮＨＳエステルによるア
ミン・リンカー・アーム・プローブの標識および後続の
精製。ＮＨＳエステルまたはアクリジニウムエステルの
２５ｍＭストック溶液を蒸留ＤＭＳＯ中で調製した。所
望量のプローブ（上記Ａ項において標識された種々のプ
ローブのリスト参照）を１．５ｍｌ円錐形ポリプロピレ
ン管において濃縮乾固した。下記成分を順に加えること
により、下記カクテルを構築した。 ３マイクロリットルのＨ_２Ｏ １マイクロリットルの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０） ４マイクロリットルのＤＭＳＯ（蒸留） ２マイクロリットルの２５ｍＭアクリジニウムエステル
のＮＨＳエステル（蒸留ＤＭＳＯ中）。 混合物を渦状に回し、２秒間小型遠心分離器中で回転さ
せ（管の底に内容物を集めるため）、３７℃で２０分間
インキュベーションした。次いで、下記成分を列挙した
順に反応カクテルに加えた。 ３．０マイクロリットルの２５ｍＭアクリジニウムエス
テルのＮ ＨＳエステル（蒸留ＤＭＳＯ中） １．５マイクロリットルのＨ_２Ｏ ０．５マイクロリットルの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．
０） 再びカクテルを渦状に回し、回転させ、３７℃でさらに
２０分間インキュベーションした。０．１Ｍ ＨＥＰＥ
Ｓ（ｐＨ８．０）、５０％ＤＭＳＯ中０．１２５Ｍ リ
ジン５マイクロリットルを加えることにより５倍過剰の
リジンを用いて未反応標識をクェンチングし、室温で５
分間インキュベーションした。次いで、次の方法を用い
てアクリジニウムエステル標識プローブを精製した。未
反応標識の大部分を除去するため、プローブを次の要領
でエタノール沈澱させた。２０マイクロリットルのクェ
ンチングされた反応混合物に、３０マイクロリットルの
３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、２４５マイクロリッ
トルのＨ_２Ｏおよび５マイクロリットルのグリコーゲン
を担体として加えた（グリコーゲンを前処理することに
より、ヌクレアーゼ活性を全て除去した）。試料を短時
間渦状に回し、６４０マイクロリットルの無水ＥｔＯＨ
を加えた。試料を短時間渦状に回し、氷上で５−１０分
間インキュベーションし、次いで５分間小型遠心分離器
中１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を注意深く除
去し、沈澱物を２０マイクロリットルの０．１ＭＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ５．０）、０．１％ＳＤＳに再溶解した。次
いで、下記の２つのＨＰＬＣシステムの一方法を用いる
ことにより、残存遊離標識、非標識プローブおよびＡＥ
標識プローブの分解生成物からＡＥ標識プローブを分離
した。イオン交換ＨＰＬＣ ＩＢＭ９５３３ＨＰＬＣシステムに搭載されたヌクレオ
ーゲン−ＤＥＡＥ６０−７イオン交換ＨＰＬＣカラムに
２０マイクロリットルの再溶解沈澱物を注入した。ＨＰ
ＬＣ用水、アセトニトリル（ＣＨ_３ＣＮ）および酢酸ナ
トリウム（ＮａＯＡｃ）（フィッシャー・サイエンティ
フイックから）並びに試薬用氷酢酸（ＨＯＡＣ）および
ＬｉＣｌにより全ての緩衝液を調製した。使用前に全緩
衝液を０．４５マイクロモル孔サイズのナイロン−６６
フィルターによりろ過した。０．５ｍｌ／分の流速で２
５分間５５％の緩衝液Ａ、４５％の緩衝液Ｂから３０％
の緩衝液Ａ、７０％の緩衝液Ｂへの一次勾配により溶出
を行った。流出中、２６０ｎｍでの吸光度をモニターし
た。視野の範囲は１光学密度単位に等しかった。チャー
ト速度は２０ｃｍ／時であった。０．５ｍｌのフラクシ
ョンを１．５ｍｌのスクリュー・キャップ式エッペンド
ルフ管に集めた。結果を第４Ａ図に示す（この場合、プ
ローブは、上記Ａ項記載の末端アミン・リンカー・アー
ム含有２６量体であった。他のプローブは全て酷似した
プロフィールを示した。）。流出直後、５マイクロリッ
トルの１０％ＳＤＳを各管に加え、次いで各管を渦状に
回した（これは、アクリジニウムエステル標識プローブ
が管壁に付着していないことを確実にするために行なっ
た）。０．５マイクロリットルのアリコートをフラクシ
ョン２１−４２から除去し、１２×７５ｍｍ管中２００
マイクロリットルの水に加えた（各アリコートに対して
分離ピペット・チップを用いることにより、持ち越し問
題を回避した）。次いで、ベルトールド・クリニルマッ
トにおいて、２００マイクロリットルの０．２５Ｎ Ｈ
ＮＯ_３、０．１％Ｈ_２Ｏ_２、１秒遅れで２００マイクロ
リットルの１Ｎ ＮａＯＨを自動的に注入し、続いて１
０秒間化学発光アウトプットを読み取ることにより、各
アリコートの化学発光度を測定した。次に、フラクショ
ン６４−６８を次の要領でＥｔＯＨ沈澱させた。各々５
マイクロリットルのグリコーゲンに加え、渦状に回し、
１ｍｌのＥｔＯＨを加え、渦状に回し、氷上で５−１０
分間インキュベーションし、小型遠心分離器中１５００
０ｒｐｍで５分間遠心分離した。各上清を注意深く除去
し、沈澱物を２０マイクロリットルの０．１Ｍ ＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ５、０．１％ＳＤＳに再溶解し、フラクショ
ンをプールした。逆相ＨＰＬＣ また、アクリジニウムエステル標識プローブを概ね上記
手順に従い精製した。例外として、バイダックＣ４逆相
カラムを使用し、緩衝液Ａは０．１Ｍ酢酸トリエチルア
ンモニウム（アプライド・バイオシステムズ、インコー
ポレイテッド、フォスター・シティー、カリフォルニ
ア）であり、緩衝液ＢはＣＨ_３ＣＮであった。流速１ｍ
ｌ／分で２５分間１０−１５％溶媒Ｂからの一次勾配を
用いて標識プローブを溶離した。吸光度を２６０ｎｍで
モニターした。０．５ｍｌのフラクションを集めた。次
いで、主たる化学発光ピークを確認し、上記の要領で後
処理した（ただし、ＥｔＯＨ沈澱前に４５マイクロリッ
トルの３Ｍ ＮａＯＡｃを各フラクションに加えた）。
添付図面の第４Ｂ図は、上記Ａ項記載の２４量体プロー
ブ（内部リンカー・アーム、Ｌ７型）の溶離プロフィー
ルを示す。他のプローブも全て非常に似たプローブを示
した。これらの手順の両方を用いることにより、この明
細書に記載されている全てのリンカー・アーム化学作用
について本質的に同等の結果で高純度アクリジニウムエ
ステル標識プローブが得られた。これらのプローブの比
活性は、プローブ１ピコモル当たり一般的に５−１０×
１０’化学発光カウント（ベルトールド・クリニルマッ
ト）であった。添付図面の第５図は、一旦精製されたそ
れらのプローブが検出され得る感度を示す。 Ｃ．アクリジニウムエステルのメトキシイミデート誘導
体によるアミン・リンカー・アームプローブの標識およ
び後続の精製。 この手順は概ね上記Ｂ項記載の手順に従い行ったが、異
なる点は次の通りであった。乾燥プローブを５０マイク
ロリットルの０．５モルＮａＣＯ_３、ｐＨ９および２５
マイクロリットルのジメチルホルムアミドに再溶解し
た。次に、０．２ｍｇのメトキシイミンアクリジニウム
エステル（ＭＩ−ＡＥ）を加え、混合物を渦状に回し、
室温で３０分間反応させた。さらに０．２ｍｇのＭＩ−
ＡＥを加え、室温でさらに３０分間反応を続行した。未
反応標識を０．５Ｍ ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ９中５０ｍＭ
リジン１００マイクロリットルによりクェンチングした
（室温で１０分間インキュベーション）。次いでアクリ
ジニウムエステル標識プローブを上記Ａ項の記載に従い
エタノール沈澱させたが、ただし、４０マイクロリット
ルの３Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）、１０５マイクロ
リットルのＨ_２Ｏおよび７５０マイクロリットルの無水
ＥｔＯＨを使用した。次いで、Ｂ項の記載に従いイオン
交換ＨＰＬＣを用いてプローブをさらに精製した。 実施例２ アクリジニウムエステル標識プローブを用いた臨床環境
における標的ポリヌクレオチド配列の希釈系列の検出。
下記手順に従い、アクリジニウムエステルにより内部標
識したプローブ（３３量体、内部リンカー−アーム、１
型、アデノシン置換、実施例１参照）を、その標的ｒＲ
ＮＡ（この場合、クラミジア・トラコマティス）とハイ
ブリッド形成させた。ハイブリダイゼーション混合物 １６マイクロリットルの咽喉のスワブ（綿棒で採取した
試料）、３％ラウリル硫酸リチウム、３０ｍＭ燐酸緩衝
液（ＰＢ）ｐＨ６．８、１ミリモルＥＤＴＡ、１ミリモ
ルＥＧＴＡ中。 ２マイクロリットルの４．８モルＰＢ、ｐＨ４．７ １マイクロリットルのｒＲＮＡ（１０−^３、１０−^２、
１０−^１または０．３３マイクログラム） １マイクロリットルのプローブ（０．３３ピコモル） 対照混合物は、ｒＲＮＡの代わりに水を含むこと以外、
ハイブリダイゼーション混合物と同じであった。混合物
を６０℃で６０分間インキュベーションした。次いで、
次の要領で水酸化リン灰石（ＨＡＰ）を用いて非ハイブ
リッド形成プローブからハイブリッドを分離した。各ハ
イブリッドおよび対照混合物に、１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８（２％ＨＡＰ含有）
を加えた。生成した混合物を各々５秒間渦状に回し、６
０℃で５分間インキュベーションし、２０秒間渦状に回
し、次いで小型遠心分離器中１５０００ｒｐｍで３０秒
間遠心分離した。上清を除去し、１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８をＨＡＰ沈澱物に加
え、混合物を１０秒間渦状に回し、次いで、小型遠心分
離器中１５０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。上清
を除去し、この洗浄処理を正確に同じやり方でもう２回
反復した。残りのＨＡＰ沈澱物を１５０マイクロリット
ルの０．１４モルＰＢ、ｐＨ６．８に再懸濁し、実施例
１の記載と全く同様に化学発光度を直接読み取った。 結果： 結果はデュプリケイト値の平均を表す。シグナルは数百
の相対光単位（ｒｌｕ’ｓ）として与えられた。対照シ
グナルは、約０．１％のインプットｒｌｕを表す。Ｓ：
Ｂは、シグナル対基底値の比、すなわち特定ｒＲＮＡ濃
度での化学発光度を対照の化学発光度で除した値であ
る。これらのデータは、この明細書の記載に従いアクリ
ジニウムエステル標識および精製されたプローブを用い
ることにより、標的ポリヌクレオチド配列を高感度で特
異的に検出することができることを立証している。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION This is the application number no. 5 filed on October 5, 1987.
No. 105080 is a continuation-in-part application.Field of the invention The present invention attaches a detectable label to a diagnostic reagent.
Methods and compositions. Learn more
The present invention provides a diagnostic hybridization
For chemiluminescent acridinium esters used in Say
Labeling and purification of nucleotide probes by
Things.Background of the Invention Prior art Over the past 20 years, a wide variety of drugs have been clinically diagnosed and researched
It has been used as a label in assays. Even more
Recently, the presence of unique polynucleotide sequences has been detected with high sensitivity.
Hybridization assays to detect
Has been issued. Generally, these assays are easily detected.
Depending on the atoms or groups that can be released, nucleotide multimers (pro
Label). Under hybridization conditions,
Label probes with samples suspected of containing the target nucleotide sequence.
When the probe is exposed, the target hybridizes with the labeled probe.
Form. The presence of the target sequence in the sample is usually
Separating probe-forming and non-hybridizing probes,
Then measure the presence of the label in the probe hybrid
Or the amount of label in unhybridized probe
And measure the amount of hybridized labeled probe
Can be measured qualitatively or quantitatively.
it can. Historically, radioactive labels have been used. But,
Due to health hazards and handling difficulties,
Non-radioactive labels have been developed. Such signs include
Where the measurement is made directly or indirectly
Is also included. Examples of direct labels include chemiluminescence, fluorescence
Alternatively, a label capable of spectroscopic measurement is included. Indirect sign
Examples include compounds such as biotin and appropriate detection
Detectable with a protein conjugated to a possible label
Various antigens are included. Labels on nucleotide multimer probes
One preferred method of introducing knowledge is to use enzymatic or chemical synthesis.
The introduction of a linker-arm into the synthetic probe.
Was. For example, 4-thio-UTP (H. Eshapua and the like,
Nucleic Acids Research, Vol. 7, 1485
1979) at the 3'-end of the DNA fragment.
And subsequently in the nucleophilic sulfhydryl moiety
I knew. PCT Application by Chen (International Application No. WO86
/ 00074, published on January 3, 1986).
Another method is to remove pyrimidine base nucleotides.
The sugar ring that is formed by limidination is opened, and the amine bearing
3 shows a technique for joining holding parts. Further, P.I.
R. Langer, etc. (Proceedings of the Pear
Jonal Academy of Sciences USA, 7
8, 6633, 1981).
The precursor of the allylamine uridine triphosphate analog is labeled
Nucleophilicity to nucleotide multimer probes that provide sites
Can be used for amine uptake. The chemical method of labeling
It has been proposed that this may result in some nucleotides in the nucleotide multimer.
A label is bound to a nucleotide. One way
May be located at the C-4 position of the cytosine residue of the nucleic acid probe.
Bisulfite catalyzed transamination with ethylenediamine in aqueous solution
(RP Visisi et al., Journal of Clini
Cal Biology, 23, 311 (1986).
Nucleotide multimers, typically of oligonucleotides
Other than attaching only one label to the 5'- or 3'-end
Technology has also been reported. For example, solid-phase oligonucleotides
Linker-arm linkage as the last step in tide synthesis
End labeling methods are disclosed. This linker
The arm is then used for label attachment. For example, B.
A. Connolly, Nucleic Acids Research, 1
3, 4485 (1985); Agrawal, etc.
Nucleic Acids Research, Volume 15, 3131
See (1987). Also, during the standard automatic synthesis method
Of a synthetic oligonucleotide at a selected position in
Compounds that can be used for insertion of primary amine-modified nucleotides
Things have been reported. Such compounds include deoxy
Thymidine and deoxyadenine, deoxyguanine
Which analogs are available (Procide, GB Dryer, etc.)
Things of the National Academy of
Sciences USA, 82, 968, 1985,
J. L. Lus, PCT Application No. US84 / 00279,
Publication number WO84 / 03285, August 30, 1984
Release). In addition, the alkyl group of the nucleotide-linked phosphate group
Mine derivatives have also been reported, the amino function of which
(RL Letsinger and M.L.
E. FIG. Shot, Journal of the American K
Mikar Society, 103, 7394, 198
One year, N. JP-A-61-44353 by Sugimoto (198)
March 4, 2006), 61-57595 (March 1986)
24th), 61-44352 (March 4, 1986)
Attached)). Theoretically, these compounds are labeled nucleosides
Can be placed in several places along the sequence
Therefore, the use of multiple labels can increase detection sensitivity.
You. However, linker-arm sites are particularly numerous.
When a heavy label is present, the high formed by the target sequence
The linker may reduce the stability of the bridging
-Care must be taken in selecting the arm position. The above linker
In addition to arms, non-nucleotide based linker-
Were designed by Arnold et al.
Two pending patent applications, namely "for nucleotide probes"
United States application entitled "Non-Nucleotide Binding Reagents"
No. 099050 (September 21, 1987)
No. 2-503146) and “oligonucleotides”
United States entitled "Non-Nucleotide Reagents for Terminal Substitution"
Country Application No. 104330 (October 2, 1987
Attached) (Japanese Translation of PCT International Publication No. 2-502284).
These linker-arm reagents can be used according to other prior art.
Overcome the limitations of reagents,
Linker-arm binding and nucleotides / non-nuclei
Enables construction of otide polymers. Known non-isotopic labels
One of the most sensitive types of
Acridinium to proteins and hormones used
Campbell et al. (British patent on stealing)
No. 21112779B, Oct. 15, 1986) and
And Richardson et al. ("Professors used as labeled antigens"
Plasma by gesterone-acridinium ester
Progesterone Chemiluminescence Immunoassay ", Clinical
Chemistry, vol. 31, pp. 1664-1668, 198
5 years).
Tell. Acrizi to nucleotide probe multimers
The bond of the sodium ester is the label described for the protein.
It is not easily achieved using knowledge and purification methods. A
Nucleotide multimer probe with clidinium ester
Bulb marking has been previously proposed. However, it
Proposed a labeling and purification method (Abesaki et al.
US Patent No. 4599303)
If not, or if described, hybrida
Narrow label range for use in issay assays
And the degree of purification of the labeled probe is insufficient (Mock
Et al., EPA Application No. 863063, filed August 15, 1986.
No. 05.3, Publication No. 0212951). For example,
The method described by Mock and Septech is a protein
Quality labeling and purification procedures (Weeks, etc.) and similar
A similar procedure is shown. These methods use amine-terminated
Oligonucleotide probes containing a linker-arm
Insufficient to label to a significant degree (≦ 10%)
Was found. In addition, acridinium ester label
Gel filtration methods used for protein purification are labeled and
Unseparated unconjugated probe without separating unlabeled probe
We do not even remove it. Hybridization diagnostic assay
When used in a
Unlabeled probe competes with the labeled probe,
The absence of large amounts of unlabeled probe and
The conjugate label binds to the separation support and is used in diagnostic assays.
To produce a high chemiluminescence base value that greatly reduces the sensitivity,
Purified samples contain no more than 1% unconjugated label.
Is necessary. What is requested is nucleotchi
The means for labeling the multimer and the labeled multimer
It is a means to purify in pure form. Described here
The invention provides those means.Purpose of the invention One object of this invention is to provide an acridinium ester
Label the lobe and purify the labeled probe with high purity.
It is to make. (1) Acridinium ester
Labeling of nucleotide probe and labeled probe
Purification and (2) Acridinium ester
Prior art on white matter labeling and purification of the labeled protein
The art system is unsatisfactory for this purpose
It turns out. In particular, this prior art has low micromolar
Nuclide using acridinium ester reagent in concentration range
Uses leotide probe labeling and conventional gel filtration techniques
Disclosed purifications. Their micromolar range
Boxes are low degree (10% or less) nucleotides
Only useful for labeling probes. Similarly, gel filtration
Prior art separation technologies, including Acridinium
It is not feasible in the case of an application to a probe labeled with a probe. Aggregation
Free acridinium ester label
In a void volume with a muster labeled probe
It was found to co-elute. In addition, free acrizini
Umester labels bind non-covalently to the probe and
Transfer with the acridinium ester labeled probe in the ram
Moved. Eventually, a method known in the art is an unlabeled probe
Separation of Acridinium Ester Labeled Probes from
It was unsatisfactory. Therefore, for the purpose of this invention,
Highly efficient nucleic acid probe with acridinium ester
Labeling methods are included. Another object of the present invention is to
Coagulated and non-covalently bound acridinium S
A method of separating the labeled probe from the
You. Yet another object of the invention is to provide an unlabeled probe and
The labeled probe from the degradation products of the labeled probe
It is a way to release. Yet another object of this invention is
Of high-purity acridinium ester-labeled oligomers
The labeled probe useful in diagnostic assays.
It is an effective, quick and reproducible method by which the steel can be manufactured.Summary of the Invention Acridinium ester, 4- (2-succinimidyl
Oxycarbonylethyl) phenyl-10-methylac
Ridinium-9-carboxylate fluorosulfone
The advanced grade containing amine-reactive succinimidyl groups
It is a chemiluminescent compound. This and similar compounds
Chemical reaction by primary amine-containing nucleic acid probe
A light-labeled probe is generated. Also related reaction system smell
Thiol-containing nucleic acid probes and other amines and
And Thiol Conjugation Partner
Reacts with a dinium ester to form a chemiluminescent labeled probe.
Can be generated. The present invention relates to an acridinium ester.
Construction of primary amine containing probes, labeling and subsequent
A purification method, wherein one primary amine is reacted with one
Describes how to make probes with lydinium esters.
You. In addition, the thiol group containing by acridinium ester
Probes associated with probe construction, labeling and subsequent purification.
The stem is also described. Low micromolar range
N-hydroxysuccinimidyl active ester label in box
It is difficult to label a probe with a reagent. Further
Acridinium ester of nucleotide probe
The label, once attached to the probe, is acridinium
Troublesome due to the fact that esters are particularly unstable
It is. The present invention relates to an amine or hydroxyl containing probe.
Discloses a novel method of attaching an acridinium ester to a group
ing. These moieties, especially amines,
Acridinium ester is used to interact with charged phosphate groups.
Labeling is difficult. Acridinium according to the invention
The method of coupling the ester to the probe is high acridinium
Requires the use of ester concentrations (0.1-50 mmol)
You. These high concentrations represent between 20% and 80% of the total reaction volume.
This can be achieved by the use of organic solvents at concentrations. Ma
Also, by using a high pH, nucleophilic amino or
Effective concentration of thiol conjugation partner
Can be increased. Preferred method for labeling probes
Is acridinine having a concentration of 1 to 10 mmol with an organic solvent.
Use of umester. Such labeling methods are
In liquid or with acridinium ester or probe
It can be carried out with either one suspended in the solution.
That is, the constructed labeled probe is disclosed in this specification.
Can be purified using the method of the present invention. Unlabeled
Acrylic from lobe and free acridinium esters
Purification or separation of dinium ester labeled probes
Probe most of the free acridinium ester labels
And then remove substantially all remaining free label
Probe, and finally labeled and unlabeled probes
And separation of labeled probe degradation products
Be done. These steps can be performed sequentially or simultaneously.
obtain. Most favorable removal of free label from the probe
Methods include nucleic acid precipitation, ion exchange HPLC and reverse phase HP
Rapid separation techniques including, but not limited to, LC
Not necessarily. Traces of Acridinium Este Remaining
The probe is removed from the probe and labeled and unlabeled
Preferred methods for simultaneous separation of ions are ion exchange, reverse
Phase or specific application of hydroxide apatite HPLC
You. By this method, the nucleic acid probe is acridinium
It can be labeled with an ester and purified to high purity. next,
These labels and purification probes are
Can be used to detect small amounts of specific target substances. Ma
Used for detection of acridinium ester-labeled probes
Reagents and assay systems and kits
Included in the invention.Brief description of drawings FIG. 1 illustrates the acridinium ester reaction formula.
It is. Figure 2 shows the internal
Fig. 3 shows a partially labeled probe. Fig. 3
Is used for probe labeling with acridinium ester.
Conjugation partners and reaction products
Fig. 4 is a table summarizing the conditions and conditions.
Ion exchange of ester-labeled probe (4A) and reverse phase
(4B) Illustrates the HPLC profile.
FIG. 5 shows detection of an acridinium ester-labeled probe.
Is illustrated.Detailed description of preferred embodiments Definition Used in this specification (including the claims)
The following words are defined. N-hydroxysuccinimi of acridinium ester
Jill ester: has a tetravalent nitrogen center and is derivatized at position 9.
Of the acridinine with the phenyl ester moiety formed
Derivatives, specifically, 4- (2-succinimidyloxy)
(Cyclocarbonylethyl) phenyl-10-methylacridi
Nium-9-carboxylate fluorosulfone
G.Acridinium ester methoxyimidate Acridinium esters: parts of the following general types: R₁= Alkyl, alkenyl, aryl, substituted alk
, Substituted alkenyl, substituted aryl, alkoxy, ant
Oxy or present when X = halogen
do not do. R₂= H, alkyl, alkenyl, aryl,
Substituted alkyl, substituted alkenyl, substituted aryl, alk
Xy, aryloxy (if only X = N
B). R₃= H, amino, hydroxy, thiol, halo
Gen, nitro, amino, amide, acetyl, alkyl,
Alkenyl, aryl, substituted acetyl, substituted alkyl,
Substituted alkenyl, substituted aryl, alkoxy, aryl
Oxy. R₄= Alkyl, alkenyl, aryl, substituted
Alkyl, substituted alkenyl, substituted aryl. X = O,
N, S, halogen, substituted phosphorus, substituted sulfur, substituted boron or
Is substituted arsenic. Y = O, S or NH. R₁And / or
Is R₂And / or R₃And / or R₄Is chemical
It has a reactive site that allows conjugation. Nucleotides: phosphate groups, 5-carbon sugars and nitrogen-containing bases
A nucleic acid subunit comprising: In RNA, 5-carbon sugars
Is ribose. In DNA, it is 2-deoxy
It is siribose. This term also refers to those subunits
Analogs. Nucleotide multimers: linked by phosphodiester bonds
Strand of nucleotides or analogs thereof. Oligonucleotides: generally about 10 to about 100 long nuclei
Nucleotides having a leotide but having a length of more than 100
Nucleotide multimers, which may also be nucleotides. They are
Usually thought to be synthesized from nucleotide monomers
Can also be produced by enzymatic means. Deoxyribonucleotide: Deoxyribonucleotide
Oligonucleotides consisting of tide monomers. Polynucleotide: generally up to about 100 nucleotides in length
Or more nucleotide multimers. These are usually raw
Or obtained by enzymatic means. Nucleotide multimer probe: Second nucleotide multimer
Target nucleotide contained within the body, usually a polynucleotide
Having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence
De multimer. Usually completely complementary to the corresponding base in the target sequence
The target probe is selected. However, in the probe
One or more nucleotides correspond to the target sequence.
Suitable or more desirable even if it is not complementary to the base
It is possible. Generally, the probes will be labeled. all
The abbreviated “probe” throughout the body is defined in this specification.
Defined as nucleotide multimer probes
I do. Nucleotide / non-nucleotide polymer: nucleotide
And polymers comprising non-nucleotide monomer units.
When used as a probe, it is generally labeled
You. Hybrid: Watson-Crick base between complementary bases
Formed between two nucleotide multimers by pairing
Complex. Suspension: A mixture of liquids or solid non-
A mixture of precipitated particles. Particle (containment) liquid, particles are dispersed phase
Yes, the suspension medium is a continuous phase. Acridinium Esthe
Chemistry is described by Weeks et al.
Acridinium esters as active labels ", Clinica
Le Chemistry, 2918, pp. 1474-1479.
(1983). Briefly, a
Clidinium esters equilibrate with their corresponding bases
It exists in a state where it has been done. High pH is preferred for base formation. 4
Low pH is preferred for the formation of valent nitrogen. The chemiluminescent reaction is
Leads to the formation of electronically excited N-methylacridone
Acrydinium hydroxyperoxide ion
Accompanied by an attack by This reaction is illustrated in FIG.
Is shown. 1. N-hydroxysuccinine of acridinium ester
Labeling with imidyl-ester. a. Probe selection In a preferred embodiment, the probe to be labeled is a primary
Contains min. The 5'-terminal is modified (5'-aminoethyl
Sulfate, "terminal amine linker-arm"), internal
Modification [non-nucleotide based "internal amine linker-
Arm ", type 1 (see L1 in Patent Application No. 0999050)
), Type 2 (see L3 of Patent Application No. 099050),
L2, L4, L5, L6, L7 or L8, base substitution
Or used as an intercalation base) or amine modification
Decorated base internal addition [Amino (12) dUTP, Carbioque
San Diego, CA] or probe
3'-terminal modified (5-allylamine UTP)
With the Minlinker-Arm, this method is effectively implemented.
Was. Further, the present invention provides, for example, a phosphate backbone and
And labeling of sugar residues. According to the present invention,
Amine linkers mentioned in the prior art section of the specification of
Arm probe, probe containing thiol phosphate
And thiol uridine-containing probes (provided that
Without limitation), other known in the prior art
The use of modified nucleotide probes is also contemplated. Attachment
FIG. 2 of the drawing shows the internal marking with acridinium ester.
3 shows the probe identified. b. Probe label 1. Choice of pH This depends to some extent on the amine linker arm
However, the optimal pH for this chemical reaction is about 8. 2. Choice of buffer It needs to be a good buffer at the optimum pH. H
EPES, phosphate and bicarbonate buffers may be selected.
It is not limited to these. 3. Selection of organic solvent Used in the range of 20% -80% in the final reaction cocktail
It should be. The selection range includes DMSO, CH₂C
N, dimethylformamide, dioxane, acetone,
But not limited to
No. Selection requirements are probe and acridinium
Esters must be highly soluble in the chosen solvent.
Acridinium esters and
Lobes are not excessively degraded by the solvent. 4. Acridinium ester concentration Depending on the chemical conditions chosen, 0.1 mmol to 5
0 mmol is an acceptable range. N-hydroxy
Succinimidyl ester conjugation
-The optimal range of toner is the amine / linker used
-About 1-10 mM, depending on arm chemistry
It is a clidinium ester. Many during the course of the reaction
The polyaddition increases the final labeling, but the purification
Becomes even more difficult. 5. temperature 15-40 ° C is optimal. 6. Reaction persistence This is due to linker arm chemistry and other reaction parameters.
Time points
Should be determined by analysis. In this analysis,
Degree vs. acridinium ester-probe degradation products
Consider the emergence. 7. N-hydroxysuccinimidyl-acridinium
Unreacted electrophilic conjugation part of the ester
Quenching of the nar. Conjugation under the same reaction conditions
Should add a simple analog of the nucleophile
is there. FIG. 3 shows a nucleic acid probe containing amine and thiol.
And each of their conjugation partners
A summary of the reaction products and conditions of this invention
is there. c. Purification of labeled probe. A two-stage method is generally more effective. First, jin
Most of the free label should be removed using a fast and simple method
It is. This includes, for example, precipitation, hydroxide apatite,
Obes SM-2, Sepupak or free label
But not labeled probe (or vice versa)
Binding of free label to solid support, high speed gel filtration, organic
Extraction of free label into phase, filtration (eg, centricon), high
Fast ion exchange chromatography (including HPLC)
Or high-performance reverse phase chromatography (including HPLC)
Yes, but not limited to these. Next,
Contains acridinium ester non-covalently bonded to
Remaining free labeled and unlabeled probe to labeled probe
Must be separated to a very high degree of purity. This place
The choices in the case are quite limited. Fastest and most effective
The method is by ion exchange, reversed phase and hydroxide apatite
HPLC, but not limited thereto. H
It works reasonably well, though not as much as PLC,
Another tedious and time-consuming method is the use of organic solvents.
Gel filtration (typically biogel P in formamide)
-100 or P-200). Also purified
If the amount to be purified is sufficiently small using HPLC,
In one step using gel filtration in organic solvents
Can be achieved. This one-step method generally involves the two-step method described above.
Not as effective. Example Example 1 Ethanol precipitation followed by ion exchange HPLC
Labeling and purification of a simple amine linker arm probe
Made. A. Synthesis of amine linker arm probe and
Purification. Different Deo with Different Amine Linker Arm Chemistry
Description herein for xyligonucleotide probes
To demonstrate the valid applicability of the methods and procedures described,
The following amine linker arm probe was prepared. 1.5'-amine linker-arm probe Attach 5'-amine linker arm to probe
For this, two approaches were taken. One is Applied
Marketed by Biosystems, Inc.
Using the reagent “Aminolink”
Was. The other was a method using the following compounds. For this compound, the terminal amine linker arm
Called reagent. This reagent was synthesized as follows. 6-A
Minohexanol was added to S-ethyltrihydrate in anhydrous ethyl acetate.
Reacted with fluorothioacetate. Reaction product on stone
Precipitated with oil ether and mixed with 10% pyridine (in water)
Possibility of being formed by treating with compound for 10 minutes
Is hydrolyzed to give a gum form.
The solution was concentrated to dryness. This compound is then used as a standard in the literature.
According to the protocol (Nucleic Acids Lisa
Ji,12(11), 4539 (1984))
By phytylation, the desired compound,
The terminal amine linker arm reagent (1) was produced.
5'-amine linker arm (aminolink or
Probe containing a terminal amine linker arm)
Was synthesized as follows. Applied Biosystem
Muzu, Inc. Model 380A DNA
Use a synthesizer to generate the desired nucleotide sequence.
Probes are constructed from the lobe to the 3'-end to the 5'-end
Manufactured by standard phosphoramidite chemistry
Was. After completion of the desired sequence, another phosphoramidite
Terminal amino acids can be treated in the same way as for nucleoside attachment.
Use linker-arm reagents or
Use aminolinks using procedures described by the company
Automatically probe the amine linker arm
To the 5'-hydroxyl group. Standard protocol
The probe is then cleaved from the solid support using
NH₄Deprotection using OH, polyacrylamide gel
Electrophoresis followed by Sephadex G-25 chromatography
Purified by fee. The next probe using this procedure
Was synthesized and purified. Represents] and2. Internal amino linker arm probe. Amine linker arm incorporated inside probe
US Patent Application by Arnold et al.
No. 099050 (submitted on September 21, 1987, name
Non-nucleotide binding assay for nucleotide probes
Internal amine linker arm described in "Drugs")
Reagents, type 1 or type 2 were used. Similarly, the standard phosphor
-Probes are synthesized using amidite chemistry and
Lilamide gel electrophoresis and Sephadex G-25
Purified using chromatography. By this method
The following probes were synthesized: 1. ) 16S subunit derived from Escherichia coli
30-mer complementary to rRNA of the Ade at position 18 in the sequence
Nin residue placed by internal amine linker arm type 1
Has been replaced. It also contains thymidine, cytidine or guanosine residues internally.
Probes are replaced by linker arm type 1
Done. 2. ) 16S from Chlamydia trachomatis
33-mer complementary to buunit rRNA. Array 21
Adenine residue at position 1 with internal amine linker arm 1
Replace with Or it is inserted between residues 21 and 22. 3. ) 23S sa derived from Chlamydia trachomatis
24-mer complementary to buunit rRNA. Residue 15
The internal linker arm L7 is inserted between
I have. B. Acridinium ester with NHS ester
Labeling of the Min linker arm probe and subsequent
Purification. NHS ester or acridinium ester
A 25 mM stock solution was prepared in distilled DMSO. Place
Desired amount of probe (various probes labeled in section A above)
See list of lobes) 1.5ml conical polypropylene
Concentrated to dryness in a tube. Add the following ingredients in order
The following cocktail was constructed. 3 microliters of H₂O 1 microliter of 1M HEPES (pH 8.0) 4 microliters of DMSO (distilled) 2 microliters of 25 mM acridinium ester
NHS ester in distilled DMSO. Vortex the mixture and spin in a small centrifuge for 2 seconds.
(To collect the contents at the bottom of the tube) at 37 ° C for 20 minutes
Incubate. Then, the following components were listed
It was added to the reaction cocktail in order. 3.0 microliters of 25 mM Acridinium S
Ter NHS ester in distilled DMSO 1.5 microliters of H₂O 0.5 microliter of 1 M HEPES (pH 8.
0) Again swirl the cocktail, rotate and at 37 ° C. further
Incubated for 20 minutes. 0.1M HEPE
S (pH 8.0), 0.125 M solution in 50% DMSO
5 fold excess by adding 5 microliters of gin
The unreacted label is quenched with lysine, and
Incubated for minutes. Then, using the following method
Thus, the acridinium ester-labeled probe was purified. Not yet
To remove most of the reaction labels,
For ethanol precipitation. 20 microliter que
30 microliters of the quenched reaction mixture
3M NaOAc (pH 5.0), 245 microliter
Torr H₂O and 5 microliters of glycogen
Was added as a carrier (pretreatment of glycogen
All nuclease activity was removed). Short time sample
Vortex for 640 microliters of absolute EtOH
Was added. Vortex sample briefly, on ice for 5-10 minutes
For 5 minutes and then a small centrifuge for 5 minutes
And centrifuged at 15000 rpm. Carefully remove the supernatant
The precipitate was removed and 20 microliters of 0.1 M NaO
Ac (pH 5.0), redissolved in 0.1% SDS. Next
Use one of the following two HPLC systems
The remaining free labeled, unlabeled probe and AE
Separation of AE-labeled probe from degradation products of labeled probe
did.Ion exchange HPLC Nucleos mounted on IBM9533 HPLC system
-Gen-DEAE60-7 on an ion exchange HPLC column
20 microliters of the redissolved precipitate was injected. HP
Water for LC, acetonitrile (CH₃CN) and sodium acetate
Thorium (NaOAc) (Fisher Scientific
Glacial acetic acid (HOAC) and reagents
All buffers were prepared with LiCl. All loose before use
The impregnating solution was made up of 0.45 micromolar pore size nylon-66
It was filtered by a filter. 2 at a flow rate of 0.5 ml / min
30% from 55% buffer A, 45% buffer B for 5 minutes
Elution with a primary gradient to buffer A, 70% buffer B
Was done. During the run, monitor the absorbance at 260 nm.
Was. The range of the field of view was equal to one optical density unit. Char
The speed was 20 cm / hour. 0.5 ml of frax
1.5ml screw cap type eppend
Collected in a Ruff tube. The results are shown in FIG. 4A (in this case,
The lobe is a terminal amine linker as described in A above.
26-mer. All other probes were very similar
Profile was shown. ). Immediately after spill
Torr of 10% SDS is added to each tube, and then each tube is swirled.
Turned (this is an acridinium ester labeled probe
To make sure that no
T). Aliquot 0.5 microliter aliquots
200-200 in a 12 x 75 mm tube
Added to microliters of water (for each aliquot
By using a separate pipette tip,
Title was avoided). Next, Berthold Clinilma
200 microliters of 0.25N H
NO₃, 0.1% H₂O₂200 microseconds with 1 second delay
One liter of 1N NaOH is automatically injected, followed by 1
By reading the chemiluminescence output for 0 seconds,
An aliquot was measured for chemiluminescence. Next, the fraction
4-64 were EtOH precipitated as follows. 5 each
In addition to microliters of glycogen, swirl,
Add 1 ml of EtOH, swirl and place on ice for 5-10
Incubate for 1 minute, 1500 in a small centrifuge
Centrifuged at 0 rpm for 5 minutes. Carefully remove each supernatant
And the precipitate was washed with 20 microliters of 0.1 M NaO.
Redissolve in Ac, pH 5, 0.1% SDS, fraction
Pooled.Reversed phase HPLC In addition, the acridinium ester-labeled probe is generally
Purified according to the procedure. The exception is Baidak C4 reverse phase
Using a column, buffer A was 0.1 M triethyl acetate.
Nummonium (Applied Biosystems, Inc.
Polated, Foster City, California
A) and buffer B is CH₃CN. Flow velocity 1m
Primary gradient from 10-15% solvent B at 1 / min for 25 minutes
To elute the labeled probe. Absorbance at 260 nm
Monitored. 0.5 ml fractions were collected. Next
Check the main chemiluminescence peak and follow the procedure above.
Treated (but 45 microliters before EtOH precipitation)
Torr of 3M NaOAc was added to each fraction).
FIG. 4B of the accompanying drawings shows the 24-mer probe described in the above item A.
Elution profile of probe (internal linker arm, L7 type)
Show All other probes show very similar probes
did. By using both of these procedures,
All linker arm chemistry described in the textbook
High purity acridinium
A stell-labeled probe was obtained. The ratio of these probes
The activity is generally 5-10 × per picomole of probe.
10 'chemiluminescence count (Berthold Clinilma
G). FIG. 5 of the accompanying drawings shows the once purified product.
Shows the sensitivity with which these probes can be detected. C. Methoxyimidate induction of acridinium esters
Labeling of amine linker arm probe with
And subsequent purification. This procedure was generally performed in accordance with the procedure described in section B above.
The points were as follows. 50 microphones with dry probe
Liter of 0.5 molar NaCO₃, PH 9 and 25
Redissolve in microliters of dimethylformamide
Was. Next, 0.2 mg of methoxyimine acridinium
Ester (MI-AE) is added and the mixture is swirled,
The reaction was performed at room temperature for 30 minutes. 0.2 mg of MI-
AE was added and the reaction continued at room temperature for another 30 minutes. Not yet
Reaction label was 0.5M NaHCO₃50 mM in pH 9
Quenched with 100 microliters of lysine
(Incubation for 10 minutes at room temperature). Then Acri
A dinium ester-labeled probe was used in accordance with the description in section A above.
Ethanol precipitated, but 40 microlitres
3M NaOAc (pH 5.0), 105 microliters
Liters of H₂O and 750 microliters anhydrous
EtOH was used. Then, ion as described in section B
The probe was further purified using exchange HPLC. Example 2 Clinical environment using acridinium ester labeled probe
Of a dilution series of the target polynucleotide sequence in E. coli.
Follow the procedure below and use the acridinium ester to
Probe (33mer, internal linker-arm, 1
Type, adenosine substitution, see Example 1) with its target rR
NA (in this case, Chlamydia trachomatis) and high
It was allowed to form a brid.Hybridization mixture 16 microliter throat swab (taken with a cotton swab
Sample) 3% lithium lauryl sulfate, 30 mM phosphate buffer
Liquid (PB) pH 6.8, 1 mmol EDTA, 1 mmol
During EGTA. 2 microliters of 4.8 molar PB, pH 4.7 1 microliter of rRNA (10-³, 10-²,
10-¹Or 0.33 microgram) 1 microliter probe (0.33 pmol) The control mixture contained water instead of rRNA,
Same as the hybridization mixture. blend
Was incubated at 60 ° C. for 60 minutes. Then
Non-hive using hydroxide apatite (HAP) as follows
Hybrids were separated from lid forming probes. Each c
150 microlitres for hybrid and control mixtures
0.14 mol PB, pH 6.8 (containing 2% HAP)
Was added. The resulting mixture was vortexed for 5 seconds each, 6
Incubate at 0 ° C for 5 minutes and vortex for 20 seconds
And then in a small centrifuge at 15000 rpm for 30 seconds
Centrifugation between the plates. Remove supernatant and add 150 microlitres
Of 0.14 mol PB, pH 6.8, was added to the HAP precipitate.
Vortex the mixture for 10 seconds and then centrifuge
Centrifuged at 15000 rpm for 30 seconds in a separator. Supernatant
And repeat this cleaning process twice more in exactly the same way
Repeated. 150 microliters of remaining HAP precipitate
Resuspended in 0.14 M PB, pH 6.8.
The chemiluminescence was read directly, exactly as described in 1. result: The results represent the average of duplicate values. Hundreds of signals
As relative light units (rlu's). Contrast
Gunal represents about 0.1% input rlu. S:
B is the ratio of signal to baseline, ie, specific rRNA concentration.
Is the value obtained by dividing the chemiluminescence in
You. These data will be used as described in this specification.
Using dinium ester label and purified probe
With this, the target polynucleotide sequence can be identified with high sensitivity.
It proves that it can be detected differently.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ネルソン、ノーマン・チャールズ アメリカ合衆国92111 カリフォルニア サンディエゴ マースレタ・ドライブ 3639番   ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page    (72) Inventors Nelson, Norman Charles             United States 92111 California             San Diego Marseleta Drive             3639th

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １．核酸プローブを標識化する方法であって、核酸プロ
ーブがアクリジニウムエステル類に結合し得る第１のコ
ンジュゲート部分を有し、アクリジニウムエステル標識
試薬が該核酸プローブの該第１のコンジュゲート部分に
結合し得る第２のコンジュゲート部分を有し、該プロー
ブが溶媒中において高濃度のアクリジニウムエステル標
識試薬により結合することを特徴とする核酸プローブを
標識化する方法。 ２．該標識試薬の濃度が少なくとも０．１ｍＭ以上であ
る、請求の範囲第１項に記載の核酸プローブを標識化す
る方法。 ３．該標識試薬の濃度が０．１ｍＭ〜５０ｍＭである、
請求の範囲第１項に記載の核酸プローブを標識化する方
法。 ４．該核酸プローブを標識化する工程をｐＨ７〜９にお
いて行う、請求の範囲第１〜３項のいずれかひとつに記
載の核酸プローブを標識化する方法。 ５．該核酸プローブを標識化する工程を１５〜４０℃に
おいて行う、請求の範囲第１〜４項のいずれかひとつに
記載の核酸プローブを標識化する方法。 ６．溶媒が２０容量％〜８０容量％の有機溶媒濃度であ
る、請求の範囲第１〜５項に記載の核酸プローブを標識
化する方法。 ７．有機溶媒が、ＤＭＳＯ、ＣＨ_３ＣＮ、ジメチルホル
ムアミド、ジオキサン、アセトン及びメタノールからな
る群より選ばれる、請求の範囲第６項に記載の核酸プロ
ーブを標識化する方法。 ８．溶媒中において核酸プローブを標識化する工程を、
核酸プローブを含む溶液により行い、該標識試薬を溶液
に懸濁させる、請求の範囲第１〜７項に記載の核酸プロ
ーブをアクリジニウムエステル試薬で標識化する方法。 ９．溶媒中において核酸プローブを標識化する工程を、
標準試薬を含む溶液により行い、核酸プローブを溶液に
懸濁させる、請求の範囲第１〜８項に記載の核酸プロー
ブを標識化する方法。 １０．核酸プローブを標識化する方法がさらに、未反応
のアクリジニウムエステル標識試薬をクエンチングする
ことを含有する、請求の範囲第１〜９項に記載の核酸プ
ローブを標識化する方法。 １１．核酸プローブの第１のコンジュゲート部分及びア
クリジニウムエステル標識試薬の第２コンジュゲート部
分が各々下記のものである、請求の範囲第１〜１０項の
いずれかに記載の核酸プローブをアクリジニウムエステ
ル標識試薬で標識化する方法。 １２．該アクリジニウムエステル試薬がＮ−ヒドロキシ
スクシンイミデ−アクリジニウムエステル試薬である、
請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の核酸プロー
ブを標識化する方法。 １３．アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プ
ローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高
純度で分離する方法であって、第１の緩衝液中で、イオ
ン交換、逆相及びヒドロキシアパタイトからなる群から
選ばれるＨＰＬＣカラムに該標識プローブを結合させ、
ＨＰＬＣカラムを第２の緩衝液と接触、または、第１の
緩衝液及び第２の緩衝液の勾配に接触させることによ
り、標識プローブ、非標識プローブ及び遊離アクリジニ
ウムエステル標識試薬の分別溶離を実現させることを含
むアクリジニウムエステル標識プローブを非標識プロー
ブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度
で分離する方法。 １４．カラムがイオン交換であり、第１の緩衝液が２０
ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮで
あり、第２の緩衝液が２０ミリモルＮａＯＡｃ、ｐＨ
５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、１モルＬｉＣｌである、請
求の範囲第１３項に記載のアクリジニウムエステル標識
プローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエス
テル標識試薬から高純度で分離する方法。 １５．カラムがイオン交換であり、２０ミリモルＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．４５モルＬ
ｉＣｌからなる第１の緩衝液から、２０ミリモルＮａＯ
Ａｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．７モルＬｉ
Ｃｌからなる第２の、緩衝液への勾配が使用される、請
求の範囲第１３に記載のアクリジニウムエステル標識プ
ローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエステ
ル標識試薬から高純度で分離する方法。 １６．カラムが逆相であり、第１の緩衝液が０．１Ｍ酢
酸トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０であり、第２の
緩衝液がＣＨ_３ＣＮである、請求の範囲第１３に記載の
アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プローブ
及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度で
分離する方法。 １７．カラムが逆相であり、０．１モル酢酸トリエチル
アンモニウム、ｐＨ７．０、１０％ＣＨ_３ＣＮからなる
第１の緩衝液から、０．１モル酢酸トリエチルアンモニ
ウム、ｐＨ７．０、５０％ＣＨ_３ＣＮからなる第２の緩
衝液への勾配が使用される、請求の範囲第１３項に記載
のアクリジニウムエステル標識プローブを非標識プロー
ブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度
で分離する方法。 １８．アクリジニウムエステル標識プローブを非標識プ
ローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高
純度で分離する方法であって、高速な分離手段を用いて
標識プローブから遊離アクリジニウムエステル標識試薬
の大部分を除去し、残存している実質的に全部の遊離ア
クリジニウムエステル標識試薬をプローブから除去し、
イオン交換、逆相またはヒドロキシアパタイトからなる
群から選ばれるＨＰＬＣを用いて標識プローブを非標識
プローブから分離することを含むアクリジニウムエステ
ル標識プローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウ
ムエステル標識試薬から高純度で分離する方法。 １９．高速な選択手段が、（１）核酸沈殿、（２）ヒド
ロキシアパタイト、バイオ−ビーズＳＭ２、セプ−パッ
ク又は標識が結合し遊離標識プローブが結合しないか、
または標識プローブが結合し遊離標識が結合しない固体
支持体に、遊離標識を結合、（３）高速ゲルろ過、
（４）有機相への遊離アクリジニウムエステル標識試薬
の抽出、（５）ろ過、（６）高速イオン交換クロマトグ
ラフィー、（７）イオン交換ＨＰＬＣ、及び、（８）逆
相ＨＰＬＣからなる群から選ばれる、請求の範囲第１８
項に記載のアクリジニウムエステル標識プローブを非標
識プローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬か
ら高純度で分離する方法。 ２０．高速な分離手段がエタノール沈殿であり、ＨＰＬ
Ｃがイオン交換であり、除去及び分離が、２０ミリモル
ＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．４５
モルＬｉＣｌからなる第１の緩衝液から２０ミリモルＮ
ａＯＡｃ、ｐＨ５．５、２０％ＣＨ_３ＣＮ、０．７モル
ＬｉＣｌからなる第２の緩衝液への勾配の使用により達
成される、請求の範囲第１８または１９項に記載のアク
リジニウムエステル標識プローブを非標識プローブ及び
遊離アクリジニウムエステル標識試薬から高純度で分離
する方法。 ２１．高速な分離手段がエタノール沈殿であり、ＨＰＬ
Ｃが逆相であり、除去及び分離が、０．１ミリモル酢酸
トリエチルアンモニウム、ｐＨ７．０、１０％ＣＨ_３Ｃ
Ｎからなる第１の緩衝液から０．１ミリモル酢酸トリエ
チルアンモニウム、ｐＨ７．０、５０％ＣＨ_３ＣＮから
なる第２の緩衝液への勾配の使用により達成される、請
求の範囲第１８に記載のアクリジニウムエステル標識プ
ローブを非標識プローブ及び遊離アクリジニウムエステ
ル標識試薬から高純度で分離する方法。 ２２．高純度のアクリジニウムエステルで標識化された
核酸プローブであって、該標識化核酸プローブが第１の
コンジュゲート部分を有する核酸プローブを該核酸プロ
ーブの該第１のコンジュゲート部分と結合可能な第２の
コンジュゲート部分を有する高濃度のアクリジニウムエ
ステル標識試薬で溶媒中で標識化し、緩衝液中で該標識
化プローブをイオン交換、逆相及びハイドロキシアパタ
イトからなる群より選ばれたＨＰＬＣカラムに結合さ
せ、該アクリジニウムエステル標識化プローブを未標識
化プローブ及び遊離アクリジニウムエステル標識試薬か
ら分離することにより得られることを特徴とする高純度
のアクリジニウムエステルで標識化された核酸プロー
ブ。[Claims] 1. A method for labeling a nucleic acid probe, wherein the nucleic acid probe has a first conjugate moiety capable of binding to acridinium esters, and wherein the acridinium ester labeling reagent is a first conjugate of the nucleic acid probe. A method for labeling a nucleic acid probe, comprising a second conjugate moiety capable of binding to the moiety, wherein the probe is bound by a high concentration of an acridinium ester labeling reagent in a solvent. 2. 2. The method for labeling a nucleic acid probe according to claim 1, wherein the concentration of the labeling reagent is at least 0.1 mM or more. 3. The concentration of the labeling reagent is 0.1 mM to 50 mM,
A method for labeling a nucleic acid probe according to claim 1. 4. The method for labeling a nucleic acid probe according to any one of claims 1 to 3, wherein the step of labeling the nucleic acid probe is performed at pH 7 to 9. 5. The method for labeling a nucleic acid probe according to any one of claims 1 to 4, wherein the step of labeling the nucleic acid probe is performed at 15 to 40 ° C. 6. 6. The method for labeling a nucleic acid probe according to claim 1, wherein the solvent has an organic solvent concentration of 20% by volume to 80% by volume. 7. How the organic solvent, DMSO, CH 3 _CN, dimethylformamide, dioxane, selected from the group consisting of acetone and methanol, labeling the nucleic acid probe according to claim 6. 8. Labeling the nucleic acid probe in a solvent,
The method for labeling a nucleic acid probe with an acridinium ester reagent according to claim 1, wherein the method is performed with a solution containing a nucleic acid probe, and the labeling reagent is suspended in the solution. 9. Labeling the nucleic acid probe in a solvent,
9. The method for labeling a nucleic acid probe according to claim 1, wherein the method is performed using a solution containing a standard reagent, and the nucleic acid probe is suspended in the solution. 10. The method for labeling a nucleic acid probe according to any one of claims 1 to 9, wherein the method for labeling a nucleic acid probe further comprises quenching an unreacted acridinium ester labeling reagent. 11. The nucleic acid probe according to any one of claims 1 to 10, wherein the first conjugate portion of the nucleic acid probe and the second conjugate portion of the acridinium ester labeling reagent are as follows. A method of labeling with an ester labeling reagent. 12. The acridinium ester reagent is an N-hydroxysuccinimide-acridinium ester reagent,
A method for labeling a nucleic acid probe according to any one of claims 1 to 11. 13. A method for separating an acridinium ester-labeled probe with high purity from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent, wherein the first buffer is selected from the group consisting of ion-exchange, reverse phase, and hydroxyapatite. Binding the labeled probe to an HPLC column to be
By contacting the HPLC column with the second buffer or with the gradient of the first buffer and the second buffer, the fractional elution of the labeled probe, the unlabeled probe and the free acridinium ester labeled reagent can be achieved. A method for separating an acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent with high purity, comprising: 14． The column is ion exchange and the first buffer is 20
Mmol NaOAc, was pH5.5,20% _CH 3 CN, the second buffer 20 mM NaOAc, pH
14. A method for separating an acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent with high purity, wherein the probe is 5.5, 20% CH ₃ CN, and 1 mol LiCl. . 15. The column is ion exchange and 20 mmol NaO
Ac, pH 5.5, 20% CH ₃ CN, 0.45 mol L
From a first buffer consisting of iCl, 20 mM NaO
Ac, pH 5.5, 20% CH ₃ CN, 0.7 mol Li
14. A method for separating an acridinium ester-labeled probe of high purity from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent according to claim 13, wherein a second gradient to a buffer solution comprising Cl is used. . 16. Column is reverse phase, the first buffer 0.1M triethylammonium acetate, a pH 7.0, the second buffer is _CH 3 CN, acridinium esters according to the thirteenth claims A method of separating a labeled probe with high purity from an unlabeled probe and a free acridinium ester labeling reagent. 17． Column is reverse phase, 0.1 mol triethylammonium acetate, from a first buffer consisting of pH 7.0, 10% _CH 3 CN, 0.1 mol triethylammonium acetate, pH7.0,50% _CH 3 CN 14. The method for separating an acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent with high purity according to claim 13, wherein a gradient to a second buffer solution is used. 18. A method for separating an acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent with high purity, wherein most of the free acridinium ester-labeled reagent is separated from the labeled probe using a high-speed separation means. Removing and removing substantially all remaining free acridinium ester labeling reagent from the probe;
Separating the labeled probe from the unlabeled probe using an HPLC selected from the group consisting of ion-exchange, reverse phase or hydroxyapatite comprises separating the acridinium ester-labeled probe from the unlabeled probe and the free acridinium ester labeling reagent. A method of separating by purity. 19. The fast selection means is based on (1) nucleic acid precipitation, (2) hydroxyapatite, bio-bead SM2, Sep-Pak or label bound and free labeled probe not bound,
Alternatively, a free label is bound to a solid support to which a labeled probe is bound and no free label is bound, (3) high-speed gel filtration,
(4) extraction of a free acridinium ester labeling reagent into an organic phase, (5) filtration, (6) high performance ion exchange chromatography, (7) ion exchange HPLC, and (8) reverse phase HPLC. Claim 18th to be selected
A method for separating the acridinium ester-labeled probe according to the above section from the unlabeled probe and the free acridinium ester-labeled reagent with high purity. 20. A high-speed separation method is ethanol precipitation.
C is ion exchange and removal and separation is performed using 20 mmol NaOAc, pH 5.5, 20% CH ₃ CN, 0.45
20 mM N from a first buffer consisting of
aOAc, _pH5.5,20% CH 3 CN, are achieved by the use of gradient to a second buffer consisting of 0.7 mol LiCl, acridinium ester label according to a 18 or 19 wherein the claims A method for separating a probe with high purity from an unlabeled probe and a free acridinium ester labeling reagent. 21. A high-speed separation method is ethanol precipitation.
C is in reverse phase and removal and separation is performed using 0.1 mM triethylammonium acetate, pH 7.0, 10% CH ₃ C
The first buffer 0.1 mmol triethylammonium acetate from solution comprising N, is achieved by the use of gradient to a second buffer consisting pH7.0,50% _CH 3 CN, according to the 18 claims A method for separating an acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester-labeled reagent with high purity. 22. A nucleic acid probe labeled with high-purity acridinium ester, wherein the labeled nucleic acid probe is capable of binding a nucleic acid probe having a first conjugate portion to the first conjugate portion of the nucleic acid probe. An HPLC column selected from the group consisting of ion exchange, reverse phase and hydroxyapatite in a solvent, labeled in a solvent with a high concentration of acridinium ester labeling reagent having a second conjugate moiety. And a nucleic acid labeled with a high-purity acridinium ester, which is obtained by separating the acridinium ester-labeled probe from an unlabeled probe and a free acridinium ester labeling reagent. probe.