JPH11313670A - Magnetic carrier, its production and extraction of nucleic acid by using the same - Google Patents

Magnetic carrier, its production and extraction of nucleic acid by using the same

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JPH11313670A
JPH11313670A JP36769198A JP36769198A JPH11313670A JP H11313670 A JPH11313670 A JP H11313670A JP 36769198 A JP36769198 A JP 36769198A JP 36769198 A JP36769198 A JP 36769198A JP H11313670 A JPH11313670 A JP H11313670A
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Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a magnetic carrier having a controlled content of the magnetic body, shapes, particle diameters and pore diameters, excellent in strength and adsorption efficiency, and suitable for extraction or the like of a nucleic acid by reacting a specific magnetic silica particles with (poly)acrylamide, and washing and drying the product. SOLUTION: This magnetic carrier having 0.3-5 mmol/g polyacrylamide expressed in terms of the monomer is obtained by reacting silica (or a raw material thereof), imparting a magnetic body such as magnetite to the reacted silica to provide a magnetic silica particles, reacting the obtained magnetic silica particles with a silane-based coupling agent or the like, washing the obtained magnetic silica particles, reacting the obtained magnetic silica particles with (poly)acrylamide while regulating the content of the dissolved oxygen in a solution so as to be <=1 mg/L, and the polymerization degree of the polyacrylamide in the solution after the reaction so as to be 1,000-1,000,000, and washing and drying the reaction product. Preferably the magnetic carrier is mixed with a sample, a nucleic acid is adsorbed onto the carrier, and the nucleic acid is extracted by utilizing the magnetic power.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は吸着剤や抽出剤とし
て好適な、表面にポリアクリルアミドを有し、その磁性
体含有量や形状、粒径、細孔径が制御された磁性担体、
その製造方法、さらにこの磁性担体を用いた核酸の抽出
方法に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a magnetic carrier having polyacrylamide on its surface and having a controlled content, shape, particle size and pore size of a magnetic substance, which is suitable as an adsorbent or an extractant.
The present invention relates to a method for producing the same, and a method for extracting a nucleic acid using the magnetic carrier.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来より吸着剤や吸着剤を担持するため
の固相担体としてはシリカ粒子等が良く知られている
が、これらを用いる場合、その回収のためには遠心分離
法や、あるいはフィルターによる濾過等を行わなければ
ならなず、簡便な方法ではなかった。また、吸着、抽出
操作においては、目的とする吸着物や抽出物とそれ以外
の他の物質とを分離する必要があるが、従来の遠心分離
法やカラム分離法等の手法では分離のみでも長時間を要
し、また大規模な装置も必要とすることがあるなど簡便
な方法ではなかった。2. Description of the Related Art Conventionally, silica particles and the like are well known as an adsorbent and a solid support for supporting the adsorbent. When these are used, centrifugation or recovery is required for their recovery. Filtering by a filter or the like had to be performed, which was not a simple method. In addition, in the adsorption and extraction operations, it is necessary to separate the target adsorbate or extract from other substances, but conventional methods such as centrifugation and column separation require a long time only for separation. It is not a simple method, as it takes time and sometimes requires a large-scale device.

【０００３】そのため、目的の物質を分離する手段とし
て、例えば特開昭６０−２４４２５１号公報に記載のよ
うに、粒子に強磁性体を付加し、磁場を与えることによ
り、目的の粒子を回収するという方法が用いられてい
た。しかしながら、この方法では、吸着、抽出、反応操
作等において、強磁性体自身が自己会合してしまうこと
があり、さらに磁場をかけるとさらに自己会合しやすく
なることがあるなど、粒子が均一に分散した状態にてそ
の操作を実施したい場合においても粒子の存在状態を自
由に制御できないという課題があった。[0003] Therefore, as a means for separating the target substance, a ferromagnetic substance is added to the particles and a magnetic field is applied to recover the target particles as described in, for example, JP-A-60-244251. That method was used. However, in this method, the ferromagnetic substance itself may self-associate during adsorption, extraction, reaction operation, etc., and the self-association may be further facilitated when a magnetic field is further applied. There is a problem that the state of the particles cannot be freely controlled even when the user wants to perform the operation in a state where the operation is performed.

【０００４】近年、強磁性体自身の自己会合をなくす方
法として、特開昭６１−１８１９６７号公報には磁性体
として超常磁性体を用いた方法が、特表平４−５０１９
５７号公報には検体を固定する固相として超常磁性体を
含んだ磁性粒子を用い、蛋白質、細胞、ＤＮＡの分離、
分析等に利用できることが開示されている。また、特許
第２５５４２５０号公報には、ゲルマトリックスに超常
磁性磁気反応性物質を捕捉させ運動性の高い試薬担体に
ついて開示している。これらに記載の超常磁性磁気粒子
は、酸化鉄等の磁性体を永久磁性を維持するのに必要な
磁区の大きさより小さい微粒子にして粒子中に含ませた
もので、外部磁場をかけず、凝集させる時に外部磁場を
かけて溶液中の粒子を凝集させる方法である。しかしな
がら、これらの方法においても、磁性粒子の物性を十分
に制御したものとはいえず、磁性粒子を種々の用途に応
じてその物性を十分に制御し、最適な磁性粒子を製造す
る方法が望まれていた。特に、磁性粒子の粒子径、細孔
径及びその容積、比表面積、磁性粒子中の磁性体の量や
表面のシリカなどの濃度、といった磁性粒子の特性を制
御することでその目的に応じ最適な粒子を得る方法が望
まれていた。In recent years, as a method of eliminating self-association of a ferromagnetic material itself, Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-181967 discloses a method using a superparamagnetic material as a magnetic material.
No. 57 uses magnetic particles containing a superparamagnetic substance as a solid phase for immobilizing a sample, and separates proteins, cells, and DNA.
It is disclosed that it can be used for analysis and the like. Further, Japanese Patent No. 2554250 discloses a highly mobile reagent carrier in which a superparamagnetic magnetically reactive substance is captured in a gel matrix. The superparamagnetic magnetic particles described in these are magnetic particles such as iron oxide, which are made into fine particles smaller than the size of a magnetic domain necessary for maintaining permanent magnetism and contained in the particles, and are not aggregated without applying an external magnetic field. In this method, an external magnetic field is applied to agglomerate particles in the solution. However, even in these methods, it cannot be said that the physical properties of the magnetic particles are sufficiently controlled, and a method of manufacturing the optimal magnetic particles by sufficiently controlling the physical properties of the magnetic particles according to various uses is desired. Was rare. In particular, by controlling the characteristics of the magnetic particles, such as the particle size of the magnetic particles, the pore size and its volume, the specific surface area, the amount of the magnetic substance in the magnetic particles and the concentration of silica on the surface, the optimum particles for the purpose. There was a need for a method of obtaining.

【０００５】また、シリカ粒子を吸着剤または抽出剤と
して使用する場合、目的の吸着物や抽出物に応じて予め
シリカ粒子の表面に特定の官能基を導入したり、核酸な
どを吸着させて用いてきた。例えば、高速液体クロマト
グラフィー用のゲルのように、特定の官能基をゲルに導
入して用いられてきた。しかしながら、従来の方法では
導入した官能基が剥離して官能基の量が減少し、その結
果吸着剤として使用する際に性能の劣化が起こってしま
う、といった問題が生じることがあった。When silica particles are used as an adsorbent or an extractant, a specific functional group is introduced into the surface of the silica particles in advance or a nucleic acid or the like is adsorbed according to the target adsorbate or extract. Have been. For example, specific functional groups have been introduced into gels, such as gels for high performance liquid chromatography. However, in the conventional method, the introduced functional group is peeled off, and the amount of the functional group is reduced. As a result, there is a problem that the performance is deteriorated when used as an adsorbent.

【０００６】磁性シリカ粒子へのポリアクリルアミドの
導入方法としては、磁性シリカ粒子とアクリルアミドを
混合し、重合反応を行い、ゲルにポリアクリルアミドを
担持する方法がある。しかしながら、この方法ではゲル
とポリアクリルアミドとの間には直接的な結合はなく、
単にポリアクリルアミドがゲルを覆っているだけである
ため、吸着や抽出操作中にゲルとポリアクリルアミドが
分離してしまうという問題があった。As a method for introducing polyacrylamide into magnetic silica particles, there is a method in which magnetic silica particles and acrylamide are mixed, a polymerization reaction is carried out, and polyacrylamide is supported on a gel. However, in this method, there is no direct bond between the gel and polyacrylamide,
Since the polyacrylamide merely covers the gel, there is a problem that the gel and the polyacrylamide are separated during the adsorption or extraction operation.

【０００７】また、ゲルのような担体とポリアクリルア
ミドとの間に結合を形成させるためには、ゲルとポリア
クリルアミドを反応させる必要がある。この場合、一定
量のポリアクリルアミドをゲル上の官能基と直接反応さ
せてゲルにポリアクリルアミドを一定量導入することは
困難であり、たとえできたとしてもその性能の再現性に
問題があるため、再現性よく担体に目的量のポリアクリ
ルアミドを導入することが望まれていた。Further, in order to form a bond between a carrier such as a gel and polyacrylamide, it is necessary to react the gel with the polyacrylamide. In this case, it is difficult to introduce a certain amount of polyacrylamide into the gel by directly reacting a certain amount of polyacrylamide with the functional group on the gel, and even if it is possible, there is a problem in reproducibility of the performance, It has been desired to introduce a desired amount of polyacrylamide into a carrier with good reproducibility.

【０００８】また、特開平９−１９２９２号公報に記載
のように核酸を吸着する担体としてシリカ粒子を使用す
ることが知られており、核酸とシリカ粒子との吸着はシ
リカ表面の水酸基と核酸の塩基との間の水素結合が関与
していると言われている。シリカ粒子を核酸吸着用に用
いる場合、核酸分子がかさ高いために立体障害が生じ、
シリカ粒子の表面のみでは吸着が起こりにくくなったり
し、吸着量に再現性がないという問題があった。It is also known to use silica particles as a carrier for adsorbing nucleic acids as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-19292, and the adsorption of nucleic acids and silica particles depends on hydroxyl groups on the silica surface and nucleic acids. It is said that a hydrogen bond with the base is involved. When silica particles are used for nucleic acid adsorption, steric hindrance occurs due to the bulky nucleic acid molecules,
There has been a problem that the adsorption becomes difficult to occur only on the surface of the silica particles and the adsorption amount is not reproducible.

【０００９】さらに、特表平４−５０１９５９号公報に
は磁性粒子の表面にオリゴヌクレオチド分子を担持した
ものが開示されている。しかしながら、この場合には、
吸着あるいは抽出したい核酸の種類に応じて、磁性粒子
表面に吸着あるいは抽出する核酸と相補的な配列からな
るオリゴヌクレオチドを固定化する必要がある。そのた
め、対象となる核酸にあわせて、相補的な配列からなる
オリゴヌクレオチドを固定化した磁性粒子を準備する必
要が生じる。従って、臨床の現場においては、目的核酸
を吸着あるいは抽出するために、多種類のオリゴヌクレ
オチド固定化磁性粒子が必要になり、経済性など、新た
な問題を生じることとなる。Furthermore, Japanese Patent Publication No. 4-501959 discloses a magnetic particle having oligonucleotide molecules supported on the surface thereof. However, in this case,
Depending on the type of nucleic acid to be adsorbed or extracted, it is necessary to immobilize an oligonucleotide having a sequence complementary to the nucleic acid to be adsorbed or extracted on the surface of the magnetic particles. Therefore, it is necessary to prepare a magnetic particle on which an oligonucleotide having a complementary sequence is immobilized according to the target nucleic acid. Therefore, in a clinical setting, various kinds of oligonucleotide-immobilized magnetic particles are required to adsorb or extract a target nucleic acid, which causes new problems such as economy.

【００１０】さらに、臨床検査の現場において扱われる
血清、血漿、体液等の生体試料には、感染性のウイルス
や細菌が含まれている可能性があり、これらの試料から
核酸を抽出する操作は、手動で行う場合、常に感染の危
険性がある。従って核酸抽出を手動で行う場合は、でき
る限り簡単な方法で、かつ、エアロゾル等が発生し難い
方法を使用することが好ましく、さらには操作の自動化
を図ることが必要である。しかしながら、現在実施され
ている核酸の抽出方法は、一般的に操作が複雑であるた
め、自動化が困難であるという課題があった。Furthermore, biological samples such as serum, plasma, and body fluids handled in clinical examination sites may contain infectious viruses and bacteria, and the procedure for extracting nucleic acids from these samples is not always possible. If done manually, there is always the risk of infection. Therefore, when the nucleic acid extraction is performed manually, it is preferable to use a method as simple as possible and that does not easily generate an aerosol or the like, and it is necessary to automate the operation. However, the method of nucleic acid extraction currently practiced has a problem in that automation is generally difficult due to generally complicated operations.

【００１１】[0011]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
に記載の従来の課題等を解決する、すなわち、磁性体含
有量や形状、粒径、細孔径を制御することができ、強
度、吸着効率に優れた磁性担体、このような磁性担体を
簡便に製造できる方法、さらにこの磁性担体を用いて簡
便で自動化が可能な核酸の抽出方法を提供するものであ
る。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to solve the above-mentioned conventional problems and the like, that is, to control the content, shape, particle size, and pore size of a magnetic substance, An object of the present invention is to provide a magnetic carrier having excellent adsorption efficiency, a method for easily producing such a magnetic carrier, and a method for extracting a nucleic acid which can be easily and automatically automated using the magnetic carrier.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を重ねた結果、磁性体を含むシ
リカ粒子（以下、「磁性シリカ粒子」という）に所定量
のポリアクリルアミドを導入し、さらにこのポリアクリ
ルアミドが導入された磁性シリカ粒子（以下、「磁性担
体」という）の物性を制御することにより、その吸着容
量や吸着速度が大きくなって、種々の吸着剤、抽出剤と
して好適となること、また、このようなポリアクリルア
ミドが導入された磁性シリカ粒子の製造する方法として
磁性シリカ粒子とカップリング剤とを反応させ、その後
アクリルアミド及び／又はポリクリルアミドと反応させ
ることにより容易に製造できること、さらに、このよう
にして得られる粒子を用いることで生体試料中の核酸を
極めて簡便にかつ効率よく抽出できることを見出し、本
発明を完成させるに至った。Means for Solving the Problems The inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, a predetermined amount of polyacrylamide has been added to silica particles containing a magnetic substance (hereinafter referred to as "magnetic silica particles"). By controlling the physical properties of the magnetic silica particles (hereinafter referred to as “magnetic carrier”) into which the polyacrylamide is introduced, the adsorption capacity and the adsorption speed are increased, and various adsorbents and extractants are introduced. As a method of producing such magnetic silica particles having polyacrylamide introduced therein, the magnetic silica particles are reacted with a coupling agent and then reacted with acrylamide and / or polyacrylamide. It can be easily manufactured, and further, by using the particles thus obtained, nucleic acid in a biological sample can be extremely easily and Found to be able to rate well extracted, thereby completing the present invention.

【００１３】すなわち本発明はポリアクリルアミドが導
入された磁性シリカ粒子、その製造方法及びこれを用い
た核酸抽出方法に関するものである。That is, the present invention relates to magnetic silica particles into which polyacrylamide has been introduced, a method for producing the same, and a method for extracting nucleic acids using the same.

【００１４】なお、本発明でいう核酸とは、ＤＮＡ（デ
オキシリボ核酸）及び／又はＲＮＡ（リボ核酸）を意味
するが、それらは一本鎖であっても二本鎖であってもよ
く、またこれらの混合物であってもよい。The nucleic acid in the present invention means DNA (deoxyribonucleic acid) and / or RNA (ribonucleic acid), which may be single-stranded or double-stranded. These mixtures may be used.

【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【００１６】本発明の磁性担体は、磁性体とシリカ粒子
からなる磁性シリカ粒子の表面にポリアクリルアミドを
有するものであり、以下、磁性担体を構成する材料につ
いて順次説明する。The magnetic carrier of the present invention has polyacrylamide on the surface of magnetic silica particles composed of a magnetic substance and silica particles. Hereinafter, the materials constituting the magnetic carrier will be sequentially described.

【００１７】＜磁性体＞本発明の磁性担体において用い
られる磁性体とは、磁性を有するものであれば特に限定
されないが、磁場を与えられることで強い磁性を発生
し、磁場がなくなるとその磁性もなくなる、いわゆる超
常磁性を示すものが好ましく用いられる。このような性
質を示すものとしては、例えば、スピネル型、プランバ
イト型のフェライトや、鉄、ニッケル、コバルト等を主
成分とした合金などが挙げられる。さらに、これらの内
でも、磁性体をシリカ粒子により均一に導入するため
に、マグネタイトやフェライトの超微粒子を水や有機溶
媒に懸濁させて得られる磁性流体が好ましく用いられ
る。<Magnetic Body> The magnetic body used in the magnetic carrier of the present invention is not particularly limited as long as it has magnetism. However, when a magnetic field is applied, a strong magnetism is generated. Those exhibiting so-called superparamagnetism are preferably used. Examples of those exhibiting such properties include spinel-type and plumbite-type ferrites and alloys containing iron, nickel, cobalt, or the like as a main component. Further, among these, a magnetic fluid obtained by suspending ultrafine particles of magnetite or ferrite in water or an organic solvent is preferably used in order to uniformly introduce the magnetic substance into the silica particles.

【００１８】＜シリカ粒子＞本発明の磁性担体に用いら
れるシリカ粒子はＳｉ（シリコン）とＯ（酸素）との結
合から成る重合体であって、例えば、シリカゲル、シリ
カガラス、酸化ケイ素、ケイ酸塩などを意味し、これら
の内でも、比表面積が比較的大きくその細孔構造の制御
も容易であることからシリカゲルが好ましく用いられ
る。また、これらの材料は、核酸等の抽出、吸着操作に
おいて不純物の影響をより少なくするために合成品であ
ることが好ましいが、天然品を精製して用いることもで
きる。<Silica Particles> The silica particles used in the magnetic carrier of the present invention are polymers comprising a bond of Si (silicon) and O (oxygen), such as silica gel, silica glass, silicon oxide, and silicate. Among these, silica gel is preferably used because of its relatively large specific surface area and easy control of its pore structure. In addition, these materials are preferably synthetic products in order to further reduce the influence of impurities in extraction and adsorption operations of nucleic acids and the like, but natural products can also be used after purification.

【００１９】シリカ粒子の平均粒径の範囲としては、１
〜２００μｍが好ましい。この範囲にあれば、シリカ粒
子への磁性体の導入量が多くなり、磁性担体を用いて分
離する際に短時間ですむし、また、実際の使用面におい
てもゲルが破壊されたりしにくく、形状を維持できる点
で好ましい。さらに、この効果に加え、試料を含む溶液
中での分散性がよく、実際の使用面でも沈降しにくいた
め撹拌などにより容易に分散性を確保することができる
ため、平均粒径が１〜２０μｍの範囲が好ましい。特
に、平均粒径が４〜２０μｍの範囲にあれば、粒子の大
きさが小さすぎず、実際の用途において試料を含む溶液
と本発明により最終的に得られる磁性担体とを分離する
際に容易に分離でき、磁石捕捉力、形状保持、溶液中で
の分散性、溶液との分離特性が優れたものとなり好まし
い。The range of the average particle size of the silica particles is 1
~ 200 µm is preferred. Within this range, the amount of the magnetic substance introduced into the silica particles is increased, so that a short time is required for separation using a magnetic carrier. Is preferable in that it can be maintained. Further, in addition to this effect, the dispersibility in the solution containing the sample is good, and it is difficult to settle even in the actual use surface, so that the dispersibility can be easily secured by stirring or the like, so that the average particle size is 1 to 20 μm. Is preferable. In particular, if the average particle size is in the range of 4 to 20 μm, the particle size is not too small, and it is easy to separate the solution containing the sample from the magnetic carrier finally obtained by the present invention in practical use. It is preferable because it has excellent magnet-capturing force, shape retention, dispersibility in a solution, and characteristics of separation from a solution.

【００２０】シリカ粒子の平均細孔径の範囲としては、
粒子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出の際の吸着
容量や吸着速度といった反応効率がよいために１〜２０
０ｎｍが好ましい。さらに、この効果に加え、実際の使
用に際して適度な強度を長期に渡って保つことができる
ために１〜１００ｎｍの範囲が好ましい。特に、１〜８
０ｎｍの範囲にあればさらに粒子の強度を長期に渡って
保つことができるため好ましい。The range of the average pore diameter of the silica particles is as follows:
1 to 20 due to good shape retention of particles and good reaction efficiency such as adsorption capacity and adsorption speed during adsorption and extraction.
0 nm is preferred. Further, in addition to this effect, the range of 1 to 100 nm is preferable because appropriate strength can be maintained for a long time in actual use. In particular, 1-8
It is preferable that the particle diameter is in the range of 0 nm because the strength of the particles can be maintained for a long period of time.

【００２１】シリカ粒子の細孔容積の範囲としては、粒
子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出の際の吸着容
量や吸着速度といった反応効率がよいために、乾燥重量
換算で、０．１〜２．５ｍｌ／ｇが好ましい。さらに、
この効果に加え、実際の使用に際して適度な強度を長期
に渡って保つことができるために０．１〜１．５ｍｌ／
ｇの範囲が好ましい。特に、０．１〜１．２ｍｌ／ｇの
範囲にあればさらに粒子の強度を長期に渡って保つこと
ができるため好ましい。The pore volume of the silica particles is preferably in the range of 0.1% in terms of dry weight because the shape retention of the particles is good and the reaction efficiency such as the adsorption capacity and the adsorption rate during adsorption and extraction is good. 1-2.5 ml / g is preferred. further,
In addition to this effect, it is possible to maintain an appropriate strength for a long period of time in actual use.
The range of g is preferred. In particular, it is preferable to be in the range of 0.1 to 1.2 ml / g because the strength of the particles can be maintained over a long period of time.

【００２２】シリカ粒子のＢＥＴ比表面積の範囲として
は、粒子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出の際の
吸着容量や吸着速度といった反応効率がよいために、乾
燥重量換算で、１０〜８００ｍ2／ｇが好ましい。さら
に、この効果に加え、実際の使用に際して適度な強度を
長期に渡って保つことができるために１０〜４００ｍ2
／ｇの範囲が好ましい。The range of the BET specific surface area of the silica particles is 10 to 10% in terms of dry weight because the shape retention of the particles is good and the reaction efficiency such as the adsorption capacity and the adsorption rate during adsorption and extraction is good. 800 m 2 / g is preferred. Furthermore, 10 to 400 m 2 for addition to this effect can be maintained for a long time the appropriate strength in actual use
/ G is preferred.

【００２３】＜磁性シリカ粒子＞本発明の磁性担体にお
いて用いられる磁性シリカ粒子は前記した磁性体及びシ
リカ粒子からなり、その製造方法については特に限定さ
れるものではない。例えば、ＳｉアルコキシドよりＳｉ
アルコキシドポリマーを生成させ、これに磁性体、アル
カリを加えてゲル化する方法、シリカゲル等のシリカ粒
子に磁性体を浸漬して付加する方法、磁性体にケイ酸ア
ルカリを加え、その後酸を加えてゲルを生成させる方
法、などが挙げられる。<Magnetic Silica Particles> The magnetic silica particles used in the magnetic carrier of the present invention are composed of the above-mentioned magnetic substance and silica particles, and the production method thereof is not particularly limited. For example, from Si alkoxide to Si
A method of generating an alkoxide polymer, gelling it by adding a magnetic substance and an alkali thereto, a method of immersing the magnetic substance in silica particles such as silica gel and adding it, adding an alkali silicate to the magnetic substance, and then adding an acid And a method of forming a gel.

【００２４】また、磁性シリカ粒子中の磁性体の含有量
としては、磁性シリカ粒子全量の５〜５０重量％の範囲
であることが好ましい。この範囲にあれば得られた磁性
シリカ粒子の磁性が十分となって用途面で優れた効果を
奏することができ、また、磁性体同士の凝集があまり強
くなく前記したシリカ粒子中に磁性体を均一に導入で
き、さらに、磁性シリカ粒子の球状化、多孔性の制御
や、粒子表面をポリアクリルアミドで修飾することが容
易となるため好ましい。さらに、磁性シリカ粒子中の磁
性体の含有量が５〜２５重量％の範囲にあれば、この効
果に加え、実際の使用に際して磁性シリカ粒子の磁性が
十分であり、添加する磁性体量を減らすことで、よりシ
リカ分の濃度が増え、粒子形状、多孔性など、より形状
の制御が容易になるために好ましい。The content of the magnetic substance in the magnetic silica particles is preferably in the range of 5 to 50% by weight based on the total amount of the magnetic silica particles. If the magnetic silica particles are in this range, the obtained magnetic silica particles have sufficient magnetism and can exhibit excellent effects in terms of application, and the aggregation of the magnetic materials is not so strong. It is preferable because it can be introduced uniformly, and furthermore, it becomes easy to control the spheroidization and porosity of the magnetic silica particles and to modify the particle surface with polyacrylamide. Further, when the content of the magnetic substance in the magnetic silica particles is in the range of 5 to 25% by weight, in addition to this effect, the magnetic properties of the magnetic silica particles are sufficient in actual use, and the amount of the magnetic substance to be added is reduced. This is preferable because the concentration of the silica content is further increased, and the shape, such as the particle shape and porosity, is more easily controlled.

【００２５】＜磁性担体＞本発明の磁性担体は、上記記
載の磁性シリカ粒子の表面に少なくともポリアクリルア
ミドが結合しているものであり、さらに詳しくいえば、
磁性シリカ粒子にアクリルアミド及び／又はポリアクリ
ルアミドを重合させつつ、磁性シリカ粒子の表面にアク
リルアミドやポリアクリルアミドを結合させたり、磁性
シリカ粒子にポリアクリルアミドを結合させることで得
られるものである。従って、最終的に得られる磁性担体
の表面には少なくともポリアクリルアミドを有する構造
となったものである。尚、ここでいう表面とは粒子の最
外面を意味するが、粒子がその内部に細孔を有する場合
には細孔内の表面も含む。<Magnetic Carrier> The magnetic carrier of the present invention is one in which at least polyacrylamide is bonded to the surface of the magnetic silica particles described above.
It is obtained by bonding acrylamide or polyacrylamide to the surface of the magnetic silica particles while polymerizing acrylamide and / or polyacrylamide on the magnetic silica particles, or bonding polyacrylamide to the magnetic silica particles. Therefore, the magnetic carrier finally obtained has a structure having at least polyacrylamide on the surface. The surface as used herein means the outermost surface of the particle, but when the particle has pores inside, the surface inside the pores is also included.

【００２６】本発明の磁性担体中のポリアクリルアミド
の含有量は、乾燥重量換算で、０．３〜５ｍｍｏｌ／ｇ
の範囲であることが好ましい。ここで、磁性担体中のポ
リアクリルアミドの含有量としては、磁性担体中のＮ
（窒素）を元素分析等により得、また、Ｎのモル量とモ
ノマーであるアクリルアミドのモル量が等しいことか
ら、磁性担体１ｇ中のＮのモル量として表されるもので
ある。従って、磁性担体中のポリアクリルアミドの含有
量とは、磁性担体に含まれるアクリルアミド及びポリア
クリルアミドの合計の量として示されるものである。こ
のポリアクリルアミドの含有量がこの範囲内にあれば、
導入量が適当であり、アクリルアミドやポリアクリルア
ミドのもつアミド基に由来する性質が十分に働き、かつ
アクリルアミドやポリアクリルアミドの量が多すぎず、
強度が使用に耐えることができ好ましい。さらに、この
効果に加え、実際の合成でのポリアクリルアミドの導入
量の再現性が高い、そのため吸着、抽出性能の再現性が
高いために０．５〜３．０ｍｍｏｌ／ｇの範囲にあるこ
とが好ましい。特に、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／ｇの範
囲にあれば、さらに吸着、抽出性能の安定性が高くなる
ため好ましい。The content of polyacrylamide in the magnetic carrier of the present invention is 0.3 to 5 mmol / g in terms of dry weight.
Is preferably within the range. Here, the content of polyacrylamide in the magnetic carrier is determined by the N content in the magnetic carrier.
(Nitrogen) is obtained by elemental analysis or the like, and since the molar amount of N is equal to the molar amount of acrylamide as a monomer, it is expressed as the molar amount of N in 1 g of the magnetic carrier. Therefore, the content of polyacrylamide in the magnetic carrier is indicated as the total amount of acrylamide and polyacrylamide contained in the magnetic carrier. If the content of this polyacrylamide is within this range,
The amount introduced is appropriate, the properties derived from the amide groups of acrylamide or polyacrylamide work well, and the amount of acrylamide or polyacrylamide is not too large,
The strength is preferable because it can withstand use. Furthermore, in addition to this effect, the reproducibility of the amount of polyacrylamide introduced in the actual synthesis is high. Therefore, the reproducibility of the adsorption and extraction performance is high, so that the content is in the range of 0.5 to 3.0 mmol / g. preferable. In particular, a range of 1.0 to 3.0 mmol / g is preferable because the stability of the adsorption and extraction performance is further increased.

【００２７】本発明の磁性担体の平均粒径の範囲として
は、１〜２００μｍが好ましい。この範囲にあれば、磁
性担体中の磁性体の導入量が多くなり、磁性担体を用い
て分離する際に短時間ですむし、また、実際の使用面に
おいてもゲルが破壊されたりしにくく、形状を維持でき
る点で好ましい。さらに、この効果に加え、試料を含む
溶液中での分散性がよく、実際の使用面でも沈降しにく
いため撹拌などにより容易に分散性を確保することがで
きるため、平均粒径が１〜２０μｍの範囲が好ましい。
特に、平均粒径が４〜２０μｍの範囲にあれば、粒子の
大きさが小さすぎず、実際の用途において試料を含む溶
液と本発明により最終的に得られる磁性担体とを分離す
る際に容易に分離でき、磁石捕捉力、形状保持、溶液中
での分散性、溶液との分離特性が優れたものとなり好ま
しい。The average particle size of the magnetic carrier of the present invention is preferably in the range of 1 to 200 μm. Within this range, the amount of the magnetic substance introduced into the magnetic carrier is increased, and a short time is required for separation using the magnetic carrier.Also, the gel is hardly destroyed even in the actual use surface, and the shape is reduced. Is preferable in that it can be maintained. Further, in addition to this effect, the dispersibility in the solution containing the sample is good, and it is difficult to settle even in the actual use surface, so that the dispersibility can be easily secured by stirring or the like, so that the average particle size is 1 to 20 μm. Is preferable.
In particular, if the average particle size is in the range of 4 to 20 μm, the particle size is not too small, and it is easy to separate the solution containing the sample from the magnetic carrier finally obtained by the present invention in practical use. It is preferable because it has excellent magnet-capturing force, shape retention, dispersibility in a solution, and characteristics of separation from a solution.

【００２８】本発明の磁性担体の平均細孔径の範囲とし
ては、粒子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出の際
の吸着容量や吸着速度といった反応効率がよいために１
〜２００ｎｍが好ましい。さらに、この効果に加え、実
際の使用に際して適度な強度を長期に渡って保つことが
できるために１〜１００ｎｍの範囲が好ましい。特に、
１〜８０ｎｍの範囲にあればさらに粒子の強度を長期に
渡って保つことができるため好ましい。The range of the average pore size of the magnetic carrier of the present invention is set to 1 because the shape retention of the particles is good and the reaction efficiency such as the adsorption capacity and the adsorption rate at the time of adsorption and extraction is good.
~ 200 nm is preferred. Further, in addition to this effect, the range of 1 to 100 nm is preferable because appropriate strength can be maintained for a long time in actual use. Especially,
It is preferable that the particle diameter is in the range of 1 to 80 nm because the strength of the particles can be maintained for a long period of time.

【００２９】本発明の磁性担体の細孔容積の範囲として
は、粒子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出の際の
吸着容量や吸着速度といった反応効率がよいために、乾
燥重量換算で、０．１〜２．５ｍｌ／ｇが好ましい。さ
らに、この効果に加え、実際の使用に際して適度な強度
を長期に渡って保つことができるために０．１〜１．５
ｍｌ／ｇの範囲が好ましい。特に、０．１〜１．２ｍｌ
／ｇの範囲にあればさらに粒子の強度を長期に渡って保
つことができるため好ましい。The range of the pore volume of the magnetic carrier of the present invention is good in terms of dry weight conversion because of good particle shape retention and high reaction efficiency such as adsorption capacity and adsorption rate during adsorption and extraction. , 0.1 to 2.5 ml / g is preferred. Further, in addition to this effect, it is possible to maintain an appropriate strength for a long period of time in actual use, so that 0.1 to 1.5
A range of ml / g is preferred. In particular, 0.1-1.2ml
/ G is preferable because the strength of the particles can be maintained over a long period of time.

【００３０】本発明の磁性担体のＢＥＴ比表面積の範囲
としては、粒子の形状保持性がよく、また、吸着、抽出
の際の吸着容量や吸着速度といった反応効率がよいため
に、乾燥重量換算で、１０〜８００ｍ2／ｇが好まし
い。さらに、この効果に加え、実際の使用に際して適度
な強度を長期に渡って保つことができるために１０〜４
００ｍ2／ｇの範囲が好ましい。The range of the BET specific surface area of the magnetic carrier of the present invention is determined in terms of dry weight, because the shape retention of particles is good and the reaction efficiency such as adsorption capacity and adsorption rate during adsorption and extraction is good. , 10 to 800 m 2 / g. Further, in addition to this effect, it is possible to maintain an appropriate strength for a long period of time in actual use.
A range of 00 m 2 / g is preferred.

【００３１】また、磁性担体中の磁性体の含有量として
は、磁性シリカ粒子中の磁性体含有量よりも導入された
ポリアクリルアミドの分だけ減少するものであり、通常
１０〜２０％程度減少する。The content of the magnetic substance in the magnetic carrier is reduced by the amount of the introduced polyacrylamide from the content of the magnetic substance in the magnetic silica particles, and usually decreases by about 10 to 20%. .

【００３２】本発明の磁性担体は核酸を吸着分離または
抽出するために使用することができる。吸着分離とは核
酸を磁性担体に吸着させて、反応溶液から分離すること
をいい、また、抽出とは核酸を磁性担体に吸着させた
後、核酸の吸着した磁性担体から核酸を溶出させて目的
の核酸を得る操作をいう。The magnetic carrier of the present invention can be used for separating or extracting nucleic acids by adsorption. Adsorption separation means that nucleic acids are adsorbed on a magnetic carrier and separated from the reaction solution, and extraction is a method in which nucleic acids are adsorbed on the magnetic carrier and then eluted from the magnetic carrier on which the nucleic acids are adsorbed. Refers to the operation of obtaining the nucleic acid.

【００３３】本発明の磁性担体を核酸を含む溶液中の核
酸の吸着分離又は抽出のために使用する際には、その平
均粒径の範囲としては、磁性担体の分散性が適度に生じ
て操作しやすくなり、また、分離性能にも優れることか
ら１〜２０μｍであることが好ましく、さらに１〜１５
μｍであることが好ましく、特に３〜１０μｍであるこ
とが好ましい。１μｍ未満の場合には、粒子が小さすぎ
るために分離の際に時間がかかり過ぎることがある。ま
た、２０μｍを超える場合には、核酸を含む溶液中での
分散安定性が低いために安定した性能を示さないことが
あり、さらに、２００μｍを超えるような大きな粒子で
は粒子がさらに沈降しやすくなって操作が煩雑となって
しまうことがある。When the magnetic carrier of the present invention is used for adsorptive separation or extraction of a nucleic acid in a solution containing the nucleic acid, the average particle size is set so that the dispersibility of the magnetic carrier is appropriately generated. It is preferable that the thickness is 1 to 20 μm because the separation is easy and the separation performance is excellent.
μm, particularly preferably 3 to 10 μm. If it is less than 1 μm, it may take too much time for separation because the particles are too small. On the other hand, if it exceeds 20 μm, stable performance may not be exhibited due to low dispersion stability in a solution containing nucleic acids. In addition, particles having a size larger than 200 μm are more likely to settle. Operation may be complicated.

【００３４】本発明の磁性担体を核酸吸着分離や抽出用
に使用し、高い性能と再現性を得るためには、ポリアク
リルアミドの含有量は、乾燥重量換算で、０．５〜５ｍ
ｍｏｌ／ｇであることが好ましい。このポリアクリルア
ミドの含有量がこの範囲にあれば、アクリルアミドやポ
リアクリルアミドのもつアミド基に由来する性質が十分
に働き、かつアクリルアミドやポリアクリルアミドの量
が多すぎず、強度が使用に耐えることができるので好ま
しい。さらに、ポリアクリルアミドの含有量が０．５〜
３．０ｍｍｏｌ／ｇの範囲にあれば、この効果に加え、
実際の合成でのポリアクリルアミドの導入量の再現性が
高い、そのため吸着、抽出性能の再現性が高いため好ま
しい。特に、１．０〜３．０ｍｍｏｌ／ｇの範囲にあれ
ば、さらに吸着、抽出性能の安定性が高くなるため好ま
しい。In order to use the magnetic carrier of the present invention for nucleic acid adsorption separation or extraction and to obtain high performance and reproducibility, the content of polyacrylamide should be 0.5 to 5 m in terms of dry weight.
mol / g is preferred. If the content of this polyacrylamide is in this range, the properties derived from the amide group of acrylamide or polyacrylamide work sufficiently, and the amount of acrylamide or polyacrylamide is not too large, and the strength can withstand use. It is preferred. Furthermore, the content of polyacrylamide is 0.5 to
In the range of 3.0 mmol / g, in addition to this effect,
This is preferable because the reproducibility of the amount of polyacrylamide introduced in the actual synthesis is high, and the reproducibility of the adsorption and extraction performance is high. In particular, a range of 1.0 to 3.0 mmol / g is preferable because the stability of the adsorption and extraction performance is further increased.

【００３５】本発明の磁性担体を核酸吸着分離や抽出用
に使用し、高い性能と再現性を得るためには、磁性担体
の表面の窒素原子の量が５原子％以上であることが好ま
しい。窒素原子の量がこの範囲にあれば、磁性担体の表
面がポリアクリルアミドでおおむね被覆され、吸着容量
等の性能が安定するため好ましい。さらに、窒素原子の
量が５〜１０原子％の範囲にあれば、この効果に加え、
核酸の吸着分離や抽出を実施する場合には分子が大きな
核酸に対しても磁性担体の表面が効果的に利用され、ま
た、ポリアクリルアミドが磁性担体の表面をおおむね被
覆しかつ余分に結合しすぎることもないため、ポリアク
リルアミドをより有効に使用できることとなるため好ま
しい。尚、磁性担体表面の窒素原子の量の測定は、例え
ば、Ｘ線光電子分光分析法等により測定することでよ
い。In order to use the magnetic carrier of the present invention for nucleic acid adsorption separation or extraction and to obtain high performance and reproducibility, the amount of nitrogen atoms on the surface of the magnetic carrier is preferably 5 atomic% or more. When the amount of nitrogen atoms is in this range, the surface of the magnetic carrier is generally covered with polyacrylamide, and the performance such as the adsorption capacity is stable, which is preferable. Further, if the amount of nitrogen atoms is in the range of 5 to 10 atomic%, in addition to this effect,
When performing adsorption separation or extraction of nucleic acids, the surface of the magnetic carrier is effectively used even for nucleic acids having large molecules, and polyacrylamide generally covers the surface of the magnetic carrier and is excessively bonded. This is preferable because polyacrylamide can be used more effectively. The amount of nitrogen atoms on the surface of the magnetic carrier may be measured by, for example, X-ray photoelectron spectroscopy.

【００３６】＜磁性担体の製造方法＞次に、本発明の磁
性担体の製造方法について説明するが、その製造方法
は、シリカ又はシリカ原料を反応させ、さらに磁性体
を付与して磁性シリカ粒子を得る工程：ａ）と、この
得られた磁性シリカ粒子にポリアクリルアミドを導入し
て磁性担体を得る工程：ｂ）〜ｅ）からなっており、以
下にこれらの工程を順に説明する。<Method for Producing Magnetic Carrier> Next, the method for producing the magnetic carrier of the present invention will be described. In the method for producing the magnetic carrier, silica or a silica raw material is reacted, and a magnetic substance is further provided to produce magnetic silica particles. Obtaining step: a) and steps of introducing a polyacrylamide into the obtained magnetic silica particles to obtain a magnetic carrier: b) to e). These steps will be described below in order.

【００３７】＜磁性シリカ粒子を得る工程＞本発明の
磁性担体に用いられる磁性シリカ粒子の製造方法は公知
の方法により実施できるが、以下の工程からなる製造方
法によりさらに容易に製造できる。<Step of Obtaining Magnetic Silica Particles> The method for producing magnetic silica particles used in the magnetic carrier of the present invention can be carried out by a known method, but can be more easily carried out by a production method comprising the following steps.

【００３８】１）Ｓｉアルコキシドを酸で加水分解しＳ
ｉアルコキシドポリマーを生成する工程 ２）アルコキシドポリマーに磁性体を加える工程 ３）アルコキシドポリマーと磁性体の混合溶液を水に分
散させ球状化し、アルカリと接触させてゲル化する工程 ４）ゲルを水洗後、溶媒置換し、乾燥させる工程 ここで、本発明の製造方法において使用されるＳｉアル
コキシドとしては、以下に示す製造方法において、加水
分解によりポリマーを生成するものであれば特に制限な
く用いることができ、例えば、Ｓｉ（ＯＣＨ3）4、Ｓｉ
（ＯＣ2Ｈ5）4、Ｓｉ（Ｏ−ｎ−Ｃ3Ｈ7）4、Ｓｉ（Ｏ−
ｉ−Ｃ3Ｈ7）4、Ｓｉ（Ｏ−ｎ−Ｃ4Ｈ9）4、Ｓｉ（Ｏ−
ｉ−Ｃ4Ｈ9）4等を挙げることができる。また、本発明
の製造方法においては、Ｓｉアルコキシドにさらに他の
金属アルコキシドを添加してもよい。1) Hydrolysis of Si alkoxide with acid to form S
i) a step of producing an alkoxide polymer 2) a step of adding a magnetic substance to the alkoxide polymer 3) a step of dispersing a mixed solution of the alkoxide polymer and the magnetic substance in water to form a sphere, and contacting with an alkali to gel the gel 4) , Solvent replacement and drying step Here, the Si alkoxide used in the production method of the present invention can be used without particular limitation as long as it produces a polymer by hydrolysis in the production method described below. , For example, Si (OCH 3 ) 4 , Si
(OC 2 H 5) 4, Si (O-n-C 3 H 7) 4, Si (O-
i-C 3 H 7) 4 , Si (O-n-C 4 H 9) 4, Si (O-
i-C 4 H 9) can be given 4 or the like. In the production method of the present invention, another metal alkoxide may be further added to the Si alkoxide.

【００３９】これらの工程において、まずＳｉのアルコ
キシドを酸性溶液中でゲル化しない程度に部分的に加水
分解する。酸性溶液としては酸、水および有機溶媒の混
合溶液が好ましい。In these steps, first, the alkoxide of Si is partially hydrolyzed in an acidic solution so as not to gel. As the acidic solution, a mixed solution of an acid, water and an organic solvent is preferable.

【００４０】Ｓｉアルコキシドの部分的加水分解後、次
に上記Ｓｉアルコキシド溶液を重合する。Ｓｉアルコキ
シドポリマーの重合度は水の量、重合温度、重合時間等
により制御することができる。Ｓｉアルコキシドポリマ
ーの重合度と粘度の間には相関があり、Ｓｉアルコキシ
ドポリマーの重合度が高くなるほど粘度は高くなる。Ｓ
ｉアルコキシドポリマーの重合度は室温における反応溶
液の粘度で１０センチポイズ以上でゲル化が起こらない
程度であればよい。例えば、ＪＩＳ−Ｋ−７１１７−１
９８７に準拠し、２５℃における粘度を測定することで
確認できる。After the partial hydrolysis of the Si alkoxide, the above Si alkoxide solution is polymerized. The polymerization degree of the Si alkoxide polymer can be controlled by the amount of water, the polymerization temperature, the polymerization time and the like. There is a correlation between the degree of polymerization of the Si alkoxide polymer and the viscosity, and the higher the degree of polymerization of the Si alkoxide polymer, the higher the viscosity. S
The degree of polymerization of the i-alkoxide polymer may be at least 10 centipoise as the viscosity of the reaction solution at room temperature and may be such that gelation does not occur. For example, JIS-K-7117-1
It can be confirmed by measuring the viscosity at 25 ° C. according to 987.

【００４１】得られたＳｉアルコキシドポリマー溶液は
そのままかあるいは有機溶媒で希釈する。有機溶媒で希
釈する場合のＳｉアルコキシドポリマーの濃度として
は、球状のゲルを得るために希釈された溶液全量に対し
て２０重量％以上であることが好ましい。The obtained Si alkoxide polymer solution is used as it is or diluted with an organic solvent. The concentration of the Si alkoxide polymer when diluted with an organic solvent is preferably 20% by weight or more based on the total amount of the solution diluted to obtain a spherical gel.

【００４２】なお、上記記載のように得られるＳｉアル
コキシドポリマーの代わりに市販のシリカ粒子をそのま
ま用いてもよい。In place of the Si alkoxide polymer obtained as described above, commercially available silica particles may be used as they are.

【００４３】次にＳｉアルコキシドポリマーに磁性体を
加える。使用される磁性体は水又は有機溶媒に分散させ
て懸濁液状又は溶液状としたものを使用できる。磁性体
としては、Ｓｉアルコキシドポリマーへの分散性の面か
ら磁性流体が好ましく用いられ、この磁性流体として
は、市販品等をそのままあるいは溶媒置換等を実施して
用いることができる。Next, a magnetic substance is added to the Si alkoxide polymer. The magnetic substance used may be a suspension or a solution dispersed in water or an organic solvent. As the magnetic material, a magnetic fluid is preferably used from the viewpoint of dispersibility in the Si alkoxide polymer. As the magnetic fluid, a commercially available product or the like can be used as it is or after performing solvent substitution or the like.

【００４４】次に、Ｓｉアルコキシドポリマー又はこれ
に希釈溶媒を加えた混合溶液と磁性体との混合液又は混
合物を、撹拌下に水中に分散させ球状化する。ここで、
この混合物を分散させる水へ界面活性剤、ポリビニルア
ルコール等の分散剤を添加してもよい。Next, a mixture or mixture of the Si alkoxide polymer or a mixed solution obtained by adding a diluting solvent thereto and a magnetic substance is dispersed in water with stirring to form a spheroid. here,
A dispersant such as a surfactant and polyvinyl alcohol may be added to water for dispersing the mixture.

【００４５】球状化後、上記記載の混合物へ塩基性物質
を添加してゲル化する。After spheroidization, a basic substance is added to the above-mentioned mixture to gel.

【００４６】生成したゲルは濾過、遠心分離等により分
離し、水洗後乾燥する。濾過、分離の方法としては公知
の方法を用いることができる。また、洗浄の際に使用す
る水としては、水、温水等の通常使用できる水であれば
良い。The formed gel is separated by filtration, centrifugation, etc., washed with water and dried. A known method can be used as a method of filtration and separation. The water used for washing may be any water that can be used normally, such as water or warm water.

【００４７】さらに、乾燥条件としては、ゲル内部及び
ゲル表面の水分を直接蒸発させるとゲルが収縮し、凝集
するため有機溶媒により置換後、乾燥される。Further, as the drying conditions, the gel shrinks and agglomerates when the moisture inside the gel and the surface of the gel are directly evaporated, so that the gel is replaced with an organic solvent and then dried.

【００４８】以上の手法により、本発明の磁性担体に用
いられる磁性シリカゲルが得られる。The magnetic silica gel used for the magnetic carrier of the present invention can be obtained by the above method.

【００４９】＜磁性シリカ粒子にポリアクリルアミド
を導入して磁性担体を得る工程＞磁性シリカ粒子より磁
性担体を得る工程としては、公知の方法により実施でき
るが、以下の工程からなる製造方法により、さらに容易
に製造できる。<Step of Obtaining Magnetic Carrier by Introducing Polyacrylamide into Magnetic Silica Particles> The step of obtaining a magnetic carrier from magnetic silica particles can be carried out by a known method. Can be easily manufactured.

【００５０】ｂ）磁性シリカ粒子とカップリング剤とを
反応させる工程 ｃ）工程ｂ）で得られたカップリング剤が導入された磁
性シリカ粒子を洗浄する工程 ｄ）工程ｃ）で得られた磁性シリカ粒子と、アクリルア
ミド及び／又はポリアクリルアミドとを反応させる工程 ｅ）工程ｄ）で得られた磁性シリカ粒子を洗浄し乾燥さ
せる工程 本発明において用いられる上記に記載したような磁性シ
リカ粒子は磁性体を含有したシリカ粒子であれば特に制
限されるものではない。B) a step of reacting the magnetic silica particles with the coupling agent c) a step of washing the magnetic silica particles into which the coupling agent obtained in step b) has been introduced d) a magnetic step obtained in step c) A step of reacting silica particles with acrylamide and / or polyacrylamide e) a step of washing and drying the magnetic silica particles obtained in step d) The magnetic silica particles used in the present invention as described above are magnetic substances There is no particular limitation as long as it is a silica particle containing.

【００５１】本発明の磁性担体は、磁性シリカ粒子の表
面にカップリング剤を反応させ、その後アクリルアミド
及び／又はポリアクリルアミドとを反応させて、磁性シ
リカ粒子にポリアクリルアミドを導入して得られるもの
である。The magnetic carrier of the present invention is obtained by reacting a coupling agent on the surface of magnetic silica particles and then reacting with acrylamide and / or polyacrylamide to introduce polyacrylamide into the magnetic silica particles. is there.

【００５２】ここで、本発明において使用されるカップ
リング剤としては、磁性シリカ粒子の表面にある式
（１）に示されるシラノール基と結合性を有し、かつア
クリルアミド及び／又はポリアクリルアミドと結合でき
るものであればよく、１つの化合物を用いても、２以上
の化合物を用いてもよい。さらに、本発明において使用
されるカップリング剤としては、磁性シリカ粒子に式
（２）に示されるビニル基、式（３）に示されるメタク
リル基、又は式（４）に示されるエポキシ基を導入する
ものであることが好ましく、導入されたこれらの官能基
と、式（５）に示されるアクリルアミドあるいは式
（６）に示されるポリアクリルアミドとを反応させるこ
とで最終的に本発明の磁性担体が得られる。ここで、ア
クリルアミドがモノマーとして２分子以上重合した化合
物をポリアクリルアミドとして示した。Here, the coupling agent used in the present invention has a binding property to the silanol group represented by the formula (1) on the surface of the magnetic silica particles and binds to acrylamide and / or polyacrylamide. Any compound that can be used may be used, and one compound or two or more compounds may be used. Further, as a coupling agent used in the present invention, a vinyl group represented by the formula (2), a methacryl group represented by the formula (3), or an epoxy group represented by the formula (4) is introduced into the magnetic silica particles. By reacting these introduced functional groups with acrylamide represented by the formula (5) or polyacrylamide represented by the formula (6), the magnetic carrier of the present invention is finally formed. can get. Here, a compound obtained by polymerizing two or more molecules of acrylamide as a monomer is shown as polyacrylamide.

【００５３】[0053]

【化１】 Embedded image

【００５４】[0054]

【化２】 Embedded image

【００５５】[0055]

【化３】 Embedded image

【００５６】[0056]

【化４】 Embedded image

【００５７】[0057]

【化５】 Embedded image

【００５８】[0058]

【化６】 Embedded image

【００５９】さらに具体的に本発明において用いられる
カップリング剤としては、カップリング剤が１つの化合
物の場合には、以下に示す製造方法において、アクリル
アミド及び／又はポリアクリルアミドと結合を形成する
ことができるものであれば特に制限なく用いることがで
き、例えば、ビニルトリクロロシラン、トリメトキシビ
ニルシラン、トリエトキシビニルシラン、トリス（２−
メトキシエトキシ）ビニルシラン、３−グリシドキシプ
ロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピ
ルトリメトキシシラン、ジエトキシ−３−グリシドキシ
プロピルメチルシラン等のビニル基、メタクリル基又は
エポキシ基を有したシランカップリング剤が好ましく用
いられる。これらのカップリング剤は単独で使用しても
２種以上を用いてもよい。More specifically, as the coupling agent used in the present invention, when the coupling agent is one compound, a bond with acrylamide and / or polyacrylamide may be formed by the following production method. Any material that can be used can be used without any particular limitation. For example, vinyltrichlorosilane, trimethoxyvinylsilane, triethoxyvinylsilane, tris (2-
(Methoxyethoxy) silane coupling having a vinyl group, methacryl group or epoxy group such as vinyl silane, 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane, 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, diethoxy-3-glycidoxypropylmethylsilane Agents are preferably used. These coupling agents may be used alone or in combination of two or more.

【００６０】また、カップリング剤が２以上の型の化合
物の場合には、磁性シリカ粒子表面のシラノールを介し
て誘導化するカップリング剤（Ａ）と、誘導化された磁
性シリカ粒子にビニル基、メタクリル基又はエポキシ基
を導入するためのカップリング剤（Ｂ）とを用い、これ
らを段階的に反応させる手法を用いてもよい。When the coupling agent is a compound of two or more types, the coupling agent (A) which is derivatized via silanol on the surface of the magnetic silica particles and the derivatized magnetic silica particles have a vinyl group. And a coupling agent (B) for introducing a methacryl group or an epoxy group, and a method of reacting these in a stepwise manner.

【００６１】これらのカップリング剤の内、本発明の磁
性担体をより容易に製造するためには、カップリング剤
として１つの化合物を用いることが好ましい。Among these coupling agents, in order to more easily produce the magnetic carrier of the present invention, it is preferable to use one compound as the coupling agent.

【００６２】製造にあたっては、まず、上記に記載した
磁性シリカ粒子を乾燥させ、吸着水を除去する。吸着水
はできるだけ除去することが好ましく、磁性シリカ粒子
中の水分量は５重量％以下まで乾燥させる。このシリカ
粒子とカップリング剤とを有機溶媒中にて混合し撹拌す
る。次いで、酸又は塩基を添加し、あるいは酸を添加後
引き続き塩基を添加し、磁性シリカ粒子とカップリング
剤の反応を行う。使用する有機溶媒としては、ベンゼ
ン、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン等の炭化水素
が好ましい。この反応の際に使用される酸としてはフェ
ノール、ギ酸、酢酸等の有機酸が挙げられる。また、使
用される塩基としては、アミン、尿素等の有機塩基性物
質が挙げられる。磁性シリカ粒子とカップリング剤を均
一に反応させるには、混合溶液を３０〜９０℃の範囲
で、３０分〜６時間撹拌させることで良い。In the production, first, the magnetic silica particles described above are dried to remove adsorbed water. The adsorbed water is preferably removed as much as possible, and the magnetic silica particles are dried to a water content of 5% by weight or less. The silica particles and the coupling agent are mixed and stirred in an organic solvent. Next, an acid or a base is added, or a base is added after the acid is added, and the reaction between the magnetic silica particles and the coupling agent is performed. As the organic solvent to be used, hydrocarbons such as benzene, toluene, hexane and cyclohexane are preferable. Examples of the acid used in this reaction include phenol, formic acid, acetic acid and other organic acids. Examples of the base used include organic basic substances such as amine and urea. In order to uniformly react the magnetic silica particles with the coupling agent, the mixed solution may be stirred at 30 to 90 ° C. for 30 minutes to 6 hours.

【００６３】次にカップリング剤が導入された磁性シリ
カ粒子を洗浄し、未反応のカップリング剤を除去する。
まず、カップリング剤が導入された磁性シリカ粒子は濾
過、遠心分離等により分離し、さらに、非水系の有機溶
媒を磁性シリカ粒子に添加し混合し、濾過、遠心分離等
により分離する操作を２〜５回行うことが好ましい。そ
して、工程ｃ）で使用する溶媒に分散させ、濾過、遠心
分離等により分離する操作を１〜４回行うことが好まし
い。濾過、分離の方法は公知の方法を用いることができ
る。Next, the magnetic silica particles into which the coupling agent has been introduced are washed to remove unreacted coupling agent.
First, the magnetic silica particles into which the coupling agent has been introduced are separated by filtration, centrifugation, etc., and further, a non-aqueous organic solvent is added to the magnetic silica particles, mixed, and separated by filtration, centrifugation, etc. It is preferable to carry out up to 5 times. Then, it is preferable that the operation of dispersing in the solvent used in step c) and separating by filtration, centrifugation or the like is performed 1 to 4 times. A known method can be used for the method of filtration and separation.

【００６４】次にカップリング剤で処理された磁性シリ
カ粒子とアクリルアミド及び／又はポリアクリルアミド
を反応させる。この場合、磁性シリカ粒子に直接アクリ
ルアミド及び／又はポリアクリルアミドを反応させるこ
ともできるが、以下に記載のように、アクリルアミド及
び／又はポリアクリルアミドを重合させつつ磁性シリカ
粒子と反応させることで、導入量を多くしたりポリアク
リルアミドの分子量を適切に制御することができるため
好ましい。さらにこの場合、製造がさらに容易となり、
また、磁性シリカ粒子にアクリルアミドが結合後、これ
より重合反応にて直鎖状のポリアクリルアミドが生成し
やすくなることが期待できるためにアクリルアミドを用
いて重合させることが好ましい。特に核酸を抽出する場
合には、核酸が直鎖状の分子であることからより好まし
くなることが期待できる。Next, acrylamide and / or polyacrylamide are reacted with the magnetic silica particles treated with the coupling agent. In this case, the acrylamide and / or polyacrylamide can be directly reacted with the magnetic silica particles. However, as described below, the amount of the acrylamide and / or polyacrylamide is allowed to react with the magnetic silica particles while being polymerized. And the molecular weight of polyacrylamide can be appropriately controlled. Furthermore, in this case, the production becomes easier,
Further, after acrylamide is bonded to the magnetic silica particles, it is expected that a linear polyacrylamide is likely to be generated by the polymerization reaction, so that it is preferable to polymerize using acrylamide. In particular, in the case of extracting a nucleic acid, it can be expected that the nucleic acid is more preferable because the nucleic acid is a linear molecule.

【００６５】アクリルアミドの磁性シリカ粒子への導入
反応はどのような重合反応であってもよいが、特にラジ
カル反応で行うことが好ましい。The reaction of introducing acrylamide into the magnetic silica particles may be any polymerization reaction, but is preferably performed by a radical reaction.

【００６６】ラジカル反応を行う場合、反応の際に用い
られる溶媒としては水又はアルコール、あるいは水とア
ルコールの混合溶液を使用することが好ましい。さらに
アルコールとしては水と溶解するものが好ましく、例え
ば、メタノール、エタノール、１−プロパノ−ル、２−
プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノールが挙げ
られる。また、反応雰囲気としては、脱酸素雰囲気、す
なわち溶存酸素濃度が低いことが好ましく、特に溶液中
の溶存酸素濃度が０〜１ｍｇ／リットルであることが好
ましい。When a radical reaction is performed, it is preferable to use water or alcohol, or a mixed solution of water and alcohol, as a solvent used in the reaction. Further, as the alcohol, those which dissolve in water are preferable. For example, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-
Examples include propanol, 1-butanol, and 2-butanol. The reaction atmosphere is preferably a deoxygenated atmosphere, that is, a low dissolved oxygen concentration, and particularly preferably a dissolved oxygen concentration in a solution of 0 to 1 mg / liter.

【００６７】反応にあたっては、磁性シリカ粒子と、ア
クリルアミド及び／又はポリアクリルアミドに、重合開
始剤を混合して反応を行わせる。重合開始剤としては、
単一開始剤系ではアゾビスイソブチロニトリルといった
アゾ系開始剤や過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウムと
いった無機系の過酸化物系開始剤や過酸化ベンゾイル、
過酸化ジ第三ブチルといった有機系の過酸化物系開始剤
等が挙げられる。また、２元開始剤系では過酸化水素と
第一鉄塩系の組み合わせなどが挙げられる。In the reaction, the magnetic silica particles, acrylamide and / or polyacrylamide are mixed with a polymerization initiator to cause a reaction. As the polymerization initiator,
In a single initiator system, azo initiators such as azobisisobutyronitrile, inorganic peroxide initiators such as potassium persulfate and ammonium persulfate, and benzoyl peroxide,
Organic peroxide-based initiators such as di-tert-butyl peroxide may be used. Further, in the case of the binary initiator system, a combination of hydrogen peroxide and a ferrous salt system may be used.

【００６８】また、磁性シリカ粒子にアクリルアミド及
び／又はポリアクリルアミドを均一に反応させるには、
カップリング剤で処理された磁性シリカ粒子とアクリル
アミド及び／又はポリアクリルアミドとラジカル開始剤
とを混合した溶液を３０〜９０℃の範囲で、３０分〜２
４時間撹拌させることでよい。この時反応後の溶液中の
ポリアクリルアミドの数平均分子量が１０００〜１００
００００であることが好ましい。反応後の溶液中のポリ
アクリルアミドの数平均分子量が１０００未満では、磁
性シリカ粒子に導入された官能基とアクリルアミド及び
／又はポリアクリルアミドとの反応が十分には起こって
いないことがあり、また、反応後の溶液中のポリアクリ
ルアミドの数平均分子量が１００００００を越えると反
応中に溶液の粘性が高くなりすぎて、これらを均一に磁
性シリカ粒子に導入することが困難となることがある。For uniformly reacting acrylamide and / or polyacrylamide with magnetic silica particles,
A solution obtained by mixing a magnetic silica particle treated with a coupling agent, acrylamide and / or polyacrylamide, and a radical initiator in a range of 30 to 90 ° C. for 30 minutes to 2 minutes
It may be stirred for 4 hours. At this time, the polyacrylamide in the solution after the reaction has a number average molecular weight of 1000 to 100.
0000 is preferred. If the number average molecular weight of the polyacrylamide in the solution after the reaction is less than 1000, the reaction between the functional group introduced into the magnetic silica particles and the acrylamide and / or polyacrylamide may not be sufficiently performed, and If the number average molecular weight of the polyacrylamide in the subsequent solution exceeds 1,000,000, the viscosity of the solution becomes too high during the reaction, and it may be difficult to uniformly introduce these into the magnetic silica particles.

【００６９】次に得られた磁性担体を洗浄し、非結合の
アクリルアミド、ポリアクリルアミドを除去する。この
磁性担体は濾過、遠心分離等により分離し、洗浄される
が、その方法としては公知の方法を用いることができ
る。また、洗浄の際に使用される溶媒としては、水、温
水等の通常使用できる水であればよいが、さらにメタノ
ール、エタノール、プロパノール等の親水性のアルコー
ルや、これらアルコールと水との混合溶液を用いること
もできる。この除去操作によって、非結合のアクリルア
ミド、ポリアクリルアミドを極力除去することで実際の
使用時に吸着対象物と非結合のアクリルアミド、ポリア
クリルアミドとの結合を避けることができ、さらに、磁
性シリカ粒子と結合しなかった非結合のアクリルアミ
ド、ポリアクリルアミドが磁性担体中に１ｐｐｍ以下と
なるようにすることが好ましい。Next, the obtained magnetic carrier is washed to remove unbound acrylamide and polyacrylamide. This magnetic carrier is separated and washed by filtration, centrifugation or the like, and a known method can be used as the method. The solvent used for washing may be any water that can be used normally, such as water or warm water, but may be a hydrophilic alcohol such as methanol, ethanol, or propanol, or a mixed solution of these alcohols and water. Can also be used. By this removal operation, non-bonded acrylamide and polyacrylamide can be removed as much as possible, so that the bond between the adsorption target and the non-bonded acrylamide and polyacrylamide can be avoided during actual use, and furthermore, the bond with the magnetic silica particles can be prevented. It is preferable that the amount of unbonded acrylamide and polyacrylamide is 1 ppm or less in the magnetic carrier.

【００７０】この洗浄された磁性担体を公知の方法によ
り乾燥すれば本発明の磁性担体を乾燥品として得ること
ができる。When the washed magnetic carrier is dried by a known method, the magnetic carrier of the present invention can be obtained as a dried product.

【００７１】さらに、乾燥処理の前に、溶媒置換を行っ
た後に乾燥してもよい。この理由は、ゲルの内部及びゲ
ル表面の水分を直接蒸発させるとゲルが収縮し、凝集し
たり、ゲルの破壊が起きることがあるからである。Further, before the drying treatment, the solvent may be replaced and then dried. The reason for this is that if the water inside the gel and on the surface of the gel is directly evaporated, the gel shrinks and may agglomerate or break the gel.

【００７２】溶媒置換の方法としては、ゲル中の水分を
有機溶媒で置換後、有機溶媒を加熱除去する方法であ
る。ここで用いられる有機溶媒としては、水より低表面
張力の溶媒が好ましく、水と任意の割合で溶けあうもの
が好ましい。ここで、水より低表面張力の溶媒とは、水
のＷｉｌｈｅｌｍ法による２５℃における空気に対する
表面張力が７２ｄｙｎ／ｃｍ（ｄｙｎ／ｃｍ＝１０-3Ｎ
ｍ-1）であることから、これより小さい表面張力を有す
る溶媒が選択できる。例えば、ホルムアミド、Ｎ，Ｎ−
ジメチルホルムアミド、エチレングリコール、プロピレ
ングリコール、メタノール、エタノール、１−プロパノ
ール、２−プロパノール、１−ブタノール、２−ブタノ
ール、１−ペンタノール、２−ペンタノール等が挙げら
れる。水、溶媒の留去は通常、常圧で行うが減圧下で行
ってもよい。The method of solvent replacement is a method of replacing water in the gel with an organic solvent and then removing the organic solvent by heating. As the organic solvent used here, a solvent having a lower surface tension than water is preferable, and a solvent that dissolves in water at an arbitrary ratio is preferable. Here, the solvent having a surface tension lower than that of water is defined as a water having a surface tension of 72 dyn / cm (dyn / cm = 10 −3 N) at 25 ° C. in air by the Wilhelm method.
m -1 ), a solvent having a surface tension smaller than this can be selected. For example, formamide, N, N-
Examples include dimethylformamide, ethylene glycol, propylene glycol, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 1-pentanol, 2-pentanol and the like. The distillation of water and the solvent is usually performed at normal pressure, but may be performed under reduced pressure.

【００７３】また、上記記載の工程において、ポリアク
リルアミドが導入された磁性シリカ粒子を洗浄し、その
後これを乾燥せずに洗浄後溶媒と同等の組成の溶液中に
て保存してもよい。Further, in the above-described step, the magnetic silica particles having polyacrylamide introduced therein may be washed, and thereafter, may be stored in a solution having the same composition as the solvent after washing without drying.

【００７４】このようにして得られる本発明の磁性担体
の表面のポリアクリルアミドの量を、前記したＸ線光電
子分光分析法等により窒素原子の量を指標とし、磁性シ
リカ粒子の一定量に対して導入するポリアクリルアミド
の量を増加させてもある磁性担体に導入されるポリアク
リルアミドの量は一定の量で飽和する。このことから、
本発明の磁性担体をにおいては、ある程度の量まではポ
リアクリルアミドが磁性シリカ粒子の表面に結合してい
くが、ある一定の到達すると磁性シリカ粒子の表面をほ
ぼ完全に覆ってしまうものと推察される。The amount of polyacrylamide on the surface of the magnetic carrier of the present invention obtained as described above is determined by using the amount of nitrogen atoms as an index by the above-mentioned X-ray photoelectron spectroscopy, etc. Even if the amount of polyacrylamide to be introduced is increased, the amount of polyacrylamide introduced to a certain magnetic carrier is saturated at a certain amount. From this,
In the magnetic carrier of the present invention, polyacrylamide is bound to the surface of the magnetic silica particles up to a certain amount, but it is presumed that when a certain amount is reached, the surface of the magnetic silica particles is almost completely covered. You.

【００７５】以上により、本発明の磁性担体を得ること
ができる。As described above, the magnetic carrier of the present invention can be obtained.

【００７６】本発明の磁性担体は種々の糖類、疎水性を
有する低分子の有機化合物、核酸類などの吸着、抽出用
として使用することができると共に、核酸類、糖類の分
析等の各種の測定法やアフィニティークロマトグラフィ
ー等による種々の糖類、疎水性を有する低分子の有機化
合物、核酸類などの分離手段などに用いられる担体とし
て使用することもできる。The magnetic carrier of the present invention can be used for adsorption and extraction of various sugars, hydrophobic low-molecular organic compounds, nucleic acids, etc., and various measurements such as analysis of nucleic acids and sugars. It can also be used as a carrier used for separation means for various saccharides, hydrophobic low-molecular organic compounds, nucleic acids, etc. by the method and affinity chromatography.

【００７７】特に、核酸類の吸着や抽出用として使用す
る際には、本発明の磁性担体を用い、これと核酸類が含
まれる試料とを混合し、試料中の核酸を磁性担体に吸着
させた後、磁力を利用して磁性担体と試料とを分離する
ことで容易に核酸を抽出することができ、抽出処理され
た磁性担体に核酸を脱着させる溶液、例えば水を加えて
核酸を脱着させ、核酸を分離することができる。その後
分離された核酸は、直接、あるいはポリメレースチェー
ンリアクションにより核酸の量を増幅させてその量を測
定することができる。In particular, when used for adsorption or extraction of nucleic acids, the magnetic carrier of the present invention is used, and this is mixed with a sample containing nucleic acids, and the nucleic acid in the sample is adsorbed on the magnetic carrier. After that, the nucleic acid can be easily extracted by separating the magnetic carrier and the sample by using a magnetic force, and a solution for desorbing the nucleic acid to the extracted magnetic carrier, for example, water is added to desorb the nucleic acid. , Nucleic acids can be separated. Thereafter, the separated nucleic acid can be measured directly or by amplifying the amount of the nucleic acid by polymerase chain reaction.

【００７８】このように、本発明の磁性担体は、核酸類
の吸着、抽出用として有用であるが、これはポリアクリ
ルアミドを担体の表面に有しているため、核酸類と相互
作用しうるアミド基等の極性を有する官能基が担体の表
面近傍のみに導入されているのではなく、高分子のポリ
アクリルアミドとして担体から離れた位置にも担体と結
合した状態にて存在し、その結果、高分子の核酸等との
相互作用する作用点が多くなり、また、一旦形成された
相互作用関係を高分子のポリアクリルアミドとの重なり
合いにより、より強く保持されることとなるからと推察
される。しかしながら、このような推察は本発明をなん
ら拘束するものではない。As described above, the magnetic carrier of the present invention is useful for adsorbing and extracting nucleic acids, but since it has polyacrylamide on the surface of the carrier, it can interact with nucleic acids. A polar functional group such as a group is not introduced only near the surface of the carrier, but also exists as a high molecular weight polyacrylamide at a position distant from the carrier in a state bonded to the carrier. It is presumed that the number of action points at which the molecule interacts with the nucleic acid or the like increases, and the interaction relationship once formed is more strongly retained by the overlap with the high-molecular polyacrylamide. However, such a presumption does not restrict the present invention at all.

【００７９】[0079]

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、これらに実施例により本発明はなんら限定さ
れるものでない。なお、各評価は以下に示した方法によ
って実施した。The present invention will be described in more detail with reference to the following Examples, which should not be construed as limiting the invention thereto. In addition, each evaluation was implemented by the method shown below.

【００８０】実施例で使用した磁性シリカ粒子につい
て、その磁気ヒステリシスを振動試料型磁力計（ＶＳ
Ｍ）（理研電子製、型式：ＢＨＶ−５０）を用いて、そ
の磁気ヒステリシスを測定したところ、超常磁性を示す
ものであった。The magnetic hysteresis of the magnetic silica particles used in the examples was measured using a vibrating sample magnetometer (VS).
M) When its magnetic hysteresis was measured using (manufactured by Riken Denshi, model: BHV-50), it showed superparamagnetism.

【００８１】〜磁性体の含有量〜 Ｓｉについては、磁性シリカ粒子を王水により分解後、
過塩素酸処理し、重量法により測定した。Ｆｅ（鉄）に
ついては、硝酸・フッ化水素酸により分解後、過塩素酸
処理し、ＩＣＰ発光法により測定した。-Content of Magnetic Substance-As for Si, magnetic silica particles are decomposed by aqua regia,
It was treated with perchloric acid and measured by a gravimetric method. Fe (iron) was decomposed with nitric acid / hydrofluoric acid, treated with perchloric acid, and measured by ICP emission method.

【００８２】〜平均粒径〜 サンプルを水に分散させたものを、粒度分布測定装置Ｌ
Ｓ−１３０（ＣＯＵＬＴＥＲ社製）で測定し、体積平均
粒径として示した。-Average Particle Size- A sample obtained by dispersing a sample in water is measured using a particle size distribution measuring device L.
It was measured by S-130 (manufactured by COULTER) and expressed as a volume average particle size.

【００８３】〜平均細孔径及び細孔容積〜 ポアサイザ９３２０（ＭＩＣＲＯＭＥＲＩＴＩＣＳ社
製）を用い、水銀圧入法により０〜２０７ＭＰａの圧力
範囲で測定した。-Average pore diameter and pore volume- Using a pore sizer 9320 (manufactured by MICROMERITICS), measurement was carried out by a mercury intrusion method in a pressure range of 0 to 207 MPa.

【００８４】〜ＢＥＴ比表面積〜 ＭＯＮＯＳＯＲＢ（米国ＱＵＡＮＴＡＣＨＲＯＭＥ社
製）を用い、ＢＥＴ式１点法により測定した。BET Specific Surface Area Bone specific surface area was measured using MONOSORB (manufactured by QUANTACHROME, USA) by the BET one-point method.

【００８５】〜表面分析〜 Ｘ線光電子分光分析装置（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製、ＥＳＣＡ５４００ＭＣ）により、サンプルの粒子の
表面のＦｅ、Ｓｉ、Ｎ、Ｃ、Ｏを分析した。表面の元素
の組成（原子％）はＦｅ、Ｓｉ、Ｎ、Ｃ、Ｏの総量を１
００原子％として計算した。Surface Analysis Fe, Si, N, C, and O on the surface of the sample particles were analyzed using an X-ray photoelectron spectrometer (ESCA5400MC, manufactured by Perkin-Elmer). The composition (atomic%) of the elements on the surface is such that the total amount of Fe, Si, N, C, and O is 1
Calculated as 00 atomic%.

【００８６】〜Ｎ量（ポリアクリルアミドの含有量）の
分析〜 元素分析装置を使用し、Ｎ量を測定した。Analysis of N Content (Polyacrylamide Content) The N content was measured using an elemental analyzer.

【００８７】〜溶存酸素濃度〜 溶存酸素濃度計ＵＣ−１２（セントラル科学社製）を使
用し、反応溶液中の溶存酸素濃度を測定した。-Dissolved oxygen concentration- The dissolved oxygen concentration in the reaction solution was measured using a dissolved oxygen concentration meter UC-12 (manufactured by Central Science Co., Ltd.).

【００８８】〜ポリアクリルアミドの重合度の分析〜 高速液体クロマトグラフィーの装置一式（ＡＳ−８００
０、ＣＣＰＭ、ＣＯ−８０１０、ＲＩ−８０１０、ＳＣ
−８０１０（いずれも東ソー製））を用いて、ポリアク
リルアミドの重合度を測定し、数平均分子量として示し
た。分子量の決定のための標準試料としては、スタンダ
ードポリエチレンオキシドキット（東ソー製）を使用し
た。-Analysis of Degree of Polymerization of Polyacrylamide- High-Performance Liquid Chromatography Apparatus (AS-800
0, CCPM, CO-8010, RI-8010, SC
The degree of polymerization of polyacrylamide was measured using -8010 (both manufactured by Tosoh Corporation), and indicated as a number average molecular weight. As a standard sample for determining the molecular weight, a standard polyethylene oxide kit (manufactured by Tosoh Corporation) was used.

【００８９】〜核酸抽出性能の標準評価方法〜 核酸としてはｐＡＷ １０９ ＤＮＡ（ＰＥＲＫＩＮ
ＥＬＭＥＲ）を使用し、試料濃度は２×１０7分子／ｍ
ｌとした。Standard Evaluation Method for Nucleic Acid Extraction Performance As nucleic acids, pAW109 DNA (PERKIN
ELMER) and the sample concentration is 2 × 10 7 molecules / m
l.

【００９０】核酸試料溶液２００μｌに対して４００μ
ｌの下記固相抽出液を加えて室温にて１０分間撹拌した
後、磁石を用いて磁性担体を容器の端に集め、溶液部分
を吸引除去した。残ったゲルに０．４ｍｌの洗浄液（４
０ｖｏｌ％イソプロパノール水溶液）を加えて再懸濁さ
せた。再び磁石を用いてゲルを容器の端に集め溶液部分
を吸引除去した後、磁性担体を２００μｌの溶出液
（水）に懸濁し、磁石を用いてゲルを容器の端に集めた
時の容器溶液を吸い出し、溶液を減圧乾燥して固形分を
得た。この固形分を２００μｌの水に再溶解させた。こ
の溶液５０μｌについて以下で示される手順によりポリ
メレースチェインリアクション（以下、「ＰＣＲ」と略
して表す）を行った。400 μl per 200 μl of nucleic acid sample solution
After adding 1 l of the following solid phase extract and stirring at room temperature for 10 minutes, the magnetic carrier was collected at the end of the container using a magnet, and the solution portion was removed by suction. 0.4 ml of the washing solution (4
(0 vol% isopropanol aqueous solution). After the gel was again collected at the end of the container using a magnet and the solution portion was removed by suction, the magnetic carrier was suspended in 200 μl of eluate (water), and the container solution when the gel was collected at the end of the container using a magnet. Was sucked out and the solution was dried under reduced pressure to obtain a solid content. This solid was redissolved in 200 μl of water. Polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as “PCR”) was performed on 50 μl of this solution according to the following procedure.

【００９１】すなわち、固相抽出液として、磁性担体
２．５ｍｇ／ｍｌと５０ｖｏｌ％イソプロパノール水溶
液とを混合し、２種のプライマー（以下の、配列番号１
及び２であり、ＰＣＲ反応液組成中、配列番号１の核酸
は０．２μＭ−ＦｏｗａｒｄＰｒｉｍｅｒ ＤＭ １５
１、配列番号２の核酸は０．２μＭ−ＲｅｖｅｒｓｅＰ
ｒｉｍｅｒ ＤＭ １５２、他の組成は２．２ｍＭ−Ｍ
ｇＣｌ2、０．２９ｍＭ−ｄＮＴＰ、Ｔａｑポリメレー
ス（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌｄ）２．２５ｕｎｉｔ
／７５μｌ）を使用し、９５℃で１０分４５秒温置し、
その後９５℃で１５秒及び６０℃で３０秒のサイクルを
４５サイクル繰り返す。その後、７２℃で７分の条件で
ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ終了後、反応液の一部をアガ
ロース電気泳動に供し、目的サイズのバンドの有無につ
いて目視で判定した。That is, as a solid phase extract, 2.5 mg / ml of a magnetic carrier and a 50 vol% aqueous solution of isopropanol were mixed, and two kinds of primers (the following, SEQ ID NO: 1)
And 2, in the composition of the PCR reaction solution, the nucleic acid of SEQ ID NO: 1 was 0.2 μM-Fward Primer DM 15
1, the nucleic acid of SEQ ID NO: 2 is 0.2 μM-ReverseP
rimer DM 152, other composition is 2.2 mM-M
gCl 2, 0.29mM-dNTP, Taq polymerase (Ampli Taq Gold) 2.25unit
/ 75 μl) and incubated at 95 ° C. for 10 minutes 45 seconds,
Thereafter, a cycle of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 30 seconds is repeated 45 times. Thereafter, PCR was performed at 72 ° C. for 7 minutes. After completion of the PCR, a part of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and the presence or absence of a band of a desired size was visually determined.

【００９２】各サンプルに対し上記の抽出試験を１０回
行った。核酸の抽出（目的サイズのバンド）を確認した
割合を以下に示す検出率として表し核酸抽出性能とし
た。The above-mentioned extraction test was performed 10 times for each sample. The ratio at which the extraction of the nucleic acid (the band of the target size) was confirmed was expressed as the detection rate shown below, and the nucleic acid extraction performance was used.

【００９３】検出率（％）＝（（抽出試験で核酸の抽出
を確認した回数）／（抽出試験回数））×１００ 実施例１ Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）4 １５０．０ｇとエタノール ６
２．７ｇの混合溶液を４０℃で３０分撹拌した。この混
合溶液を４０℃で撹拌しながら１／１００Ｎ−塩酸水溶
液 １４．９ｇを滴下した。この溶液を１時間撹拌した
後、９０℃で４時間、さらに１６５℃で１２時間撹拌し
て留出物を除去し、Ｓｉアルコキシドポリマーを得た。
この操作は窒素雰囲気中で行なった。得られたＳｉアル
コキシドポリマーの粘度を前記した方法により測定した
ところ、粘度は室温で５０センチポイズであった。得ら
れたＳｉアルコキシドポリマーのうち７０．０ｇを１−
ペンタノール７０．０ｇに溶解した。この溶液に市販の
磁性流体（（株）フェローテック製、：全量に対して、
磁性体量３５重量％、界面活性剤量１０重量％、１−ブ
タノール溶液含有） ２０ｍｌを添加し、均一溶液を得
た。この溶液を撹拌しながら８０℃の５％ポリビニルア
ルコール水溶液 ５６０．０ｇに投入した。３０分撹拌
後、５重量％のＮＨ4ＯＨ水溶液 １２．５ｍｌを加
え、８０℃で３時間撹拌した。得られた懸濁液を７０℃
の温水 １０００ｍｌに投入し、固体を濾取後、温水で
洗浄した。洗浄後、溶媒を２−プロパノールで３回置換
し、真空乾燥し、球状の磁性シリカ粒子を得た。Detection rate (%) = ((number of times that extraction of nucleic acid was confirmed in extraction test) / (number of times of extraction test)) × 100 Example 1 150.0 g of Si (OC 2 H 5 ) 4 and ethanol 6
2.7 g of the mixed solution was stirred at 40 ° C. for 30 minutes. While stirring this mixed solution at 40 ° C., 14.9 g of a 1/100 N aqueous hydrochloric acid solution was added dropwise. After stirring the solution for 1 hour, the mixture was stirred at 90 ° C. for 4 hours and further at 165 ° C. for 12 hours to remove distillate, thereby obtaining a Si alkoxide polymer.
This operation was performed in a nitrogen atmosphere. When the viscosity of the obtained Si alkoxide polymer was measured by the method described above, the viscosity was 50 centipoise at room temperature. 70.0 g of the obtained Si alkoxide polymer was 1-
Dissolved in 70.0 g of pentanol. To this solution, a commercially available magnetic fluid (manufactured by Ferrotec Co., Ltd .:
20 ml of a magnetic substance amount of 35% by weight, a surfactant amount of 10% by weight, and a 1-butanol solution were added to obtain a uniform solution. This solution was added to 560.0 g of a 5% aqueous solution of polyvinyl alcohol at 80 ° C. while stirring. After stirring for 30 minutes, 12.5 ml of a 5% by weight aqueous NH 4 OH solution was added, and the mixture was stirred at 80 ° C. for 3 hours. 70 ° C.
Was added to 1000 ml of warm water, and the solid was collected by filtration and washed with warm water. After washing, the solvent was replaced with 2-propanol three times and dried under vacuum to obtain spherical magnetic silica particles.

【００９４】この磁性シリカ粒子１０ｇを１５０℃で１
５時間乾燥させ、トルエン１００ｍｌ中に加えて撹拌し
た。さらに、その溶液中に、３−メタクリロキシプロピ
ルトリメトキシシランを４ｍｌ、ジメチルアミノエタノ
ール０．７ｍｌ、フェノール５０μｌを添加して撹拌し
た。この溶液を、８５℃で３時間撹拌後、濾過し、３−
メタクリル基を有する磁性シリカ粒子を得た。これをト
ルエン５０ｍｌで洗浄し濾過を２回行い、その後、メタ
ノール５０ｍｌで洗浄し濾過を３回行い、さらに、４０
体積％メタノール水溶液５０ｍｌで洗浄し濾過を２回行
った。この磁性シリカ粒子を４０体積％メタノール水溶
液１００ｍｌに加え、撹拌した。さらに、その溶液にア
クリルアミドモノマーを９ｇと、過硫酸カリウム０．３
ｇを添加して撹拌して混合した。この溶液を５０ｍｌ／
分のＮ2流通中で、６０℃、１５時間撹拌する。次に温
水２００ｍｌを加えて、反応溶液を遠心分離し、ポリア
クリルアミドで修飾した磁性担体を含む沈殿を得た。こ
れを温水１００ｍｌで洗浄し濾過を４回行い、さらに、
２−プロパノール５０ｍｌで置換し濾過を３回行い、真
空乾燥し、磁性担体を得た。10 g of the magnetic silica particles were heated at 150 ° C. for 1 hour.
It was dried for 5 hours, added to 100 ml of toluene and stirred. Further, 4 ml of 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, 0.7 ml of dimethylaminoethanol and 50 μl of phenol were added to the solution and stirred. The solution was stirred at 85 ° C. for 3 hours, and then filtered.
Magnetic silica particles having a methacryl group were obtained. This was washed with 50 ml of toluene and filtered twice, and then washed with 50 ml of methanol and filtered three times.
After washing with 50 ml of a volume% aqueous methanol solution, filtration was performed twice. The magnetic silica particles were added to 100 ml of a 40% by volume aqueous methanol solution and stirred. Further, 9 g of acrylamide monomer and 0.3% of potassium persulfate were added to the solution.
g was added and mixed by stirring. 50 ml of this solution
The mixture is stirred at 60 ° C. for 15 hours in a N 2 flow. Next, 200 ml of warm water was added, and the reaction solution was centrifuged to obtain a precipitate containing a magnetic carrier modified with polyacrylamide. This was washed with 100 ml of warm water and filtered four times.
The mixture was replaced with 50 ml of 2-propanol, filtered three times, and dried under vacuum to obtain a magnetic carrier.

【００９５】得られた磁性担体中のポリアクリルアミド
の含有量（アクリルアミドモノマーとしてのモル量）、
粒径、表面の窒素原子の量、水銀圧入法による平均細孔
径、細孔容積等および反応溶液中のポリアクリルアミド
の平均分子量、反応溶液中の溶存酸素濃度を前記の方法
により測定し、その結果を表１に示した。また、得られ
た磁性担体を使用し、核酸の抽出性能の評価を前記の方
法により行った。その結果を表２に示す。この磁性担体
では目的サイズのバンドが確認され、核酸抽出性能が確
認された。また、検出率も１００％であり、再現性よ
く、核酸抽出が行われていることが確認された。The content of polyacrylamide in the obtained magnetic carrier (molar amount as acrylamide monomer),
The particle diameter, the amount of nitrogen atoms on the surface, the average pore diameter by the mercury intrusion method, the pore volume, etc. and the average molecular weight of polyacrylamide in the reaction solution, the dissolved oxygen concentration in the reaction solution were measured by the methods described above, and the results were measured. Are shown in Table 1. Using the obtained magnetic carrier, the nucleic acid extraction performance was evaluated by the above method. Table 2 shows the results. In this magnetic carrier, a band of the target size was confirmed, and the nucleic acid extraction performance was confirmed. In addition, the detection rate was 100%, and it was confirmed that nucleic acid extraction was performed with good reproducibility.

【００９６】[0096]

【表１】 [Table 1]

【００９７】[0097]

【表２】 [Table 2]

【００９８】実施例２ ３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランをトリ
エトキシビニルシランにした以外は実施例１と同様に
し、ポリアクリルアミドを結合させた磁性シリカ粒子
（磁性担体）を得た。得られた磁性担体中のポリアクリ
ルアミドのアクリルアミドモノマーとしてのモル量は乾
燥重量換算で１．４ｍｍｏｌ／ｇであった。得られた磁
性担体を実施例１と同様の方法により測定し、その結果
を表１に示した。また、得られた磁性担体を使用し、核
酸の抽出性能の評価を実施例１と同様の方法により行っ
た。その結果を表２に示す。この磁性担体では性能評価
試験で目的サイズのバンドが確認され、核酸抽出性能が
確認された。また、検出率も１００％であり、再現性よ
く、核酸抽出が行われていることが確認された。Example 2 In the same manner as in Example 1 except that 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane was changed to triethoxyvinylsilane, magnetic silica particles (magnetic carrier) bonded with polyacrylamide were obtained. The molar amount of polyacrylamide as acrylamide monomer in the obtained magnetic carrier was 1.4 mmol / g in terms of dry weight. The obtained magnetic carrier was measured in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Table 1. Using the obtained magnetic carrier, the nucleic acid extraction performance was evaluated in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results. In this magnetic carrier, a band of the target size was confirmed in the performance evaluation test, and the nucleic acid extraction performance was confirmed. In addition, the detection rate was 100%, and it was confirmed that nucleic acid extraction was performed with good reproducibility.

【００９９】実施例３ ３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシランをジメ
トキシ−３−グリシドキシプロピルメチルシランにした
以外は実施例１と同様にし、ポリアクリルアミドを結合
させた磁性シリカ粒子（磁性担体）を得た。得られた磁
性担体中のポリアクリルアミドのアクリルアミドモノマ
ーとしてのモル量は乾燥重量換算で３．５ｍｍｏｌ／ｇ
であった。得られた磁性担体を実施例１と同様の方法に
より測定し、その結果を表１に示した。また、得られた
磁性担体を使用し、核酸の抽出性能の評価を実施例１と
同様の方法により行った。その結果を表２に示す。この
磁性担体では性能評価試験で目的サイズのバンドが確認
され、核酸抽出性能が確認された。また、検出率も１０
０％であり、再現性よく、核酸抽出が行われていること
が確認された。Example 3 The same procedure as in Example 1 was carried out except that dimethoxy-3-glycidoxypropylmethylsilane was used instead of 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane, and magnetic silica particles (magnetic carrier) bonded with polyacrylamide were used. Obtained. The molar amount of polyacrylamide as acrylamide monomer in the obtained magnetic carrier was 3.5 mmol / g in terms of dry weight.
Met. The obtained magnetic carrier was measured in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Table 1. Using the obtained magnetic carrier, the nucleic acid extraction performance was evaluated in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results. In this magnetic carrier, a band of the target size was confirmed in the performance evaluation test, and the nucleic acid extraction performance was confirmed. In addition, the detection rate is 10
It was 0%, and it was confirmed that nucleic acid extraction was performed with good reproducibility.

【０１００】比較例１ 実施例１と同様にして得た、カップリング剤を導入して
いない磁性シリカ粒子をそのまま用い、核酸の抽出性能
の評価を実施例１と同様の方法により行った。その結果
を表１に示す。核酸の抽出は確認されたが、目的サイズ
のバンドの濃さが薄く、また、検出率が２０％と再現性
が悪く、性能は不安定であった。Comparative Example 1 Using the magnetic silica particles obtained in the same manner as in Example 1 and having no coupling agent introduced therein, the nucleic acid extraction performance was evaluated in the same manner as in Example 1. Table 1 shows the results. Extraction of the nucleic acid was confirmed, but the band of the target size was low in density, and the detection rate was 20%, which was poor in reproducibility and unstable in performance.

【０１０１】比較例２ 比較例１の磁性シリカ粒子を実施例１と同様にして、カ
ップリング剤である３−メタクリロキシプロピルトリメ
トキシシランを用いて３−メタクリル基を導入した磁性
シリカ粒子（表１にその特性を示す）をそのまま用い、
核酸の抽出性能の評価を実施例１と同様の方法により行
った。その結果を表２に示す。核酸の抽出は確認されず
検出率０％であった。Comparative Example 2 The magnetic silica particles of Comparative Example 1 were treated in the same manner as in Example 1 by introducing 3-methacrylic groups using 3-methacryloxypropyltrimethoxysilane as a coupling agent. 1 whose properties are shown)
Evaluation of nucleic acid extraction performance was performed in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results. No nucleic acid extraction was confirmed, and the detection rate was 0%.

【０１０２】比較例１、２と実施例とを比較すると、ポ
リアクリルアミドが導入されていない磁性シリカ粒子で
は核酸の抽出効率が低く、さらに磁性シリカ粒子に３−
メタクリル基を導入することで核酸の抽出効率がいっそ
う低下すること、そして、この粒子にポリアクリルアミ
ドを導入することで核酸抽出性能を獲得できることが分
かる。Comparison between Comparative Examples 1 and 2 and the Examples shows that magnetic silica particles into which polyacrylamide has not been introduced have a low nucleic acid extraction efficiency.
It can be seen that the efficiency of nucleic acid extraction is further reduced by introducing a methacryl group, and that nucleic acid extraction performance can be obtained by introducing polyacrylamide into the particles.

【０１０３】比較例３ ３−メタクリル基を導入した磁性シリカ粒子（表１にそ
の特性を示す）とアクリルアミドの反応を大気中で行う
以外は実施例１と同様にし、ポリアクリルアミドを結合
させた磁性シリカ粒子を得た。得られた磁性担体を実施
例１と同様の方法により測定し、その結果を表１に示し
た。得られた磁性担体中のポリアクリルアミドのアクリ
ルアミドモノマーとしてのモル量は乾燥重量換算で０．
２ｍｍｏｌ／ｇであり、ポリアクリルアミドの導入量は
少なかった。また、表面のＮの濃度も１．３原子％であ
り、少なかった。また、得られた磁性担体を使用し、核
酸の抽出性能の評価を実施例１と同様の方法により行っ
た。その結果を表２に示す。この磁性担体では目的サイ
ズのバンドが確認され、核酸の抽出は確認されたが、検
出率が２０％と再現性が悪く、性能は不安定であった。Comparative Example 3 The same procedure as in Example 1 was carried out except that the reaction of the acrylamide with the magnetic silica particles having 3-methacrylic group introduced therein (the characteristics are shown in Table 1) was carried out in the air, and the magnetic properties of the polyacrylamide-bonded magnet Silica particles were obtained. The obtained magnetic carrier was measured in the same manner as in Example 1, and the results are shown in Table 1. The molar amount of polyacrylamide in the obtained magnetic carrier as an acrylamide monomer was 0.1 in terms of dry weight.
2 mmol / g, and the amount of polyacrylamide introduced was small. Further, the concentration of N on the surface was 1.3 atomic%, which was low. Using the obtained magnetic carrier, the nucleic acid extraction performance was evaluated in the same manner as in Example 1. Table 2 shows the results. In this magnetic carrier, a band of a target size was confirmed, and nucleic acid extraction was confirmed. However, the detection rate was 20%, the reproducibility was poor, and the performance was unstable.

【０１０４】比較例３と実施例とを比較すると、ポリア
クリルアミドの導入量が少ないと核酸抽出効率が低くな
ることが分かる。A comparison between Comparative Example 3 and Example shows that the efficiency of nucleic acid extraction decreases when the amount of polyacrylamide introduced is small.

【０１０５】実施例４ 実施例１で得た磁性担体を用いて、核酸の実試料である
ＨＣＶ感染者のプール血清を使用し、核酸抽出性能の評
価を行った。以下に評価方法を示す。Example 4 Using the magnetic carrier obtained in Example 1, the nucleic acid extraction performance was evaluated using a pooled serum of an HCV infected person, which is a real nucleic acid sample. The evaluation method is described below.

【０１０６】ＨＣＶ感染者のプール血清１５０μｌに対
して３００μｌの下記固相抽出液を加えて室温にて１２
分間撹拌した後、磁石を用いて磁性担体を容器の端に集
め、溶液部分を吸引除去した。残った磁性担体に０．３
ｍｌの洗浄液（４０ｖｏｌ％のイソプロパノール：６０
％の０．３３Ｍ−ＫＣｌ水溶液の混合液）を加えて再懸
濁させた。再び磁石を用いてゲルを容器の端に集め溶液
部分を吸引除去した後、磁性担体を１００μｌの溶出液
（注射用蒸留水）に懸濁し、磁石を用いてゲルを容器の
端に集めた時の容器底部溶液１０μｌについて逆転写反
応を行ってＤＮＡに変換した後、ポリメレース溶液を加
えてＰＣＲを行った。[0106] 300 µl of the following solid phase extract was added to 150 µl of the pooled sera of HCV infected persons,
After stirring for minutes, the magnetic carrier was collected at the end of the container using a magnet, and the solution portion was removed by suction. 0.3 for remaining magnetic carrier
ml of washing solution (40 vol% isopropanol: 60
(A mixture of 0.3% M-KCl aqueous solution). When the gel was again collected at the end of the container using a magnet and the solution portion was removed by suction, the magnetic carrier was suspended in 100 μl of eluate (distilled water for injection), and the gel was collected at the end of the container using a magnet. After 10 μl of the solution at the bottom of the container was subjected to a reverse transcription reaction and converted into DNA, a polymerase solution was added to perform PCR.

【０１０７】尚、固相抽出液、逆転写反応液及びＰＣＲ
反応液の組成、ＰＣＲの温度条件は以下の通りである。The solid phase extract, reverse transcription reaction solution and PCR
The composition of the reaction solution and the temperature conditions for PCR are as follows.

【０１０８】すなわち、固相抽出液として、６Ｍチオシ
アン酸グアニジン／３７．５ｍＭクエン酸ナトリウム／
磁性担体（１．２ｍｇ／ｍｌ）とイソプロパノールとを
１：１で混合したものを用いた。これを、配列番号３の
核酸プライマー（１．２μＭ−ＨＣＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ
Ｐｒｉｍｅｒ）を用い、４．５ｍＭ−ＭｇＣｌ2、
３．４ｍＭ−ＮａＣｌ、１．４ｍＭ−ｄＮＴＰ、０．８
７ｍＭ−ＤＴＴ及び、１．３ｕｎｉｔ／μｌ−ＲＮａｓ
ｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造（株）製）、２．０ｕ
ｎｉｔ／μｌ−ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ（ＢＲＬ製）にて
逆転写した。その後、配列番号４の核酸プライマー（２
４０ｎＭ−ＨＣＶ Ｆｏｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ）を用
い、２．２ｍＭ−ＭｇＣｌ2、０．２９ｍＭ−ｄＮＴ
Ｐ、Ｔａｑポリメレース（Ａｍｐｌｉ Ｔａｑ Ｇｏｌ
ｄ）２．２５ｕｎｉｔ／７５μｌにて、９５℃で２０
秒、続いて６０℃で３０秒のサイクルを４５サイクル繰
り返した後、７２℃で６０秒の条件でＰＣＲを実施し
た。ＰＣＲ終了後、反応液の一部をアガロース電気泳動
に供し、目的サイズのバンドの有無について目視で判定
した。That is, 6M guanidine thiocyanate / 37.5 mM sodium citrate /
A mixture of a magnetic carrier (1.2 mg / ml) and isopropanol at a ratio of 1: 1 was used. This was combined with the nucleic acid primer of SEQ ID NO: 3 (1.2 μM-HCV Reverse).
Using Primer), 4.5mM-MgCl 2,
3.4 mM NaCl, 1.4 mM dNTP, 0.8
7 mM-DTT and 1.3 unit / μl-RNas
e Inhibitor (Takara Shuzo Co., Ltd.), 2.0u
Reverse transcription was performed using nit / μl-MMLV RTase (manufactured by BRL). Thereafter, the nucleic acid primer of SEQ ID NO: 4 (2
40nM-HCV Foward Primer) using, 2.2mM-MgCl 2, 0.29mM- dNT
P, Taq Polymerase (Ampli Taq Gol
d) 2.25 units / 75 μl, 20 at 95 ° C.
After repeating the cycle for 45 seconds at 60 ° C. for 30 seconds, PCR was carried out at 72 ° C. for 60 seconds. After completion of the PCR, a part of the reaction solution was subjected to agarose electrophoresis, and the presence or absence of a band of a desired size was visually determined.

【０１０９】各サンプルに対し上記の抽出試験を１０回
行った。核酸の抽出（目的サイズのバンド）を確認した
割合を以下に示す検出率として表し核酸抽出性能とし
た。Each sample was subjected to the above-mentioned extraction test 10 times. The ratio at which the extraction of the nucleic acid (the band of the target size) was confirmed was expressed as the detection rate shown below, and the nucleic acid extraction performance was used.

【０１１０】検出率（％）＝（（抽出試験で核酸の抽出
を確認した回数）／（抽出試験回数））×１００ 得られた結果を表２に示す。実試料においても目的サイ
ズのバンドが確認され、核酸抽出性能が確認された。ま
た、検出率は１００％であり、実試料においても抽出の
再現性が確認された。Detection rate (%) = ((number of times that extraction of nucleic acid was confirmed in extraction test) / (number of times of extraction test)) × 100 The results obtained are shown in Table 2. The band of the target size was confirmed also in the actual sample, and the nucleic acid extraction performance was confirmed. In addition, the detection rate was 100%, and the reproducibility of the extraction was confirmed in the actual sample.

【０１１１】[0111]

【発明の効果】本発明の磁性担体はその表面にアクリル
アミドやポリアクリルアミドが均一に結合しているた
め、担体である磁性シリカ粒子にはない吸着や抽出性能
を持たせることでき、また、球状であり、その内部に十
分な量の磁性体を含有し、その強度も大きいことが明ら
かであることから核酸等の吸着剤や、抽出剤として有用
である。また、本発明の製造方法によれば、種々の用途
に応じた所望量のアクリルアミド及び／又はポリアクリ
ルアミド量を有する磁性シリカ粒子を容易に製造するこ
とが可能である。さらに、本発明の磁性担体を用いて核
酸を容易にかつ再現性よく抽出できる。Since the magnetic carrier of the present invention has acrylamide or polyacrylamide uniformly bonded to its surface, the magnetic carrier can have adsorption and extraction performance not found in magnetic silica particles as a carrier. It is clear that it contains a sufficient amount of magnetic substance and has a high strength, so that it is useful as an adsorbent for nucleic acids and the like and an extractant. Further, according to the production method of the present invention, it is possible to easily produce magnetic silica particles having a desired amount of acrylamide and / or polyacrylamide according to various uses. Furthermore, nucleic acids can be easily and reproducibly extracted using the magnetic carrier of the present invention.

【０１１２】[0112]

【配列表】[Sequence list]

【０１１３】[0113]

【配列番号：１】 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在の位置：１．．２６ （配列） ＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴ ＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴ ＴＣＴＡＴＣ ２６[SEQ ID NO: 1] Sequence length: 26 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. . 26 (Sequence) GTCTCTGAAT CAGAAATCCT TCTATC 26

【０１１４】[0114]

【配列番号：２】 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在の位置：１．．２５ （配列） ＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴ ＴＴＣＡＣＴＧＣＴＴ ＣＡＴＣＣ ２５[SEQ ID NO: 2] Sequence length: 25 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics Location of occurrence: 1. . 25 (Sequence) CATGTCAAAT TTCACTGCTT CATCC 25

【０１１５】[0115]

【配列番号：３】 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在の位置：１．．１９ （配列） ＡＴＣＣＧＣＡＡＧＣ ＡＣＣＣＴＡＴＣＡ １９[SEQ ID NO: 3] Sequence length: 19 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics Location of occurrence: 1. . 19 (sequence) ATCCGCAAGC ACCCTATCA 19

【０１１６】[0116]

【配列番号：４】 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列の特徴 存在の位置：１．．２１ （配列） ＣＡＣＴＣＣＡＣＣＡ ＴＡＧＡＴＣＡＣＴＣ Ｃ ２１[SEQ ID NO: 4] Sequence length: 21 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1. . 21 (Sequence) CACTCCACCA TAGATCACTC C 21

Claims (8)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】磁性体を含むシリカ粒子の表面にポリアク
リルアミドをアクリルアミドモノマー換算量として０．
３〜５ｍｍｏｌ／ｇ有することを特徴とする磁性担体。(1) Polyacrylamide is added to the surface of silica particles containing a magnetic substance in an amount of 0.1 to 100% in terms of acrylamide monomer.
A magnetic carrier having 3 to 5 mmol / g. 【請求項２】核酸を吸着分離又は抽出するための磁性担
体であって、ポリアクリルアミドをアクリルアミドモノ
マー換算量として０．５〜５ｍｍｏｌ／ｇ有することを
特徴とする請求項１に記載の磁性担体。2. The magnetic carrier according to claim 1, which is a magnetic carrier for adsorbing and separating or extracting nucleic acids, wherein the polyacrylamide has a content of 0.5 to 5 mmol / g in terms of acrylamide monomer. 【請求項３】表面の窒素原子の量が５原子％以上である
ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の磁性担
体。3. The magnetic carrier according to claim 1, wherein the amount of nitrogen atoms on the surface is 5 atomic% or more. 【請求項４】磁性担体を製造する以下の工程； ａ）シリカ又はシリカ原料を反応させ、さらに磁性体を
付与して磁性シリカ粒子を得る工程、 ｂ）工程ａ）で得られた磁性シリカ粒子とカップリング
剤とを反応させる工程、 ｃ）工程ｂ）で得られた磁性シリカ粒子を洗浄する工
程、 ｄ）工程ｃ）で得られた磁性シリカ粒子と、アクリルア
ミド及び／又はポリアクリルアミドとを反応させる工
程、 ｅ）工程ｄ）で得られた磁性シリカ粒子を洗浄し乾燥さ
せる工程、 を備えることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記
載の磁性担体の製造方法。4. The following steps for producing a magnetic carrier: a) a step of reacting silica or a silica raw material and further providing a magnetic substance to obtain magnetic silica particles; b) the magnetic silica particles obtained in step a) Reacting with the coupling agent; c) washing the magnetic silica particles obtained in step b); d) reacting the magnetic silica particles obtained in step c) with acrylamide and / or polyacrylamide The method for producing a magnetic carrier according to any one of claims 1 to 3, further comprising: e) washing and drying the magnetic silica particles obtained in step d). 【請求項５】請求項４に記載の磁性担体の製造方法の工
程ｄ）において、磁性シリカ粒子を洗浄した後溶媒置換
し乾燥させることを特徴とした磁性担体の製造方法。5. A method for producing a magnetic carrier according to claim 4, wherein in step d) of the method for producing a magnetic carrier, the magnetic silica particles are washed, replaced with a solvent, and dried. 【請求項６】請求項４又は請求項５に記載の磁性担体の
製造方法の工程ｄ）において、磁性シリカ粒子とアクリ
ルアミド及び／又はポリアクリルアミドとを反応させる
溶液中の溶存酸素濃度を１ｍｇ／リットル以下とするこ
とを特徴とした磁性担体の製造方法。6. A method for producing a magnetic carrier according to claim 4 or 5, wherein the concentration of dissolved oxygen in the solution for reacting the magnetic silica particles with acrylamide and / or polyacrylamide is 1 mg / liter. A method for producing a magnetic carrier, comprising: 【請求項７】請求項４〜６のいずれかに記載の磁性担体
の製造方法の工程ｄ）において、反応後の溶液中のポリ
アクリルアミドの重合度が数平均分子量で１０００〜１
００００００であることを特徴とする請求項５又は請求
項６に記載の磁性担体の製造方法。7. The method according to claim 4, wherein the degree of polymerization of the polyacrylamide in the solution after the reaction is 1000 to 1 in terms of number average molecular weight.
The method for producing a magnetic carrier according to claim 5, wherein the magnetic carrier is 000000. 【請求項８】請求項１〜３のいずれかに記載の磁性担体
と試料とを混合し、前記試料中の核酸を磁性担体に吸着
させた後、磁力を利用して磁性担体と試料とを分離する
ことを特徴とする核酸抽出方法。8. The magnetic carrier according to claim 1, which is mixed with a sample, and the nucleic acid in the sample is adsorbed on the magnetic carrier, and then the magnetic carrier and the sample are separated by magnetic force. A method for extracting a nucleic acid, comprising separating the nucleic acid.
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