JPH11281646A - Immunological measuring method - Google Patents
Immunological measuring methodInfo
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- JPH11281646A JPH11281646A JP8357998A JP8357998A JPH11281646A JP H11281646 A JPH11281646 A JP H11281646A JP 8357998 A JP8357998 A JP 8357998A JP 8357998 A JP8357998 A JP 8357998A JP H11281646 A JPH11281646 A JP H11281646A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、被検試料中の微量
な抗原物質をホモジニアスな系で簡便、迅速かつ高感度
に検出又は定量することができる免疫学的測定法及びこ
れに用いる測定試薬に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an immunoassay method capable of detecting or quantifying a trace amount of an antigen substance in a test sample with a homogeneous system simply, quickly and with high sensitivity, and a measuring reagent used therefor. About.
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年、病院、検査センター等において
は、人員及び経費の削減にともない、臨床検査の自動
化、簡便化、測定時間の短縮化が図られている。ここで
一般的に使用される汎用性の自動分析機に適する免疫学
的測定法としては、不溶性担体を利用した抗原物質を定
性及び定量する凝集法が挙げられる。2. Description of the Related Art In recent years, in hospitals, examination centers, and the like, automation and simplification of clinical examinations and shortening of measurement time have been attempted with reductions in personnel and costs. As an immunological measurement method suitable for a general-purpose automatic analyzer generally used herein, there is an agglutination method for qualitatively and quantitatively determining an antigenic substance using an insoluble carrier.
【０００３】現在、免疫学的測定法における凝集法とし
ては、ラテックス凝集免疫測定法が主として行われてい
る。例えば、特公昭５８−１１５７５号公報に開示され
ているように、ラテックス凝集免疫測定法は、抗原物質
又は該抗原物質に特異的に反応する抗体あるいはそのフ
ラグメントを直接ラテックスに担持させ、この担持され
た抗原物質又は抗体に、被検試料を反応させ、ラテック
スの凝集の程度を光学的に測定することにより、抗原物
質（測定対象物質）を検出及び定量するものである。こ
こで、ラテックス免疫凝集法で被検試料中の抗原物質を
測定する場合に使用する抗体としては、通常、ポリクロ
ーナル抗体あるいはモノクローナル抗体が用いられてい
る。しかし、上記の様な抗原物質又は抗体を直接ラテッ
クスに担持させた免疫凝集法における測定感度（検出限
界）は、抗体の親和性あるいはラテックスに担持させる
条件で異なるものの、充分であるとは言い難い。そこ
で、従来よりラテックス凝集免疫測定法の測定感度を上
げるため、被検試料中の抗原物質に対する抗体を直接ラ
テックスに担持するのではなく、該抗体に対する第二抗
体を介してラテックスに担持する方法が提案された（特
開昭６１−１９６１６６号公報、特開平９−３１８６２
９号公報）。[0003] At present, latex agglutination immunoassay is mainly performed as an agglutination method in an immunological assay. For example, as disclosed in Japanese Patent Publication No. 58-11575, latex agglutination immunoassay involves directly loading an antigenic substance, an antibody specifically reacting with the antigenic substance or a fragment thereof on the latex, and loading the antigenic substance. A test sample is allowed to react with the antigen substance or antibody, and the degree of aggregation of latex is optically measured to detect and quantify the antigen substance (substance to be measured). Here, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody is generally used as an antibody used when measuring an antigenic substance in a test sample by the latex immunoagglutination method. However, the measurement sensitivity (detection limit) in the immunoagglutination method in which an antigenic substance or an antibody is directly supported on latex as described above differs depending on the affinity of the antibody or the conditions for supporting on the latex, but it is hard to say that it is sufficient. . Therefore, conventionally, in order to increase the measurement sensitivity of the latex agglutination immunoassay, an antibody to an antigenic substance in a test sample is not directly carried on the latex, but is carried on the latex via a second antibody against the antibody. Proposals (JP-A-61-196166, JP-A-9-31862)
No. 9).
【０００４】[0004]
【発明が解決しようとする課題】しかし、特開昭６１−
１９６１６６号公報記載の方法では、第二抗体にモノク
ローナル抗体を用いているものの、抗原物質に対する抗
体がポリクローナル抗体であることから、被検試料中の
極くわずかな夾雑成分に反応したり、測定対象抗原と構
造が類似する成分と交差反応することがある。また、こ
のようなポリクローナル抗体を測定対象抗原のみに特異
的に反応するものに精製すると、収量は少なく、かつ同
じ品質のものを得ることが難しいという問題点があっ
た。However, Japanese Patent Application Laid-Open No.
In the method described in 196166, although a monoclonal antibody is used as the second antibody, since the antibody against the antigenic substance is a polyclonal antibody, it reacts with very few contaminant components in the test sample, It may cross-react with components that are similar in structure to the antigen. In addition, when such a polyclonal antibody is purified to one that specifically reacts only with the antigen to be measured, there is a problem that the yield is low and it is difficult to obtain the same quality.
【０００５】一方、特開平９−３１８６２９号公報記載
の方法は、抗原物質に対する２種類のモノクローナル抗
体を用いる方法で、一方は直接ラテックスに担持され、
他方は第二抗体を介してラテックスに担持されている。
従って、これら２種類のモノクローナル抗体の由来が同
じ動物である場合（一般的にはマウス同士）は、第二抗
体担持ラテックスが、他方のモノクローナル抗体を直接
担持したラテックスと抗原物質を介さないで凝集する危
険性が高く、ブランク及び非特異的な凝集が高くなると
いう問題がある。また、ラテックスに直接担持したモノ
クローナル抗体が異種の動物由来の場合、マウスと種が
近いものであれば、第二抗体の交差反応による非特異的
凝集が生じる可能性が高く、マウスと種が離れていれ
ば、モノクローナル抗体を安定に産生するハイブリドー
マを得難く、また、得られたハイブリドーマも培養中に
モノクローナル抗体の産生能を欠落しやすいため、安定
供給が難しいという問題がある。さらに、この方法は２
種類のモノクローナル抗体を使用していることから、目
的に応じて特殊な２種類のモノクローナル抗体の組み合
わせを選択しなければならないという問題がある。On the other hand, the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-318629 is a method using two kinds of monoclonal antibodies against an antigenic substance, one of which is directly supported on latex,
The other is carried on the latex via the second antibody.
Therefore, when these two types of monoclonal antibodies are derived from the same animal (generally, mice), the latex carrying the second antibody aggregates with the latex directly carrying the other monoclonal antibody without passing through the antigenic substance. There is a problem that there is a high risk of occurrence of agglutination and high blank and non-specific aggregation. In addition, when the monoclonal antibody directly supported on the latex is derived from a different animal, if the species is close to that of the mouse, there is a high possibility that nonspecific aggregation will occur due to cross-reaction of the second antibody, and the species will be separated from the mouse. If so, it is difficult to obtain a hybridoma that stably produces a monoclonal antibody, and the obtained hybridoma also tends to lack the ability to produce a monoclonal antibody during culturing, so that there is a problem that stable supply is difficult. In addition, this method is
Since various types of monoclonal antibodies are used, there is a problem that a combination of two special types of monoclonal antibodies must be selected according to the purpose.
【０００６】従って本発明の目的は、上記の如き問題点
がなく、被検試料中の抗原物質を、簡便、迅速かつ高感
度に検出し得る方法を提供することにある。Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method capable of detecting an antigen substance in a test sample simply, quickly and with high sensitivity without the above-mentioned problems.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】斯かる実情に鑑み本発明
者は鋭意研究を行った結果、被検試料中の抗原物質に対
する抗体が該抗体又はその断片をリガンドとし得るレセ
プターを介して担持された不溶性担体と、被検試料中の
抗原物質に非免疫学的に結合する物質を担持した不溶性
担体とを用いれば、抗原物質が微量であっても特異的な
凝集が生起し、被検試料中の抗原物質を簡便、迅速かつ
高感度に検出できることを見出し本発明を完成した。Means for Solving the Problems In view of such circumstances, the present inventors have conducted intensive studies and as a result, an antibody against an antigenic substance in a test sample has been carried via a receptor that can use the antibody or a fragment thereof as a ligand. The use of an insoluble carrier and an insoluble carrier carrying a substance that binds non-immunologically to the antigenic substance in the test sample causes specific aggregation even when the amount of the antigenic substance is very small, and the test sample The present inventors have found that an antigen substance therein can be detected simply, quickly and with high sensitivity, and completed the present invention.
【０００８】すなわち本発明は、被検試料中の抗原物質
に対する抗体が該抗体又はその断片をリガンドとし得る
レセプターを介して担持された不溶性担体と、被検試料
中の抗原物質に非免疫学的に結合する物質を担持した不
溶性担体とを被検試料中の抗原物質と反応させ、生じる
凝集を測定することを特徴とする抗原物質の免疫学的測
定法を提供するものである。[0008] That is, the present invention provides an insoluble carrier in which an antibody against an antigenic substance in a test sample is carried via a receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand; The present invention provides an immunological assay method for an antigenic substance, characterized by reacting an insoluble carrier carrying a substance that binds to an antigenic substance in a test sample and measuring the resulting aggregation.
【０００９】また本発明は、被検試料中の抗原物質に対
する抗体が該抗体又はその断片をリガンドとし得るレセ
プターを介して担持された不溶性担体と、被検試料中の
抗原物質に非免疫学的に結合する物質を担持した不溶性
担体とを含有する抗原物質の免疫学的測定試薬を提供す
るものである。[0009] The present invention also provides an insoluble carrier in which an antibody against an antigenic substance in a test sample is carried via a receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand; And a reagent for immunologically measuring an antigenic substance, comprising:
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】本発明の被検試料中の抗原物質に
対する抗体が該抗体又はその断片をリガンドとし得るレ
セプターを介して担持された不溶性担体（以下「不溶性
担体（Ａ）」という）において、使用されるレセプター
としては、被検試料中の抗原物質に対する抗体又はその
断片をリガンドとし得るものであれば特に限定されない
が、該リガンドと反応し単独で凝集を生じない抗体、プ
ロテインＡ又はプロテインＧが好ましい。レセプターと
して用いる抗体はモノクローナル抗体が好ましいが、リ
ガンドと反応し単独で凝集を生じなければポリクローナ
ル抗体も使用することができる。本発明で使用される上
記レセプターは市販品を用いてもよい。またここで用い
るモノクローナル抗体は、常法により調製することがで
きる（G. Kohlerand C. Milstein, Nature, 1975, 25
6、Yarmush M. et al, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 77,
2899, 1980）。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION In an insoluble carrier (hereinafter referred to as "insoluble carrier (A)") in which an antibody against an antigenic substance in a test sample of the present invention is carried via a receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand. The receptor to be used is not particularly limited as long as it can use an antibody against an antigenic substance in a test sample or a fragment thereof as a ligand, but an antibody which reacts with the ligand and does not cause aggregation alone, protein A or protein G is preferred. Monoclonal antibodies are preferable as the antibodies used as receptors, but polyclonal antibodies can also be used as long as they do not react with the ligand and cause aggregation alone. The receptor used in the present invention may be a commercially available product. The monoclonal antibody used here can be prepared by a conventional method (G. Kohlerand C. Milstein, Nature, 1975, 25).
6, Yarmush M. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77,
2899, 1980).
【００１１】すなわち、レセプターとして用いるモノク
ローナル抗体は、抗原物質に対する抗体がポリクロー
ナル抗体の場合には、ポリクローナル抗体由来の免疫動
物のＩｇＧを免疫したマウスの脾臓細胞とマウスのミエ
ローマ細胞を融合したハイブリドーマから調製できる。
次に、抗原物質に対する抗体がモノクローナル抗体
（マウス由来）の場合には、マウスＩｇＧを免疫したラ
ット脾臓細胞とラットのミエローマ細胞を融合したハイ
ブリドーマ、あるいは、マウスＩｇＧを免疫したラッ
ト、ラビット等の異種動物の脾臓細胞とマウスのミエロ
ーマ細胞を融合したヘテロハイブリドーマから調製でき
る。次に、抗原物質に対する抗体がモノクローナル抗
体（ラット、ラビットなどのヘテロハイブリドーマ由
来）の場合には、と同様に調製できる。得られたハイ
ブリドーマのうち、目的とする抗体を産生するものをク
ローニングし、細胞を樹立する。モノクローナル抗体の
大量調製は、ハイブリドーマを培養した培養上清を回収
して、あるいは、動物の腹腔内にハイブリドーマを接種
して増殖させた後、腹水を回収して、これに含まれるモ
ノクローナル抗体を塩析法、吸着クロマトグラフィー法
等の操作により濃縮、精製することができる。なお、動
物の腹腔内に接種する場合、ヘテロハイブリドーマでは
ヌードマウスあるいはヌードラットの使用が好ましい。That is, when the antibody against the antigenic substance is a polyclonal antibody, the monoclonal antibody used as a receptor is prepared from a hybridoma obtained by fusing spleen cells of a mouse immunized with IgG of an immunized animal derived from the polyclonal antibody and myeloma cells of the mouse. it can.
Next, when the antibody against the antigenic substance is a monoclonal antibody (derived from mouse), a hybridoma obtained by fusing rat spleen cells immunized with mouse IgG and myeloma cells of a rat, or a heterologous rat or rabbit immunized with mouse IgG is used. It can be prepared from a heterohybridoma obtained by fusing animal spleen cells and mouse myeloma cells. Next, when the antibody against the antigenic substance is a monoclonal antibody (derived from a heterohybridoma such as a rat or a rabbit), it can be prepared in the same manner as described above. Among the obtained hybridomas, those producing the desired antibody are cloned to establish cells. Large-scale preparation of the monoclonal antibody is performed by collecting the culture supernatant of the hybridoma, or inoculating the hybridoma into the abdominal cavity of the animal, growing the ascites, collecting the ascites, and salting the monoclonal antibody contained therein. It can be concentrated and purified by an operation such as a precipitation method and an adsorption chromatography method. In addition, when inoculating intraperitoneally into an animal, it is preferable to use a nude mouse or a nude rat as a heterohybridoma.
【００１２】動物に免疫する際に使用する抗体は、Ｉｇ
Ｇ分子をそのまま用いても良いが、得られるモノクロー
ナル抗体（レセプター）が主にＩｇＧであるため、市販
の酵素標識抗体を用いたスクリーニングでは、交差反応
等の面から好ましくない。また、抗原物質に特異的な抗
体の反応がレセプターにより阻害される危険性が低減で
き、高感度な試薬ができることが予想されるため、Ｆｃ
あるいはＦｄの抗体断片を使用することが好ましい。さ
らに、抗体断片を利用することは、ポリクローナル抗体
（レセプター）が単独でＩｇＧ分子と反応して凝集を示
さないポリクローナル抗体（レセプター）を得るために
も好ましい。なお、該抗体断片は、プラスミンやトリプ
シン等、蛋白質分解酵素を利用した限定分解により得る
ことができる。Antibodies used for immunizing animals are Ig
The G molecule may be used as it is, but since the obtained monoclonal antibody (receptor) is mainly IgG, screening using a commercially available enzyme-labeled antibody is not preferable in terms of cross-reactivity and the like. In addition, the risk that the reaction of an antibody specific to an antigenic substance is inhibited by a receptor can be reduced, and it is expected that a highly sensitive reagent can be obtained.
Alternatively, it is preferable to use an antibody fragment of Fd. Furthermore, it is preferable to use an antibody fragment in order to obtain a polyclonal antibody (receptor) that does not show aggregation by reacting with an IgG molecule by itself. The antibody fragment can be obtained by limited degradation using a protease such as plasmin or trypsin.
【００１３】次に、不溶性担体（Ａ）で被検試料中の抗
原物質に対する抗体としては、モノクローナル抗体及び
ポリクローナル抗体のいずれも使用できるが、ポリクロ
ーナル抗体としては、ポリクローナル抗体単独で抗原物
質と反応し凝集を示さないポリクローナル抗体が好まし
い。Next, as the antibody against the antigenic substance in the test sample with the insoluble carrier (A), either a monoclonal antibody or a polyclonal antibody can be used. As the polyclonal antibody, the polyclonal antibody reacts with the antigenic substance alone. Polyclonal antibodies that do not show aggregation are preferred.
【００１４】さらに、不溶性担体（Ａ）で使用される被
検試料中の抗原物質に対する抗体としては、市販品が使
用できる。この他に、モノクローナル抗体及びポリクロ
ーナル抗体を作製する場合は、前述のように通常の方法
で調製が可能である。なお、動物を免疫する際に使用す
る抗原は、所望の抗原を認識し得る抗体を誘導するもの
であれば特に限定されない。Further, as the antibody against the antigenic substance in the test sample used in the insoluble carrier (A), a commercially available product can be used. In addition, when producing a monoclonal antibody and a polyclonal antibody, they can be prepared by a usual method as described above. The antigen used for immunizing an animal is not particularly limited as long as it induces an antibody capable of recognizing a desired antigen.
【００１５】また、本発明の抗原物質と非免疫学的に結
合する物質を担持した不溶性担体（以下、「不溶性担体
（Ｂ）」という）における、抗原物質と非免疫学的に結
合する物質としては、従来、生体成分の精製・分析に広
く応用されているものが挙げられ、吸着クロマトグラフ
ィーで利用されているものが特に好ましい。具体的に
は、例えば、ヘパリン、リジン及びアルギニンなどのア
ミノ酸、Cibacron Blue3GA 及びProcion Red HE-3B 等
の色素、Poly(U) 及びPoly(A) 等のオリゴヌクレオチ
ド、5' AMP及び2'5' ADP等のアデノシンのリン酸化合
物、ゼラチン、ベンザミジン、イミノジ酢酸等の金属イ
オン保持体、糖親和性物質であるコンカナバリンＡ糖の
レクチン及びボロン酸誘導体（特開昭６２−１００６６
０号公報、特開平７−８３９２１号公報）等が挙げられ
る。[0015] Further, in the insoluble carrier (hereinafter referred to as "insoluble carrier (B)") carrying the substance which non-immunologically binds to the antigenic substance of the present invention, the substance which non-immunologically binds to the antigenic substance is used. Examples of the above include those widely used in the purification and analysis of biological components, and those used in adsorption chromatography are particularly preferable. Specifically, for example, amino acids such as heparin, lysine and arginine, dyes such as Cibacron Blue 3GA and Procion Red HE-3B, oligonucleotides such as Poly (U) and Poly (A), 5 ′ AMP and 2 ′ 5 ′ Adenosine phosphate compounds such as ADP, metal ion carriers such as gelatin, benzamidine, iminodiacetic acid, etc., lectins and boronic acid derivatives of concanavalin A sugar which is a sugar affinity substance (JP-A-62-10066)
0, JP-A-7-83921) and the like.
【００１６】また、不溶性担体（Ａ）及び（Ｂ）で使用
される不溶性担体の材質は、特に限定されず、従来、不
溶性担体を用いて抗原又は抗体を測定する場合に使用さ
れる公知の物質であればいずれも使用することができ
る。このような物質としては、有機高分子物質、磁性体
を含む有機高分子物質、無機物質、細胞膜、血球、微生
物等が挙げられる。このうち、有機高分子物質としての
ラテックス粒子が好ましい。特に、アクリル酸重合体、
スチレン重合体、メタクリル酸重合体等の樹脂から選ば
れた１種又は２種以上の微粉末を均一に懸濁させたラテ
ックス粒子が好ましい。無機物質としては、シリカ、ア
ルミナ等の微粒子が挙げられる。また、カルボキシル基
あるいはアミノ基等を保有した上記の不溶性担体は、縮
合剤あるいは二架橋試薬等を用いて目的の物質（抗原、
抗体、リガンド、レセプター、官能基など）を化学的に
結合させる場合に好適である。さらに、不溶性担体の粒
径は、特に限定されるものではないが、凝集体を直接光
学的に測定する場合は、一般的には平均粒子径が１．６
μｍ以下のものが好ましく、特に平均粒子径が０．０１
〜１μｍ、さらには０．０１〜０．５μｍのものが好ま
しい。また、凝集体を凝集板上で肉眼的に観察する場合
は、平均粒子径が１μｍ以上のものが好ましく、特に、
１〜２０μｍのものが好ましい。The material of the insoluble carrier used in the insoluble carriers (A) and (B) is not particularly limited, and is a known substance conventionally used when measuring an antigen or an antibody using the insoluble carrier. Any can be used. Examples of such substances include organic polymer substances, organic polymer substances including magnetic substances, inorganic substances, cell membranes, blood cells, microorganisms, and the like. Of these, latex particles as an organic polymer substance are preferred. In particular, acrylic acid polymers,
Latex particles in which one or more fine powders selected from resins such as a styrene polymer and a methacrylic acid polymer are uniformly suspended are preferred. Examples of the inorganic substance include fine particles such as silica and alumina. Further, the insoluble carrier having a carboxyl group or an amino group or the like can be used as a target substance (antigen,
It is suitable when chemically binding antibodies, ligands, receptors, functional groups, etc.). Further, the particle size of the insoluble carrier is not particularly limited, but when the aggregate is directly optically measured, the average particle size is generally 1.6.
μm or less is preferable, and especially the average particle diameter is 0.01
To 1 μm, more preferably 0.01 to 0.5 μm. When the aggregate is visually observed on the aggregate plate, the average particle size is preferably 1 μm or more,
Those having a thickness of 1 to 20 μm are preferred.
【００１７】次に、本発明において、前記レセプターを
不溶性担体に結合させる方法としては、特に限定され
ず、物理的吸着あるいは化学的結合法が利用される。特
に、化学的結合法を利用すると、レセプターが不溶性担
体から溶離しにくくなるので、より安定な試薬を得るこ
とができる。化学的結合法としては、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドなどの
縮合剤あるいは、４，４′−ジイソチオシアノ−２，
２′−スチルベンジスルホン酸（ＤＩＤＳ）、エチレン
グリコール−Ｏ，Ｏ′−ビス（スクシンイミジルスクシ
ネート）（ＥＧＳ）、Ｎ−（６−マレイミドカプロイル
オキシ）スクシンイミド、Ｎ−スクシンイミジル−６−
マレイミドヘキサノエート（ＥＭＣＳ）などの二架橋試
薬を用いる方法が好ましい。Next, in the present invention, the method for binding the receptor to the insoluble carrier is not particularly limited, and a physical adsorption or chemical binding method is used. In particular, when the chemical bonding method is used, the receptor is hardly eluted from the insoluble carrier, so that a more stable reagent can be obtained. As a chemical bonding method, 1-ethyl-3-
A condensing agent such as (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide or 4,4'-diisothiocyano-2,
2'-stilbenedisulfonic acid (DIDS), ethylene glycol-O, O'-bis (succinimidyl succinate) (EGS), N- (6-maleimidocaproyloxy) succinimide, N-succinimidyl-6
A method using a dicrosslinking reagent such as maleimide hexanoate (EMCS) is preferred.
【００１８】次に、本発明において、被検試料中の抗原
物質に対する抗体を不溶性担体に結合したレセプターに
結合させる方法としては、抗体とレセプターとの抗原抗
体反応又はリガンド−レセプター反応を利用すればよ
い。この時、使用した抗体あるいはレセプターによって
は、抗原抗体反応又はリガンド−レセプター反応終了
後、ホルムアルデヒドやグルタールアルデヒド等で化学
処理を行い、レセプターから抗体の遊離を防ぐこともで
きる。また、レセプターと未反応の遊離の抗体は、遠
心、透析、濾過などの方法で除去することが好ましい。Next, in the present invention, as a method of binding an antibody to an antigenic substance in a test sample to a receptor bound to an insoluble carrier, an antigen-antibody reaction between the antibody and the receptor or a ligand-receptor reaction may be used. Good. At this time, depending on the antibody or receptor used, after the antigen-antibody reaction or the ligand-receptor reaction is completed, a chemical treatment with formaldehyde, glutaraldehyde, or the like can be performed to prevent release of the antibody from the receptor. Further, it is preferable to remove free antibodies that have not reacted with the receptor by a method such as centrifugation, dialysis, or filtration.
【００１９】被検試料中の抗原物質に非免疫学的に結合
する物質を不溶性担体に結合させる方法としては、特に
限定されず、該物質とカルボキシル基あるいはアミノ基
等を保有した不溶性担体に縮合剤あるいは二架橋試薬を
利用して直接化学的に結合させることができる。また、
該物質をキャリア蛋白質（アルブミン、カゼイン、フィ
ブロネクチンなど）に、縮合剤あるいは二架橋試薬を利
用して化学的に結合させたものを不溶性担体に物理的吸
着法あるいは化学的結合法により結合させても構わな
い。The method of binding a substance that non-immunologically binds to the antigenic substance in the test sample to the insoluble carrier is not particularly limited, and the substance is condensed with the insoluble carrier having a carboxyl group or an amino group. It can be chemically bonded directly using an agent or a two-crosslinking reagent. Also,
A substance obtained by chemically binding the substance to a carrier protein (such as albumin, casein, fibronectin, etc.) using a condensing agent or a di-crosslinking reagent may be bound to an insoluble carrier by a physical adsorption method or a chemical bonding method. I do not care.
【００２０】次に、本発明で使用される不溶性担体を懸
濁する液あるいは被検試料の希釈液としては、特に限定
されず、通常用いられる緩衝液は、いずれも使用するこ
とができる。例えば、酢酸、クエン酸、リン酸、トリ
ス、グリシン、ホウ酸、炭酸、グッドの緩衝液等が使用
でき、反応におけるpHは５〜１０、特に６〜９が好まし
い。Next, the solution for suspending the insoluble carrier or the diluting solution of the test sample used in the present invention is not particularly limited, and any commonly used buffer solution can be used. For example, acetic acid, citric acid, phosphoric acid, Tris, glycine, boric acid, carbonic acid, Good's buffer and the like can be used, and the pH in the reaction is preferably 5 to 10, particularly preferably 6 to 9.
【００２１】本発明で行う被検試料と試薬の反応、すな
わち、不溶性担体の一方と被検試料の反応及び不溶性担
体の他方と被検試料の反応は、同時に行っても良いし、
また、いずれかを先に行っても良い。In the present invention, the reaction between the test sample and the reagent, that is, the reaction between one of the insoluble carriers and the test sample and the reaction between the other of the insoluble carriers and the test sample may be performed simultaneously,
Further, any one of them may be performed first.
【００２２】本発明における測定対象物質としては、被
検試料中の抗原物質に対する抗体及び前述の官能基が反
応する抗原物質であれば、特定のエピトープが１個で
ある多価抗原物質、特定のエピトープが複数含まれる
多価抗原物質、分子量の小さなハプテン等の１価の抗
原物質であれ、特に限定されないが、臨床検査上重要な
項目であり、従来の免疫凝集法では測定感度が不足であ
るとされていた項目について特に有用であり、例えば、
汎発性血管内凝固症候群の診断のために測定されるＴＡ
Ｔ（トロンビン・アンチトロンビンIII 複合体) 、プラ
スミン・α2−プラスミンインヒビター複合体、血液凝
固因子、癌検診のスクリーニングに測定されるＡＦＰ、
ＣＥＡ、ＣＡ１９−９などのng／mlまで測定感度が要求
される項目などが好ましい。The substance to be measured in the present invention may be an antibody against the antigenic substance in the test sample or an antigenic substance to which the above-described functional group reacts, a polyvalent antigenic substance having one specific epitope, a specific antigenic substance. A multivalent antigen substance containing a plurality of epitopes or a monovalent antigen substance such as a hapten having a small molecular weight is not particularly limited, but is an important item in a clinical test, and the measurement sensitivity is insufficient with the conventional immunoagglutination method. Is particularly useful for items that have been described as, for example,
TA measured for the diagnosis of generalized intravascular coagulation syndrome
T (thrombin / antithrombin III complex), plasmin / α 2 -plasmin inhibitor complex, blood clotting factor, AFP measured for screening for cancer screening,
Items requiring measurement sensitivity up to ng / ml, such as CEA and CA19-9, are preferred.
【００２３】試験試料、不溶性担体（Ａ）及び不溶性担
体（Ｂ）の反応により生じた凝集を光学的に測定する光
学的測定機器としては、汎用の分光光度計、分光光度測
定を測定原理とした生化学用自動分析装置（日立製作所
社製；日立７１５０，７０７０，７１７０等、東芝社
製；東芝ＴＢＡ−８０Ｒ等）、近赤外を測定波長とした
装置（三菱化成社製；ＬＰＩＡ等）、積分球濁度を測定
原理とした装置（協和発酵社製；ＥＬシステム等）、散
乱光強度を測定する装置（ベーリンガー社製；ＢＮＡシ
ステム等）等が挙げられる。As an optical measuring instrument for optically measuring the agglutination generated by the reaction between the test sample, the insoluble carrier (A) and the insoluble carrier (B), a general-purpose spectrophotometer and a spectrophotometric measurement principle are used. Automatic analyzers for biochemistry (Hitachi, Ltd .; Hitachi 7150, 7070, 7170, etc., Toshiba; Toshiba TBA-80R, etc.), devices using near-infrared measurement wavelength (Mitsubishi Kasei, LPIA, etc.), Examples of the apparatus include a device based on the measuring principle of the integrating sphere turbidity (manufactured by Kyowa Hakko Co., Ltd .; EL system, etc.) and a device for measuring the scattered light intensity (manufactured by Boehringer Company, BNA system, etc.).
【００２４】[0024]
【実施例】以下、製造例並びに実施例を挙げて本発明を
さらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定される
ものではない。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Production Examples and Examples, but the present invention is not limited thereto.
【００２５】製造例１．ヘパリン結合不溶性担体液の調
製 アミノ化ポリスチレンラテックス（平均粒径０．２μ
ｍ、インターヘイシャル・ダイナミックス社製）を０．
０５Ｍホウ酸緩衝液（pH７．５）で２％の濃度に調製し
た懸濁液６mlに、０．０５Ｍホウ酸緩衝液（pH７．５）
で８mg／mlの濃度に調製したヘパリンナトリウム（第一
化学薬品社製）溶液３ml及び０．０５Ｍホウ酸緩衝液
（pH７．５）で２mg／mlの濃度に調製した１−エチル−
３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩（同仁化学研究所製）溶液３mlを加え、２５℃で４
時間反応させた。さらに、グリシンを２％含有した０．
０５Ｍホウ酸緩衝液（pH７．５）４mlを加え、２５℃で
一晩攪拌した。０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）
を用いて遠心洗浄を２回行った後、０．０５Ｍグリシン
緩衝液（pH８．４）８４mlに再分散させ、ヘパリン結合
不溶性担体懸濁液（ヘパリン−Ｌｘ）を得た。Production Example 1 Preparation of heparin-bound insoluble carrier liquid Aminated polystyrene latex (average particle size 0.2μ
m, manufactured by Interhetic Dynamics).
To 6 ml of the suspension adjusted to a concentration of 2% with a 05 M borate buffer (pH 7.5) was added a 0.05 M borate buffer (pH 7.5).
3 ml of a solution of sodium heparin (manufactured by Dai-ichi Kagaku Chemical Co., Ltd.) adjusted to a concentration of 8 mg / ml with 1-ethyl-prepared to a concentration of 2 mg / ml with a 0.05 M borate buffer (pH 7.5).
Add 3 ml of 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (Dojindo Laboratories) solution,
Allowed to react for hours. In addition, 0.1% containing 2% glycine.
4 ml of a 05M borate buffer (pH 7.5) was added, and the mixture was stirred at 25 ° C overnight. 0.05M glycine buffer (pH 8.4)
After performing centrifugal washing twice using, it was redispersed in 84 ml of 0.05M glycine buffer (pH 8.4) to obtain a heparin-bound insoluble carrier suspension (heparin-Lx).
【００２６】製造例２．２６２１０結合不溶性担体液の
調製 抗ＴＡＴモノクローナル抗体は、特開平７−２３８０９
９号公報の第７項右欄の表２（段落番号００３８）に示
す抗体Ｎｏ．２６２１０を用いた。この２６２１０を
０．２５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）で１．４mg／ml
の濃度に調製した溶液５mlに、平均粒径０．２μｍのポ
リスチレンラテックス（積水化学工業社製）を０．２５
Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）で２％の濃度に調製した
懸濁液５mlを加え、４℃にて５時間攪拌した。次に、２
％牛血清アルブミンを含む０．２５Ｍグリシン緩衝液
（pH８．４）を加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄に
より上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH
８．４）７０mlを加えてよく混和し、２６２１０結合不
溶性担体懸濁液（２６２１０−Ｌｘ）を調製した。Preparation Example 2. Preparation of insoluble carrier solution bound to 26210 Anti-TAT monoclonal antibody is disclosed in JP-A-7-23809.
No. 9, the antibody No. 9 shown in Table 2 (paragraph number 0038) of the right column of the seventh paragraph. 26210 was used. The 26210 was dissolved in 0.25 M glycine buffer (pH 8.4) at 1.4 mg / ml.
Of polystyrene latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) having an average particle size of 0.2 μm was added to 5 ml of a solution prepared to a concentration of
5 ml of a suspension prepared to a concentration of 2% with an M glycine buffer (pH 8.4) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 5 hours. Next, 2
A 0.25 M glycine buffer (pH 8.4) containing 5% bovine serum albumin was added, and the mixture was stirred at 4 ° C overnight. After removing the supernatant by centrifugal washing, 0.05M glycine buffer (pH
8.4) 70 ml was added and mixed well to prepare 26210-bound insoluble carrier suspension (26210-Lx).
【００２７】製造例３．プロテインＡ結合不溶性担体液
の調製 プロテインＡ（シグマ社製）６０mgを８．４mlの精製水
で溶解した後、０．２５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）
で一晩透析した。このプロテインＡ液７．７mlに０．２
５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）を加え１３mlとし、平
均粒径０．２μｍのポリスチレンラテックス（積水化学
工業社製）を０．２５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）で
２％の濃度に調製した懸濁液１３mlを加え、４℃にて一
晩攪拌した。次に、２％牛血清アルブミンを含む０．０
５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）を加え、４℃で一晩攪
拌した。遠心洗浄により上清を除去した後、０．０５Ｍ
グリシン緩衝液（pH８．４）１８２mlを加えてよく混和
し、プロテインＡ結合不溶性担体懸濁液（プロテインＡ
−Ｌｘ）を調製した。Production Example 3 Preparation of Protein A Binding Insoluble Carrier Solution After dissolving 60 mg of Protein A (manufactured by Sigma) in 8.4 ml of purified water, a 0.25 M glycine buffer solution (pH 8.4) was added.
And dialyzed overnight. 0.2 ml in 7.7 ml of this protein A solution
5 M glycine buffer (pH 8.4) was added to make 13 ml, and polystyrene latex having an average particle size of 0.2 μm (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was adjusted to a concentration of 2% with a 0.25 M glycine buffer (pH 8.4). 13 ml of the suspension was added and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight. Next, 0.0% containing 2% bovine serum albumin.
A 5M glycine buffer (pH 8.4) was added, and the mixture was stirred at 4 ° C overnight. After removing the supernatant by centrifugal washing, 0.05M
182 ml of glycine buffer (pH 8.4) was added and mixed well, and the protein A-bound insoluble carrier suspension (protein A) was added.
-Lx) was prepared.
【００２８】製造例４．抗マウスＩｇＧ−ラット・モノ
クローナル抗体結合不溶性担体液の調製 抗マウスＩｇＧ−ラット・モノクローナル抗体（ａ：Ｉ
ＢＬ アメリカンリサーチプロダクツ社製（アメリカ）
及びｂ：ＥＩＵ エキスペリメンタルイムノロジー社製
（ベルギー）１mgを１mlの精製水で溶解した後、０．２
５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）で一晩透析した。この
抗マウスＩｇＧ−ラット・モノクローナル抗体液に０．
２５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）を加え、２８０nmで
の吸光度が１Ａｂｓとなるように調製した（約１．３m
l）。この抗体液に平均粒径０．２μｍのポリスチレン
ラテックス（積水化学工業社製）を０．２５Ｍグリシン
緩衝液（pH８．４）で２％の濃度に調製した懸濁液１．
３mlを加え、４℃にて５時間攪拌した。次に、２％牛血
清アルブミンを含む０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８．
４）２．６mlを加え、４℃で一晩攪拌した。遠心洗浄に
より上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH
８．４）１８．２mlを加えてよく混和し、抗マウスＩｇ
Ｇ−ラット・モノクローナル抗体結合不溶性担体懸濁液
（ａ及びｂ抗Ｍ・ＩｇＧ−Ｒ・ＭｏＡｂ−Ｌｘ）を調製
した。Production Example 4 Preparation of Insoluble Carrier Solution Conjugated with Anti-Mouse IgG-Rat Monoclonal Antibody Anti-mouse IgG-rat Monoclonal Antibody (a: I
BL American Research Products (USA)
And b: After dissolving 1 mg of EIU Experimental Immunology (Belgium) with 1 ml of purified water, 0.2
It was dialyzed overnight against 5M glycine buffer (pH 8.4). The anti-mouse IgG-rat monoclonal antibody solution was added with 0.1%.
A 25 M glycine buffer (pH 8.4) was added to adjust the absorbance at 280 nm to 1 Abs (about 1.3 m).
l). A suspension in which polystyrene latex having an average particle size of 0.2 μm (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) was adjusted to a concentration of 2% with 0.25 M glycine buffer (pH 8.4) to this antibody solution.
3 ml was added and the mixture was stirred at 4 ° C. for 5 hours. Next, a 0.05 M glycine buffer (pH 8.0) containing 2% bovine serum albumin.
4) 2.6 ml was added and the mixture was stirred at 4 ° C overnight. After removing the supernatant by centrifugal washing, 0.05M glycine buffer (pH
8.4) Add 18.2 ml and mix well.
G-rat monoclonal antibody-bound insoluble carrier suspensions (a and b anti-M-IgG-R-MoAb-Lx) were prepared.
【００２９】製造例５．２６２１０結合プロテインＡ−
Ｌｘの調製 上記で得たプロテインＡ−Ｌｘ １１mlに２６２１０の
３０mAbsを溶解し、室温で２時間反応させた。遠心洗浄
により上清を除去した後、０．０５Ｍグリシン緩衝液
（pH８．４）１１mlを加えてよく混和し、２６２１０結
合プロテインＡ−Ｌｘ懸濁液を調製した。Preparation Example 5.26210 Bound Protein A-
Preparation of Lx 30 mAbs of 26210 was dissolved in 11 ml of the protein A-Lx obtained above and reacted at room temperature for 2 hours. After removing the supernatant by centrifugal washing, 11 ml of 0.05M glycine buffer (pH 8.4) was added and mixed well to prepare a 26210-bound protein A-Lx suspension.
【００３０】製造例６．２６２１０結合抗Ｍ・ＩｇＧ−
Ｒ・ＭｏＡｂ−Ｌｘの調製 上記で得たａ及びｂの抗Ｍ・ＩｇＧ−Ｒ・ＭｏＡｂ−Ｌ
ｘ １１mlに２６２１０の３０mAbsを溶解し、室温で２
時間反応させた。遠心洗浄により上清を除去した後、
０．０５Ｍグリシン緩衝液（pH８．４）１１mlを加えて
よく混和し、ａ及びｂの２６２１０の結合抗Ｍ・ＩｇＧ
−Ｒ・ＭｏＡｂ−Ｌｘ懸濁液を調製した。Preparation Example 6.26210-conjugated anti-M-IgG-
Preparation of R-MoAb-Lx Anti-M-IgG-R-MoAb-L of a and b obtained above
x Dissolve 26210 30 mAbs in 11 ml and add 2 ml at room temperature.
Allowed to react for hours. After removing the supernatant by centrifugal washing,
11 ml of 0.05M glycine buffer (pH 8.4) was added and mixed well, and conjugated anti-M-IgG of 26210 of a and b was added.
-An R-MoAb-Lx suspension was prepared.
【００３１】製造例７．ＴＡＴの調製 トロンビン製剤（ミドリ十字社製）のα−トロンビン
と、ＡＴIII 製剤（ヘキスト社製）のＡＴIII を０．０
２Ｍトリス緩衝液（pH７．４）で溶解し、α−トロンビ
ン：ＡＴIII ＝１：１．５のモル比で混合した後、３７
℃で１０分間反応を行った。反応物をHeparin-Sepharos
e （ファルマシア社製）の２×６cmのカラムに付し、吸
着画分を０．１−２Ｍ ＮａＣｌ／０．０２Ｍトリス緩
衝液（pH７．４）のリニアグラジエントで溶出した。各
フラクションを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（第一化学
薬品社製）にて分析し、ＴＡＴ画分を回収した。ＴＡＴ
濃度はＥＬＩＳＡ（エンザイグノスト ＴＡＴ ベーリ
ングベルケ社製）で測定した結果、７５０μｇ／mlであ
った。Production Example 7 Preparation of TAT α-Thrombin of a thrombin preparation (manufactured by Green Cross) and ATIII of an ATIII preparation (manufactured by Hoechst) were added to 0.03%.
After dissolving with 2M Tris buffer (pH 7.4) and mixing at a molar ratio of α-thrombin: ATIII = 1: 1.5, 37
The reaction was carried out at 10 ° C for 10 minutes. React the reaction with Heparin-Sepharos
e (Pharmacia) 2 × 6 cm column, and the adsorbed fraction was eluted with a linear gradient of 0.1-2 M NaCl / 0.02 M Tris buffer (pH 7.4). Each fraction was analyzed by 4-20% SDS-PAGE (manufactured by Daiichi Kagaku) and the TAT fraction was collected. TAT
The concentration was 750 µg / ml as a result of measurement by ELISA (Enzygnost TAT Beringberge).
【００３２】実施例１．ヘパリン結合不溶性担体と各２
６２１０結合不溶性担体を用いたＴＡＴの測定 第１試薬として１０％グリセリンを含有した０．０２Ｍ
トリス緩衝液（pH９．０）を用い、第１試薬２００μｌ
にＴＡＴを含有する試料液２０μｌを加えて３７℃で５
分間加温後、第２試薬としてヘパリン結合不溶性担体懸
濁液の１容に対して１容の各２６２１０結合不溶性担体
懸濁液（２６２１０結合Ｌｘ、２６２１０結合プロ
テインＡ−Ｌｘ、ａ及びｂの２６２１０結合抗Ｍ・
ＩｇＧ−Ｒ・ＭｏＡｂ−Ｌｘ液）を混和した溶液１００
μｌを加え攪拌した。その後、波長６００nmにおける１
〜５分吸光度変化量を測定した。得られた吸光度とＴＡ
Ｔ濃度の関係を表１に示した。Embodiment 1 Heparin-bound insoluble carrier and 2 each
Measurement of TAT using 6210-bound insoluble carrier 0.02M containing 10% glycerin as the first reagent
200 μl of the first reagent using Tris buffer (pH 9.0)
, Add 20 μl of a sample solution containing TAT, and add
After heating for 2 minutes, one volume of each of the 26210-bound insoluble carrier suspensions (26210-bound Lx, 26210-bound protein A-Lx, 26210- Combined anti-M
Solution 100 mixed with IgG-R.MoAb-Lx solution)
μl was added and stirred. Thereafter, 1 at a wavelength of 600 nm
The change in absorbance for 5 minutes was measured. Obtained absorbance and TA
Table 1 shows the relationship between the T concentrations.
【００３３】[0033]
【表１】 [Table 1]
【００３４】この結果から明らかなように、本発明によ
れば、ＴＡＴ特異モノクローナル抗体を直接ラテックス
に感作するより、低濃度のＴＡＴを測定できる。As is clear from the results, according to the present invention, a lower concentration of TAT can be measured than by directly sensitizing a latex with a TAT-specific monoclonal antibody.
【００３５】[0035]
【発明の効果】本発明方法によれば、被検試料中の抗原
物質を簡便、迅速かつ高感度に検出し得る。According to the method of the present invention, an antigen substance in a test sample can be detected simply, quickly and with high sensitivity.
Claims (4)
抗体又はその断片をリガンドとし得るレセプターを介し
て担持された不溶性担体と、被検試料中の抗原物質に非
免疫学的に結合する物質を担持した不溶性担体とを被検
試料中の抗原物質と反応させ、生じる凝集を測定するこ
とを特徴とする抗原物質の免疫学的測定法。1. An antibody against an antigenic substance in a test sample non-immunologically binds to an insoluble carrier carried via a receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand, and an antigenic substance in the test sample. A method for immunologically measuring an antigenic substance, comprising reacting an insoluble carrier carrying a substance with an antigenic substance in a test sample and measuring the resulting aggregation.
セプターが、該リガンドと反応し単独で凝集を生じない
抗体、プロテインＡ又はプロテインＧである請求項１記
載の測定法。2. The method according to claim 1, wherein the receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand is an antibody, protein A or protein G which reacts with the ligand and does not cause aggregation alone.
する物質がヘパリン、アミノ酸、色素、オリゴヌクレオ
チド、ＡＭＰ・ＡＤＰ、ゼラチン、ベンザミジン、金属
イオン保持体、レクチン、ボロン酸誘導体又はステロイ
ドである請求項１記載の測定法。3. The substance that non-immunologically binds to an antigen substance in a test sample is heparin, amino acid, dye, oligonucleotide, AMP / ADP, gelatin, benzamidine, metal ion carrier, lectin, boronic acid derivative or steroid. The method according to claim 1, wherein
抗体又はその断片をリガンドとし得るレセプターを介し
て担持された不溶性担体と、被検試料中の抗原物質に非
免疫学的に結合する物質を担持した不溶性担体とを含有
する抗原物質の免疫学的測定試薬。4. An antibody against an antigenic substance in a test sample non-immunologically binds to an insoluble carrier carried via a receptor capable of using the antibody or a fragment thereof as a ligand, and an antigenic substance in the test sample. An immunological assay reagent for an antigenic substance, comprising an insoluble carrier carrying the substance.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8357998A JPH11281646A (en) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | Immunological measuring method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8357998A JPH11281646A (en) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | Immunological measuring method |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11281646A true JPH11281646A (en) | 1999-10-15 |
Family
ID=13806417
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8357998A Pending JPH11281646A (en) | 1998-03-30 | 1998-03-30 | Immunological measuring method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11281646A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016136863A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | 積水メディカル株式会社 | L-fabp immunoassay method and assay reagent used in said method |
-
1998
- 1998-03-30 JP JP8357998A patent/JPH11281646A/en active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2016136863A1 (en) * | 2015-02-25 | 2016-09-01 | 積水メディカル株式会社 | L-fabp immunoassay method and assay reagent used in said method |
| KR20170118858A (en) * | 2015-02-25 | 2017-10-25 | 세키스이 메디칼 가부시키가이샤 | The immunological measurement method of L-FABP and the measurement reagent used in the method |
| JPWO2016136863A1 (en) * | 2015-02-25 | 2017-11-30 | 積水メディカル株式会社 | Method for immunological measurement of L-FABP and measurement reagent used in the method |
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