JP2001108681A - Reagent for determining immunoagglutination and measuring method - Google Patents
Reagent for determining immunoagglutination and measuring methodInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は生体試料中の生理活
性物質を測定するための凝集試薬に関するものであり、
特定の試料に含まれている特定の物質の量を定性あるい
は定量するものである。この試薬は医学薬学をはじめ、
生体成分を分析する様々な分野で利用可能である。The present invention relates to an agglutinating reagent for measuring a physiologically active substance in a biological sample,
It qualitatively or quantitatively determines the amount of a specific substance contained in a specific sample. This reagent is used in medicine and pharmacy,
It can be used in various fields for analyzing biological components.
【０００２】[0002]
【従来の技術】生体試料中の特定の物質を測定しようと
いう試みは以前から盛んに行われている。生体試料中の
特定物質を検出する方法としては、生体由来の特異的相
互作用を利用する方法が知られており、その中でも抗原
と抗体の親和性を利用した検出方法は現在臨床検査の分
野を初めとして様々な分野で広く用いられている。2. Description of the Related Art Attempts to measure a specific substance in a biological sample have been actively made for a long time. As a method for detecting a specific substance in a biological sample, a method using a specific interaction derived from a living body is known. Among them, a detection method using the affinity between an antigen and an antibody is currently in the field of clinical testing. Initially, it is widely used in various fields.
【０００３】抗原抗体反応を利用した特定物質の検出法
はイムノアッセイと呼ばれ、様々な測定原理によって抗
原抗体反応の検出が可能になっている。その中の1つで
あり比較的古典的な方法に凝集反応がある。この方法で
は、抗原や抗体に比べると圧倒的に大きな不溶性担体粒
子に、抗原あるいは抗体を固定化して、測定対象物であ
る生体試料と混合することによってそこで抗原抗体反応
を生じさせる。この抗原抗体反応は不溶性担体粒子の表
面で起こり、抗体が複数個の抗原と結合しうる性質を有
していることから、不溶性担体粒子の凝集が生じるとい
う反応を測定原理としたものである。[0003] A method for detecting a specific substance using an antigen-antibody reaction is called an immunoassay, and it is possible to detect the antigen-antibody reaction by various measurement principles. One of them is a relatively classical method called agglutination. In this method, an antigen or antibody is immobilized on insoluble carrier particles, which are much larger than an antigen or antibody, and mixed with a biological sample to be measured, thereby causing an antigen-antibody reaction. This antigen-antibody reaction occurs on the surface of the insoluble carrier particles, and since the antibody has a property capable of binding to a plurality of antigens, the reaction is based on the reaction that aggregation of the insoluble carrier particles occurs.
【０００４】不溶性担体粒子としては、現在までに赤血
球を始め、炭素粉末、ゼラチン粒子など様々な素材が使
われてきた。その中でもポリスチレンなどを材料とした
ラテックス粒子は、その粒径が均一である、表面状態が
物質の固定に好都合である、等の利点から幅広く利用さ
れるようになってきた。[0004] As the insoluble carrier particles, various materials such as red blood cells, carbon powder, gelatin particles and the like have been used so far. Among them, latex particles made of polystyrene or the like have been widely used because of their advantages, such as uniform particle size and favorable surface condition for fixing substances.
【０００５】現在までにポリスチレンラテックスを利用
した体外診断用医薬品としてはCRP測定試薬、便中ヘモ
グロビン測定試薬など、また測定装置としては、凝集の
度合いを吸光度や散乱光でとらえる自動分析装置、凝集
の程度をシースフロー中での散乱光強度でとらえる自動
分析装置などが市販されている。近年、生体試料中の物
質には遊離の状態のものと、何らかのそれに対応する結
合分子と結合している状態で存在する物質がいくつか知
られてきており、その遊離状態のものと結合状態のもの
を別個に測定することの臨床的意義が示されてきてい
る。また、遊離体と複合体を両方とも検出したいという
要望のある項目も存在する。To date, CRP measurement reagents and fecal hemoglobin measurement reagents, etc., have been used as in vitro diagnostic drugs utilizing polystyrene latex, and automatic analyzers for measuring the degree of agglutination by absorbance or scattered light have been used. Automatic analyzers that measure the degree by the scattered light intensity in the sheath flow are commercially available. In recent years, it has been known that a substance in a biological sample is in a free state and some substances are present in a state of being bound to some corresponding binding molecule. The clinical significance of measuring things separately has been shown. In addition, there is an item for which it is desired to detect both the educt and the complex.
【０００６】例えば凝固因子はそのほとんどがプロテア
ーゼとそのインヒビターであり、各酵素は前駆体、活性
型、インヒビターとの複合体のような形で血中に存在し
ている。ある凝固因子は特定のインヒビターと結合する
ことが知られており、その複合体の量が病状を反映する
場合が知られている。例としては、アンチトロンビンII
Iはトロンビンのインヒビターであり、両者の複合体(TA
T)はDICの状態を反映するとされている。For example, most coagulation factors are proteases and their inhibitors, and each enzyme is present in the blood in the form of a precursor, an active form, or a complex with an inhibitor. Certain coagulation factors are known to bind to specific inhibitors, and the amount of the complex is known to reflect a disease state. For example, Antithrombin II
I is an inhibitor of thrombin and the complex of both (TA
T) is said to reflect the status of DIC.
【０００７】また、プラスミンはそのインヒビターであ
るプラスミンインヒビターと複合体を形成することが知
られており、その複合体(PIC)の測定は凝固状態の反映
に役立っている。[0007] Plasmin is known to form a complex with its inhibitor, plasmin inhibitor, and the measurement of the complex (PIC) is useful for reflecting the coagulation state.
【０００８】また凝固因子以外では、前立腺の腫瘍マーカー
であるPSAが複合体を形成していることがよく知られて
いる。PSAはプロテアーゼであり、血中ではその多くは
各種のプロテアーゼインヒビターと結合している。その
中のα1-アンチキモトリプシン(ACT)との複合体(PSA-AC
T)はがん患者でその濃度が上昇するといわれており、新
たな腫瘍マーカーとして期待されている。In addition to coagulation factors, it is well known that PSA, a prostate tumor marker, forms a complex. PSA is a protease, and most of it is bound to various protease inhibitors in blood. Complex with α1-antichymotrypsin (ACT) (PSA-AC
T) is said to increase its concentration in cancer patients and is expected as a new tumor marker.
【０００９】また通常ラテックス凝集に使用するポリク
ローナル抗体や、あるモノクローナル抗体を使用する
と、測定対象物質の血中存在様式が遊離のものと複合体
化しているものがあった場合、その反応性に差が生じる
場合がある。PSAではこのことが原因となり、各社のキ
ット間でその測定値が乖離することが知られている。現
在PSAでは遊離PSAとPSA-ACTが同じように反応する試薬
をイクイモラーな試薬、両者に反応差のある試薬をスク
イーズな試薬として区別している。臨床的な意義はイク
イモラーな試薬の方が高いということが明らかにされて
いる。In addition, when a polyclonal antibody or a certain monoclonal antibody which is usually used for latex agglutination is used, if the presence of the substance to be measured in the blood is complexed with that of a free substance, the reactivity may differ. May occur. In PSA, this is the cause, and it is known that the measured values differ between the kits of each company. At present, PSA distinguishes between reagents in which free PSA and PSA-ACT react in the same way as equimolar reagents and reagents that have a difference between the two as squeeze reagents. The clinical significance has been shown to be higher for equimolar reagents.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】本発明は、測定対象物
質の存在様式の如何にかかわらず、測定対象物質の正確
な血中濃度を出せる試薬と、複合体のみを特異的に測定
する試薬ならびに、両者を測定する新たな方法を提供す
ることを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to a reagent capable of producing an accurate blood concentration of a substance to be measured, a reagent for specifically measuring only a complex, and a reagent, irrespective of the existence mode of the substance to be measured. It is intended to provide a new method for measuring both.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】本発明の免疫凝集測定用
試薬は、（１）測定対象物質が遊離状態であっても、そ
れに対応する結合分子と結合した複合体であっても結合
可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不溶性担
体粒子を含む第１粒子懸濁液、（２）前記測定対象物質
が遊離状態であっても、それに対応する結合分子と結合
した複合体であっても結合可能であって、さらに前記第
１モノクローナル抗体と競合しない第２モノクローナル
抗体を感作した第２不溶性担体粒子を含む第２粒子懸濁
液、及び、（３）前記測定対象物質が遊離状態では認識
しないが前記測定対象物質がそれに対応する結合分子と
結合した複合体を認識する第３モノクローナル抗体を感
作した第３不溶性担体粒子を含む第３粒子懸濁液、を含
むことを特徴とする。The reagent for measuring immunoagglutination according to the present invention is capable of (1) binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule. A first particle suspension containing first insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody; (2) a complex bound to a corresponding binding molecule even when the substance to be measured is in a free state; And a second particle suspension containing second insoluble carrier particles sensitized with a second monoclonal antibody that does not compete with the first monoclonal antibody, and (3) the substance to be measured is in a free state. A third particle suspension containing third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody that does not recognize the target substance but recognizes a complex bound to the corresponding binding molecule. You .
【００１２】さらに、本発明の免疫凝集測定法は、
（１）測定対象物質が遊離状態であっても、それに対応
する結合分子と結合した複合体であっても結合可能な第
１モノクローナル抗体を感作した第１不溶性担体粒子
と、前記測定対象物質が遊離状態であっても、それに対
応する結合分子と結合した複合体であっても結合可能で
あって、さらに前記第１モノクローナル抗体と競合しな
い第２モノクローナル抗体を感作した第２不溶性担体粒
子を用いて粒子凝集法により測定物質の総量を測定し、
次いで、（２）前記第１不溶性担体粒子と前記第２不溶
性担体粒子のうちいずれか、及び前記測定対象物質が遊
離状態では認識しないが前記測定対象物質がそれに対応
する結合分子と結合した複合体を認識する第３モノクロ
ーナル抗体を感作した第３不溶性担体粒子、を用いて粒
子凝集法により前記測定対象物質がそれに対応する結合
分子と結合した複合体の量を測定する、ことを特徴とす
る。Furthermore, the immunoagglutination assay of the present invention
(1) First insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule, and the substance to be measured Is in a free state, or can be bound even if it is a complex bound to a corresponding binding molecule, and is further sensitized with a second monoclonal antibody that does not compete with the first monoclonal antibody. The total amount of the substance to be measured is measured by the particle aggregation method using
Next, (2) a complex in which one of the first insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particles and the measurement target substance are not recognized in a free state but the measurement target substance is bound to a corresponding binding molecule. Using a third insoluble carrier particle sensitized with a third monoclonal antibody recognizing the amount of a complex in which the substance to be measured is bound to a corresponding binding molecule using a particle agglutination method. .
【００１３】また、本発明の免疫凝集測定用試薬は、
（１）測定対象物質が遊離状態であっても、それに対応
する結合分子と結合した複合体であっても結合可能な第
１モノクローナル抗体を感作した第１不溶性担体粒子、
及び前記測定対象物質が遊離状態であっても、それに対
応する結合分子と結合した複合体であっても結合可能で
あって、さらに前記第１モノクローナル抗体と競合しな
い第２モノクローナル抗体を感作した第２不溶性担体粒
子を含む測定対象物質測定用試薬、及び、（２）前記第
１不溶性担体粒子と前記第２不溶性担体粒子のうちいず
れか、及び前記測定対象物質が遊離状態では認識しない
が前記測定対象物質がそれに対応する結合分子と結合し
た複合体を認識する第３モノクローナル抗体を感作した
第３不溶性担体粒子を含む複合体測定用試薬、との組み
合わせとすることもできる。Further, the reagent for measuring immunoagglutination of the present invention
(1) First insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule,
And sensitizing a second monoclonal antibody which is capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule, and which does not compete with the first monoclonal antibody. A reagent for measuring a substance to be measured including second insoluble carrier particles, and (2) one of the first and second insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particle, and the substance to be measured is not recognized in a free state but is not recognized. It can also be combined with a reagent for measuring a complex containing third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody that recognizes a complex in which the substance to be measured is bound to the corresponding binding molecule.
【００１４】[0014]
【発明の実施の形態】測定対象物質とそれに対応する結
合分子の組み合わせとしては、例えば、プロテインＣと
プロテインＣインヒビター、エラスターゼとアンチトリ
プシン、カテプシンＧとＡＣＴ、ＰＳＡとＡＣＴ、ＰＳ
Ａとα2−マクログロブリン、トロンビンとアンチトロ
ンビンIII、Ｃ1−エステラーゼとＣ1−インヒビター、
ｔ−ＰＡとＰＡＩ−１、ｕＰＡとＰＡＩ−１、プラスミ
ンとα2−アンチプラスミン、ＰＳＡとα1−プロテアー
ゼインヒビター、ＰＳＡとプロテインＣインヒビター、
およびその逆の組み合わせ等が挙げられる。また、これ
らの組み合わせで複合体を形成する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Examples of combinations of a substance to be measured and a binding molecule corresponding thereto include, for example, protein C and protein C inhibitor, elastase and antitrypsin, cathepsin G and ACT, PSA and ACT, PS
A and α2-macroglobulin, thrombin and antithrombin III, C1-esterase and C1-inhibitor,
t-PA and PAI-1, uPA and PAI-1, plasmin and α2-antiplasmin, PSA and α1-protease inhibitor, PSA and protein C inhibitor,
And the reverse combination. Further, a complex is formed by a combination of these.
【００１５】本発明を実現するためにはモノクローナル
抗体の特異性に関する厳密な分析が不可欠であり、使用
するモノクローナル抗体を厳密に選択することによって
実現される。In order to realize the present invention, a strict analysis on the specificity of the monoclonal antibody is indispensable, and it is realized by strictly selecting the monoclonal antibody to be used.
【００１６】測定対象物質と結合するモノクローナル抗
体のうち、遊離状態でも複合体形成後もその結合力に変
化のない抗体であって、その両者がお互いに相手と競合
しないような2種類のモノクローナル抗体を選択する。
(A,B)[0016] Among the monoclonal antibodies that bind to the substance to be measured, two types of monoclonal antibodies that do not change their binding strength even in the free state or after complex formation, and that both do not compete with each other. Select
(A, B)
【００１７】選択のしかたとしては、各々のモノクロー
ナル抗体を感作したラテックスを各々調製し混合してラ
テックス試薬とし、実際に測定対象物質を添加して凝集
が起これば競合せず、凝集が起こらなければ競合すると
判断できる。As a selection method, latexes sensitized with each monoclonal antibody are prepared and mixed to form a latex reagent, and if the substance to be measured is actually added and aggregation occurs, no competition occurs and aggregation does not occur. If not, it can be determined that there is competition.
【００１８】また、複合体を形成する結合分子に特異的
なモノクローナル抗体、あるいは複合体に特異的に結合
するモノクローナル抗体を1種類用意する。（Ｃ）Further, one kind of a monoclonal antibody specific to a binding molecule forming a complex or a monoclonal antibody specifically binding to a complex is prepared. (C)
【００１９】3種類のモノクローナル抗体を感作したラ
テックスを調製し、それをそれぞれ特定の2種類を組み
合わせて用いることにより、測定対象物質の血中濃度を
遊離状態と複合状態の構成比に影響されることなく測定
できる試薬と、複合体のみに特異的な試薬を同時に調製
できることを見いだした。本発明は複数の存在様式を有
する生体成分の分析全てに有用な方法であり、また複合
体のみに選択性を持たせることも可能な画期的な技術で
ある。By preparing latex sensitized with three kinds of monoclonal antibodies and using each of them in combination of two specific types, the blood concentration of the substance to be measured is influenced by the composition ratio between the free state and the complex state. It has been found that a reagent that can be measured without the need and a reagent specific to only the complex can be prepared simultaneously. INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is a method which is useful for all analyzes of biological components having a plurality of existence modes, and is a revolutionary technique capable of giving selectivity only to a complex.
【００２０】すなわち、AとBを組み合わせて試薬を調製
することにより、遊離体と複合体の両方に同じように反
応する試薬の調製が可能であり、CをAあるいはBのどち
らか片方と組み合わせることによって複合体を選択的に
測定することが出来る試薬となる。That is, by preparing a reagent by combining A and B, it is possible to prepare a reagent that reacts in the same manner for both the free form and the complex, and combines C with either A or B. Thus, the reagent can be used for selectively measuring the complex.
【００２１】ここで使用する抗体はモノクローナルな抗
体である必要がある。特に複合体測定系においては、遊
離抗原で凝集が起こらないためには、抗原に特異的な抗
体が抗原に対して1分子しか結合できないことが重要に
なってくる。もしAあるいはBにポリクローナル抗体や、
モノクローナル抗体でも抗原分子上に複数存在する同じ
エピトープを認識するような抗体を使用すると、この抗
体を感作したラテックスはそれ1種類で遊離抗原と凝集
を生じてしまい、複合体の選択性は失われてしまう。The antibodies used here need to be monoclonal antibodies. In particular, in the complex measurement system, it is important that an antigen-specific antibody can bind only one molecule to the antigen in order to prevent aggregation with free antigen. If A or B has a polyclonal antibody,
If an antibody that recognizes the same multiple epitopes on the antigen molecule is used even for a monoclonal antibody, the latex sensitized with this antibody will aggregate with the free antigen by itself, and the complex will lose its selectivity. I will be.
【００２２】なお、抗体を固定化する不溶性担体粒子と
してはラテックス粒子が有用である。凝集反応を目視で
測定するのであれば、担体粒子としては血球、炭素粉
末、ゼラチン粒子など既知の粒子凝集法に利用されてい
る担体粒子を使用することは可能である。しかしなが
ら、シースフロー中を流れる担体粒子に、レーザー光を
照射し、その前方散乱光強度から凝集の程度を測定しよ
うとする場合、粒径が均一なラテックス粒子が望まし
い。Latex particles are useful as the insoluble carrier particles for immobilizing the antibody. If the agglutination reaction is measured visually, it is possible to use carrier particles used in known particle agglutination methods, such as blood cells, carbon powder, and gelatin particles, as the carrier particles. However, when the carrier particles flowing in the sheath flow are irradiated with laser light and the degree of agglomeration is measured from the forward scattered light intensity, latex particles having a uniform particle size are desirable.
【００２３】ラテックス粒子への抗体の結合は既存のど
んな方法でもとることが出来る。ポリスチレンの表面は
疎水性であるため、抗体はラテックス表面に物理的に吸
着可能である。また、表面にアミノ基やカルボキシル基
を有するラテックス粒子を用いるのならば、共有結合的
にラテックス粒子表面に抗体を結合することが出来る。
その場合は様々な2価性試薬(グルタルアルデヒド、カル
ボジイミド、マレイミド、サクシイミド等)が使用可能
である。The binding of the antibody to the latex particles can be achieved by any existing method. Because the surface of polystyrene is hydrophobic, antibodies can be physically adsorbed on the latex surface. When latex particles having an amino group or a carboxyl group on the surface are used, the antibody can be covalently bonded to the surface of the latex particles.
In that case, various bivalent reagents (glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide, succinimide, etc.) can be used.
【００２４】このようにして、本発明により測定対象物
質の全量と、複合体の量とを3種類のモノクローナル抗
体を感作したラテックスを組み合わせて測定することに
よって測定することができるようになる。またこの両方
の測定値から遊離状態の測定対象物質の量を計算で求め
ることは容易である。このことにより、測定対象物質の
試料中の全量、遊離体の量、複合体の量という3種類の
測定結果が得られ、これらを利用することにより、新た
な測定意義が生じてくる。As described above, according to the present invention, the total amount of the substance to be measured and the amount of the complex can be measured by measuring the latex sensitized with three types of monoclonal antibodies. Further, it is easy to calculate the amount of the substance to be measured in a free state from both the measured values. As a result, three types of measurement results, that is, the total amount of the substance to be measured in the sample, the amount of the educt, and the amount of the complex are obtained, and the use of these results has new significance in measurement.
【００２５】例えばPSAの場合、血中のPSA濃度が上昇す
る疾患としては前立腺肥大症と前立腺癌があり、両者を
鑑別診断することが近年重要とされている。両疾患とも
PSAの総量は増加するが、前立腺癌においてはACTとの複
合体であるPSA-ACTの量が遊離体よりも上昇する場合が
多く、総PSA量あるいは遊離PSA量とPSA-ACT複合体量を
同時に測定することによって、前立腺肥大と前立腺癌の
鑑別診断に有用であるという報告が数多く出されてい
る。総PSA量のみの測定であれば、PSA4〜10ng/mlの範囲
内は前立腺肥大症と前立腺癌が混在するグレイゾーンと
いわれている。PSAが10ng/ml以上になれば前立腺癌であ
る可能性が非常に大きくなるのであるが、グレイゾーン
の検体に対する鑑別診断の手段は今までなかった。そこ
でグレイゾーンの検体中のPSA-ACT量を測定することに
より、両者の鑑別診断に有効であるという報告が行われ
ている。前立腺眼中のPSAでは前立腺肥大症よりもPSA-A
CTの割合が高いという報告がいくつかある。したがっ
て、PSA-ACT複合体の定量と遊離体と総量の濃度比(F/T
比)を求めることは、臨床的意義は非常に大きい。For example, in the case of PSA, there are prostatic hyperplasia and prostate cancer as diseases in which the PSA concentration in the blood increases, and it has recently been important to make a differential diagnosis of both. Both diseases
Although the total amount of PSA increases, the amount of PSA-ACT, which is a complex with ACT, is often higher in prostate cancer than in the free form, and the total PSA amount or the amount of free PSA and the amount of PSA-ACT complex are reduced. There have been many reports that simultaneous measurement is useful for differential diagnosis of prostate hypertrophy and prostate cancer. If only the total PSA amount is measured, the range of 4 to 10 ng / ml PSA is said to be a gray zone in which prostatic hyperplasia and prostate cancer are mixed. If the PSA is 10 ng / ml or more, the possibility of prostate cancer is greatly increased, but there has been no means for differential diagnosis of gray zone specimens. Therefore, it has been reported that by measuring the amount of PSA-ACT in the gray zone sample, it is effective for differential diagnosis of both. PSA in the prostate eye is PSA-A more than prostatic hypertrophy
There are some reports that CT rates are high. Therefore, the quantification of the PSA-ACT complex and the concentration ratio of the free form and the total amount (F / T
Finding the ratio) is of great clinical significance.
【００２６】[0026]
【実施例】以下に実施例を示す。Examples are shown below.
【００２７】PSA測定試薬とPSA-ACT測定試薬の調製 抗PSAモノクローナル抗体はScrippsラボラトリーズ社よ
り購入した。購入したモノクローナル抗体の特異性はPS
AとPSA-ACTの両方に反応するモノクローナル抗体で、お
互いに競合しないもの2種類(A,B) Ａ：anti-PSA Lot.No. BA324025 Ｂ：anti-PSA Lot.No. BB196010 PSAにもACTにも反応せずにPSA-ACTにのみ反応するモノ
クローナル抗体( C ) Ｃ：anti-PSA-ACT complex Lot.No. BA324024 である。Preparation of PSA measuring reagent and PSA-ACT measuring reagent The anti-PSA monoclonal antibody was purchased from Scripps Laboratories. The specificity of the purchased monoclonal antibody is PS
BB196010 Monoclonal antibodies that react with both A and PSA-ACT and do not compete with each other (A, B) A: anti-PSA Lot.No. BA324025 B: anti-PSA Lot.No. Monoclonal antibody (C) which reacts only with PSA-ACT without reacting with C: C: anti-PSA-ACT complex Lot. No. BA324024.
【００２８】なお、上記２つのモノクローナル抗体
（Ａ，Ｂ）がお互いに競合するかしないかは、以下に示
した方法にしたがって、モノクローナル抗体感作ラテッ
クス試薬を各々調製し、実際にＰＳＡを添加して凝集が
起こることを確認することによってモノクローナル抗体
を選択した。The two monoclonal antibodies (A, B) compete with each other to determine whether or not the monoclonal antibody-sensitized latex reagents are prepared according to the following method, and PSA is actually added. A monoclonal antibody was selected by confirming that aggregation occurred.
【００２９】モノクローナル抗体感作ラテックスの調製 各モノクローナル抗体を100μg/mlの濃度になるように
ｐＨ６．２PBS（５０ｍＭリン酸塩）に希釈した。Preparation of Monoclonal Antibody Sensitized Latex Each monoclonal antibody was diluted to a concentration of 100 μg / ml in pH 6.2 PBS (50 mM phosphate).
【００３０】ポリスチレンラテックスは積水化学（株）
製の粒径0.78μmのもので、濃度は10%(w/v)のものを使
用した。Polystyrene latex is available from Sekisui Chemical Co., Ltd.
The particle size was 0.78 μm, and the concentration was 10% (w / v).
【００３１】ラテックス浮遊液100μlに抗体溶液2mlを
混合し、4℃で一晩静置した。2 μl of the antibody solution was mixed with 100 μl of the latex suspension and allowed to stand at 4 ° C. overnight.
【００３２】10000rpmの遠心を行い上清を除去後、1%BS
AをｐＨ６．２PBS（５０ｍＭリン酸塩）に溶解した溶液
を2ml添加し粒子を分散させた。この操作を２回行った
後、同溶液2mlにラテックス粒子を分散させて懸濁液と
しラテックス試薬とした。After centrifugation at 10,000 rpm to remove the supernatant, 1% BS
2 ml of a solution of A dissolved in pH 6.2 PBS (50 mM phosphate) was added to disperse the particles. After performing this operation twice, latex particles were dispersed in 2 ml of the same solution to obtain a suspension, which was used as a latex reagent.
【００３３】各モノクローナル抗体ごとに抗体感作ラテ
ックスを調製し、3種類のモノクローナル抗体感作ラテ
ックス試薬を調製した。An antibody-sensitized latex was prepared for each monoclonal antibody, and three types of monoclonal antibody-sensitized latex reagents were prepared.
【００３４】PSA及びPSA-ACTの測定 3種類のラテックス試薬のうちA（第１不溶性担体粒子懸
濁液）とB（第２不溶性担体粒子懸濁液）を1:1で混合し
たものをPSA測定用ラテックス試薬（測定対象物質測定
用試薬）、AとC（第３不溶性担体粒子懸濁液）を1:1で
混合したものをPSA-ACT測定用ラテックス試薬（複合体
測定用試薬）として用意した。Measurement of PSA and PSA-ACT Of the three types of latex reagents, a mixture of A (first insoluble carrier particle suspension) and B (second insoluble carrier particle suspension) in a ratio of 1: 1 was used as PSA. A latex reagent for measurement (reagent for measuring the target substance), a mixture of A and C (third insoluble carrier particle suspension) at a ratio of 1: 1 are used as a latex reagent for PSA-ACT measurement (reagent for measuring complex). Prepared.
【００３５】反応緩衝液として、5%のBSAを含むｐＨ
６．０PBS（５０ｍＭリン酸塩）を用意した。As a reaction buffer, pH containing 5% BSA
6.0 PBS (50 mM phosphate) was prepared.
【００３６】またキャリブレータとして、1%BSAを含む
ｐＨ７．０PBS（５０ｍＭリン酸塩）に溶解したPSA及び
PSA-ACTを用意した。この両者はアボットラボラトリー
ズ社のＩＭｘ（登録商標）システム及びＩＭｘ PSA Ass
ay試薬を用いて濃度を測定し、表示値をつけた。As a calibrator, PSA dissolved in pH 7.0 PBS (50 mM phosphate) containing 1% BSA and
PSA-ACT was prepared. Both are based on Abbott Laboratories' IMx® system and IMx PSA Ass
The concentration was measured using the ay reagent and given the indicated value.
【００３７】PSA及びPSA-ACTキャリブレータの表示値は
以下の通り。The display values of the PSA and PSA-ACT calibrator are as follows.
【００３８】[0038]
【表１】 [Table 1]
【００３９】[0039]
【表２】 [Table 2]
【００４０】なお、濃度0の溶液はキャリブレータの溶
媒を使用した。The solution having a concentration of 0 used a calibrator solvent.
【００４１】測定にはPAMIA-50(シスメックス（株）製)
を用いた。この装置は反応緩衝液80μl、ラテックス試
薬10μl、測定試料10μlを混合し、45℃で凝集反応を起
こし、15分の反応後、その凝集率をシースフロー中での
半導体レーザーによる前方散乱光強度によって測定する
装置である。ラテックスの凝集度は約10万個の粒子を測
定し、トータルの粒子計数値(T)と凝集した粒子の計数
値(P)からP/Tとして%で算出される。For the measurement, PAMIA-50 (manufactured by Sysmex Corporation)
Was used. This device mixes 80 μl of reaction buffer, 10 μl of latex reagent, and 10 μl of measurement sample, initiates an agglutination reaction at 45 ° C, and after 15 minutes of reaction, measures the agglutination rate by the forward scattered light intensity of the semiconductor laser in the sheath flow. It is a device for measuring. The agglomeration degree of latex is measured by measuring about 100,000 particles, and is calculated as P / T in% from the total particle count (T) and the count of aggregated particles (P).
【００４２】PSA測定試薬およびPSA-ACT測定試薬の測定
結果は以下の通りであった。The measurement results of the PSA measurement reagent and PSA-ACT measurement reagent were as follows.
【００４３】PSA測定試薬の測定結果Measurement results of PSA measurement reagent
【表３】 [Table 3]
【００４４】PSA-ACT測定試薬の測定結果Measurement results of PSA-ACT measurement reagent
【表４】 [Table 4]
【００４５】両試薬ともPSAあるいはPSA-ACTの濃度に依
存して凝集率は上昇し、反応していることが確認でき
た。The agglutination rate of both reagents increased depending on the concentration of PSA or PSA-ACT, confirming that the reagents were reacted.
【００４６】PSA測定試薬の特異性調査 PSA測定試薬は、そのモノクローナル抗体の性質から考
えると、PSAおよびPSA-ACTの両方と反応することが考え
られるのでその確認を行った。Investigation of the specificity of the PSA measuring reagent The PSA measuring reagent was confirmed to react with both PSA and PSA-ACT in view of the properties of the monoclonal antibody.
【００４７】PSAとPSA-ACTとを異なる割合で混合した試
料を調製し、それを測定することにより、PSAとPSA-ACT
の反応性を調べることとした。A sample in which PSA and PSA-ACT are mixed at different ratios is prepared and measured, whereby PSA and PSA-ACT are obtained.
Was determined.
【００４８】PSAとPSA-ACTの混合比を100:0,80:20,60:4
0,40:60,20:80,0:100となるような試料を調製した。こ
のときトータルのPSAは全て同じとした。それをPSA測定
用試薬で測定したところ、100:0の測定値を100%とした
ときの各試料の相対測定値は、以下の通りとなった。The mixing ratio of PSA and PSA-ACT is set to 100: 0, 80:20, 60: 4
Samples were prepared so as to be 0,40: 60,20: 80,0: 100. At this time, the total PSA was all the same. When it was measured with a PSA measurement reagent, the relative measured value of each sample when the measured value of 100: 0 was 100% was as follows.
【００４９】[0049]
【表５】 [Table 5]
【００５０】表に示した通り、ほぼ一定の値を示した。
このことから、このPSA測定試薬はPSAとPSA-ACTをほぼ
等価に測定していると考えられる。As shown in the table, the value was almost constant.
From this, it is considered that this PSA measurement reagent measures PSA and PSA-ACT almost equivalently.
【００５１】PSA-ACT測定試薬の特異性調査 PSA-ACT測定試薬はPSA-ACTに特異的な抗体を使用してい
るので、その凝集はPSA-ACTに特異的なはずである。そ
れを確認するために交差反応性試験を行った。Investigation of Specificity of PSA-ACT Measurement Reagent Since the PSA-ACT measurement reagent uses an antibody specific to PSA-ACT, its aggregation should be specific to PSA-ACT. A cross-reactivity test was performed to confirm this.
【００５２】交差反応性の測定はPSAとACTで行った。遊
離状態のPSAとACTを含む試料を測定して、PSA-ACT測定
用試薬がどの程度反応するかを調べた。The measurement of cross-reactivity was performed with PSA and ACT. A sample containing free PSA and ACT was measured to determine the degree of reaction of the PSA-ACT measurement reagent.
【００５３】まず、既知濃度のPSA-ACTキャリブレータ
を調製し（濃度はＩＭｘョを用いて決定した）、PSA-ACT
測定用試薬を用いてこのキャリブレータをPAMIA-50で測
定し、PSA-ACT濃度と凝集率P/T(%)の関係を示す検量線
を作成した。First, a PSA-ACT calibrator having a known concentration was prepared (concentration was determined using IMx), and PSA-ACT was prepared.
This calibrator was measured with a PAMIA-50 using a measurement reagent, and a calibration curve showing the relationship between the PSA-ACT concentration and the aggregation rate P / T (%) was created.
【００５４】次に、高濃度の遊離状態のPSA（366.6ng/m
l）及びACT（1.25mg/ml）を試料として、PSA-ACT測定用
試薬を用いてPAMIA-50で測定し、各々の凝集率P/T(%)に
相当するPSA-ACT量を上記検量線から求めた。Next, a high concentration of free PSA (366.6 ng / m
l) and ACT (1.25 mg / ml) as samples, measure with PAMIA-50 using PSA-ACT measurement reagent, and determine the amount of PSA-ACT corresponding to each agglutination rate P / T (%) Determined from the line.
【００５５】その結果、上記遊離状態のPSAは、PSA-ACT
量としては3.70ng/mL（したがってPSAに対する交差反応
性は1.0%）、上記遊離状態のACTは、PSA-ACT量としては
1.00ng/mL（したがってACTに対する交差反応性は０．８
×１０-4%）であり、この測定試薬はPSA-ACTに特異的で
あることが示された。As a result, the PSA in the free state was converted to PSA-ACT
The amount of 3.70 ng / mL (therefore, the cross-reactivity to PSA is 1.0%).
1.00 ng / mL (thus the cross-reactivity to ACT is 0.8
× 10 -4 %), indicating that this measurement reagent was specific to PSA-ACT.
【００５６】[0056]
【発明の効果】本発明を使用すれば、まず総PSA量を測
定するラテックスの組合せの試薬（第１不溶性担体粒子
と第２不溶性担体粒子との組み合わせ（総PSA量測定用
試薬））で検体をスクリーニングし、総PSA量の多かっ
た検体に対して、複合体の量を測定するラテックス試薬
（第１不溶性担体粒子と第２不溶性担体粒子のいずれか
と第３不溶性担体粒子の組み合わせ（PSA-ACT複合体測
定用試薬））を用いることにより、より詳細なスクリー
ニングが可能である。この場合、3種類のラテックス試
薬を必要量だけ事前に混合して総PSA量測定用試薬及びP
SA-ACT複合体測定用試薬として測定を行ってもいいし、
測定装置内で3種類のラテックス試薬（第１不溶性担体
粒子懸濁液、第２不溶性担体粒子懸濁液及び第３不溶性
担体粒子懸濁液）を必要量だけ自動的に混合して測定を
行ってもよい。例えば、総PSA量測定に際しては、ま
ず、第１不溶性担体粒子懸濁液及び第２不溶性担体粒子
懸濁液を必要量だけ自動的に採取して反応チャンバ内で
混合した後に測定を行い、次いで、第１不溶性担体粒子
懸濁液と第３不溶性担体粒子懸濁液を必要量だけ自動的
に採取して反応チャンバ内で混合した後にPSA-ACT複合
体測定を行うことができる。本発明を用いることにより
3つの測定データ(総量、遊離体量、複合体量)を3種類の
モノクローナル抗体感作ラテックスを任意に組み合わせ
ることによって得ることが可能になった。この方法によ
る2段階スクリーニングは試薬の無駄がない最も効率的
な測定方法であり、目的とする測定項目に適合した試薬
を必要量だけ調製できる有効な方法ということができ
る。According to the present invention, first, a sample of a latex combination reagent (a combination of the first insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particles (reagent for measuring the total PSA amount)) is used as a sample to measure the total PSA amount. And a latex reagent (a combination of any of the first insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particles and the third insoluble carrier particles (PSA-ACT More detailed screening is possible by using the complex measurement reagent)). In this case, the three types of latex reagents are mixed in advance in the required amount, and the total PSA amount measurement reagent and P
The measurement may be performed as a reagent for SA-ACT complex measurement,
The required amount of three types of latex reagents (the first insoluble carrier particle suspension, the second insoluble carrier particle suspension, and the third insoluble carrier particle suspension) are automatically mixed and measured in the measuring device. You may. For example, when measuring the total PSA amount, first, the first insoluble carrier particle suspension and the second insoluble carrier particle suspension are automatically collected by a required amount and mixed in the reaction chamber, and then the measurement is performed. The required amounts of the first insoluble carrier particle suspension and the third insoluble carrier particle suspension are automatically collected and mixed in the reaction chamber, and then the PSA-ACT complex measurement can be performed. By using the present invention
It became possible to obtain three measurement data (total amount, free body amount, complex amount) by arbitrarily combining three types of monoclonal antibody-sensitized latex. The two-step screening by this method is the most efficient measurement method with no waste of the reagent, and can be said to be an effective method for preparing a required amount of a reagent suitable for a target measurement item.
Claims (3)
も、それに対応する結合分子と結合した複合体であって
も結合可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不
溶性担体粒子を含む第１粒子懸濁液、（２）前記測定対
象物質が遊離状態であっても、それに対応する結合分子
と結合した複合体であっても結合可能であって、さらに
前記第１モノクローナル抗体と競合しない第２モノクロ
ーナル抗体を感作した第２不溶性担体粒子を含む第２粒
子懸濁液、及び、（３）前記測定対象物質が遊離状態で
は認識しないが前記測定対象物質がそれに対応する結合
分子と結合した複合体を認識する第３モノクローナル抗
体を感作した第３不溶性担体粒子を含む第３粒子懸濁
液、を含むことを特徴とする免疫凝集測定用試薬。(1) The first insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule. A first particle suspension containing (2) the substance to be measured can be bound even if it is in a free state or a complex bound to a binding molecule corresponding to the substance, and can be combined with the first monoclonal antibody. A second particle suspension containing second insoluble carrier particles sensitized with a non-competitive second monoclonal antibody, and (3) a binding molecule which does not recognize the substance to be measured in a free state but has a corresponding substance to be measured. A third particle suspension containing third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody recognizing a complex bound with the third monoclonal antibody.
も、それに対応する結合分子と結合した複合体であって
も結合可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不
溶性担体粒子、及び前記測定対象物質が遊離状態であっ
ても、それに対応する結合分子と結合した複合体であっ
ても結合可能であって、さらに前記第１モノクローナル
抗体と競合しない第２モノクローナル抗体を感作した第
２不溶性担体粒子を含む測定対象物質測定用試薬、及
び、（２）前記第１不溶性担体粒子と前記第２不溶性担
体粒子のうちいずれか、及び前記測定対象物質が遊離状
態では認識しないが前記測定対象物質がそれに対応する
結合分子と結合した複合体を認識する第３モノクローナ
ル抗体を感作した第３不溶性担体粒子を含む複合体測定
用試薬、を含むことを特徴とする免疫凝集測定用試薬。(1) a first insoluble carrier particle sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding even if a substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule; And sensitizing a second monoclonal antibody which is capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule, and which does not compete with the first monoclonal antibody. A reagent for measuring a substance to be measured including second insoluble carrier particles, and (2) one of the first and second insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particle, and the substance to be measured is not recognized in a free state but is not recognized. The substance to be measured includes a reagent for measuring a complex including third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody recognizing a complex bound to the corresponding binding molecule. Characteristic reagent for immunoagglutination measurement.
も、それに対応する結合分子と結合した複合体であって
も結合可能な第１モノクローナル抗体を感作した第１不
溶性担体粒子と、前記測定対象物質が遊離状態であって
も、それに対応する結合分子と結合した複合体であって
も結合可能であって、さらに前記第１モノクローナル抗
体と競合しない第２モノクローナル抗体を感作した第２
不溶性担体粒子を用いて粒子凝集法により測定物質の総
量を測定し、次いで、（２）前記第１不溶性担体粒子と
前記第２不溶性担体粒子のうちいずれか、及び前記測定
対象物質が遊離状態では認識しないが前記測定対象物質
がそれに対応する結合分子と結合した複合体を認識する
第３モノクローナル抗体を感作した第３不溶性担体粒子
を用いて粒子凝集法により前記測定対象物質がそれに対
応する結合分子と結合した複合体の量を測定する、こと
を特徴とする免疫凝集測定法。(1) First insoluble carrier particles sensitized with a first monoclonal antibody capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule. The second monoclonal antibody which is capable of binding even if the substance to be measured is in a free state or a complex bound to a corresponding binding molecule, and which does not compete with the first monoclonal antibody, was sensitized. Second
The total amount of the measurement substance is measured by the particle aggregation method using the insoluble carrier particles, and then (2) any one of the first insoluble carrier particles and the second insoluble carrier particles, and the substance to be measured is in a free state. Using the third insoluble carrier particles sensitized with a third monoclonal antibody which does not recognize but recognize the complex in which the substance to be measured binds to the corresponding binding molecule, the substance to be measured binds to the corresponding substance by the particle aggregation method. An immunoagglutination assay, wherein the amount of a complex bound to a molecule is measured.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP28616699A JP2001108681A (en) | 1999-10-07 | 1999-10-07 | Reagent for determining immunoagglutination and measuring method |
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|---|---|
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005106609A (en) * | 2003-09-30 | 2005-04-21 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Reagent for immunological measurement |
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| JP2010237105A (en) * | 2009-03-31 | 2010-10-21 | Eiken Chem Co Ltd | Immunoassay reagent and immunoassay method |
| WO2012133482A1 (en) | 2011-03-28 | 2012-10-04 | 積水メディカル株式会社 | Psa assay method and reagent therefor |
-
1999
- 1999-10-07 JP JP28616699A patent/JP2001108681A/en active Pending
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