JPH11271219A - Surface plasmon resonance system immunoassay device - Google Patents
Surface plasmon resonance system immunoassay deviceInfo
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- JPH11271219A JPH11271219A JP11987098A JP11987098A JPH11271219A JP H11271219 A JPH11271219 A JP H11271219A JP 11987098 A JP11987098 A JP 11987098A JP 11987098 A JP11987098 A JP 11987098A JP H11271219 A JPH11271219 A JP H11271219A
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- G01N21/05—Flow-through cuvettes
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、プリズム上に形成
した金薄膜の表面近傍の媒体の屈折率の変化から、試料
溶液中の生体分子の濃度を測定する表面プラズモン共鳴
方式免疫測定装置に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a surface plasmon resonance type immunoassay for measuring the concentration of biomolecules in a sample solution from a change in the refractive index of a medium near the surface of a gold thin film formed on a prism.
【０００２】[0002]
【従来の技術】金属薄膜を一つの側面に形成したプリズ
ムに、別の側面から金属薄膜形成面に対して全反射角度
で光線を入射したときに、金属薄膜の表面でエバネッセ
ント光と表面プラズマ波の共鳴が起きるために、反射光
強度が減少する現象は既に知られている。そして、この
現象を用いて金属薄膜の表面近傍の媒体の屈折率を測定
するための表面プラズモン共鳴デバイス、さらには同デ
バイスを使って金属薄膜表面で生じる抗原抗体反応等の
生体分子どうしの相互作用を調べる装置および測定法は
既に知られている。2. Description of the Related Art When a light beam is incident on a prism having a metal thin film formed on one side at a total reflection angle from the other side to the surface on which the metal thin film is formed, evanescent light and surface plasma waves are generated on the surface of the metal thin film. The phenomenon that the intensity of the reflected light decreases due to the resonance of the light is already known. A surface plasmon resonance device for measuring the refractive index of the medium near the surface of the metal thin film using this phenomenon, and the interaction between biomolecules such as an antigen-antibody reaction generated on the surface of the metal thin film using the device. The device and the measuring method for checking are already known.
【０００３】表面プラズモン共鳴デバイスは、その特徴
を生かして様々な分野において利用されているが、特に
抗原抗体反応の計測の分野において盛んに利用されてい
る。以下に表面プラズモン共鳴デバイス、同デバイスを
用いた免疫測定装置、同装置を用いた生体分子検出方法
について詳細に説明する。[0003] The surface plasmon resonance device is utilized in various fields taking advantage of its characteristics, and is particularly actively used in the field of measurement of an antigen-antibody reaction. Hereinafter, a surface plasmon resonance device, an immunoassay device using the device, and a biomolecule detection method using the device will be described in detail.
【０００４】図１に従来の表面プラズモン共鳴デバイス
の構造の概略を示す。従来の表面プラズモン共鳴デバイ
スは、一般的に、多角形もしくは半円形のプリズム１の
一つの側面の上に金属薄膜２を形成したものである。特
にこのデバイスを利用して抗原抗体反応により生体分子
を検出する場合には、金属薄膜の上に抗体あるいは抗原
を固定化している。金属薄膜としては厚さ５０ｎｍ〜６
０ｎｍ程度の金の薄膜が用いられる事が多いが、ガラス
とこれらの金属薄膜との密着性を向上させる目的で通常
は１〜５ｎｍ程度のクロム等の層を間に形成する。FIG. 1 schematically shows the structure of a conventional surface plasmon resonance device. A conventional surface plasmon resonance device generally has a polygonal or semicircular prism 1 having a metal thin film 2 formed on one side surface. In particular, when a biomolecule is detected by an antigen-antibody reaction using this device, an antibody or an antigen is immobilized on a metal thin film. 50nm ~ 6 thickness as metal thin film
Although a gold thin film of about 0 nm is often used, a layer of chromium or the like having a thickness of about 1 to 5 nm is usually formed between the glass and the metal thin film for the purpose of improving the adhesion.
【０００５】なお、デバイスの取扱いを簡単にするため
に、図２の様に実際にはプリズムに直接金属薄膜を形成
するのではなく、プリズム１と同じ材質のガラス板３の
上に金属薄膜２を形成し、使用時にガラスと同じ屈折率
を有するマッチングオイル４を介してこのガラス板をプ
リズムに密着させる方式が取られることが多い。しか
し、本申請書類では便宜上ガラス板がマッチングオイル
を介してプリズムに装着されたものも単にプリズムとし
て記述する。In order to simplify the handling of the device, the metal thin film is not formed directly on the prism as shown in FIG. Is formed, and the glass plate is closely attached to the prism via a matching oil 4 having the same refractive index as glass when used. However, in this application, for convenience, a glass plate attached to a prism via a matching oil is simply described as a prism.
【０００６】プリズム型の表面プラズモン共鳴デバイス
５は、図３の様に半導体レーザー（ＬＤ）あるいは発光
ダイオード（ＬＥＤ）等の単色光源６、電荷結合素子
（ＣＣＤ）あるいはフォトトランジスタ等の光検出器
７、偏光板３３と組み合わせて一体化された装置として
使用される。表面プラズモン共鳴デバイス、単色光源、
および光検出器は、単色光源の光がプリズムのガラス面
から入射され、金属薄膜形成面で全反射し、再びガラス
面から出射されて偏光板を通り光検出器で検出される様
に配置される。ただし、偏光板はＰ偏光（電場がプリズ
ムに対する光の入射面に平行）のみが透過する様に配置
される。表面プラズモン共鳴を起こしその結果として反
射光強度が減少しうるのはＰ偏光のみである。As shown in FIG. 3, a prism type surface plasmon resonance device 5 includes a monochromatic light source 6 such as a semiconductor laser (LD) or a light emitting diode (LED), and a photodetector 7 such as a charge coupled device (CCD) or a phototransistor. , And a polarizing plate 33 to be used as an integrated device. Surface plasmon resonance device, monochromatic light source,
And the photodetector are arranged such that the light of the monochromatic light source enters from the glass surface of the prism, is totally reflected by the metal thin film forming surface, is emitted again from the glass surface, passes through the polarizing plate, and is detected by the photodetector. You. However, the polarizing plate is arranged so that only P-polarized light (the electric field is parallel to the plane of incidence of light on the prism) is transmitted. Only P-polarized light can cause surface plasmon resonance and consequently reduce the reflected light intensity.
【０００７】図４に示すように、この様な光学系が配置
された装置の光検出器の出力８は、表面プラズモン共鳴
現象のため、全反射であるにもかかわらず反射光の吸収
９が観測される。このとき反射光強度が最小となる角度
（共鳴角度）θと金属薄膜に接している媒体の屈折率ｎ
との関係は次式で表されることが知られている： Ｋｐ・ｓｉｎ（θ）＝ω／ｃ・｛ε・ｎ２／（ε＋
ｎ２）｝１／２ 但し、この式においてＫｐは入射光の波数、ωは入射光
の角周波数、ｃは光速、εは金属薄膜の誘電率を表す。
この式から、金属薄膜に接する媒体の屈折率およびその
変化量を共鳴角度θから知ることができる。ただし、表
面プラズモン共鳴現象に影響を与える媒体層は、金属薄
膜の表面から高々数１００ｎｍの範囲に限られる。従っ
て、共鳴角度を計測することにより金属薄膜の表面から
高々数１００ｎｍの範囲の媒体の屈折率およびその変化
を知ることができる。As shown in FIG. 4, the output 8 of the photodetector of the device in which such an optical system is disposed has absorption 9 of the reflected light despite the total reflection due to the surface plasmon resonance phenomenon. Observed. At this time, the angle (resonance angle) θ at which the reflected light intensity becomes minimum and the refractive index n of the medium in contact with the metal thin film
Is known to be expressed by the following equation: Kp · sin (θ) = ω / c · ｛ε · n 2 / (ε +
n 2 )｝ 1/2 where Kp is the wave number of the incident light, ω is the angular frequency of the incident light, c is the speed of light, and ε is the dielectric constant of the metal thin film.
From this equation, the refractive index of the medium in contact with the metal thin film and the amount of change thereof can be known from the resonance angle θ. However, the medium layer that affects the surface plasmon resonance phenomenon is limited to a range of at most several hundred nm from the surface of the metal thin film. Therefore, by measuring the resonance angle, the refractive index of the medium within a range of at most several hundred nm from the surface of the metal thin film and its change can be known.
【０００８】屈折率およびその変化量が測定できる媒体
はプリズムより低い屈折率を有するもの全てが対象と成
りうるが、特に抗原抗体反応を検出する場合は水溶液と
なる。図５に示す様に表面プラズモン共鳴デバイス５を
組み込んだ免疫反応検出装置は、フローセル１１を金属
薄膜の上に形成し、フローシステムとして用いられるこ
とが多い。この場合、抗体１２（あるいは抗原）が金属
薄膜上に固定されており、対応する抗原１３（あるいは
抗体）を含む溶液１４がフローセルに入ると金属薄膜表
面で抗原抗体反応が起こり、金属薄膜表面近傍の屈折率
が変化するために共鳴角度θが変化する。このθを測定
することにより、金属薄膜表面近傍の屈折率の変化がわ
かり、このことから溶液中の抗原あるいは抗体の濃度を
知ることができる。[0008] The medium whose refractive index and its change can be measured can be any medium having a refractive index lower than that of a prism. In particular, when an antigen-antibody reaction is detected, an aqueous solution is used. As shown in FIG. 5, an immune reaction detection device incorporating the surface plasmon resonance device 5 has a flow cell 11 formed on a metal thin film and is often used as a flow system. In this case, the antibody 12 (or antigen) is fixed on the metal thin film, and when the solution 14 containing the corresponding antigen 13 (or antibody) enters the flow cell, an antigen-antibody reaction occurs on the surface of the metal thin film, and the vicinity of the surface of the metal thin film Changes the resonance angle θ. By measuring this θ, the change in the refractive index near the surface of the metal thin film can be determined, and from this, the concentration of the antigen or antibody in the solution can be determined.
【０００９】一般的に、抗体は、物理的吸着法、化学的
結合法、あるいは高分子担体法を使ってプリズム上の金
属薄膜に固定化される。ここで物理的吸着とは抗体と金
属薄膜との間の静電相互作用、ファンデルワールス力等
の物理的相互作用により抗体が金属薄膜に吸着されるこ
とを指すが、結合力が弱いために長時間溶液にさらされ
ると抗体等が薄膜より脱落するために実用的な固定化法
とは言いがたい。一方、化学的結合法とは抗体を金属薄
膜に化学的結合力で固定化することを指す。この方法で
は、金属薄膜層として金を用い、金メルカプチド結合を
介して抗体を金属薄膜に固定化することが多い。また、
高分子担体法では金属基板上に固定化された高分子担体
に抗体を結合させる。この場合、高分子担体自身は金メ
ルカプチド結合を介して金薄膜に固定化される。Generally, an antibody is immobilized on a metal thin film on a prism using a physical adsorption method, a chemical bonding method, or a polymer carrier method. Here, the physical adsorption means that the antibody is adsorbed to the metal thin film due to the electrostatic interaction between the antibody and the metal thin film, a physical interaction such as van der Waals force, etc. When exposed to the solution for a long time, the antibody or the like drops off from the thin film, so it is hard to say that this is a practical immobilization method. On the other hand, the chemical bonding method refers to immobilizing an antibody to a metal thin film with a chemical bonding force. In this method, gold is often used as the metal thin film layer, and the antibody is often immobilized on the metal thin film via a gold mercaptide bond. Also,
In the polymer carrier method, an antibody is bound to a polymer carrier immobilized on a metal substrate. In this case, the polymer carrier itself is immobilized on the gold thin film via a gold mercaptide bond.
【００１０】従来の高分子担体膜は、均質な分子鎖長の
高分子を用いるために金薄膜上に緻密に高分子膜が形成
され、抗体等が担体膜内部に固定されにくく、かつ測定
の際に試料溶液中の生体分子が担体膜内部まで入り込み
にくいという問題がある。In the conventional polymer carrier film, since a polymer having a uniform molecular chain length is used, a polymer film is densely formed on a gold thin film, and antibodies and the like are hardly fixed inside the carrier film, and the measurement is difficult. In this case, there is a problem that it is difficult for the biomolecules in the sample solution to enter the inside of the carrier membrane.
【００１１】ところで、フローシステムでは、サンプル
溶液中の生体分子の濃度を測る際に、常に生体分子を含
まない溶液を流しておき、サンプル溶液を注入したとき
の共鳴角度の変化を測定する。すなわち、サンプル溶液
注入前後の共鳴角度の変化量を測定することになるが、
これはサンプル注入時以外では共鳴角度が経時的に安定
していることが前提となる。しかしながら、実際には溶
液の温度変動、圧力変動さらには組成の変動などが原因
となり共鳴角度を安定に保つことは容易ではない。特に
温度変動は大きな問題であり、例えば、水の温度が１℃
上昇すると水の屈折率が変化するため共鳴角度が０．０
１５度減少する。In the flow system, when measuring the concentration of biomolecules in a sample solution, a solution containing no biomolecules is always flowed, and the change in resonance angle when the sample solution is injected is measured. That is, the change amount of the resonance angle before and after the injection of the sample solution is measured,
This is based on the premise that the resonance angle is stable over time except at the time of sample injection. However, in practice, it is not easy to keep the resonance angle stable due to temperature fluctuation, pressure fluctuation, and composition fluctuation of the solution. In particular, temperature fluctuation is a major problem.
As the refractive index of water changes when it rises, the resonance angle becomes 0.0
Decrease by 15 degrees.
【００１２】従来の方式では、フローセルもしくはその
周囲の温度をサーミスタで測定し、同様にフローセルも
しくはその周囲に取り付けられたヒーターで溶液温度を
一定温度に保つことで共鳴角度の安定化を図っている。
しかし、このことは装置が巨大化する原因となってい
る。また、サーミスタとヒーターの取り付け位置が離れ
ている、フローセルの熱容量が大きい、などのためにフ
ローセルの温度は定温制御しているにもかかわらず、わ
ずかではあるが変動する。In the conventional method, the temperature of the flow cell or its surroundings is measured by a thermistor, and similarly, the solution temperature is kept at a constant temperature by a heater attached to the flow cell or its surroundings, thereby stabilizing the resonance angle. .
However, this causes the device to become huge. Also, the temperature of the flow cell fluctuates, albeit slightly, despite the fact that the thermistor and the heater are distant from each other and the heat capacity of the flow cell is large.
【００１３】[0013]
【発明が解決しようとする課題】上述のような従来技術
の高分子担体膜固定化方法およびフローセルの温度制御
法の問題に鑑み、発明が解決しようとする課題は、抗体
等を安定かつ高密度に保持しエバネッセント場を有効に
活用することで高精度に共鳴角度を測定できるような表
面プラズモン共鳴デバイスや方法を提供すること、また
フローセルの温度を測定しリアルタイムに共鳴角度を補
正する方式を採用することで小型化を可能にした表面プ
ラズモン共鳴方式免疫測定装置や方法を提供することで
ある。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the problems of the prior art method for immobilizing a polymer carrier membrane and the method for controlling the temperature of a flow cell as described above, the problem to be solved by the present invention is to stabilize antibodies and the like at high density. To provide a surface plasmon resonance device and method that can measure the resonance angle with high precision by effectively using the evanescent field by holding it at the same time, and adopting a method that measures the temperature of the flow cell and corrects the resonance angle in real time Accordingly, it is an object of the present invention to provide a surface plasmon resonance type immunoassay apparatus and method capable of downsizing.
【００１４】[0014]
【課題を解決するための手段】上記の課題は、図６に示
すように、プリズムの上の金薄膜表面に形成する高分子
担体として分子鎖長が互いに異なる２種類以上の高分子
を使用した表面プラズモン共鳴デバイスを用い、また、
フローセルにサーミスタを組み込み、同サーミスタによ
る測定温度を用いて共鳴角度の温度による経時変動を計
算によりリアルタイムに補正することで解決される。The above object is achieved, as shown in FIG. 6, by using two or more kinds of polymers having different molecular chain lengths as polymer carriers formed on the surface of a gold thin film on a prism. Using a surface plasmon resonance device,
The problem can be solved by incorporating a thermistor into the flow cell and correcting the variation with time of the resonance angle over time using the temperature measured by the thermistor.
【００１５】即ち、第１の要旨において、本発明はプリ
ズム上の金属薄膜表面に生体分子の固定化のための担体
である多糖類等の高分子膜を分子鎖長が互いに異なる２
種類以上の高分子を使って形成することにより成る表面
プラズモン共鳴デバイスを提供する。That is, in the first gist, according to the present invention, a polymer film such as a polysaccharide as a carrier for immobilizing biomolecules is provided on the surface of a metal thin film on a prism.
Provided is a surface plasmon resonance device formed by using more than one kind of polymer.
【００１６】また、第２の要旨において、本発明はフロ
ーセルにサーミスタを組み込み、同サーミスタによる測
定温度を用いて、共鳴角の温度による経時変動をリアル
タイムに補正する計算方法および表面プラズモン共鳴方
式免疫測定装置を提供する。According to a second aspect of the present invention, there is provided a calculation method for incorporating a thermistor into a flow cell, correcting a time-dependent change in resonance angle with time using a temperature measured by the thermistor, and a surface plasmon resonance type immunoassay. Provide equipment.
【００１７】本発明において、液体試料とは、測定すべ
き対象である特定の生体分子が共存している液体であっ
て、具体的には、血液、血清、血漿、尿、髄液などの体
液を例示できる。In the present invention, a liquid sample is a liquid in which a specific biomolecule to be measured coexists, and specifically, a body fluid such as blood, serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid. Can be exemplified.
【００１８】本発明において、生体分子とは、生体由来
の分子もしくは分子集合体、及びこれらの分子もしくは
分子集合体と相補的に結合する分子もしくは分子集合体
のことである。具体的には、酵素、抗体、レクチン等の
蛋白質、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、デンプン、デキス
トラン等の糖類、カルシウムやマグネシウムなどの無機
物質、尿素や乳酸等の有機物質などが例示できる。In the present invention, a biomolecule refers to a molecule or a molecular aggregate derived from a living body, and a molecule or a molecular aggregate that complementarily binds to these molecules or a molecular aggregate. Specific examples include proteins such as enzymes, antibodies and lectins, nucleic acids such as DNA and RNA, sugars such as starch and dextran, inorganic substances such as calcium and magnesium, and organic substances such as urea and lactic acid.
【００１９】本発明において、表面プラズモン共鳴方式
デバイスとは図７に示すごとく、プリズム１５もしくは
基板２０の上に、金属薄膜層１６が形成された構造をし
ているデバイスを意味する。さらには、図６に示すごと
く、金属薄膜層の上にさらに生体分子固定化用担体であ
る高分子膜２５を形成したものをも意味する。In the present invention, the surface plasmon resonance type device means a device having a structure in which a metal thin film layer 16 is formed on a prism 15 or a substrate 20, as shown in FIG. Further, as shown in FIG. 6, it also means that a polymer film 25 which is a carrier for immobilizing biomolecules is further formed on a metal thin film layer.
【００２０】本発明において、プリズムとは、石英やガ
ラスやポリメチルメタタリレートなどを例とする紫外、
可視、近赤外領域の光に対して透明で、しかも液体試料
より大きな屈折率を有する材質より成る光学部品を意味
する。その形状に特に制限は無いが、半円柱、三角柱、
台形柱などの形状を有するものが多くの場合に使われて
いる。なお、プリズムと同じ材質の基板の上に金属薄膜
を形成し、使用時にプリズムや基板と同じ屈折率を有す
るマッチングオイルを介してこの基板をプリズムに密着
させる方式が取られることが多い。本申請書類では便宜
上基板がマッチングオイルを介してプリズムに装着され
たものも単にプリズムと呼ぶ。In the present invention, the prism means an ultraviolet ray such as quartz, glass, polymethyl methacrylate, or the like.
An optical component made of a material that is transparent to light in the visible and near-infrared regions and that has a higher refractive index than the liquid sample. There are no particular restrictions on the shape, but semi-cylindrical, triangular,
Those having a shape such as a trapezoidal column are used in many cases. In many cases, a metal thin film is formed on a substrate made of the same material as the prism, and the substrate is brought into close contact with the prism via a matching oil having the same refractive index as the prism or the substrate when used. In this application document, for convenience, a substrate mounted on a prism via a matching oil is also simply referred to as a prism.
【００２１】本発明において、抗体等の固定化担体とし
て用いる多糖類とは、グルコースなどの単糖類が直鎖も
しくは分枝して多数結合した通常の意味での多糖類、も
しくはこれらを化学的に修飾した物を意味し、例えば硫
酸化デキストラン、可溶性スターチ、カルボキシメチル
セルロースなどがある。図８の様に金属層２１に直接物
理的あるいは化学的方法によって抗体２２（あるいは抗
原）を固定した場合には、この抗体（あるいは抗原）は
金属薄膜表面より高々１０ナノメートル程度しか離れて
いない。しかしながら、一般に表面プラズモン共鳴セン
シングデバイスが屈折率の変化を検出できる層は、エバ
ネッセント光２４が到達する範囲、すなわち金属薄膜表
面より数百ナノメートルの範囲であり、抗体（あるいは
抗原）が固定されている層を除いて殆どの範囲が使用さ
れていない。しかるに図９のごとく分子量が大きくて長
い多糖類２５に抗体２２（あるいは抗原）を固定化した
場合には、金属薄膜表面より数百ナノメートルの範囲に
わたり抗体（あるいは抗原）が分布するので、抗原抗体
等の相補的結合反応によりこの全ての領域で屈折率変化
が生じるため抗原２３（あるいは抗体）の測定感度が高
まる。特に水に近い屈折率を有する多糖類を用いた場合
には、溶液の温度、ｐＨ、イオン強度等の変化により担
体の立体構造の変化は極めて小さく屈折率の変化が生じ
ないので信頼性の高い測定が可能である。In the present invention, the polysaccharide used as a carrier for immobilizing an antibody or the like is a polysaccharide in the ordinary sense in which a monosaccharide such as glucose is linearly or branched and is bonded in a large number, or a polysaccharide that is chemically synthesized. It means a modified product, for example, sulfated dextran, soluble starch, carboxymethylcellulose and the like. When the antibody 22 (or antigen) is directly fixed to the metal layer 21 by a physical or chemical method as shown in FIG. 8, the antibody (or antigen) is separated from the surface of the metal thin film by at most about 10 nm. . However, the layer in which the surface plasmon resonance sensing device can detect a change in the refractive index is generally in a range where the evanescent light 24 reaches, that is, in a range of several hundred nanometers from the surface of the metal thin film, and the antibody (or antigen) is immobilized. Most of the area is not used except for some layers. However, when the antibody 22 (or antigen) is immobilized on the long polysaccharide 25 having a large molecular weight as shown in FIG. 9, the antibody (or antigen) is distributed over several hundred nanometers from the surface of the metal thin film. Since the refractive index changes in all the regions due to the complementary binding reaction of the antibody or the like, the measurement sensitivity of the antigen 23 (or the antibody) is increased. In particular, when a polysaccharide having a refractive index close to that of water is used, a change in the temperature, pH, ionic strength, etc. of the solution causes a very small change in the three-dimensional structure of the carrier, and does not cause a change in the refractive index. Measurement is possible.
【００２２】本発明における表面プラズモン共鳴方式免
疫測定装置とは、液体試料中の特定生体分子の濃度を光
学的方法により測定するための装置であって、上述の本
発明の表面プラズモン共鳴デバイス、フローセル、イン
ジェクションバルブ、送液ポンプ、光源、光検出器、偏
光板、サーミスタ、コンピュータを有してなる装置を指
す。特に小型化を重視しない場合は、さらに温度コント
ローラやヒーターを組み込んでも良い。The surface plasmon resonance type immunoassay apparatus of the present invention is an apparatus for measuring the concentration of a specific biomolecule in a liquid sample by an optical method. , An injection valve, a liquid feed pump, a light source, a photodetector, a polarizing plate, a thermistor, and a computer. If the miniaturization is not particularly important, a temperature controller and a heater may be further incorporated.
【００２３】このような測定装置の構成を模式的に図１
０に示す。本発明の測定装置は、通常は次の様な使用形
態で用いられる。まず、表面プラズモン共鳴デバイス２
６の金属薄膜面にフローセル２７が装着される。このと
き、本デバイスには使用前に抗体（あるいは抗原）を結
合した多糖類が固定されているものとする。溶液は送液
ポンプ２８からインジェクションバルブ２９を介してフ
ローセルへと注入され、フローセルから出た溶液は廃液
溜３０に排出される。表面プラズモン共鳴デバイスには
光源３１から光線が入射され、フローセルとの界面で入
射光線は全反射し、偏光板３３を通して光検出器３４で
反射光は検出される。検出器の出力信号はコンピュータ
３８に取り込まれ反射光強度最小となる角度がリアルタ
イムでモニタリングされるものとする。検出器で検出さ
れる反射光強度から反射光強度最小角度（共鳴角度）を
計算するアルゴリズムは既存の手法が使用可能であり、
これ以上の説明は不要である。抗原等の生体分子を含む
試料はインジェクションバルブより注入され、ポンプか
ら送液される溶液の流れにのりフローセルに入り、デバ
イス最表面の金属薄膜表面で抗原抗体反応がおこる。こ
のとき、試料溶液注入前後の共鳴角度をそれぞれθ、
θ’とするとき、θ’−θから試料溶液中の抗原（ある
いは抗体）の濃度を算出する。FIG. 1 schematically shows the configuration of such a measuring apparatus.
0 is shown. The measuring device of the present invention is usually used in the following usage form. First, the surface plasmon resonance device 2
The flow cell 27 is mounted on the metal thin film surface of No. 6. At this time, it is assumed that a polysaccharide to which an antibody (or an antigen) is bound is fixed to the device before use. The solution is injected into the flow cell from the liquid sending pump 28 via the injection valve 29, and the solution discharged from the flow cell is discharged to the waste liquid reservoir 30. Light is incident on the surface plasmon resonance device from the light source 31, the incident light is totally reflected at the interface with the flow cell, and the reflected light is detected by the photodetector 34 through the polarizing plate 33. The output signal of the detector is taken into the computer 38 and the angle at which the reflected light intensity becomes minimum is monitored in real time. Existing algorithms can be used to calculate the minimum angle of reflected light intensity (resonance angle) from the reflected light intensity detected by the detector.
No further explanation is necessary. A sample containing a biomolecule such as an antigen is injected from an injection valve, flows into a flow of a solution sent from a pump, enters a flow cell, and an antigen-antibody reaction occurs on the surface of a metal thin film on the outermost surface of the device. At this time, the resonance angles before and after the sample solution injection are θ,
When θ ′, the concentration of the antigen (or antibody) in the sample solution is calculated from θ′−θ.
【００２４】フローセルの温度は同セルに取り付けられ
たサーミスタ３５により測定され、その出力信号はコン
ビュータに送られる。この測定温度を元に、共鳴角度の
温度変動分が計算され、測定値（測定される共鳴角度）
が補正される。その補正手順は、理想的には、フローセ
ルの温度から溶液の屈折率が計算され、その屈折率から
共鳴角度の温度変動を計算するものである。試料溶液の
屈折率と温度との関係は予め高精度屈折率計により測定
した関係を用いる。また、屈折率と温度変動との関係
は、初歩的な光学計算により求められるが、その計算方
法自体は周知のことであり、これ以上の説明は不要であ
る。なお、実際には、共鳴角度の温度変動は必ずしも上
述の理想通りにはならないことが多く、その場合には予
め測定した温度と共鳴角度との関係を使って補正を行
う。また、装置の小型化を特に重視しなくても良い場合
は、さらに温度コントローラとヒーターが装置に組み込
まれる。この場合は、サーミスタの出力信号は温度調節
コントローラ３６に送られ筐体内３７の温度がヒーター
により制御される。The temperature of the flow cell is measured by a thermistor 35 attached to the flow cell, and the output signal is sent to a computer. Based on the measured temperature, the temperature variation of the resonance angle is calculated, and the measured value (measured resonance angle)
Is corrected. In the correction procedure, ideally, the refractive index of the solution is calculated from the temperature of the flow cell, and the temperature variation of the resonance angle is calculated from the refractive index. As the relationship between the refractive index of the sample solution and the temperature, a relationship previously measured by a high-precision refractometer is used. Further, the relationship between the refractive index and the temperature fluctuation can be obtained by elementary optical calculation, but the calculation method itself is well known, and further explanation is unnecessary. In practice, the temperature fluctuation of the resonance angle does not always become the above-described ideal, and in such a case, the correction is performed using the relationship between the temperature and the resonance angle measured in advance. In addition, when it is not necessary to attach importance to miniaturization of the apparatus, a temperature controller and a heater are further incorporated in the apparatus. In this case, the output signal of the thermistor is sent to the temperature control controller 36, and the temperature of the inside 37 of the housing is controlled by the heater.
【００２５】[0025]
【実施例１】２５０ｍｇの硫酸化デキストラン（分子量
１２，１００）と２５０ｍｇの可溶性スターチ（分子量
２５８，０００）をそれぞれ３ｍｌの水に溶かした溶液
を、それぞれ２ｍｌの１１．７ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウ
ム溶液と混合し４時間かけて酸化処理を行った。この処
理はそれぞれの高分子の基本単位である糖分子のビシナ
ル水酸基をアルデヒド基に変えるものである。Example 1 A solution prepared by dissolving 250 mg of sulfated dextran (molecular weight: 12,100) and 250 mg of soluble starch (molecular weight: 258,000) in 3 ml of water was combined with 2 ml of 11.7 mM sodium periodate solution each. The mixture was mixed and oxidized for 4 hours. This treatment changes the vicinal hydroxyl group of the sugar molecule, which is the basic unit of each polymer, into an aldehyde group.
【００２６】次に、金蒸着ガラス基板を１０μＭアミノ
エタンチオール溶液に２４時間浸漬し洗浄した。この処
理はガラス基板の金蒸着面に金メルカプチド結合を介し
てアミノ基を導入するものである。Next, the gold-deposited glass substrate was immersed and washed in a 10 μM aminoethanethiol solution for 24 hours. In this treatment, an amino group is introduced into a gold deposition surface of a glass substrate via a gold mercaptide bond.
【００２７】そして上記の溶液を４２（硫酸化デキスト
ラン）対５８（可溶性スターチ）の比率で混合した溶液
０．６ｍｌを、上記のアミノエタンチオール浸漬後のガ
ラス基板の金蒸着面上に滴下し４時間反応させた。この
反応は金蒸着面上のアミノ基と高分子のアルデヒド基と
でシッフ結合を形成させ、高分子を金表面に固定化する
ものである。Then, 0.6 ml of a solution obtained by mixing the above solution at a ratio of 42 (sulfated dextran) to 58 (soluble starch) was dropped on the gold-deposited surface of the glass substrate immersed in the aminoethanethiol. Allowed to react for hours. This reaction forms a Schiff bond between the amino group on the gold deposition surface and the aldehyde group of the polymer, and immobilizes the polymer on the gold surface.
【００２８】さらに、０．６ｍｌのヒト血清アルブミン
溶液（５ｍｇ／ｍｌ）をこの基板上に滴下し３０分反応
させた。この反応は、金薄膜表面に固定された高分子の
アルデヒド基とアルブミンのアミノ基とでシッフ結合を
形成させ、アルブミンを高分子担体を介して金薄膜に固
定化するものである。Further, 0.6 ml of a human serum albumin solution (5 mg / ml) was dropped on the substrate and reacted for 30 minutes. In this reaction, a Schiff bond is formed between the aldehyde group of the polymer immobilized on the surface of the gold thin film and the amino group of albumin, and the albumin is immobilized on the gold thin film via the polymer carrier.
【００２９】その次に、１０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウ
ム溶液にこの基板を浸漬し洗浄した。これは、シッフ結
合を還元してアミド結合とし、化学的に安定化させるも
のである。Next, the substrate was immersed in a 10 mM sodium borohydride solution and washed. In this method, a Schiff bond is reduced to an amide bond and chemically stabilized.
【００３０】この様にして用意した金薄膜ガラス基板を
表面プラズモン共鳴測定装置のプリズムにマッチングオ
イルを介して装着し、２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）
を送液下、５０μＬの抗ヒトアルブミン（ヤギ）溶液を
インジェクションバルブより注入した後グリシン−塩酸
緩衝液（ｐＨ２．５）を注入するという動作を繰り返し
たときのセンサ応答（共鳴角の変化）を図１１に示す。
本図において、抗ヒトアルブミン溶液を注入した直後に
共鳴角度がオーバーシュートを示し、その後、一定の値
で安定している。そして、グリシン−塩酸緩衝液を注入
すると直後にアンダーシュートを示した後、抗ヒトアル
ブミン溶液注入前の値に戻っている。オーバーシュート
後の共鳴角と抗ヒトアルブミン溶液注入前の共鳴角との
差をプロットしたものを図１２に示す。The gold thin-film glass substrate prepared as described above was mounted on a prism of a surface plasmon resonance measuring device via a matching oil, and a 20 mM phosphate buffer solution (pH 7) was used.
The response of the sensor (change in resonance angle) when the operation of injecting 50 μL of an anti-human albumin (goat) solution from an injection valve and then injecting a glycine-hydrochloric acid buffer (pH 2.5) was repeated. As shown in FIG.
In this figure, the resonance angle shows an overshoot immediately after the injection of the anti-human albumin solution, and then stabilizes at a constant value. Then, immediately after the injection of the glycine-hydrochloric acid buffer solution, an undershoot was shown, and the value returned to the value before the injection of the anti-human albumin solution. FIG. 12 shows a plot of the difference between the resonance angle after overshoot and the resonance angle before injection of the anti-human albumin solution.
【００３１】[0031]
【実施例２】実施例１と同様の方法において、硫酸化デ
キストランと可溶性スターチの比率を様々に変えて作製
した表面プラズモン共鳴デバイスを用いて、２０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）を送液下、５０μＬの抗ヒトアル
ブミンをインジェタションバルブより注入したときの共
鳴角度の変化を図１３に示す。Example 2 In the same manner as in Example 1, a 20 mM phosphate buffer (pH 7) was sent using a surface plasmon resonance device prepared by changing the ratio of sulfated dextran to soluble starch. FIG. 13 shows the change in resonance angle when 50 μL of anti-human albumin was injected from the injection valve.
【００３２】[0032]
【実施例３】実施例１と同様の方法にて作製した表面プ
ラズモン共鳴デバイスを用いて、２０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７）を送液下、５０μＬの抗ヒトアルブミンをイ
ンジェクションバルブより注入した後グリシン−塩酸緩
衝液（ｐＨ２．５）を注入するという動作を、様々な濃
度の抗ヒトアルブミンに対して行った結果を図１４に示
す。Example 3 Using a surface plasmon resonance device prepared in the same manner as in Example 1, 50 μL of anti-human albumin was injected from an injection valve while sending 20 mM phosphate buffer (pH 7), and then glycine was injected. FIG. 14 shows the results of performing the operation of injecting a hydrochloric acid buffer (pH 2.5) on various concentrations of anti-human albumin.
【００３３】[0033]
【発明の効果】本発明の表面プラズモン共鳴方式免疫セ
ンサを使用することにより、溶液の温度の変動に影響さ
れにくく、かつ高感度に試料溶液中の生体分子の濃度を
測定できる。このことによって、従来よりも、より迅速
に、かつより正確に、かつリアルタイムに、血液、血
清、血漿、尿、髄液などの体液に含まれる特定成分の検
出が可能となる。The use of the surface plasmon resonance type immunosensor of the present invention makes it possible to measure the concentration of biomolecules in a sample solution with high sensitivity, without being affected by fluctuations in the temperature of the solution. This makes it possible to detect specific components contained in body fluids such as blood, serum, plasma, urine, and cerebrospinal fluid more quickly, more accurately, and in real time than before.
【図１】 従来の表面プラズモン共鳴センシングデバイ
スの一つの形態を模式的に示す概略図である。FIG. 1 is a schematic diagram schematically showing one form of a conventional surface plasmon resonance sensing device.
【図２】 従来の表面プラズモン共鳴センシングデバイ
スの別の形態を模式的に示す概略図である。FIG. 2 is a schematic view schematically showing another embodiment of the conventional surface plasmon resonance sensing device.
【図３】 従来の表面プラズモン共鳴センシングデバイ
スを用い、表面プラズモン共鳴現象を観測するための最
小の装置構成を模式的に示す概略図である。FIG. 3 is a schematic diagram schematically showing a minimum apparatus configuration for observing a surface plasmon resonance phenomenon using a conventional surface plasmon resonance sensing device.
【図４】 従来の表面プラズモン共鳴センシングデバイ
スを用い表面プラズモン共鳴現象を観測したときに、光
検出器で観測される反射光強度の角度依存性を示した図
である。FIG. 4 is a diagram showing the angle dependence of reflected light intensity observed by a photodetector when a surface plasmon resonance phenomenon is observed using a conventional surface plasmon resonance sensing device.
【図５】 従来の表面プラズモン共鳴センシングデバイ
スを組み込んだ抗原抗体反応検出装置を模式的に示す概
略図である。FIG. 5 is a schematic diagram schematically showing an antigen-antibody reaction detection device incorporating a conventional surface plasmon resonance sensing device.
【図６】 本発明の表面プラズモン共鳴センシングデバ
イスの一つの形態を模式的に示す概略図である。FIG. 6 is a schematic view schematically showing one embodiment of the surface plasmon resonance sensing device of the present invention.
【図７】 本発明の表面プラズモン共鳴センシングデバ
イスの一つの形態を模式的に示す概略図である。FIG. 7 is a schematic diagram schematically showing one embodiment of the surface plasmon resonance sensing device of the present invention.
【図８】 抗体（あるいは抗原）を表面プラズモン共鳴
センシングデバイスの金属薄膜表面に直接固定化した場
合の金属薄膜表面近傍の様子を示した図である。FIG. 8 is a diagram showing a state near a metal thin film surface when an antibody (or antigen) is directly immobilized on a metal thin film surface of a surface plasmon resonance sensing device.
【図９】 抗体（あるいは抗原）固定化担体である多糖
類を表面プラズモン共鳴センシングデバイスに用いた場
合の金属薄膜表面近傍の様子を示した図である。FIG. 9 is a diagram showing a state near the surface of a metal thin film when a polysaccharide as an antibody (or antigen) -immobilized carrier is used for a surface plasmon resonance sensing device.
【図１０】 本発明の表面プラズモン共鳴センシングデ
バイスを用い、試料溶液中の特定の生体分子の濃度を測
定するための装置を模式的に示す概略図である。ただ
し、図中の温度コントローラ及びヒーターは必須ではな
い。FIG. 10 is a schematic diagram schematically showing an apparatus for measuring the concentration of a specific biomolecule in a sample solution using the surface plasmon resonance sensing device of the present invention. However, the temperature controller and heater in the figure are not essential.
【図１１】 硫酸化デキストラン−可溶性スターチ固定
化膜担体を用いてヒトアルブミンを固定化した本発明の
表面プラズモン共鳴デバイスに抗ヒトアルブミンを注入
したときの共鳴角度の時間変化を示した図である。FIG. 11 is a diagram showing a time change of a resonance angle when anti-human albumin is injected into a surface plasmon resonance device of the present invention in which human albumin is immobilized using a sulfated dextran-soluble starch-immobilized membrane carrier. .
【図１２】 硫酸化デキストラン−可溶性スターチ固定
化膜担体を用いてヒトアルブミンを固定化した本発明の
表面プラズモン共鳴デバイスの抗ヒトアルブミンに対す
る繰り返し応答を示した図である。FIG. 12 is a diagram showing the repetitive response to anti-human albumin of the surface plasmon resonance device of the present invention in which human albumin is immobilized using a sulfated dextran-soluble starch-immobilized membrane carrier.
【図１３】 硫酸化デキストランと可溶性スターチの比
率を変えた固定化膜担体を用いた場合の、ヒトアルブミ
ンを固定化した本発明の表面プラズモン共鳴デバイス
の、抗ヒトアルブミン濃度に対する応答を示した図であ
る。FIG. 13 is a diagram showing the response of the surface plasmon resonance device of the present invention on which human albumin is immobilized to the anti-human albumin concentration when an immobilized membrane carrier in which the ratio of sulfated dextran to soluble starch is changed is used. It is.
【図１４】 硫酸化デキストラン−可溶性スターチ固定
化膜担体を用いてヒトアルブミンを固定化した本発明の
表面プラズモン共鳴デバイスの、抗ヒトアルブミン濃度
と応答の大きさとの関係を示した図である。FIG. 14 is a diagram showing the relationship between the concentration of anti-human albumin and the magnitude of response of the surface plasmon resonance device of the present invention in which human albumin is immobilized using a sulfated dextran-soluble starch-immobilized membrane carrier.
１ プリズム ２ 金属薄膜 ３ ガラス板 ４ マッチングオイル ５ 表面プラズモン共鳴デバイス ６ 光源 ７ 光検出器 ８ 表面プラズモン共鳴曲線 ９ 反射光強度吸収 １０ 臨界角 １１ フローセル １２ 抗体 １３ 抗原 １４ 溶液 １５ 表面プラズモン共鳴デバイス １６ 金属薄膜 ２１ 金属薄膜 ２２ 抗体 ２３ 抗原 ２４ エバネッセント光のエネルギー分布 ２５ 多糖類 ２６ 表面プラズモン共鳴デバイス ２７ フローセル ２８ 送液ポンプ ２９ インジェクションバルブ ３０ 廃液溜 ３１ 光源 ３３ 偏光板 ３４ 光検出器 ３５ サーミスタ ３６ 温度コントローラおよびヒーター ３７ 筐体 ３８ コンピュータ DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Prism 2 Metal thin film 3 Glass plate 4 Matching oil 5 Surface plasmon resonance device 6 Light source 7 Photodetector 8 Surface plasmon resonance curve 9 Reflected light intensity absorption 10 Critical angle 11 Flow cell 12 Antibody 13 Antigen 14 Solution 15 Surface plasmon resonance device 16 Metal Thin film 21 Metal thin film 22 Antibody 23 Antigen 24 Evanescent light energy distribution 25 Polysaccharide 26 Surface plasmon resonance device 27 Flow cell 28 Liquid feed pump 29 Injection valve 30 Waste liquid reservoir 31 Light source 33 Polarizing plate 34 Photodetector 35 Thermistor 36 Temperature controller and heater 37 housing 38 computer
Claims (5)
類以上の互いに分子鎖長の異なる高分子を金薄膜表面へ
固定化したものを用い、もってプリズム表面のエバネッ
セント場を有効に利用し、かつ高分子膜の空間占有率が
低いために抗原もしくは抗体が同膜の内部にまで容易に
侵入できる様にすることで、感度の増強を行う高分子担
体膜固定化方法、同方法で作製された表面プラズモン共
鳴デバイス、および同デバイスを用いた表面プラズモン
共鳴方式免疫測定装置。1. An immobilizing carrier for an antigen or an antibody, wherein two or more kinds of polymers having different molecular chain lengths are immobilized on the surface of a gold thin film, whereby the evanescent field on the prism surface is effectively used, and A polymer carrier membrane immobilization method that enhances sensitivity by allowing antigens or antibodies to easily penetrate into the interior of the membrane due to the low space occupancy of the polymer membrane. A surface plasmon resonance device and a surface plasmon resonance type immunoassay using the device.
として硫酸化デキストラン、可溶性スターチ、カルボキ
シメチルセルロースの中から少なくとも２種類以上を含
む糖鎖高分子膜を用いる高分子担体膜固定化方法、同方
法で作製された表面プラズモン共鳴デバイス、および同
デバイスを用いた表面プラズモン共鳴方式免疫測定装
置。2. The method for immobilizing a polymer carrier membrane according to claim 1, wherein a sugar chain polymer membrane containing at least two or more of sulfated dextran, soluble starch, and carboxymethyl cellulose is used as the polymer membrane material. A surface plasmon resonance device produced by the method, and a surface plasmon resonance type immunoassay using the device.
サーミスタによる測定温度を用いて、共鳴角度の温度に
よる経時変動を計算によりリアルタイムに補正する方式
により小型化を可能とした表面プラズモン共鳴方式免疫
測定装置。3. A surface plasmon resonance type immunoassay apparatus in which a thermistor is incorporated in a flow cell, and the temperature is measured by the thermistor, and the variation with time of the resonance angle due to temperature is corrected in real time by calculation.
サーミスタによる測定温度を用いて、同セルに取り付け
たヒーターの温度制御をし、かつ同ヒーターによる温度
制御で除去しきれない共鳴角度の経時変動を計算により
補正する方式の表面プラズモン共鳴方式免疫測定装置。4. A thermistor is incorporated in a flow cell, the temperature of the heater attached to the cell is controlled using the temperature measured by the thermistor, and the variation over time of the resonance angle that cannot be completely removed by the temperature control by the heater is calculated. Surface plasmon resonance type immunoassay system that corrects by using
鳴角の温度による経時変動をリアルタイムに補正する方
式の請求項３もしくは４の表面プラズモン共鳴方式免疫
測定装置。5. The surface plasmon resonance type immunoassay apparatus according to claim 3, wherein a time-dependent change of the resonance angle due to temperature is corrected in real time using the relationship between the refractive index of water and temperature.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11987098A JPH11271219A (en) | 1998-03-25 | 1998-03-25 | Surface plasmon resonance system immunoassay device |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11987098A JPH11271219A (en) | 1998-03-25 | 1998-03-25 | Surface plasmon resonance system immunoassay device |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11271219A true JPH11271219A (en) | 1999-10-05 |
Family
ID=14772311
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11987098A Pending JPH11271219A (en) | 1998-03-25 | 1998-03-25 | Surface plasmon resonance system immunoassay device |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
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