JPH11246600A - Monoclonal antibody, hybrid cell, and production of monoclonal antibody - Google Patents
Monoclonal antibody, hybrid cell, and production of monoclonal antibodyInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、モノクローナル抗
体、ハイブリッド細胞及びその製造方法に関する。特に
メチルグリオキサールとアミノ酸、ペプチドあるいは蛋
白質のアルギニン残基との反応物に対する高い特異性を
有するモノクローナル抗体、ハイブリッド細胞及びその
製造方法に関する。さらに詳しくは、アルグピリミジン
構造を特異的に認識するモノクローナル抗体とその抗体
を産生するハイブリッド細胞およびモノクローナル抗体
の製造方法に関する。[0001] The present invention relates to a monoclonal antibody, a hybrid cell and a method for producing the same. In particular, the present invention relates to a monoclonal antibody, a hybrid cell having high specificity for a reaction product of methylglyoxal with an arginine residue of an amino acid, peptide or protein, a hybrid cell, and a method for producing the same. More specifically, the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes an argupyrimidine structure, a hybrid cell producing the antibody, and a method for producing a monoclonal antibody.
【０００２】[0002]
【従来の技術】アミノ酸、ペプチドあるいは蛋白質のア
ミノ基は、還元糖のアルデヒド基と非酵素的に縮合し、
非酵素的に糖化され、糖化アミノ酸、糖化ペプチドある
いは糖化蛋白質（以下、「糖化蛋白質等」と略すことも
ある。）となることが知られている。該糖化反応は、メ
イラード反応と呼ばれ、この反応が生体内でも進行し、
老化や糖尿病合併症の進展に関与していることが知られ
ている（Ｂｉｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ｖｏｌ．１３，Ｎ
ｏ．７，ｐ１４，１９９６年）。メイラード反応は前期
段階および後期段階の反応に分けることができる。前期
段階の反応は、蛋白質の側鎖アミノ基やＮ末端アミノ基
と糖のカルボニル基が反応し、シッフ塩基を形成した
後、アマドリ転位化合物が形成される。生体内に存在す
る該前期段階反応生成物としては、例えば、ヘモグロビ
ンＡ１Ｃや糖化アルブミン等が知られており、さまざま
な病態、特に糖尿病に関与していることが知られてい
る。後期段階の反応は、上記前期段階反応の後、さらに
酸化・脱水・縮合・環状化等の複雑な反応を経由し、
蛍光性、褐色化、分子内・分子間架橋および生物
学的認識のうち少なくともどれか一つの特性を有する後
期反応生成物（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｌｙｃａｔｉｏｎ
Ｅｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．以下「ＡＧＥ」と略
す。）を生じる。該ＡＧＥ構造体としては、カルボキシ
メチルリジン、ピラリン、ペントシジン、クロスリン、
或いはＸ１等が提唱されている。ところで、糖化蛋白質
等に特異的に反応する抗体であって、特異的認識部位が
分子構造レベルで特定された抗体は、該抗体を抗原物質
の検出に使用した場合に正確、且つ精密に検出すること
ができるので、臨床診断、分析等において有用なもので
ある。抗原物質の検出方法としては、免疫化学的な検出
方法ならばいずれの方法でも使用することが可能である
が、具体的には免疫組織学的方法、酵素免疫学的測定法
等が挙げられる。従って、このような特定分子構造を特
異的に認識する抗体の出現が強く要望されている。2. Description of the Related Art Amino groups of amino acids, peptides or proteins are non-enzymatically condensed with aldehyde groups of reducing sugars.
It is known that non-enzymatic saccharification results in saccharified amino acids, saccharified peptides or saccharified proteins (hereinafter sometimes abbreviated as “saccharified proteins or the like”). The saccharification reaction is called a Maillard reaction, and this reaction proceeds in vivo,
It is known to be involved in the progression of aging and diabetic complications (Bio Industry vol. 13, N.
o. 7, p14, 1996). The Maillard reaction can be divided into early stage and late stage reactions. In the first-stage reaction, the side chain amino group or N-terminal amino group of the protein reacts with the carbonyl group of the sugar to form a Schiff base, and then an Amadori rearrangement compound is formed. As the early-stage reaction product existing in the living body, for example, hemoglobin A1C and glycated albumin are known, and it is known that they are involved in various disease states, particularly diabetes. The latter-stage reaction, after the above-mentioned first-stage reaction, further passes through complicated reactions such as oxidation, dehydration, condensation, and cyclization,
Advanced Glycation which has at least one property of fluorescence, browning, intramolecular / intermolecular crosslinking, and biological recognition
End Products. Hereinafter, it is abbreviated as “AGE”. ). Examples of the AGE structure include carboxymethyl lysine, pyralin, pentosidine, crosulin,
Alternatively, X1 or the like has been proposed. By the way, an antibody that specifically reacts with a glycated protein or the like, in which a specific recognition site is specified at a molecular structure level, is accurately and accurately detected when the antibody is used for detecting an antigenic substance. Therefore, it is useful in clinical diagnosis, analysis and the like. As a method for detecting an antigenic substance, any method can be used as long as it is an immunochemical detection method, and specific examples include an immunohistological method and an enzyme immunological measurement method. Therefore, the appearance of an antibody that specifically recognizes such a specific molecular structure is strongly demanded.
【０００３】前記のような背景から、上記ＡＧＥ構造体
に対する抗体が調製され、その免疫学的研究によれば、
老化・糖尿病、糖尿病性腎症或いは哺乳動物の眼球のレ
ンズクリスタリン等で陽性であることが知られている
（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８５．３８０−３８
４，１９９０年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，
３７５８−３７６４，１９８９年，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎ
ｖｅｓｔ．，８９．１１０２−１１１２，１９９２
年）。また、特開平９−１７８７４０号公報によれば、
カルボキシメチルリジンに対する抗体が糖尿病又は糖尿
病合併症用マーカーとして利用できることが記載されて
いる。[0003] Against such a background, an antibody against the above AGE structure was prepared, and according to its immunological studies,
It is known to be positive for aging / diabetes, diabetic nephropathy or lens crystallin of mammalian eyes (J. Clin. Invest., 85.380-38).
4, 1990, J. Mol. Biol. Chem. , 263,
3758-3764, 1989, J. Am. Clin. In
vest. , 89.1102-1111, 1992.
Year). According to Japanese Patent Application Laid-Open No. 9-178740,
It is described that antibodies to carboxymethyl lysine can be used as markers for diabetes or diabetic complications.
【０００４】一方、メチルグリオキサール（以下、「Ｍ
Ｇ」と略すこともある。）は、トリオースリン酸、ジヒ
ドロキシアセトンリン酸、あるいはグリセルアルデヒド
−３−リン酸の非酵素的あるいは酵素的異化により生体
内、特に血中に比較的多量に存在することが知られてお
り、糖尿病患者での血清レベルが高値であること、ある
いはストレプトゾトシンにより糖尿病を誘発したラット
の眼球レンズに多量に存在することが報告されている
（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ｖｏｌ４６，
ｐ８０５−８１１，１９９３年、Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．，
ｖｏｌ８７，ｐ２１−２９，１９９４年）。またさら
に、ＭＧは、生体内濃度レベルで蛋白質と反応して蛍光
性の産物を生成し、ＡＧＥを生成する直接的なメディエ
ーターとして機能することができるばかりでなく、糖尿
病や老化との関連性も報告されている（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，ｖｏｌ１２７０，ｐ
３６−４３，１９９５年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
ｖｏｌ２６９，ｐ３２２９９−３２３０５，１９９４
年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ２６７，ｐ４３
６４−４３６９，１９９２年）。従って、ＭＧと蛋白質
の反応により生じたＡＧＥ構造体を有する物質あるいは
部位を特異的に検出することにより糖化蛋白質等を検出
することは臨床学上、あるいは分析方法上非常に有用で
ある。On the other hand, methylglyoxal (hereinafter referred to as “M
G ". ) Are known to be present in relatively large amounts in vivo, especially in blood, due to non-enzymatic or enzymatic catabolism of triosephosphoric acid, dihydroxyacetone phosphate, or glyceraldehyde-3-phosphate. It has been reported that serum levels in patients are high or that they are present in large amounts in the ocular lens of rats in which streptozotocin induced diabetes (Biochem. Pharmacol. Vol 46,
p805-811, 1993, Clin. Sci. ,
vol 87, p21-29, 1994). Furthermore, MG not only can react with proteins at the in vivo concentration level to generate a fluorescent product and function as a direct mediator of AGE generation, but also has a relationship with diabetes and aging. Reported (Biochi
m. Biophys. Acta. , Vol 1270, p
36-43, 1995; Biol. Chem. ,
vol269, p32299-32305, 1994
Year, J. Biol. Chem. , Vol 267, p43
64-4369, 1992). Therefore, it is very useful clinically or analytically to detect a glycated protein or the like by specifically detecting a substance or site having an AGE structure generated by a reaction between MG and a protein.
【０００５】このような状況下、ＭＧで修飾されたアミ
ノ酸に対するポリクローナル抗体を使用した免疫組織学
的研究では、ヒト動脈硬化病巣には該ポリクローナル抗
体により強く染色される部位が存在することが報告され
ている（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ４１０，ｐ
３１３−３１８，１９９７年）。しかしながら、上記抗
体はポリクローナル抗体であり、抗体を得る場合、多
量の抗原が必要である、抗体の力価が製造毎に異な
る、経済的効率が低い等の問題があり、さらには抗体
の特異的認識部位が分子構造レベルで特定されていない
ため測定対象が明確でない等の問題が生じており、この
ようなデメリットのない、特定分子構造を特異的に認識
するモノクローナル抗体が必要とされている。ところ
で、ＭＧと蛋白質との反応は既に知られており、特にア
ミノ酸のアルギニン（Ａｒｇ）、リジン（Ｌｙｓ）とＭ
Ｇの反応がかなり詳細に論じられている｛Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６９，ｐ３２２９９−３２
３０５（１９９４年）、Ｊ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．ｖｏ
ｌ．１４（５），ｐ３５９−３７２（１９９５年）｝。
ＭＧは蛋白質やペプチドのアルギニン残基あるいはアミ
ノ酸のアルギニンと反応して次式の［１］[0005] Under these circumstances, immunohistological studies using a polyclonal antibody against amino acids modified with MG have reported that human atherosclerotic lesions have sites that are strongly stained by the polyclonal antibody. (FEBS Letters, vol 410, p
313-318, 1997). However, the above antibody is a polyclonal antibody, and when obtaining an antibody, there are problems that a large amount of antigen is required, the titer of the antibody varies depending on the production, the economic efficiency is low, and the like. Since the recognition site is not specified at the molecular structure level, there is a problem that the measurement target is not clear, and a monoclonal antibody that specifically recognizes a specific molecular structure without such disadvantages is required. By the way, the reaction between MG and protein is already known, and in particular, the amino acids arginine (Arg), lysine (Lys) and M
The reaction of G is discussed in considerable detail {J. Bio
l. Chem. , Vol. 269, p32299-32
305 (1994); Prot. Chem. vo
l. 14 (5), p359-372 (1995)}.
MG reacts with an arginine residue of a protein or peptide or an arginine of an amino acid to form the following formula [1]
【化１】 （式中、Ｒ1、Ｒ2は蛋白質残基、ペプチド残基あるいは
Ｒ1＝Ｒ2＝Ｈであり、Ｒ 1＝Ｒ2＝Ｈがアルギニンを示
す。）で表されるアルグピリミジン構造を有する化合物
を生成することが報告されている。従ってアルグピリミ
ジン構造を有する物質あるいは部位を検出することによ
り糖化蛋白質等を検出することは、臨床学上あるいは分
析方法上非常に有用である。Embedded image(Where R1, RTwoIs a protein residue, peptide residue or
R1= RTwo= H and R 1= RTwo= H indicates arginine
You. ) A compound having an argupyrimidine structure represented by
Is reported to produce Therefore Argupimi
By detecting substances or sites with a gin structure
Detection of glycated proteins is clinically or
It is very useful in the analysis method.
【０００６】[0006]
【発明が解決しようとする課題】本発明の第１の目的
は、糖化蛋白質等に特異的に反応する抗体であって、特
異的認識部位が分子構造レベルで特定されており、臨床
診断、分析等において有用なモノクローナル抗体を提供
することにある。本発明の第２の目的は、前記のモノク
ローナル抗体を産生するハイブリッド細胞を提供するこ
とにある。本発明の第３の目的は、前記のモノクローナ
ル抗体の製造方法を提供することである。SUMMARY OF THE INVENTION A first object of the present invention is to provide an antibody which specifically reacts with a glycated protein or the like, wherein a specific recognition site is specified at a molecular structure level. And the like to provide a useful monoclonal antibody. A second object of the present invention is to provide a hybrid cell that produces the above-mentioned monoclonal antibody. A third object of the present invention is to provide a method for producing the above-mentioned monoclonal antibody.
【０００７】[0007]
【発明を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に鑑み、鋭意検討した結果、メチルグリオキサールと
共にインキュベートしたカギアナカサガイのヘモシアニ
ン（以下、「ＫＬＨ」と略すこともある。）を調製し、
これを抗原として免疫されたマウスから得られる抗体産
生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッド細胞
が、アルグピリミジン構造を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体を産生することを見いだし、本発明を完成す
るに至った。Means for Solving the Problems In view of the above problems, the present inventors have conducted intensive studies, and as a result, have found that Khemian limpet hemocyanin (hereinafter sometimes abbreviated as “KLH”) incubated with methylglyoxal. Prepared,
The inventors have found that a hybrid cell of an antibody-producing cell obtained from a mouse immunized with the antigen and a mouse myeloma cell produces a monoclonal antibody that specifically recognizes an argupyrimidine structure, thereby completing the present invention. .
【０００８】すなわち、発明の第１はＭＧと共にインキ
ュベートした蛋白質を調製し、これを抗原として免疫さ
れたマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエロー
マ細胞とのハイブリッド細胞が産生する、アルグピリミ
ジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体である
ことを特徴とする。That is, a first aspect of the present invention is to prepare a protein incubated with MG, and to prepare a protein that is hybridized with a mouse myeloma cell and an antibody-producing cell obtained from a mouse immunized with the protein, and to produce a specific argupyrimidine structure. Characterized in that it is a monoclonal antibody that specifically recognizes it.
【０００９】また、発明の第２はＭＧと共にインキュベ
ートした蛋白質を調製し、これを抗原として免疫された
マウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエローマ細
胞とのハイブリッド細胞である。A second aspect of the present invention is a hybrid cell of a mouse myeloma cell and an antibody-producing cell obtained from a mouse immunized with a protein prepared by incubating the protein with MG.
【００１０】またさらに、発明の第３はＭＧと共にイン
キュベートした蛋白質を調製し、これを抗原として免疫
されたマウスから得られる抗体産生細胞とマウスミエロ
ーマ細胞とのハイブリッド細胞が産生する、アルグピリ
ミジン構造を特異的に認識するモノクローナル抗体の製
造方法である。Further, a third aspect of the present invention is to prepare a protein incubated with MG, and to prepare an argupyrimidine structure produced by a hybrid cell of an antibody-producing cell and a mouse myeloma cell obtained from a mouse immunized using the protein as an antigen. This is a method for producing a monoclonal antibody that specifically recognizes.
【００１１】なお、本発明の前記モノクローナル抗体及
びその製造方法においては、ＭＧと共にインキュベート
されるべき蛋白質がＫＬＨであることが望ましい。In the monoclonal antibody and the method for producing the same according to the present invention, it is desirable that the protein to be incubated with MG is KLH.
【００１２】[0012]
【発明の実施の形態】本発明のアルグピリミジン構造を
特異的に認識するモノクローナル抗体は、ＭＧと共にイ
ンキュベートした蛋白質を調製し、これを抗原として免
疫された哺乳類動物から得られる抗体産生細胞と、得ら
れた抗体産生細胞を継代培養可能なマウスミエローマ細
胞とのハイブリッド細胞を創出し、このハイブリッド細
胞の中から目的のモノクローナル抗体のみを産生するハ
イブリッド細胞をスクリーニングし、このハイブリッド
細胞が抗体を産生する環境下で大量培養することにより
抗体は製造される。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION A monoclonal antibody specifically recognizing an argupyrimidine structure of the present invention is prepared by preparing a protein incubated with MG, preparing an antibody using the protein as an antigen, and obtaining an antibody-producing cell obtained from a mammal immunized with the protein. Hybrid cells with mouse myeloma cells that can be subcultured from the selected antibody-producing cells, and screen hybrid cells that produce only the desired monoclonal antibody from the hybrid cells, and the hybrid cells produce antibodies Antibodies are produced by mass culturing in an environment.
【００１３】本発明のモノクローナル抗体の製造に用い
ることができる抗原は、蛋白質とＭＧの反応物であれば
良い。蛋白質としては特に限定されず、例えば、ウシ血
清アルブミン（以下、「ＢＳＡ」と略すこともあ
る。）、卵白アルブミン、カギアナカサガイのヘモシア
ニン（以下、「ＫＬＨ」と略すこともある。）などが挙
げられ、ＫＬＨが好ましく使用できる。The antigen which can be used for producing the monoclonal antibody of the present invention may be any reaction product of a protein and MG. The protein is not particularly limited, and includes, for example, bovine serum albumin (hereinafter, sometimes abbreviated as “BSA”), ovalbumin, and hemocyanin of the limpet (hereinafter sometimes abbreviated as “KLH”). KLH can be preferably used.
【００１４】ＭＧと蛋白質の反応を行うための具体的な
方法としては、例えば、前記蛋白質とＭＧを緩衝液中で
混合（撹拌）して得ることが可能である。用いる緩衝液
としては、リン酸塩、炭酸塩などの緩衝液が挙げられ、
好ましくはリン酸緩衝液が用いられる。緩衝液のｐＨは
該反応が進行するｐＨであれば特に限定されないが、ｐ
Ｈ６〜１１、好ましくはｐＨ７〜９である。緩衝液の濃
度は、該反応が進行する濃度であれば特に限定されない
が、１ｍＭ〜０．５Ｍ、好ましくは１０〜１００ｍＭの
緩衝液である。この反応過程は、蛋白質中のアミノ酸の
減少率で検出することが可能である。アミノ酸の減少率
は、例えば、反応前後の試料のＭＧと反応していないア
ミノ酸をアミノ酸自動分析装置で測定することにより求
めることができる。アミノ酸減少率としては、使用する
蛋白質により異なるが、アルギニン減少率が１０％以
上、好ましくは２０％以上減少することが望ましい。As a specific method for carrying out the reaction between MG and a protein, for example, the protein and MG can be obtained by mixing (stirring) in a buffer solution. Examples of the buffer used include phosphates, carbonates, and other buffers.
Preferably, a phosphate buffer is used. The pH of the buffer is not particularly limited as long as the reaction proceeds.
H6-11, preferably pH7-9. The concentration of the buffer is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is 1 mM to 0.5 M, preferably 10 to 100 mM. This reaction process can be detected by the reduction rate of amino acids in the protein. The rate of amino acid reduction can be determined, for example, by measuring amino acids that have not reacted with MG in the sample before and after the reaction using an automatic amino acid analyzer. Although the amino acid reduction rate varies depending on the protein used, it is desirable that the arginine reduction rate is reduced by 10% or more, preferably 20% or more.
【００１５】このようなアミノ酸減少率となる反応条件
は、例えば、２５〜４５℃で１時間〜１カ月間が好まし
く、さらに好ましくは３０〜４０℃で１日〜７日であ
る。The reaction conditions for such an amino acid reduction rate are, for example, preferably at 25 to 45 ° C. for 1 hour to 1 month, and more preferably at 30 to 40 ° C. for 1 day to 7 days.
【００１６】本発明で免疫される動物は恒温動物が使用
できる。該免疫動物としては、例えばマウス、ハムスタ
ー、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ等であれば特に
制限されないが、抗体産生細胞を融合するミエローマ細
胞がマウス由来のものであるため、好ましくはマウスが
使用される。The animal immunized in the present invention can be a constant temperature animal. The immunized animal is not particularly limited as long as it is, for example, a mouse, a hamster, a rat, a guinea pig, a rabbit, a dog, or the like, but a mouse is preferably used because the myeloma cells to which antibody-producing cells are fused are derived from a mouse. You.
【００１７】免疫する方法は、通常の公知の免疫方法を
用いることができる。例えば、７ないし３０日、特に１
２ないし１６日間隔で２または３回の投与が好ましい。
１回の投与量は、免疫される動物により異なるが、例え
ば、約０．０５〜２ｍｇ程度を目安とする。投与経路は
皮下注射、皮内注射、腹膜腔内注射、静脈内注射、筋肉
内注射等を選択することができるが、好ましくは腹膜
腔、皮下もしくは筋肉内に注射して行う投与形態であ
る。さらに好ましくは、前記投与経路を２ないし３組み
合わせた投与経路、例えば、腹膜腔注射、皮下注射およ
び筋肉内注射全ての投与経路を組み合わせるのが好まし
い。なお、この場合、抗原は適当な緩衝液、例えばフロ
イントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュ
バント、水酸化アルミニウム等の通常用いられるアジュ
バントの１種を含有するナトリウムリン酸緩衝液、生理
食塩水等に溶解して用いることができるが、上記のよう
なアジュバントを使用しなくとも良い。ここで、アジュ
バントとは抗原と共に投与したとき、非特異的にその抗
原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。As a method for immunization, a commonly known immunization method can be used. For example, 7 to 30 days, especially 1
Two or three administrations at 2 to 16 day intervals are preferred.
The single dose varies depending on the animal to be immunized, but is, for example, about 0.05 to 2 mg. The administration route can be selected from subcutaneous injection, intradermal injection, intraperitoneal injection, intravenous injection, intramuscular injection, and the like, and is preferably a dosage form in which injection is performed in the peritoneal cavity, subcutaneous or intramuscular. More preferably, two or three of the above administration routes are combined, for example, all the administration routes of peritoneal injection, subcutaneous injection and intramuscular injection are combined. In this case, the antigen is dissolved in an appropriate buffer, for example, complete phosphate adjuvant, incomplete Freund's adjuvant, sodium phosphate buffer containing one kind of commonly used adjuvant such as aluminum hydroxide, physiological saline, or the like. Although it can be used after being dissolved, the adjuvant as described above need not be used. Here, an adjuvant means a substance that, when administered together with an antigen, nonspecifically enhances an immune response to the antigen.
【００１８】そして、上記の抗原を免疫した恒温動物を
７〜３０日間処置せずに放置した後、該恒温動物の血清
を少量採取し、抗体価をウエスタンブロット法、凝集
法、酵素免疫測定法、一元放射状免疫拡散法等により測
定することができる。より簡便には酵素免疫測定法によ
り測定することができる。抗体価が上昇してきたら、状
況に応じて抗原の追加投与を適当回数行うことができ
る。例えば、０．０１〜１ｍｇ、特に、０．０５〜０．
５ｍｇの投与量で１もしくは２回の追加投与が行われ
る。最後の投与の１ないし３０日後、特に好ましくは１
〜７日後に免疫した恒温動物から抗体を産生するリンパ
球を含む組織を摘出する。摘出する組織は、抗体を産生
するリンパ球を含む抹消リンパ系組織ならどこでも良い
が、好ましくは脾臓である。得られた組織は、例えば、
「単クローン抗体実験操作入門」（講談社サイエンティ
フィック 安藤民衛ら １９９１）等に記載されている
方法により、継体培養可能な細胞とするために、例え
ば、仙台ウイルスやポリエチレングリコール存在下、あ
る種のガン細胞と細胞融合させて、ハイブリッド細胞を
得ることができる。ここで用いられるガン細胞は、同じ
恒温動物でも同種の恒温動物のガン細胞を用いることが
望ましく、例えばマウスを免疫動物として得られた脾臓
細胞と融合させる場合、マウスミエローマ細胞を用いる
ことが好ましい。実際に用いられる細胞融合の方法とし
ては、公知の技術（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏ
ｄ、第３９巻：２８５−３０８頁，１９８０年）を用い
ることができる。例えば、免疫されたマウスから得られ
た脾臓とマウスミエローマ細胞をポリエチレングリコー
ル存在下で融合を行い、ハイブリッド細胞のみが生育可
能であるＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン添加培地）により選択的にハイブリッド細
胞を増殖させ、ハイブリッド細胞がコロニーを形成させ
た後、培養上清中の抗体をスクリーニングすることで目
的の抗体を産生するハイブリッド細胞を得ることができ
る。After leaving the homeothermic animal immunized with the above antigen without treatment for 7 to 30 days, a small amount of serum from the homeotherm animal is collected and the antibody titer is determined by Western blotting, agglutination, enzyme immunoassay. Can be measured by a one-way radial immunodiffusion method or the like. More simply, it can be measured by an enzyme immunoassay. When the antibody titer increases, the antigen can be additionally administered an appropriate number of times depending on the situation. For example, 0.01-1 mg, especially 0.05-0.
One or two booster doses are given at a dose of 5 mg. 1 to 30 days after the last administration, particularly preferably 1
Tissues containing antibody-producing lymphocytes are excised from the immunized animals at ７7 days. The tissue to be removed may be any peripheral lymphoid tissue containing antibody-producing lymphocytes, but is preferably a spleen. The resulting tissue, for example,
According to the method described in “Introduction to Monoclonal Antibody Experimental Procedures” (Kodansha Scientific Tamie Ando et al., 1991), for example, in order to obtain cells that can be subcultured, for example, certain species are used in the presence of Sendai virus or polyethylene glycol. Cell fusion with the above cancer cells to obtain hybrid cells. As the cancer cells used here, it is desirable to use the same constant temperature animal cancer cells even in the same constant temperature animal. For example, when a mouse is fused with spleen cells obtained as an immunized animal, mouse myeloma cells are preferably used. As a method of cell fusion actually used, a known technique (J. Immunol.
d, 39: 285-308, 1980). For example, spleen obtained from an immunized mouse and mouse myeloma cells are fused in the presence of polyethylene glycol, and selectively mixed with a HAT medium (hypoxanthine, aminopterin, thymidine-supplemented medium) in which only hybrid cells can grow. After hybrid cells are grown and hybrid cells form colonies, antibodies in the culture supernatant are screened to obtain hybrid cells that produce the desired antibody.
【００１９】スクリーニングする方法としては、例え
ば、ウエスタンブロット法あるいは酵素免疫化学的測定
法等が挙げられる。また、目的の抗体を産生するハイブ
リッド細胞は、限界希釈法を繰り返すことにより最終的
に単一のハイブリッド細胞を得ることができる。さらに
は、これら目的の抗体を産生するハイブリッド細胞は抗
体を産生する環境下で大量培養することにより抗体を製
造することができる。さらに、これらの目的とする抗体
を産生するハイブリッド細胞が産生した抗体は、例えば
遠心分離、硫酸アンモニウムまたはポリエチレングリコ
ールを用いる蛋白質分画、水性二層分配法、ゲル濾過ク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、電気泳動等の蛋白質
の一般的な生化学的分離方法を、単独もしくはいくつか
の方法を組み合わせて使用することにより精製すること
ができる。Examples of the screening method include a Western blot method and an enzyme immunochemical assay. A hybrid cell producing the target antibody can be finally obtained as a single hybrid cell by repeating the limiting dilution method. Furthermore, these hybrid cells that produce the desired antibody can be produced by culturing them in large quantities in an antibody-producing environment. Furthermore, the antibodies produced by the hybrid cells producing these desired antibodies are, for example, centrifugation, protein fractionation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, aqueous two-layer partitioning, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity Purification can be performed by using a general biochemical separation method for proteins such as chromatography and electrophoresis, alone or in combination of several methods.
【００２０】[0020]
【発明の効果】以上の説明から明らかなように、本発明
によればメチルグリオキサールと蛋白質の反応生成物が
結合したときに生じるアルグピリミジン構造を特異的に
認識するモノクローナル抗体を提供することができる。
また、下記実施例から明らかなように、本発明のモノク
ローナル抗体は、認識部位が分子構造レベルで限定され
ているので、臨床診断、分析等において有用性が有り、
糖化蛋白質等の疾患・病態との関連性の解明のための一
助となることが期待される。As is apparent from the above description, according to the present invention, it is possible to provide a monoclonal antibody that specifically recognizes an argupyrimidine structure generated when a reaction product of methylglyoxal and a protein is bound. .
Further, as is clear from the following examples, the monoclonal antibody of the present invention has a useful recognition in clinical diagnosis and analysis because the recognition site is limited at the molecular structure level.
It is expected to be helpful in elucidating the relationship between glycated proteins and other diseases and conditions.
【００２１】[0021]
１．抗原の調製 １００ｍＭのメチルグリオキサール（略語：ＭＧ）に１
ｍｇのカギアナカサガイのヘモシアニン（略語：ＫＬ
Ｈ）を５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で溶解した
溶液（濃度：１ｍｇ／ｍｌ）を即座に加え、３７℃で３
日間反応させてＭＧとＫＬＨのコンジュゲート（略語：
ＭＧ−ＫＬＨ）を得て、これを抗原とした。自動アミノ
酸分析装置〔ＪＥＯＬ ＪＬＣ−５００、日本分光
（株）製〕でＭＧ−ＫＬＨ中の減少したアミノ酸を調べ
たところ、リジン（以下、「Ｌｓｙ」と略すこともあ
る。）およびアルギニン（以下、「Ａｒｇ」と略すこと
もある。）はそれぞれ５７％および６５％減少してい
た。1. Preparation of Antigen 100 mM methylglyoxal (abbreviation: MG)
mg of limpet hemocyanin (abbreviation: KL
H) in 50 mM phosphate buffer (pH 7.2) (concentration: 1 mg / ml) was immediately added.
After reacting for days, the conjugate of MG and KLH (abbreviation:
MG-KLH) was obtained and used as an antigen. When the reduced amino acids in MG-KLH were examined using an automatic amino acid analyzer [JEOL JLC-500, manufactured by JASCO Corporation], lysine (hereinafter sometimes abbreviated as "Lsy") and arginine (hereinafter, may be referred to as "Lsy"). "Arg" was also reduced by 57% and 65%, respectively.
【００２２】２．免疫方法 ＭＧ−ＫＬＨ（１ｍｇ／ｍｌ）は等量のフロイントの完
全アジュバントとよく混合してエマルジョンとし、これ
をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、オス、６〜８週齢）の腹腔内
に１００μｌ免疫した。初回免疫から１０〜１４日後、
抗原とフロイントの不完全アジュバントをよく混合して
エマルジョンとして、追加免疫を行った。追加免疫から
３週間後、抗原とリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢ
Ｓ」と略す。）を混合して最終免疫を行った。なお、抗
体価は、追加免疫の１週間後、マウス眼孔静脈から血液
を採取し、得られた血清を用いて酵素免疫化学的方法で
抗原に対する抗体が産生していることを確認した。酵素
免疫化学的方法では、免疫したマウスから得られた血清
と比較対照となる免疫前のマウスから得られた血清の間
に比較的大きな抗体価の差異が見られ、抗体価の上昇が
確認された。2. Immunization Method MG-KLH (1 mg / ml) was mixed well with an equal volume of Freund's complete adjuvant to form an emulsion, and 100 μl of this was immunized intraperitoneally into a mouse (BALB / c, male, 6 to 8 weeks old). 10-14 days after the first immunization,
The antigen was mixed well with Freund's incomplete adjuvant to form an emulsion, and boosting was performed. Three weeks after the boost, the antigen and phosphate buffered saline (hereinafter referred to as “PB
S ”. ) Was mixed for final immunization. One week after the booster immunization, the antibody titer was determined by collecting blood from the ocular vein of a mouse and using the obtained serum to produce an antibody against the antigen by an enzyme immunochemical method. The enzyme immunochemical method showed a relatively large difference in antibody titer between the serum obtained from the immunized mouse and the serum obtained from the control pre-immune mouse, confirming the increase in the antibody titer. Was.
【００２３】３．抗体価の確認方法 抗体価はＭＧとウシ血清アルブミンを固相とした酵素免
疫測定法により確認した。すなわち、抗原の調製に記載
した方法と同様にウシ血清アルブミン（以下、「ＢＳ
Ａ」と略すこともある。）とＭＧを反応させて、ＭＧと
ＢＳＡのコンジュゲート（以下、「ＭＧ−ＢＳＡ」と略
すこともある。）を得た。これを９６穴イムノプレート
に物理吸着させ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−トリス緩
衝液（ｐＨ７．４）（以下、「ＴＴＢＳ」と略す）で３
回洗浄した後、１％ＢＳＡを含むトリス緩衝液（ｐＨ
７．４）（以下、「ブロッキング液」と略すこともあ
る。）でブロッキングを行った。このプレートのウエル
にマウスから得られた血清（１００μｌ／ウエル）を入
れて、３７℃で１時間反応させた。ウエルを洗浄後、西
洋ワサビペルオキシダーゼで標識されているマウス抗体
に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５０００倍希釈した液
（１００μｌ／ウエル）（以下、「酵素標識抗体溶液」
と略す。）を入れて、３７℃で１時間反応させた。ウエ
ルを洗浄後、Ｏ−フェニレンジアミン（０．４ｍｇ／ｍ
ｌ）および過酸化水素（０．００３％）を含む０．１Ｍ
クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５）（１００μｌ／ウエ
ル）（以下、「発色液」と略す。）を入れて室温で１５
−２０分間反応させた。発色反応は１Ｍの硫酸（５０μ
ｌ／ウエル）（以下、「反応停止液」と略す。）を入れ
ることで停止し、マイクロプレートリーダーで４９２ｎ
ｍの吸光度を測定して抗体価の確認を行った。なお、ブ
ランクとしては、ＭＧ−ＢＳＡのかわりにＢＳＡを用い
たプレートを準備して用いた。3. Method for confirming antibody titer The antibody titer was confirmed by enzyme immunoassay using MG and bovine serum albumin as solid phases. That is, bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BS
A ". ) And MG to give a conjugate of MG and BSA (hereinafter sometimes abbreviated as "MG-BSA"). This was physically adsorbed to a 96-well immunoplate, and washed with 0.05% Tween 20-Tris buffer (pH 7.4) (hereinafter abbreviated as “TTBS”).
After washing twice, Tris buffer containing 1% BSA (pH
7.4) (hereinafter sometimes abbreviated as "blocking solution"). Serum (100 μl / well) obtained from a mouse was added to the wells of this plate, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After the wells were washed, a rabbit antibody against a mouse antibody labeled with horseradish peroxidase was diluted 5000 times with TTBS (100 μl / well) (hereinafter referred to as “enzyme-labeled antibody solution”).
Abbreviated. ) Was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing the wells, O-phenylenediamine (0.4 mg / m
l) and 0.1 M containing hydrogen peroxide (0.003%)
A citrate-phosphate buffer (pH 5) (100 μl / well) (hereinafter abbreviated as “coloring solution”) was added and the solution was added at room temperature for 15 minutes.
The reaction was performed for -20 minutes. The color reaction is 1M sulfuric acid (50μ
1 / well) (hereinafter abbreviated as "reaction stop solution") and stopped by a microplate reader.
The antibody titer was confirmed by measuring the absorbance at m. In addition, as a blank, a plate using BSA instead of MG-BSA was prepared and used.
【００２４】４．細胞融合 免疫したマウスからマウス脾臓を摘出し、よくほぐして
脾細胞を得た。得られた脾細胞はＲＰＭＩ−１６４０培
地で洗浄した。この洗浄した脾細胞と同様にＲＰＭＩ−
１６４０培地でよく洗浄したミエローマ細胞であるマウ
ス６５３細胞（Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８，６５３：ＣＲＬ・
１５８０）を細胞数が７：１の割合になるように混和
し、培地に対して５０ｗ／ｖ％のポリエチレングリコー
ル１５４０溶液を徐々に加えて５分間混和した。これに
ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて反応を停止させた後、
５分間遠心分離して上清を廃棄した。これにＲＰＭＩ−
１６４０培地を加えた後、５分間遠心分離を行い上清を
廃棄した。この操作を２回繰り返して細胞を洗浄し、細
胞を得た。4. Cell fusion The mouse spleen was excised from the immunized mouse and loosened well to obtain spleen cells. The obtained splenocytes were washed with RPMI-1640 medium. Like the washed splenocytes, RPMI-
Mouse 653 cells (P3X63-Ag8,653: CRL
1580) was mixed so that the cell number was 7: 1, and a 50 w / v% polyethylene glycol 1540 solution was gradually added to the medium, followed by mixing for 5 minutes. After stopping the reaction by adding RPMI-1640 medium thereto,
The supernatant was discarded after centrifugation for 5 minutes. This is RPMI-
After adding 1640 medium, the mixture was centrifuged for 5 minutes and the supernatant was discarded. This operation was repeated twice to wash the cells to obtain cells.
【００２５】５．クローニング 前述の得られた細胞に３０ｍｌのＨＡＴ培地を加えて細
胞を懸濁し、９６穴マイクロプレートの各ウエルに１０
０μｌづつ分注し、ＨＡＴ培地により選択的にハイブリ
ッド細胞を増殖させた。融合から１０日後、ＨＴ培地
（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）でウエ
ル中の１／２量の培養上清を置換した。この操作を２〜
３回繰り返した。培養上清については酵素免疫化学的方
法により抗体価を確認し、スクリーニングを行った。な
お、抗体価の確認方法は、前述の抗体価の確認方法と同
様であるが、試験に用いる試料を血清の代わりに得られ
た培養上清を用いた。スクリーニングにより抗体活性の
確認されたウエルの細胞は限界希釈を行い培養し、最終
的にはスクリーニングと限界希釈を繰り返すことにより
ＭＧ修飾蛋白質に対して高い抗体活性を有し、且つ単一
の細胞からなるクローン４株を得た。得られたクローン
の産生するモノクローナル抗体はクローンをＢＡＬＢ／
Ｃマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水中からプロテイ
ン−Ａ−セファロース４ＦＦカラム（ファルマシア社
製）を用いてそれぞれ精製した。[5] Cloning To the cells obtained above, 30 ml of HAT medium was added to suspend the cells, and 10 μl was added to each well of a 96-well microplate.
0 μl was dispensed, and hybrid cells were selectively grown in HAT medium. Ten days after the fusion, 量 of the culture supernatant in the well was replaced with HT medium (HAT medium minus aminopterin). This operation is
Repeated three times. The culture supernatant was screened by confirming the antibody titer by an enzyme immunochemical method. The method for confirming the antibody titer is the same as the method for confirming the antibody titer described above, except that the sample used for the test was a culture supernatant obtained instead of serum. Well cells whose antibody activity has been confirmed by screening are subjected to limiting dilution and cultured, and finally, screening and limiting dilution are repeated to have high antibody activity against the MG-modified protein, and from a single cell 4 clones were obtained. Monoclonal antibodies produced by the obtained clones were cloned from BALB /
The cells were grown in the abdominal cavity of C mice and purified from the ascites fluid using a protein-A-Sepharose 4FF column (Pharmacia).
【００２６】〔実施例２〕得られた４株クローンから得
られたＭＧ修飾蛋白質を認識するモノクローナル抗体の
内、３Ｃ株のモノクローナル抗体の反応特異性について
確認を行った。なお、３Ｃ株は通商産業省工業技術院生
命工業技術研究所に平成１０年２月２５日に寄託番号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１６６６６）として寄託されている。 １．モノクローナル抗体の反応特異性の評価法−１ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ウエル当たり１００μｌの糖あるいは、アルデヒド等と
共にインキュベートしたＢＳＡ（４μｇ／ｍｌ）また
は、銅酸化した低比重リポ蛋白質（４μｇ／ｍｌ）を加
え、４℃で一昼夜静置してプレートに物理吸着させ、ウ
エル当たり３００μｌのＴＴＢＳで３回洗浄した後、１
％ＢＳＡ含有ＴＴＢＳもしくは蒸留水で４倍希釈したブ
ロックエース（雪印（株）社製、ブロッキング剤）をウ
エル当たり３００μｌ加えてブロッキングした。このプ
レートを上記と同様にＴＴＢＳで３回洗浄した後、ウエ
ル当たり１００μｌのＴＴＢＳで希釈した本モノクロー
ナル抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を加えて、３７℃で３時
間インキュベートした。このプレートをＴＴＢＳで３回
洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識されて
いるマウス抗体に対するウサギ抗体をＴＴＢＳで５００
０倍希釈した液（１００μｌ／ウエル）を入れて、３７
℃で１時間反応させた。ウエル当たり１００μｌの発色
液を加えて室温で１５〜２０分間インキュベートした。
ウエル当たり５０μｌの反応停止液を加えた後、マイク
ロプレートリーダーで４９２ｎｍの吸光度を測定し、本
発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。Example 2 Among the monoclonal antibodies recognizing the MG-modified protein obtained from the four strain clones obtained, the reaction specificity of the 3C strain monoclonal antibody was confirmed. The 3C strain was deposited with the Ministry of International Trade and Industry, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, as a deposit number (FERM P-16666) on February 25, 1998. 1. Evaluation method for reaction specificity of monoclonal antibody-1 The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated by enzyme immunoassay. That is, 100 μl / well of BSA (4 μg / ml) or copper-oxidized low-density lipoprotein (4 μg / ml) incubated with a sugar or aldehyde was added to a 96-well immunoplate, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. overnight. After physical adsorption on the plate and washing three times with 300 μl TTBS per well,
The blocking was performed by adding 300 μl per well of Block Ace (blocking agent, manufactured by Snow Brand Co., Ltd.) diluted 4-fold with TTBS containing% BSA or distilled water. After washing the plate three times with TTBS in the same manner as described above, the monoclonal antibody solution (1 μg / ml) diluted with 100 μl of TTBS per well was added, and the plate was incubated at 37 ° C. for 3 hours. After the plate was washed three times with TTBS, a rabbit antibody against a mouse antibody labeled with horseradish peroxidase was washed with 500 mL of TTBS.
A 0-fold diluted solution (100 μl / well) was added, and 37
The reaction was carried out at a temperature of 1 hour. 100 μl of the color developing solution was added per well and incubated at room temperature for 15 to 20 minutes.
After adding 50 μl of reaction stop solution per well, absorbance at 492 nm was measured with a microplate reader to evaluate the reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention.
【００２７】２．モノクローナル抗体の反応特異性評価
法−２ 本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を酵素免疫測
定法にて評価した。すなわち、９６穴イムノプレートに
ＭＧと共にインキュベートしたＢＳＡを加えてプレート
に物理吸着させたプレートのウエルに、本発明によるモ
ノクローナル抗体（１μg／ｍｌ）に終濃度１ｍＭとな
るように各種のＭＧ処理アミノ酸（以下、「ＭＧ−アミ
ノ酸」と略すこともある。）を加えたものを試料とする
以外は前項に記載の方法と同様にして吸光度を測定し、
本発明のモノクローナル抗体の反応特異性を評価した。2. Monoclonal Antibody Reaction Specificity Evaluation Method-2 The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated by enzyme immunoassay. That is, BSA incubated with MG was added to a 96-well immunoplate, and various MG-treated amino acids (1 μg / ml) were treated with various MG-treated amino acids (1 μg / ml) so that the final concentration was 1 mM. Hereinafter, it may be abbreviated as “MG-amino acid”.) The absorbance was measured in the same manner as described in the preceding section except that a sample to which the compound was added was used.
The reaction specificity of the monoclonal antibody of the present invention was evaluated.
【００２８】３．ＭＧ処理アミノ酸の調製方法 ＭＧ−アミノ酸は、実施例１の「抗原の調製」に記載し
た方法に準じて調製を行った。すなわち、アミノ酸とし
て、Ｎ−α−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（略語：
Ｎａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）または、Ｎ−α−ａｃｅｔｙ
ｌ−Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（略語：Ｎａｃｅｔｙｌ−Ａ
ｒｇ）をＭＧと供にインキュベートしてＭＧ−アミノ酸
誘導体を調製した。調製したＭＧ−アミノ酸誘導体は、
それぞれ、溶媒系として１０％メタノール含有５０ｍＭ
酢酸を流速１．０ｍｌ／ｍｉｎとするＤｅｖｅｌｏｓｉ
ｌ ＯＤＳ−ＨＧ−５（８×２５０ｍｍ；Ｎｏｍｕｒａ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）に供した。溶出プロフィルは、２
１５ｎｍの吸光度によりモニターし、ピークを分取し
た。得られたピークをマススペクトロメーター（ＪＯＥ
Ｌ ＪＭＳ−ＤＸ ７０５ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏ
ｍｅｔｅｒ）および 1Ｈ−ＮＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ ＡＲ
Ｘ−４００ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）で解析した結
果、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、
１，３−ｄｉ−Ｎ−α−ａｃｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｏ−
４−ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ＩＬ）およびＮ
−δ−（Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−Ｎ−α−ａｃｅ
ｔｈｙｌｌｙｓｉｎｅ（ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔ
ｙｌ−Ａｒｇ）誘導体として、Ｎ−δ−（５−Ｈｙｄｒ
ｏ−５−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎ−２
−ｙｌ）ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（５ＨＭＩ）、Ｎ−δ−
（５−Ｈｙｄｒｏｘｙ−４，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙ
ｒｉｍｉｄｉｎｅ−２−ｅｌ）ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（慣
用名；アルグピリミジン＝ＡＰと略す。）およびＭＡ１
を得た。これらの化合物の構造を次に示した。3. Method for Preparing MG Treated Amino Acid MG-amino acid is described in “Preparation of Antigen” in Example 1.
Preparation was carried out according to the method described above. That is, as amino acids
And N-α-acetyl-L-lysine (abbreviation:
Nactyl-Lys) or N-α-acyty
l-L-arginine (abbreviation: Nacetyl-A
rg) is incubated with MG to give MG-amino acid
Derivatives were prepared. The prepared MG-amino acid derivative is
50 mM each containing 10% methanol as a solvent system
Develosi with acetic acid at a flow rate of 1.0 ml / min
l ODS-HG-5 (8 x 250 mm; Nomura
Chemicals). The elution profile is 2
Monitor by absorbance at 15 nm and separate peaks
Was. The obtained peak is analyzed by a mass spectrometer (JOE).
L JMS-DX 705 mass spectro
meter) and 1H-NMR (Bruker AR
X-400 spectrometer)
As a result, as an MG- (Nacetyl-Lys) derivative,
1,3-di-N-α-acetyllysino-
4-methylimidazole (IL) and N
-Δ- (Carboxyethyl) -N-α-ace
Tlylysine (CEL), MG- (Nacet
As a yl-Arg) derivative, N-δ- (5-Hydr)
o-5-methyl-4-imidazolone-2
-Yl) ornithine (5HMI), N-δ-
(5-Hydroxy-4,6-dimethylylpy
rimidine-2-el) ornithine
Name: algpyrimidine = AP. ) And MA1
I got The structures of these compounds are shown below.
【００２９】[0029]
【化２】 Embedded image
【化３】 Embedded image
【化４】 Embedded image
【化５】 Embedded image
【化６】 Embedded image
【００３０】４．モノクローナル抗体の反応特異性−１ 実施例１のモノクローナル抗体に関して蛋白質に対する
反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ、キシロース、
フルクトース、グルコース、アラビノース、ヘキサナー
ル、ペンタナール、プロペナール、ノネナール、オクテ
ナール、ヘキセナール、クロトナール、アクロレイン、
マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、４−ヒドロキシノネナ
ール（ＨＮＥ）、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、
銅酸化低比重ＬＤＬ蛋白質（Ｃｕ２＋ＬＤＬ）、フルク
トース−６−リン酸（Ｆ６Ｐ）、グルコース−６−リン
酸（Ｇ６Ｐ）、未処理ＢＳＡ（Ｎａｔｉｖｅ）などの図
１に記載される各種物質と共にインキュベートしたＢＳ
Ａを用い、前記のモノクローナル抗体の反応特異性評価
法−１により測定した。その結果を縦軸は物質、横軸は
吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフとして図１に示し
た。ＭＧとインキュベートしたＢＳＡは認識されるもの
の、他の物質でインキュベートしたＢＳＡは全く認識さ
れなかった。4. Reaction Specificity-1 of Monoclonal Antibody The specificity of the monoclonal antibody of Example 1 for protein was evaluated. That is, MG, xylose,
Fructose, glucose, arabinose, hexanal, pentanal, propenal, nonenal, octenal, hexenal, crotner, acrolein,
Malondialdehyde (MDA), 4-hydroxynonenal (HNE), carboxymethyl lysine (CML),
BS incubated with various substances described in FIG. 1, such as copper-oxidized low-density LDL protein (Cu2 + LDL), fructose-6-phosphate (F6P), glucose-6-phosphate (G6P), untreated BSA (Native), etc.
A was measured by the above-mentioned reaction specificity evaluation method-1 of the monoclonal antibody. The results are shown in FIG. 1 as a graph showing the substance on the vertical axis and the absorbance (OD) on the horizontal axis. BSA incubated with MG was recognized, but BSA incubated with other substances was not recognized at all.
【００３１】５．モノクローナル抗体の反応性−２ 実施例１のモノクローナル抗体に関してＭＧ−アミノ酸
誘導体に対する反応特異性を評価した。すなわち、ＭＧ
−（Ｎａｃｅｔｙｌ−Ｌｙｓ）誘導体として、１，３−
ｄｉ−Ｎ−α−ａｃｅｔｈｙｌｌｙｓｉｎｏ−４−ｍｅ
ｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ（ＩＬ）およびＮ−δ−
（Ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）−Ｎ−α−ａｃｅｔｈｙ
ｌｌｙｓｉｎｅ（ＣＥＬ）、ＭＧ−（Ｎａｃｅｔｙｌ−
Ａｒｇ）誘導体として、Ｎ−δ−（５−Ｈｙｄｒｏ−５
−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｉｍｉｄａｚｏｌｏｎ−２−ｙ
ｌ）ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ（５ＨＭＩ）、Ｎ−δ−（５−
Ｈｙｄｒｏｘｙ−４，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｐｙｒｉｍ
ｉｄｉｎｅ−２−ｅｌ）ｏｒｎｉｔｈｉｎｅおよびＭＡ
１を競合物質として前記のモノクローナル抗体の反応特
異性評価法−２により測定した。その結果を縦軸は競合
物質、横軸は吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示したグラフとして
図２に示した。その結果、ＡＰを競合物質として添加し
たもののみ吸光度が減少した。従って本抗体はＡＰを特
異的に認識するものの、他のＭＧ−アミノ酸誘導体は全
く特異的に認識しないことが明らかとなった。なお、化
合物の略号は前記に示したものと同じである。5. Monoclonal Antibody Reactivity-2 The specificity of the monoclonal antibody of Example 1 for MG-amino acid derivative was evaluated. That is, MG
-(Nacetyl-Lys) derivatives as 1,3-
di-N-α-acetyllysino-4-me
thylimidazole (IL) and N-δ-
(Carboxyethyl) -N-α-acethy
lysine (CEL), MG- (Nacetyl-
Arg) as a derivative, N-δ- (5-Hydro-5)
-Methyl-4-imidazolone-2-y
l) orthine (5HMI), N-δ- (5-
Hydroxy-4,6-dimethylpyrim
idine-2-el) ornithine and MA
1 was used as a competitor and measured by the above-described reaction specificity evaluation method-2 of the monoclonal antibody. The results are shown in FIG. 2 as a graph showing the competitor on the vertical axis and the absorbance (OD) on the horizontal axis. As a result, the absorbance decreased only when AP was added as a competitor. Therefore, it was revealed that the antibody specifically recognizes AP, but does not specifically recognize other MG-amino acid derivatives. The abbreviations of the compounds are the same as those described above.
【図１】図１は、種々の物質をＢＳＡと共にインキュベ
ートしたＢＳＡ修飾体に対する本発明のモノクローナル
抗体の反応性について、酵素免疫学的測定法により測定
した結果を示すグラフである。FIG. 1 is a graph showing the results obtained by measuring the reactivity of a monoclonal antibody of the present invention with a modified BSA obtained by incubating various substances with BSA by an enzyme immunoassay.
【図２】図２は本発明のモノクローナル抗体の認識構造
について、酵素免疫学的測定法により測定した結果を示
すグラフである。FIG. 2 is a graph showing the results obtained by measuring the recognition structure of the monoclonal antibody of the present invention by an enzyme immunoassay.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code FI C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91)
Claims (6)
ことを特徴とするモノクローナル抗体。1. A monoclonal antibody which specifically recognizes an argupyrimidine structure.
調製し、これを抗原として免疫されたマウスから得られ
る抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッ
ド細胞が産生する請求項１記載のモノクローナル抗体。2. The monoclonal antibody according to claim 1, wherein a protein modified with methylglyoxal is prepared, and a hybrid cell of an antibody-producing cell obtained from a mouse immunized with the protein and a mouse myeloma cell is produced using the protein as an antigen.
カギアナカサガイのヘモシアニンである請求項２記載の
モノクローナル抗体。3. The monoclonal antibody according to claim 2, wherein the protein modified with methylglyoxal is limpet hemocyanin.
ーナル抗体を産生することができるハイブリッド細胞。4. A hybrid cell capable of producing the monoclonal antibody according to claim 1, 2 or 3.
調製し、これを抗原として免疫されたマウスから得られ
る抗体産生細胞とマウスミエローマ細胞とのハイブリッ
ド細胞が産生する、アルグピリミジン構造を特異的に認
識することを特徴とするモノクローナル抗体の製造方
法。5. A method for preparing a protein modified with methylglyoxal, specifically recognizing an argupyrimidine structure produced by a hybrid cell of a mouse myeloma cell and an antibody-producing cell obtained from a mouse immunized with the protein. A method for producing a monoclonal antibody.
カギアナカサガイのヘモシアニンであることを特徴とす
る請求項５記載のモノクローナル抗体の製造方法。6. The method for producing a monoclonal antibody according to claim 5, wherein the protein modified with methylglyoxal is hemocyanin of a limpet.
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