JPH0753757B2 - Monoclonal antibody and method of using the same - Google Patents
Monoclonal antibody and method of using the sameInfo
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- JPH0753757B2 JPH0753757B2 JP63199945A JP19994588A JPH0753757B2 JP H0753757 B2 JPH0753757 B2 JP H0753757B2 JP 63199945 A JP63199945 A JP 63199945A JP 19994588 A JP19994588 A JP 19994588A JP H0753757 B2 JPH0753757 B2 JP H0753757B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒスチジン・リツチ・グリコプロテイン（以
下、HRGと略記する）に対して特異性を有するモノクロ
ーナル抗体及びその使用方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a monoclonal antibody having specificity for histidine-rich-glycoprotein (hereinafter abbreviated as HRG) and a method for using the same.
HRGは分子量67,000の１本鎖の糖タンパク質であり、197
2年にN.ハイムブルゲル（N.Heimburger）ら〔ホツプ−
ザイレルのツアイトシユリフト フユール フイジオロ
ギツシエ ヘミー（Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.）
第353巻、第1133頁（1972）〕によって、ヒト血清から
初めて精製され、ヒスチジン含量が異常に高いところか
らHRGと命名された。HRG is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of 67,000.
In 2 years N. Heimburger et al. [Hop-
Zaire's Zuitoshiyurufuyufuru Fuijiorogitsushie Hemi (Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.)
Vol. 353, p. 1133 (1972)], which was first purified from human serum and named HRG because of its abnormally high histidine content.
HRGは近年色々な角度から研究され、ヘパリンへの高い
親和性をはじめ、プラスミノーゲン、フイブリノーゲ
ン、トロンボスポンジン、ヘパリンなどとの相互作用、
種々の２価金属イオンやヘム、ローズベンガル結合能な
ど数多くの性質が報告され、多機能タンパク質の１つと
考えられるようになつてきた。HRG has been studied from various angles in recent years, including high affinity for heparin, interaction with plasminogen, fibrinogen, thrombospondin, heparin, etc.,
Many properties such as various divalent metal ions, heme, and rose bengal binding ability have been reported, and it has come to be considered as one of multifunctional proteins.
各種の疾患時におけるHRGの血中レベルの変動としては
敗血症、肝機能不全症、重症肝硬変などで減少し、心筋
梗塞、リユマチ性心疾患などで増加することが知られて
いた。最近、HRG過剰症家系における血栓症多発傾向が
報告され、HRGが凝固・線溶系の調節因子として重要な
役割を果していることが知られてきた。It has been known that changes in blood level of HRG during various diseases are decreased in sepsis, hepatic dysfunction, severe cirrhosis, and increased in myocardial infarction and rheumatic heart disease. Recently, it has been reported that thrombosis tends to occur frequently in families with HRG excess, and it has been known that HRG plays an important role as a regulator of coagulation / fibrinolysis system.
したがつて、血液中のHRGを測定することは臨床診断上
重要な測定意義を有する。従来知られているHRGの測定
方法としてHRGに対する抗血清を用いる免疫拡散法があ
つた。Therefore, measuring HRG in blood has important measurement significance in clinical diagnosis. An immunodiffusion method using an antiserum against HRG has been known as a conventionally known method for measuring HRG.
しかしながら、従来法は動物抗血清を用いるために一定
の活性を有する抗血清を安定して得ることが極めて困難
であり、また、免疫拡散に長時間を有するという欠点が
あつた。However, since the conventional method uses animal antiserum, it is extremely difficult to stably obtain an antiserum having a certain activity, and there is a drawback that immunodiffusion takes a long time.
本発明の目的は、上記のような欠点のない抗HRGモノク
ローナル抗体及びその使用方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide an anti-HRG monoclonal antibody which does not have the above-mentioned drawbacks and a method for using the same.
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は抗HRGモノ
クローナル抗体に関し、アンチトロンビンIII、プラス
ミノーゲン、フイブリノーゲンと交差反応せず、プラス
ミノーゲン、フイブリノーゲン、ヘパリンのHRGへの結
合によつて抗体のHRGへの反応性が阻害されないモノク
ローナル抗体であることを特徴とする。また第２の発明
は生体試料中のHRGの測定に当り、上記第１の発明の抗H
RGモノクローナル抗体を使用するHRGの測定方法に関す
る。Briefly describing the present invention, the first invention of the present invention relates to an anti-HRG monoclonal antibody, which does not cross-react with antithrombin III, plasminogen, fibrinogen, and binds plasminogen, fibrinogen, heparin to HRG. It is characterized in that it is a monoclonal antibody whose reactivity with HRG is not inhibited. The second invention is the measurement of HRG in a biological sample, which comprises the anti-H of the first invention.
The present invention relates to a method for measuring HRG using an RG monoclonal antibody.
本発明者らは、前述した問題点を克服するため鋭意研究
を重ねた結果,HRGに対して特異性を有するモノクローナ
ル抗体を取得することに成功し、このモノクローナル抗
体を用いることでHRGを特異的に、簡便に測定すること
が可能であることを見出し、本発明を完成するに至つ
た。As a result of intensive studies to overcome the above-mentioned problems, the present inventors have succeeded in obtaining a monoclonal antibody having specificity for HRG, and by using this monoclonal antibody, specific HRG can be obtained. Moreover, they have found that it is possible to measure easily and have completed the present invention.
本発明のモノクローナル抗体は、いわゆる細胞融合法に
よつて製造される。すなわち、抗体産生細胞と骨髄腫細
胞との間に、融合ハイブリドーマを形成させ、該ハイブ
リドーマをクローン化し、HRGに対し特異性を示す抗体
を産生するクローンを選択することによつて製造され
る。抗体産生細胞は例えばHRGによつて免疫された動物
からの脾細胞、リンパ節細胞由来のＢリンパ球が使用で
きる。免疫させる動物としては、マウス、ラツト、ウサ
ギなどが例示される。The monoclonal antibody of the present invention is produced by a so-called cell fusion method. That is, it is produced by forming a fused hybridoma between an antibody-producing cell and a myeloma cell, cloning the hybridoma, and selecting a clone that produces an antibody showing specificity for HRG. As the antibody-producing cells, for example, B lymphocytes derived from splenocytes or lymph node cells from an animal immunized with HRG can be used. Examples of animals to be immunized include mice, rats, rabbits and the like.
抗原としてはヒト血液由来のHRGが利用可能であり、例
えばヒト血しようからヘパリンアフイニテイークロマト
グラフイー及びイオン交換クロマトグラフイーにより精
製され、かくして得られたヒトHRGをフロイントのアジ
ユバントと混合し、動物に免疫する。免疫は動物の皮
下、筋肉内あるいは腹腔内に投与することによつて行わ
れ、最終免疫より約２〜５日後、免疫動物から抗体産生
細胞を分取する。Human blood-derived HRG can be used as the antigen, and for example, human blood plasma is purified by heparin affinity chromatography and ion exchange chromatography, and human HRG thus obtained is mixed with Freund's adjuvant to obtain an animal. Immunize with. Immunization is carried out by administering subcutaneously, intramuscularly or intraperitoneally to the animal. About 2 to 5 days after the final immunization, antibody-producing cells are fractionated from the immunized animal.
骨髄腫細胞としてはマウス、ラツト、ヒト等由来のもの
が使用される。細胞融合は例えばG.ケラー（G.Khle
r）ら、ネーチヤー（Nature）第256巻、第495頁（197
5）に記載の方法又はこれに準ずる方法によつて行われ
る。この際30〜50％ポリエチレングリコール（分子量10
00〜4000）を用い、30〜40℃の温度下約１〜３分間程度
反応させることによつて行われる。As the myeloma cells, those derived from mouse, rat, human and the like are used. Cell fusion can be performed, for example, by G. Khle.
r) et al., Nature, 256, 495 (197).
It is carried out by the method described in 5) or a method equivalent thereto. At this time, 30-50% polyethylene glycol (molecular weight 10
00 to 4000) and reacting at a temperature of 30 to 40 ° C. for about 1 to 3 minutes.
細胞融合によつて得られたハイブリドーマはスクリーニ
ングに付される。すなわち、スクリーニングは酵素抗体
法等によつて行われる。得られた抗体産生ハイブリドー
マはクローニングに付される。すなわち、当該ハイブリ
ドーマを例えば限界希釈法によつてクローニングを行つ
てクローンを得る。得られたクローンは、次いで目的と
するモノクローナル抗体を産生するクローンのスクリー
ニングに付され、例えば酵素抗体法等によつて行われ
る。選ばれたクローンは、例えばあらかじめプリスタン
（2,6,10,14−テトラメチルペンタデカン）を投与したB
ALB/cマウスの腹腔内へ移植し、10〜14日後にモノクロ
ーナル抗体を高濃度に含む腹水を採取する。この腹水か
らのモノクローナル抗体の回収はIgの精製法として従来
既知の硫安分画法、イオン交換クロマトグラフイー、ゲ
ルクロマトグラフイー、アフイニテイークロマトグラフ
イー等を応用することで容易に達成される。The hybridoma obtained by cell fusion is subjected to screening. That is, screening is performed by the enzyme antibody method or the like. The obtained antibody-producing hybridoma is subjected to cloning. That is, the hybridoma is cloned by, for example, the limiting dilution method to obtain a clone. The obtained clones are then subjected to screening for clones producing the desired monoclonal antibody, for example, by the enzyme antibody method. The selected clone is, for example, B to which pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) was previously administered.
ALB / c mouse is transplanted into the abdominal cavity, and 10 to 14 days later, ascites fluid containing a high concentration of the monoclonal antibody is collected. The recovery of the monoclonal antibody from the ascites can be easily achieved by applying the conventionally known ammonium sulfate fractionation method, ion exchange chromatography, gel chromatography, affinity chromatography, etc. as a purification method for Ig.
かくして得られた抗HRGモノクローナル抗体は、生体由
来の試料、例えば血清、血しよう又は尿中のHRGを特異
的に簡便に測定するために極めて好適である。この測定
のために、モノクローナル抗体そのもの又はそれからの
相応する免疫学的特性を有するフラグメント、例えばF
(ab)2フラグメントを使用することができる。The anti-HRG monoclonal antibody thus obtained is extremely suitable for specifically and conveniently measuring HRG in a sample derived from a living body, such as serum, blood plasma or urine. For this determination, the monoclonal antibody itself or a fragment from it with corresponding immunological properties, such as F
(ab) 2 fragments can be used.
以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれら実施例に限定されない。Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ モノクローナル抗体の作製 （１） 抗原の精製 クエン酸添加の新鮮血しよう（１）にポリブレン（50
mg）、ベンズアミジン（終濃度1mM）、ダイズトリブシ
ンインヒビター（50mg）、PMSF（フエニルメタンスルホ
ニルフルオリド、終濃度0.1mM）及びアプロチニン（360
00 カリクレイン阻害単位）を加えた後、1M BaCl2 80m
lを徐々に加える。添加後１時間静置し、7800×ｇで20
分間遠心して上清画を得、これに0.1M EDTA溶液を0.1mM
となるように加え、硫安35％〜80％飽和画分を常法によ
り得る。これを蒸留水に再溶解し、0.4M NaClを含む0.0
2Mリン酸バツフアー（pH6.3）30lに１昼夜透析する。次
いで透析内液を上記バツフアーで平衡化したヘパリン−
アガロースカラム（6.8cm×11cm）に添加し、1M NaClを
含む0.02Mリン酸バツフアー（pH6.3）で溶出した後、1M
〜3M NaClの濃度勾配法で吸着タンパク質を溶出させ
る。２峰性のピークが得られ、この内先に溶出されるピ
ークを集め、10mMクエン酸ナトリウム及び20mM NaClを
含む50mMトリス（Tris）-HClバツフアー（pH8.0）に透
析する。これを同上のバツフアーで平衡化したDEAE−セ
フアデツクスＡ−50カラム（2.5cm×20cm）に添加し、2
0〜320mM NaClの濃度勾配法により吸着タンパク質を溶
出する。先に溶出されてくるピークを集め、純化HRGが
得られ、抗原として使用した。Example 1 Preparation of Monoclonal Antibody (1) Purification of Antigen Citrated fresh blood plasma (1) was added to polybrene (50).
mg), benzamidine (final concentration 1 mM), soybean tribucin inhibitor (50 mg), PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride, final concentration 0.1 mM) and aprotinin (360
00 Kallikrein Inhibition Unit), then 1M BaCl 2 80m
Add l gradually. Allow to stand for 1 hour after the addition, 20 at 7800 × g
Centrifuge for minutes to obtain a supernatant fraction.Add 0.1 M EDTA solution to this to 0.1 mM.
And a saturated fraction of ammonium sulfate of 35% to 80% is obtained by a conventional method. This was redissolved in distilled water, and 0.04 containing 0.4M NaCl.
Dialyze against 30 l of 2M phosphate buffer (pH 6.3) for one day. Then, the dialysis solution was heparin-equilibrated with the above buffer.
Add to an agarose column (6.8 cm x 11 cm) and elute with 0.02 M phosphate buffer (pH 6.3) containing 1 M NaCl.
Elute the adsorbed protein by ~ 3 M NaCl gradient method. A bimodal peak is obtained, and the peaks eluting ahead are collected and dialyzed against 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 10 mM sodium citrate and 20 mM NaCl. This was added to a DEAE-Sephadex A-50 column (2.5 cm x 20 cm) equilibrated with the buffer described above, and 2
Elute the adsorbed protein by the gradient method of 0 to 320 mM NaCl. The peaks eluting earlier were collected and purified HRG was obtained and used as an antigen.
（２） マウスへの免疫 HRGを0.15M NaClを含む10mMリン酸バツフアー（pH7.4）
に溶解し、フロイントの完全アジュバントと1:1（v/v）
の割合でよく混合し、マウス１匹当りHRGが50μｇとな
るように腹腔内に免疫した。初回免疫から21日後にHRG
50μｇをフロイントの不完全アジュバントと混合し腹腔
内投与し、更にその14日後、HRG 20μｇを尾静脈より投
与した。(2) Immunization of mice HRG containing 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 0.15 M NaCl
And 1: 1 (v / v) with Freund's complete adjuvant
The above mixture was mixed well and the mice were immunized intraperitoneally so that HRG was 50 μg per mouse. 21 days after the first immunization HRG
50 μg was mixed with Freund's incomplete adjuvant and intraperitoneally administered, and 14 days later, 20 μg of HRG was administered via the tail vein.
（３） 細胞融合及びクローニング 最終免疫の３日後にマウスの脾臓を取出し、その脾細胞
とマウスミエローマP3U1とを10:1の割合で混合し、前記
ネーチヤー記載のケラーらの方法に準じて細胞融合を行
つた。次に、96ウエルマイクロプレートに植え込み、HA
T（ヒポキサンチン１×10-4Ｍ、アミノブテリン４×10
-7Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだMDEM−10％FCS培
地（HAT培地）で10〜17日間培養後、HT（ヒポキサンチ
ン１×10-4Ｍ、チミジン1.6×10-5Ｍ）を含んだDMEM−1
0％FCS培地（HT培地）に移行し、更にフラスコ（25ml）
に培養できるようになつてからDMEM−10％FCS培地で培
養を続けた。増殖の見られたウエルの培養上清中の抗体
価を酵素抗体法により測定し、適切なウエルから限界希
釈法により、求めるハイブリドーマのクローニングを行
つた。すなわち、マイクロプレートにウエル当り約2.5
×104個のマウス胸腺細胞を植え込み、次にDMEM培地で
５、１、0.5個/0.1mlになるようにハイブリドーマを希
釈し、これを上記マイクロプレートに0.1ml/ウエルずつ
植え込み培養した。培養開始後10〜14日で肉眼で認めら
れるコロニーが形成され、クローン株を得た。(3) Cell fusion and cloning Three days after the final immunization, the mouse spleen was taken out, and the splenocytes and mouse myeloma P3U1 were mixed at a ratio of 10: 1, and cell fusion was performed according to the method of Keller et al. I went. Next, implant in a 96-well microplate and HA
T (hypoxanthine 1 × 10 -4 M, aminobuterin 4 × 10
-7 M, thymidine 1.6 × 10 −5 M) in MDEM-10% FCS medium (HAT medium) for 10 to 17 days, and then HT (hypoxanthine 1 × 10 −4 M, thymidine 1.6 × 10 −5 M). M) containing DMEM-1
Transferred to 0% FCS medium (HT medium) and further flask (25 ml)
After the culture became possible, the culture was continued in DMEM-10% FCS medium. The antibody titer in the culture supernatant of the well in which the proliferation was observed was measured by the enzyme antibody method, and the desired hybridoma was cloned from the appropriate well by the limiting dilution method. That is, about 2.5 per well in the microplate.
X10 4 mouse thymocytes were inoculated, and then the hybridoma was diluted to 5, 1, 0.5 / 0.1 ml with DMEM medium, and 0.1 ml / well was inoculated into the above microplate and cultured. Colonies that were visible to the naked eye were formed 10 to 14 days after the start of culturing to obtain a clone strain.
（４） スクリーニング法 ハイブリドーマ及びクローンが増殖したウエルの培養上
清を分取し、エンザイム リンクドイムノソルベント
アツセイ（Enzyme Linked Immunosorbent Assay）（ELI
SA）法によりHRGに対する抗体産生能を調べた。マイク
ロタイタープレートにHRGを0.5μg/50μl/ウエルとなる
ように分注し、４℃で18時間静置してHRGを固相に吸着
させた。10mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.4）20
0μｌで３回各ウエルを洗浄した後、１％ウシ血清アル
ブミン（BSA）含有PBSを100μl/ウエル加え、37℃で１
時間静置し、各ウエルの未吸着部分をブロツクした。次
いで、検体である培養液を50μl/ウエル加え37℃で１時
間反応させた。PBSで３回洗浄した後、1000倍希釈した
ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG（カペル社製）を50
μl/ウエル添加し、37℃で１時間反応させた。PBSで洗
浄し、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTS〔2,2′−ア
ジノ−ジ（３−エチルベンゾチアゾリン−スルホネー
ト）〕（ベーリンガーマンハイム社製）を含む0.1Mクエ
ン酸バツフアー（PH4.0）を加え、波長405nmでの吸光度
を測定した。検体中、HRGに対する抗体が存在した場合
強い発色がみられた。(4) Screening method The culture supernatant of the well in which the hybridoma and the clone were propagated was collected and the enzyme-linked immunosorbent was used.
Atsushi (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (ELI
The antibody production ability against HRG was examined by the SA method. HRG was dispensed to a microtiter plate at 0.5 μg / 50 μl / well and allowed to stand at 4 ° C. for 18 hours to adsorb HRG to a solid phase. 10 mM phosphate buffered saline (PBS) (pH7.4) 20
After washing each well 3 times with 0 μl, 100 μl / well of PBS containing 1% bovine serum albumin (BSA) was added, and the well was incubated at 37 ° C. for 1 hour.
After allowing to stand for a while, the unadsorbed portion of each well was blocked. Then, 50 μl / well of a culture solution as a sample was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 3 times with PBS, 50 times diluted 1000 times peroxidase-labeled anti-mouse IgG (manufactured by Kapel)
μl / well was added and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing with PBS, 0.1M citrate buffer (PH4) containing 0.001% hydrogen peroxide, 0.55 mg / ml ABTS [2,2'-azino-di (3-ethylbenzothiazoline-sulfonate)] (Boehringer Mannheim). .0) was added and the absorbance at a wavelength of 405 nm was measured. In the sample, strong coloration was observed when the antibody against HRG was present.
この結果、抗体産生能の高いクローン株HR−１及びHR-2
6が得られた。As a result, clone strains HR-1 and HR-2 with high antibody-producing ability are obtained.
6 was obtained.
前記クローン株は、各々Hybridoma HR−１と表示し微工
研菌寄第10171号（FERM P−10171）、Hybridoma HR-26
と表示し微工研菌寄第10172号（FERM P−10172）とし
て、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託されてい
る。The clone strains were designated as Hybridoma HR-1 and were respectively designated as Microindustrial Research Institute No. 10171 (FERM P-10171), Hybridoma HR-26.
It has been deposited with the Institute for Microbial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, as Microindustry Research Institute No. 10172 (FERM P-10172).
（５） モノクローナル抗体の作製 ７週令以上のBALB/c系マウスにプリスタン（アルドリツ
チ社製）0.5mlを腹腔内に投与し、１週間以上経過した
後、培養、増殖させたクローン株１〜９×108個／マウ
スを腹腔内接種した。10〜14日後にマウスを殺し、腹水
を採取した。これを3,000rpm10分間遠心分離し、５〜15
ml/匹のモノクローナル抗体含有腹水を得た。(5) Preparation of monoclonal antibody Clone strains 1 to 9 which were cultured and propagated after intraperitoneal administration of 0.5 ml of pristane (manufactured by Aldrich Co., Ltd.) to BALB / c mice aged 7 weeks or older and 1 week or longer × 10 8 cells / mouse were inoculated intraperitoneally. After 10 to 14 days, the mice were killed and ascites was collected. Centrifuge this at 3,000 rpm for 10 minutes, and
Ascitic fluid containing monoclonal antibody (ml / mouse) was obtained.
（６） モノクローナル抗体の精製 上記（５）によつて得られた腹水を脱脂綿で過して脂
肪を除き、50mMリン酸バツフアー（pH7.3）で２倍希釈
した後、等量の100％飽和硫酸アンモニウムを加え、沈
殿画分を分取した。この画分をなるべく少量の上記リン
酸バツフアーに溶解させ、同バツフアーに対して透析し
た。このサンプルをDEAE−セルロースカラムにかけ、抗
HRGモノクローナル抗体HR−１及びHR-26を得た。(6) Purification of Monoclonal Antibody The ascites obtained in (5) above was filtered with absorbent cotton to remove fat, and diluted 2-fold with 50 mM phosphate buffer (pH 7.3), and then saturated with an equal volume of 100%. Ammonium sulfate was added, and the precipitated fraction was collected. This fraction was dissolved in a small amount of the above phosphate buffer and dialyzed against the buffer. Apply this sample to a DEAE-cellulose column and
HRG monoclonal antibodies HR-1 and HR-26 were obtained.
（７） モノクローナル抗体の物理化学的性質 Igサブクラス HR−1:IgG1 HR-26:IgG1 精製したモノクローナル抗体の特定のクラスを、クラス
特異性抗マウスIg抗体を使用してオクタロニーゲル拡散
試験で決定した。(7) Physicochemical properties of monoclonal antibody Ig subclass HR-1: IgG 1 HR-26: IgG 1 Octaronie gel diffusion test using a specific class of purified monoclonal antibody using class-specific anti-mouse Ig antibody Decided.
分子量 HR-26:170,000±5,000 HR−1:165,000±5,000 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（12.5％）でモ
ノクローナル抗体の分子量を推定した。分子量マーカー
はバイオ−ラッド社のSDS-PAGE分子量スタンダード−Hi
ghを用いた（ミオシン200kDa、β−ガラクトシダーゼ
116kDa、ホスホリバーゼｂ 97kDa、血清アルブミン 6
6kDa、卵白アルブミン 43kDa）。Molecular weight HR-26: 170,000 ± 5,000 HR-1: 165,000 ± 5,000 The molecular weight of the monoclonal antibody was estimated by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (12.5%). The molecular weight marker is SDS-PAGE molecular weight standard from Hi-Bio-Hi
gh was used (myosin 200 kDa, β-galactosidase
116 kDa, Phosphorivase b 97 kDa, Serum albumin 6
6kDa, ovalbumin 43kDa).
抗原との反応性 HR−1:CNBr 50kDa断片と反応する HR-26:上記断片と反応しない HRGをCNBrにより分解〔T.小出（T.Koide）ら、ジヤーナ
ル オブ バイオケミストリー（J.Biochem.）第98巻、
第1191〜1200頁（1985）〕した後、50mMトリス−HClバ
ツフアーpH8.6に溶解し、SDS−ポリアクリルアミド電気
泳動を行つた後、イムノブロツト法により〔W.N.ブルネ
ツト（W.N.Burnette）、アナリテイカル バイオケミス
トリー（Anal.Biochem.）第112巻、第195〜203頁（198
1）〕モノクローナル抗体との反応性を検討した。Reactivity with antigen HR-1: Reacts with CNBr 50kDa fragment HR-26: Does not react with the above fragment HRG is decomposed by CNBr [T. Koide et al., Journal of Biochemistry (J. Biochem. ) Volume 98,
Pp. 1191 to 1200 (1985)], dissolved in 50 mM Tris-HCl buffer pH 8.6, and subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis, and then subjected to immunoblot method [WN Brunet (WNBurnette), Analytical Biochemistry (Anal). Biochem.) 112, 195-203 (198
1)] The reactivity with the monoclonal antibody was examined.
その結果、HRGをCNBr分解して得られるHRGのＮ末端側50
kDaのペプチドと、HR−１は反応し、HR-26は反応しなか
つた。As a result, the N-terminal side of HRG obtained by decomposing HRG with CNBr 50
HR-1 and HR-26 did not react with the kDa peptide.
なお、各CNBr断片はT.小出らの方法（前出）によつて同
定した。Each CNBr fragment was identified by the method of T. Koide et al. (Supra).
交差反応性 HR−1:アンチトロンビンIII、プラスミノーゲン、フイ
ブリノーゲンと交差反応を示さない HR-26:アンチトロンビンIII、プラスミノーゲン、フイ
ブリノーゲンと交差反応を示さない アンチトロンビンIII、プラスミノーゲン、フイブリノ
ーゲンを各々10μg/mlとなるようにPBSに溶解し、これ
らを各々マイクロタイタープレートにコーテイングし、
前記ハイブリドーマのスクリーニング法と同様にして上
記物質との交差反応性を検討した。Cross-reactivity HR-1: Antithrombin III, plasminogen, no fibrinogen cross-reactivity HR-26: Antithrombin III, plasminogen, fibrinogen no cross-reactivity antithrombin III, plasminogen, fibrinogen Were dissolved in PBS to be 10 μg / ml each, and these were each coated on a microtiter plate,
Cross-reactivity with the above substances was examined in the same manner as in the screening method for hybridomas.
共存物質の影響 HR−1:HR-26、プラスミノーゲン、フイブリノーゲン、
ヘパリンの存在によつてHRGとの反応性は影響されない HR-26:HR−１、プラスミノーゲン、フイブリノーゲン、
ヘパリンの存在によってHRGとの反応性は影響されない マイクロタイタープレートにHRG（５μg/mlとなるよう
にPBSに溶解したもの）を50μl/ウエル加え37℃で３時
間コーテイングし、PBSで洗浄後、１％ウシ血清アルブ
ミンを含有するPBSを200μl/ウエル加え37℃で１時間ブ
ロツキングし、PBSで洗浄する。これにHR-26（10μg/m
l）、HR−１（10μg/ml）、プラスミノーゲン（10μg/m
l）、フイブリノーゲン（10μg/ml）、ヘパリン（1IU/m
l）を50μl/ウエル各々加え37℃で１時間反応させ、引
続いて、ナカネ（Nakane）法〔P.K.ナカネ（P.K.Nakan
e）、ジヤーナル オブ ヒストケミストリー アンド
サイトケミストリー（J.Histochem.Cytochem）第22
巻、第1084頁（1974）〕により作成した。ペルオキシダ
ーゼ（POD）標識HR−１又はHR-26を各々50μl/ウエル加
え、37℃で１時間反応させ、PBSで洗浄した後、前記ABT
Sを発色基質として発色させ、405nmの吸光度を測定し、
共存物質無添加の場合と比較し、共存物質の影響を検討
した。Effects of coexisting substances HR-1: HR-26, plasminogen, fibrinogen,
Reactivity with HRG is not affected by the presence of heparin HR-26: HR-1, plasminogen, fibrinogen,
Reactivity with HRG is not affected by the presence of heparin. Add 50 μl / well of HRG (dissolved in PBS to 5 μg / ml) to a microtiter plate, coat at 37 ° C. for 3 hours, wash with PBS, and then 200 μl / well of PBS containing% bovine serum albumin is added and blotted at 37 ° C. for 1 hour and washed with PBS. Add HR-26 (10 μg / m
l), HR-1 (10 μg / ml), plasminogen (10 μg / m
l), fibrinogen (10 μg / ml), heparin (1 IU / m)
l) at 50 μl / well and reacted at 37 ° C for 1 hour, followed by the Nakane method [PK Nakan (PK Nakan)
e), Journal of Histochemistry and Sight Chemistry (J.Histochem.Cytochem) No. 22
Vol. 1084 (1974)]. Peroxidase (POD) -labeled HR-1 or HR-26 was added at 50 μl / well each, reacted at 37 ° C. for 1 hour, washed with PBS, and then the ABT
S is developed as a chromogenic substrate, the absorbance at 405 nm is measured,
The effect of the coexisting substance was examined in comparison with the case where the coexisting substance was not added.
以上の結果を表１及び表２にまとめて示す。表１はHR−
１、HR-26のIgサブクラス、抗原との反応性、交差反応
性について、また、表２は共存物質の影響についてまと
めたものであり、HR−１及びHR-26は各々HRG上の異なる
エピトープを認識し、プラスミノーゲン、フイブリノー
ゲン、ヘパリンのHRGへの結合及び共存によつてその反
応性が影響されないことが示された。特にHR-26は、CNB
r断片化により反応性が消失又は著しく減少することが
示された。The above results are summarized in Tables 1 and 2. Table 1 shows HR-
1. Ig subclass of HR-26, reactivity with antigen, cross-reactivity, and Table 2 summarizes the effect of coexisting substances. HR-1 and HR-26 are different epitopes on HRG. It was demonstrated that the reactivity of plasminogen, fibrinogen, and heparin was not affected by binding and coexistence with HRG. Especially HR-26 is CNB
It was shown that the reactivity was lost or significantly reduced by r fragmentation.
実施例２ モノクローナル抗体を用いたサンドイツチEI
A法によるHRGの測定 実施例１で得たモノクローナル抗体HR−１、HR-26を用
いてHRG測定試薬を調整した。 Example 2 San-Germany EI using a monoclonal antibody
Measurement of HRG by Method A The HRG measurement reagents were prepared using the monoclonal antibodies HR-1 and HR-26 obtained in Example 1.
（１） ペルオキシダーゼ（POD）標識モノクローナル
抗体の作製 モノクローナル抗体HR−１をナカネ法（前出）によりPO
D標識した。(1) Preparation of Peroxidase (POD) -Labeled Monoclonal Antibody Monoclonal antibody HR-1 was PO by the Nakane method (supra).
D labeled.
（２） サンドイツチEIA法による測定系 96ウエルマイクロタイタープレートの各ウエルにPBSに
溶解したモノクローナル抗体HR-26（10μg/ml）を100μ
ｌずつ添加し４℃で１晩インキユベートし、溶液を捨て
た後、１％BSAを含むPBS溶液を200μｌずつ各ウエルに
添加し、37℃で１時間ブロツキングを行つた。PBSでよ
く洗浄したのち、サンプル200μｌを添加して引続き１
％BSAを含むPBSで希釈したPOD標識HR−１抗体液100μｌ
を添加して37℃30分間反応させた後、PBSで３回洗浄
し、0.001％過酸化水素、0.55mg/ml ABTSを含む0.1Mク
エン酸−水酸化ナトリウムのバツフアー（pH4.0）を加
え、波長405nmの吸光度を測定した。(2) Sangerichi EIA assay system 100 μl of monoclonal antibody HR-26 (10 μg / ml) dissolved in PBS was added to each well of a 96-well microtiter plate.
After adding 1 liter each and incubating overnight at 4 ° C., discarding the solution, 200 μl each of PBS solution containing 1% BSA was added to each well, and blocking was carried out at 37 ° C. for 1 hour. After thorough washing with PBS, add 200 μl of sample and continue 1
100 μl of POD-labeled HR-1 antibody solution diluted with PBS containing% BSA
After reacting at 37 ℃ for 30 minutes, wash with PBS 3 times, and add 0.1M citric acid-sodium hydroxide buffer (pH 4.0) containing 0.001% hydrogen peroxide and 0.55mg / ml ABTS. The absorbance at a wavelength of 405 nm was measured.
（３） 検体の測定 健常人18例、心筋梗塞18例、脳梗塞12例より得た血しよ
うサンプルを１％BSA含有PBSで1000倍希釈した試料を上
記EIA法で測定した。この時、精製HRGを標準品として得
た検量線から各々検体のHRG濃度を求めた。結果を第１
図に示す。すなわち第１図は本発明のモノクローナル抗
体を用いたサンドイツチEIA法による血しょうのHRG測定
結果を、HRG濃度（μg/ml、縦軸）と各血しようサンプ
ル（横軸）との関係を示す図である。(3) Measurement of Specimens Plasma samples obtained from 18 healthy individuals, 18 myocardial infarctions, and 12 cerebral infarctions were diluted 1000-fold with 1% BSA-containing PBS, and measured by the EIA method. At this time, the HRG concentration of each sample was determined from the calibration curve obtained using purified HRG as a standard product. First result
Shown in the figure. That is, FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the HRG concentration (μg / ml, vertical axis) and each plasma sample (horizontal axis), which is the HRG measurement result of plasma by the San-Germany EIA method using the monoclonal antibody of the present invention. Is.
健常群では平均±SDは100.6±19.15μg/mlであつた。一
方、心筋梗塞群、脳梗塞群では各々115.2±51.3μg/m
l、117.7±61.6μg/mlと健常人に比べ幅広い分布を示
し、健常群の平均±2SDをカツト オフ（cut off）値と
した場合、異常値を示す症例が認められた。In the healthy group, the mean ± SD was 100.6 ± 19.15 μg / ml. On the other hand, in myocardial infarction group and cerebral infarction group, respectively 115.2 ± 51.3 μg / m
l, 117.7 ± 61.6 μg / ml, showing a broader distribution than in healthy subjects, and there were cases in which abnormal values were observed when the mean ± 2SD of the healthy group was used as the cut off value.
実施例３ モノクローナル抗体を用いたラテツクス凝集
法によるHRGの測定 実施例１で得たモノクローナル抗体HR−１、HR-26を用
いてHRG測定試薬を調整した。Example 3 Measurement of HRG by Latex Aggregation Method Using Monoclonal Antibody The HRG measurement reagents were prepared using the monoclonal antibodies HR-1 and HR-26 obtained in Example 1.
（１） ラテツクスの感作 0.1M NaCl含有の0.05Mグリシン−NaOHバツフアー（GB、
pH8.5）に、ラテツクス〔セキスイ化学工業（株）製、
粒径0.464μｍ〕固形分が4.0％（w/v）となるように分
散させた懸濁液１容とHR−１又はHR-26（各々30mg/ml）
の溶液１容とを各々混合し、37℃３時間インキユベート
した。これにBSA、シヨ糖、塩化コリン、NaN3を含むGB6
容を加え、終濃度としてラテツクス固形分0.5％、BSA1
％、シヨ糖１％、塩化コリン0.1M、NaN30.1％となるよ
うにした。HR−１、HR-26を別々に感作したラテツクス
を用時1:1で混合し、これをラテツクス試薬とした。(1) Sensitization of Latex 0.05M glycine-NaOH buffer containing 0.1M NaCl (GB,
pH8.5), latex (manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.,
Particle size 0.464 μm] 1 volume of suspension dispersed so that the solid content is 4.0% (w / v) and HR-1 or HR-26 (30 mg / ml each)
1 volume of the solution was mixed with each other and incubated at 37 ° C. for 3 hours. GB6 containing BSA, sucrose, choline chloride, NaN 3
The final concentration of lattex solids 0.5%, BSA1
%, Sucrose 1%, choline chloride 0.1M, NaN 3 0.1%. HR-1 and HR-26 were separately sensitized and mixed at a ratio of 1: 1 before use, and this was used as a latex reagent.
（２） 検体の測定法 血しようサンプルを１％BSA含有PBSで1000倍希釈した検
体20μｌとラテツクス試薬20μｌをラテツクス凝集判定
プレート上で混合し、３分後に凝集の有無を判定した。
この時、精製HRGを用いてこの系での検出感度を求めた
結果、150ng/mlであつた。本測定法を用いて健常人14
例、脳梗塞13例、心筋梗塞10例について血しようサンプ
ルを用いて測定した結果、表３に示すように、脳梗塞、
心筋梗塞患者において血中HRGが高値を示すことが示さ
れた。(2) Method for measuring sample 20 μl of a sample obtained by diluting a blood sample 1000 times with PBS containing 1% BSA and 20 μl of a latex reagent were mixed on a latex agglutination determination plate, and after 3 minutes, the presence or absence of aggregation was determined.
At this time, the detection sensitivity of this system using purified HRG was 150 ng / ml. Healthy people using this measurement method 14
Examples, cerebral infarction 13 cases, myocardial infarction 10 cases, as a result of measurement using blood sample, as shown in Table 3, cerebral infarction,
It was shown that the blood HRG level was high in patients with myocardial infarction.
〔発明の効果〕 以上詳細に説明した通り、本発明によりHRGに対するモ
ノクローナル抗体が提供された。本発明のモノクローナ
ル抗体を利用することにより、簡便で特異性の高いHRG
の測定が可能となり、HRGの生理作用の研究、血液の凝
固・線溶系の疾患の診断に非常に有用である。 [Effects of the Invention] As described in detail above, the present invention provides a monoclonal antibody against HRG. By using the monoclonal antibody of the present invention, HRG is simple and highly specific.
It is very useful for studying the physiological effects of HRG and for diagnosing blood coagulation / fibrinolytic system diseases.
第１図は本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイ
ツチEIA法による血しよう中のHRG濃度の測定結果を示す
図である。FIG. 1 is a diagram showing the results of measurement of the HRG concentration in blood plasma by the San-Germany EIA method using the monoclonal antibody of the present invention.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，25［８ ］（1986）Ｐ．2220−2225 Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，119 ［３］（1981）Ｐ．641−646 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏ ｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ, 255［21］（1980）Ｐ．10214−10222─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Office reference number FI technical display location C12P 21/08 9161-4B (C12P 21/08 C12R 1:91) (72) Inventor Ikuyuki Kato Shin, 3-4-1 Seta, Otsu City, Shiga Prefecture, Central Research Laboratory, Mina Shuzo Co., Ltd. (56) References Biochemistry, 25 [8] (1986) p. 2220-2225 Eur. J. Biochem. , 119 [3] (1981) p. 641-646 The Journal of Biological Chemistry, 255 [21] (1980) P. 10214-10222
Claims (4)
ン、フイブリノーゲンと交差反応せず、プラスミノーゲ
ン、フイブリノーゲン、ヘパリンのヒスチジン・リツチ
・グリコプロテインへの結合によつて抗体のヒスチジン
・リツチ・グリコプロテインへの反応性が阻害されない
抗ヒスチジン・リツチ・グリコプロテインモノクローナ
ル抗体。1. An antihistidine-rich-glycoprotein antibody by binding plasminogen, fibrinogen, heparin to histidine-rich glycoprotein without cross-reacting with antithrombin III, plasminogen, fibrinogen. Anti-histidine-rich-glycoprotein monoclonal antibody whose reactivity is not inhibited.
ノクローナル抗体。 （ａ） 分子量:170,000±5,000 （ｂ） Igサブクラス；IgG1 （ｃ） 抗原との反応性：ヒスチジン・リツチ・グリコ
プロテインをCNBr分解して得られるヒスチジン・リツチ
・グリコプロテインのＮ末端側50kDaのペプチドと反応
しない2. The monoclonal antibody according to claim 1, which has the following properties. (A) Molecular weight: 170,000 ± 5,000 (b) Ig subclass; IgG 1 (c) Reactivity with antigen: 50 kDa of N-terminal side of histidine-rich-glycoprotein obtained by degrading histidine-rich-glycoprotein by CNBr Does not react with peptides
ノクローナル抗体。 （ａ） 分子量:165,000±5,000 （ｂ） Igサブクラス；IgG1 （ｃ） 抗原との反応性：ヒスチジン・リツチ・グリコ
プロテインをCNBr分解して得られるヒスチジン・リツチ
・グリコプロテインのＮ末端側50kDaのペプチドと反応
する3. The monoclonal antibody according to claim 1, which has the following properties. (A) Molecular weight: 165,000 ± 5,000 (b) Ig subclass; IgG 1 (c) Reactivity with antigen: 50 kDa of N-terminal side of histidine-rich-glycoprotein obtained by decomposing histidine-rich-glycoprotein by CNBr React with peptides
プロテインの測定に当り、請求項１記載の抗ヒスチジン
・リツチ・グリコプロテインモノクローナル抗体を使用
することを特徴とするヒスチジン・リツチ・グリコプロ
テインの測定方法。4. A method for measuring histidine-rich-glycoprotein, which comprises using the anti-histidine-rich-glycoprotein monoclonal antibody according to claim 1 in measuring histidine-rich-glycoprotein in a biological sample. Method.
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- 1988-08-12 JP JP63199945A patent/JPH0753757B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５［８（１９８６）Ｐ．２２２０−２２２５ |
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１９［３（１９８１）Ｐ．６４１−６４６ |
| ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５５［２１（１９８０）Ｐ．１０２１４−１０２２２ |
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