JPH11201903A - カルシウムイオン分析法およびそれに用いる試薬 - Google Patents
カルシウムイオン分析法およびそれに用いる試薬Info
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- JPH11201903A JPH11201903A JP2279798A JP2279798A JPH11201903A JP H11201903 A JPH11201903 A JP H11201903A JP 2279798 A JP2279798 A JP 2279798A JP 2279798 A JP2279798 A JP 2279798A JP H11201903 A JPH11201903 A JP H11201903A
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- cyclodextrin
- calcium ion
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 エクオリンの発光を利用して細胞内等のカル
シウムイオンを分析するに当たり、セレンテラジンまた
はその類縁化合物を効率的に被分析系に導入することに
より、発光性能が優れ高感度にカルシウムイオンを分析
することのできる技術を提供する。 【解決手段】 アポエクオリン、セレンテラジンまたは
その類縁化合物、および分子状酸素から形成されるエク
オリンの発光によってカルシウムイオンを分析するに当
たり、シクロデキストリンを添加するカルシウムイオン
分析法、および該分析法を実施するのに使用される試薬
であって、セレンテラジンまたはその類縁化合物とシク
ロデキストリンとを含有する乾燥固体状または液状の混
合物から成るカルシウムイオン分析用試薬。好ましく
は、シクロデキストリンとしてヒドロキシプロピル−β
−シクロデキストリンを使用する。
シウムイオンを分析するに当たり、セレンテラジンまた
はその類縁化合物を効率的に被分析系に導入することに
より、発光性能が優れ高感度にカルシウムイオンを分析
することのできる技術を提供する。 【解決手段】 アポエクオリン、セレンテラジンまたは
その類縁化合物、および分子状酸素から形成されるエク
オリンの発光によってカルシウムイオンを分析するに当
たり、シクロデキストリンを添加するカルシウムイオン
分析法、および該分析法を実施するのに使用される試薬
であって、セレンテラジンまたはその類縁化合物とシク
ロデキストリンとを含有する乾燥固体状または液状の混
合物から成るカルシウムイオン分析用試薬。好ましく
は、シクロデキストリンとしてヒドロキシプロピル−β
−シクロデキストリンを使用する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、カルシウムイオン
を分析する技術分野に属し、特に、エクオリンの発光を
利用して細胞内等における低濃度のカルシウムイオンを
分析する方法の改良および該方法に用いられる新規な試
薬に関する。
を分析する技術分野に属し、特に、エクオリンの発光を
利用して細胞内等における低濃度のカルシウムイオンを
分析する方法の改良および該方法に用いられる新規な試
薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】エクオリン（aequorin) は発光オワンク
ラゲ(Aequorea)から単離された発光蛋白質であり、蛋白
質部分であるアポエクオリン(apoaequorin) 、発光種で
あるセレンテラジン(coelenterazine)、および分子状酸
素から成る複合体である。この複合体にカルシウムイオ
ン（Ｃａ2+) が結合すると、蛋白質のコンフォメーショ
ンが変化し、セレンテラジンが酸化的分解する過程で生
じる励起カルボニル基が基底状態に戻るときのエネルギ
ーが発光として放出されることが知られている。
ラゲ(Aequorea)から単離された発光蛋白質であり、蛋白
質部分であるアポエクオリン(apoaequorin) 、発光種で
あるセレンテラジン(coelenterazine)、および分子状酸
素から成る複合体である。この複合体にカルシウムイオ
ン（Ｃａ2+) が結合すると、蛋白質のコンフォメーショ
ンが変化し、セレンテラジンが酸化的分解する過程で生
じる励起カルボニル基が基底状態に戻るときのエネルギ
ーが発光として放出されることが知られている。
【０００３】このエクオリンの発光は、極めて低濃度の
カルシウムイオンの存在により起こるので、生理的条件
下のカルシウムイオン濃度の測定に適している。したが
って、エクオリンは、その発見以来、細胞の研究等に際
して細胞内にマイクロインジェクションされ、細胞内の
遊離カルシウムイオン濃度を測定するのに採用されてき
た。それとともに、発光種であるセレンテラジンについ
ても化学発光物質として研究が進められＭＣＬＡに代表
する各種の類縁化合物（アナログ）の合成が試みられて
きた。しかし、このエクオリンの発光を利用するカルシ
ウムイオン分析法は、精製されたエクオリン（アポエ
クオリン）を入手するのが難しいこと、アポエクオリ
ンやセレンテラジンを小さな細胞に注入するのに困難を
伴うという欠点があるため、最近の細胞研究などにおい
てはFura２に代表されるＣａ2+蛍光指示薬にとって代わ
られつつある。
カルシウムイオンの存在により起こるので、生理的条件
下のカルシウムイオン濃度の測定に適している。したが
って、エクオリンは、その発見以来、細胞の研究等に際
して細胞内にマイクロインジェクションされ、細胞内の
遊離カルシウムイオン濃度を測定するのに採用されてき
た。それとともに、発光種であるセレンテラジンについ
ても化学発光物質として研究が進められＭＣＬＡに代表
する各種の類縁化合物（アナログ）の合成が試みられて
きた。しかし、このエクオリンの発光を利用するカルシ
ウムイオン分析法は、精製されたエクオリン（アポエ
クオリン）を入手するのが難しいこと、アポエクオリ
ンやセレンテラジンを小さな細胞に注入するのに困難を
伴うという欠点があるため、最近の細胞研究などにおい
てはFura２に代表されるＣａ2+蛍光指示薬にとって代わ
られつつある。
【０００４】しかしながら、エクオリンはＣａ2+蛍光指
示薬に比較すると、励起光を必要としないので細胞に
損傷を与えず、また、細胞自身の自己蛍光の影響も受け
ない、エクオリンの発光は微弱であるので、蛍光光度
計に比べ安価な光電子倍増管やフォトカウンターで測定
できる、Ｃａ2+蛍光指示薬のように細胞内オルガネラ
に入ることもなく細胞質に局在化するので解析が容易で
あるという利点を有するので、上記のごとき欠点が解消
されれば、細胞の機能や状態を調べる研究などにおいて
理想的なカルシウムイオン分析手段となり得る可能性を
残している。
示薬に比較すると、励起光を必要としないので細胞に
損傷を与えず、また、細胞自身の自己蛍光の影響も受け
ない、エクオリンの発光は微弱であるので、蛍光光度
計に比べ安価な光電子倍増管やフォトカウンターで測定
できる、Ｃａ2+蛍光指示薬のように細胞内オルガネラ
に入ることもなく細胞質に局在化するので解析が容易で
あるという利点を有するので、上記のごとき欠点が解消
されれば、細胞の機能や状態を調べる研究などにおいて
理想的なカルシウムイオン分析手段となり得る可能性を
残している。
【０００５】最近、組換えＤＮＡ法によるアポエクオリ
ンを入手する試みがなされ、例えば、アポエクオリンｃ
ＤＮＡを酵母の高発現プロモーターの１つであるＧＡＰ
プロモーターの下流につないだプラスミドを作製し、酵
母細胞でアポエクオリンを発現させるとともに、該細胞
にセレンテラジンを加えることにより生きている細胞内
でエクオリンを再生させ、カルシウムイオン濃度変化を
測定する実験系が開発されている（嶋田ら：Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 88, 6878-6882 (1991)）。このよ
うな手法により、高純度のアポエクオリンを入手できる
ようになったので、残された課題はセレンテラジンを細
胞内等の被分析系に効率よく導入するということであ
る。
ンを入手する試みがなされ、例えば、アポエクオリンｃ
ＤＮＡを酵母の高発現プロモーターの１つであるＧＡＰ
プロモーターの下流につないだプラスミドを作製し、酵
母細胞でアポエクオリンを発現させるとともに、該細胞
にセレンテラジンを加えることにより生きている細胞内
でエクオリンを再生させ、カルシウムイオン濃度変化を
測定する実験系が開発されている（嶋田ら：Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA, 88, 6878-6882 (1991)）。このよ
うな手法により、高純度のアポエクオリンを入手できる
ようになったので、残された課題はセレンテラジンを細
胞内等の被分析系に効率よく導入するということであ
る。
【０００６】このセレンテラジン（およびその類縁化合
物）は、生体試料において一般的な中性近傍のｐＨにお
ける水溶性が低いために、細胞内等の被分析系への注入
が難しく、細胞表面に吸着して有効に利用されず、発光
性能を低下させるという問題点を有している。このた
め、セレンテラジン系化合物は、一般にメタノールに溶
解して使用されるが、メタノール溶媒は生体組織に毒性
を与えるので回避することが好ましい。また、セレンテ
ラジン系化合物は、アルカリ水溶液中では溶解度が増す
が、ｐＨをアルカリ領域にすると自動酸化が起こり易く
なり安定性に欠け、実用的ではなくなる。
物）は、生体試料において一般的な中性近傍のｐＨにお
ける水溶性が低いために、細胞内等の被分析系への注入
が難しく、細胞表面に吸着して有効に利用されず、発光
性能を低下させるという問題点を有している。このた
め、セレンテラジン系化合物は、一般にメタノールに溶
解して使用されるが、メタノール溶媒は生体組織に毒性
を与えるので回避することが好ましい。また、セレンテ
ラジン系化合物は、アルカリ水溶液中では溶解度が増す
が、ｐＨをアルカリ領域にすると自動酸化が起こり易く
なり安定性に欠け、実用的ではなくなる。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、エク
オリンの発光を利用して細胞内等のカルシウムイオンを
分析するに当たり、セレンテラジンまたはその類縁化合
物を効率的に被分析系に導入することにより、発光性能
が優れ高感度にカルシウムイオンを分析することのでき
る技術を提供することにある。
オリンの発光を利用して細胞内等のカルシウムイオンを
分析するに当たり、セレンテラジンまたはその類縁化合
物を効率的に被分析系に導入することにより、発光性能
が優れ高感度にカルシウムイオンを分析することのでき
る技術を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明に従えば、上記の
目的を達成するものとして、アポエクオリン、セレンテ
ラジンまたはその類縁化合物、および分子状酸素から形
成されるエクオリンの発光によってカルシウムイオンを
分析するに当たり、シクロデキストリンを添加すること
を特徴とするカルシウムイオン分析法が提供される。
目的を達成するものとして、アポエクオリン、セレンテ
ラジンまたはその類縁化合物、および分子状酸素から形
成されるエクオリンの発光によってカルシウムイオンを
分析するに当たり、シクロデキストリンを添加すること
を特徴とするカルシウムイオン分析法が提供される。
【０００９】本発明に従えば、さらに、該分析法を実施
するのに使用される試薬であって、セレンテラジンまた
はその類縁化合物とシクロデキストリンとを含有する乾
燥固体状または液状の混合物から成ることを特徴とする
カルシウムイオン分析用試薬が提供される。本発明のカ
ルシウムイオン分析法およびカルシウムイオン分析用試
薬に使用されるのに特に好適なシクロデキストリンは、
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
するのに使用される試薬であって、セレンテラジンまた
はその類縁化合物とシクロデキストリンとを含有する乾
燥固体状または液状の混合物から成ることを特徴とする
カルシウムイオン分析用試薬が提供される。本発明のカ
ルシウムイオン分析法およびカルシウムイオン分析用試
薬に使用されるのに特に好適なシクロデキストリンは、
ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明に従えば、シクロデキスト
リンを使用することにより、中性ｐＨ域を含む広範囲の
ｐＨ域においてセレンテラジンまたはその類縁化合物の
水溶性が高められて確実に被分析系に導入されるために
エクオリンの発光性能が著しく高められる。このよう
に、シクロデキストリンを使用することによりセレンテ
ラジンまたはその類縁化合物（アナログ）の水溶性が高
められるのは、シクロデキストリンの疎水性空孔内にセ
レンテラジンまたはその類縁化合物が包接されてその見
かけの溶解性が向上し、とりわけ、ヒドロキシプロピル
−β−シクロデキストリンは、その空孔の大きさがセレ
ンテラジンに適合すること、および、ヒドロキシプロピ
ル基の存在により特にそのような効果を高めるためと推
測される。
リンを使用することにより、中性ｐＨ域を含む広範囲の
ｐＨ域においてセレンテラジンまたはその類縁化合物の
水溶性が高められて確実に被分析系に導入されるために
エクオリンの発光性能が著しく高められる。このよう
に、シクロデキストリンを使用することによりセレンテ
ラジンまたはその類縁化合物（アナログ）の水溶性が高
められるのは、シクロデキストリンの疎水性空孔内にセ
レンテラジンまたはその類縁化合物が包接されてその見
かけの溶解性が向上し、とりわけ、ヒドロキシプロピル
−β−シクロデキストリンは、その空孔の大きさがセレ
ンテラジンに適合すること、および、ヒドロキシプロピ
ル基の存在により特にそのような効果を高めるためと推
測される。
【００１１】本発明に従いヒドロキシプロピル−β−シ
クロデキストリンのようなシクロデキストリンによって
溶解されたセレンテラジンまたはその類縁化合物を被分
析系に導入するには、分析時に適当な緩衝液中でセレン
テラジンまたはその類縁化合物とシクロデキストリンを
混合して注入してもよいが、セレンテラジンまたはその
類縁化合物とシクロデキストリンを含有する混合物を予
め調製して、分析用試薬として使用に供すると取扱い上
も便利で好ましい。そのような試薬を構成する混合物
は、適当な緩衝液（一般に、メタノールを含有する水性
緩衝液）中にセレンテラジンまたはその類縁化合物とシ
クロデキストリンとが含有された液状混合物（水溶液）
でもよいが、乾燥固体状の混合物が特に好ましい。
クロデキストリンのようなシクロデキストリンによって
溶解されたセレンテラジンまたはその類縁化合物を被分
析系に導入するには、分析時に適当な緩衝液中でセレン
テラジンまたはその類縁化合物とシクロデキストリンを
混合して注入してもよいが、セレンテラジンまたはその
類縁化合物とシクロデキストリンを含有する混合物を予
め調製して、分析用試薬として使用に供すると取扱い上
も便利で好ましい。そのような試薬を構成する混合物
は、適当な緩衝液（一般に、メタノールを含有する水性
緩衝液）中にセレンテラジンまたはその類縁化合物とシ
クロデキストリンとが含有された液状混合物（水溶液）
でもよいが、乾燥固体状の混合物が特に好ましい。
【００１２】この乾燥固体状の試薬は次のように調製す
ることができる：セレンテラジンまたはその類縁化合物
のメタノール溶液とシクロデキストリン（例えばヒドロ
キシプロピル−β−シクロデキストリン）の水溶液とを
混合し、室温において減圧下でメタノールおよび水を留
去し、乾固した後、得られた乾固体を水に溶解し、室温
において減圧で水を留去し、乾固する。得られる乾固体
はそのままでも使用できるが、一般的には、この水への
溶解および乾固を数回繰り返すことにより、セレンテラ
ジン（またはその類縁化合物）とシクロデキストリン
（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン）とから成る乾燥固体状のカルシウムイオン分析用試
薬が調製される。通常、最終的に得られる乾固体は粉末
化して、使用に供されるまで密閉し低温化（−20℃程
度）に保存する。かくして、本発明に従うこの乾燥固体
状の試薬は、保存や運搬が容易であり、使用時に適当な
緩衝液に溶解させるだけで、高濃度のセレンテラジンま
たはその類縁化合物が溶解された水溶液が得られ、被分
析系にセレンテラジン（またはその類縁化合物）を効率
的に導入することができる。
ることができる：セレンテラジンまたはその類縁化合物
のメタノール溶液とシクロデキストリン（例えばヒドロ
キシプロピル−β−シクロデキストリン）の水溶液とを
混合し、室温において減圧下でメタノールおよび水を留
去し、乾固した後、得られた乾固体を水に溶解し、室温
において減圧で水を留去し、乾固する。得られる乾固体
はそのままでも使用できるが、一般的には、この水への
溶解および乾固を数回繰り返すことにより、セレンテラ
ジン（またはその類縁化合物）とシクロデキストリン
（例えばヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリ
ン）とから成る乾燥固体状のカルシウムイオン分析用試
薬が調製される。通常、最終的に得られる乾固体は粉末
化して、使用に供されるまで密閉し低温化（−20℃程
度）に保存する。かくして、本発明に従うこの乾燥固体
状の試薬は、保存や運搬が容易であり、使用時に適当な
緩衝液に溶解させるだけで、高濃度のセレンテラジンま
たはその類縁化合物が溶解された水溶液が得られ、被分
析系にセレンテラジン（またはその類縁化合物）を効率
的に導入することができる。
【００１３】使用するセレンテラジン（またはその類縁
化合物）とシクロデキストリンの混合比およびそれらの
濃度は、特に限定的なものではなく、対象となる被分析
系に応じて定められる。１例として、重量比で、セレン
テラジン２％に対してヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン98％の割合で混合される。
化合物）とシクロデキストリンの混合比およびそれらの
濃度は、特に限定的なものではなく、対象となる被分析
系に応じて定められる。１例として、重量比で、セレン
テラジン２％に対してヒドロキシプロピル−β−シクロ
デキストリン98％の割合で混合される。
【００１４】なお、本発明において用いるセレンテラジ
ンの類縁化合物とは、アポエクオリンおよび分子状酸素
と複合体を形成してセレンテラジンと同様の発光機能を
有するものであり、一般に「３，７−ジヒドロイミダゾ
ール〔１，２−ａ〕ピラジン−３−オン」構造を有し、
その代表例はＭＣＬＡ「２−メチル−６−（４−メトキ
シフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾール〔１，２
−ａ〕ピラジン−３−オン」である。その他のセレンテ
ラジン類縁化合物（アナログ）は、例えば、本発明者ら
による論文「Bull. Chem. Soc., Jpn., 63, 3132-3140
(1990)」に記載されており、それらの化合物も本発明に
従いヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンによ
り水溶性を高めて使用することができる。
ンの類縁化合物とは、アポエクオリンおよび分子状酸素
と複合体を形成してセレンテラジンと同様の発光機能を
有するものであり、一般に「３，７−ジヒドロイミダゾ
ール〔１，２−ａ〕ピラジン−３−オン」構造を有し、
その代表例はＭＣＬＡ「２−メチル−６−（４−メトキ
シフェニル）−３，７−ジヒドロイミダゾール〔１，２
−ａ〕ピラジン−３−オン」である。その他のセレンテ
ラジン類縁化合物（アナログ）は、例えば、本発明者ら
による論文「Bull. Chem. Soc., Jpn., 63, 3132-3140
(1990)」に記載されており、それらの化合物も本発明に
従いヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンによ
り水溶性を高めて使用することができる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明の特徴をさらに明らかにするた
め実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制
限されるものではない。 〔実施例１：水溶性試験〕この実施例は、シクロデキス
トリン、特にヒドロキシプロピル−β−シクロデキスト
リンによりセレンテラジンの水溶性が高められることを
示すものである。 セレンテラジン／シクロデキストリン乾固試薬の調製 3.0mM のセレンテラジンのメタノール溶液0.1ml と45mM
のα−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）、ヒドロキシ
プロピル−α−シクロデキストリン（ＨＰ−α−Ｃｙ
Ｄ）、β−シクロデキストリン（β−ＣｙＤ）およびヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β
−ＣｙＤ）の水溶液各0.2ml とを混合し室温において真
空ポンプを用いて減圧下で突沸に注意しながら約40℃に
加熱してメタノールおよび水を留去し、乾燥固体状のセ
レンテラジン／シクロデキストリン混合試薬を調製し
た。
め実施例を示すが、本発明はこれらの実施例によって制
限されるものではない。 〔実施例１：水溶性試験〕この実施例は、シクロデキス
トリン、特にヒドロキシプロピル−β−シクロデキスト
リンによりセレンテラジンの水溶性が高められることを
示すものである。 セレンテラジン／シクロデキストリン乾固試薬の調製 3.0mM のセレンテラジンのメタノール溶液0.1ml と45mM
のα−シクロデキストリン（α−ＣｙＤ）、ヒドロキシ
プロピル−α−シクロデキストリン（ＨＰ−α−Ｃｙ
Ｄ）、β−シクロデキストリン（β−ＣｙＤ）およびヒ
ドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β
−ＣｙＤ）の水溶液各0.2ml とを混合し室温において真
空ポンプを用いて減圧下で突沸に注意しながら約40℃に
加熱してメタノールおよび水を留去し、乾燥固体状のセ
レンテラジン／シクロデキストリン混合試薬を調製し
た。
【００１６】水溶性テスト 上記のように調製したセレンテラジン／シクロデキスト
リン乾固体を２mMのＥＤＴＡを含有する10mMのリン酸緩
衝液（ｐＨ5.5 、6.5 または7.5)1.0ml に混合し、該混
合物を室温で約30秒間撹拌した後、０℃で５分間遠心分
離（10,000rpm）した。上澄液中のセレンテラジンの濃
度を430nm における吸光度（Ａ430)を測定することによ
り評価した。その結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、セレンテラジンを可溶化するのにＨＰ−β−Ｃｙ
Ｄが特に効果的であり、次いでβ−ＣｙＤが効果的であ
る。
リン乾固体を２mMのＥＤＴＡを含有する10mMのリン酸緩
衝液（ｐＨ5.5 、6.5 または7.5)1.0ml に混合し、該混
合物を室温で約30秒間撹拌した後、０℃で５分間遠心分
離（10,000rpm）した。上澄液中のセレンテラジンの濃
度を430nm における吸光度（Ａ430)を測定することによ
り評価した。その結果を図１に示す。図１に示されるよ
うに、セレンテラジンを可溶化するのにＨＰ−β−Ｃｙ
Ｄが特に効果的であり、次いでβ−ＣｙＤが効果的であ
る。
【００１７】β−ＣｙＤおよびＨＰ−β−ＣｙＤについ
ては、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によっ
てもセレンテラジンの溶解量を測定した。このＨＰＬＣ
分析においてはセレンテラジンの自動酸化によりＡ430
の値が減少することはないと考えられる。ＨＰＬＣ分析
はＯＤＳカラム（4.6mm ×250mm)中で0.3%のＣＦ3 ＣＯ
ＯＨを含有する40％ＣＨ3 ＣＮから成る無勾配溶出液を
用いてＡ430 を測定することにより行った。
ては、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によっ
てもセレンテラジンの溶解量を測定した。このＨＰＬＣ
分析においてはセレンテラジンの自動酸化によりＡ430
の値が減少することはないと考えられる。ＨＰＬＣ分析
はＯＤＳカラム（4.6mm ×250mm)中で0.3%のＣＦ3 ＣＯ
ＯＨを含有する40％ＣＨ3 ＣＮから成る無勾配溶出液を
用いてＡ430 を測定することにより行った。
【００１８】結果を図２に示す。図２に示されるよう
に、ＨＰ−β−ＣｙＤはβ−ＣｙＤよりもセレンテラジ
ンの水溶性を高めるのに効果的である。β−ＣｙＤを含
有するセレンテラジン水溶液においては、ｐＨ値が7.0
以下になると１〜３時間内にセレンテラジンまたはセレ
ンテラジン−ＣｙＤコンプレックスの一部が沈殿するこ
とが認められた。これに対して、ＨＰ−β−ＣｙＤを用
いた場合は、ｐＨ値が6.0 以下においても24時間経過し
てもそのような沈降は見られなかった。このようにＨＰ
−β−ＣｙＤは、中性域を含む広範囲のｐＨ域において
セレンテラジンの水溶性を高めるのにきわめて効果的で
ある。
に、ＨＰ−β−ＣｙＤはβ−ＣｙＤよりもセレンテラジ
ンの水溶性を高めるのに効果的である。β−ＣｙＤを含
有するセレンテラジン水溶液においては、ｐＨ値が7.0
以下になると１〜３時間内にセレンテラジンまたはセレ
ンテラジン−ＣｙＤコンプレックスの一部が沈殿するこ
とが認められた。これに対して、ＨＰ−β−ＣｙＤを用
いた場合は、ｐＨ値が6.0 以下においても24時間経過し
てもそのような沈降は見られなかった。このようにＨＰ
−β−ＣｙＤは、中性域を含む広範囲のｐＨ域において
セレンテラジンの水溶性を高めるのにきわめて効果的で
ある。
【００１９】次に、ｐＨ7.0 におけるＨＰ−β−ＣｙＤ
の濃度と溶解セレンテラジンの濃度の関係を調べた。こ
のために、セレンテラジン溶液（0.8 ％メタノール溶
液、0.5ml)と濃度を変えたＨＰ−β−ＣｙＤ水溶液とを
混合して、該混合液から室温において減圧下にメタノー
ルと水を蒸発、除去した。得られた乾燥サンプルの各々
に、２mMのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
を添加、混合し、必要に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨを
用いてｐＨを7.0 に調製した。混合液を室温で約30秒攪
拌し、遠心分離した後、直ちにＨＰＬＣ分析によりセレ
ンテラジンの溶解量を測定した。
の濃度と溶解セレンテラジンの濃度の関係を調べた。こ
のために、セレンテラジン溶液（0.8 ％メタノール溶
液、0.5ml)と濃度を変えたＨＰ−β−ＣｙＤ水溶液とを
混合して、該混合液から室温において減圧下にメタノー
ルと水を蒸発、除去した。得られた乾燥サンプルの各々
に、２mMのＥＤＴＡを含有するリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
を添加、混合し、必要に応じてＨＣｌまたはＮａＯＨを
用いてｐＨを7.0 に調製した。混合液を室温で約30秒攪
拌し、遠心分離した後、直ちにＨＰＬＣ分析によりセレ
ンテラジンの溶解量を測定した。
【００２０】結果を図３に示す。図３に示されるよう
に、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が増加するに従ってセレン
テラジンの溶解量も増大しており、セレンテラジンの溶
解量の最大値は、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が50mMのとき
に3.7mM となっており、この値は該シクロデキストリン
を添加しない場合の約 280倍であった。
に、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が増加するに従ってセレン
テラジンの溶解量も増大しており、セレンテラジンの溶
解量の最大値は、ＨＰ−β−ＣｙＤの濃度が50mMのとき
に3.7mM となっており、この値は該シクロデキストリン
を添加しない場合の約 280倍であった。
【００２１】〔実施例２：エクオリン発光試験〕この実
施例は、セレンテラジンとＨＰ−β−ＣｙＤとを含有す
る乾燥固体状の試薬を用いて、生細胞でのエクオリン発
光性能を試験した結果を示すものである。上述のように
調製したセレンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ乾燥固体
（10mg、重量でセレンテラジン２％およびＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ98％から成る）を、10mMのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
0.1ml に溶かした。このセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液を用い、前述の嶋田らの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA, 88, 6878 (1991)) に従い、アポエクオ
リン発現酵母細胞に導入し、Ｃａ2+による発光をＡＲＵ
ＧＵＳ−50（浜松ホトニクス）で測定した。
施例は、セレンテラジンとＨＰ−β−ＣｙＤとを含有す
る乾燥固体状の試薬を用いて、生細胞でのエクオリン発
光性能を試験した結果を示すものである。上述のように
調製したセレンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ乾燥固体
（10mg、重量でセレンテラジン２％およびＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ98％から成る）を、10mMのリン酸緩衝液（ｐＨ7.0)
0.1ml に溶かした。このセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液を用い、前述の嶋田らの方法（Proc. Natl. Ac
ad. Sci., USA, 88, 6878 (1991)) に従い、アポエクオ
リン発現酵母細胞に導入し、Ｃａ2+による発光をＡＲＵ
ＧＵＳ−50（浜松ホトニクス）で測定した。
【００２２】定常状態において、従来用いられていたセ
レンテラジン／メタノール溶液（実験ａ）に比べ、セレ
ンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ溶液を加えた場合（実験
ｂ）では、およそ２〜３倍高い発光強度が得られた。ま
た、TritonＸ−100 を加えて酵母細胞を壊し、大過剰の
Ｃａ2+と反応させると、従来のセレンテラジン／メタノ
ール溶液（実験ｃ）よりセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液（実験ｄ）の方が３倍以上高い発光強度を示し
た。発光強度の経時変化を図４に示す。従来のセレンテ
ラジン／メタノール溶液の系にくらべ、発光強度が大き
くなり、Ｓ／Ｎ比が向上していることが分かる。
レンテラジン／メタノール溶液（実験ａ）に比べ、セレ
ンテラジン／ＨＰ−β−ＣｙＤ溶液を加えた場合（実験
ｂ）では、およそ２〜３倍高い発光強度が得られた。ま
た、TritonＸ−100 を加えて酵母細胞を壊し、大過剰の
Ｃａ2+と反応させると、従来のセレンテラジン／メタノ
ール溶液（実験ｃ）よりセレンテラジン／ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ溶液（実験ｄ）の方が３倍以上高い発光強度を示し
た。発光強度の経時変化を図４に示す。従来のセレンテ
ラジン／メタノール溶液の系にくらべ、発光強度が大き
くなり、Ｓ／Ｎ比が向上していることが分かる。
【００２３】ＨＰ−β−ＣｙＤを使用することにより、
セレンテラジンの水溶性が高められ、充分量のセレンテ
ラジンが酵母内に導入されて、エクオリンの発光に有効
的に利用されたものと思われる。
セレンテラジンの水溶性が高められ、充分量のセレンテ
ラジンが酵母内に導入されて、エクオリンの発光に有効
的に利用されたものと思われる。
【００２４】
【発明の効果】本発明の分析法によれば、ＨＰ−β−Ｃ
ｙＤ（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）
のようなシクロデキストリンを使用することによりセレ
ンテラジン（またはその類縁化合物）を、その水溶性を
高めて確実に被分析系に導入することができるので、エ
クオリンの発光性能が著しく向上し、極めて高感度にカ
ルシウムイオンを分析することができる。本発明のシク
ロデキストリン／セレンテラジン（またはその類縁化合
物）の混合物から成るカルシウムイオン分析用試薬は取
扱い易く、特に、乾燥固体状のカルシウムイオン分析用
試薬は使用時に適当な緩衝液に溶解させるだけで高濃度
のセレンテラジンまたはその類縁化合物の水溶液が得ら
れ被分析系に効率的に導入することができる。
ｙＤ（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）
のようなシクロデキストリンを使用することによりセレ
ンテラジン（またはその類縁化合物）を、その水溶性を
高めて確実に被分析系に導入することができるので、エ
クオリンの発光性能が著しく向上し、極めて高感度にカ
ルシウムイオンを分析することができる。本発明のシク
ロデキストリン／セレンテラジン（またはその類縁化合
物）の混合物から成るカルシウムイオン分析用試薬は取
扱い易く、特に、乾燥固体状のカルシウムイオン分析用
試薬は使用時に適当な緩衝液に溶解させるだけで高濃度
のセレンテラジンまたはその類縁化合物の水溶液が得ら
れ被分析系に効率的に導入することができる。
【図１】各種のシクロデキストリンによるセレンテラジ
ンの溶解効果を比較して示すグラフである。
ンの溶解効果を比較して示すグラフである。
【図２】シクロデキストリンによるセレンテラジンの溶
解濃度とｐＨの関係を示すグラフである。
解濃度とｐＨの関係を示すグラフである。
【図３】セレンテラジンの溶解濃度とヒドロキシプロピ
ル−β−シクロデキストリンの濃度の関係を示すグラフ
である。
ル−β−シクロデキストリンの濃度の関係を示すグラフ
である。
【図４】本発明のヒドロキシプロピル−β−シクロデキ
ストリン／セレンテラジン混合試薬を用いたエクオリン
発光試験の結果の１例を示すグラフである。
ストリン／セレンテラジン混合試薬を用いたエクオリン
発光試験の結果の１例を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 アポエクオリン、セレンテラジンまたは
その類縁化合物、および分子状酸素から形成されるエク
オリンの発光によってカルシウムイオンを分析するに当
たり、シクロデキストリンを添加することを特徴とする
カルシウムイオン分析法。 - 【請求項２】 シクロデキストリンとして、ヒドロキシ
プロピル−β−シクロデキストリンを用いることを特徴
とする請求項１のカルシウムイオン分析法。 - 【請求項３】 セレンテラジンまたはその類縁化合物と
シクロデキストリンとを含有する乾燥固体状または液状
の混合物から成ることを特徴とするカルシウムイオン分
析用試薬。 - 【請求項４】 シクロデキストリンが、ヒドロキシプロ
ピル−β−シクロデキストリンであることを特徴とする
請求項３のカルシウムイオン分析用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279798A JPH11201903A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | カルシウムイオン分析法およびそれに用いる試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2279798A JPH11201903A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | カルシウムイオン分析法およびそれに用いる試薬 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11201903A true JPH11201903A (ja) | 1999-07-30 |
Family
ID=12092683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2279798A Pending JPH11201903A (ja) | 1998-01-19 | 1998-01-19 | カルシウムイオン分析法およびそれに用いる試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11201903A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009153444A (ja) * | 2007-12-26 | 2009-07-16 | Chisso Corp | 発光基質水溶液およびその製造方法 |
| US11103528B1 (en) | 2019-07-18 | 2021-08-31 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Slow release calcium composition |
| JP2022512611A (ja) * | 2018-10-03 | 2022-02-07 | プロメガ コーポレイション | セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体を安定化させるための組成物及び方法 |
-
1998
- 1998-01-19 JP JP2279798A patent/JPH11201903A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009153444A (ja) * | 2007-12-26 | 2009-07-16 | Chisso Corp | 発光基質水溶液およびその製造方法 |
| JP2022512611A (ja) * | 2018-10-03 | 2022-02-07 | プロメガ コーポレイション | セレンテラジンならびにその類似体及び誘導体を安定化させるための組成物及び方法 |
| US11103528B1 (en) | 2019-07-18 | 2021-08-31 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Air Force | Slow release calcium composition |
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