JPH11187879A - Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属植物由来の新規ＩＮＰＳ遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、塩ストレスに対して耐性を有する
新規ＩＮＰＳ遺伝子を見い出すこを課題とする。さらに
詳しくは、遺伝子操作によ利、塩ストレスに対して耐性
を有する新規ＩＮＰＳ遺伝子を見い出し、それを用いて
植物の塩分ストレス耐性を改良することを課題とする。 【効果】 本発明で得られた遺伝子は植物に塩分ストレ
ス耐性を付与する機能があると考えられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、塩ストレス若くは
乾燥ストレス等の水分ストレスに耐性活性を有するDNA
に関する。さらに詳しくは、遺伝子工学技術を用いた塩
ストレス若くは乾燥ストレス等の水分ストレスに耐性活
性を有するNicotiana属由来のDNAに関する。

【０００２】

【従来の技術】植物は通常の育成環境下においても、常
にストレスを受けている。このようなストレスには、
塩、乾燥、高温、低温、強光、空気汚染等のさまざまな
ものが含まれるが、農業生産の観点から最も問題となっ
ているのは、塩害や乾燥による塩ストレスである。塩害
は元々塩分の高い地域のみならず、潅漑を行なうことに
よりそれまで問題の無かった農地においても発生し問題
になっている。現在、全耕地の１０％以上が何らかの塩
害を受けていると言われている。また、人口増加に追い
つくための食料生産増加を行うには、現在では塩害など
による耕作不適当土壌とされている土地での農業生産が
必要になるとの見方もある。

【０００３】また、乾燥ストレスは天候不順による干ば
つなどにより生じる。アメリカでは数年おきに、干ばつ
による農業物生産高の低下が起こっている。したがっ
て、このような塩ストレスに耐性を有する植物を見い出
すことは、将来起こりうると考えられる食料危機等を考
慮すると非常に重要なことである。

【０００４】我々は、Nicotiana属の植物について、塩
および乾燥ストレス耐性のスクリーニングを行い (Plan
t Physiology (1995), 108, 106)、 Nicotiana excelsi
orおよびNicotiana paniculataを塩ストレス耐性種とし
て選抜した（育種学雑誌、第４６巻、別冊２号、１８８
ページ）。その耐性程度は、海水の約半分の塩濃度（25
0mM NaCl）溶液を灌水しても生育が可能な程である。こ
れまでに国内外で行われてきた、いわゆる耐塩性植物に
ついての研究から、耐塩性植物を、非ストレス条件から
塩ストレス条件に移すと新たな遺伝子の発現が誘発さ
れ、これらの遺伝子の産物が塩ストレス耐性に役立って
いることが知られている。

【０００５】Nicotiana属植物から塩ストレス耐性遺伝
子を単離したという報告も存在する（Nelson et al. (1
992) Plant Molecular Biology, vol. 19, 577-588, Yu
n etal. (1996) Plant Physiology, vol. 111, 1219-12
25）が、これらの報告はNicotiana属植物におけるINPS
遺伝子の存在に関するものではなく、INPS遺伝子を単離
したという報告はなかった。

【０００６】従来から、植物にはINPS遺伝子が存在する
ことが知られている。INPS（イノシトール-１-リン酸合
成酵素（Inositol monophosphate synthase））は、グ
ルコース-6-リン酸（D-glucose 6-phosphate）からイノ
シトール-１-リン酸（1L-myo-inositol 1-phosphate）
を合成するという作用を有するものである。上記INPS遺
伝子は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、マ
ツバギク（Mesembryanthemum crystallinum）等が知ら
れており、Ishitaniらの報告（Ishitani et al.(1996)
Plant Journal, vol.9, 537-548）には塩生植物のマツ
バギクにおいて、塩ストレスによりINPS遺伝子が誘導さ
れる旨の記載がある。一方、非塩生植物のシロイヌナズ
ナでは誘導されない。マツバギクではINPSにより合成さ
れるイノシトールは、ピニトール合成系を介して最終的
にピニトールという適合溶質として機能する糖アルコー
ルになる。しかしながら、マツバギクには存在するINPS
より下流にあるピニトール合成系がシロイヌナズナでは
欠如しており、イノシトールからピニトールが産生され
ないことから、INPS自体が塩ストレスに誘導されないと
考えられる。この報告に基づいて、今回Nicotiana pani
culataで観察された現象をみると、後述のごとく塩スト
レスによりINPSが産生されることより、 Nicotiana pan
iculataではINPSが塩ストレス耐性に役立っている可能
性が強いと考えられる。 Nicotiana paniculataにおい
ても、INPSより下流にあるピニトール合成系は欠如して
いると考えられているため、イノシトールの生産量を増
加させることで、塩ストレスに対する耐性を改良するこ
とができると思われる。しかしながら、Nicotiana属植
物に関してはINPS遺伝子は、知られておらず、また単離
もされていなかった。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】上述したように、塩ス
トレスに対して耐性を有する植物を見い出すことは緊急
の課題であるが、このような塩ストレス耐性を有する植
物を得る方法として、遺伝子操作等により植物の水分含
量をコントロールすることによる方法がある。一般的に
は、植物体の水分含量を増加させる、すなわち、水分保
持能力を増加させることにより水分ストレス耐性を有す
る植物を得ることができると考えられている。従って、
本発明は塩ストレスに対して耐性を有する遺伝子を見い
出すことを課題とする。更に詳しくは、遺伝子操作等に
より本発明は塩ストレスに対して耐性を有する遺伝子を
見い出し、それを用いて植物の水分ストレス耐性を改良
することを課題とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本願発明者らは、Nicoti
ana属植物のうち、塩ストレス耐性種であるNicotianapa
niculataから、塩ストレスにより誘導される新規なINPS
遺伝子を見い出し、その遺伝子を単離した。上記の事実
から、今回得られた遺伝子がコードするINPS遺伝子は、
植物に水分ストレス耐性を付与する機能があると考えら
れる。そこで、この遺伝子の発現を制御することによ
り、植物の塩ストレス耐性を改良する事ができる。さら
に、栽培植物は常に水分ストレスを受けるおそれにさら
されているため、植物のストレス状況をすばやく関知す
ることは、その後の対策のために有用である。そこで、
当遺伝子の発現状況をモニターする事により、植物にか
かるストレス状況を知ることができる。

【０００９】本発明は、上記事情に鑑みてなされたもの
で、植物由来の塩ストレス耐性の遺伝子を植物に導入し
て、当該植物の水分含量を調節する方法を提案し、これ
により塩ストレス耐性植物を得ることを目的としてなさ
れたものである。

【００１０】より具体的には、本発明は、 （１） Nicotiana属植物由来であるINPS遺伝子。 （２） 配列番号：１記載のDNA配列又は該配列におい
て１又は数個のDNAが置換、欠失、挿入又は付加され、
かつ実質的にINPS活性を有するタンパクをコードするDN
A。 （３） 配列番号：１記載のDNA配列。

【００１１】ここで、「塩ストレス」とは、土壌中の塩
化ナトリム濃度が上昇し、植物の生育にとって不利とな
ることを意味する。「塩ストレス耐性」とは、上記塩ス
トレスに対する抵抗性を意味する。「実質的にINPS活性
を有する」とは、塩ストレスに対し実質的にINPS活性を
有する意味である。

【００１２】以下、本発明についてさらに詳しく説明す
る。本発明は、植物の水分含量をコントロールするため
に植物にNicotiana属由来のINPS遺伝子を導入すること
を特徴とするものである。まず、植物を塩ストレス環境
下にさらし、その環境下において新たに産生した遺伝子
を取り出し、配列を解析することにより本発明遺伝子を
導き出した。本発明に用いられるNicotiana属由来のINP
S遺伝子は、植物体にセンス方向に導入されてもよく、
またアンチセンス方向に導入されてもよい。本発明にお
いては、水分ストレス条件下において植物の水分保持能
力を増大させる目的の場合は、センス方向に導入するこ
とが好ましいが、ストレスの性質によっては植物の代謝
変化を抑えることにより、影響を低減できる場合もあ
り、このような場合は、アンチセンス方向に導入するこ
とが好ましい。

【００１３】一方、アンチセンス方向に導入する場合
は、形質転換植物を作出しようとする種と導入する遺伝
子の由来の種とが近縁であるほど好ましく、特に好まし
くは同種のものである。なお、アンチセンス方向に導入
する場合は必ずしも全体を導入する必要はなく、一部を
用いた場合でも十分な効果が示される場合もある。した
がって、本発明において遺伝子をアンチセンス方向に導
入する場合は、少なくともその一部が導入することを必
要とするものである。本発明に用いられる発現プロモー
ターとしては、転写力が強く全細胞で発現されるもの
（３５S、１９S、nosなど）、光に反応するもの（rbcな
ど）、温度に反応するもの（hspなど）、ホルモンに反
応するもの、そして組織特異的に反応するもの等、従来
より知られているものであれば特に限定されないが、特
に好ましくは３５Sプロモーターなどの強力なものが挙
げられる。

【００１４】本発明において、センス方向もしくはアン
チセンス方向のINPS遺伝子を形質転換する植物に導入す
る方法としては、特別な方法を用いる必要はなく、通常
植物を形質転換する際に用いられる方法であれば如何な
る方法も用いることができる。例えば、遺伝子銃を用い
た形質転換方法、エレクトロポレーション法、アグロバ
クテリウム属菌を用いたリーフディスク法等が挙げられ
るが、好ましくはアグロバクテリウム属菌を用いたリー
フディスク法を用いる場合であり、以下これについて説
明する。

【００１５】センス方向もしくはアンチセンス方向のIN
PS遺伝子を適当な植物発現ベクターに挿入し、このベク
ターをアグロバクテリウム属菌に導入する。次に、形質
転換しようとする植物の無菌葉から採取したリーフディ
スクを、前記のアグロバクテリウム菌の培養液に浸漬し
た後、カルスを形成させ、形質転換が生じたもののみを
選抜することにより形質転換植物を得ることができる。

【００１６】アグロバクテリウム菌への形質転換を行う
に際して、必要に応じて別の宿主を形質転換させ、後に
アグロバクテリウム菌に所望のベクターを導入させるこ
ともできる。前記の別の宿主として例えば、細菌（エシ
ェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセ
ス属、ピキア属など）、動物細胞、昆虫細胞など、好ま
しくは大腸菌（DH5，HB101等）が例示されるが、これら
に限定されるものではない。

【００１７】INPS遺伝子を導入した宿主を検出するに
は、レポーター遺伝子を導入したベクターを宿主細胞
（アグロバクテリウム菌）に導入することにより達成さ
れる。レポーター遺伝子をプラスミドベクター、ファー
ジベクター、レトロウイルスベクター等のベクターに導
入し、細胞を形質転換して、あるいはインビトロパッケ
ージング後、宿主細胞に形質移入（トランスフェクト）
することによりレポーター遺伝子を安定に保持した形質
転換細胞を作製する。

【００１８】ここで用いられるプラスミドベクターとし
ては、宿主細胞内で複製保持されるものであれば特に制
限されず、また用いられるファージベクターとしても宿
主細胞内で増殖できるものであればよい。常法的に用い
られるベクターとしてpUC119、λgt10、λgt11、pBlues
cript、λZAP II、λZAP XR等が例示される。

【００１９】プラスミドにcDNAを組み込む方法として
は、例えば、「Maniatis,T.ら,モレキュラークローニン
グ，ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Clonin
g,A Laboratory Manual, second edition）、Cold Spri
ng Harbor Laboratory, 1.53(1989)」に記載の方法など
が挙げられる。また、ファージベクターにcDNAを組み込
む方法としては、Hyunh,T.V.らの方法（Hyunh,T.V.,DNA
Cloning,a practical approach,1,49(1985)）などが挙
げられる。簡便には、市販のライゲーションキット（例
えば、宝酒造製等）を用いることもできる。このように
して得られる組換えプラスミドやファージベクターは、
原核細胞（例えば、E.coli HB101，DH5またはMC1061/P3
等）及び／または真核細胞（J774.1、PU5-1.8、RAW264.
7、ST2）の各種の適当な宿主細胞に導入する。

【００２０】プラスミドを宿主細胞に導入する方法とし
ては、「Maniatis,T.ら,モレキュラークローニング，ア
・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning,A La
boratory Manual, second edition）,Cold Spring Harb
or Laboratory, 1.74(1989)」に記載の塩化カルシウム
法または塩化カルシウム／塩化ルビジウム法、エレクト
ロポレーション法、エレクトロインジェクション法、PE
Gなどの化学的な処理による方法、遺伝子銃などを用い
る方法などが挙げられる。また、ファージベクターを宿
主細胞に導入する方法としてはファージDNAをインビト
ロパッケージングした後、増殖させた宿主細胞に導入す
る方法等が例示される。インビトロパッケージングは、
市販のインビトロパッケージングキット（例えば、スト
ラタジーン社製、アマシャム社製等）を用いることによ
って簡便に行うことができる。

【００２１】ベクターは、簡便には当業界において入手
可能な組換え用ベクター（プラスミドDNAおよびバクテ
リアファージDNA）に所望の遺伝子を常法により連結す
ることによって調製することができる。用いられるベク
ターとしては、具体的には、大腸菌由来のプラスミドと
して、例えば、pBR322、pBR325、pUC12、pUC13などが、
酵母由来プラスミドとして、例えば、pSH19、pSH15など
が、枯草菌由来プラスミドとして、例えば、pUB110、pT
P5、pC194などが例示されるがこれらに制限されない。
また、ファージとしてはλファージなどのバクテリオフ
ァージが、さらにレトロウイルス、ワクシニヤウイル
ス、核多角体ウイルスなどの動物や昆虫のウイルス[pVL
1393（インビトロゲン社製）]などが例示されるがこれ
らに制限されない。

【００２２】所望のタンパク質を生産する目的において
は、特に、発現ベクターが有用である。発現ベクターと
しては、原核細胞および／または真核細胞の各種の宿主
細胞中で所望の遺伝子を発現し、所望のタンパク質を生
産する機能を有するものであれば特に制限はないが、例
えば、大腸菌（pGEX-5X-1）、またはSV-40由来の発現ベ
クターなどが好ましい。

【００２３】アグロバクテリウム菌へ形質転換する前の
宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、一般に
発現ベクターは少なくとも、プロモーター−オペレータ
ー領域、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドンおよび
複製可能単位から構成される。宿主細胞としてアグロバ
クテリウム菌を用いる場合には、一般に発現ベクターは
少なくとも、プロモーター、開始コドン、所望の遺伝
子、終止コドンを含んでいることが好ましい。またシグ
ナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、所
望遺伝子の5’側および3’側の非翻訳領域、スプライシ
ング接合部、ポリアデニレーション部位、選択マーカー
領域または複製可能単位などを適宜含んでいてもよい。
また、目的に応じて通常用いられる遺伝子増幅遺伝子
（マーカー）を含んでいてもよい。

【００２４】本発明の遺伝子に使用するベクターにおい
て、好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（AT
G）が例示される。また、終止コドンとしては、常用の
終止コドン（例えば、TAG，TGAなど）が例示される。

【００２５】複製可能単位とは、宿主細胞中でその全DN
A配列を複製することができる能力をもつDNAをいい、天
然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（天然
のプラスミドから調製されたDNAフラグメント）および
合成プラスミド等が含まれる。好適なプラスミドとして
は、E．coliではプラスミドpBR322、もしくはその人工
的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られる
DNAフラグメント）が、酵母では酵母2μプラスミド、も
しくは酵母染色体DNAが、また哺乳動物細胞ではプラス
ミドpRSVneo ATCC 37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC 37
145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224、プラスミド
pSV2neo ATCC 37149、プラスミドpME18S等があげられ
る。

【００２６】エンハンサー配列、ポリアデニレーション
部位およびスプライシング接合部位については、例え
ば、それぞれSV40に由来するもの等、当業者において通
常使用されるものを用いることができる。遺伝子増幅遺
伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝
子、チミジンキナーゼ遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝
子、グルタミン酸合成酵素遺伝子、アデノシンデアミナ
ーゼ遺伝子、オルニチンデカルボキシラーゼ遺伝子、ヒ
グロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子、
アスパルラートトランスカルバミラーゼ遺伝子等を例示
することができる。

【００２７】発現ベクターは、少なくとも、上述のプロ
モーター、開始コドン、所望の遺伝子、終止コドン、お
よびターミネーター領域を連続的かつ環状に適当な複製
可能単位に連結することによって調製することができ
る。またこの際、所望により制限酵素での消化やT4DNA
リガーゼを用いるライゲーション等の常法により適当な
DNAフラグメント（例えば、リンカー、他のレストリク
ションサイトなど）を用いることができる。

【００２８】また、形質転換植物の選抜は、カルス形成
させる培地に適当な抗生物質を添加し、その耐性の有無
により行うことができる。この場合、選択マーカーとし
ては、通常使用されるものを常法により用いることがで
きる。例えばテトラサイクリン、アンピシリン、または
カナマイシンもしくはネオマイシン等の抗生物質耐性遺
伝子などが例示される。このとき、ベクターにはカリウ
ムチャンネル遺伝子の他、培地に添加された抗生物質耐
性の遺伝子を導入することが好ましい。

【００２９】上記のごとく調整した宿主細胞からの所望
タンパクの産生確認試験は、以下のように行えばよい。
つまり、上記のごとく調整した宿主細胞には、上記ベク
ターの所望遺伝子部位にレポーター遺伝子を導入し、宿
主細胞からレポーターとなるタンパクを産生させ、その
タンパクを検出すればよい。

【００３０】ここで、所望遺伝子部位に用いるレポータ
ー遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GU
S）、ルシフェラーゼ遺伝子、β-ガラクトシダーゼ、グ
リーンフルオレッセンスプロテイン（GFP）、エクオリ
ン、β-ラクタマーゼなどが挙げられる。

【００３１】なお、アグロバクテリウム菌による形質転
換方法は双子葉植物のみならず、単子葉植物にも適用す
ることができる（WO９４／００９７７号公報）。

【００３２】本発明により形質転換される植物、すなわ
ち本発明により植物体の水分含量をコントロールされる
植物としては、特に限定されるものではないが、ダイ
ズ、トウモロコシ、ジャガイモ、トマト、イネ及びタバ
コ等が挙げられる。本発明において形質転換された植物
の水分含量を測定する方法としては、種々の方法が考え
られる。その一方法としては、例えば、所定の大きさま
で育成した植物を人工気象機等によりストレス環境下で
一定期間育成する。そして、植物体地上部を収穫し生重
量を測定し、さらにこれらの植物を６０℃で数日間乾燥
させた後に乾燥重量を測定する。この生重量と乾燥重量
の比により水分含量を測定する方法等が挙げられる。

【００３３】

【実施例】[実施例１] ＜植物材料の生育＞ Nicotiana paniculataは、温室内で培養土に播種し発芽
させた。本葉４枚程度まで生育した時点で、バーミキュ
ライトとハイドロボールの混合物（体積比１：１）を詰
めた、直径約１０ｃｍの黒色ビニールポットに移植し
た。その後は、人工気象機内に移し（１２時間日長、摂
氏２３℃、相対湿度７０％）、１日あたり１００ｍＬの
１／４希釈ホーグランド溶液を灌水した。塩ストレス処
理区植物には、２５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む１／４
希釈ホーグランド溶液を１日１００ｍＬ灌水した。

【００３４】[実施例２] ＜mRNA の抽出＞ Nicotiana paniculata緑葉組織からの全RNA抽出はOstre
mらの方法（Ostrem etal., Plant Physiology 84,1270-
1275(1987)）に従って行ったが、実施にあたり以下の点
を改良した。 １）磨砕した植物体を抽出用緩衝液とフェノールと共に
行なう振盪を氷上で１時間行った。 ２）遠心後の上清をクロロホルムと共に行う振盪を氷上
で行った。poly(A)＋-RNAの精製はQuickPrep mRNA puri
fication Kit（Pharmacia社製）を使用し、製造者の手
引き書に従って行った。

【００３５】[実施例３] ＜ Nicotiana paniculata IN
PS cDNAの単離＞ ストレスをかけたNicotiana paniculata緑葉cDNAライブ
ラリーの作製は、実施例２でストレス処理をした植物か
ら抽出、精製したpoly(A)＋RNAを鋳型として、ZAP-cDNA
Synthesis Kit（Stratagene社製）、クローニングベク
ターにはUni-ZAP XR（Stratagene社製）を使用して行っ
た。 宿主細胞として XLI-Blueを使用した。cDNAライブ
ラリーのスクリーニングは、ディファレンシャルスクリ
ーニング法により行った。以下にその詳細な手順を述べ
る。

【００３６】スクリーニングを行うための溶菌プラーク
は、Stratagene社の手引き書に従って行った。プラーク
が出現した寒天培地からのプラークリフトはナイロン膜
のHybond N＋(Amersham 社製）を用いた。一枚の寒天培
地から２回ずつプラークリフトを行った。こうして作製
したスクリーニング用ナイロン膜の変性は、Amersham社
の手引き書に従って行った。スクリーニングに用いた32
P標識プローブは以下のようにして作製した。実施例２
で得たpoly(A)＋RNA 50-100ngを30μlの滅菌水に溶解し
て、プライマー（宝酒造）1μlを加え、65℃で１０分間
置いた。その後室温まで冷却し、そこにRNse阻害剤を1
μl、MMLV逆転写酵素添付の５Ｘ緩衝液（宝酒造）を5μ
l、dATP・dGTP・dTTP溶液（各10mM）を5μl 、32P-dCTP
（Amersham 社）を1μl（10μCi）、蒸留水を6μl加
え、よく混合した後に、 MMLV逆転写酵素（宝酒造）を1
μl加えた。この反応液を３７℃で１時間反応させた後
にスピンカラムを用いて、遊離の32P-dCTPを除いた。プ
ローブは、ストレス処理した植物と、ストレス処理して
いないコントロール植物から調製したpoly(A)＋RNAにつ
いて、それぞれ作製した。２組作製したナイロン膜のう
ち１組をコントロールプローブで、もう１組をストレス
プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーションは製造者の手引き書に記載されて
いる標準的な条件で16時間行なった。洗浄は、300 mM N
aCl、30 mM trisodium citrate、0.1% SDSを用いて65
℃で20分間2回行い、続いて75 mM NaCl、7.5 mM trisod
ium citrate、0.1% SDSを用いて65 ℃で20分間 2回行っ
た。コントロール区とストレス処理区の結果を比較し、
ストレス処理区で強いシグナルを示す陽性クローンを得
た。得られたクローンに含まれる挿入cDNA断片は、Stra
tagene社の手引き書に従って行って、pBluescriptプラ
スミドにサブクローニングした。

【００３７】得られた陽性クローンの塩基配列決定は、
DNAシーケンサーModel 373A（アプライドバイオシステ
ムズ社製）を用いて、反応にはTaq Dye Terminator Cyc
le Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ社
製）を使い、製造者の手引き書に従って行った。得られ
た塩基配列の解析は、GENETYX-MAC ver.8（ソフトウェ
ア開発）により行った。その結果、配列表１に示すcDN
A、NpINPS1を得た。

【００３８】[実施例４] ＜塩ストレスによるINPS 転
写産物蓄積量変化の解析＞ 実施例１に述べた方法で塩ストレス処理したN. panicul
ataから、経時的に全RNAを抽出、精製してRNAゲルブロ
ット法により該当遺伝子の発現を調べた。全RNAの抽出
は実施例２に述べた手法を用い、ストレス処理開始後０
時間、８時間、１日、３日目に行った。抽出した全RNA
をLiCl処理により精製した後、バーノンらの方法に従っ
てホルムアルデヒドゲルにより電気泳動を行った（Vern
on and Bohnert, EMBO Journal 11: 2077-2085(199
2)）。RNAは１レーンあたり５μg用いた。電気泳動後、
RNAをナイロン膜（HybondN+、Amersham社製）に転写
し、製造者の手引き書に従ってハイブリダイゼーション
を行った。32P-dCTPで標識したプローブは、RediprimeT
M DNA labelling system（Amersham社製）を用いて、製
造者の手引き書に従って行った。反応終了後、遊離の32
P-dCTPをスピンカラムを用いて取り除き、ハイブリダイ
ゼーションに使用した。ハイブリダイゼーション溶液に
は、0.25ＭNa2HPO4 (pH 7.2)、7% SDSを含む溶液を用い
て、65℃で終夜行った。ハイブリダーイゼーション終了
後の洗浄は、300 mM NaCl、30 mM trisodium citrate、
0.1% SDSを用いて65 ℃で20分間2回行い、続いて75 mM
NaCl、7.5 mM trisodium citrate、0.1% SDSを用いて65
℃で20分間 2回行った。洗浄後、ナイロン膜を乾燥さ
せ、イメージングプレート（富士写真フィルム株式会
社）に密着させて感光した。その後、そのイメージング
プレートをバイオイメージアナライザーBAS100（富士写
真フィルム株式会社）により解析して、ナイロン膜に残
る放射線エネルギーの分布を画像化させた。その結果、
図１に示すような発現パターンを得た。

【００３９】図１においてRNA産生量が多い程黒く写る
ことから、１日目及び３日目のコントロール及びストレ
スを比較するとコントロールよりもストレス状況下の方
がRNA産生量が多いことがわかる。RNA産生量が多いとい
うことは、即ち遺伝子産物産生量が多いということを意
味する。

【００４０】

【発明の効果】上記の事実から、今回得られた遺伝子が
コードするINPSは、植物に水分ストレス耐性を付与する
機能があると考えられる。そこで、この遺伝子の発現を
制御することにより、植物の塩ストレス耐性を改良する
事ができる。さらに、栽培植物は常に水分ストレスを受
けるおそれにさらされているため、植物のストレス状況
をすばやく関知することは、その後の対策のために有用
である。そこで、当遺伝子の発現状況をモニターする事
により、植物にかかるストレス状況を知ることができ
る。

【００４１】

【配列表】

【００４２】配列番号：１ 配列の長さ：1950 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：Nicotiana paniculata 性質：INPSのcDNA （NpINPS1） 配列の特徴 92-1703 CDS 1 CTTAGCCTTAAAGTATACTCATAGCGTGTTCTTCTCTTTGTTTGTTACAAAACCTCTTTC 60 61 CCCTTCGATACTTTAGAAAAGTTTCCTCAAAATGTTTATTGAGAATTTTAAGGTTGAGAG 120 MetPheIleGluAsnPheLysValGluSer 121 CCCCAACGTTAAGTACACCGAAAGTGAAATTCACTCTGTCTATGATTATCAAACCACTGA 180 ProAsnValLysTyrThrGluSerGluIleHisSerValTyrAspTyrGlnThrThrGlu 181 GTTAGTTCATGATGAGAAAAATGGGACATATCAATGGACCGTCAAGCCTAAGACTGTCAA 240 LeuValHisAspGluLysAsnGlyThrTyrGlnTrpThrValLysProLysThrValLys 241 ATATGAGTTCAAGACTGATGTTCATGTTCCCAAATTAGGGGTTATGCTTGTTGGATGGGG 300 TyrGluPheLysThrAspValHisValProLysLeuGlyValMetLeuValGlyTrpGly 301 TGGAAACAATGGTTCAACCTTGACCGGTGGTGTTATTGCTAACAGAGAAGGAATTTCATG 360 GlyAsnAsnGlySerThrLeuThrGlyGlyValIleAlaAsnArgGluGlyIleSerTrp 361 GGCCACCAAAGATAAGGTGCAACAAGCCAATTACTTTGGCTCTCTTACTCAGGCTTCTAC 420 AlaThrLysAspLysValGlnGlnAlaAsnTyrPheGlySerLeuThrGlnAlaSerThr 421 TATTCGAGTTGGGTCTTTCAATGGAGAAGAGATCTATGCTCCATTTAAAAGCCTCCTTCC 480 IleArgValGlySerPheAsnGlyGluGluIleTyrAlaProPheLysSerLeuLeuPro 481 AATGGTCAATCCAGATGACGTAGTGTTTGGAGGATGGGACATCAGCGACATGAATTTAGC 540 MetValAsnProAspAspValValPheGlyGlyTrpAspIleSerAspMetAsnLeuAla 541 AGATGCCATGGCCAGGGCTAAGGTATTTGATATTGATCTACAAAAGCAGTTGAgGCCCTA 600 AspAlaMetAlaArgAlaLysValPheAspIleAspLeuGlnLysGlnLeuArgProTyr 601 CATGGAATCTATGGTCCCACTCCCTGGTATCTATGACCCTGATTTCATTGCTGCTAACCA 660 MetGluSerMetValProLeuProGlyIleTyrAspProAspPheIleAlaAlaAsnGln 661 AGGGTCACGTGCCAACAACGTGATCAAAGGAACCAAGAAAGAACAAATTGATCAAATCAT 720 GlySerArgAlaAsnAsnValIleLysGlyThrLysLysGluGlnIleAspGlnIleIle 721 TAAGGATATTAGGGAGTTTAAGGAAAAGAACAAAGTGGACAAGGTGGTAGTATTGTGGAC 780 LysAspIleArgGluPheLysGluLysAsnLysValAspLysValValValLeuTrpThr 781 TGCTAACACTGAAAGATACAGTAATGTGGTTGTTGGACTTAATGACACTATGGAAAACCT 840 AlaAsnThrGluArgTyrSerAsnValValValGlyLeuAsnAspThrMetGluAsnLeu 841 CTTTGCTTCTGTGGACAGAAATGAAGCTGAAATATCTCCTTCCACTTTGTATGCTATTGC 900 PheAlaSerValAspArgAsnGluAlaGluIleSerProSerThrLeuTyrAlaIleAla 901 CTGCATTCTTGAAAATGTGCCTTTTATTAATGGAAGCCCCCAGAACACCTTTGTCCCAGG 960 CysIleLeuGluAsnValProPheIleAsnGlySerProGlnAsnThrPheValProGly 961 CCTCATTGATTTGGCCATCAAGAAGAACACATTGATTGGTGGTGATGACTTTAAGAGTGG 1020 LeuIleAspLeuAlaIleLysLysAsnThrLeuIleGlyGlyAspAspPheLysSerGly 1021 TCAAACCAAAATGAAGTCAGTGCTGGTTGATTTCCTTGTTGGAGCTGGTATTAAGCCAAC 1080 GlnThrLysMetLysSerValLeuValAspPheLeuValGlyAlaGlyIleLysProThr 1081 ATCAATTGTGAGCTACAACCATTTGGGTAACAATGATGGAATGAATCTGTCTGCCCcTCA 1140 SerIleValSerTyrAsnHisLeuGlyAsnAsnAspGlyMetAsnLeuSerAlaProGln 1141 AACTTTCCGGTCAAAGGAGATCTCGAAAAGTAATGTTGTTGATGACATGGTTTCAAGCAA 1200 ThrPheArgSerLysGluIleSerLysSerAsnValValAspAspMetValSerSerAsn 1201 TGCCATCCTTTATGAGCCTGGAGAGCACCCTGACCATGTTGTTGTGATTAAGTATGTGCC 1260 AlaIleLeuTyrGluProGlyGluHisProAspHisValValValIleLysTyrValPro 1261 ATATGTGGGAGACAGCAAGAgGGCAATGGATGAGTACACATCTGAGATTTTCATGGGGGG 1320 TyrValGlyAspSerLysArgAlaMetAspGluTyrThrSerGluIlePheMetGlyGly 1321 AAAGAACACCATTGTTTTGCACAATACTTGTGAgGATTCACTTTTAGCTGCTCCAATTAT 1380 LysAsnThrIleValLeuHisAsnThrCysGluAspSerLeuLeuAlaAlaProIleIle 1381 ATTGGATTTGGTCCTTCTTGCTGAACTCAGTACCCGCATTCAGCTCAAAGCTGAAGGAGA 1440 LeuAspLeuValLeuLeuAlaGluLeuSerThrArgIleGlnLeuLysAlaGluGlyGlu 1441 gGGTaAGTTCCACTCCTTCCACCCCGTGGcTACTATCcTCAGCTACCTTACCAAgGcTCc 1500 GlyLysPheHisSerPheHisProValAlaThrIleLeuSerTyrLeuThrLysAlaPro 1501 TCTGGTACCACCAGGTACACCAGTGGTGAATGCACTCTCAAAGCAGAGGGCAATGCTTGA 1560 LeuValProProGlyThrProValValAsnAlaLeuSerLysGlnArgAlaMetLeuGlu 1561 GAACATATTGAGGGCTTGTGTTGGACTTGCACCAGAGAACAACATGATTCTGGAATACAA 1620 AsnIleLeuArgAlaCysValGlyLeuAlaProGluAsnAsnMetIleLeuGluTyrLys 1621 ATGAAGATCCATTTCCCTAAGAAGGGAAAGGACTCAAGAAGCTGTACGGCAGAAGAACCA 1680 ***ArgSerIleSerLeuArgArgGluArgThrGlnGluAlaValArgGlnLysAsnHis 1681 TAATGGTCTTTCTTTTCTTTAGTATTTGTAATCTTCATCTTTCATTAGTACTATGATTAG 1740 AsnGlyLeuSerPheLeu*** 1741 CTAAATGTCGGCAACCCTTCGAGGTATAGCTGTTTTGTAATGGCAGGCCAAGTTGAATGT 1800 1801 CATTATAATTTCTTTGTTGTCTTTGTATGTTAGCCTTCTATTTACAAGGTTGTATCCGTG 1860 1861 TTGCTCTTTCTCATTTAGAGCTAGCAACGCTTTTCTCTAATGGAAATACAATGTGTAGTC 1920 1921 CTTTAGACGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1950

【００４３】

【図面の簡単な説明】

【図１】INPS遺伝子のRNAゲルブロット解析を行った図
である。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Nicotiana属植物由来であるINPS遺伝
   子。
2. 【請求項２】 配列番号：１記載のDNA配列又は該配列
   において１又は数個のDNAが置換、欠失、挿入又は付加
   され、かつ実質的にINPS活性を有するタンパクをコード
   するDNA。
3. 【請求項３】 配列番号：１記載のDNA配列。