JPH11187870A - 新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法 - Google Patents
新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法Info
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- JPH11187870A JPH11187870A JP9366651A JP36665197A JPH11187870A JP H11187870 A JPH11187870 A JP H11187870A JP 9366651 A JP9366651 A JP 9366651A JP 36665197 A JP36665197 A JP 36665197A JP H11187870 A JPH11187870 A JP H11187870A
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】 クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxy
toca)菌体から得ることができ、トランス−4−ヒドロ
キシケイ皮酸を基質とするトランス−4−ヒドロキシケ
イ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素を用いた重水素化
を提供する。 【解決手段】 本発明は、クレブシエラ オキシトカ
(Klebsiella oxytoca)菌体から得ることができ、トラ
ンス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするトランス−
4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素
を用いた重水素化方法等に関する。
toca)菌体から得ることができ、トランス−4−ヒドロ
キシケイ皮酸を基質とするトランス−4−ヒドロキシケ
イ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素を用いた重水素化
を提供する。 【解決手段】 本発明は、クレブシエラ オキシトカ
(Klebsiella oxytoca)菌体から得ることができ、トラ
ンス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするトランス−
4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、脱炭酸酵素
を用いた重水素化方法等に関する。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、クレブシエラ オ
キシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体から得ることがで
き、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素に関する。
また、本発明は、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体を、4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシ
ラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させることによ
る、重水素化4−ヒドロキシスチレン又はその誘導体の
位置選択的な重水素化方法に関する。本発明の方法によ
れば、高収率、高選択率で目的とする重水素化物を製造
することができる。
キシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体から得ることがで
き、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とするト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素に関する。
また、本発明は、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体を、4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシ
ラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させることによ
る、重水素化4−ヒドロキシスチレン又はその誘導体の
位置選択的な重水素化方法に関する。本発明の方法によ
れば、高収率、高選択率で目的とする重水素化物を製造
することができる。
【0002】
【従来の技術】幾つかの有機酸の非酸化的酵素反応によ
る脱炭酸反応が知られている。これらの非酸化的酵素反
応による脱炭酸反応は、基質の構造や性状によってグル
ープ分けをすることが可能である。最も大きなグループ
のひとつであるアミノ酸脱炭酸酵素は、アミノ化炭素原
子に結合するカルボキシル基を脱炭酸し、脂肪族アミン
類を生成する(例えば、グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ)。また、安息香酸脱炭酸酵素は、ベンゼン環上のカ
ルボキシル基を脱炭酸し、それを水素原子に置換する
(例えば、没食子酸デカルボキシラーゼ)。
る脱炭酸反応が知られている。これらの非酸化的酵素反
応による脱炭酸反応は、基質の構造や性状によってグル
ープ分けをすることが可能である。最も大きなグループ
のひとつであるアミノ酸脱炭酸酵素は、アミノ化炭素原
子に結合するカルボキシル基を脱炭酸し、脂肪族アミン
類を生成する(例えば、グルタミン酸デカルボキシラー
ゼ)。また、安息香酸脱炭酸酵素は、ベンゼン環上のカ
ルボキシル基を脱炭酸し、それを水素原子に置換する
(例えば、没食子酸デカルボキシラーゼ)。
【0003】一方、4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキ
シラーゼ(4−HCD)は、α,β−不飽和カルボン酸
をもつケイ皮酸類を脱炭酸してビニル基を持つスチレン
化合物を生成させることから、これらとは別のグループ
に分けられる。本発明者らは、クレブシエラ オキシト
カ(Klebsiella oxytoca)という植物着生細菌(エンテ
ロバクター科)が4−HCD活性を有していることを報
告してきた(橋床ら、「ジェイ、バイオサイ、バイオテ
ク、バイオケム」第57巻、第215頁、1993年
(Hashidoko,Y, et al.,J.Biosci.Biotech.Biochem.,(1
993),57,215))。しかし、当該植物着生細菌から、4
−HCDを単離するには至らなかった。
シラーゼ(4−HCD)は、α,β−不飽和カルボン酸
をもつケイ皮酸類を脱炭酸してビニル基を持つスチレン
化合物を生成させることから、これらとは別のグループ
に分けられる。本発明者らは、クレブシエラ オキシト
カ(Klebsiella oxytoca)という植物着生細菌(エンテ
ロバクター科)が4−HCD活性を有していることを報
告してきた(橋床ら、「ジェイ、バイオサイ、バイオテ
ク、バイオケム」第57巻、第215頁、1993年
(Hashidoko,Y, et al.,J.Biosci.Biotech.Biochem.,(1
993),57,215))。しかし、当該植物着生細菌から、4
−HCDを単離するには至らなかった。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、さらに
研究を進め、このクレブシエラ オキシトカ(Klebsiel
la oxytoca)中の酵素を初めて単離し、この酵素の特性
及び活性を確認したところ、この酵素が新規な4−HC
Dの一種であることを見出した。そして、この新規な酵
素が特異的にトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸類を脱
炭酸することを見出し、かつ、当該酵素反応においては
カルボキシル基の開裂反応時の水素導入に際して、高度
な幾何選択性があることを見出した。さらに、本発明者
らは、この酵素的脱炭酸反応においては、α位の炭素原
子に導入される水素は酵素タンパクのアミノ酸残基上の
交換性プロトン(H+) に由来するとされているので、
重水を含有する緩衝液中で反応を行うことにより、生成
するスチレンのC−8炭素原子へ重水素を幾何選択的に
導入することができることを見出した。
研究を進め、このクレブシエラ オキシトカ(Klebsiel
la oxytoca)中の酵素を初めて単離し、この酵素の特性
及び活性を確認したところ、この酵素が新規な4−HC
Dの一種であることを見出した。そして、この新規な酵
素が特異的にトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸類を脱
炭酸することを見出し、かつ、当該酵素反応においては
カルボキシル基の開裂反応時の水素導入に際して、高度
な幾何選択性があることを見出した。さらに、本発明者
らは、この酵素的脱炭酸反応においては、α位の炭素原
子に導入される水素は酵素タンパクのアミノ酸残基上の
交換性プロトン(H+) に由来するとされているので、
重水を含有する緩衝液中で反応を行うことにより、生成
するスチレンのC−8炭素原子へ重水素を幾何選択的に
導入することができることを見出した。
【0005】即ち、本発明は、クレブシエラ オキシト
カ(Klebsiella oxytoca)菌体由来のトランス−4−ヒ
ドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス−4−ヒ
ドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素を提供するものであり、ま
た、本発明は、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体を用いて、重水を含有する反応溶媒中で脱炭
酸反応を行うことにより、対応する4−ヒドロキシスチ
レン又はその誘導体のビニル位のトランス位(E配置)
が位置選択的に重水素化された化合物及びその製造方法
を提供するものである。
カ(Klebsiella oxytoca)菌体由来のトランス−4−ヒ
ドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス−4−ヒ
ドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素を提供するものであり、ま
た、本発明は、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体を用いて、重水を含有する反応溶媒中で脱炭
酸反応を行うことにより、対応する4−ヒドロキシスチ
レン又はその誘導体のビニル位のトランス位(E配置)
が位置選択的に重水素化された化合物及びその製造方法
を提供するものである。
【0006】
【課題を解決するための手段】本発明は、クレブシエラ
オキシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体から得ること
ができ、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とす
る新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素
に関する。また、本発明は、トランス−4−ヒドロキシ
ケイ皮酸又はその誘導体を、4−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させ
ることによる重水素化−4−ヒドロキシスチレン又はそ
の誘導体のビニル位を位置選択的に重水素化する方法に
関する。さらに、本発明は次式(II)
オキシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体から得ること
ができ、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とす
る新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素
に関する。また、本発明は、トランス−4−ヒドロキシ
ケイ皮酸又はその誘導体を、4−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させ
ることによる重水素化−4−ヒドロキシスチレン又はそ
の誘導体のビニル位を位置選択的に重水素化する方法に
関する。さらに、本発明は次式(II)
【0007】
【化3】
【0008】(式中、Dは重水素原子を示し、Rは水
素、低級アルキル基、水酸基、又は、低級アルコキシ基
を示し、当該Rはベンゼン環上に各々独立して1〜4個
存在することができる。)で示される重水素化−4−ヒ
ドロキシスチレン類に関する。本発明の重水素化−4−
ヒドロキシスチレン類は、立体選択的に化合物を製造す
る際の製造法を確立させるための多様な試薬として有用
である。
素、低級アルキル基、水酸基、又は、低級アルコキシ基
を示し、当該Rはベンゼン環上に各々独立して1〜4個
存在することができる。)で示される重水素化−4−ヒ
ドロキシスチレン類に関する。本発明の重水素化−4−
ヒドロキシスチレン類は、立体選択的に化合物を製造す
る際の製造法を確立させるための多様な試薬として有用
である。
【0009】本発明の新規な酵素は、クレブシエラ オ
キシトカ(Klebsiella oxytoca)という植物着生細菌
(エンテロバクター科)から得ることができるものであ
る。本発明の新規な酵素は、例えば、トランス−カフェ
酸などの存在下にジャガイモ煮汁などの培地で培養した
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体
を、超音波などの手段によりこれを破砕することにより
得られる可溶化されたタンパクを、常法により、例えば
硫安などで沈殿させることにより得ることができる。
キシトカ(Klebsiella oxytoca)という植物着生細菌
(エンテロバクター科)から得ることができるものであ
る。本発明の新規な酵素は、例えば、トランス−カフェ
酸などの存在下にジャガイモ煮汁などの培地で培養した
クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella oxytoca)菌体
を、超音波などの手段によりこれを破砕することにより
得られる可溶化されたタンパクを、常法により、例えば
硫安などで沈殿させることにより得ることができる。
【0010】本発明の酵素の理化学的性質を示す。本発
明の酵素は、α,β−不飽和カルボン酸を脱炭酸する作
用を有する。本発明の酵素は、4−ヒドロキシケイ皮酸
を特異的な基質とするものである。本発明の酵素の基質
について検討した結果を図1に示す。図1には左側に本
発明の酵素の基質となる物質を示しており、右側に基質
とならない物質を示している。これらの結果は、本発明
の酵素の基質特異性を示すものである。基質となる物質
は、図1中の化合物番号1、2、3、4、5、及び、1
8として示される物質である。図1中の化合物番号6、
7、8、9、10、及び、11で示される化合物は、ベ
ンゼン環のパラ位(4位)にヒドロキシ基を有していな
いために本発明の酵素の基質にならない物質である。化
合物番号12及び13はカルボン酸基のα、β位に不飽
和結合が無く共役結合が延びていないために本発明の酵
素の基質とならないものである。
明の酵素は、α,β−不飽和カルボン酸を脱炭酸する作
用を有する。本発明の酵素は、4−ヒドロキシケイ皮酸
を特異的な基質とするものである。本発明の酵素の基質
について検討した結果を図1に示す。図1には左側に本
発明の酵素の基質となる物質を示しており、右側に基質
とならない物質を示している。これらの結果は、本発明
の酵素の基質特異性を示すものである。基質となる物質
は、図1中の化合物番号1、2、3、4、5、及び、1
8として示される物質である。図1中の化合物番号6、
7、8、9、10、及び、11で示される化合物は、ベ
ンゼン環のパラ位(4位)にヒドロキシ基を有していな
いために本発明の酵素の基質にならない物質である。化
合物番号12及び13はカルボン酸基のα、β位に不飽
和結合が無く共役結合が延びていないために本発明の酵
素の基質とならないものである。
【0011】図1中の化合物番号14及び15で示され
る化合物はシス体であり、また、化合物番号16で示さ
れる化合物は共役がさらに延びている化合物であり、不
飽和結合と反応する位置が不適合なものであるから本発
明の酵素の基質とならないものである。図1中の化合物
番号17で示される化合物は隣接する電子吸引基が存在
するために、反応に関与する部位の電子密度が不足して
おり本発明の酵素の基質とならないものである。
る化合物はシス体であり、また、化合物番号16で示さ
れる化合物は共役がさらに延びている化合物であり、不
飽和結合と反応する位置が不適合なものであるから本発
明の酵素の基質とならないものである。図1中の化合物
番号17で示される化合物は隣接する電子吸引基が存在
するために、反応に関与する部位の電子密度が不足して
おり本発明の酵素の基質とならないものである。
【0012】本発明の酵素の至適pHは、7.0付近で
あり(図9及び10参照)、安定pHとしてはpH約
6.0〜8.0である。本発明の酵素の特性と公知の4
−HCDの特性を比較すると次の表1のとおりとなる。
あり(図9及び10参照)、安定pHとしてはpH約
6.0〜8.0である。本発明の酵素の特性と公知の4
−HCDの特性を比較すると次の表1のとおりとなる。
【0013】
【表1】
【0014】表1中の、文献1は、ビー ジェー フィン
ケルら、ジャーナル バイオロ ケム、237巻、第29
26−2931頁(1962年)(B.J.Finkl
e,et al.,J.Biol,Chem.,23
7,292 6−2931(1962))、
文献2は、エイチ ジー バインら、ジャーナル ジェネ
ラル ミクロバイオロ、 95巻、第18
8−190頁(1976年)(H.G.Bayn
e,et al.,J.General Mi
crobiol., 95,188−19
0(1976))、文献3は、ティー ハラダら、キャン
ジャーナル ミクロバイオロ、22巻、
第1258−1262頁(1976年)(T.Hara
da,e t al.,Can.J.Mi
crobiol.,22,1258 −1
262(1976))、文献4は、エー アール グッディ
ーら、ジャーナル ジェネラル ミクロバイオロ、128
巻、第2615−2620頁(1982年)(A.R.
Goodey,et al.,J.General M
icr obiol.,128,2615
−2620(1982))、文献5は、アール エフ リン
ドセイら、ジャーナル アプリ バクテリアル、39巻、
第181−187頁(1975年)(R.F.Lind
say,et al.,J.Appl.Bacteri
ol.,3 9,181−187(197
5))、文献6は、ジー デグラシーら、アプリ エンバ
イロン ミクロバイオロ、61 巻、第3
26−332頁(1995年)(G.Degrass
i, et al.,Appl.Envi
ron.Microbiol., 61,
326−332(1995))、を各々示す。
ケルら、ジャーナル バイオロ ケム、237巻、第29
26−2931頁(1962年)(B.J.Finkl
e,et al.,J.Biol,Chem.,23
7,292 6−2931(1962))、
文献2は、エイチ ジー バインら、ジャーナル ジェネ
ラル ミクロバイオロ、 95巻、第18
8−190頁(1976年)(H.G.Bayn
e,et al.,J.General Mi
crobiol., 95,188−19
0(1976))、文献3は、ティー ハラダら、キャン
ジャーナル ミクロバイオロ、22巻、
第1258−1262頁(1976年)(T.Hara
da,e t al.,Can.J.Mi
crobiol.,22,1258 −1
262(1976))、文献4は、エー アール グッディ
ーら、ジャーナル ジェネラル ミクロバイオロ、128
巻、第2615−2620頁(1982年)(A.R.
Goodey,et al.,J.General M
icr obiol.,128,2615
−2620(1982))、文献5は、アール エフ リン
ドセイら、ジャーナル アプリ バクテリアル、39巻、
第181−187頁(1975年)(R.F.Lind
say,et al.,J.Appl.Bacteri
ol.,3 9,181−187(197
5))、文献6は、ジー デグラシーら、アプリ エンバ
イロン ミクロバイオロ、61 巻、第3
26−332頁(1995年)(G.Degrass
i, et al.,Appl.Envi
ron.Microbiol., 61,
326−332(1995))、を各々示す。
【0015】表1に示す酵素特性からも明らかなよう
に、本発明の酵素は文献6に記載の4−HCDと酵素の
タイプが同じであるが至適pH及びミカエリス定数にお
いて明確な相違がみられ、また基質において文献1、
2、3、5及び6のものと同じにみえても、至適pH、
ミカエリス定数において明確な相違がみられる。さらに
本発明の酵素はZ−異性体に不活性な点において公知の
4−HCDとも相違するものである。このように、本発
明の酵素は、公知の4−HCDとは作用、至適pH、及
び、ミカエリス定数を異にする新規な酵素である。
に、本発明の酵素は文献6に記載の4−HCDと酵素の
タイプが同じであるが至適pH及びミカエリス定数にお
いて明確な相違がみられ、また基質において文献1、
2、3、5及び6のものと同じにみえても、至適pH、
ミカエリス定数において明確な相違がみられる。さらに
本発明の酵素はZ−異性体に不活性な点において公知の
4−HCDとも相違するものである。このように、本発
明の酵素は、公知の4−HCDとは作用、至適pH、及
び、ミカエリス定数を異にする新規な酵素である。
【0016】図2〜10に本発明の新規な酵素の特性を
示す。図2は、本発明の酵素の基質による活性の変化を
示したものである。使用した酵素液は、1μlで1.8
×10-2単位のものを0.5μl相当とし、反応液はト
リス塩酸緩衝液(Tris−HCl)(pH7.2)5
0mlで、反応条件は25℃、30分であった。活性の
変化は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩を10
0とした相対活性度で示しており、遊離のカフェ酸が基
準とした4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩の約
1.4倍の活性を有していることがわかる。
示す。図2は、本発明の酵素の基質による活性の変化を
示したものである。使用した酵素液は、1μlで1.8
×10-2単位のものを0.5μl相当とし、反応液はト
リス塩酸緩衝液(Tris−HCl)(pH7.2)5
0mlで、反応条件は25℃、30分であった。活性の
変化は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩を10
0とした相対活性度で示しており、遊離のカフェ酸が基
準とした4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩の約
1.4倍の活性を有していることがわかる。
【0017】図3は、緩衝液系に各種の溶質を添加した
ときの、本発明の酵素の活性の変化を4−ヒドロキシケ
イ皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)を基質として用
い、トリス塩酸緩衝液(Tris−HCl)(pH7.
2)を基準とした相対活性度で示したものである。使用
した酵素液は、1μlで1.8×10-2単位のものを
0.5μlあるいは0.02μl相当とし、反応液はT
ris−HCl(pH7.2)50mlで、反応条件は
25℃、30分であった。クエン酸又はEDTA(エチ
レンジアミン四酢酸)の添加により本発明の酵素の活性
が大幅に増強されることがわかる。
ときの、本発明の酵素の活性の変化を4−ヒドロキシケ
イ皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)を基質として用
い、トリス塩酸緩衝液(Tris−HCl)(pH7.
2)を基準とした相対活性度で示したものである。使用
した酵素液は、1μlで1.8×10-2単位のものを
0.5μlあるいは0.02μl相当とし、反応液はT
ris−HCl(pH7.2)50mlで、反応条件は
25℃、30分であった。クエン酸又はEDTA(エチ
レンジアミン四酢酸)の添加により本発明の酵素の活性
が大幅に増強されることがわかる。
【0018】図4は、本発明の酵素の濃度が一定のとき
の、基質濃度と反応速度のとの関係を示したものであ
る。使用した基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニ
ウム塩(1mg/ml)であり、酵素液は、1μlで
1.8×10-2単位のものが0.02μl相当であり、
反応液はTris−HCl(pH7.2)50mlで、
反応条件は25℃、30分であった。基質濃度が0.5
mg/ml付近までは、反応速度は基質濃度にほぼ正比
例するが、それ以上の基質濃度になるとほぼ飽和状態を
示すことがわかった。本酵素のKm値はおよそ0.5m
Mである。
の、基質濃度と反応速度のとの関係を示したものであ
る。使用した基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニ
ウム塩(1mg/ml)であり、酵素液は、1μlで
1.8×10-2単位のものが0.02μl相当であり、
反応液はTris−HCl(pH7.2)50mlで、
反応条件は25℃、30分であった。基質濃度が0.5
mg/ml付近までは、反応速度は基質濃度にほぼ正比
例するが、それ以上の基質濃度になるとほぼ飽和状態を
示すことがわかった。本酵素のKm値はおよそ0.5m
Mである。
【0019】図5の(A)及び(B)は、基質濃度に対
する4−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロット
したものであり、この図からミカエリス定数(Km)が
約0.5mMであることが判る。
する4−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロット
したものであり、この図からミカエリス定数(Km)が
約0.5mMであることが判る。
【0020】図6は、本発明の酵素の量と基質の反応速
度との関係を示したものである。使用した基質は、4−
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)で
あり、酵素液は、1μlで1.8×10-2単位のもので
あり、反応液はTris−HCl(pH7.2)50m
l(黒三角印)及びクエン酸緩衝液(pH6.0)50
ml(黒丸印)で、反応条件は25℃、30分であっ
た。反応速度は酵素の量に正比例していることがわか
る。
度との関係を示したものである。使用した基質は、4−
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)で
あり、酵素液は、1μlで1.8×10-2単位のもので
あり、反応液はTris−HCl(pH7.2)50m
l(黒三角印)及びクエン酸緩衝液(pH6.0)50
ml(黒丸印)で、反応条件は25℃、30分であっ
た。反応速度は酵素の量に正比例していることがわか
る。
【0021】図7は、塩化ナトリウムの濃度が本発明の
酵素の活性に与える影響を示したものである。使用した
基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1m
g/ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×10-2
単位のものが0.25μl相当であり、反応液はTri
s−HCl(pH7.2)50mlで、反応条件は25
℃、30分であった。塩化ナトリウムの濃度が1モル付
近までは、反応速度は塩化ナトリウムの濃度の影響をあ
まり受けないが、それ以上の濃度になると塩化ナトリウ
ムの濃度の上昇に伴って反応速度が少しづつ減少する傾
向にあることがわかる。
酵素の活性に与える影響を示したものである。使用した
基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1m
g/ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×10-2
単位のものが0.25μl相当であり、反応液はTri
s−HCl(pH7.2)50mlで、反応条件は25
℃、30分であった。塩化ナトリウムの濃度が1モル付
近までは、反応速度は塩化ナトリウムの濃度の影響をあ
まり受けないが、それ以上の濃度になると塩化ナトリウ
ムの濃度の上昇に伴って反応速度が少しづつ減少する傾
向にあることがわかる。
【0022】図8は、エタノールの濃度が本発明の酵素
の活性に与える影響を示したものである。使用した基質
は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1mg/
ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×10-2単位
のものが0.5μl相当であり、反応液はTris−H
Cl(pH7.2)50mlで、反応条件は25℃、3
0分であった。反応速度はエタノールの濃度の増加によ
り急激に減少し、本発明の酵素がエタノールの影響を極
めて敏感に受けることがわかる。
の活性に与える影響を示したものである。使用した基質
は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(1mg/
ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×10-2単位
のものが0.5μl相当であり、反応液はTris−H
Cl(pH7.2)50mlで、反応条件は25℃、3
0分であった。反応速度はエタノールの濃度の増加によ
り急激に減少し、本発明の酵素がエタノールの影響を極
めて敏感に受けることがわかる。
【0023】図9は、クエン酸緩衝液(50ml)にお
ける本発明の酵素のpHの影響を示したものである。使
用した基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩
(1mg/ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×
10-2単位のものが0.02μl相当であり、反応条件
は25℃、30分であった。図10は、トリス塩酸緩衝
液(50ml)における本発明の酵素のpHの影響を示
したものである。使用した基質は、4−ヒドロキシケイ
皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)であり、酵素液
は、1μlで1.8×10-2単位のものが0.5μl相
当であり、反応条件は25℃、30分であった。図9と
図10に示したpH曲線から、本発明の酵素の至適pH
が7.2付近であることがわかった。アエロバクター
アエロゲネス(Aerobacter aerogenes)由来の公知の
4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適pHは5.7
(B.J.Finkle,et al.,J.Biol,Chem.,237,2926(196
2))、バチルス プミルス(Bacillus pumilus)由来の
公知の4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適pHは
5.5(G.Degrassi,et al.,Appl.Environ.Microbiol.,
61,326(1995))、クラドスポリウムフィレイ(Cladospo
rium phlei)由来の公知の4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭
酸酵素の至適pHは6.0であり(T.Harada, et al.,C
an. J. Microbiol., 22,1258(1976))、本発明の酵素が
公知のものと異なるものであることがこの至適pHから
も明らかとなった。
ける本発明の酵素のpHの影響を示したものである。使
用した基質は、4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩
(1mg/ml)であり、酵素液は、1μlで1.8×
10-2単位のものが0.02μl相当であり、反応条件
は25℃、30分であった。図10は、トリス塩酸緩衝
液(50ml)における本発明の酵素のpHの影響を示
したものである。使用した基質は、4−ヒドロキシケイ
皮酸アンモニウム塩(1mg/ml)であり、酵素液
は、1μlで1.8×10-2単位のものが0.5μl相
当であり、反応条件は25℃、30分であった。図9と
図10に示したpH曲線から、本発明の酵素の至適pH
が7.2付近であることがわかった。アエロバクター
アエロゲネス(Aerobacter aerogenes)由来の公知の
4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適pHは5.7
(B.J.Finkle,et al.,J.Biol,Chem.,237,2926(196
2))、バチルス プミルス(Bacillus pumilus)由来の
公知の4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素の至適pHは
5.5(G.Degrassi,et al.,Appl.Environ.Microbiol.,
61,326(1995))、クラドスポリウムフィレイ(Cladospo
rium phlei)由来の公知の4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭
酸酵素の至適pHは6.0であり(T.Harada, et al.,C
an. J. Microbiol., 22,1258(1976))、本発明の酵素が
公知のものと異なるものであることがこの至適pHから
も明らかとなった。
【0024】次に、本発明の位置選択的な重水素化の方
法について説明する。本発明の位置選択的な重水素化方
法に使用するトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はそ
の誘導体としては、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸
の化学構造を有するものであって、当該化学構造の他に
4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ(4−HC
DC)よる脱炭酸反応を阻害しないいかなる置換基を有
するものであってもよく、好ましくは次式(I)
法について説明する。本発明の位置選択的な重水素化方
法に使用するトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はそ
の誘導体としては、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸
の化学構造を有するものであって、当該化学構造の他に
4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ(4−HC
DC)よる脱炭酸反応を阻害しないいかなる置換基を有
するものであってもよく、好ましくは次式(I)
【0025】
【化4】
【0026】(式中、Rは水素、低級アルキル基、水酸
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Rはベンゼン環上
に各々独立して1〜4個存在することができる。)で示
されるトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体が挙げられる。式(I)で示される化合物における、
低級アルキル基としては、炭素数1〜15、好ましくは
1〜10、より好ましくは1〜5のアルキル基が挙げら
れ、例えばメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソ
プロピル基、n−ブチル基、sec−ブチル基などを挙
げることができる。また、低級アルコキシ基としては、
炭素数1〜15、好ましくは1〜10、より好ましくは
1〜5のアルコキシ基が挙げられ、例えばメトキシ基、
エトキシ基、n−プロポキシ基、イソプロポキシ基、n
−ブトキシ基、sec−ブトキシ基などを挙げることが
できる。
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Rはベンゼン環上
に各々独立して1〜4個存在することができる。)で示
されるトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体が挙げられる。式(I)で示される化合物における、
低級アルキル基としては、炭素数1〜15、好ましくは
1〜10、より好ましくは1〜5のアルキル基が挙げら
れ、例えばメチル基、エチル基、n−プロピル基、イソ
プロピル基、n−ブチル基、sec−ブチル基などを挙
げることができる。また、低級アルコキシ基としては、
炭素数1〜15、好ましくは1〜10、より好ましくは
1〜5のアルコキシ基が挙げられ、例えばメトキシ基、
エトキシ基、n−プロポキシ基、イソプロポキシ基、n
−ブトキシ基、sec−ブトキシ基などを挙げることが
できる。
【0027】より具体的に本発明の好ましいトランス−
4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を例示すれば、
トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸、トランス−カフェ
酸、トランス−フェルラ酸、トランス−2,4−ジヒド
ロキシケイ皮酸などを挙げることができる。これらのト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、1
種の化合物を単独で使用してもよいが、これらの化合物
の2種以上を使用することもできる。
4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を例示すれば、
トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸、トランス−カフェ
酸、トランス−フェルラ酸、トランス−2,4−ジヒド
ロキシケイ皮酸などを挙げることができる。これらのト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、1
種の化合物を単独で使用してもよいが、これらの化合物
の2種以上を使用することもできる。
【0028】本発明の4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボ
キシラーゼ(4−HCDC)は、トランス−4−ヒドロ
キシケイ皮酸の化学構造を有し、そのカルボキシル基を
幾何選択的に脱炭酸する能力を有するものであれば特に
制限はないが、本発明のクレブシエラ オキシトカ(Kl
ebsiella oxytoca)菌体から得ることができ、トランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素が好ましい。本発
明の方法によりトランス体(E体)の重水素化物を製造
する方法を化学反応式で示すと次式
キシラーゼ(4−HCDC)は、トランス−4−ヒドロ
キシケイ皮酸の化学構造を有し、そのカルボキシル基を
幾何選択的に脱炭酸する能力を有するものであれば特に
制限はないが、本発明のクレブシエラ オキシトカ(Kl
ebsiella oxytoca)菌体から得ることができ、トランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とする新規なトランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素が好ましい。本発
明の方法によりトランス体(E体)の重水素化物を製造
する方法を化学反応式で示すと次式
【0029】
【化5】
【0030】(式中、Rは水素、低級アルキル基、水酸
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Rはベンゼン環上
に各々独立して1〜4個存在することができる。)のよ
うになる。即ち、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体、例えば式(I)で示される化合物を、重
水を含有する反応溶媒中で、4−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させ
ることにより、ビニル基のベンゼン環に対するトランス
位(E配置)が位置選択的に重水素化された4−ヒドロ
キシスチレン又はその誘導体(III) を製造することが
できる。
基、又は、低級アルコキシ基を示し、Rはベンゼン環上
に各々独立して1〜4個存在することができる。)のよ
うになる。即ち、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又
はその誘導体、例えば式(I)で示される化合物を、重
水を含有する反応溶媒中で、4−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させ
ることにより、ビニル基のベンゼン環に対するトランス
位(E配置)が位置選択的に重水素化された4−ヒドロ
キシスチレン又はその誘導体(III) を製造することが
できる。
【0031】重水素を含有する反応溶媒としては、その
一部又は全部を重水で置換した緩衝液が好ましく、緩衝
液に重水を加えたものを使用することもできる。緩衝液
としては、反応を阻害しないものであれば特に制限はな
く、例えばクエン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)が好
ましい。反応条件としては、通常の培養条件を採用すれ
ばよく、基質や使用する酵素に応じて適宜最適条件を設
定することができる。また、本発明の方法によれば、シ
ス位(Z配置)を位置選択的に重水素化した重水素化−
4−ヒドロキシスチレン又はその誘導体を製造すること
ができる。この方法は、まず、8−重水素化−トランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を、通常の緩
衝液中で、4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ
(4−HCD)の存在下に脱炭酸させることにより、シ
ス位(Z配置)が選択的に重水素化された4−ヒドロキ
シスチレン又はその誘導体を製造することができる。
一部又は全部を重水で置換した緩衝液が好ましく、緩衝
液に重水を加えたものを使用することもできる。緩衝液
としては、反応を阻害しないものであれば特に制限はな
く、例えばクエン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)が好
ましい。反応条件としては、通常の培養条件を採用すれ
ばよく、基質や使用する酵素に応じて適宜最適条件を設
定することができる。また、本発明の方法によれば、シ
ス位(Z配置)を位置選択的に重水素化した重水素化−
4−ヒドロキシスチレン又はその誘導体を製造すること
ができる。この方法は、まず、8−重水素化−トランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を、通常の緩
衝液中で、4−ヒドロキシケイ皮酸デカルボキシラーゼ
(4−HCD)の存在下に脱炭酸させることにより、シ
ス位(Z配置)が選択的に重水素化された4−ヒドロキ
シスチレン又はその誘導体を製造することができる。
【0032】この方法における8−重水素化−トランス
−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体としては、前
記したトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体の8位(ビニル位)が重水素化されたものを使用する
ことができる。より具体的には、8−重水素化−トラン
ス−4−ヒドロキシケイ皮酸、8−重水素化−トランス
−カフェ酸、8−重水素化−トランス−フェルラ酸、8
−重水素化−トランス−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸
などを例示することができる。
−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体としては、前
記したトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導
体の8位(ビニル位)が重水素化されたものを使用する
ことができる。より具体的には、8−重水素化−トラン
ス−4−ヒドロキシケイ皮酸、8−重水素化−トランス
−カフェ酸、8−重水素化−トランス−フェルラ酸、8
−重水素化−トランス−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸
などを例示することができる。
【0033】これらの、8−重水素化−トランス−4−
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、公知の種々の方
法で入手することができる。例えば、次の化学反応式
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体は、公知の種々の方
法で入手することができる。例えば、次の化学反応式
【0034】
【化6】
【0035】に示されるように、重水素置換したパラヒ
ドロキシベンスアルデヒド又はその誘導体とマロン酸の
混合物を、ドブナー(Dobner)反応(Dobner,O.,Ber.,1
900,33,2140参照)に従って、ピリジン/重水中で行う
ことにより、目的とする8−重水素化−トランス−4−
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を製造することがで
きる。得られた8−重水素化−トランス−4−ヒドロキ
シケイ皮酸又はその誘導体を、通常の軽水緩衝液中で脱
炭酸酵素と反応させると、シス位が重水素化された目的
物を得ることができる。
ドロキシベンスアルデヒド又はその誘導体とマロン酸の
混合物を、ドブナー(Dobner)反応(Dobner,O.,Ber.,1
900,33,2140参照)に従って、ピリジン/重水中で行う
ことにより、目的とする8−重水素化−トランス−4−
ヒドロキシケイ皮酸又はその誘導体を製造することがで
きる。得られた8−重水素化−トランス−4−ヒドロキ
シケイ皮酸又はその誘導体を、通常の軽水緩衝液中で脱
炭酸酵素と反応させると、シス位が重水素化された目的
物を得ることができる。
【0036】さらに、本発明の方法による前記の方法を
組み合わせることにより、4−ヒドロキシスチレン類の
ビニル基の2個の水素原子が共に重水素化された化合物
を製造することもできる。本発明の方法によれば、従来
の合成的手段によって調製することが極めて困難である
とされていた末端の8位のみが重水素化された重水素化
スチレン類を、簡便な方法で幾何選択的に調製すること
ができる。また、本発明の方法によれば、8−重水素化
−トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とすること
により、トランス体の重水素化物のみならずシス体の重
水素化スチレン類をも簡便な方法で幾何選択的に調製す
ることもできる。
組み合わせることにより、4−ヒドロキシスチレン類の
ビニル基の2個の水素原子が共に重水素化された化合物
を製造することもできる。本発明の方法によれば、従来
の合成的手段によって調製することが極めて困難である
とされていた末端の8位のみが重水素化された重水素化
スチレン類を、簡便な方法で幾何選択的に調製すること
ができる。また、本発明の方法によれば、8−重水素化
−トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸を基質とすること
により、トランス体の重水素化物のみならずシス体の重
水素化スチレン類をも簡便な方法で幾何選択的に調製す
ることもできる。
【0037】
【実施例】以下に具体例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの具体例に限定されるもので
はない。
【0038】実施例1 クエン酸−リン酸緩衝液(pH7.0)を凍結乾燥した
残さに、2mlの重水を加え、クレブシエラ オキシト
カ(Klebsiella oxytoca)から抽出し40%グリセリン
−トリス塩酸緩衝液として冷凍保存しておいた粗酵素液
100マイクロを加え、これを再び凍結乾燥した。その
結果得られた固体を10mlの重水に再溶解し、ほぼ完
全に重水素置換された酵素液を調製した。38mgのト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸重水素化アンモニウム
塩を基質とし、この重水素置換緩衝液酵素溶液中で脱炭
酸反応を行った。脱炭酸反応は重水中においても速やか
に進行した。唯一の生成物をエーテル転溶し、引き続い
て調製TLCで精製した(収量 16mg)。
残さに、2mlの重水を加え、クレブシエラ オキシト
カ(Klebsiella oxytoca)から抽出し40%グリセリン
−トリス塩酸緩衝液として冷凍保存しておいた粗酵素液
100マイクロを加え、これを再び凍結乾燥した。その
結果得られた固体を10mlの重水に再溶解し、ほぼ完
全に重水素置換された酵素液を調製した。38mgのト
ランス−4−ヒドロキシケイ皮酸重水素化アンモニウム
塩を基質とし、この重水素置換緩衝液酵素溶液中で脱炭
酸反応を行った。脱炭酸反応は重水中においても速やか
に進行した。唯一の生成物をエーテル転溶し、引き続い
て調製TLCで精製した(収量 16mg)。
【0039】生成物の1H−NMRスペクトルは、4−
ヒドロキシスチレンに帰属できるシグナル群を示した
が、C−8に位置するビニルメチレンの一方(8−E)
が消失していた(図11の(A)のスペクトル参照)。
図11には、シス位(Z配置)が重水素化されたものの
NMRスペクトル(図11の(B))、及び、重水素化
されていない4−ヒドロキシスチレンのNMRスペクト
ル(図11の(C))が併記されている。なお、図11
のNMRの測定条件は、CDCl3を溶媒とし、270
MHzである。また、EI−MSと13C−NMRのスペ
クトルは、それぞれ8位重水素化−4−ヒドロキシスチ
レン構造の正当性を支持した。
ヒドロキシスチレンに帰属できるシグナル群を示した
が、C−8に位置するビニルメチレンの一方(8−E)
が消失していた(図11の(A)のスペクトル参照)。
図11には、シス位(Z配置)が重水素化されたものの
NMRスペクトル(図11の(B))、及び、重水素化
されていない4−ヒドロキシスチレンのNMRスペクト
ル(図11の(C))が併記されている。なお、図11
のNMRの測定条件は、CDCl3を溶媒とし、270
MHzである。また、EI−MSと13C−NMRのスペ
クトルは、それぞれ8位重水素化−4−ヒドロキシスチ
レン構造の正当性を支持した。
【0040】8位−重水素化−4−ヒドロキシスチレン
: 無色シ口ップ状、 Rf 0.3(4% MeOH/CHCl3) EI−MS (m/z,%) :122(M++1,1
7),121(M十,100),120(31),92
(35)1 H−NMR : δ(CDCl3) 7.29(2H,br.d,J=8.6Hz)[2位及
び6位の水素]、6.79(2H,br.d,J=8.
6Hz)[3位及び5位の水素]、6.64(1H,b
r.d,J=17.5Hz)[7位の水素]、5.58
(1H,d,J=17.5Hz)[8位Z配置の水素]13 C−NMR : 68MHz,CDCl3 155.4(4−C),136.0(7−CH),13
0.5(1−C),127.6(2−及び6−CH),
115.4(3−及び5−CH),111.2(t,8
−CHD)
: 無色シ口ップ状、 Rf 0.3(4% MeOH/CHCl3) EI−MS (m/z,%) :122(M++1,1
7),121(M十,100),120(31),92
(35)1 H−NMR : δ(CDCl3) 7.29(2H,br.d,J=8.6Hz)[2位及
び6位の水素]、6.79(2H,br.d,J=8.
6Hz)[3位及び5位の水素]、6.64(1H,b
r.d,J=17.5Hz)[7位の水素]、5.58
(1H,d,J=17.5Hz)[8位Z配置の水素]13 C−NMR : 68MHz,CDCl3 155.4(4−C),136.0(7−CH),13
0.5(1−C),127.6(2−及び6−CH),
115.4(3−及び5−CH),111.2(t,8
−CHD)
【0041】実施例2 基質としてトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸に換え
て、トランス−カフェ酸、トランス−フェルラ酸、トラ
ンス−2,4−ジビドロキシケイ皮酸を用い、実施例1
と同様にして、それぞれ対応するE−重水素化スチレン
誘導体を生成した。
て、トランス−カフェ酸、トランス−フェルラ酸、トラ
ンス−2,4−ジビドロキシケイ皮酸を用い、実施例1
と同様にして、それぞれ対応するE−重水素化スチレン
誘導体を生成した。
【0042】実施例3 基質としてトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸に代えて
Z−8−重水素化−トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸
(38mg)を用い、緩衝液として通常の軽水緩衝液中
で、実施例1と同様に反応させることにより、Z−8−
重水素化−4−ヒドロキシスチレンを得た(収量 9m
g)。無色シロップ状。
Z−8−重水素化−トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸
(38mg)を用い、緩衝液として通常の軽水緩衝液中
で、実施例1と同様に反応させることにより、Z−8−
重水素化−4−ヒドロキシスチレンを得た(収量 9m
g)。無色シロップ状。
【0043】 Rf 0.3 (4% MeOH/CHC13) EI−MS (m/z,%) :122(M++1,1
2),121(M+,100),120(27),92
(38)1 H−NMR δ(CDCl3) :7.30(br.
d,J=8.6Hz)[2位、6位水素],6.79
(br.d,J=8.6Hz)[3位、5位水素],
6.63(m−liked,J=10.9Hz)[7位
水素],5.10(d,J=10.9Hz)[8位水
素]
2),121(M+,100),120(27),92
(38)1 H−NMR δ(CDCl3) :7.30(br.
d,J=8.6Hz)[2位、6位水素],6.79
(br.d,J=8.6Hz)[3位、5位水素],
6.63(m−liked,J=10.9Hz)[7位
水素],5.10(d,J=10.9Hz)[8位水
素]
【0044】実施例4 実施例3で使用した8−Z−重水素化−4−ヒドロキシ
ケイ皮酸は次のようにして製造した。重水素置換したマ
ロン酸(0.5g)とパラヒドロキシベンズアルデヒド
(65mg)を用いて、ドブナー反応(Dobner 反応)
を行った。即ち、ピリジン/重水(2ml/0.5m
l)中、70℃で終夜反応をさせた後、反応混合液を水
で希釈し、塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。目
的の8−重水素化−4−ヒドロキシケイ皮酸を、TLC
(10% MeOH/CHCl3)により精製し、48
mgの淡黄色固体として得た(収率55%)。
ケイ皮酸は次のようにして製造した。重水素置換したマ
ロン酸(0.5g)とパラヒドロキシベンズアルデヒド
(65mg)を用いて、ドブナー反応(Dobner 反応)
を行った。即ち、ピリジン/重水(2ml/0.5m
l)中、70℃で終夜反応をさせた後、反応混合液を水
で希釈し、塩酸で酸性にし、酢酸エチルで抽出した。目
的の8−重水素化−4−ヒドロキシケイ皮酸を、TLC
(10% MeOH/CHCl3)により精製し、48
mgの淡黄色固体として得た(収率55%)。
【0045】8−Z−重水素化−4−ヒドロキシケイ皮
酸: EI−MS (m/z,%) :166(M++1,1
8),165(M+,100),164(49),14
8(61),120(31)1 H−NMR δ(270MHz,アセトン−d6)
:8.86(1H,br.,4−OH),7.60
(1H,br.s,7−H),7.55(2H,br.
d,J=8.6Hz,2−及び6−H),6.90(2
H,br.d,J=8.6Hz,3及び5−H) なお、溶媒の重水素置換が完全でなかったために、微小
なH−8シグナルがpH6.35付近に約6%の強度で
観察された。
酸: EI−MS (m/z,%) :166(M++1,1
8),165(M+,100),164(49),14
8(61),120(31)1 H−NMR δ(270MHz,アセトン−d6)
:8.86(1H,br.,4−OH),7.60
(1H,br.s,7−H),7.55(2H,br.
d,J=8.6Hz,2−及び6−H),6.90(2
H,br.d,J=8.6Hz,3及び5−H) なお、溶媒の重水素置換が完全でなかったために、微小
なH−8シグナルがpH6.35付近に約6%の強度で
観察された。
【0046】実施例5 本発明の酵素は次のようにして単離した。菌株クレブシ
エラ オキシトカ(JCM1665)は、理化学研究所
(埼玉県)より入手した。クレブシエラ オキシトカ
(Klebsiella oxytoca)菌体を、2mM濃度のトランス
−カフェ酸を含むジャガイモ煮汁培地(Difco,4
00ml)で25℃で48時間振とう培養した。培養し
た菌体を、2,000gで10分間遠心分離して集め、
これを50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.2)に
懸濁し、2,000gで10分間遠心分離した。得られ
た菌体を、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.0,20ml)中に懸濁し、氷溶中で超音波破砕し
た(Soniphier20meV,15分間,10%
パルス)。得られた液を遠心分離(12,000gで5
分間(5℃))し、4−HCD活性を示す浮遊物を得た。
可溶性蛋白質は、70〜80%Na2SO4で沈澱させ、
40%グリセロールと25mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.0,10ml)に再溶解させて、−20℃で
保存した。この溶解液(蛋白質含有量は約100μl/
μl)の、4−ヒドロキシケイ皮酸ナトリウム塩を基質
として使用した場合の脱炭酸活性は、約30nmol/
μl/分であった。
エラ オキシトカ(JCM1665)は、理化学研究所
(埼玉県)より入手した。クレブシエラ オキシトカ
(Klebsiella oxytoca)菌体を、2mM濃度のトランス
−カフェ酸を含むジャガイモ煮汁培地(Difco,4
00ml)で25℃で48時間振とう培養した。培養し
た菌体を、2,000gで10分間遠心分離して集め、
これを50mMのトリス−塩酸緩衝液(pH7.2)に
懸濁し、2,000gで10分間遠心分離した。得られ
た菌体を、25mMのリン酸ナトリウム緩衝液(pH
7.0,20ml)中に懸濁し、氷溶中で超音波破砕し
た(Soniphier20meV,15分間,10%
パルス)。得られた液を遠心分離(12,000gで5
分間(5℃))し、4−HCD活性を示す浮遊物を得た。
可溶性蛋白質は、70〜80%Na2SO4で沈澱させ、
40%グリセロールと25mMリン酸ナトリウム緩衝液
(pH7.0,10ml)に再溶解させて、−20℃で
保存した。この溶解液(蛋白質含有量は約100μl/
μl)の、4−ヒドロキシケイ皮酸ナトリウム塩を基質
として使用した場合の脱炭酸活性は、約30nmol/
μl/分であった。
【0047】実施例6 50mMクエン酸・リン酸緩衝液10mlにシス−4−
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩10mgをとり、同
量の粗酵素液を加え、よく攪拌した。このとき、光があ
たると基質のシス体がトランス体に光異性化するおそれ
があるので、反応容器をアルミホイルで包み、室温、暗
所で一晩放置した。また、対照として、同じ条件で基質
としてトランス体を用いて反応させた。その結果、トラ
ンス体では脱炭酸反応が生起したが、シス体では脱炭酸
反応は全く起こらなかった。
ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩10mgをとり、同
量の粗酵素液を加え、よく攪拌した。このとき、光があ
たると基質のシス体がトランス体に光異性化するおそれ
があるので、反応容器をアルミホイルで包み、室温、暗
所で一晩放置した。また、対照として、同じ条件で基質
としてトランス体を用いて反応させた。その結果、トラ
ンス体では脱炭酸反応が生起したが、シス体では脱炭酸
反応は全く起こらなかった。
【0048】実施例7(本発明の酵素の活性試験) 本酵素の4−HCD活性はガスクロマトグラフィーを用
いて次のようにして決定された。まず、ガスクロマトグ
ラフィーの標準溶液として、100mgのパルミチン酸
メチル(和光純薬、分析グレード)の100ml n−
ヘキサン溶液を調整した。酵素の溶液(5μl)に10
0mMのリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液を加え、こ
れに基質として5mMのE−4−ヒドロキシケイ酸ナト
リウム(5a)溶液5mlを加え、各々10、20、3
0、40、50及び60分間、25℃で放置した。各々
の反応時間の終了時に、酵素反応を終結させるために2
mlの酢酸エチルを加え、少し振った。さらに、内部標
準として、前記の標準溶液1mlを加え、振り混ぜた。
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、ガスクロマトグ
ラフィーで分析した。4−ヒドロキシスチレンと内部標
準のピークは、リテンションタイム(eR)が各々4.
1分と8.7分のところに現れた。標準のカーブにおい
ては、10μモルの4−ヒドロキシスチレンが標準のピ
ークに対して1.02の一定の比率で示された。結果を
図2に示す。図2に示されるように、酵素反応が20分
間の場合が、標準のカーブにおいて最も信頼できる値の
ようである(基質の6%が反応していると考えられ
る)。図3に示されるように、ミカエリス定数(Km)
は約0.5mMであった。
いて次のようにして決定された。まず、ガスクロマトグ
ラフィーの標準溶液として、100mgのパルミチン酸
メチル(和光純薬、分析グレード)の100ml n−
ヘキサン溶液を調整した。酵素の溶液(5μl)に10
0mMのリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液を加え、こ
れに基質として5mMのE−4−ヒドロキシケイ酸ナト
リウム(5a)溶液5mlを加え、各々10、20、3
0、40、50及び60分間、25℃で放置した。各々
の反応時間の終了時に、酵素反応を終結させるために2
mlの酢酸エチルを加え、少し振った。さらに、内部標
準として、前記の標準溶液1mlを加え、振り混ぜた。
有機層を硫酸ナトリウムで乾燥した後、ガスクロマトグ
ラフィーで分析した。4−ヒドロキシスチレンと内部標
準のピークは、リテンションタイム(eR)が各々4.
1分と8.7分のところに現れた。標準のカーブにおい
ては、10μモルの4−ヒドロキシスチレンが標準のピ
ークに対して1.02の一定の比率で示された。結果を
図2に示す。図2に示されるように、酵素反応が20分
間の場合が、標準のカーブにおいて最も信頼できる値の
ようである(基質の6%が反応していると考えられ
る)。図3に示されるように、ミカエリス定数(Km)
は約0.5mMであった。
【0049】実施例 8 基質特異性の試験に用いた図1に記載の化合物の合成例
を次に記載する。 (1)E−4−アミノケイ皮酸(11) p−アミノベンズアルデヒドとマロン酸とを、ピリジン
中で100℃、一夜、ドブナー(Dobner)反応により製
造した。溶媒を除去した後、反応混合物を少量の10%
メタノール/クロロホルムに溶解し、シリカゲルクロマ
トグラフィー(20%メタノール/クロロホルム)にか
けた。溶出した主生成物(11)を、薄層クロマトグラ
フィー(TLC)(10%メタノール/クロロホルム)
で分離した。黄色固体。収率49%。 EI−MS (m/z,%):163(M+,10
0),146(35),118(20),117(1
7),91(11)1 H−NMR δ(アセトン−d6);7.54(d,J=15.8Hz,7
-H), 7.36(br.d,J=8.6Hz,2- and 6-H),6.64(br.d,J=8.6
Hz,3- and 5-H),6.18(d,J=15.8Hz,8-H).
を次に記載する。 (1)E−4−アミノケイ皮酸(11) p−アミノベンズアルデヒドとマロン酸とを、ピリジン
中で100℃、一夜、ドブナー(Dobner)反応により製
造した。溶媒を除去した後、反応混合物を少量の10%
メタノール/クロロホルムに溶解し、シリカゲルクロマ
トグラフィー(20%メタノール/クロロホルム)にか
けた。溶出した主生成物(11)を、薄層クロマトグラ
フィー(TLC)(10%メタノール/クロロホルム)
で分離した。黄色固体。収率49%。 EI−MS (m/z,%):163(M+,10
0),146(35),118(20),117(1
7),91(11)1 H−NMR δ(アセトン−d6);7.54(d,J=15.8Hz,7
-H), 7.36(br.d,J=8.6Hz,2- and 6-H),6.64(br.d,J=8.6
Hz,3- and 5-H),6.18(d,J=15.8Hz,8-H).
【0050】(2)E,E−5−(4−ヒドロキシフェ
ニル)−2,4−ペンタジエン酸(16) 4−メトキシケイ皮アルデヒドとマロン酸とを、70℃
でドブナー(Dobner)反応により縮合させ、EI−MS
による親ピークm/zが248(M+,100)を示す
二塩基酸を得た(収率99%以上)。次いで、この二塩
基酸を160℃で一夜加熱することにより、E,E−5
−(4−メトキシフェニル)−2,4−ペンタジエン酸
(16)を得た(収率30%)。これを、BBr3/C
H2Cl2を用いて脱メチル化して、目的のE,E−5−
(4−ヒドロキシフェニル)−2,4−ペンタジエン酸
(16)を得た(収率45%)。 EI−MS (m/z,%);190(M+,87),
145(100),144(31),127(42),
117(16),115(21)1 H−NMR δ(アセトン−d6);7.39(br.d,J=8.6H
z,2- and 6-H),7.39(dd,J=15.2 and 9.9Hz,8-H), 6.94
(br.d,J=15.8Hz,7-H),6.85(dd,J=15.2 and 9.9Hz,9-H),
6.82(br.d,J=8.6Hz,3-and5-H)5.91(d,J=15.2Hz,10-H).
ニル)−2,4−ペンタジエン酸(16) 4−メトキシケイ皮アルデヒドとマロン酸とを、70℃
でドブナー(Dobner)反応により縮合させ、EI−MS
による親ピークm/zが248(M+,100)を示す
二塩基酸を得た(収率99%以上)。次いで、この二塩
基酸を160℃で一夜加熱することにより、E,E−5
−(4−メトキシフェニル)−2,4−ペンタジエン酸
(16)を得た(収率30%)。これを、BBr3/C
H2Cl2を用いて脱メチル化して、目的のE,E−5−
(4−ヒドロキシフェニル)−2,4−ペンタジエン酸
(16)を得た(収率45%)。 EI−MS (m/z,%);190(M+,87),
145(100),144(31),127(42),
117(16),115(21)1 H−NMR δ(アセトン−d6);7.39(br.d,J=8.6H
z,2- and 6-H),7.39(dd,J=15.2 and 9.9Hz,8-H), 6.94
(br.d,J=15.8Hz,7-H),6.85(dd,J=15.2 and 9.9Hz,9-H),
6.82(br.d,J=8.6Hz,3-and5-H)5.91(d,J=15.2Hz,10-H).
【0051】(3)2−(3−プロペン−1−カルボキ
シル)−5−アセトキシ−4H−ピラン−4−オン(1
8) コウジ酸(2−ヒドロキシメチル−5−ヒドロキシ−4
H−ピラン−4−オン、和光製)をエタノールに溶解
し、これに等量のKOH及び等量の無水酢酸を加えて、
アセチル化することにより、2−ヒドロキシメチル−5
−アセトキシ−4H−ピラン−4−オンを得た(収率7
0%)。得られたモノアセチル体を、50%クロロホル
ム/トルエン中で粉末状の二酸化マンガンを用いて酸化
することにより2−ホルミル−5−アセトキシ−4H−
ピラン−4−オンを得た(収率26%、約70%の原料
を回収した。)。 EI−MS (m/z,%);113(M+,10
0),91(44),65(32),44(33),4
0(58)1 H−NMR δ(CDCl3);9.70 (s,7-H), 8.02
(s,6-H), 7.07 (s,3-H), 2.35 (s,5-OAc)
シル)−5−アセトキシ−4H−ピラン−4−オン(1
8) コウジ酸(2−ヒドロキシメチル−5−ヒドロキシ−4
H−ピラン−4−オン、和光製)をエタノールに溶解
し、これに等量のKOH及び等量の無水酢酸を加えて、
アセチル化することにより、2−ヒドロキシメチル−5
−アセトキシ−4H−ピラン−4−オンを得た(収率7
0%)。得られたモノアセチル体を、50%クロロホル
ム/トルエン中で粉末状の二酸化マンガンを用いて酸化
することにより2−ホルミル−5−アセトキシ−4H−
ピラン−4−オンを得た(収率26%、約70%の原料
を回収した。)。 EI−MS (m/z,%);113(M+,10
0),91(44),65(32),44(33),4
0(58)1 H−NMR δ(CDCl3);9.70 (s,7-H), 8.02
(s,6-H), 7.07 (s,3-H), 2.35 (s,5-OAc)
【0052】この生成物(34mg)をマロン酸と、ピ
リジン中、70℃で一夜処理した。溶媒を減圧で留去
し、残渣をクロロホルム溶解し、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより10%メタノール/クロロホルム
で溶出させて目的の化合物(18)を得た(収率40
%)。黄色固体。 Rf 0.1(10%メタノール/クロロホルム) EI−MS(m/z,%):182(M+,100),
153(35),125(17),97(12),79
(11)44(14)1 H−NMR δ(CD3OD);8.10(s,6-H), 7.80(d,J
=15.8 Hz,7-H), 6.77(d,J=15.8Hz,8-H),6.70(s,3-H).
リジン中、70℃で一夜処理した。溶媒を減圧で留去
し、残渣をクロロホルム溶解し、シリカゲルカラムクロ
マトグラフィーにより10%メタノール/クロロホルム
で溶出させて目的の化合物(18)を得た(収率40
%)。黄色固体。 Rf 0.1(10%メタノール/クロロホルム) EI−MS(m/z,%):182(M+,100),
153(35),125(17),97(12),79
(11)44(14)1 H−NMR δ(CD3OD);8.10(s,6-H), 7.80(d,J
=15.8 Hz,7-H), 6.77(d,J=15.8Hz,8-H),6.70(s,3-H).
【0053】(4)Z−4−ヒドロキシケイ皮酸(1
4) E−4−ヒドロキシケイ皮酸エチルエステルに、254
nmの紫外線を照射して異性化させ、次いでこれを1M
のNaOH/メタノールで加水分解することにより目的
物(14)を得た(収率約30%)。1 H−NMR δ(アセトン−d6);6.75(J=12.9Hz),
5.70(J=12.9 Hz)
4) E−4−ヒドロキシケイ皮酸エチルエステルに、254
nmの紫外線を照射して異性化させ、次いでこれを1M
のNaOH/メタノールで加水分解することにより目的
物(14)を得た(収率約30%)。1 H−NMR δ(アセトン−d6);6.75(J=12.9Hz),
5.70(J=12.9 Hz)
【0054】(5)2,4−ジヒドロキシケイ皮酸 7−ヒドロキシクマリンを濃アンモニア水に溶解し、一
夜室温で暗所に放置した。水層を酢酸エチルで洗浄して
未反応の原料を除いた。水層を減圧下で乾燥すると、粉
状のZ−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸(15)のアン
モニウム塩を得た。一方、水層に254nmの紫外線を
30分間照射すると、C7/C8の二重結合が異性化し
たE−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸(4)のアンモニ
ウム塩が得られる。後者の乾燥した残渣を2M塩酸溶液
に溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機層を5%NaH
CO3と酢酸エチルに分配した。これはE−2,4−ジ
ヒドロキシケイ皮酸が遊離カルボン酸に止まり、E−体
のみが水層に移行するからであり、目的化合物は酸性化
して酢酸エチルで再抽出することにより得られた。
夜室温で暗所に放置した。水層を酢酸エチルで洗浄して
未反応の原料を除いた。水層を減圧下で乾燥すると、粉
状のZ−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸(15)のアン
モニウム塩を得た。一方、水層に254nmの紫外線を
30分間照射すると、C7/C8の二重結合が異性化し
たE−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸(4)のアンモニ
ウム塩が得られる。後者の乾燥した残渣を2M塩酸溶液
に溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機層を5%NaH
CO3と酢酸エチルに分配した。これはE−2,4−ジ
ヒドロキシケイ皮酸が遊離カルボン酸に止まり、E−体
のみが水層に移行するからであり、目的化合物は酸性化
して酢酸エチルで再抽出することにより得られた。
【0055】実施例9 基質に化学構造が似ているが、基質にならない化合物
(9)、(12)、(17)、4−ヒドロキシフェニル
酢酸(19)、及び、4−ヒドロキシケイ皮アルコール
(20)について、4−HCDの活性阻害を検討した。
5mlの100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.2)
又はリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
に、酵素溶液(10μl)と100μモルの試験化合物
(50μlの100μMメタノール溶液)とを加え、2
5℃で5分間放置した。この酵素溶液に、5mlの10
mM4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(5a、5
0μモル)を加え、同じ温度で30分間放置した。十分
な阻害活性が観察され、この阻害活性は基質の濃度にほ
ぼ定量的であった。
(9)、(12)、(17)、4−ヒドロキシフェニル
酢酸(19)、及び、4−ヒドロキシケイ皮アルコール
(20)について、4−HCDの活性阻害を検討した。
5mlの100mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.2)
又はリン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0)
に、酵素溶液(10μl)と100μモルの試験化合物
(50μlの100μMメタノール溶液)とを加え、2
5℃で5分間放置した。この酵素溶液に、5mlの10
mM4−ヒドロキシケイ皮酸アンモニウム塩(5a、5
0μモル)を加え、同じ温度で30分間放置した。十分
な阻害活性が観察され、この阻害活性は基質の濃度にほ
ぼ定量的であった。
【0056】
【発明の効果】本発明によれば、新規な4−HCDが提
供され、また、重水素化−4−ヒドロキシスチレン類を
位置選択的に収率よく製造することができる。
供され、また、重水素化−4−ヒドロキシスチレン類を
位置選択的に収率よく製造することができる。
【図1】図1は、本発明の酵素の基質となる物質と基質
とならないものを示したものである。
とならないものを示したものである。
【図2】図2は、本発明の酵素の基質による活性の変化
を示したものである。
を示したものである。
【図3】図3は、緩衝液系に各種の溶質を添加したとき
の、本発明の酵素の活性の変化をカフェ酸アンモニウム
塩(1mg/ml)を基質として用い、トリス塩酸緩衝
液(Tris−HCl)(pH7.2)を基準とした相
対活性度で示したものである。
の、本発明の酵素の活性の変化をカフェ酸アンモニウム
塩(1mg/ml)を基質として用い、トリス塩酸緩衝
液(Tris−HCl)(pH7.2)を基準とした相
対活性度で示したものである。
【図4】図4は、本発明の酵素の濃度が一定のときの、
基質濃度と反応速度との関係を示したものである。
基質濃度と反応速度との関係を示したものである。
【図5】図5の(A)及び(B)は、基質濃度に対する
4−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロットした
ものである。
4−ヒドロキシスチレンの生成量の変化をプロットした
ものである。
【図6】図6は、本発明の酵素の量と基質の反応速度と
の関係を示したものである。
の関係を示したものである。
【図7】図7は、塩化ナトリウムの濃度が本発明の酵素
の活性に与える影響を示したものである。
の活性に与える影響を示したものである。
【図8】図8は、エタノールの濃度が本発明の酵素の活
性に与える影響を示したものである。
性に与える影響を示したものである。
【図9】図9は、クエン酸緩衝液(50ml)における
本発明の酵素のpHの影響を示したものである。
本発明の酵素のpHの影響を示したものである。
【図10】図10は、トリス塩酸緩衝液(50ml)に
おける本発明の酵素のpHの影響を示したものである。
おける本発明の酵素のpHの影響を示したものである。
【図11】図11は、4−ヒドロキシスチレンの1H−
NMR(270MHz,CDCl3中)のスペクトルを
示す。図11の(A)はE−8−重水素化物のスペクト
ルであり、(B)はZ−8−重水素化物のスペクトルで
あり、(C)は非重水素化物のスペクトルを示す。図中
の矢印はシグナルが消失している部分を示している。
NMR(270MHz,CDCl3中)のスペクトルを
示す。図11の(A)はE−8−重水素化物のスペクト
ルであり、(B)はZ−8−重水素化物のスペクトルで
あり、(C)は非重水素化物のスペクトルを示す。図中
の矢印はシグナルが消失している部分を示している。
Claims (11)
- 【請求項1】 クレブシエラ オキシトカ(Klebsiella
oxytoca)菌体から得ることができ、トランス−4−ヒ
ドロキシケイ皮酸を基質とするトランス−4−ヒドロキ
シケイ皮酸脱炭酸酵素。 - 【請求項2】 至適pHが、7.2付近である請求項1
に記載のトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵
素。 - 【請求項3】 トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体を、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸デカ
ルボキシラーゼ(4−HCD)の存在下に脱炭酸させる
ことによる、ビニル位に位置選択的に重水素原子を有す
る4−ヒドロキシスチレン又はその誘導体の製造方法。 - 【請求項4】 脱炭酸反応が重水を含有する反応溶媒中
で行われることを特徴とする請求項3に記載の製造方
法。 - 【請求項5】 重水素化がベンゼン環に対してトランス
位である請求項3又は4に記載の製造方法。 - 【請求項6】 トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体が次式(I) 【化1】 (式中、Rは水素、低級アルキル基、水酸基、又は、低
級アルコキシ基を示し、Rはベンゼン環上に各々独立し
て1〜4個存在することができる。)で示される化合物
である請求項3〜5のいずれか1項に記載の製造方法。 - 【請求項7】 トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸又は
その誘導体が、トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸、ト
ランス−カフェ酸、トランス−フェルラ酸、又は、トラ
ンス−2,4−ジヒドロキシケイ皮酸のいずれか1種又
は2種以上である請求項6に記載の製造方法。 - 【請求項8】 重水素化がベンゼン環に対してシス位で
ある請求項3に記載の製造方法。 - 【請求項9】 ビニル位の2個の水素が重水素化される
ことを特徴とする請求項3又は4に記載の製造方法。 - 【請求項10】 トランス−4−ヒドロキシケイ皮酸デ
カルボキシラーゼ(4−HCD)が、請求項1又は2に
記載の4−HCDである請求項3〜9のいずれか1項に
記載の製造方法。 - 【請求項11】 次式(II) 【化2】 (式中、Dは重水素原子を示し、Rは水素、低級アルキ
ル基、水酸基、又は、低級アルコキシ基を示し、Rはベ
ンゼン環上に各々独立して1〜4個存在することができ
る。)で示される重水素化−4−ヒドロキシスチレン
類。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9366651A JPH11187870A (ja) | 1997-12-26 | 1997-12-26 | 新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP9366651A JPH11187870A (ja) | 1997-12-26 | 1997-12-26 | 新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
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JPH11187870A true JPH11187870A (ja) | 1999-07-13 |
Family
ID=18487310
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP9366651A Pending JPH11187870A (ja) | 1997-12-26 | 1997-12-26 | 新規なトランス−4−ヒドロキシケイ皮酸脱炭酸酵素、及び、それを用いた重水素化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH11187870A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008019208A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-01-31 | Pola Chem Ind Inc | 新規化合物及びそれを含有する皮膚外用剤 |
US7378261B2 (en) | 2003-04-14 | 2008-05-27 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for preparing para-hydroxystyrene by biocatalytic decarboxylation of para-hydroxycinnamic acid in a biphasic reaction medium |
JP2018123127A (ja) * | 2017-01-31 | 2018-08-09 | 東洋合成工業株式会社 | アルケニル化合物の合成方法及び製造方法 |
-
1997
- 1997-12-26 JP JP9366651A patent/JPH11187870A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7378261B2 (en) | 2003-04-14 | 2008-05-27 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for preparing para-hydroxystyrene by biocatalytic decarboxylation of para-hydroxycinnamic acid in a biphasic reaction medium |
JP2008019208A (ja) * | 2006-07-13 | 2008-01-31 | Pola Chem Ind Inc | 新規化合物及びそれを含有する皮膚外用剤 |
JP2018123127A (ja) * | 2017-01-31 | 2018-08-09 | 東洋合成工業株式会社 | アルケニル化合物の合成方法及び製造方法 |
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