JPH11178600A - Probe for detecting target nucleic acid - Google Patents
Probe for detecting target nucleic acidInfo
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- JPH11178600A JPH11178600A JP35534897A JP35534897A JPH11178600A JP H11178600 A JPH11178600 A JP H11178600A JP 35534897 A JP35534897 A JP 35534897A JP 35534897 A JP35534897 A JP 35534897A JP H11178600 A JPH11178600 A JP H11178600A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、蛍光共鳴エネルギ
ー移動（以下ＦＲＥＴとする）を利用した標的核酸検出
プローブに関する。[0001] The present invention relates to a probe for detecting a target nucleic acid utilizing fluorescence resonance energy transfer (hereinafter referred to as FRET).
【０００２】[0002]
【従来の技術】近年の研究の進展により、種々の生物情
報が遺伝子の配列から得ることが出来るようになった。
それに伴い当該遺伝子を検出（標的核酸中の特定のポリ
ヌクレオチド配列に対応する）することにより、医療分
野においては疾病の存在、薬物に対する感受性、臓器移
植の適合性などを診断することが、食品分野においては
食中毒の原因になる様々な病原体を検出したり同定する
ことが可能になった。2. Description of the Related Art Recent advances in research have made it possible to obtain various biological information from gene sequences.
Along with that, by detecting the gene (corresponding to a specific polynucleotide sequence in the target nucleic acid), in the medical field, it is possible to diagnose the presence of disease, sensitivity to drugs, suitability for organ transplantation, etc., in the food field. In, various pathogens causing food poisoning can be detected and identified.
【０００３】このような特定のポリヌクレオチド配列を
検出するために、検出しようとする配列と相補的な塩基
配列からなるプローブを用いたハイブリダイゼーション
法が知られている。[0003] In order to detect such a specific polynucleotide sequence, a hybridization method using a probe having a base sequence complementary to the sequence to be detected is known.
【０００４】このハイブリダイゼーション法において使
用される検出手段の１つとしては、蛍光色素でラベル化
したプローブを用いて非放射性エネルギー転移（蛍光エ
ネルギー転移又は蛍光共鳴エネルギー移動（以下ＦＲＥ
Ｔとする））現象を利用する方法が知られている。係る
ＦＲＥＴ現象についてはFeorster等によりその理論的取
扱を含めてよく知られているものである（Foerster、Di
scuss.Faraday Soc.,27,7-17(1959)）。実際、エネルギ
ー供与体と受容体をそれぞれ連結したオリゴペプチド類
（Stryer等、Proc.Natl.Acad.Sci.,58,719-726(1967)）
や、オリゴヌクレオチオド（特公平7-63400）を用いた
例が知られている。[0004] One of the detection means used in this hybridization method is non-radiative energy transfer (fluorescence energy transfer or fluorescence resonance energy transfer (hereinafter referred to as FRE) using a probe labeled with a fluorescent dye.
A method using a phenomenon is known. Such FRET phenomenon is well known by Feorster et al. Including its theoretical treatment (Foerster, Di
scuss. Faraday Soc., 27, 7-17 (1959)). In fact, oligopeptides linking an energy donor and an acceptor, respectively (Stryer et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 58, 719-726 (1967))
And examples using oligonucleotides (Japanese Patent Publication No. 7-63400).
【０００５】一方、係るＦＲＥＴ現象を、特定のポリヌ
クレオチド塩基配列を高感度かつ高認識で検出する目的
に使用するためには、該ＦＲＥＴに基づく現象（例えば
エネルギー転移効率）が検出用プローブの構造から定量
的に解析可能なものである必要がある。例えば、特定の
検出用プローブを使用して特定のオリゴヌクレオチド塩
基配列とハイブリダイズさせた際、観測されるＦＲＥＴ
のエネルギー転移効率から該プローブ近傍の塩基配列情
報（例えば該プローブ間にいくつの塩基が介在している
か）を定量的に推定可能とするものである。On the other hand, in order to use the FRET phenomenon for the purpose of detecting a specific polynucleotide base sequence with high sensitivity and high recognition, a phenomenon based on the FRET (eg, energy transfer efficiency) requires the structure of a detection probe. Must be able to be analyzed quantitatively. For example, when hybridizing with a specific oligonucleotide base sequence using a specific detection probe, FRET observed
The base sequence information near the probe (for example, how many bases exist between the probes) can be quantitatively estimated from the energy transfer efficiency.
【０００６】実際上記のオリゴペプチド類について、エ
ネルギー供与体及び受容体としての２種類の蛍光色素を
用いた場合、該色素間の間隔（距離）と、観測されるエ
ネルギー転移効率の間には、Foerster等による理論式に
よく一致することが知られている（Stryer等、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,58,719-726(1967)）。しかしながら、上記
のオリゴヌクレオチド（１本の標的核酸に対して２本の
プローブを用い、その間隔を開けるようなハイブリダイ
ゼーションの方法においては）については、該色素間の
間隔（距離）と、観測されるエネルギー転移効率の間に
は、Foerster等による理論式には一致しない（特公平7-
63400）。In fact, when two kinds of fluorescent dyes are used as the energy donor and the acceptor for the above oligopeptides, the distance (distance) between the dyes and the observed energy transfer efficiency are: It is known that it is in good agreement with the theoretical formula by Foerster et al. (Stryer et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci., 58, 719-726 (1967)). However, for the above-mentioned oligonucleotides (in a hybridization method using two probes for one target nucleic acid and increasing the interval), the distance (distance) between the dyes is observed. Energy transfer efficiency does not agree with the theoretical formula by Foerster et al.
63400).
【０００７】[0007]
【発明が解決しようとする課題】本発明者等は上記従来
技術に係る問題点、すなわち、オリゴヌクレオチドにつ
いて見られる、該色素間の間隔（距離）と観測されるエ
ネルギー転移効率間の、Foerster等による理論式との不
一致の原因を鋭意解析し、その結果、特定の構造を有す
る検出プローブを用いることにより、前記色素間の間隔
（距離、又は介在する塩基数）と観測されるエネルギー
転移効率の関係において、Foerster等による理論式とよ
く一致することを見出し、本発明を完成するに至った。SUMMARY OF THE INVENTION The inventors of the present invention have identified the above-mentioned problems with the prior art, namely, Foerster et al. The intense analysis of the cause of the inconsistency with the theoretical formula according to the above results. As a result, by using a detection probe having a specific structure, the distance between the dyes (distance or the number of intervening bases) and the observed energy transfer efficiency can be reduced. In this connection, they found that the formula well agreed with the theoretical formula by Foerster et al., And completed the present invention.
【０００８】すなわち、本発明に係る検出プローブは、
特定のオリゴヌクレオチド塩基配列とハイブリダイズし
た際においても、該プローブの色素間の間隔（距離、又
は塩基数に換算）と観測されるエネルギー転移効率の間
に、Foerster等による理論式とのよい一致を与えるもの
である。That is, the detection probe according to the present invention comprises:
Even when hybridized with a specific oligonucleotide base sequence, the distance between the dyes of the probe (in terms of distance or the number of bases) and the observed energy transfer efficiency are in good agreement with the theoretical formula by Foerster et al. Is to give.
【０００９】すなわち、本発明は、第１のオリゴヌクレ
オチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌク
レオチド配列ＩN（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検
体の特定の第２のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とか
らなる連続する特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が
５’末端側でＡ２が３’末端側、以下同じ）を有する被
検体を検出する、第１のプローブと第２のプローブから
なる１組の検出プローブにおいて、(1) 前記第１プロ
ーブが、前記Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ
前記Ｂ１の５’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラ
ベル化され、(2) 前記第２プローブが、前記Ａ２と相
補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端に
エネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、か
つ(a) 前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イ
オン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ(b) 前
記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包す
る球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オングス
トローム以上であり、(3) 前記１組のプローブと前記
被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍
光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への
の蛍光エネルギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に
従い単調に減少すること、を特徴とする検出プローブを
提供するものである。That is, the present invention provides a first oligonucleotide base sequence A1, an oligonucleotide sequence I N consisting of N bases (N is an integer of 0 to 15), and a specific second base sequence of the subject. A first probe and a second probe for detecting an analyte having a continuous specific base sequence A1I N A2 consisting of an oligonucleotide base sequence A2 (A1 is at the 5 'end and A2 is at the 3' end, and so forth) (1) The first probe has a base sequence B1 complementary to the A1 and is labeled at the 5 ′ end of the B1 with an energy donor fluorescent dye. (2) the second probe has a base sequence B2 complementary to the A2, and is labeled at the 3 ′ end of the B2 with an energy-accepting fluorescent dye, and (a) the energy acceptor The non-ionic condensed polycyclic hydrocarbon-based dye is a non-ionic condensed fluorescent dye, and (b) the diameter when forming a sphere enclosing or enclosing the energy-accepting fluorescent dye is 12 to 100 Å or more (3) the transfer efficiency of the fluorescence energy transfer of the hybrid of the set of probes and the analyte from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye, as the N increases The present invention provides a detection probe characterized by monotonically decreasing.
【００１０】また、本発明は、上記プローブの構成にお
いて、エネルギーアクセプター及びエネルギードナー性
蛍光色素の結合一のみ異なる構成を有するプローブであ
る、第１のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ１と、Ｎ個の
塩基からなるオリゴヌクレオチド配列ＩN（Ｎは０〜１
５の整数）と、前記被検体の特定の第２のオリゴヌクレ
オチド塩基配列Ａ２とからなる連続する特定の塩基配列
Ａ１ＩNＡ２を有する被検体を検出する、第１のプロー
ブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにおい
て、(1) 前記第１プローブが、前記Ａ１と相補的な塩
基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端にエネルギ
ーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ(a)
前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮
合多環式炭化水素系色素であり、かつ(b) 前記エネル
ギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を形
成させた場合の直径が、１２〜１００オングストローム
の範囲であり、(2) 前記第２プローブが、前記Ａ２と
相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端
にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、(3)
前記１組のプローブと前記被検体とのハイブリッド体の
前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エネルギーア
クセプター性蛍光色素へのの蛍光エネルギー 移動の移
動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減少することを特
徴とする、検出プローブを提供するものである。[0010] The present invention also relates to a probe comprising the first oligonucleotide base sequence A1 and the N bases, wherein the first oligonucleotide base sequence A1 is different from the above-described probe in the structure of only one bond between the energy acceptor and the energy donor fluorescent dye. the oligonucleotide sequences I N (N consisting of 0-1
5) and a first probe and a second probe, which detect an analyte having a continuous specific nucleotide sequence A1I N A2 composed of the specific second oligonucleotide nucleotide sequence A2 of the analyte. In one set of detection probes, (1) the first probe has a base sequence B1 complementary to the A1, and is labeled with an energy-accepting fluorescent dye at the 5 ′ end of the B1, and (a)
The energy-accepting fluorescent dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon-based dye, and (b) the diameter when forming a sphere enclosing or including the energy-accepting fluorescent dye is 12 (2) the second probe has a base sequence B2 complementary to the A2, and is labeled with an energy donor fluorescent dye at the 3 ′ end of the B2, (3) )
The transfer efficiency of the transfer of the fluorescent energy from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye of the hybrid of the one set of probe and the analyte monotonously decreases with the increase of the N Which provides a detection probe.
【００１１】さらに、上記前記エネルギーアクセプター
性蛍光色素の最大径を直径とする球とした際の、前記直
径においてより好ましい範囲として１２〜１００オング
ストローム以上のものが含まれる。Further, when the above-mentioned energy acceptor fluorescent dye is formed into a sphere having a maximum diameter as a diameter, a more preferable range of the diameter is 12 to 100 angstroms or more.
【００１２】また、本発明は、前記エネルギーアクセプ
ター性蛍光色素が、ペリレン、パイセン、ペンタフェ
ン、ペンタセン、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ル
ビセン、コロネン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘ
プタセン、ピランスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフ
ェニルナフタレン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビ
アントラニル、9,10-ジナフチルアントラセン、ルブレ
ン、1,3,6,8-テトラフェニルピレン、ビピレニル、o-フ
ェニレンピレン、アンサンスレン、3,3'-ビフルオロア
ンセニル、デカサイクレンからなる群から選択される基
を有するものであることを特徴からなる群から選択され
る基を有するものであることを特徴とする検出プローブ
を提供するものである。Further, the present invention provides the above-mentioned energy acceptor fluorescent dye, wherein the perylene, paisene, pentaphene, pentacene, tetraphenylene, hexaphene, rubicene, coronene, trinaphthylene, heptafen, heptacene, pyranthrene, ovalene, 1,4,5 , 8-Tetraphenylnaphthalene, 9,10-diphenylanthracene, bianthranyl, 9,10-dinaphthylanthracene, rubrene, 1,3,6,8-tetraphenylpyrene, bipyrenyl, o-phenylenepyrene, anthanthrene, 3 , 3'-bifluoroanthenyl, having a group selected from the group consisting of decacyclene, and a detection probe characterized by having a group selected from the group consisting of: It is.
【００１３】さらに、本発明は、前記エネルギーアクセ
プター性蛍光色素が、ペリレン基を有し、かつ前記エネ
ルギードナー性蛍光色素が、ピレン基を有することを特
徴とする検出プローブを提供するものである。Further, the present invention provides a detection probe, wherein the energy acceptor fluorescent dye has a perylene group, and the energy donor fluorescent dye has a pyrene group. .
【００１４】さらに、本発明は、上記本発明に係るプロ
ーブを用いて被検体を検出する方法を提供するものであ
る。Further, the present invention provides a method for detecting an object using the probe according to the present invention.
【００１５】本明細書において使用される、「エネルギ
ードナー性蛍光色素」、又は「エネルギーアクセプター
性蛍光色素」とは、それぞれ「蛍光共鳴エネルギー移動
ドナー性蛍光色素」、又は「蛍光共鳴エネルギー移動ア
クセプター性蛍光色素」を意味するものとする。As used herein, "energy donor fluorescent dye" or "energy acceptor fluorescent dye" refers to "fluorescence resonance energy transfer donor fluorescent dye" or "fluorescence resonance energy transfer acceptor," respectively. Fluorescent dye ".
【００１６】以下、本発明を、実施の形態に即してより
詳しく説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to embodiments.
【００１７】[0017]
【発明の実施の形態】特定のオリゴヌクレオチド配列を
有する標的核酸 本発明においては標的核酸の種類については、特に制限
はされず、各種の核酸（ＤＮＡ，ＲＮＡ、オリゴヌクレ
オチド等）に適用可能である。また標的核酸の長さにお
いても特に制限はなく目的に応じて、適当な処理により
適当な長さに調製したものにも使用可能である。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Target Nucleic Acid Having In the present invention, the type of target nucleic acid is not particularly limited, and can be applied to various nucleic acids (DNA, RNA, oligonucleotides, etc.). There is no particular limitation on the length of the target nucleic acid, and it can be used for one prepared to an appropriate length by an appropriate treatment according to the purpose.
【００１８】本発明は図１にその概念が示されるよう
に、被検体（又は標的核酸、又はターゲット）中の特定
のポリヌクレオチド塩基配列（図１では連続するＡ１Ｉ
NＡ２）を検出する方法であって、この特定のポリヌク
レオチド塩基配列とハイブリダイズ可能な塩基配列を有
する２種類のプローブ（プローブ１と２）を用いるもの
である（図１では、塩基配列Ｂ１、Ｂ２とする）。従っ
て、この特定のポリヌクレオチド配列はあらかじめ知ら
れている必要があるが、その数については特に制限はな
い。充分な認識を可能とするためには、少なくとも２０
塩基数あればよい。さらに好ましくは３０塩基以上であ
る。またその特定のポリヌクレオチドの標的核酸中での
位置についても特に制限はない。末端付近でも中間部分
でもよい。As shown in FIG. 1, the concept of the present invention is to use a specific polynucleotide base sequence (a continuous A1I in FIG. 1) in a subject (or a target nucleic acid or a target).
A method for detecting the N A2), in this particular polynucleotide base sequences of two and a hybridizable with the base sequence of the probe (probe 1 and 2) is to use a (FIG. 1, the base sequence B1 , B2). Thus, this particular polynucleotide sequence must be known in advance, but the number is not particularly limited. In order to allow for full recognition, at least 20
What is necessary is just the number of bases. More preferably, it has 30 bases or more. There is no particular limitation on the position of the specific polynucleotide in the target nucleic acid. It may be near the end or in the middle.
【００１９】さらに、本発明に係る方法を使用する際に
は、ハイブリダイズさせるために少なくとも上記特定の
ポリヌクレオチド配列部分は１本鎖である必要がある
が、標的核酸が２本鎖である場合には、通常の、熱また
はアルカリ変性等の方法により容易に１本鎖とすること
が可能である。Furthermore, when using the method according to the present invention, at least the above-mentioned specific polynucleotide sequence portion needs to be single-stranded for hybridization, but when the target nucleic acid is double-stranded, Can be easily made into a single chain by a usual method such as heat or alkali denaturation.
【００２０】また、本発明において、特定のポリヌクレ
オチド塩基配列を検出するとは、図１に示されるよう
に、被検体中の特定の塩基配列が、中間のいくつかの不
特定の塩基で離されて存在する場合（図１中ＩNで表さ
れている）において、その中間に存在する塩基の数（図
中Ｎで表され、Ｎが０、すなわち係るＩN配列が存在し
ない場合も含むものである）を正確に測定することも意
味するものである。In the present invention, to detect a specific polynucleotide base sequence means, as shown in FIG. 1, that a specific base sequence in a subject is separated by some intermediate unspecified bases. 1 (indicated by IN in FIG. 1), the number of bases present in the middle thereof (indicated by N in the figure and N is 0, that is, includes the case where such an IN sequence does not exist) ) Also means to measure accurately.
【００２１】検出プローブ 本発明に係る検出プローブは、その１つの態様が図１に
示されるように、１組２種類のオリゴヌクレオチドから
なるプローブ（プローブ１およびプローブ２）である。
被検体中の特定のオリゴヌクレオチド塩基配列とハイブ
リダイズし認識するためのオリゴヌクレオチド塩基配列
（Ｂ１、Ｂ２）を有し、かつ蛍光検出のためにそれぞれ
蛍光色素でラベル化されているものである。図１では、
一例としてプローブ１にエネルギードナー性蛍光色素
（Ｄ）が結合し、またプローブ２にエネルギーアクセプ
ター性蛍光色素（Ａ）が結合しているものを示した。当
然、本発明においては、上記（Ｄ）及び（Ａ）が相違す
るプローブに結合したプローブも含まれる。 Detection Probe The detection probe according to the present invention is a probe (probe 1 and probe 2) composed of a set of two types of oligonucleotides, as shown in FIG.
It has an oligonucleotide base sequence (B1, B2) for hybridizing and recognizing a specific oligonucleotide base sequence in a subject, and is labeled with a fluorescent dye for fluorescence detection. In FIG.
As an example, an example in which an energy donor fluorescent dye (D) is bound to probe 1 and an energy acceptor fluorescent dye (A) is bound to probe 2 is shown. Naturally, the present invention also includes a probe bound to a different probe from the above (D) and (A).
【００２２】（塩基配列）さらに、図１に示すように、
プローブ１は標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列部
分Ａ１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、また、プローブ
２は標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列部分Ａ２と
相補的な塩基配列Ｂ２を有することから、これら２種類
のプローブは上記の特定のポリヌクレオチド配列部分Ａ
１、Ａ２と連続して、又は中間塩基部分（ＩN）を介し
てハイブリダイゼーションし、ハイブリッド体を形成す
るものである。(Base Sequence) Further, as shown in FIG.
Probe 1 has a base sequence B1 complementary to a specific polynucleotide sequence portion A1 of a target nucleic acid, and Probe 2 has a base sequence B2 complementary to a specific polynucleotide sequence portion A2 of a target nucleic acid. And these two types of probes correspond to the specific polynucleotide sequence portion A described above.
1, hybridizes with A2 continuously or via an intermediate base portion ( IN ) to form a hybrid.
【００２３】それぞれのプローブの塩基配列の数には特
に制限はない。本発明においては、塩基配列数は約１０
以上あればよく、好ましくは１５以上である。塩基数が
少ない場合は充分な特異的認識作用がなく、またあまり
に多いと取扱性、保存性などに問題を生じるからであ
る。The number of base sequences of each probe is not particularly limited. In the present invention, the number of base sequences is about 10
More than 15 is preferable, and it is preferably 15 or more. This is because when the number of bases is small, there is no sufficient specific recognition action, and when the number is too large, problems arise in handleability and storage stability.
【００２４】なお、ここではプローブ１及びプローブ２
はそれぞれ別々のものとして説明したが、プローブ１の
３’末端とプローブ２の５’末端が適当なリンカーで結
合した１つのプローブであってもよい（図示せず）。Here, probe 1 and probe 2
Are described separately, but may be one probe in which the 3 ′ end of probe 1 and the 5 ′ end of probe 2 are bound by an appropriate linker (not shown).
【００２５】また、中間塩基部分ＩNについてもその数
Ｎについては特に制限はない。その最小値は０の場合で
あり、これはプローブ１および２の間に介在する塩基配
列がない場合の被検体をも含むことを意味する。被検体
の存在を検出する目的で使用する場合は、図４に示され
るように、蛍光エネルギー移動効率が最大となるＮが０
または１のプローブが好ましいプローブの構成となる。Further, no particular limitation is also the number N the intermediate base moiety I N. The minimum value is the case of 0, which means that the specimen includes no intervening base sequence between the probes 1 and 2. When used for the purpose of detecting the presence of the subject, as shown in FIG.
Alternatively, one probe is a preferred probe configuration.
【００２６】また使用可能なＮの最大値は、使用する蛍
光色素の組合せによる。具体的には、実施例で示すよう
な方法で、種々のＮ値において蛍光エネルギー移動（転
移）効率の測定を行い、その結果該効率が有意の値を示
す場合の最大のＮの値を求めることが可能となる。以下
で説明する実施例の場合はその値（Ｎ）は１０である。The maximum value of N that can be used depends on the combination of fluorescent dyes used. Specifically, the fluorescence energy transfer (transfer) efficiency is measured at various N values by the method shown in the examples, and as a result, the maximum N value when the efficiency shows a significant value is obtained. It becomes possible. In the case of the embodiment described below, the value (N) is 10.
【００２７】また、図４に示されるように、一連のＮ値
を有するプローブを用いてエネルギー転移効率とＮ値の
間の関係を確立した後は、Ｎ値が未知の被検体の測定に
おいても測定された転移効率から、Ｎ値が推定可能とな
る。After establishing the relationship between the energy transfer efficiency and the N value using a series of probes having N values, as shown in FIG. From the measured transfer efficiency, the N value can be estimated.
【００２８】（蛍光色素）本発明に係るプローブ１はそ
の５’末端にエネルギードナー性の蛍光色素を結合し、
またプローブ２はその３’末端にエネルギーアクセプタ
ー性の蛍光色素を結合するものである（具体的一例が図
１に示される）。なお、プローブ１にその５’末端にエ
ネルギーアクセプター性の蛍光色素を結合し、またプロ
ーブ２はその３’末端にエネルギードナー性の蛍光色素
を結合するものも可能であるが、以下、プローブ１にそ
の５’末端にエネルギードナー性の蛍光色素を結合し、
またプローブ２にその３’末端にエネルギーアクセプタ
ー性の蛍光色素を結合したもので説明する。(Fluorescent Dye) The probe 1 according to the present invention has an energy donor fluorescent dye bound to its 5 ′ end,
The probe 2 has a fluorescent dye having an energy acceptor property bonded to its 3 ′ end (a specific example is shown in FIG. 1). It should be noted that the probe 1 may have an energy acceptor fluorescent dye bonded to its 5 ′ end, and the probe 2 may have an energy donor fluorescent dye bonded to its 3 ′ end. Has an energy donor fluorescent dye bonded to its 5 'end,
In addition, the description will be made by using a probe 2 in which a fluorescent dye having an energy acceptor property is bonded to its 3 ′ end.
【００２９】係るエネルギードナー性、及びエネルギー
アクセプター性色素は、該エネルギードナー蛍光色素の
励起に基づきＦＲＥＴ現象によりエネルギーアクセプタ
ー性蛍光色素から蛍光を発生可能とするものである。係
る蛍光色素は、主として、大きなストークスシフト、高
い量子収率、高い消衰係数、及び放射光波長、励起波長
等を考慮して適時選択可能である。The energy donor property and the energy acceptor dye enable the energy acceptor fluorescent dye to generate fluorescence by the FRET phenomenon based on the excitation of the energy donor fluorescent dye. Such a fluorescent dye can be appropriately selected mainly in consideration of a large Stokes shift, a high quantum yield, a high extinction coefficient, a radiation wavelength, an excitation wavelength, and the like.
【００３０】上記エネルギードナー性蛍光色素として
は、特に制限はなく、下記エネルギーアクセプター性色
素の蛍光帯とほぼ一致する吸収帯を有する色素であれば
よい。具体的には、エネルギードナー性蛍光色素／エネ
ルギーアクセプター性色素の好ましい組合せとして、ピ
レン(Pyrene)／アンスアンスラセン(anthanthrene)、ペ
リレン(Perylene)／ルブレン(rubrene)、３−フェニル
フルオランテン(3-phenylfluoranthene)／ルブレン(rub
rene)等が挙げられる。本発明においては、特にピレン
が好ましい。The energy donor fluorescent dye is not particularly limited, and may be any dye having an absorption band that substantially matches the fluorescent band of the following energy acceptor dye. Specifically, as preferred combinations of the energy donor fluorescent dye / energy acceptor dye, pyrene / anthanethrene, Perylene / rubrene, 3-phenylfluoranthene ( 3-phenylfluoranthene) / rubrene (rub
rene) and the like. In the present invention, pyrene is particularly preferred.
【００３１】また、本発明においては以下の条件を満た
すエネルギーアクセプター性色素が好ましく使用でき
る。すなわち、 (i) 色素が非イオン性の縮合多環式炭化水素系である
こと。In the present invention, an energy acceptor dye satisfying the following conditions can be preferably used. That is, (i) the dye is a nonionic fused polycyclic hydrocarbon system.
【００３２】(ii) 色素の分子サイズが、被検体と、プ
ローブ１及びプローブ２により形成されるハイブリッド
の２本鎖内の疎水性領域（グルーブ）よりも十分大き
く、該色素分子が該ハイブリッド２本鎖の外側に向いて
いること。(Ii) The molecular size of the dye is sufficiently larger than the hydrophobic region (groove) in the double strand of the hybrid formed by the analyte and probe 1 and probe 2, and the dye molecule is It faces the outside of the main chain.
【００３３】係る条件を満たす蛍光色素分子としては、
少なくとも５個以上のベンゼン環、又はベンゼン環と同
等の芳香族環を有する縮合多環式炭化水素が挙げられ
る。具体的には、ペリレン、パイセン、ペンタフェン、
ペンタセン、テトラフェニレン、ヘキサフェン、ルビセ
ン、コロネン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタ
セン、ピランスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフェニ
ルナフタレン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビアン
トラニル（例えば9,9'-ビアントラニル）、9,10-ジナフ
チルアントラセン、ルブレン、1,3,6,8-テトラフェニル
ピレン、ビピレニル、o-フェニレンピレン、アンサンス
レン、3,3'-ビフルオロアンセニル、デカサイクレンが
好ましく、より好ましくはペリレンが挙げられる。ここ
で、ベンゼン環と同等の芳香族環とは、炭素数６のベン
ゼン環のみならず、炭素数６〜８個の芳香族環をも含む
ものである。また、炭素以外のヘテロ原子（Ｓ、Ｎ、Ｏ
等）を含む芳香族環をも含むものである。Fluorescent dye molecules satisfying such conditions include:
A condensed polycyclic hydrocarbon having at least five or more benzene rings or an aromatic ring equivalent to the benzene ring is exemplified. Specifically, perylene, paisen, pentaphene,
Pentacene, tetraphenylene, hexaphene, rubicene, coronene, trinaphthylene, heptaphen, heptacene, pyranthrene, ovalene, 1,4,5,8-tetraphenylnaphthalene, 9,10-diphenylanthracene, bianthranyl (for example, 9,9′-bi Anthranyl), 9,10-dinaphthylanthracene, rubrene, 1,3,6,8-tetraphenylpyrene, bipyrenyl, o-phenylenepyrene, anthansulene, 3,3′-bifluoroanthenyl, decacyclene are preferred, and more Preferably, perylene is used. Here, the aromatic ring equivalent to the benzene ring includes not only a benzene ring having 6 carbon atoms but also an aromatic ring having 6 to 8 carbon atoms. In addition, hetero atoms other than carbon (S, N, O
And the like.
【００３４】さらに、上記のエネルギードナー性蛍光色
素との組合せにおいては、大きなストークスシフト、高
い量子収率、高い消衰係数を有する組合せ、及び放射光
波長、励起波長等を考慮して適時選択可能である。Further, in combination with the above-mentioned energy-donating fluorescent dye, a combination having a large Stokes shift, a high quantum yield and a high extinction coefficient, and a timely selection can be made in consideration of the emission light wavelength, the excitation wavelength, and the like. It is.
【００３５】係るエネルギーアクセプター蛍光色素を選
択した場合、以下に説明するように、ＦＲＥＴ現象のエ
ネルギー転移効率が、蛍光色素環の距離に従い減少し、
Foersterの理論式に一致するものとなる。When such an energy acceptor fluorescent dye is selected, as described below, the energy transfer efficiency of the FRET phenomenon decreases with the distance of the fluorescent dye ring,
This is consistent with Foerster's theoretical formula.
【００３６】すなわち、該色素が非イオン性であること
は、ハイブリダイズ条件が種々のpHで行われても係るpH
の変化に影響されにくいこととなる。実際、通常の蛍光
色素ラベル化基がイオン解離基を有しているものが多
く、pHの変化に大きく影響されることと比較して本発明
に係るプローブが高感度、高認識の検出に適しているも
のである。That is, the fact that the dye is non-ionic means that the hybridization is carried out at various pHs.
Is less susceptible to changes. In fact, many of the usual fluorescent dye labeling groups have an ion-dissociating group, and the probe according to the present invention is more suitable for high-sensitivity and high-recognition detection compared to being greatly affected by a change in pH. Is what it is.
【００３７】また、本発明に係るエネルギーアクセプタ
ー性色素の特徴としては、その分子の大きさが、被検体
と、プローブ１及びプローブ２により形成されるハイブ
リッドの２本鎖内に形成されるいわゆる疎水性領域（グ
ルーブ）よりも十分大きいものであり、従って該色素分
子が該ハイブリッド２本鎖の該疎水性領域とは相互作用
できず、外側に向いていることである。The energy acceptor dye according to the present invention is characterized in that its molecular size is different from that of a so-called hybrid formed by the analyte and the probe 1 and the probe 2 in the double strand. It is much larger than the hydrophobic region (groove), so that the dye molecule cannot interact with the hydrophobic region of the hybrid duplex and is facing outward.
【００３８】従って疎水領域以上の分子サイズを有する
蛍光色素はその疎水性領域とは相互作用しにくいことに
なる。その結果、エネルギードナー蛍光色素からの蛍光
エネルギー移動がfoersterの理論が予想するように生じ
ることとなるものである。Therefore, a fluorescent dye having a molecular size larger than the hydrophobic region hardly interacts with the hydrophobic region. The result is that fluorescence energy transfer from the energy donor fluorescent dye occurs as expected by foerster's theory.
【００３９】その結果、Foersterの理論式が適用可能と
なり、前記Ｎが０の場合に最もエネルギー転移効率が高
く、Ｎが増加するにともないエネルギー転移効率が減少
することなる。As a result, the Foerster's theoretical formula can be applied. When N is 0, the energy transfer efficiency is the highest, and the energy transfer efficiency decreases as N increases.
【００４０】係る色素を選択する場合においては、色素
分子の大きさを、例えば、エネルギーアクセプター性蛍
光色素を内接又は内包する球を形成させたとした場合
を、通常公知の分子模型、分子計算等を用いて見積り、
その直径が１２オングストローム以上、好ましくは１５
オングストローム以上のものである。また、あまりに大
きい場合は溶解性、取扱性等が困難となることから、約
１００オングストローム以下であることが好ましい。In the case of selecting such a dye, the size of the dye molecule, for example, when a sphere enclosing or enclosing an energy acceptor fluorescent dye is formed, is generally known in the art of molecular models and molecular calculations. Etc.
Its diameter is more than 12 Å, preferably 15
More than Angstrom. On the other hand, if it is too large, it becomes difficult to dissolve and handle easily. Therefore, it is preferably about 100 Å or less.
【００４１】さらに、色素が非イオン性の縮合多環式炭
化水素系であり、他の置換基がない場合、またはアルキ
ル基等の置換基のみの場合には、該色素分子の大きさは
その色素基の計算上の分子量を用いても推定可能であ
る。具体的には、ペリレン（C2 0H12）が２５２であり、
少なくともこの値以上であることが好ましい。Further, when the dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon system and has no other substituent or only a substituent such as an alkyl group, the size of the dye molecule is increased. It can also be estimated using the calculated molecular weight of the dye group. Specifically, perylene (C 2 0 H 12 ) is 252,
It is preferably at least this value.
【００４２】（リンカー）本発明において上記２種類の
蛍光色素は、各プローブに適当な長さのリンカーを介し
て結合してもよい。ここでリンカーの種類、形状等には
特に制限はない。プローブと標的核酸をハイブリダイズ
する条件、及び蛍光測定条件等において充分強固な結合
性を有していればよい。(Linker) In the present invention, the above two types of fluorescent dyes may be bonded to each probe via a linker having an appropriate length. Here, the type, shape, and the like of the linker are not particularly limited. It is sufficient that the probe has sufficiently strong binding properties under conditions for hybridizing the probe and the target nucleic acid and under conditions for measuring fluorescence.
【００４３】具体的には、アミド結合、エステル結合、
エーテル結合等の通常の化学結合を利用したものが好ま
しいが、特に限定されるものではない。Specifically, an amide bond, an ester bond,
Those using ordinary chemical bonds such as an ether bond are preferable, but are not particularly limited.
【００４４】（プローブ間の距離）本発明に係る２種類
のプローブは、標的核酸たる被検体上で特定の位置を有
するようにハイブリダイズするものであるが、必ずしも
連続してハイブリダイズする必要はない。すなわち、標
的核酸の特定のポリヌクレオチド配列Ａ１とＡ２と連続
してハイブリダイズする場合と、上記塩基配列Ａ１とＡ
２間にさらにいくつかの不特定の塩基配列ＩNを介して
ハイブリダイズする場合とが可能である。(Distance between Probes) The two types of probes according to the present invention hybridize so as to have a specific position on the target nucleic acid, but it is not always necessary to continuously hybridize. Absent. That is, the case where the specific nucleotide sequence A1 and A2 of the target nucleic acid are continuously hybridized,
It is possible in the case of hybridizing through further several unspecified nucleotide sequence I N between 2.
【００４５】この場合、２種類の蛍光色素間の距離（又
はＮ値）と、エネルギー転移効率にはFoersterの理論式
が適当可能となるため、その転移効率の測定から、Ｎ値
すなわち色素間の塩基数（距離）が推定可能となるもの
である。In this case, the distance (or N value) between the two types of fluorescent dyes and the Foerster's theoretical formula can be appropriately applied to the energy transfer efficiency. The number of bases (distance) can be estimated.
【００４６】（ハイブリダイズの条件）本発明におい
て、本発明に係る１組のプローブと標的核酸とのハイブ
リダイズ条件は特に制限なく通常の条件を使用可能であ
る。例えば、「分子生物学実験マニュアル」（川上正也
監修；講談社）１７２ページに記載の方法に準じて、ま
たは修正して使用できる。(Conditions for Hybridization) In the present invention, the conditions for hybridization between the set of probes according to the present invention and the target nucleic acid are not particularly limited, and ordinary conditions can be used. For example, it can be used according to the method described on page 172 of "Molecular Biology Experiment Manual" (supervised by Masaya Kawakami; Kodansha) or modified.
【００４７】（検出方法）本発明に係る標的核酸の検出
方法は、図１に模式的に示されるように、本発明に係る
検出プローブを用いるものであって、前記１組のプロー
ブが標的核酸の特定のポリヌクレオチド配列Ａ１とＡ２
にハイブリダイズさせ（連続して、又は適当な不特定塩
基配列を介して）、得られるハイブリダイズ体の蛍光ス
ペクトルを測定するものである。(Detection Method) The method for detecting a target nucleic acid according to the present invention uses a detection probe according to the present invention, as schematically shown in FIG. Specific polynucleotide sequences A1 and A2 of
(Continuously or via an appropriate unspecified base sequence), and the fluorescence spectrum of the obtained hybrid is measured.
【００４８】すなわち、エネルギードナー性蛍光色素を
光励起する条件にて、上記ハイブリダイズ体（ハイブリ
ッド体）の蛍光スペクトルを測定するものである。That is, the fluorescence spectrum of the above-mentioned hybrid body (hybrid body) is measured under the condition of exciting the energy donor fluorescent dye with light.
【００４９】ここで、あらかじめ測定して作成した、蛍
光色素間の距離と、蛍光色素間のエネルギー転移効率と
の検量線に基づき、(1)特定の塩基配列Ａ１Ａ２が存在
するかどうか、また(2)Ａ１とＡ２間にいくつの塩基配
列が存在するかが解析可能となる。具体的には、以下の
実施例で使用したプローブにおいては、色素間に塩基数
が０個から少なくとも１０個存在することが解析可能と
なる。Here, based on the calibration curve of the distance between the fluorescent dyes and the energy transfer efficiency between the fluorescent dyes, which was previously measured and prepared, (1) whether or not a specific base sequence A1A2 exists; 2) It becomes possible to analyze how many base sequences exist between A1 and A2. Specifically, in the probe used in the following examples, it can be analyzed that the number of bases is 0 to at least 10 between the dyes.
【００５０】また、標的核酸の存在を検出する目的にお
いては、該蛍光色素間のエネルギー移動が生じているこ
とを判別すればよく、この目的においては、色素間の塩
基数が少ない程エネルギー転移効率がよく従って、塩基
数が０又は１のプローブが好ましい。For the purpose of detecting the presence of the target nucleic acid, it is sufficient to determine that energy transfer has occurred between the fluorescent dyes. For this purpose, the smaller the number of bases between the dyes, the higher the energy transfer efficiency. Therefore, a probe having 0 or 1 base is preferable.
【００５１】以下実施例に基づき本発明を具体的に説明
するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例
に限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist.
【００５２】[0052]
【実施例】(1) 以下のオリゴヌクレオチドの合成は、
一般的に、ホスホロアミダイト固相合成法による自動核
酸合成機にて合成し、イオン交換ＨＰＬＣにて精製（純
度９９％以上）した。EXAMPLES (1) The synthesis of the following oligonucleotides
Generally, it was synthesized by an automatic nucleic acid synthesizer using a phosphoramidite solid-phase synthesis method, and purified by ion exchange HPLC (purity: 99% or more).
【００５３】 標的核酸： 5'-TTTGATCCCGGCGCGAAAGATCCGAACGCAAT-3'（以下、Tarとする） 5'-TTTGATCCCGGCGCGA(T)NAAGATCCGAACGCAAT-3'（Ｎ＝１〜１０） プローブ： 5'-ATTGCGTTCGGATCTU-3'（以下、P3とする）及び 5'-TCGCGCCGGGATCAAA-3'(以下、P5とする） 上記２つのプローブの末端へ以下の色素を結合した。Target nucleic acid: 5′-TTTGATCCCGGCGCGAAAGATCCGAACGCAAT-3 ′ (hereinafter referred to as Tar) 5′-TTTGATCCCGGCGCGA (T) N AAGATCCGAACGCAAT-3 ′ (N = 1 to 10) Probe: 5′-ATTGCGTTCGGATCTU-3 ′ , P3) and 5′-TCGCGCCGGGATCAAA-3 ′ (hereinafter, referred to as P5) The following dyes were bonded to the ends of the above two probes.
【００５４】P3の3'末端へは1-pyrenebutanoic acid
を、carbonyldiimidazole法(CDI法）により導入した（G
ottikh等、Tetrahedron 26,4419-4433)。得られた色素
導入プローブをPBuA-P3とする。1-pyrenebutanoic acid is added to the 3 'end of P3
Was introduced by the carbonyldiimidazole method (CDI method) (G
ottikh et al., Tetrahedron 26,4419-4433). The obtained dye-introduced probe is designated as PBuA-P3.
【００５５】さらに、P5の5'末端にはN-(1-perylenemet
hyl)-iodoacetamideを導入した（Czworkwski等、Bioche
mistry 30,4821-4830,1991）。得られた色素導入プロー
ブをPEMIA-P5とする。Further, N- (1-perylenemet) is added to the 5 'end of P5.
hyl) -iodoacetamide (Czworkwski et al., Bioche
mistry 30,4821-4830,1991). The obtained dye-introduced probe is designated as PEMIA-P5.
【００５６】(2) 標準ハイブリダイゼーション溶液（1
0 mM phosphate buffer(pH7.0)、0.2M NaCl, 20%(v/v)d
imethylformamide(DMF)、以下STDsolnとする）を調製
し、100nMのPEMIA-P5、PBuA-P3 および100 nMのTarを
溶解し、得られた溶液の蛍光スペクトルを測定した。結
果を図２、３に示す。ペリレンの蛍光ピーク(488 nm)で
モニターした図２の励起スペクトルから明らかなよう
に、Tarが存在する（すなわち、ハイブリッド形成した
ことを意味する）場合にのみ認められる300から360nmに
かけての励起帯が存在する。この励起帯は、ピレン残基
の蛍光ピーク(368nm)でモニターした場合の励起スペク
トル（図３）と同一であり、PBuA-P3の吸収スペクトル
との一致する。この結果は、ハイブリダイゼーションに
よってピレン残基とペリレン残基が接近した場合にのみ
認められる励起帯で、ピレンからペリレンへの蛍光エネ
ルギー移動に起因している。(2) Standard hybridization solution (1
0 mM phosphate buffer (pH7.0), 0.2M NaCl, 20% (v / v) d
imethylformamide (DMF), hereinafter referred to as STDsoln) was prepared, 100 nM of PEMIA-P5, PBuA-P3 and 100 nM of Tar were dissolved, and the fluorescence spectrum of the obtained solution was measured. The results are shown in FIGS. As is evident from the excitation spectrum of FIG. 2 monitored at the perylene fluorescence peak (488 nm), the excitation band from 300 to 360 nm, which is only observed when Tar is present (ie, indicates hybridization), Exists. This excitation band is the same as the excitation spectrum (FIG. 3) when monitored by the fluorescence peak (368 nm) of the pyrene residue, and coincides with the absorption spectrum of PBuA-P3. This result is an excitation band observed only when the pyrene residue and the perylene residue approach each other due to hybridization, and is caused by fluorescence energy transfer from pyrene to perylene.
【００５７】(3) Tar 32-merの中央部分に余分の挿入
配列（thymine oligodeoxyribonucleotides)を導入した
ターゲットとプローブとのハイブリッド形成における励
起スペクトルを測定した（図示せず）。挿入配列のない
場合の励起ピーク（347 nm)の強度とTarを添加しない場
合の347 nmにおける強度の比はPBuA-P3とPEMIA-P5との3
47 nmでの分子吸光係数の比がほぼ一致していた。この
結果は、２つの蛍光色素が最接近した場合に、エネルギ
ー転移効率が100%であり、Tarのない場合には、転移効
率が0%となることを意味する（Stryer等、Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,58,719-726(1967)）。そこでTarに対する挿入
配列の数と励起ピーク(347 nm)でのエネルギー転移効率
の関係図示すると図４となる。すなわち、挿入配列の数
が増加し、２つの蛍光色素間の距離が増加すると転移効
率が減少する。(3) The excitation spectrum in the hybridization between the target and the probe in which an extra insertion sequence (thymine oligodeoxyribonucleotides) was introduced into the central part of the Tar 32-mer was measured (not shown). The ratio of the intensity of the excitation peak (347 nm) without the inserted sequence to the intensity at 347 nm without the addition of Tar was 3 times for PBuA-P3 and PEMIA-P5.
The ratio of the molecular extinction coefficients at 47 nm was almost the same. This result indicates that the energy transfer efficiency is 100% when the two fluorescent dyes come closest, and that the transfer efficiency is 0% when there is no Tar (Stryer et al., Proc. Natl. Ac
ad.Sci., 58, 719-726 (1967)). FIG. 4 shows the relationship between the number of insertion sequences for Tar and the energy transfer efficiency at the excitation peak (347 nm). That is, the transfer efficiency decreases as the number of inserted sequences increases and the distance between the two fluorescent dyes increases.
【００５８】さらに、係る結果を解析するために、次式
からフェルスター距離を求めた。Further, in order to analyze the results, the Forster distance was obtained from the following equation.
【００５９】 R0 6＝(8.79x105)・κ2・η4・ΦDxJ （オングストローム） ここで、Roはフェルスター距離、κは配向因子でdonor
双極子とacceptor双極子の転移効率における配向に依存
する定数を示す。また、ηは溶媒の屈折率で、本実験で
は1.36である（Abbe屈折計で測定）。ΦDはdonor蛍光の
量子収率であり、本実験では、0.0201であった。Jはdon
orの蛍光スペクトルとacceptorの励起スペクトルとの重
なり部分の積分値である。R 0 6 = (8.79 × 10 5 ) · κ 2 · η 4 · Φ D xJ (Angstrom) where Ro is the Förster distance and κ is the orientation factor.
Fig. 3 shows orientation-dependent constants in the transfer efficiency of dipoles and acceptor dipoles. Η is the refractive index of the solvent, which is 1.36 in this experiment (measured with an Abbe refractometer). Φ D is the quantum yield of donor fluorescence, which was 0.0201 in this experiment. J is don
This is the integral value of the overlap between the fluorescence spectrum of or and the excitation spectrum of the acceptor.
【００６０】 J＝｛∫fD(λ)・εA(λ)・λ4・dλ｝／｛∫fD(λ)dλ｝ (2) ここで、λはcm単位で表した場合の波長を表す。ε
A(λ)はacceptorの分子吸光係数(M-1・cm-1)を表す。f
D(λ)は単位波長あたりのdonorの補正蛍光スペクトルの
量子収率（全面積を１に規格化）を表す。実験により各
パラメータを求めて、配向因子についてはランダム配向
を仮定すると、R0は20.9オングストロームであった。J = ｛∫f D (λ) · ε A (λ) · λ 4 · dλ｝ / ｛∫f D (λ) dλ｝ (2) where λ is the wavelength in cm. Represents ε
A (λ) represents the molecular extinction coefficient (M −1 · cm −1 ) of the acceptor. f
D (λ) represents the quantum yield of the corrected fluorescence spectrum of the donor per unit wavelength (the entire area is normalized to 1). R 0 was 20.9 Å, assuming random orientation as an orientation factor by calculating each parameter by experiments.
【００６１】ここで塩基間隔が塩基数に比例すると仮定
すると、 R＝a＋bN (3) となる。Here, assuming that the base interval is proportional to the number of bases, R = a + bN (3).
【００６２】ここでRは色素間の距離（オングストロー
ム）で、aとbは比例定数である。Nは挿入した塩基の数
を示す。転移効率とR0の関係式は、 E＝R0 6／（R0 6＋R6） (4) となる。Here, R is the distance (angstrom) between the dyes, and a and b are proportional constants. N indicates the number of inserted bases. Relationship of transfer efficiency and R 0 is, E = R 0 6 / ( R 0 6 + R 6) become (4).
【００６３】式(3)を式(4)に代入し、NとEの関係を示し
た結果（図４）のカーブフィットを行った。実験結果と
カーブフィットデータがよく一致することが示された。The equation (3) was substituted into the equation (4), and a curve fitting of the result (FIG. 4) showing the relationship between N and E was performed. It was shown that the experimental results and the curve fit data agreed well.
【００６４】この場合、定数aは10.5オングストローム
で、bは1.89オングストロームであった。 また、分子
モデル（ＣＰＫモデル）から、両色素分子の距離は約5
オングストローム程度と予想できるが、定数aの値はそ
れとよく一致する。また、b-typeの２重らせんの塩基間
隔は約3.5オングストロームと予想されるが、ここでは
ＤＮＡは単鎖であり、水溶液中ではbendingしており、
この値よりも小さくなると予想される。このことからも
bの値は一致する。これらの結果から、本実験例での蛍
光エネルギー移動はフェルスターの理論とよく一致する
系であることが明らかである。In this case, the constant a was 10.5 angstroms and b was 1.89 angstroms. From the molecular model (CPK model), the distance between both dye molecules is about 5
It can be expected to be about angstrom, but the value of the constant a agrees well with it. Also, the base spacing of the b-type double helix is expected to be about 3.5 angstroms, but here the DNA is single-stranded and is bent in aqueous solution,
It is expected to be less than this value. From this
The values of b match. From these results, it is clear that the fluorescence energy transfer in this experimental example is a system that is in good agreement with Forster's theory.
【００６５】[0065]
配列番号：1 配列の長さ：32 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TTTGATCCCG GCGCGAAAGA TCCGAACGCA AT 32 配列番号：2 配列の長さ：16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ATTGCGTTCG GATCTU 16 配列番号：3 配列の長さ：16 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 TCGCGCCGGG ATCAAA 16 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 32 Sequence type: Nucleic acid topology: Linear Sequence type: DNA sequence TTTGATCCCG GCGCGAAAGA TCCGAACGCA AT 32 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 16 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Type Sequence type: DNA sequence ATTGCGTTCG GATCTU 16 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 16 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: DNA sequence TCGCGCCGGG ATCAAA 16
【図１】本発明に係るプローブ、およびそれを用いた被
検体の検出を模式的に示す図である。FIG. 1 is a diagram schematically showing a probe according to the present invention and detection of a subject using the probe.
【図２】PEMIA-P5、PBuA-P3及びTar間のハイブリッド体
の励起スペクトルを示す図である。FIG. 2 is a diagram showing an excitation spectrum of a hybrid between PEMIA-P5, PBuA-P3 and Tar.
【図３】PEMIA-P5、PBuA-P3及びTar間の標準ハイブリダ
イーゼション条件下でのハイブリッド体の蛍光スペクト
ルを示す図である。FIG. 3 shows a fluorescence spectrum of a hybrid under standard hybridization conditions between PEMIA-P5, PBuA-P3 and Tar.
【図４】中間塩基配列ＩNのＮ値と、得られる蛍光エネ
ルギー移動効率の関係を示す図である。[Figure 4] and N values of the intermediate base sequence I N, is a diagram showing the relationship of the resulting fluorescent energy transfer efficiency.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification symbol FI // C12N 15/09 C12N 15/00 A
Claims (8)
と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列Ｉ
N（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２
のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する
特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２
が３’末端側）を有する被検体を検出する、第１のプロ
ーブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにお
いて、(1) 前記第１プローブが、前記Ａ１と相補的な
塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共
鳴エネルギードナー性蛍光色素でラベル化され、(2)
前記第２プローブが、前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２
を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギーアクセプ
ター性蛍光色素でラベル化され、かつ(a) 前記エネル
ギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭
化水素系色素であり、かつ(b) 前記エネルギーアクセ
プター性蛍光色素を内接又は内包する球を形成させた場
合の直径が、１２〜１００オングストロームの範囲であ
り、(3) 前記１組のプローブと前記被検体とのハイブ
リッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エ
ネルギーアクセプター性蛍光色素へのの蛍光共鳴エネル
ギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減
少することを特徴とする、検出プローブ。1. A first oligonucleotide base sequence A1
And an oligonucleotide sequence I consisting of N bases
N (N is an integer from 0 to 15) and the second specific
And a continuous specific nucleotide sequence A1I N A2 (A1 is A5 at the 5′-terminal side)
(1) detecting a subject having a 3 ′ end), comprising: a first probe and a second probe, wherein (1) the first probe has a base sequence B1 complementary to A1. And B5 is labeled with a fluorescent resonance energy donor fluorescent dye at the 5 ′ end thereof, (2)
The second probe has a base sequence B2 complementary to the A2.
And the 3 ′ end of B2 is labeled with an energy acceptor fluorescent dye, and (a) the energy acceptor fluorescent dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon dye, and (b) a diameter of a sphere enclosing or enclosing the energy-accepting fluorescent dye is in the range of 12 to 100 Å, and (3) a hybrid of the set of probes and the subject. A detection probe, wherein the transfer efficiency of fluorescence resonance energy transfer from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye in the body monotonically decreases as the N increases.
と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列Ｉ
N（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２
のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する
特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２
が３’末端側）を有する被検体を検出する、第１のプロ
ーブと第２のプローブからなる１組の検出プローブにお
いて、(1) 前記第１プローブが、前記Ａ１と相補的な
塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’末端に蛍光共
鳴エネルギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、
かつ(a) 前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非
イオン性縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ(b)
前記エネルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包
する球を形成させた場合の直径が、１２〜１００オング
ストロームの範囲であり、(2) 前記第２プローブが、
前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２
の３’末端にエネルギードナー性蛍光色素でラベル化さ
れ、(3) 前記１組のプローブと前記被検体とのハイブ
リッド体の前記エネルギードナー性蛍光色素から前記エ
ネルギーアクセプター性蛍光色素へのの蛍光共鳴エネル
ギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い単調に減
少することを特徴とする、検出プローブ。2. The first oligonucleotide base sequence A1
And an oligonucleotide sequence I consisting of N bases
N (N is an integer from 0 to 15) and the second specific
And a continuous specific nucleotide sequence A1I N A2 (A1 is A5 at the 5′-terminal side)
(1) detecting a subject having a 3 ′ end), comprising: a first probe and a second probe, wherein (1) the first probe has a base sequence B1 complementary to A1. And labeled at the 5 ′ end of the B1 with a fluorescent resonance energy acceptor fluorescent dye,
And (a) the energy acceptor fluorescent dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon dye, and (b)
The diameter when forming a sphere inscribed or containing the energy acceptor fluorescent dye is in the range of 12 to 100 Å, (2) the second probe,
Having a base sequence B2 complementary to A2, and
(3) fluorescence from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye of the hybrid of the set of probes and the analyte at the 3 ′ end of A detection probe, wherein the transfer efficiency of resonance energy transfer monotonously decreases with the increase of N.
が、ペリレン、パイセン、ペンタフェン、ペンタセン、
テトラフェニレン、ヘキサフェン、ルビセン、コロネ
ン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピラ
ンスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフェニルナフタレ
ン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビアントラニル、
9,10-ジナフチルアントラセン、ルブレン、1,3,6,8-テ
トラフェニルピレン、ビピレニル、o-フェニレンピレ
ン、アンサンスレン、3,3'-ビフルオロアンセニル、デ
カサイクレンからなる群から選択される基を有するもの
であることを特徴とする請求項１又は２のいずれかに記
載の検出プローブ。3. The method according to claim 1, wherein the energy acceptor fluorescent dye is perylene, paisene, pentaphene, pentacene,
Tetraphenylene, hexaphene, rubicene, coronene, trinaphthylene, heptafen, heptacene, pyranthrene, ovalen, 1,4,5,8-tetraphenylnaphthalene, 9,10-diphenylanthracene, bianthranil,
Selected from the group consisting of 9,10-dinaphthylanthracene, rubrene, 1,3,6,8-tetraphenylpyrene, bipyrenyl, o-phenylenepyrene, anthansulene, 3,3'-bifluoroanthenyl, and decacyclene The detection probe according to claim 1, wherein the detection probe has a group.
が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍
光色素が、ピレン基を有することを特徴とする請求項１
又は２のいずれかに記載の検出プローブ。4. The method according to claim 1, wherein the energy acceptor fluorescent dye has a perylene group, and the energy donor fluorescent dye has a pyrene group.
Or the detection probe according to any of 2.
と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列Ｉ
N（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２
のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する
特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２
が３’末端側）を有する被検体を、第１のプローブと第
２のプローブからなる１組の検出プローブを用いて検出
する方法において、(1) 前記第１プローブが、前記Ａ
１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’
末端に蛍光共鳴エネルギードナー性蛍光色素でラベル化
され、(2) 前記第２プローブが、前記Ａ２と相補的な
塩基配列Ｂ２を有し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネル
ギーアクセプター性蛍光色素でラベル化され、かつ(a)
前記エネルギーアクセプター性蛍光色素が非イオン性
縮合多環式炭化水素系色素であり、かつ(b) 前記エネ
ルギーアクセプター性蛍光色素を内接又は内包する球を
形成させた場合の直径が、１２〜１００オングストロー
ムの範囲であり、(3) 前記１組のプローブと前記被検
体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍光色
素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素へのの蛍
光エネルギー 移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴い
単調に減少することを特徴とする、検出方法。5. The first oligonucleotide base sequence A1
And an oligonucleotide sequence I consisting of N bases
N (N is an integer from 0 to 15) and the second specific
And a continuous specific nucleotide sequence A1I N A2 (A1 is A5 at the 5′-terminal side)
(3 ′ end side) using a set of detection probes consisting of a first probe and a second probe, wherein (1) the first probe is the A
Has a base sequence B1 complementary to 1 and 5 ′ of B1.
(2) the second probe has a base sequence B2 complementary to the A2, and an energy acceptor fluorescent dye at the 3 'end of the B2. And (a)
The energy-accepting fluorescent dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon-based dye, and (b) the diameter when forming a sphere enclosing or including the energy-accepting fluorescent dye is 12 (3) the transfer efficiency of the fluorescence energy transfer from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye of the hybrid of the set of probes and the analyte, A detection method characterized by monotonically decreasing as N increases.
と、Ｎ個の塩基からなるオリゴヌクレオチド配列Ｉ
N（Ｎは０〜１５の整数）と、前記被検体の特定の第２
のオリゴヌクレオチド塩基配列Ａ２とからなる連続する
特定の塩基配列Ａ１ＩNＡ２（Ａ１が５’末端側でＡ２
が３’末端側）を有する被検体を、第１のプローブと第
２のプローブからなる１組の検出プローブを用いて検出
する方法であって、(1) 前記第１プローブが、前記Ａ
１と相補的な塩基配列Ｂ１を有し、かつ前記Ｂ１の５’
末端に蛍光共鳴エネルギーアクセプター性蛍光色素でラ
ベル化され、かつ(a) 前記エネルギーアクセプター性
蛍光色素が非イオン性縮合多環式炭化水素系色素であ
り、かつ(b) 前記エネルギーアクセプター性蛍光色素
を内接又は内包する球を形成させた場合の直径が、１２
〜１００オングストロームの範囲であり、(2) 前記第
２プローブが、前記Ａ２と相補的な塩基配列Ｂ２を有
し、かつ前記Ｂ２の３’末端にエネルギードナー性蛍光
色素でラベル化され、(3) 前記１組のプローブと前記
被検体とのハイブリッド体の前記エネルギードナー性蛍
光色素から前記エネルギーアクセプター性蛍光色素への
の蛍光エネルギー移動の移動効率が、前記Ｎの増加に伴
い単調に減少することを特徴とする、方法。6. The first oligonucleotide base sequence A1
And an oligonucleotide sequence I consisting of N bases
N (N is an integer from 0 to 15) and the second specific
And a continuous specific nucleotide sequence A1I N A2 (A1 is A5 at the 5′-terminal side)
A 3 ′ terminal side) using a set of detection probes consisting of a first probe and a second probe, wherein (1) the first probe is the A
Has a base sequence B1 complementary to 1 and 5 ′ of B1.
The terminal is labeled with a fluorescent resonance energy acceptor fluorescent dye, and (a) the energy acceptor fluorescent dye is a nonionic condensed polycyclic hydrocarbon dye, and (b) the energy acceptor property When a sphere enclosing or enclosing the fluorescent dye is formed, the diameter is 12
(2) the second probe has a base sequence B2 complementary to the A2, and is labeled with an energy donor fluorescent dye at the 3 ′ end of the B2, (3) ) The transfer efficiency of the fluorescence energy transfer from the energy donor fluorescent dye to the energy acceptor fluorescent dye of the hybrid of the set of probes and the analyte decreases monotonically with the increase of N. A method, comprising:
が、ペリレン、パイセン、ペンタフェン、ペンタセン、
テトラフェニレン、ヘキサフェン、ルビセン、コロネ
ン、トリナフチレン、ヘプタフェン、ヘプタセン、ピラ
ンスレン、オバレン、1,4,5,8-テトラフェニルナフタレ
ン、9,10-ジフェニルアントラセン、ビアントラニル、
9,10-ジナフチルアントラセン、ルブレン、1,3,6,8-テ
トラフェニルピレン、ビピレニル、o-フェニレンピレ
ン、アンサンスレン、3,3'-ビフルオロアンセニル、デ
カサイクレンからなる群から選択される基を有するもの
であることを特徴とする請求項５又は６のいずれかに記
載の検出方法。7. The method according to claim 7, wherein the energy acceptor fluorescent dye is perylene, paisene, pentaphen, pentacene,
Tetraphenylene, hexaphene, rubicene, coronene, trinaphthylene, heptafen, heptacene, pyranthrene, ovalen, 1,4,5,8-tetraphenylnaphthalene, 9,10-diphenylanthracene, bianthranil,
Selected from the group consisting of 9,10-dinaphthylanthracene, rubrene, 1,3,6,8-tetraphenylpyrene, bipyrenyl, o-phenylenepyrene, anthansulene, 3,3'-bifluoroanthenyl, and decacyclene The detection method according to claim 5, wherein the detection method has a group.
が、ペリレン基を有し、かつ前記エネルギードナー性蛍
光色素が、ピレン基を有することを特徴とする請求項５
又は６のいずれかに記載の検出方法。8. The energy acceptor fluorescent dye has a perylene group, and the energy donor fluorescent dye has a pyrene group.
Or the detection method according to any one of 6.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35534897A JP4008996B2 (en) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Target nucleic acid detection probe |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP35534897A JP4008996B2 (en) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Target nucleic acid detection probe |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11178600A true JPH11178600A (en) | 1999-07-06 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP35534897A Expired - Fee Related JP4008996B2 (en) | 1997-12-24 | 1997-12-24 | Target nucleic acid detection probe |
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001053527A1 (en) * | 2000-01-20 | 2001-07-26 | Japan Science And Technology Corporation | Method of detecting dna by dna hybridization method with the use of fluorescent resonance energy transfer |
| JP2007037465A (en) * | 2005-08-03 | 2007-02-15 | Hamamatsu Photonics Kk | Method for designing fluorescent resonance energy-transfer probe |
| JP2007518844A (en) * | 2003-12-16 | 2007-07-12 | プリシセンス エイ／エス | Reagent for detecting specimen |
| JP2010503860A (en) * | 2006-09-18 | 2010-02-04 | アンサンブル ディスカバリー コーポレイション | Receptor family profiling |
-
1997
- 1997-12-24 JP JP35534897A patent/JP4008996B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001053527A1 (en) * | 2000-01-20 | 2001-07-26 | Japan Science And Technology Corporation | Method of detecting dna by dna hybridization method with the use of fluorescent resonance energy transfer |
| JP2007518844A (en) * | 2003-12-16 | 2007-07-12 | プリシセンス エイ／エス | Reagent for detecting specimen |
| JP2007037465A (en) * | 2005-08-03 | 2007-02-15 | Hamamatsu Photonics Kk | Method for designing fluorescent resonance energy-transfer probe |
| JP2010503860A (en) * | 2006-09-18 | 2010-02-04 | アンサンブル ディスカバリー コーポレイション | Receptor family profiling |
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|---|---|
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