JPH05123195A - Method for carrying out homogeneous assay of nucleic acid - Google Patents
Method for carrying out homogeneous assay of nucleic acidInfo
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- JPH05123195A JPH05123195A JP28522191A JP28522191A JPH05123195A JP H05123195 A JPH05123195 A JP H05123195A JP 28522191 A JP28522191 A JP 28522191A JP 28522191 A JP28522191 A JP 28522191A JP H05123195 A JPH05123195 A JP H05123195A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の検定法、より詳
しくは標的となるＤＮＡ又はＲＮＡ (以下「標的ＤＮＡ
等」と略記する) などの遺伝物質をこれと相補的な配列
を持つポリヌクレオチドであるＤＮＡプローブとのハイ
ブリッド形成により検定する方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for assaying nucleic acid, more specifically target DNA or RNA (hereinafter referred to as "target DNA").
Abbreviated as "etc.") and the like by a hybridization with a DNA probe which is a polynucleotide having a sequence complementary thereto.
【０００２】[0002]
【従来の技術】標的となるＤＮＡ等の試料の検定をこれ
と相補的な配列を持つＤＮＡプローブとのハイブリッド
形成により行う方法は、従来、プロシーディングス オ
ブ ザナショナル アカデミー オブ サイエンシズ
オブ ユー エス エー 80巻 (1983年) 第278頁から2
82頁 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (1983) pp.278
-282) に記載されているように、フィルターなどの固相
上でハイブリダイゼーション反応を行うインホモジニア
ス法が中心であった。この方法では核酸試料の固相上へ
の固定、未反応プローブの洗浄などの操作が必要なこ
と、及びハイブリダイゼーション反応に長時間を要する
などの問題点があった。2. Description of the Related Art A method for assaying a sample such as a target DNA by hybridization with a DNA probe having a sequence complementary thereto has hitherto been known as Proceedings of the National Academy of Sciences.
Volume 80, 1983, pp. 278-2
Page 82 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80 (1983) pp. 278
-282), the in-homogeneous method in which a hybridization reaction is carried out on a solid phase such as a filter was the main one. In this method, there are problems that the nucleic acid sample must be fixed on the solid phase, the unreacted probe must be washed, and that the hybridization reaction must take a long time.
【０００３】そこで、(1) 液中でのハイブリダイゼーシ
ョン反応を可能とする、ホモジニアスな手法が開発され
た。かかる手法は、特開昭58-23795に記載されている。
この方法は、化学発光触媒と蛍光体を別々のＤＮＡオリ
ゴマーのそれぞれ3'端と5'端に標識しておき、標的ＤＮ
Ａへのハイブリダイゼーションにより両者を隣接せしめ
て、エネルギー受容体である蛍光体からの化学発光条件
下での発光を検出することにより標的ＤＮＡの有無を判
定している。Therefore, (1) a homogeneous method has been developed which enables a hybridization reaction in a liquid. Such a method is described in JP-A-58-23795.
In this method, a chemiluminescent catalyst and a fluorophore are separately labeled at the 3'end and 5'end of a DNA oligomer, respectively, and the target DN is labeled.
The presence or absence of the target DNA is determined by allowing the two to be adjacent to each other by hybridization to A and detecting the light emission from the fluorophore which is the energy acceptor under the chemiluminescent condition.
【０００４】さらに、(2) 蛍光体間のエネルギー移動に
よる、エネルギー供与側の蛍光体の消光の程度を検出す
ることによる、液中でのＤＮＡハイブリッド体の検出法
が特開昭62-244399に記載されている。この方法では、
二本鎖を形成するＤＮＡオリゴマーのそれぞれの3'端と
5'端にエネルギー移動を起こす２種の蛍光体を標識して
おき、標的ＤＮＡとのハイブリッド形成による二本鎖オ
リゴマーの解離に基づくエネルギー移動の解消による、
エネルギー供与体からの発光の回復を計測することでハ
イブリッド形成を判定している。Further, (2) a method for detecting a DNA hybrid in a liquid by detecting the extent of quenching of the fluorophore on the energy donor side due to energy transfer between the fluorophores is disclosed in JP-A-62-244399. Have been described. in this way,
With each 3'end of the DNA oligomer forming a double strand
By labeling two types of fluorophores that cause energy transfer at the 5'end, and by eliminating energy transfer based on dissociation of the double-stranded oligomer due to hybridization with the target DNA,
Hybridization is determined by measuring the recovery of luminescence from the energy donor.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】上記(1) の化学発光触
媒と蛍光体を標識する方法では、(a) 標的ＤＮＡの検出
に２種類のＤＮＡオリゴマーを用いるため、検出に関わ
る反応が３分子反応であり、ハイブリダイゼーション反
応に要する時間が長くなるという欠点がある。また、
(b) 標的ＤＮＡとその相補鎖との再結合反応の影響を受
け易いという欠点も生ずる。さらに(c)ハイブリダイゼ
ーション反応の時間の短縮とハイブリダイゼーションの
効率を上げるために標識オリゴマーの濃度を増加させる
と雑音となるバックグラウンドの発光が増えてしまうと
いう問題がある。このため従来、標的ＤＮＡ検出の高感
度化にはおのずから限界があった。In the method (1) for labeling a chemiluminescent catalyst and a fluorophore, (a) since two kinds of DNA oligomers are used for detection of target DNA, the reaction involved in detection involves three molecules. Since it is a reaction, there is a drawback that the time required for the hybridization reaction becomes long. Also,
(b) There is also a drawback that it is easily affected by the recombination reaction between the target DNA and its complementary strand. Further, (c) when the concentration of the labeled oligomer is increased in order to shorten the time of the hybridization reaction and increase the efficiency of the hybridization, there is a problem that the background luminescence which becomes noise increases. For this reason, conventionally, there has been a limit to increase the sensitivity of detection of target DNA.
【０００６】また、上記(2) の二本鎖ＤＮＡオリゴマー
と標的二本鎖ＤＮＡ間の再結合反応を利用する方法で
は、競合反応を利用するため標的ＤＮＡに対する標識Ｄ
ＮＡオリゴマーのハイブリダイゼーション効率を上げる
ことに問題があり、やはり標的ＤＮＡ検出高感度化には
限界があった。Further, in the method (2) of utilizing the recombination reaction between the double-stranded DNA oligomer and the target double-stranded DNA, the competitive reaction is utilized, and therefore the label D for the target DNA is used.
There is a problem in increasing the hybridization efficiency of NA oligomers, and there is also a limit to increase the sensitivity of target DNA detection.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題を
解決すべく鋭意検討した結果、エネルギー供与体とエネ
ルギー受容体とを標識した一本鎖ポリヌクレオチドをプ
ローブとして用いることでこの課題を解決しうることを
見出した。すなわち、本発明は中間部分、及び、その中
間部分の両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオ
チドを有し、該中間部分の両端部の近傍のヌクレオチド
を、それぞれ、その間でエネルギー移動が生ずるような
エネルギー供与体及びエネルギー受容体で標識した一本
鎖ポリヌクレオチドを調製し、該一本鎖ポリヌクレオチ
ドを試料のＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイゼーション
させる処理を行い、該エネルギー供与体を励起したとき
に生ずる、エネルギー移動によるエネルギー供与体又は
エネルギー受容体における蛍光発光の、標的ＤＮＡ又は
ＲＮＡとのハイブリッド形成の有無による変化を検出す
ることにより、該試料中の標的ＤＮＡ又はＲＮＡの定量
を行う方法を提供するものである。Means for Solving the Problems As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has solved this problem by using a single-stranded polynucleotide labeled with an energy donor and an energy acceptor as a probe. I found a solution. That is, the present invention has an intermediate portion and a polynucleotide extending from both ends of the intermediate portion to both sides thereof, and nucleotides in the vicinity of both ends of the intermediate portion each have an energy such that energy transfer occurs between them. Energy generated when a single-stranded polynucleotide labeled with a donor and an energy acceptor is prepared, the single-stranded polynucleotide is hybridized with DNA or RNA of a sample, and the energy donor is excited. Provided is a method for quantifying a target DNA or RNA in a sample by detecting a change in fluorescence emission from an energy donor or an energy acceptor due to transfer depending on the presence or absence of hybridization with the target DNA or RNA. is there.
【０００８】本発明においては、中間部分及びその中間
部分の両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオチ
ドを有し、該中間部分の両端部の近傍のヌクレオチド
を、それぞれその間でエネルギー移動を生ずるようなエ
ネルギー供与体及びエネルギー受容体で標識した一本鎖
ポリヌクレオチド鎖をプローブとすることが必要であ
る。In the present invention, an intermediate portion and a polynucleotide extending from both ends of the intermediate portion to both sides thereof are provided, and nucleotides in the vicinity of both ends of the intermediate portion have energy that causes energy transfer therebetween. It is necessary to use a single-stranded polynucleotide chain labeled with a donor and an energy acceptor as a probe.
【０００９】プローブの基となる一本鎖ポリヌクレオチ
ドの具体的な塩基配列は、標的ＤＮＡ等の塩基配列及び
本発明の実施態様に応じて決定される。すなわち、一本
鎖ヌクレオチドを標識しているエネルギー供与体とエネ
ルギー受容体との距離を、標的ＤＮＡ等とのハイブリッ
ド未形成時において、エネルギー供与体とエネルギー受
容体の間で、エネルギーの移動が生ずるべくプローブを
設計するか否かにより相違する。The specific base sequence of the single-stranded polynucleotide serving as the probe base is determined according to the base sequence of the target DNA and the like and the embodiment of the present invention. That is, the distance between the energy donor labeled with the single-stranded nucleotide and the energy acceptor is set so that energy is transferred between the energy donor and the energy acceptor when a hybrid with the target DNA or the like is not formed. Therefore, it depends on whether or not the probe is designed.
【００１０】すなわち、(1) ハイブリッド未形成時にエ
ネルギー移動が生ずるべくプローブを設計する場合に
は、ハイブリッド形成時には、エネルギー移動を生じな
い程十分に、エネルギー供与体とエネルギー受容体が離
れるように設計することが必要である。具体的には、中
間部分のポリヌクレオチドの塩基配列が標的ＤＮＡ等の
塩基配列と相補性を有し、かつ、中間部分の両端部から
それぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドの塩基配列が相
互に相補性を有するべくプローブの塩基配列を設計する
のが好ましい。That is, (1) When a probe is designed so that energy transfer occurs when a hybrid is not formed, the probe is designed so that the energy donor and the energy acceptor are sufficiently separated from each other so that energy transfer does not occur during hybrid formation. It is necessary to. Specifically, the base sequence of the polynucleotide in the intermediate portion has complementarity with the base sequence of the target DNA and the like, and the base sequences of the polynucleotides extending from both ends of the intermediate portion to both sides are complementary to each other. It is preferable to design the base sequence of the probe to have.
【００１１】かかる場合、中間部のポリヌクレオチドに
含まれる塩基は、一般的には、少なくとも10個以上、好
ましくは20個以上となるように設計し、この中間部分の
両端部からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドに含
まれる塩基は６個以上、より好ましくは６〜20個になる
よう設計することで、後述するステップを経て本発明の
目的を達成し得る。In such a case, the number of bases contained in the polynucleotide of the intermediate portion is generally designed to be at least 10 or more, preferably 20 or more, and extends from both ends of the intermediate portion to both sides. By designing the number of bases contained in the polynucleotide to be 6 or more, more preferably 6 to 20, the object of the present invention can be achieved through the steps described below.
【００１２】なお、上記において「相補性を有する」と
は、所要のハイブリダイズが可能な程度に互いに相補的
であることを意味するもので、完全に互いの塩基が相補
的である場合はもちろん、ポイントミューテーション、
数塩基程度の挿入・欠失により、非相補的な塩基が含ま
れている場合も含まれる。 (2) ハイブリッド未形成時には、エネルギー移動を生じ
ないようにプローブを設計する場合には、ハイブリッド
形成時には、エネルギー移動を生ずるのに十分にエネル
ギー受容体とエネルギー供与体とが接近するように設計
することが必要である。In the above description, "complementary" means that they are complementary to each other to the extent that the required hybridization is possible. Of course, when the bases are completely complementary to each other. , Point mutation,
It also includes the case where non-complementary bases are included due to insertion / deletion of about several bases. (2) When designing the probe so that energy transfer does not occur when the hybrid is not formed, design so that the energy acceptor and the energy donor are sufficiently close to each other to cause the energy transfer when the hybrid is formed. It is necessary.
【００１３】具体的には、中間部分のポリヌクレオチド
の塩基配列が標的ＤＮＡ等の塩基配列と相補性がなく、
中間部分の両端部から、それぞれ両側に伸びるポリヌク
レオチドの塩基配列が、標的ＤＮＡ等の近接する塩基配
列とそれぞれ相補性を有するべく、プローブの塩基配列
を設計するのが好ましい。かかる場合、中間部のヌクレ
オチド鎖に含まれる塩基は、一般的には、少なくとも10
個以上、好ましくは20個以上となるように設計し、この
中間部分の両端部から、それぞれ両側に伸びるポリヌク
レオチドに含まれる塩基は８個以上、好ましくは20個以
上となるように；さらに標的ＤＮＡ等とハイブリッドさ
せた場合にプローブの中間部分の両端部からそれぞれ両
側に伸びるポリヌクレオチド同士が少なくとも10塩基、
好ましくは４塩基以下になるように設計することで、後
述するステップを経て本発明の目的を達成し得る。Specifically, the base sequence of the polynucleotide in the middle portion has no complementarity with the base sequence of the target DNA,
It is preferable to design the base sequence of the probe so that the base sequences of the polynucleotides extending from both ends of the intermediate portion to the both sides are complementary to the adjacent base sequences of the target DNA and the like. In such a case, the base contained in the intermediate nucleotide chain is generally at least 10
The number of bases contained in the polynucleotide extending from both ends of the intermediate portion to both sides is 8 or more, preferably 20 or more; When hybridized with DNA or the like, at least 10 bases of polynucleotides extending from both ends of the intermediate portion of the probe to each side,
By designing to preferably have 4 bases or less, the object of the present invention can be achieved through the steps described below.
【００１４】なお、上記において「相補性がなく」とは
完全に非相補的であるのが好ましいが、所要のハイブリ
ダイズが生起しない程度に非相補的な場合も含まれる。
このようにして設計されたプローブは、通常公知の方法
に従い化学合成することにより得ることができる。(1)
(2)のごとく設計し、得られたポリヌクレオチドの中間
部分の両端部の近傍のヌクレオチドをそれぞれ相互にエ
ネルギー移動を生ずるようなエネルギー供与体とエネル
ギー受容体とで標識することで、本発明の第一の構成要
件であるプローブが完成する。[0014] In the above description, "no complementarity" is preferably completely non-complementary, but also includes non-complementary cases to the extent that required hybridization does not occur.
The probe designed in this way can be obtained by chemical synthesis according to a generally known method. (1)
Designed as in (2), by labeling the nucleotides in the vicinity of both ends of the intermediate portion of the obtained polynucleotide with an energy donor and an energy acceptor that cause mutual energy transfer, respectively, The probe, which is the first component, is completed.
【００１５】標識部位となるヌクレオチドは、中間部分
の両端部の近傍に存在することが必須である。中間部分
の両端部の近傍とは、プローブの中間部分の両端部のヌ
クレオチドから5'又は3'方向に向かって１個目のヌクレ
オチドから5'末端又は3'末端に位置するヌクレオチドに
該当する部分全てを指すが、好ましくは、中間部の両末
端から５塩基以内の部分を指すものである。It is essential that the nucleotide serving as the labeling site exists near both ends of the intermediate portion. The vicinity of both ends of the intermediate portion means a portion corresponding to a nucleotide located at the 5'end or 3'end from the first nucleotide in the 5'or 3'direction from the nucleotides at both ends of the intermediate portion of the probe. It refers to all, but preferably refers to a portion within 5 bases from both ends of the intermediate portion.
【００１６】エネルギー供与体とエネルギー受容体の種
類は、相互にエネルギーの励起移動が起り、かかる励起
移動が測定可能な限りにおいて特に限定されない。エネ
ルギー供与体及びエネルギー受容体間の無輻射的なエネ
ルギー移動の効率については、フェルスター (Von Th.
Foerster)による式が知られている (アンナーレン デ
ア フュジーク シリーズ６, ２巻 (1948年) 第55頁か
ら75頁 (Annalen der Physik. 6. Folge. Band2. (194
8) pp.55-75) 参照) 。これによれば、エネルギー移動
速度は、エネルギー供与体とエネルギー受容体間との距
離の６乗に反比例し、エネルギー供与体の発光スペクト
ルとエネルギー受容体の吸収スペクトルの重なりに比例
する。また、エネルギー供与体とエネルギー受容体の配
向によっても影響を受ける。The types of the energy donor and the energy acceptor are not particularly limited as long as the excitation transfer of energy occurs between them and the excitation transfer can be measured. For efficiency of non-radiative energy transfer between energy donors and energy acceptors, see Forster (Von Th.
The formula by Foerster is known (Annalen der Physik. 6. Folge. Band2. (194), pages 55-75 (Annalen der Physik Series 6, Volume 2 (1948)).
8) pp.55-75)). According to this, the energy transfer rate is inversely proportional to the sixth power of the distance between the energy donor and the energy acceptor, and is proportional to the overlap between the emission spectrum of the energy donor and the absorption spectrum of the energy acceptor. It is also affected by the orientation of the energy donor and energy acceptor.
【００１７】エネルギー移動のエネルギー供与体及びエ
ネルギー受容体間の距離依存性の実験的研究がストライ
ヤー(L.Stryer)とホーグランド (R.P.Haugland) によっ
て報告されている (プロシーディングス オブ ザ ナ
ショナル アカデミー オブサイエンシズ オブ ユー
エス エー 58巻 (1967年) 第719頁から726頁 (Pro
c. Natl. Acad. Sci.USA. 58 (1967) pp.719-726) 参
照) これは、ポリペプチドオリゴマーのペプチドの個数
を変えることにより、その両端にあるエネルギー供与体
とエネルギー受容体の距離を変化させたもので、エネル
ギー移動の距離依存性がフェルスターの式とよく一致し
ていることを示している。またエネルギー移動の効率と
して、エネルギー供与体及びエネルギー受容体間の距離
1.２nmのとき１00％、4.６nmのときの16％という値を得
ている。An experimental study of the distance dependence between energy donors and energy acceptors of energy transfer was reported by L. Stryer and RP Haugland (Proceedings of the National Academy of Sciences). Of USA 58 (1967) pp. 719-726 (Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA. 58 (1967) pp.719-726)) This is the distance between the energy donor and the energy acceptor at both ends of the polypeptide oligomer by changing the number of peptides. It shows that the distance dependence of energy transfer is in good agreement with Forster's equation. In addition, the efficiency of energy transfer depends on the distance between the energy donor and the energy acceptor.
The values are 100% at 1.2 nm and 16% at 4.6 nm.
【００１８】したがって、一本鎖ＤＮＡオリゴマーに標
識されたエネルギー供与体とエネルギー受容体の距離
が、一本鎖ＤＮＡオリゴマー単独のときと標的となるＤ
ＮＡあるいはＲＮＡとハイブリダイゼーションしている
ときで大きく違えば、エネルギー供与体を光で励起した
ときのエネルギー供与体又はエネルギー受容体からの発
光量は変化するのでこの変化量を計測することにより、
標的ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイゼーションしてい
るＤＮＡオリゴマー量を定量することができる。すなわ
ち、標的ＤＮＡ量又はＲＮＡ量を定量することができ
る。Therefore, the distance between the energy donor and the energy acceptor labeled on the single-stranded DNA oligomer becomes the target D when the single-stranded DNA oligomer is alone.
If there is a large difference during hybridization with NA or RNA, the amount of light emitted from the energy donor or energy acceptor when the energy donor is excited by light changes, so by measuring this change,
The amount of DNA oligomers hybridizing with the target DNA or RNA can be quantified. That is, the amount of target DNA or RNA can be quantified.
【００１９】エネルギー供与体としては、例えば、フル
オロセイン、フルオレセインイソチオシアネイト等のフ
ルオレセイン系の色素等を；エネルギー受容体として
は、例えば、テトラメチルローダミンイソチオシアネイ
ト（ＴＲＩＴＣ）等のローダミン系の色素及びアルミニ
ウムフタロシアニン等のフタロシアニン系の色素等を例
示することができる。なお、エネルギー供与体としては
アルゴンイオンレーザー(発振波長488nm)で効率よく励
起できるフルオレセインイソチオシアネイト (ＦＩＴ
Ｃ) が好ましく、これに対応する受容体としては、励起
スペクトルがＦＩＴＣの蛍光スペクトルと重なりが大き
く、かつ蛍光スペクトルの極大がＦＩＴＣのそれと １
00nm近く離れているスルフォローダミン101 の塩化スル
フォン酸誘導体 (商品名 テキサスレッド) を用いるの
が好ましい。Examples of energy donors include fluorescein-based dyes such as fluoroscein and fluorescein isothiocyanate; and examples of energy acceptors include rhodamine-based dyes such as tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC). And phthalocyanine dyes such as aluminum phthalocyanine. As the energy donor, fluorescein isothiocyanate (FIT) that can be efficiently excited by an argon ion laser (oscillation wavelength 488 nm) is used.
C) is preferable, and as a receptor corresponding thereto, the excitation spectrum has a large overlap with the fluorescence spectrum of FITC, and the maximum of the fluorescence spectrum is the same as that of FITC.
Preference is given to using the sulphonated chlorosulphonic acid derivative of sulforhodamine 101 (trade name Texas Red) which is close to 00 nm.
【００２０】エネルギー供与体とエネルギー受容体との
プローブへの標識方法は、標識する物質により異なる
が、一般的には、特開昭61-44353に開示された方法に従
うのが好適である。この方法は、ポリヌクレオチドの蛍
光体標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸
結合に置き換え、この官能基と蛍光体結合させることに
より蛍光体標識を表現するものであり、任意の位置に標
識物を導入できる手法である。The method for labeling the probe with the energy donor and the energy acceptor differs depending on the substance to be labeled, but generally, it is preferable to follow the method disclosed in JP-A-61-44353. This method replaces the phosphate bond at the fluorophore labeling site of the polynucleotide with a phosphonate bond having a functional group, and expresses the fluorophore label by binding the fluorophore with this functional group. This is a method that can introduce a labeled substance.
【００２１】エネルギー供与体及びエネルギー受容体を
それぞれ１分子ずつ標識する場合には、例えばホスホン
酸を予め導入したポリヌクレオチドにエネルギー供与体
又はエネルギー受容体の一方を標識し (特開昭61-44353
号公報) 、反応生成物を液体クロマトグラフィー等で随
時モニターし、この際ＤＮＡ由来の260nm 付近の吸光度
とエネルギー供与体又はエネルギー受容体に特異的な吸
光度とを比較し、エネルギー供与体又はエネルギー受容
体がある程度導入はされているが、２個以上導入されて
いるポリヌクレオチドがそれほど多くないと判断可能な
段階で反応を停止させ、反応生成物を電気泳動法等を用
いて分離し、エネルギー供与体又はエネルギー受容体が
１分子導入されたポリヌクレオチドのみを単離後、他方
のエネルギー供与体又はエネルギー受容体を同様の方法
を用いて標識する方法を用いることができる。In the case of labeling one molecule of each of the energy donor and the energy acceptor, for example, one of the energy donor and the energy acceptor is labeled to a polynucleotide into which phosphonic acid is previously introduced (JP-A-61-44353).
The reaction product is monitored by liquid chromatography or the like at any time, and at this time, the absorbance at around 260 nm derived from DNA is compared with the absorbance specific to the energy donor or the energy acceptor. Although the body has been introduced to some extent, the reaction is stopped at a stage where it can be judged that the number of introduced polynucleotides is not so large, and the reaction products are separated by electrophoresis or the like to provide energy. It is possible to use a method in which only the polynucleotide in which one molecule of the body or energy acceptor is introduced is isolated, and then the other energy donor or energy acceptor is labeled using the same method.
【００２２】さらに、エネルギー供与体又はエネルギー
受容体の標識位置を、中間部の両端部の近傍の互いに異
なる塩基配列に対応させて確定する場合には、予め、そ
れぞれの標識物に対応すべきプローブの5'側又は3'側に
相当するポリヌクレオチドを別々に調製し、それぞれの
ポリヌクレオチドの所望の位置にエネルギー供与体又は
エネルギー受容体を標識させた後で両者を連結させる方
法を用いることができる。かかる場合それぞれのポリヌ
クレオチドに含まれる塩基数は通常６〜50塩基であり、
10〜20塩基であることが好ましい。そしてこの２つの標
識ポリヌクレオチドを通常公知の方法で連結させ、所望
のエネルギー供与体とエネルギー受容体の標識位置が確
定したプローブを調製することができる。Further, when the labeling position of the energy donor or the energy acceptor is determined by associating with different base sequences in the vicinity of both ends of the intermediate portion, a probe that should correspond to each labeling substance is prepared in advance. It is possible to use a method in which polynucleotides corresponding to the 5'side or 3'side of are prepared separately, and an energy donor or energy acceptor is labeled at a desired position of each polynucleotide, and then the two are ligated. it can. In such a case, the number of bases contained in each polynucleotide is usually 6 to 50 bases,
It is preferably 10 to 20 bases. Then, the two labeled polynucleotides can be ligated by a generally known method to prepare a probe in which the labeling positions of the desired energy donor and energy acceptor are confirmed.
【００２３】なお、標識するエネルギー供与体及びエネ
ルギー受容体は、通常それぞれ１ヶ所に標識すれば足り
るが、必要な場合は、同一の近傍部分内であれば複数ヶ
所に標識することもできる。さらに、エネルギー供与体
及びエネルギー受容体の標識方法は上記に限定されるも
のではなく、例えば上記のヌクレオチド骨格のリン原子
への標識方法以外に、塩基に直接標識する手段 (サイエ
ンス 238巻 (1987年) 336〜341頁)をも好適な標識方法
として選択することができる。The energy donor and the energy acceptor to be labeled usually need to be labeled at one location each, but if necessary, they can be labeled at multiple locations within the same vicinity. Further, the labeling method of the energy donor and the energy acceptor is not limited to the above, and for example, in addition to the above labeling method for the phosphorus atom of the nucleotide skeleton, a means for directly labeling the base (Science 238 (1987) ) Pp. 336-341) can also be selected as a suitable labeling method.
【００２４】次に、前記より得られた標識プローブと標
識ＤＮＡ等をハイブリダイズすることが必要である。こ
のハイブリダイズの方法として、従来より広く用いられ
ているサザンブロットフィルターハイブリダイゼーショ
ン法 (Southern, E., J. Mol. Biol., 98,503, 1975)等
の固相法を採用することができるのはもちろんである
が、従来は、自動化には好適であるが、従来標的ＤＮＡ
等の検出の感度に問題があるとされた液相法をも用いる
ことができる。Next, it is necessary to hybridize the labeled probe obtained above with the labeled DNA. As a method of this hybridization, it is possible to adopt a solid phase method such as the Southern blot filter hybridization method (Southern, E., J. Mol. Biol., 98, 503, 1975) which has been widely used conventionally. Of course, conventionally, although it is suitable for automation,
It is also possible to use a liquid phase method which is said to have a problem in the sensitivity of detection such as.
【００２５】この液相ハイブリダイゼーションはハイブ
リダイズさせるＤＮＡ同士を、一価の陽イオンの存在下
で適当な温度条件を設定することによって、簡便・正確
に行うことができる。液相として用いる緩衝液は、ハイ
ブリダイズを阻害しない範囲で広く用いることができ
る。例えば、リン酸緩衝液やトリス塩酸緩衝液をpH８付
近に調整して用いることができる。一価の陽イオンとし
ても特に限定されず、例えばナトリウムイオンを好まし
いものとして用いることができる。This liquid phase hybridization can be carried out simply and accurately by setting appropriate temperature conditions for the DNAs to be hybridized in the presence of monovalent cations. The buffer solution used as the liquid phase can be widely used as long as it does not inhibit hybridization. For example, a phosphate buffer solution or a Tris-hydrochloric acid buffer solution can be used by adjusting the pH to around 8. The monovalent cation is not particularly limited, and sodium ion can be preferably used.
【００２６】ハイブリダイズの反応自体は、ＤＮＡ分子
自らの折りたたみ等を解消し、ハイブリダイズし易くす
るための昇温過程と、ハイブリダイズを行う降温過程を
通して行われる。昇温過程は60〜95℃、好ましくは65℃
付近まで液相温度を上昇させることにより行われ、降温
過程は一旦昇温させた液相を37℃〜室温、好ましくは25
℃付近まで下降させることによって行われる。一般にこ
の降温過程に要する時間は、少なくとも５分以上は必要
であるが、15分間あれば十分にハイブリダイズは終了す
る。The hybridization reaction itself is carried out through a temperature raising process for eliminating the folding of the DNA molecule itself and facilitating the hybridization, and a temperature lowering process for carrying out the hybridization. Temperature rising process is 60-95 ℃, preferably 65 ℃
It is carried out by raising the liquid phase temperature to the vicinity, and the temperature decreasing process is performed by heating the liquid phase once at 37 ° C to room temperature, preferably 25
It is carried out by lowering the temperature to around ℃. Generally, the time required for this temperature lowering process is at least 5 minutes or more, but if it is 15 minutes, hybridization is sufficiently completed.
【００２７】さらに、ハイブリダイズ前後の標識された
エネルギー供与体あるいは受容体における励起による蛍
光発光の変化を検出して、試料中の標的ＤＮＡ等の定量
を行なう必要がある。ハイブリッド未形成時に、エネル
ギー供与体と受容体間にエネルギー移動が生ずるよう
に、かつハイブリッド形成時には、エネルギー移動が生
じないようにプローブを設計した場合には、ハイブリッ
ド形成時に生ずる受容体からの発光量の減少分を計測す
ることにより、又は、供与体からの発光量の増加分を計
測することにより、標的ＤＮＡ等の定量を行ない得る。Further, it is necessary to detect the change in fluorescence emission due to excitation in the labeled energy donor or acceptor before and after the hybridization to quantify the target DNA and the like in the sample. When the probe is designed so that energy transfer occurs between the energy donor and the acceptor when the hybrid is not formed, and energy transfer does not occur during the hybrid formation, the amount of luminescence from the acceptor that occurs during the hybrid formation. The target DNA etc. can be quantified by measuring the amount of decrease in the amount of light emitted from the donor or by measuring the amount of increase in the amount of luminescence from the donor.
【００２８】逆にハイブリッド未形成時にエネルギー移
動を生じないように、かつハイブリッド形成時にエネル
ギー移動を生ずるようにプローブを設計した場合には、
ハイブリッド形成時に生ずる受容体からの発光量の増加
分又は供与体からの発光量の減少分を計測することによ
り、標的ＤＮＡ等の定量を行ない得る。エネルギー供与
体又は受容体の励起は、少なくとも供与体を特異的に励
起することができる特性を有する光を照射することによ
り行なわれる。On the contrary, when the probe is designed so that energy transfer does not occur when the hybrid is not formed and energy transfer occurs when the hybrid is formed,
Target DNA and the like can be quantified by measuring the increase in the amount of luminescence from the acceptor or the decrease in the amount of luminescence from the donor that occurs during hybridization. Excitation of the energy donor or the acceptor is performed by irradiating with light having a characteristic capable of specifically exciting the donor.
【００２９】例えば、エネルギー供与体としてＦＩＴＣ
を、エネルギー受容体としてテキサスレッドを用いた場
合には、ＦＩＴＣを効率良く励起することができる発振
波長488nm のアルゴンレーザー等を用いてＦＩＴＣを励
起するのが好ましい。試料中の標的ＤＮＡ等の量に対応
する蛍光量の増減は、目視法によって測定することもで
きるが、簡便性・正確性を期するうえでハイブリダイズ
から蛍光量測定までの一連の操作を専用の測定機器を用
いて測定するのが好ましい。For example, FITC as an energy donor
When Texas Red is used as the energy acceptor, it is preferable to excite FITC using an argon laser or the like having an oscillation wavelength of 488 nm that can efficiently excite FITC. The increase or decrease in the amount of fluorescence corresponding to the amount of target DNA in the sample can be measured by a visual method, but for convenience and accuracy, a series of operations from hybridization to fluorescence measurement is dedicated. It is preferable to measure using the measuring instrument of
【００３０】かかる測定機器は例えば図１に示した構成
による。図１において、１は試料を封入する試料管であ
る。２は光源である。光源の種類は、標識されたエネル
ギー供与体及び受容体の種類に応じて選択される。３,
４は干渉フィルターである。このフィルターの半値幅は
20〜30nm程度が好ましい。５、６は光電子増幅装置であ
る。７〜11はレンズである。Such a measuring device has, for example, the configuration shown in FIG. In FIG. 1, 1 is a sample tube for enclosing a sample. 2 is a light source. The type of light source is selected according to the type of labeled energy donor and acceptor. Three,
Reference numeral 4 is an interference filter. The full width at half maximum of this filter is
20-30 nm is preferable. Reference numerals 5 and 6 are photoelectron amplifiers. 7 to 11 are lenses.
【００３１】なお、試料から発する蛍光の強度は、光線
の照射方向とほぼ直角をなす方向で測定するのが好まし
い。標的ＤＮＡ等の定量は、濃度既知の標準試料を使用
して検量線を作成して行なうことができる。標的となる
ＤＮＡ等については、特に限定はなく、ファージ、ウイ
ルス、細菌を始めとするヒトその他の高等生物のゲノム
ＤＮＡ等を対象とすることができる。The intensity of fluorescence emitted from the sample is preferably measured in a direction substantially perpendicular to the direction of irradiation of the light beam. The target DNA and the like can be quantified by preparing a calibration curve using a standard sample of known concentration. The target DNA and the like are not particularly limited, and genomic DNA of humans and other higher organisms such as phages, viruses and bacteria can be targeted.
【００３２】[0032]
【発明の効果】本発明によれば、自動化に好適な液中で
のハイブリダイゼーション反応を実現できるホモジニア
スなＤＮＡの検定法の高感度化が実現できる。すなわ
ち、標識ＤＮＡオリゴマーと標的ＤＮＡとの近似的な２
分子反応によりハイブリダイゼーション反応を実現でき
るため、ハイブリダイゼーションの効率を高くすること
ができる。また、単一のＤＮＡオリゴマーを用いた標的
ＤＮＡとの競合反応を行うため、ＤＮＡオリゴマー内の
二本鎖形成部分と標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーショ
ン部分の塩基長を別々に選定できる。このため、ＤＮＡ
オリゴマー内の二本鎖再形成を抑え標的ＤＮＡとのハイ
ブリダイゼーションの効率を高くすることができる。EFFECTS OF THE INVENTION According to the present invention, it is possible to improve the sensitivity of a homogeneous DNA assay method capable of realizing a hybridization reaction in a liquid suitable for automation. In other words, the labeled DNA oligomer and the target DNA are approximately 2
Since the hybridization reaction can be realized by the molecular reaction, the efficiency of hybridization can be increased. Further, since the competitive reaction with the target DNA is carried out using a single DNA oligomer, the base lengths of the double stranded portion in the DNA oligomer and the hybridization portion with the target DNA can be selected separately. Therefore, DNA
It is possible to suppress double-strand rearrangement in the oligomer and increase the efficiency of hybridization with the target DNA.
【００３３】[0033]
【実施例】以下、実施例を挙げて、本発明について具体
的に説明する。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples.
【００３４】[0034]
【実施例１】 本実施例はハイブリッド未形成時にエネ
ルギー移動を生じないように、かつハイブリッド形成時
にエネルギー移動を生ずるべく設計したプローブについ
ての一実施態様である。本実施例の概略を図２に示す。
本実施例においては、標的ＤＮＡ試料17として、Ｍ13フ
ァージのＤＮＡ (二本鎖のＭ13mp８RF DNA) を用いた。Example 1 This example is an embodiment of a probe designed so that energy transfer does not occur when a hybrid is not formed and energy transfer occurs when a hybrid is formed. The outline of this embodiment is shown in FIG.
In this example, M13 phage DNA (double-stranded M13mp8RF DNA) was used as the target DNA sample 17.
【００３５】(１) プローブとして用いるＤＮＡオリゴ
マーの調製 本実施例においてプローブとして用いる二本鎖ＤＮＡオ
リゴマーを以下の様に設計した。図２において、一本鎖
ＤＮＡオリゴマー12の端部13の塩基配列としてＭ13ファ
ージのＤＮＡシーケンス用のプライマーと同一の配列番
号１で示される15塩基配列及びこれに隣接する配列番号
２で示される15塩基配列を；中間部分14として標的ＤＮ
Ａの塩基配列と相関のない配列番号３で示された30塩基
配列を選択し、計60塩基からなるＤＮＡオリゴマー12を
設計した。(1) Preparation of DNA oligomer used as probe A double-stranded DNA oligomer used as a probe in this example was designed as follows. In FIG. 2, as the base sequence of the end portion 13 of the single-stranded DNA oligomer 12, the same 15 base sequence represented by SEQ ID NO: 1 as the primer for the DNA sequence of M13 phage and the adjacent sequence represented by SEQ ID NO: 2 15 Base sequence; target DN as intermediate portion 14
A 30-nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 having no correlation with the nucleotide sequence of A was selected, and a DNA oligomer 12 having a total of 60 nucleotides was designed.
【００３６】この60塩基からなるＤＮＡオリゴマー12の
うち30塩基分ずつを、以下の標識過程に付する目的で市
販のＤＮＡシンセサイザーより合成した。 (２) ＤＮＡオリゴマーの標識 エネルギー供与体15としてフルオロセインイソチアネイ
ト (ＦＩＴＣ) (同仁化学社製) を、エネルギー受容体
16としてスルフォローダミン101 の塩化スルフォン酸誘
導体 (商品名テキサスレッド：モレキュラープローブ社
製) を選択して上記 (１)で得られた一本鎖ＤＮＡオリ
ゴマーを以下の手順で標識してプローブを調製した。30 bases each of the 60 bases of the DNA oligomer 12 were synthesized from a commercially available DNA synthesizer for the purpose of the following labeling process. (2) Labeling of DNA oligomer Fluorescein isothiocyanate (FITC) (manufactured by Dojindo Co., Ltd.) was used as an energy acceptor 15 as an energy acceptor.
A sulfosulfonic acid derivative of sulforhodamine 101 (trade name Texas Red manufactured by Molecular Probes) was selected as 16 and the single-stranded DNA oligomer obtained in (1) above was labeled by the following procedure to prepare a probe. did.
【００３７】この標識には、ポリヌクレオチドの蛍光体
標識部位のリン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合
に置き換え、この官能基と蛍光体を蛍光体結合させる蛍
光体標識法である特開昭61-44535号公報に開示してある
方法を用いた。端部２における標識位置は、5'末端から
3'方向に13番目のグアニン (Ｇ) と14番目のシトシン
(Ｃ) の間のリン酸部分と、3'末端側から5'方向に13番
目のチミン (Ｔ) と14番目のグアニン (Ｇ) の間のリン
酸部分とした。すなわち、ＤＮＡ試料６とハイブリダイ
ゼーションさせると標識物同士が３塩基分離れて位置す
るように標識部位を設定した。This labeling is a fluorescent substance labeling method in which the phosphoric acid bond at the fluorescent substance labeling site of the polynucleotide is replaced with a phosphonic acid bond having a functional group and the functional group and the fluorescent substance are fluorescently bonded. The method disclosed in 61-44535 was used. The labeling position at the end 2 is from the 5'end
13th guanine (G) and 14th cytosine in 3'direction
The phosphoric acid moiety between (C) and the phosphoric acid moiety between the 13th thymine (T) and the 14th guanine (G) in the 5'direction from the 3'end side. That is, the labeling site was set such that the labeled substances were separated by three bases when hybridized with the DNA sample 6.
【００３８】これらのリン酸結合の部分を、特開昭61-4
4535号公報に開示された方法に従い、前記の２つの30塩
基からなるオリゴヌクレオチドを別々に、エネルギー供
与体15であるＦＩＴＣとエネルギー受容体16であるテキ
サスレッドで標識した。この別々の蛍光色素15、16で標
識したオリゴヌクレオチドをそれぞれの連結部の両側の
10塩基に対して相補的な塩基配列を有する20塩基のオリ
ゴヌクレオチドをＤＮＡシンセサイザーで合成し、この
20塩基のオリゴヌクレオチドと蛍光体が標識された２種
類の30塩基のオリゴヌクレオチドとを前記したハイブリ
ダイゼーション条件下（１00mM Na+イオンの存在下で65
℃まで昇温後、10分間で25℃まで降温）で、ハイブリダ
イズ後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、本実施例で使用
する標識プローブ12と上記20塩基のオリゴヌクレオチド
の複合体を得た。These phosphoric acid-bonding moieties are described in JP-A-61-4
According to the method disclosed in Japanese Patent No. 4535, the above-mentioned two 30-base oligonucleotides were separately labeled with FITC which is an energy donor 15 and Texas Red which is an energy acceptor 16. The oligonucleotides labeled with the separate fluorescent dyes 15 and 16 are attached to both sides of each junction.
A 20-base oligonucleotide having a base sequence complementary to the 10-base was synthesized by a DNA synthesizer.
A 20-base oligonucleotide and two kinds of fluorescent-labeled 30-base oligonucleotides were used under the above-mentioned hybridization conditions (65 mM in the presence of 100 mM Na + ion).
After raising the temperature to 0 ° C. and lowering the temperature to 25 ° C. for 10 minutes), after hybridization, a complex of the labeled probe 12 used in this example and the above-mentioned 20-base oligonucleotide was obtained using T4 DNA ligase.
【００３９】このＤＮＡ複合体を、通常公知の方法によ
りホルムアミドで一本鎖ＤＮＡに変性して、ゲル電気泳
動により分子量分離して、本実施例で使用する標識プロ
ーブ12を得た。 (３) 標的ＤＮＡ量の測定 次に上記（２）により得られた標識プローブ12を用いて
標的ＤＮＡ17の量を測定した。This DNA complex was denatured into a single-stranded DNA with formamide by a commonly known method, and the molecular weight was separated by gel electrophoresis to obtain a labeled probe 12 used in this example. (3) Measurement of target DNA amount Next, the amount of target DNA 17 was measured using the labeled probe 12 obtained in the above (2).
【００４０】この測定には図１に示した構成の測定機器
を用いた。試料管１として、キャピラリーセルを、光源
２として出力10mWの空冷アルゴンレーザー（発振波長４
88nm）を、３及び４の干渉フィルターとして、それぞれ
５15nm及び６10nmをピークとする半値幅25nmの干渉フィ
ルターを用いた。又、試料19から発する蛍光の強度は、
アルゴンレーザー２の照射方向とほぼ直角をなす方向で
測定した。For this measurement, a measuring instrument having the structure shown in FIG. 1 was used. The sample tube 1 is a capillary cell, and the light source 2 is an air-cooled argon laser with an output of 10 mW (oscillation wavelength 4
88 nm) was used as the interference filters of 3 and 4, and an interference filter having a half width of 25 nm having peaks at 515 nm and 610 nm was used. The intensity of the fluorescence emitted from sample 19 is
The measurement was performed in a direction substantially perpendicular to the irradiation direction of the argon laser 2.
【００４１】標識プローブ12と標的ＤＮＡ試料17を微量
のサンプルの測定が可能なキャピラリーセル１に、pH８
に調整した１00mMのNa+イオンを含有するリン酸緩衝
液、標的試料17及び標識プローブ12を封入した（図２、
18）。先ず、アルゴンレーザー２をキャピラリーセル１
に照射し、この時のＦＩＴＣに由来する５15nm近傍の蛍
光量とテキサスレッドに由来する６10nm近傍の蛍光量を
測定した。The labeled probe 12 and the target DNA sample 17 are added to the capillary cell 1 capable of measuring a very small amount of the sample, and the pH is set to 8
Phosphate buffer containing 100 mM Na + ion adjusted to, target sample 17 and labeled probe 12 were enclosed (Fig. 2,
18). First, the argon laser 2 is attached to the capillary cell 1
Then, the amount of fluorescence near 515 nm derived from FITC and the amount of fluorescence near 610 nm derived from Texas Red at this time were measured.
【００４２】次にキャピラリーセル１の温度を65℃まで
上昇させた後、10分間かけて25℃まで冷却した。25℃ま
で冷却した際の、アルゴンレーザー２の照射による５15
nm近傍と６10nm近傍の蛍光量を測定した。この結果、標
的ＤＮＡ試料17であるＭ13nm８ＲＦＤＮＡの添加量に対
して用量依存的に、エネルギー受容体として選択したテ
キサスレッド16に由来する６10nm近傍の蛍光量が増加し
た。Next, the temperature of the capillary cell 1 was raised to 65 ° C. and then cooled to 25 ° C. over 10 minutes. 515 by irradiation of argon laser 2 when cooled to 25 ° C
The amount of fluorescence around nm and around 610 nm was measured. As a result, the amount of fluorescence near 610 nm derived from Texas Red 16 selected as the energy acceptor increased dose-dependently with respect to the amount of the target DNA sample 17, M13nm8RFDNA, added.
【００４３】これにより、標識プローブ12と標的ＤＮＡ
試料17が複合体19を形成して、エネルギー供与体15とエ
ネルギー受容体16の間のエネルギー移動を惹起すること
により、定量的に標的試料17の存在量が測定可能である
ことが判明した。As a result, the labeled probe 12 and the target DNA
It was found that the abundance of the target sample 17 can be quantitatively measured by forming the complex 19 in the sample 17 and inducing energy transfer between the energy donor 15 and the energy acceptor 16.
【００４４】[0044]
【実施例２】 本実施例は、ハイブリッド未形成時にエ
ネルギー移動を生ずるように、かつハイブリッド形成時
にエネルギー移動を生じないように設計したプローブに
ついての一実施態様である。本実施例の概略を図３に示
す。用いた標的ＤＮＡ試料25は、実施例１と同様にして
Ｍ13ファージのＤＮＡ(二本鎖のＭ13nm８RF DNA) を用
いた。Example 2 This example is an embodiment of a probe designed so that energy transfer occurs when a hybrid is not formed, and energy transfer does not occur when a hybrid is formed. The outline of this embodiment is shown in FIG. As the target DNA sample 25 used, M13 phage DNA (double-stranded M13nm8RF DNA) was used in the same manner as in Example 1.
【００４５】(１) プローブとして用いるＤＮＡオリゴ
マーの調製 本実施例において用いる一本鎖ＤＮＡオリゴマーを以下
の様に設計した。図３において、一本鎖ＤＮＡオリゴマ
ー20の両方の端部21として配列番号４で示される６塩基
配列を；中間部分22として配列番号５で示される30塩基
配列を選択し、計42塩基からなるＤＮＡオリゴマーを設
計した。(1) Preparation of DNA oligomer used as probe The single-stranded DNA oligomer used in this example was designed as follows. In FIG. 3, a 6-base sequence shown in SEQ ID NO: 4 is selected as both ends 21 of the single-stranded DNA oligomer 20; A DNA oligomer was designed.
【００４６】この中間部分22は、Ｍ13mp８クローニング
用の部位及びそれに隣接する部位にハイブリダイゼーシ
ョンする配列であり、端部21は互いに相補的であるの
で、このＤＮＡオリゴマーを単独でハイブリダイゼーシ
ョン条件下に置いた場合、互いにハイブリダイズして二
本鎖を形成し得る。このプローブとして用いる一本鎖オ
リゴマー20は、実施例１と同様に、予め21塩基からなる
２つのオリゴヌクレオチドを市販のＤＮＡシンセサイザ
ーで合成し、エネルギー供与体23であるＦＩＴＣとエネ
ルギー受容体24であるテキサスレッドを下記（２）の方
法により標識した標識プローブである。This intermediate portion 22 is a sequence that hybridizes to the site for M13mp8 cloning and the site adjacent thereto, and since the ends 21 are complementary to each other, this DNA oligomer alone is placed under hybridization conditions. If they do, they can hybridize to each other to form a duplex. The single-stranded oligomer 20 used as this probe is the FITC which is the energy donor 23 and the energy acceptor 24 obtained by synthesizing two oligonucleotides consisting of 21 bases in advance by a commercially available DNA synthesizer as in Example 1. It is a labeled probe obtained by labeling Texas Red by the method (2) below.
【００４７】(２) ＤＮＡオリゴマーの標識 実施例１と同様にして、エネルギー供与体23としてＦＩ
ＴＣを、エネルギー受容体24としてテキサスレッドを選
択して上記 (１) に示すそれぞれの21塩基の一本鎖オリ
ゴマーを標識してこれらを連結して標識プローブ20を調
製した。なお、標識位置は、一本鎖ＤＮＡオリゴマー20
の5'端から3'方向に１番目のグアニン (Ｇ) と２番目の
アデニン (Ａ) の間のリン酸部分と、3'端から5'方向に
５番目のアデニン (Ａ) と６番目のグアニン (Ｇ) の間
のリン酸部分とした。(2) Labeling of DNA oligomer In the same manner as in Example 1, FI was used as the energy donor 23.
Texas Red was selected as TC as an energy acceptor 24, each single-stranded oligomer of 21 bases shown in (1) above was labeled, and these were linked to prepare a labeled probe 20. In addition, the labeling position is the single-stranded DNA oligomer 20.
The 5'end to the 3'direction, the phosphate moiety between the 1st guanine (G) and the 2nd adenine (A), and the 5th adenine (A) and the 6th position from the 3'end to the 5'direction Of the guanine (G) in the phosphate moiety.
【００４８】(３) 標的ＤＮＡ量の測定 先ず、調製した標識プローブ20を、キャピラリーセル１
中で実施例１と同一の条件で、端部21同士をハイブリダ
イズさせた（図３、26）。この時点で、キャピラリーセ
ル１にアルゴンレーザー２を照射して、エネルギー供与
体23とエネルギー受容体24に由来する蛍光量を測定し
た。(3) Measurement of amount of target DNA First, the prepared labeled probe 20 was applied to the capillary cell 1
The end portions 21 were hybridized with each other under the same conditions as in Example 1 (FIGS. 3 and 26). At this point, the capillary cell 1 was irradiated with an argon laser 2 and the amount of fluorescence derived from the energy donor 23 and the energy acceptor 24 was measured.
【００４９】次に、このキャピラリーセル１に標的ＤＮ
Ａ試料25を添加し、再び前記のハイブリダイゼーション
反応を行ない、反応後のキャピラリーセルにアルゴンレ
ーザー２を照射してエネルギー供与体23とエネルギー受
容体24に由来する蛍光量を測定した。この結果、標的Ｄ
ＮＡ試料25であるＭ13nm８ＲＦＤＮＡの添加量に対して
用量依存的に、エネルギー受容体として選択したテキサ
スレッド24に由来する６10nm近傍の蛍光量が減少した。Next, the target DN is attached to the capillary cell 1.
A sample 25 was added, the above-mentioned hybridization reaction was performed again, and the capillary cell after the reaction was irradiated with an argon laser 2 to measure the fluorescence amount derived from the energy donor 23 and the energy acceptor 24. As a result, target D
The amount of fluorescence near 610 nm derived from Texas Red 24, which was selected as an energy acceptor, decreased dose-dependently with respect to the amount of M13nm8 RFDNA added as NA sample 25.
【００５０】これにより、ハイブリダイズすることによ
って生ずる標識プローブ26におけるエネルギー供与体23
からエネルギー受容体24へのエネルギー移動によるテキ
サスレッド24に由来する６10nm近傍の蛍光量が、標的Ｄ
ＮＡ試料25と標識プローブ26と中間部分22のハイブリダ
イズにより標識プローブ26における端部21同士の水素結
合が切断されエネルギー供与体23とエネルギー受容体24
の距離が離れて、相互間のエネルギー移動を生じなくな
ることにより（28）、定量的にＤＮＡ標識試料25の存在
量が測定可能であることが判明した。As a result, the energy donor 23 in the labeled probe 26 generated by the hybridization
The amount of fluorescence near 610 nm derived from Texas Red 24 due to the energy transfer from the target to the energy acceptor 24 is the target D
Hybridization of the NA sample 25, the labeled probe 26, and the intermediate portion 22 breaks the hydrogen bond between the ends 21 of the labeled probe 26, and the energy donor 23 and the energy acceptor 24.
It was found that the abundance of the DNA-labeled sample 25 can be quantitatively measured by increasing the distance between the two and eliminating the mutual energy transfer (28).
【００５１】[0051]
配列番号 ：１ 配列の長さ：15 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ 配列番号 ：２ 配列の長さ：15 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ：ＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣ 配列番号 ：３ 配列の長さ：30 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列番号 ：４ 配列の長さ：６ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ：ＧＡＴＡＴＣ 配列番号 ：５ 配列の長さ：30 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 起源 ：Ｍ13ファージ 配列 ：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＧ
ＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣSEQ ID NO: 1 Sequence length: 15 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Origin: M13 phage Sequence: TGTAAAACGACGGGCC SEQ ID NO: 2 Sequence length Length: 15 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Origin: M13 phage Sequence: AGTGCCAAGCTTGGC SEQ ID NO: 3 Sequence length: 30 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA SEQ ID NO: 4 Sequence length: 6 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Origin: M13 phage Sequence: GAATAC SEQ ID NO: 5 Sequence length S: 30 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Origin: M13 phage Sequence: TGTAAAACGACGCGCCAGTG
CCAAGCTTGGC
【図１】本発明の実施に供する測定機器の構成である。FIG. 1 is a configuration of a measuring instrument used for carrying out the present invention.
【図２】実施例１の概略図である。2 is a schematic diagram of Example 1. FIG.
【図３】実施例２の概略図である。FIG. 3 is a schematic diagram of a second embodiment.
Claims (8)
からそれぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドを有し、該
中間部分の両端部の近傍のヌクレオチドを、それぞれ、
その間でエネルギー移動が生ずるようなエネルギー供与
体及びエネルギー受容体で標識した一本鎖ポリヌクレオ
チドを調製し、該一本鎖ポリヌクレオチドを試料のＤＮ
Ａ又はＲＮＡにハイブリダイゼーションさせる処理を行
い、該エネルギー供与体を励起したときに生ずる、エネ
ルギー移動によるエネルギー供与体又はエネルギー受容
体における蛍光発光の、標的ＤＮＡ又はＲＮＡとのハイ
ブリッド形成の有無による変化を検出することにより、
該試料中の標的ＤＮＡ又はＲＮＡの定量を行う方法。1. An intermediate portion and a polynucleotide extending from both ends of the intermediate portion to both sides thereof, wherein nucleotides near both ends of the intermediate portion are
A single-stranded polynucleotide labeled with an energy donor and an energy acceptor such that energy transfer occurs between them is prepared, and the single-stranded polynucleotide is used as a sample DN.
The fluorescence emission in the energy donor or energy acceptor due to energy transfer, which occurs when the energy donor is excited by performing a treatment for hybridization with A or RNA, changes depending on the presence or absence of hybridization with the target DNA or RNA. By detecting
A method for quantifying target DNA or RNA in the sample.
のポリヌクレオチドの塩基配列が標的ＤＮＡ又はＲＮＡ
の塩基配列と相補性がなく、中間部分の両端部からそれ
ぞれ両側に伸びるポリヌクレオチドの塩基配列が、標的
ＤＮＡ又はＲＮＡの近接する塩基配列とそれぞれ相補性
を有することを特徴とする方法。2. The method according to claim 1, wherein the base sequence of the polynucleotide of the intermediate portion is the target DNA or RNA.
The method is characterized in that the nucleotide sequences of the polynucleotides which have no complementarity with the nucleotide sequence of (1) and extend from both ends of the intermediate portion to both sides respectively have complementarity with the adjacent nucleotide sequences of the target DNA or RNA.
のポリヌクレオチドが20個以上の塩基からなり、中間部
分の両端部からそれぞれ両端に伸びるポリヌクレオチド
が10個以上の塩基からなることを特徴とする方法。3. The method according to claim 2, wherein the polynucleotide in the intermediate portion is composed of 20 or more bases, and the polynucleotides extending from both ends of the intermediate portion to both ends are composed of 10 or more bases. And how to.
て、ハイブリッド形成時に生じる該受容体からの発光量
の増加分を計測することにより、該試料中の標的ＤＮＡ
又はＲＮＡの定量を行う方法。4. The target DNA in the sample according to claim 2 or 3, by measuring an increase in the amount of luminescence from the receptor that occurs during hybridization.
Alternatively, a method for quantifying RNA.
のヌクレオチドの塩基配列が標的ＤＮＡ又はＲＮＡの塩
基配列と相補性を有し、中間部分の両端部からそれぞれ
両側に伸びるポリヌクレオチドの塩基配列が相互に相補
性を有することを特徴とする方法。5. The method according to claim 1, wherein the nucleotide sequence of the nucleotide in the intermediate portion is complementary to the nucleotide sequence of the target DNA or RNA, and the nucleotide sequence of the polynucleotide extends from both ends of the intermediate portion to both sides. Are complementary to each other.
のポリヌクレオチドが20個以上の塩基からなり、中間部
分の両端部からそれぞれ両側に伸びるヌクレオチドが６
〜20個の塩基からなることを特徴とする方法。6. The method according to claim 5, wherein the polynucleotide of the intermediate portion is composed of 20 or more bases, and the number of nucleotides extending from both ends of the intermediate portion to both sides is 6 respectively.
A method comprising: ~ 20 bases.
て、ハイブリッド形成時に生じる該受容体からの発光量
の減少分を計測することにより、該試料中の標的ＤＮＡ
又はＲＮＡの定量を行う方法。7. The method according to claim 5 or 6, wherein the decrease in the amount of light emitted from the receptor during hybridization is measured to measure the target DNA in the sample.
Alternatively, a method for quantifying RNA.
ハイブリッド形成時に生ずる該供与体からの発光量の増
加分を計測することにより、標的ＤＮＡ又はＲＮＡの定
量を行う方法。8. The method according to claim 5 or 6,
A method for quantifying target DNA or RNA by measuring an increase in the amount of luminescence from the donor that occurs during hybridization.
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH09504950A (en) * | 1993-11-12 | 1997-05-20 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク | Hybridization probe for nucleic acid detection, common stem, method and kit |
| WO1997019192A1 (en) * | 1995-11-20 | 1997-05-29 | Trustees Of Boston University | Method and probe for detecting a target nucleic acid sequence |
| US5723591A (en) * | 1994-11-16 | 1998-03-03 | Perkin-Elmer Corporation | Self-quenching fluorescence probe |
| US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US6037130A (en) * | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
| US6150097A (en) * | 1996-04-12 | 2000-11-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Nucleic acid detection probes having non-FRET fluorescence quenching and kits and assays including such probes |
| WO2003100095A1 (en) * | 2002-05-08 | 2003-12-04 | Arkray, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
| US6821727B1 (en) | 1993-11-15 | 2004-11-23 | Applera Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
-
1991
- 1991-10-30 JP JP03285221A patent/JP3085756B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| US6103476A (en) * | 1993-11-12 | 2000-08-15 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled, dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
| JPH09504950A (en) * | 1993-11-12 | 1997-05-20 | ザ パブリック ヘルス リサーチ インスティチュート オブ ザ シティー オブ ニューヨーク インク | Hybridization probe for nucleic acid detection, common stem, method and kit |
| US6821727B1 (en) | 1993-11-15 | 2004-11-23 | Applera Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
| US6258569B1 (en) | 1994-11-16 | 2001-07-10 | The Perkin-Elmer Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
| US5723591A (en) * | 1994-11-16 | 1998-03-03 | Perkin-Elmer Corporation | Self-quenching fluorescence probe |
| US5876930A (en) * | 1994-11-16 | 1999-03-02 | Perkin-Elmer Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
| US6030787A (en) * | 1994-11-16 | 2000-02-29 | Pe Corporation | Hybridization assay using self-quenching fluorescence probe |
| WO1997019192A1 (en) * | 1995-11-20 | 1997-05-29 | Trustees Of Boston University | Method and probe for detecting a target nucleic acid sequence |
| US6150097A (en) * | 1996-04-12 | 2000-11-21 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Nucleic acid detection probes having non-FRET fluorescence quenching and kits and assays including such probes |
| US6037130A (en) * | 1998-07-28 | 2000-03-14 | The Public Health Institute Of The City Of New York, Inc. | Wavelength-shifting probes and primers and their use in assays and kits |
| WO2003100095A1 (en) * | 2002-05-08 | 2003-12-04 | Arkray, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
| EP1500710A1 (en) * | 2002-05-08 | 2005-01-26 | ARKRAY, Inc. | Method of detecting target nucleic acid |
| EP1500710A4 (en) * | 2002-05-08 | 2006-10-04 | Arkray Inc | Method of detecting target nucleic acid |
| US7220544B2 (en) | 2002-05-08 | 2007-05-22 | Arkray, Inc. | Method for detecting target nucleic acid |
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