JPH11127894A - カルボキシペプチダーゼａ活性測定方法および測定用キット - Google Patents
カルボキシペプチダーゼａ活性測定方法および測定用キットInfo
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- JPH11127894A JPH11127894A JP9298873A JP29887397A JPH11127894A JP H11127894 A JPH11127894 A JP H11127894A JP 9298873 A JP9298873 A JP 9298873A JP 29887397 A JP29887397 A JP 29887397A JP H11127894 A JPH11127894 A JP H11127894A
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- Japan
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- carboxypeptidase
- phenylalanine
- tyrosine
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 Ｎ末端が保護されている一般式（Ｉ）
【化１】Ｒ−ＣＯ−Ｘ−Ｙ−ＯＨ （Ｉ）
（式中、Ｘはメチオニン残基または芳香環を有するアミ
ノ酸残基またはその誘導体、Ｙは芳香環を有するアミノ
酸残基またはその誘導体、Ｒ−ＣＯはアミノ基の保護
基）で示されるジペプチド基質をカルボキシペプチダー
ゼＡにて分解し、生成したＨ−Ｙ−ＯＨに、これを定量
し得る酵素を作用させるカルボキシペプチダーゼＡ活性
測定方法、および一般式（Ｉ）で示される基質を必須成
分とするカルボキシペプチダーゼＡ活性測定用キット 【効果】 従来法の基質に比べて一般式（Ｉ）で示され
る基質は、カルボキシペプチダーゼＡによって分解され
るスピードが速く、カルボキシペプチダーゼＡ活性を簡
便、迅速かつ正確に測定でき、膵疾患の臨床検査の分野
で有用である。
ノ酸残基またはその誘導体、Ｙは芳香環を有するアミノ
酸残基またはその誘導体、Ｒ−ＣＯはアミノ基の保護
基）で示されるジペプチド基質をカルボキシペプチダー
ゼＡにて分解し、生成したＨ−Ｙ−ＯＨに、これを定量
し得る酵素を作用させるカルボキシペプチダーゼＡ活性
測定方法、および一般式（Ｉ）で示される基質を必須成
分とするカルボキシペプチダーゼＡ活性測定用キット 【効果】 従来法の基質に比べて一般式（Ｉ）で示され
る基質は、カルボキシペプチダーゼＡによって分解され
るスピードが速く、カルボキシペプチダーゼＡ活性を簡
便、迅速かつ正確に測定でき、膵疾患の臨床検査の分野
で有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は一般式（Ｉ）
【化３】Ｒ−ＣＯ−Ｘ−Ｙ−ＯＨ （Ｉ） （式中、すべての記号は後記と同じ意味を表わす。）で
示されるジペプチドを基質として用いることを特徴とす
るカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法および少なく
とも一般式（Ｉ）で示される基質を必須成分とするカル
ボキシペプチダーゼＡ活性測定用キットに関する。さら
に詳しくは、Ｎ末端が保護されている本発明は一般式
（Ｉ）で示されるジペプチドをカルボキシペプチダーゼ
Ａにて分解し、生成したＨ−Ｙ−ＯＨに、これを定量し
うる酵素を作用させることを特徴とするカルボキシペプ
チダーゼＡ活性測定方法、測定用キットおよびそれに用
いる新規なジペプチドに関する。
示されるジペプチドを基質として用いることを特徴とす
るカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法および少なく
とも一般式（Ｉ）で示される基質を必須成分とするカル
ボキシペプチダーゼＡ活性測定用キットに関する。さら
に詳しくは、Ｎ末端が保護されている本発明は一般式
（Ｉ）で示されるジペプチドをカルボキシペプチダーゼ
Ａにて分解し、生成したＨ−Ｙ−ＯＨに、これを定量し
うる酵素を作用させることを特徴とするカルボキシペプ
チダーゼＡ活性測定方法、測定用キットおよびそれに用
いる新規なジペプチドに関する。
【０００２】
【発明の背景】カルボキシペプチダーゼＡ（以下、ＣＰ
Ａと略記する。）は膵臓から特異的に多く分泌される蛋
白質分解酵素であり、膵疾患時に、血清、尿などに多く
出現する。そのため、体液中におけるＣＰＡの活性を測
定することは膵疾患の診断の目安とすることができ、臨
床検査の分野で有用であると考えられている（Clinical
Chemistry, 32(5), 748-751 (1986)参照）。
Ａと略記する。）は膵臓から特異的に多く分泌される蛋
白質分解酵素であり、膵疾患時に、血清、尿などに多く
出現する。そのため、体液中におけるＣＰＡの活性を測
定することは膵疾患の診断の目安とすることができ、臨
床検査の分野で有用であると考えられている（Clinical
Chemistry, 32(5), 748-751 (1986)参照）。
【０００３】
【従来の技術】ＣＰＡ活性測定方法は種々開発されてい
る。例えば以下に示すように、基質を１段階反応または
２段階反応によって分解し、生成する分解物を酵素的に
定量することによってＣＰＡ活性を測定する方法が知ら
れている。１段階反応で行なう方法としては、例えば、
（Ａ）特開昭61-74600号明細書に、反応工程式１
る。例えば以下に示すように、基質を１段階反応または
２段階反応によって分解し、生成する分解物を酵素的に
定量することによってＣＰＡ活性を測定する方法が知ら
れている。１段階反応で行なう方法としては、例えば、
（Ａ）特開昭61-74600号明細書に、反応工程式１
【０００４】
【化４】 によって示されるように、アミノ酸のカルボキシル基ま
たはペプチドのカルボキシル末端にＬ−フェニルアラニ
ンまたはその誘導体が結合されている基質にカルボキシ
ペプチダーゼＡを作用させ、生成するＬ−フェニルアラ
ニンまたはその誘導体にこれを定量しうる酵素（Ｌ−フ
ェニルアラニンオキシダーゼ、Ｌ−フェニルアラニン−
４−モノオキシゲナーゼ、Ｌ−フェニルアラニンアンモ
ニアリアーゼ、Ｌ−フェニルアラニン脱炭酸酵素、Ｌ−
フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−フェ
ニルアラニンアセチルトランスフェラーゼ等）を作用さ
せることによって、カルボキシペプチダーゼＡの活性を
測定する方法が記載されている。
たはペプチドのカルボキシル末端にＬ−フェニルアラニ
ンまたはその誘導体が結合されている基質にカルボキシ
ペプチダーゼＡを作用させ、生成するＬ−フェニルアラ
ニンまたはその誘導体にこれを定量しうる酵素（Ｌ−フ
ェニルアラニンオキシダーゼ、Ｌ−フェニルアラニン−
４−モノオキシゲナーゼ、Ｌ−フェニルアラニンアンモ
ニアリアーゼ、Ｌ−フェニルアラニン脱炭酸酵素、Ｌ−
フェニルアラニンアミノトランスフェラーゼ、Ｌ−フェ
ニルアラニンアセチルトランスフェラーゼ等）を作用さ
せることによって、カルボキシペプチダーゼＡの活性を
測定する方法が記載されている。
【０００５】この明細書では、使用できる基質として広
い範囲のペプチドが提案されているが、実際にその効果
が確認されているのは、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−Ｌ
−アラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびベンゾイル−
グリシル−Ｌ−フェニルアラニンのみである。
い範囲のペプチドが提案されているが、実際にその効果
が確認されているのは、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−Ｌ
−アラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびベンゾイル−
グリシル−Ｌ−フェニルアラニンのみである。
【０００６】一方、２段階反応で行なう方法としては、
（Ｂ）特開昭58-105948号明細書に、一般式（Ｂ）
（Ｂ）特開昭58-105948号明細書に、一般式（Ｂ）
【化５】
【０００７】（式中、ＸBはヒドロキシル基またはメト
キシ基を示す。）で示されるＸB−ベンゾイルグリシル
−Ｌ−フェニルアラニンをＣＰＡによって分解し、生成
するＸB−ベンゾイルグリシンをさらにヒプリカーゼを
用いて分解し、得られるＸB−安息香酸を４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡ）で酸化発色し、ＣＰＡの活性を
測定する方法、および
キシ基を示す。）で示されるＸB−ベンゾイルグリシル
−Ｌ−フェニルアラニンをＣＰＡによって分解し、生成
するＸB−ベンゾイルグリシンをさらにヒプリカーゼを
用いて分解し、得られるＸB−安息香酸を４−アミノア
ンチピリン（４−ＡＡ）で酸化発色し、ＣＰＡの活性を
測定する方法、および
【０００８】（Ｃ）特開昭59-85299号明細書に、一般式
（Ｃ）
（Ｃ）
【化６】
【０００９】（式中、ＸCはオルト位またはパラ位に結
合される置換基であって、オルト位に結合される場合に
はヒドロキシル基またはアミノ基、そしてパラ位に結合
される場合にはヒドロキシル基、アミノ基またはメトキ
シル基である。ＹCはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンのいずれか
のアミノ酸残基であり、ＺCはＬ−フェニルアラニン、
Ｌ−チロシンまたはＬ−トリプトファンのいずれかのア
ミノ酸残基である。）で示されるジペプチド誘導体にＣ
ＰＡを作用させてＹC−ＺC結合を切断し、生成するＸC
−ベンゾイル−ＹCをさらにヒプリカーゼによって分解
を行なった後、得られた安息香酸誘導体を４−ＡＡで比
色定量する方法あるいは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の存在
下で該安息香酸誘導体の水酸化酵素を作用させてこの補
酵素の変化を比色定量あるいは亜硝酸塩を作用させ、生
成するジアゾニウム塩に発色試薬を作用させて比色定量
することを特徴とするＣＰＡ活性測定方法が記載されて
いる。
合される置換基であって、オルト位に結合される場合に
はヒドロキシル基またはアミノ基、そしてパラ位に結合
される場合にはヒドロキシル基、アミノ基またはメトキ
シル基である。ＹCはグリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バ
リン、Ｌ−ロイシンまたはＬ−イソロイシンのいずれか
のアミノ酸残基であり、ＺCはＬ−フェニルアラニン、
Ｌ−チロシンまたはＬ−トリプトファンのいずれかのア
ミノ酸残基である。）で示されるジペプチド誘導体にＣ
ＰＡを作用させてＹC−ＺC結合を切断し、生成するＸC
−ベンゾイル−ＹCをさらにヒプリカーゼによって分解
を行なった後、得られた安息香酸誘導体を４−ＡＡで比
色定量する方法あるいは還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）の存在
下で該安息香酸誘導体の水酸化酵素を作用させてこの補
酵素の変化を比色定量あるいは亜硝酸塩を作用させ、生
成するジアゾニウム塩に発色試薬を作用させて比色定量
することを特徴とするＣＰＡ活性測定方法が記載されて
いる。
【００１０】（Ｂ）法および（Ｃ）法は一般式（Ｂ）お
よび（Ｃ）で示される基質をＣＰＡで分解した生成物に
共役酵素をさらに作用させて安息香酸の誘導体を生成さ
せ、これを定量することにより、ＣＰＡの活性を測定す
る方法である。この方法では、ＣＰＡによる基質の分解
が遅いため、迅速に測定を行なうことが困難であり、血
液や尿などの生体試料中のＣＰＡ活性を検出するには、
感度が不足していた。さらに、安息香酸誘導体の定量操
作も煩雑で測定に長時間を要するという問題があった。
よび（Ｃ）で示される基質をＣＰＡで分解した生成物に
共役酵素をさらに作用させて安息香酸の誘導体を生成さ
せ、これを定量することにより、ＣＰＡの活性を測定す
る方法である。この方法では、ＣＰＡによる基質の分解
が遅いため、迅速に測定を行なうことが困難であり、血
液や尿などの生体試料中のＣＰＡ活性を検出するには、
感度が不足していた。さらに、安息香酸誘導体の定量操
作も煩雑で測定に長時間を要するという問題があった。
【００１１】一方、（Ａ）法の明細書中、実際に効果が
確認されている基質、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびベンゾイル−グ
リシル−Ｌ−フェニルアラニンも前記と同様にＣＰＡに
よる分解が遅いため、迅速に測定を行なうことが困難で
あった。また、この明細書中にはＬ−フェニルアラニン
またはその誘導体を酵素的に定量する方法も記載されて
いる。
確認されている基質、ｐ−ヒドロキシベンゾイル−Ｌ−
アラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびベンゾイル−グ
リシル−Ｌ−フェニルアラニンも前記と同様にＣＰＡに
よる分解が遅いため、迅速に測定を行なうことが困難で
あった。また、この明細書中にはＬ−フェニルアラニン
またはその誘導体を酵素的に定量する方法も記載されて
いる。
【００１２】芳香族アミノ酸の一般的な酵素的定量法と
して種々の方法が知られている。例えば、 １）各種アミノ酸にデカルボキシラーゼを作用させ生成
した炭酸ガスをマノメトリックに測定するか、あるいは
生成したモノアミンを呈色させて測定する方法（Method
s of Enzymatic analysis., 第２版，第４巻，1662頁お
よび1669頁(1974)，Academic Press発行に記載されてい
る。）、 ２）アミノ酸にアミノ酸オキシダーゼを作用させ生成す
る過酸化水素を測定する方法（Methods of Enzymatic a
nalysis., 第３版，第２巻，１４９頁(1983)および同第
３版，第８巻，３９９頁(1985)，Academic Press発行に
記載されている。）、
して種々の方法が知られている。例えば、 １）各種アミノ酸にデカルボキシラーゼを作用させ生成
した炭酸ガスをマノメトリックに測定するか、あるいは
生成したモノアミンを呈色させて測定する方法（Method
s of Enzymatic analysis., 第２版，第４巻，1662頁お
よび1669頁(1974)，Academic Press発行に記載されてい
る。）、 ２）アミノ酸にアミノ酸オキシダーゼを作用させ生成す
る過酸化水素を測定する方法（Methods of Enzymatic a
nalysis., 第３版，第２巻，１４９頁(1983)および同第
３版，第８巻，３９９頁(1985)，Academic Press発行に
記載されている。）、
【００１３】３）Ｌ−チロシンおよびＬ−フェニルアラ
ニンにフェニルアラニンアンモニアリアーゼを作用さ
せ、それぞれクマレイトおよびシンナメイトに変換して
紫外部２９０〜３１５ｎｍで測定する方法（Science.,
197 巻、665頁(1977)に記載されている。）、 ４）Ｌ−フェニルアラニンにＬ−フェニルアラニンオキ
シダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する方
法（Clin Chim. Acta,１３６巻，１３１頁(1984)に記載
されている。）、および ５）Ｌ−フェニルアラニンにＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼを作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部３
４０ｎｍで測定するか、あるいはジアホラーゼとテトラ
ゾリウム塩を共役させ生成するホルマザン色素を測定す
る方法（Analytical Biochemistry,１７０巻，３９７頁
(1988)および同，１８０巻，９１頁(1989)に記載されて
いる。）。
ニンにフェニルアラニンアンモニアリアーゼを作用さ
せ、それぞれクマレイトおよびシンナメイトに変換して
紫外部２９０〜３１５ｎｍで測定する方法（Science.,
197 巻、665頁(1977)に記載されている。）、 ４）Ｌ−フェニルアラニンにＬ−フェニルアラニンオキ
シダーゼを作用させ、生成する過酸化水素を測定する方
法（Clin Chim. Acta,１３６巻，１３１頁(1984)に記載
されている。）、および ５）Ｌ−フェニルアラニンにＬ−フェニルアラニンデヒ
ドロゲナーゼを作用させ、生成するＮＡＤＨを紫外部３
４０ｎｍで測定するか、あるいはジアホラーゼとテトラ
ゾリウム塩を共役させ生成するホルマザン色素を測定す
る方法（Analytical Biochemistry,１７０巻，３９７頁
(1988)および同，１８０巻，９１頁(1989)に記載されて
いる。）。
【００１４】しかしながら、これらの方法は、生体試料
中のカルボキシペプチダーゼＡ活性の測定に供するに
は、いずれも欠点を有する。すなわち、前記１）法のマ
ノメトリックな測定は特殊な機器を必要とする。２）法
および４）法は用いる酵素にアミノ酸による特異性がな
く、カルボキシペプチダーゼＡ活性の測定においては、
生体試料中の種々のアミノ酸の影響を受ける。３）法
は、生体試料中の蛋白質の紫外吸収の影響を大きく受け
精度が劣るうえ、検出感度が実用に供するには不十分で
ある。一方、上記問題点を解決した芳香族アミノ酸の定
量法として、特開昭63-226299号明細書には、芳香族ア
ミノ酸に特異性のある酵素を作用させ、しかる後に生成
物を過酸化水素発生系に導き、生成した過酸化水素を定
量して、芳香族アミノ酸量を測定する方法が記載されて
いる。
中のカルボキシペプチダーゼＡ活性の測定に供するに
は、いずれも欠点を有する。すなわち、前記１）法のマ
ノメトリックな測定は特殊な機器を必要とする。２）法
および４）法は用いる酵素にアミノ酸による特異性がな
く、カルボキシペプチダーゼＡ活性の測定においては、
生体試料中の種々のアミノ酸の影響を受ける。３）法
は、生体試料中の蛋白質の紫外吸収の影響を大きく受け
精度が劣るうえ、検出感度が実用に供するには不十分で
ある。一方、上記問題点を解決した芳香族アミノ酸の定
量法として、特開昭63-226299号明細書には、芳香族ア
ミノ酸に特異性のある酵素を作用させ、しかる後に生成
物を過酸化水素発生系に導き、生成した過酸化水素を定
量して、芳香族アミノ酸量を測定する方法が記載されて
いる。
【００１５】
【発明の目的】本発明者らは、カルボキシペプチダーゼ
Ａによる基質の分解速度を向上すべく鋭意研究を重ねた
結果、一般式（Ｉ）で示されるジペプチドが、既存の基
質よりも速く分解されることを見出した。また、芳香族
アミノ酸を定量するにおいても、特開昭63-226299号明
細書に記載されている芳香族アミノ酸の定量法を本発明
で見出された基質と組み合わせることにより、カルボキ
シペプチダーゼＡ活性をさらに簡便、迅速かつ正確に測
定できることも見出し、本発明を完成した。従来技術で
記載した（Ａ）特開昭61-74600号明細書には、実際に測
定に使用した基質（ジペプチド）として、ｐ−ヒドロキ
シベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニンお
よびベンゾイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニンが実
施例１および実施例２に記載されているにすぎない。
Ａによる基質の分解速度を向上すべく鋭意研究を重ねた
結果、一般式（Ｉ）で示されるジペプチドが、既存の基
質よりも速く分解されることを見出した。また、芳香族
アミノ酸を定量するにおいても、特開昭63-226299号明
細書に記載されている芳香族アミノ酸の定量法を本発明
で見出された基質と組み合わせることにより、カルボキ
シペプチダーゼＡ活性をさらに簡便、迅速かつ正確に測
定できることも見出し、本発明を完成した。従来技術で
記載した（Ａ）特開昭61-74600号明細書には、実際に測
定に使用した基質（ジペプチド）として、ｐ−ヒドロキ
シベンゾイル−Ｌ−アラニル−Ｌ−フェニルアラニンお
よびベンゾイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニンが実
施例１および実施例２に記載されているにすぎない。
【００１６】本発明方法で基質として使用する一般式
（Ｉ）で示されるジペプチドは、Ｘがメチオニン残基ま
たは芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体を表
わすが、上記基質のＸに相当する部分はＬ−アラニンお
よびグリシンを表わす点で、両者は相違する。
（Ｉ）で示されるジペプチドは、Ｘがメチオニン残基ま
たは芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体を表
わすが、上記基質のＸに相当する部分はＬ−アラニンお
よびグリシンを表わす点で、両者は相違する。
【００１７】
【発明の構成】本発明は、（１）一般式（Ｉ）
【化７】Ｒ−ＣＯ−Ｘ−Ｙ−ＯＨ （Ｉ） （式中、Ｘはメチオニン残基または芳香環を有するアミ
ノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｙは芳香環を有す
るアミノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｒ−ＣＯは
アミノ基の保護基を表わす。）で示されるＮ末端が保護
されているジペプチドを基質として用いることを特徴と
するカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法、（２）少
なくとも一般式（Ｉ）で示される基質を必須成分とする
カルボキシペプチダーゼＡ活性の測定用のキット、およ
び（３）それに使用する新規なジペプチド化合物に関す
る。
ノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｙは芳香環を有す
るアミノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｒ−ＣＯは
アミノ基の保護基を表わす。）で示されるＮ末端が保護
されているジペプチドを基質として用いることを特徴と
するカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法、（２）少
なくとも一般式（Ｉ）で示される基質を必須成分とする
カルボキシペプチダーゼＡ活性の測定用のキット、およ
び（３）それに使用する新規なジペプチド化合物に関す
る。
【００１８】具体的に説明すると、本発明は以下の反応
工程式２
工程式２
【化８】
【００１９】（反応工程式中、すべての記号は前記と同
じ意味を表わす。）によって示されるように、一般式
（Ｉ）で示されるＮ末端が保護されているジペプチドを
基質とし、これにカルボキシペプチダーゼＡを作用させ
て、Ｘ−Ｙ結合を分解した後、生じた一般式（II）で示
される芳香環を有するアミノ酸または誘導体に特異性の
ある酵素を作用させ、しかる後に生成物を過酸化水素発
生系へ導き、生成した過酸化水素を定量して、Ｈ−Ｙ−
ＯＨの量を測定することを特徴とするカルボキシペプチ
ダーゼＡ活性測定方法、それに用いる測定用キットおよ
びそれに用いる新規なジペプチド化合物に関する。
じ意味を表わす。）によって示されるように、一般式
（Ｉ）で示されるＮ末端が保護されているジペプチドを
基質とし、これにカルボキシペプチダーゼＡを作用させ
て、Ｘ−Ｙ結合を分解した後、生じた一般式（II）で示
される芳香環を有するアミノ酸または誘導体に特異性の
ある酵素を作用させ、しかる後に生成物を過酸化水素発
生系へ導き、生成した過酸化水素を定量して、Ｈ−Ｙ−
ＯＨの量を測定することを特徴とするカルボキシペプチ
ダーゼＡ活性測定方法、それに用いる測定用キットおよ
びそれに用いる新規なジペプチド化合物に関する。
【００２０】本発明においては、特に指示しない限り異
性体はこれをすべて包含する。例えば、アルキル基およ
びアルコキシ基には直鎖のもの、分岐鎖のものが含まれ
る。また、分岐鎖のアルキル基が存在する場合等の不斉
炭素原子の存在により生ずる異性体基も含まれる。
性体はこれをすべて包含する。例えば、アルキル基およ
びアルコキシ基には直鎖のもの、分岐鎖のものが含まれ
る。また、分岐鎖のアルキル基が存在する場合等の不斉
炭素原子の存在により生ずる異性体基も含まれる。
【００２１】一般式（Ｉ）中、ＸおよびＹによって表わ
される芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体と
は、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトフ
ァン、ナフチルアラニンおよびそれらの芳香環が水酸
基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子
（ヨウ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子）等に
よって置換されたアミノ酸等の残基が挙げられる。好ま
しいＸとして、メチオニン、フェニルアラニン、チロシ
ンが挙げられ、より好ましいＸとして、Ｌ−メチオニン
が挙げられる。好ましいＹとして、フェニルアラニン、
チロシン、トリプトファン、ナフチルアラニンが挙げら
れ、より好ましいＹとして、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニ
ルアラニンが挙げられる。
される芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体と
は、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトフ
ァン、ナフチルアラニンおよびそれらの芳香環が水酸
基、Ｃ１〜４アルコキシ基、ニトロ基、ハロゲン原子
（ヨウ素原子、塩素原子、フッ素原子、臭素原子）等に
よって置換されたアミノ酸等の残基が挙げられる。好ま
しいＸとして、メチオニン、フェニルアラニン、チロシ
ンが挙げられ、より好ましいＸとして、Ｌ−メチオニン
が挙げられる。好ましいＹとして、フェニルアラニン、
チロシン、トリプトファン、ナフチルアラニンが挙げら
れ、より好ましいＹとして、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニ
ルアラニンが挙げられる。
【００２２】一般式（Ｉ）中、Ｒ−ＣＯによって表わさ
れるアミノ基の保護基としては、一般的に知られている
ものなら何でもよい。好ましくは、Ｒは水素原子、Ｃ１
〜８アルキル基、Ｃ１〜８アルコキシ基、フェニル基、
ベンジルオキシ基、Ｃ２〜５アシル基、９−フルオレニ
ルメトキシ基、カルボキシメチル基等が挙げられる。ま
た、フェニル基およびベンジルオキシ基中のフェニル基
は、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、水酸
基、ニトロ基、ハロゲン原子等により置換されていても
よい。
れるアミノ基の保護基としては、一般的に知られている
ものなら何でもよい。好ましくは、Ｒは水素原子、Ｃ１
〜８アルキル基、Ｃ１〜８アルコキシ基、フェニル基、
ベンジルオキシ基、Ｃ２〜５アシル基、９−フルオレニ
ルメトキシ基、カルボキシメチル基等が挙げられる。ま
た、フェニル基およびベンジルオキシ基中のフェニル基
は、Ｃ１〜４アルキル基、Ｃ１〜４アルコキシ基、水酸
基、ニトロ基、ハロゲン原子等により置換されていても
よい。
【００２３】Ｒ−ＣＯの好ましい具体例としては、ホル
ミル基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、ベ
ンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ピルボイル
基、ｐ−ヒドロキシベンゾイル基、９−フルオレニルメ
トキシカルボニル基、サクシニル基等が挙げられる。よ
り好ましいＲ−ＣＯとして、アセチル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基が挙げられ
る。
ミル基、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基、ベ
ンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ピルボイル
基、ｐ−ヒドロキシベンゾイル基、９−フルオレニルメ
トキシカルボニル基、サクシニル基等が挙げられる。よ
り好ましいＲ−ＣＯとして、アセチル基、ベンジルオキ
シカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基が挙げられ
る。
【００２４】Ｒによって表わされるＣ１〜８アルキル基
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘ
キシル、ヘプチル、オクチル基およびそれらの異性体を
表わす。Ｒによって表わされるＣ１〜８アルコキシ基
は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペン
チルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチ
ルオキシ基およびそれらの異性体を表わす。Ｒによって
表わされるＣ２〜５アシル基はアセチル、プロピオニ
ル、ブチリル、バレリル基およびそれらの異性体を表わ
す。
は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘ
キシル、ヘプチル、オクチル基およびそれらの異性体を
表わす。Ｒによって表わされるＣ１〜８アルコキシ基
は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペン
チルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチ
ルオキシ基およびそれらの異性体を表わす。Ｒによって
表わされるＣ２〜５アシル基はアセチル、プロピオニ
ル、ブチリル、バレリル基およびそれらの異性体を表わ
す。
【００２５】Ｒによって表わされるフェニル基およびベ
ンジルオキシ基中のフェニル基の置換基であるＣ１〜４
アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル基お
よびそれらの異性体である。Ｒによって表わされるフェ
ニル基およびベンジルオキシ基中のフェニル基の置換基
であるＣ１〜４アルコキシ基、ＸおよびＹによって表わ
される芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体中
の芳香環の置換基としてのＣ１〜４アルコキシ基とは、
メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ基およびそ
れらの異性体である。
ンジルオキシ基中のフェニル基の置換基であるＣ１〜４
アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチル基お
よびそれらの異性体である。Ｒによって表わされるフェ
ニル基およびベンジルオキシ基中のフェニル基の置換基
であるＣ１〜４アルコキシ基、ＸおよびＹによって表わ
される芳香環を有するアミノ酸残基またはその誘導体中
の芳香環の置換基としてのＣ１〜４アルコキシ基とは、
メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ基およびそ
れらの異性体である。
【００２６】一般式（Ｉ）で示されるジペプチドのう
ち、Ｒがアセチル基を表わし、Ｘがメチオニンの残基を
表わし、ＹがＬ−チロシンの残基またはＬ−フェニルア
ラニンの残基を表わす化合物、すなわちアセチル−Ｌ−
メチオニル−Ｌ−チロシンおよびアセチル−Ｌ−メチオ
ニル−Ｌ−フェニルアラニンは新規な化合物である。一
般式（Ｉ）で示されるジペプチドは公知のペプチド合成
法、例えば、「ペプチド合成」（丸善（株）発行1975年
１１６〜１５８頁）記載の方法等により容易に合成する
ことができる。また市販品を入手することも可能であ
る。例えば、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニ
ル−Ｌ−チロシンは公知化合物であり、アセチル−Ｌ−
フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−
Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−Ｌ−チロ
シル−Ｌ−チロシン、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フ
ェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｔ−ブト
キシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン
は市販されている。
ち、Ｒがアセチル基を表わし、Ｘがメチオニンの残基を
表わし、ＹがＬ−チロシンの残基またはＬ−フェニルア
ラニンの残基を表わす化合物、すなわちアセチル−Ｌ−
メチオニル−Ｌ−チロシンおよびアセチル−Ｌ−メチオ
ニル−Ｌ−フェニルアラニンは新規な化合物である。一
般式（Ｉ）で示されるジペプチドは公知のペプチド合成
法、例えば、「ペプチド合成」（丸善（株）発行1975年
１１６〜１５８頁）記載の方法等により容易に合成する
ことができる。また市販品を入手することも可能であ
る。例えば、ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−メチオニ
ル−Ｌ−チロシンは公知化合物であり、アセチル−Ｌ−
フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−
Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン、アセチル−Ｌ−
チロシル−Ｌ−フェニルアラニン、アセチル−Ｌ−チロ
シル−Ｌ−チロシン、ｔ−ブトキシカルボニル−Ｌ−フ
ェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンおよびｔ−ブト
キシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−チロシン
は市販されている。
【００２７】この測定対象であるＣＰＡは膵臓由来の蛋
白質分解酵素で、ペプチドおよび蛋白質のカルボキシル
基末端からアミノ酸を順次分解していくエキソペプチダ
ーゼである。このＣＰＡは臨床分析の場合には血清とか
尿のような体液に含まれた状態で測定に供されるが、本
発明の方法を適用する状態はこれに限定されるものでは
なく、測定目的に応じ種々の状態のものであってよいこ
とはいうまでもない。
白質分解酵素で、ペプチドおよび蛋白質のカルボキシル
基末端からアミノ酸を順次分解していくエキソペプチダ
ーゼである。このＣＰＡは臨床分析の場合には血清とか
尿のような体液に含まれた状態で測定に供されるが、本
発明の方法を適用する状態はこれに限定されるものでは
なく、測定目的に応じ種々の状態のものであってよいこ
とはいうまでもない。
【００２８】カルボキシペプチダーゼＡによって分解さ
れ、生成する芳香環を有するアミノ酸または誘導体（Ｈ
−Ｙ−ＯＨ）を酵素的に定量する方法は、特開昭63-226
299号明細書記載の方法により行なうことができる。そ
の方法を以下に具体的に説明する。Ｈ−Ｙ−ＯＨで示さ
れる芳香族アミノ酸、具体的にはＬ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニンおよびそれらの誘導体に特異性のあ
る酵素として以下のものが挙げられる。
れ、生成する芳香環を有するアミノ酸または誘導体（Ｈ
−Ｙ−ＯＨ）を酵素的に定量する方法は、特開昭63-226
299号明細書記載の方法により行なうことができる。そ
の方法を以下に具体的に説明する。Ｈ−Ｙ−ＯＨで示さ
れる芳香族アミノ酸、具体的にはＬ−チロシンまたはＬ
−フェニルアラニンおよびそれらの誘導体に特異性のあ
る酵素として以下のものが挙げられる。
【００２９】チロシンに特異性のある酵素としてチロシ
ンデカルボキシラーゼおよびβ−チロシナーゼが挙げら
れ、フェニルアラニンに特異性のある酵素としてフェニ
ルアラニンデカルボキシラーゼおよびフェニルアラニン
４−モノオキシゲナーゼが挙げられる。さらに、チロ
シンデカルボキシラーゼは高濃度ではフェニルアラニン
にも作用することが知られている。
ンデカルボキシラーゼおよびβ−チロシナーゼが挙げら
れ、フェニルアラニンに特異性のある酵素としてフェニ
ルアラニンデカルボキシラーゼおよびフェニルアラニン
４−モノオキシゲナーゼが挙げられる。さらに、チロ
シンデカルボキシラーゼは高濃度ではフェニルアラニン
にも作用することが知られている。
【００３０】各酵素はいかなる生物に由来するものでも
よいが、例えばフェニルアラニンデカルボキシラーゼは
ストレプトコッカス・ファエカリス（Streptococcus fa
ecalis）より調製され、フェニルアラニン ４−モノオ
キシゲナーゼはラットの肝臓（J. Biol. Chem., 245, 4
745 (1970)参照）やシュードモナス（Pseudomonas, J.
Biol. Chem., 250, 6672 (1975)参照）より抽出精製さ
れる。このフェニルアラニン ４−モノオキシゲナーゼ
は６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリジ
ン（ＭＴＨＰ）存在下、定量的にフェニルアラニンをチ
ロシンに変換する。また、チロシンデカルボキシラーゼ
としてはストレプトコッカス・ファエカリスのアセトン
乾燥菌体より破砕抽出、分子篩等で精製したチロシンデ
カルボキシラーゼのアポ酵素が用いられ、これをピリド
キサールリン酸存在下に作用させてチラミンに変換す
る。もちろん、同酵素のホロ酵素を用いる場合にはピリ
ドキサールリン酸は不要である。さらにβ−チロシナー
ゼはエシェリシア・インターメディア（Escherichia in
termedia, J. Biol. Chem., 245, 1767および1773 (197
0)参照）より精製される。これらの酵素を作用させるこ
とにより、チロシンまたはフェニルアラニンをチラミ
ン、β−フェニルエチルアミンまたはピルビン酸に導く
ことができる。
よいが、例えばフェニルアラニンデカルボキシラーゼは
ストレプトコッカス・ファエカリス（Streptococcus fa
ecalis）より調製され、フェニルアラニン ４−モノオ
キシゲナーゼはラットの肝臓（J. Biol. Chem., 245, 4
745 (1970)参照）やシュードモナス（Pseudomonas, J.
Biol. Chem., 250, 6672 (1975)参照）より抽出精製さ
れる。このフェニルアラニン ４−モノオキシゲナーゼ
は６−メチル−５，６，７，８−テトラヒドロプテリジ
ン（ＭＴＨＰ）存在下、定量的にフェニルアラニンをチ
ロシンに変換する。また、チロシンデカルボキシラーゼ
としてはストレプトコッカス・ファエカリスのアセトン
乾燥菌体より破砕抽出、分子篩等で精製したチロシンデ
カルボキシラーゼのアポ酵素が用いられ、これをピリド
キサールリン酸存在下に作用させてチラミンに変換す
る。もちろん、同酵素のホロ酵素を用いる場合にはピリ
ドキサールリン酸は不要である。さらにβ−チロシナー
ゼはエシェリシア・インターメディア（Escherichia in
termedia, J. Biol. Chem., 245, 1767および1773 (197
0)参照）より精製される。これらの酵素を作用させるこ
とにより、チロシンまたはフェニルアラニンをチラミ
ン、β−フェニルエチルアミンまたはピルビン酸に導く
ことができる。
【００３１】好ましくは、（１）チロシンにチロシンデ
カルボキシラーゼ0.1〜２Ｕ／ｍｌ（最終濃度を意味
し、以下同様。また、アポ酵素を用いる場合には、アポ
酵素0.1〜２Ｕ／ｍｌとピリドキサールリン酸1μＭ〜１
ｍＭを用いる）を作用させ、チラミンに変換するか、
（２）チロシンにβ−チロシナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌを
作用させ、ピルビン酸に変換するか、（３）フェニルア
ラニンにフェニルアラニンデカルボキシラーゼ0.1〜５
Ｕ／ｍｌを作用させ、β−フェニルエチルアミンに変換
するか、（４）フェニルアラニンにＭＴＨＰ１０μＭ〜
１ｍＭ存在下、フェニルアラニン４−モノオキシゲナー
ゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌとチロシンデカルボキシラーゼ0.1〜
２Ｕ／ｍｌ（アポ酵素を用いる場合は前記と同じ）を組
み合わせて作用させ、チラミンに変換するか、（５）フ
ェニルアラニンにＭＴＨＰ１０μＭ〜１ｍＭ存在下、フ
ェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍ
ｌとβ−チロシナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌを組み合わせて
作用させ、ピルビン酸に変換するか、（６）チロシンに
チロシンデカルボキシラーゼを（１）で用いる場合の１
０〜５０倍（アポ酵素を用いる場合も１０〜５０倍）、
好ましくは、最終濃度で１〜２０Ｕ／ｍｌ作用させ、β
−フェニルエチルアミンに変換する方法が挙げられる。
カルボキシラーゼ0.1〜２Ｕ／ｍｌ（最終濃度を意味
し、以下同様。また、アポ酵素を用いる場合には、アポ
酵素0.1〜２Ｕ／ｍｌとピリドキサールリン酸1μＭ〜１
ｍＭを用いる）を作用させ、チラミンに変換するか、
（２）チロシンにβ−チロシナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌを
作用させ、ピルビン酸に変換するか、（３）フェニルア
ラニンにフェニルアラニンデカルボキシラーゼ0.1〜５
Ｕ／ｍｌを作用させ、β−フェニルエチルアミンに変換
するか、（４）フェニルアラニンにＭＴＨＰ１０μＭ〜
１ｍＭ存在下、フェニルアラニン４−モノオキシゲナー
ゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌとチロシンデカルボキシラーゼ0.1〜
２Ｕ／ｍｌ（アポ酵素を用いる場合は前記と同じ）を組
み合わせて作用させ、チラミンに変換するか、（５）フ
ェニルアラニンにＭＴＨＰ１０μＭ〜１ｍＭ存在下、フ
ェニルアラニン４−モノオキシゲナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍ
ｌとβ−チロシナーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌを組み合わせて
作用させ、ピルビン酸に変換するか、（６）チロシンに
チロシンデカルボキシラーゼを（１）で用いる場合の１
０〜５０倍（アポ酵素を用いる場合も１０〜５０倍）、
好ましくは、最終濃度で１〜２０Ｕ／ｍｌ作用させ、β
−フェニルエチルアミンに変換する方法が挙げられる。
【００３２】次に、チロシンもしくは、フェニルアラニ
ンの代謝物（チラミン、β−フェニルエチルアミン、ピ
ルビン酸）を過酸化水素発生系へ導く方法としては、
（１）チラミンおよびβ−フェニルエチルアミンにチラ
ミンオキシダーゼを作用させる方法（チラミンオキシダ
ーゼは、チラミンだけでなくβ−フェニルエチルアミン
にも作用し、過酸化水素を発生させる。）、（２）ピル
ビン酸にチアミンピロフォスフェートおよびフラビンア
デニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼ
を作用させる方法、（３）ピルビン酸にＮＡＤＨ（還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）存在下、乳
酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを作用させる方
法等が挙げられる。これらの反応に用いる酵素および試
薬はいずれも市販されている。
ンの代謝物（チラミン、β−フェニルエチルアミン、ピ
ルビン酸）を過酸化水素発生系へ導く方法としては、
（１）チラミンおよびβ−フェニルエチルアミンにチラ
ミンオキシダーゼを作用させる方法（チラミンオキシダ
ーゼは、チラミンだけでなくβ−フェニルエチルアミン
にも作用し、過酸化水素を発生させる。）、（２）ピル
ビン酸にチアミンピロフォスフェートおよびフラビンア
デニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼ
を作用させる方法、（３）ピルビン酸にＮＡＤＨ（還元
型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）存在下、乳
酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを作用させる方
法等が挙げられる。これらの反応に用いる酵素および試
薬はいずれも市販されている。
【００３３】用いる酵素量は、チラミンオキシダーゼを
用いる場合には、同酵素0.1〜５Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸
オキシダーゼを用いる場合には、同酵素１〜２０Ｕ／ｍ
ｌ、チアミンピロフォスフェート0.1〜１ｍＭおよびフ
ラビンアデニンジヌクレオチド１μＭ〜0.1ｍＭ、さら
に乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを用いる場
合には、乳酸デヒドロゲナーゼ１〜２０Ｕ／ｍｌ、乳酸
オキシダーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌおよびＮＡＤＨ0.1〜１ｍ
Ｍが適当である。
用いる場合には、同酵素0.1〜５Ｕ／ｍｌ、ピルビン酸
オキシダーゼを用いる場合には、同酵素１〜２０Ｕ／ｍ
ｌ、チアミンピロフォスフェート0.1〜１ｍＭおよびフ
ラビンアデニンジヌクレオチド１μＭ〜0.1ｍＭ、さら
に乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを用いる場
合には、乳酸デヒドロゲナーゼ１〜２０Ｕ／ｍｌ、乳酸
オキシダーゼ0.1〜５Ｕ／ｍｌおよびＮＡＤＨ0.1〜１ｍ
Ｍが適当である。
【００３４】生成した過酸化水素は公知の過酸化水素検
出系を用いて測定される。代表的な系としてはペルオキ
シダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリンなどを利
用し、各種のフェノール類あるいはアニリン類とのカッ
プリングにより色原体を発色させる方法、あるいはペル
オキシダーゼの存在下ロイコ化合物、メチレンブルー等
の色原体を発色させる方法があるが、これらに限定され
るものではない。それらの使用濃度は公知の方法におい
て採用されている測定試薬のそれに準じて適宜設定する
ことができる。
出系を用いて測定される。代表的な系としてはペルオキ
シダーゼの存在下に、４−アミノアンチピリンなどを利
用し、各種のフェノール類あるいはアニリン類とのカッ
プリングにより色原体を発色させる方法、あるいはペル
オキシダーゼの存在下ロイコ化合物、メチレンブルー等
の色原体を発色させる方法があるが、これらに限定され
るものではない。それらの使用濃度は公知の方法におい
て採用されている測定試薬のそれに準じて適宜設定する
ことができる。
【００３５】本発明に用いる緩衝液は、用いる基質によ
り活性の面で有利となるものであればよいが、ｐＨ5.0
〜8.0、望ましくはｐＨ6.0〜7.5のものである。例え
ば、ＭＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、マック
イルバイン（McIlvaine）緩衝液等が挙げられ、好まし
くは、ＭＥＳ緩衝液である。緩衝液は２０〜３００ｍＭ
の範囲の濃度で用いられる。
り活性の面で有利となるものであればよいが、ｐＨ5.0
〜8.0、望ましくはｐＨ6.0〜7.5のものである。例え
ば、ＭＥＳ緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、マック
イルバイン（McIlvaine）緩衝液等が挙げられ、好まし
くは、ＭＥＳ緩衝液である。緩衝液は２０〜３００ｍＭ
の範囲の濃度で用いられる。
【００３６】また、本発明のＣＰＡ活性測定用キットの
成分としては、少なくとも以下(i)〜(iii)の成分を含ん
でいればよいが、もちろんこれらに限定されるものでは
ない。 (i)一般式（Ｉ）で示されるジペプチド、(ii)一般式
（Ｉ）で示されるジペプチドの分解によって産生される
Ｈ−Ｙ−ＯＨを定量するために必要な酵素および試薬、
(iii)緩衝液。
成分としては、少なくとも以下(i)〜(iii)の成分を含ん
でいればよいが、もちろんこれらに限定されるものでは
ない。 (i)一般式（Ｉ）で示されるジペプチド、(ii)一般式
（Ｉ）で示されるジペプチドの分解によって産生される
Ｈ−Ｙ−ＯＨを定量するために必要な酵素および試薬、
(iii)緩衝液。
【００３７】
【実施例】以下、本発明を製造例および実施例を挙げて
詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。クロマトグラフィーによる分離の箇所に示されてい
るカッコ内の溶媒は、使用した溶出溶媒または展開溶媒
を示し、割合は体積比を表わす。
詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではな
い。クロマトグラフィーによる分離の箇所に示されてい
るカッコ内の溶媒は、使用した溶出溶媒または展開溶媒
を示し、割合は体積比を表わす。
【００３８】製造例１：アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ
−チロシンの製造 Ａｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（2.093ｇ）および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（1.54ｇ）のジメチルホルムアミド
（１００ｍｌ）溶液を０℃に冷却後、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（2.
27ｇ）を加え、３０分間撹拌した。反応混合溶液にＨ−
Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）・塩酸塩（1.64
3g）およびジイソプロピルエチルアミン（９５７μｌ）
のジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）溶液を加え、室温
で１８時間撹拌した。反応混合溶液を濃縮し、酢酸エチ
ルで抽出した。抽出液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液
（２回）、飽和シュウ酸水溶液（２回）、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液（２回）および飽和食塩水（１回）で
順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮し
た。得られた残留物を室温にて、４Ｎ−塩酸／ジオキサ
ン溶液（２０ｍｌ）に溶解し、１４時間撹拌した。反応
混合溶液を濃縮し、残留物をアセトニトリルを用いて再
結晶操作を２回行ない、下記物性値を有する標題化合物
（1.141ｇ）を白色結晶で得た。
−チロシンの製造 Ａｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ（2.093ｇ）および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール（1.54ｇ）のジメチルホルムアミド
（１００ｍｌ）溶液を０℃に冷却後、１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（2.
27ｇ）を加え、３０分間撹拌した。反応混合溶液にＨ−
Ｔｙｒ（ｔ−Ｂｕ）−（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）・塩酸塩（1.64
3g）およびジイソプロピルエチルアミン（９５７μｌ）
のジメチルホルムアミド（１５ｍｌ）溶液を加え、室温
で１８時間撹拌した。反応混合溶液を濃縮し、酢酸エチ
ルで抽出した。抽出液を１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液
（２回）、飽和シュウ酸水溶液（２回）、飽和炭酸水素
ナトリウム水溶液（２回）および飽和食塩水（１回）で
順次洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥後、濃縮し
た。得られた残留物を室温にて、４Ｎ−塩酸／ジオキサ
ン溶液（２０ｍｌ）に溶解し、１４時間撹拌した。反応
混合溶液を濃縮し、残留物をアセトニトリルを用いて再
結晶操作を２回行ない、下記物性値を有する標題化合物
（1.141ｇ）を白色結晶で得た。
【００３９】ＴＬＣ：Ｒｆ 0.45（クロロホルム：メタ
ノール：酢酸＝１６：３：１）； ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 354(M+),280； ＮＭＲ（CDCl3）：δ 7.39(1H,d,J=8.5Hz), 7.00(2H,d,
J=8.5Hz), 6.71(2H,d,J=8.5Hz), 4.70(1H,dd,J=12.5,5.
0Hz), 4.50(1H,t,J=7.0Hz), 3.76(2H,br), 3.12(1H,dd,
J=13.0,5.0Hz), 2.92(1H,dd,J=13.0,7.5Hz), 2.48(2H,
t,J=7.5Hz), 2.05(3H,s), 1.95(3H,s), 2.10-1.85(2H,
m)。
ノール：酢酸＝１６：３：１）； ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 354(M+),280； ＮＭＲ（CDCl3）：δ 7.39(1H,d,J=8.5Hz), 7.00(2H,d,
J=8.5Hz), 6.71(2H,d,J=8.5Hz), 4.70(1H,dd,J=12.5,5.
0Hz), 4.50(1H,t,J=7.0Hz), 3.76(2H,br), 3.12(1H,dd,
J=13.0,5.0Hz), 2.92(1H,dd,J=13.0,7.5Hz), 2.48(2H,
t,J=7.5Hz), 2.05(3H,s), 1.95(3H,s), 2.10-1.85(2H,
m)。
【００４０】製造例２：アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ
−フェニルアラニンの製造 トリエチルアミン（0.709ｍｌ）、水（1.6ｍｌ）および
１，２−ジクロロエタン（８０ｍｌ）の混合溶液にＬ−
フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（1.168ｇ）を
溶解し、室温で２０分間撹拌した。反応混合溶液に１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（７８０ｍｇ）およびア
セチル−Ｌ−メチオニン（８１０ｍｇ）を加え、５分間
撹拌後、カルボジイミド（８９０ｍｇ）水溶液（５ｍ
ｌ）を滴下し、１時間撹拌した。反応混合溶液を酢酸エ
チルで抽出した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮した。残留物を混合溶媒（酢酸エチル：ヘキサ
ン＝１：２）を用いて再結晶操作を行ない、アセチル−
Ｌ−メチオニル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル
（1.218ｇ）を得た。これをメタノール（２０ｍｌ）に
溶解し、０℃にて、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液（4.
3ｍｌ）をゆっくりと加え、２時間撹拌した。反応混合
溶液に２Ｎ−塩酸（８７５μｌ）を加え、ｐＨ６とし
た。メタノールを蒸発乾固し、残留物を水（１０ｍｌ）
に溶解し、２Ｎ−塩酸（１ｍｌ）を加え、白色沈殿をろ
過した。ろ過物をイソプロパノールで２回再結晶し、下
記物性値を有する標題化合物（７７５ｍｇ）を得た。
−フェニルアラニンの製造 トリエチルアミン（0.709ｍｌ）、水（1.6ｍｌ）および
１，２−ジクロロエタン（８０ｍｌ）の混合溶液にＬ−
フェニルアラニンエチルエステル塩酸塩（1.168ｇ）を
溶解し、室温で２０分間撹拌した。反応混合溶液に１−
ヒドロキシベンゾトリアゾール（７８０ｍｇ）およびア
セチル−Ｌ−メチオニン（８１０ｍｇ）を加え、５分間
撹拌後、カルボジイミド（８９０ｍｇ）水溶液（５ｍ
ｌ）を滴下し、１時間撹拌した。反応混合溶液を酢酸エ
チルで抽出した。抽出液を無水硫酸マグネシウムで乾燥
後、濃縮した。残留物を混合溶媒（酢酸エチル：ヘキサ
ン＝１：２）を用いて再結晶操作を行ない、アセチル−
Ｌ−メチオニル−Ｌ−フェニルアラニンエチルエステル
（1.218ｇ）を得た。これをメタノール（２０ｍｌ）に
溶解し、０℃にて、１Ｎ−水酸化ナトリウム水溶液（4.
3ｍｌ）をゆっくりと加え、２時間撹拌した。反応混合
溶液に２Ｎ−塩酸（８７５μｌ）を加え、ｐＨ６とし
た。メタノールを蒸発乾固し、残留物を水（１０ｍｌ）
に溶解し、２Ｎ−塩酸（１ｍｌ）を加え、白色沈殿をろ
過した。ろ過物をイソプロパノールで２回再結晶し、下
記物性値を有する標題化合物（７７５ｍｇ）を得た。
【００４１】ＴＬＣ：Ｒｆ 0.42（酢酸エチル：メタノ
ール：水＝７：２：１）； ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 339(M++1),265,167,120； ＮＭＲ（CD3OD）：δ 7.35-7.15(5H,m), 4.75(1H,dd,J=
7.0,5.0Hz), 4.50(1H,dd,J=7.5,5.5Hz), 3.22(1H,dd,J=
13.5,5.0Hz), 3.02(1H,dd,J=13.5,7.0Hz), 2.50(2H,t,J
=7.5Hz), 2.07(3H,s), 1.98(3H,s), 2.02(1H,dd,J=13.
0,6.0Hz), 1.85(1H,dd,J=13.0,6.5Hz)。
ール：水＝７：２：１）； ＭＳ（ＥＩ）：ｍ／ｚ 339(M++1),265,167,120； ＮＭＲ（CD3OD）：δ 7.35-7.15(5H,m), 4.75(1H,dd,J=
7.0,5.0Hz), 4.50(1H,dd,J=7.5,5.5Hz), 3.22(1H,dd,J=
13.5,5.0Hz), 3.02(1H,dd,J=13.5,7.0Hz), 2.50(2H,t,J
=7.5Hz), 2.07(3H,s), 1.98(3H,s), 2.02(1H,dd,J=13.
0,6.0Hz), 1.85(1H,dd,J=13.0,6.5Hz)。
【００４２】比較例１：ヒト由来ＣＰＡによる各種基質
の分解速度比較 ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.3，２０ｍ
Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、各種のＮ末端保護の
ペプチド誘導体からなる基質溶液（１０ｍＭ，４５０μ
ｌ）に、ＣＰＡ（ヒト由来，５０μｌ）を添加し、３７
℃で１２０分間インキュベートした後、0.04Ｎ−塩酸
（５００μｌ）を加え（ｐＨ2.0）、反応を停止させ除
蛋白後、この反応液をアミノ酸分析装置に供して、生成
したアミノ酸を定量し、基質の分解速度を比較した。各
種のＮ末端保護のペプチド誘導体を基質として、酵素活
性を測定した結果を表１に示す。なお、表中の酵素活性
は、ベンゾイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニン（特
開昭61-74600号明細書記載化合物）に対する加水分解速
度を１００とした相対加水分解速度で示してある。
の分解速度比較 ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.3，２０ｍ
Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、各種のＮ末端保護の
ペプチド誘導体からなる基質溶液（１０ｍＭ，４５０μ
ｌ）に、ＣＰＡ（ヒト由来，５０μｌ）を添加し、３７
℃で１２０分間インキュベートした後、0.04Ｎ−塩酸
（５００μｌ）を加え（ｐＨ2.0）、反応を停止させ除
蛋白後、この反応液をアミノ酸分析装置に供して、生成
したアミノ酸を定量し、基質の分解速度を比較した。各
種のＮ末端保護のペプチド誘導体を基質として、酵素活
性を測定した結果を表１に示す。なお、表中の酵素活性
は、ベンゾイル−グリシル−Ｌ−フェニルアラニン（特
開昭61-74600号明細書記載化合物）に対する加水分解速
度を１００とした相対加水分解速度で示してある。
【００４３】
【表１】
【００４４】表１の結果から、本発明化合物は比較化合
物に対して加水分解速度が向上していることが明らかで
ある。
物に対して加水分解速度が向上していることが明らかで
ある。
【００４５】比較例２：急性膵炎患者血清中ＣＰＡによ
る各種基質の分解速度比較 ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.3，２０ｍ
Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ベンゾイル−グリシ
ル−Ｌ−フェニルアラニン（特開昭61-74600号明細書記
載化合物，１０ｍＭ）あるいはアセチル−Ｌ−メチオニ
ル−Ｌ−チロシン（製造例１で製造した化合物）からな
る基質溶液（３６０μｌ）に、急性膵炎患者血清（４０
μｌ）を添加し、３７℃で１２０分間インキュベートし
た後、0.04Ｍ−塩酸（４００μｌ）を加え、反応を停止
させ、除蛋白後、この反応液をアミノ酸分析装置に供し
て、生成したＬ−フェニルアラニンあるいはＬ−チロシ
ンを定量した。結果を表２に示す。
る各種基質の分解速度比較 ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.3，２０ｍ
Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ベンゾイル−グリシ
ル−Ｌ−フェニルアラニン（特開昭61-74600号明細書記
載化合物，１０ｍＭ）あるいはアセチル−Ｌ−メチオニ
ル−Ｌ−チロシン（製造例１で製造した化合物）からな
る基質溶液（３６０μｌ）に、急性膵炎患者血清（４０
μｌ）を添加し、３７℃で１２０分間インキュベートし
た後、0.04Ｍ−塩酸（４００μｌ）を加え、反応を停止
させ、除蛋白後、この反応液をアミノ酸分析装置に供し
て、生成したＬ−フェニルアラニンあるいはＬ−チロシ
ンを定量した。結果を表２に示す。
【００４６】
【表２】
【００４７】表２の結果から、本発明の基質は、比較基
質に比べ、約４倍の反応速度であり、血清ＣＰＡの測定
に利用した場合に十分な感度が期待できる。
質に比べ、約４倍の反応速度であり、血清ＣＰＡの測定
に利用した場合に十分な感度が期待できる。
【００４８】実施例１：４−アミノアンチピリンおよび
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組合せによるキノンイミン色素
を色原体とするヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダー
ゼ（西洋ワサビ由来，３Ｕ／ｍｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン（4.5ｍＭ）、チラミンオキシダーゼ（微生物由
来，0.375Ｕ／ｍｌ）、チロシンデカルボキシラーゼ
（微生物由来，0.81Ｕ／ｍｌ）、ピリドキサールリン酸
（１５μＭ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、４−アミノアンチピリン（0.9ｍ
Ｍ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン（製造
例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清および急性
膵炎患者血清，６０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間
インキュベートした。その後、試薬２（３７５μｌ）を
混合し、３７℃で加温しながら５７０ｎｍにおける吸光
度変化を５分間測定した。結果を表３に示す。
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）−ｍ−トルイジンの組合せによるキノンイミン色素
を色原体とするヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダー
ゼ（西洋ワサビ由来，３Ｕ／ｍｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイ
ジン（4.5ｍＭ）、チラミンオキシダーゼ（微生物由
来，0.375Ｕ／ｍｌ）、チロシンデカルボキシラーゼ
（微生物由来，0.81Ｕ／ｍｌ）、ピリドキサールリン酸
（１５μＭ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、４−アミノアンチピリン（0.9ｍ
Ｍ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン（製造
例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清および急性
膵炎患者血清，６０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間
インキュベートした。その後、試薬２（３７５μｌ）を
混合し、３７℃で加温しながら５７０ｎｍにおける吸光
度変化を５分間測定した。結果を表３に示す。
【００４９】
【表３】
【００５０】実施例２：４−アミノアンチピリンおよび
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリンの組合せによるキノンイミン色素を色原体
とするヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダー
ゼ（西洋ワサビ由来，３Ｕ／ｍｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（4.
5ｍＭ）、チラミンオキシダーゼ（微生物由来，0.375Ｕ
／ｍｌ）、チロシンデカルボキシラーゼ（微生物由来，
0.81Ｕ／ｍｌ）、ピリドキサールリン酸（１５μＭ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、４−アミノアンチピリン（0.9ｍ
Ｍ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン（製造
例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清および急性
膵炎患者血清，６０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間
インキュベートした。その後、試薬２（３７５μｌ）を
混合し、３７℃で加温しながら６００ｎｍにおける吸光
度変化を５分間測定した。結果を表４に示す。
Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピ
ル）アニリンの組合せによるキノンイミン色素を色原体
とするヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダー
ゼ（西洋ワサビ由来，３Ｕ／ｍｌ）、Ｎ−エチル−Ｎ−
（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（4.
5ｍＭ）、チラミンオキシダーゼ（微生物由来，0.375Ｕ
／ｍｌ）、チロシンデカルボキシラーゼ（微生物由来，
0.81Ｕ／ｍｌ）、ピリドキサールリン酸（１５μＭ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、４−アミノアンチピリン（0.9ｍ
Ｍ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チロシン（製造
例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清および急性
膵炎患者血清，６０μｌ）とを混合し、３７℃で５分間
インキュベートした。その後、試薬２（３７５μｌ）を
混合し、３７℃で加温しながら６００ｎｍにおける吸光
度変化を５分間測定した。結果を表４に示す。
【００５１】
【表４】
【００５２】実施例３：１０−（カルボキシメチルアミ
ノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フ
ェノチアジンによるメチレンブルー色素を色原体とする
ヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、１０−（カルボ
キシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチ
ルアミノ）−フェノチアジン（0.06ｍＭ）、チラミンオ
キシダーゼ（微生物由来，0.375Ｕ／ｍｌ）、チロシン
デカルボキシラーゼ（微生物由来，0.405Ｕ／ｍｌ）、
ピリドキサールリン酸（１５ｍＭ）、カタラーゼ（牛肝
臓由来，２０Ｕ／ｍｌ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由
来，６Ｕ／ｍｌ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チ
ロシン（製造例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清，６０μ
ｌ）とを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。
その後試薬２（３７５μｌ）を混合し、３７℃で加温し
ながら６６０ｎｍにおける吸光度変化を５分間測定し
た。結果を表５に示す。
ノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）−フ
ェノチアジンによるメチレンブルー色素を色原体とする
ヒト血清中ＣＰＡ活性の測定 試薬１：ＭＥＳ緩衝液（同仁化学研究所製，ｐＨ6.0，
0.15Ｍ）、塩化ナトリウム（0.1Ｍ）、１０−（カルボ
キシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチ
ルアミノ）−フェノチアジン（0.06ｍＭ）、チラミンオ
キシダーゼ（微生物由来，0.375Ｕ／ｍｌ）、チロシン
デカルボキシラーゼ（微生物由来，0.405Ｕ／ｍｌ）、
ピリドキサールリン酸（１５ｍＭ）、カタラーゼ（牛肝
臓由来，２０Ｕ／ｍｌ）、 試薬２：ＭＥＳ緩衝液（ｐＨ6.0，0.15Ｍ）、塩化ナト
リウム（0.1Ｍ）、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ由
来，６Ｕ／ｍｌ）、アセチル−Ｌ−メチオニル−Ｌ−チ
ロシン（製造例１で製造した化合物，4.5ｍＭ）。 試薬１（７５０μｌ）と被検体（健常人血清，６０μ
ｌ）とを混合し、３７℃で５分間インキュベートした。
その後試薬２（３７５μｌ）を混合し、３７℃で加温し
ながら６６０ｎｍにおける吸光度変化を５分間測定し
た。結果を表５に示す。
【００５３】
【表５】
【００５４】実施例４：自動分析装置への応用（１） 実施例１の試薬１および試薬２を用いて、健常人血清を
測定した。測定は日立7070型自動分析装置を用いて、試
薬１（２５０μｌ）と試料（２０μｌ）とを混合し、５
分間インキュベートした後に、試薬２（１２５μｌ）を
添加した後３分後から５分後までの吸光度の変化量を測
定し、１分間あたりの吸光度変化として以下に示す計算
式より、ＣＰＡ活性（ＩＵ／ｌ）として計算した。測定
温度は３７℃、測定波長は主波長５７０ｎｍ（副波長７
００ｎｍ）である。 ＩＵ／ｌ＝△Ａ×（１／16480）×（３９５／２０）×
１０6、 △Ａ：１分間あたりの吸光度変化量、 16480：キノンイミン色素のモル吸光係数。 測定の結果、ＣＰＡ活性値は0.908Ｕ／ｌ、同時再現性
ＣＶは7.27％であった。
測定した。測定は日立7070型自動分析装置を用いて、試
薬１（２５０μｌ）と試料（２０μｌ）とを混合し、５
分間インキュベートした後に、試薬２（１２５μｌ）を
添加した後３分後から５分後までの吸光度の変化量を測
定し、１分間あたりの吸光度変化として以下に示す計算
式より、ＣＰＡ活性（ＩＵ／ｌ）として計算した。測定
温度は３７℃、測定波長は主波長５７０ｎｍ（副波長７
００ｎｍ）である。 ＩＵ／ｌ＝△Ａ×（１／16480）×（３９５／２０）×
１０6、 △Ａ：１分間あたりの吸光度変化量、 16480：キノンイミン色素のモル吸光係数。 測定の結果、ＣＰＡ活性値は0.908Ｕ／ｌ、同時再現性
ＣＶは7.27％であった。
【００５５】実施例５：自動分析装置への応用（２） 実施例２の試薬１および試薬２を用いて、健常人血清を
測定した。測定は日立7070型自動分析装置を用いて、試
薬１（２５０μｌ）と試料（２０μｌ）とを混合し、５
分間インキュベートした後に、試薬２（１２５μｌ）を
添加した後３分後から５分後までの吸光度の変化量を測
定し、１分間あたりの吸光度変化として以下に示す計算
式より、ＣＰＡ活性（ＩＵ／ｌ）として計算した。測定
温度は３７℃、測定波長は主波長６００ｎｍ（副波長８
００ｎｍ）である。 ＩＵ／ｌ＝△Ａ×（１／13580）×（３９５／２０）×
１０6、 △Ａ：１分間あたりの吸光度変化量、 13580：キノンイミン色素のモル吸光係数。 測定の結果、ＣＰＡ活性値は0.902Ｕ／ｌ、同時再現性
ＣＶは7.65％であった。
測定した。測定は日立7070型自動分析装置を用いて、試
薬１（２５０μｌ）と試料（２０μｌ）とを混合し、５
分間インキュベートした後に、試薬２（１２５μｌ）を
添加した後３分後から５分後までの吸光度の変化量を測
定し、１分間あたりの吸光度変化として以下に示す計算
式より、ＣＰＡ活性（ＩＵ／ｌ）として計算した。測定
温度は３７℃、測定波長は主波長６００ｎｍ（副波長８
００ｎｍ）である。 ＩＵ／ｌ＝△Ａ×（１／13580）×（３９５／２０）×
１０6、 △Ａ：１分間あたりの吸光度変化量、 13580：キノンイミン色素のモル吸光係数。 測定の結果、ＣＰＡ活性値は0.902Ｕ／ｌ、同時再現性
ＣＶは7.65％であった。
【００５６】実施例６：実施例１および実施例２の試薬
１および試薬２を用いて、ヒト膵臓由来ＣＰＡを、牛血
清アルブミン（0.1％）および塩化ナトリウム（0.1Ｍ）
を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5，２０ｍＭ）を用
いて、段階的に希釈した溶液のＣＰＡ活性を測定した。
測定は日立7070型自動分析装置を用いて、実施例４およ
び実施例５の方法にて行なった。実施例４の方法を用い
て測定した測定値と試料の希釈率との関係を図１に示
し、実施例５の方法を用いて測定した測定値と試料の希
釈率との関係を図２に示す。図１および図２の結果か
ら、本発明方法は、ＣＰＡの日常的測定に十分な測定範
囲を有することが確認された。
１および試薬２を用いて、ヒト膵臓由来ＣＰＡを、牛血
清アルブミン（0.1％）および塩化ナトリウム（0.1Ｍ）
を含むトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ7.5，２０ｍＭ）を用
いて、段階的に希釈した溶液のＣＰＡ活性を測定した。
測定は日立7070型自動分析装置を用いて、実施例４およ
び実施例５の方法にて行なった。実施例４の方法を用い
て測定した測定値と試料の希釈率との関係を図１に示
し、実施例５の方法を用いて測定した測定値と試料の希
釈率との関係を図２に示す。図１および図２の結果か
ら、本発明方法は、ＣＰＡの日常的測定に十分な測定範
囲を有することが確認された。
【図１】 実施例４の方法で測定した測定値と試料の希
釈率との関係を示しグラフである。
釈率との関係を示しグラフである。
【図２】 実施例５の方法で測定した測定値と試料の希
釈率との関係を示すグラフである。
釈率との関係を示すグラフである。
Claims (7)
- 【請求項１】 一般式（Ｉ） 【化１】Ｒ−ＣＯ−Ｘ−Ｙ−ＯＨ （Ｉ） （式中、Ｘはメチオニン残基または芳香環を有するアミ
ノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｙは芳香環を有す
るアミノ酸残基またはその誘導体を表わし、Ｒ−ＣＯは
アミノ基の保護基を表わす。）で示されるＮ末端が保護
されているジペプチドを基質とし、これをカルボキシペ
プチダーゼＡにて分解し、生成した一般式（II） 【化２】Ｈ−Ｙ−ＯＨ （II） （式中、Ｙは前記と同じ意味を表わす。）で示される芳
香環を有するアミノ酸またはその誘導体に、これを定量
し得る酵素を作用させることを特徴とするカルボキシペ
プチダーゼＡ活性測定方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の一般式（Ｉ）で示され
るＮ末端が保護されているジペプチドをカルボキシペプ
チダーゼＡにて分解し、生成したＨ−Ｙ−ＯＨに特異性
のある酵素を作用させ、しかる後に生成物を過酸化水素
発生系へ導き、生成した過酸化水素を定量して、Ｈ−Ｙ
−ＯＨの量を測定することを特徴とする請求項１記載の
カルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法。 - 【請求項３】 Ｈ−Ｙ−ＯＨに作用させる酵素がチロシ
ンデカルボキシラーゼまたはフェニルアラニンデカルボ
キシラーゼであり、前記酵素を作用させた後にチラミン
オキシダーゼを作用させ、生成した過酸化水素を定量し
て、Ｈ−Ｙ−ＯＨの量を測定することを特徴とする請求
項２記載のカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法。 - 【請求項４】 一般式（Ｉ）において、ＸがＬ−メチオ
ニン、Ｌ−チロシンまたはＬ−フェニルアラニンの残基
であり、ＹがＬ−フェニルアラニンまたはＬ−チロシン
の残基であり、Ｒ−ＣＯがホルミル基、アセチル基、ベ
ンジルオキシカルボニル基、サクシニル基、ベンゾイル
基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ピルボイル基、ｐ−ヒ
ドロキシベンゾイル基または９−フルオレニルメトキシ
カルボニル基であるジペプチドを基質として使用する請
求項１記載のカルボキシペプチダーゼＡ活性測定方法。 - 【請求項５】 ジペプチドがアセチル−Ｌ−メチオニル
−Ｌ−チロシンである請求項４記載のカルボキシペプチ
ダーゼＡ活性測定方法。 - 【請求項６】 請求項１記載の一般式（Ｉ）で示される
ジペプチドを必須成分とするカルボキシペプチダーゼＡ
活性測定用キット。 - 【請求項７】 請求項１の一般式（Ｉ）において、Ｒが
アセチル基を表わし、Ｘがメチオニンの残基を表わし、
ＹがＬ−チロシンの残基またはＬ−フェニルアラニンの
残基を表わす化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9298873A JPH11127894A (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | カルボキシペプチダーゼａ活性測定方法および測定用キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9298873A JPH11127894A (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | カルボキシペプチダーゼａ活性測定方法および測定用キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11127894A true JPH11127894A (ja) | 1999-05-18 |
Family
ID=17865296
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9298873A Withdrawn JPH11127894A (ja) | 1997-10-30 | 1997-10-30 | カルボキシペプチダーゼａ活性測定方法および測定用キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11127894A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007289097A (ja) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | 総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬 |
| JP2008534495A (ja) * | 2005-03-25 | 2008-08-28 | オブシェストヴォス オグラニチェンノイ オトヴェツトヴェンノスティユ “ファルメンテルプリセス” | アミン及びアミノ酸のフェニル−ｎ−アシル誘導体、それらの調製法、それらの製薬組成物及び使用 |
-
1997
- 1997-10-30 JP JP9298873A patent/JPH11127894A/ja not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008534495A (ja) * | 2005-03-25 | 2008-08-28 | オブシェストヴォス オグラニチェンノイ オトヴェツトヴェンノスティユ “ファルメンテルプリセス” | アミン及びアミノ酸のフェニル−ｎ−アシル誘導体、それらの調製法、それらの製薬組成物及び使用 |
| JP2007289097A (ja) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | 総分岐鎖アミノ酸／チロシンモル比測定用液状試薬 |
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