JPH1085000A - Dna sequencing - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To carry out a high-speed sequencing by placing a probe needle of a probe microscope on a two-stranded DNA fragment on a substrate, changing the position of the needle in the direction of the DNA sequence and detecting the oscillation of the needle caused by the separation of the two strands. SOLUTION: A two-stranded DNA fragment 1 is placed on a substrate 53 in a solution 2, the tip of a probe needle 12 of a probe microscope is placed above the substrate 53, the positions of the two-stranded DNA fragment 1 and the tip of the probe needle 12 are operated to attain a measuring state comprising the contact of the tip of the probe needle 12 with the substrate 53 in a region between two single-strands formed by the partial separation of the bond between the single strands of the two-stranded DNA fragment. The relative position between the two-stranded DNA fragment 1 and the probe needle 12 is changed in the orientation direction of the two-stranded DNA fragment, the oscillation of the probe needle caused by the separation of the A-T bond pair or G-C bond pair with the needle 12 is detected and the base sequence length of the DNA is measured from the number of the oscillation cycles to achieve the sequencing of the DNA.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ＤＮＡシーケンシ
ングにおいて、特に塩基配列長または塩基配列の決定を
高速に行うために好適な技術に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a technique suitable for DNA sequencing, particularly for determining a base sequence length or base sequence at high speed.

【０００２】[0002]

【従来の技術】従来、ＤＮＡの塩基配列の測定に、電気
泳動が広く用いられる。電気泳動では、ＤＮＡのサイズ
を電界中での移動度により測定できる。電気泳動により
決定できる塩基長は、電気泳動の分解能により決まり、
１０００塩基程度である。これより長いＤＮＡの解析に
は、ＤＮＡを先ず小さい断片に切断して各々を解析し、
それらを繋ぎ合わせて全体の配列が決定される。顕微鏡
によるＤＮＡの観察に関する従来技術として、以下の文
献１〜文献５がある。2. Description of the Related Art Conventionally, electrophoresis has been widely used for measuring the base sequence of DNA. In electrophoresis, the size of DNA can be measured by mobility in an electric field. The base length that can be determined by electrophoresis is determined by the resolution of electrophoresis,
About 1000 bases. For analysis of longer DNA, the DNA is first cut into smaller fragments and each is analyzed,
By joining them, the entire sequence is determined. There are the following references 1 to 5 as conventional techniques regarding observation of DNA with a microscope.

【０００３】文献１（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ
Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｓｔｒｅｔｃｈ−ａｎ
ｄ−Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ；Ｍ．Ｗａ
ｓｈｉｚｕ、ｅｔ ａｌ．；ＩＥＥＥ Ｔｒａｎｓ．
Ｉｎｄ． Ａｐｐｌｉｃａｎｔ．、Ｖｏｌ．３１、Ｎ
ｏ．３、Ｍａｙ／Ｊｕｎｅ（１９９５）、ｐｐ４４７−
４５６）では、ＤＮＡの塩基配列長を光学顕微鏡を用い
て測定している。[0003] References 1 (Applications of
Electrostatic Stretch-an
d-Positioning of DNA; Wa
Shizu, et al. IEEE Trans.
Ind. Applicant. Vol. 31, N
o. 3, May / June (1995), pp447-
456), the base sequence length of DNA is measured using an optical microscope.

【０００４】文献２（Ａｔｏｍｉｃ−ｓｃａｌｅ ｉｍ
ａｇｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ｓｃａｎｎｉ
ｎｇ ｔｕｎｎｅｌｌｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；
Ｒ．Ｊ．Ｄｒｉｓｃｏｌｌ、ｅｔ ａｌ．；Ｎａｔｕｒ
ｅ、Ｖｏｌ．３４６（１９９０）、ｐｐ．２９４−２９
６）では、２本鎖ＤＮＡの２重螺旋、及び塩基対を真空
中においてＳＴＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｔｕｎｎｅｌｉ
ｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を用いて観測している。Reference 2 (Atomic-scale im
aging of DNA using scanni
ng tunneling microscopy;
R. J. Driscoll, et al. ; Natur
e, Vol. 346 (1990); 294-29
In 6), the double helix of the double-stranded DNA and the base pairs are subjected to STM (Scanning Tunneli) in vacuum.
ng Microscope).

【０００５】文献３（Ｉｍａｇｅｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌ
ｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ
ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｕｎｎｅｌｌｉｎｇ ｍｉ
ｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｄ．Ｄ．Ｄｕｎｌａｐ ａｎｄ
Ｃ． Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ；Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．
３４２（１９８９）、ｐｐ．２０４−２０６）では、１
本鎖ＤＮＡをＳＴＭで観測し、アデニン基の２つの環を
観測している。[0005] Reference 3 (Images of single)
e-stranded nucleic acids
by scanning tunneling mi
croscopy; D. Dunlap and
C. Bustamante; Nature, Vol.
342 (1989); 204-206), 1
The single-stranded DNA was observed by STM, and two rings of the adenine group were observed.

【０００６】文献４（Ｉｍａｇｉｎｇ ｄｅｏｘｙｒｉ
ｂｏｓｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｍｏｌｅｃｕｌｅ
ｓ ｏｎ ａ ｍｅｔａｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｕｎｄｅ
ｒｗａｔｅｒ ｂｙ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｔｕｎｎｅｌ
ｉｎｇ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；Ｓ．Ｍ．Ｌｉｎｄｓａ
ｙ ａｎｄ Ｂ．Ｂａｒｒｉｓ；Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．
Ｔｅｃｈ．、Ａ６（２）、Ｍａｒ／Ａｐｒ（１９８
８）、ｐｐ５４４−５４７）では、水中のＤＮＡをＳＴ
Ｍで観測している。Document 4 (Imaging deoxyri)
Bose nucleic acidmolecule
s on a metal surface unde
rwater by scanning tunnel
ing microscopy; M. Lindsa
y and B. Barris; Vac. Sci.
Tech. , A6 (2), Mar / Apr (198
8), in pp544-547), DNA in water was converted to ST
Observed at M.

【０００７】文献５（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｗｉｔｈ ａｎ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；Ｈ．Ｇ．Ｈａｎｓｍａ、ｅｔ
ａｌ．；Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．、Ｂ９
（２）、Ｍａｒ／Ａｐｒ（１９９１）、ｐｐ１２８２−
１２８４）では、水中及びエタノール中のＤＮＡをＡＦ
Ｍ（Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｅ）で観測している。Reference 5 (Progress in seq)
uenching deoxyribonucleic
acid with an atomic force
H. microscope; G. FIG. Hansma, et
al. J .; Vac. Sci. Tech. , B9
(2), Mar / Apr (1991), pp1282-
In 1284), DNA in water and in ethanol was
M (Atomic Force Microscope)
Observed in e).

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】従来の電気泳動による
塩基長の測定では、解析に時間がかかること、１万塩基
以上の長いＤＮＡに対しては測定精度が落ちること等の
問題がある。従来の電気泳動による塩基配列の測定で
は、ＤＮＡを１０００塩基以下の小さな断片に切断する
必要があるため、ヒトゲノムＤＮＡ（３０億塩基対程
度）を全て解読するには、全くオーバーラップなしに断
片化できたと仮定しても数百万個の断片の解析が必要で
あり、更にこれら断片から全体の塩基配列を決定するに
要する手間は、ＤＮＡ断片の数が増すにつれ幾何級数的
に大きくなるため作業量は膨大となる。このような従来
のＤＮＡ解析における困難は、従来のＤＮＡ解析の手法
が化学的手法であるため、空間分解能を持たないことに
起因する。In the conventional measurement of base length by electrophoresis, there are problems such as a long analysis time and a decrease in measurement accuracy for long DNAs of 10,000 bases or more. In the conventional measurement of base sequence by electrophoresis, it is necessary to cut DNA into small fragments of 1000 bases or less. Therefore, in order to decode all human genomic DNA (about 3 billion base pairs), fragmentation without any overlap is required. It is necessary to analyze millions of fragments even if it is possible, and the work required to determine the entire base sequence from these fragments becomes geometrically larger as the number of DNA fragments increases. The amount will be enormous. Such a difficulty in the conventional DNA analysis results from the lack of spatial resolution because the conventional DNA analysis technique is a chemical technique.

【０００９】空間分解能を持つ物理的手法でＤＮＡ解析
を行う試みがある（文献１〜文献５）。文献１の従来技
術では、蛍光体を付着したＤＮＡを静電伸長し、その長
さを光学顕微鏡で計測するので、１万塩基以上の長いＤ
ＮＡも塩基配列長を測定できるが、測定される塩基配列
長はＤＮＡが約３千塩基／μｍであるとして見積られる
概算値であり、高い精度の測定ができないという問題が
ある。Attempts have been made to perform DNA analysis by a physical method having a spatial resolution (References 1 to 5). In the prior art of Document 1, the DNA to which the fluorescent substance is attached is electrostatically extended and its length is measured with an optical microscope.
Although the base sequence length can also be measured for NA, the measured base sequence length is an approximate value estimated to be about 3,000 bases / μm of DNA, and there is a problem that high-precision measurement cannot be performed.

【００１０】文献２〜文献５の従来技術では、基板上に
固定されたＤＮＡ塩基を直接観測する。これら従来技術
においてＤＮＡを構成する４塩基、即ちアデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン
（Ｃ）を区別するに十分な空間分解能が、仮りに得られ
れば、ＤＮＡ塩基配列を直接測定できる。この場合、従
来のようにＤＮＡを断片に切断する必要なく、高速に
（従来法に比べて少なくとも１００倍以上の速度（文献
５））塩基配列を決定できる。現在の探触プローブ型顕
微鏡では、４塩基を区別するのに十分な空間分解能を得
ることは困難であるが、Ｐｕ（プリン）分子が２つの環
からなり、Ｐｙ（ピリミジン）分子が１つの環からなる
ので、これらの大きさ及び形状の違いが比較的区別しや
すいため、４塩基をプリン（Ｐｕ）グループ（Ａ、Ｇが
属する）とピリミジン（Ｐｙ）グループ（Ｔ、Ｃが属す
る）とに分類することは可能である（文献３）。In the prior arts of Documents 2 to 5, the DNA base fixed on the substrate is directly observed. In these prior arts, if the spatial resolution sufficient to distinguish the four bases constituting DNA, namely, adenine (A), guanine (G), thymine (T), and cytosine (C) is obtained, the DNA base sequence Can be measured directly. In this case, the base sequence can be determined at high speed (at least 100 times faster than the conventional method (Reference 5)) without the necessity of cutting DNA into fragments as in the related art. With the current probe-type microscope, it is difficult to obtain a spatial resolution sufficient to distinguish four bases, but the Pu (purine) molecule is composed of two rings and the Py (pyrimidine) molecule is composed of one ring. Therefore, the four bases are classified into a purine (Pu) group (to which A and G belong) and a pyrimidine (Py) group (to which T and C belong). It is possible to classify (Reference 3).

【００１１】本発明の目的は、探触プローブ型顕微鏡を
用いて、ＤＮＡの塩基配列及び塩基長を高速に決定でき
る技術を提供することにある。An object of the present invention is to provide a technique capable of rapidly determining the base sequence and base length of DNA using a probe-type microscope.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】以下に、本発明のＤＮＡ
シーケンシング方法の構成の概要を説明する。The DNA of the present invention is described below.
An outline of the configuration of the sequencing method will be described.

【００１３】（構成１） 基板上の溶液中に２本鎖ＤＮ
Ａ断片を配置し、前記２本鎖ＤＮＡ断片を配置した前記
基板の上方にＳＴＭ（Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｔｕｎｎｅｌ
ｉｎｇＭｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）又はＡＦＭ（Ａｔｏｍｉ
ｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）あるいはＬＦ
Ｍ（Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐ
ｅ）の探触針の先端（探触プローブ型顕微鏡の探触針の
先端）を配置し、前記２本鎖ＤＮＡ断片を構成する２本
の１本鎖間の結合が前記探触針の先端付近において一部
解離され、前記探触針の先端が前記一部解離された２本
の１本鎖間に挟まれ、前記探触針の先端が前記基板に接
触している状態（計測状態）を前記２本鎖ＤＮＡ断片及
び前記探触針の先端の位置を操作して生成し、前記計測
状態において前記２本鎖ＤＮＡ断片と前記探触針の先端
との相対的な位置を前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向に
変化させ、前記変化により前記探触針による前記２本鎖
ＤＮＡ断片の解離位置を前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方
向に拡張し、前記解離位置の拡張において前記探触針の
先端が前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列中のアデニン−チミ
ン結合対及びグアニン−シトシン結合対を次々と解離す
る際に生じる前記探触針の振動を前記ＳＴＭ又はＡＦＭ
あるいはＬＦＭで検出し、前記振動の回数から前記２本
鎖ＤＮＡの塩基長を測定する。２本鎖ＤＮＡ断片と探触
針の先端との相対的な位置の変化により、探触針の先端
付近における２本鎖ＤＮＡ断片の解離位置を配列方向に
拡張しながら、結合対の個数を計測できる、１万塩基を
越えるような長いＤＮＡ断片に対しても、高速に塩基長
を測定できる。(Structure 1) Double-stranded DN in a solution on a substrate
A fragment is placed, and an STM (Scanning Tunnel) is placed above the substrate on which the double-stranded DNA fragment is placed.
ingMicroscope) or AFM (Atomi)
c Force Microscope) or LF
M (Lateral Force Microscope)
e) the tip of the probe (tip of the probe of the probe type microscope) is disposed, and the bond between the two single strands constituting the double-stranded DNA fragment is the tip of the probe. A state in which the tip of the probe is partially dissociated in the vicinity, the tip of the probe is sandwiched between the two single strands that are partially dissociated, and the tip of the probe contacts the substrate (measurement state) Is generated by manipulating the positions of the double-stranded DNA fragment and the tip of the probe, and in the measurement state, the relative position between the double-stranded DNA fragment and the tip of the probe is The dissociation position of the double-stranded DNA fragment by the probe is extended in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment, and the probe is extended in the dissociation position. The tip of the needle is an adenine-thymine binding pair and a guanine in the sequence of the double-stranded DNA fragment. Down - the vibration of the probe stylus caused when dissociated one after another cytosine binding pair STM or AFM
Alternatively, detection is performed by LFM, and the base length of the double-stranded DNA is measured from the number of times of the vibration. By changing the relative position between the double-stranded DNA fragment and the tip of the probe, the number of binding pairs is measured while expanding the dissociation position of the double-stranded DNA fragment near the tip of the probe in the array direction. The base length can be measured at high speed even for long DNA fragments exceeding 10,000 bases.

【００１４】（構成２） 構成１において、前記溶液中
に電極対が存在し、前記電極対で生成される電界により
前記計測状態において前記探触針の先端が挿入された前
記２本鎖ＤＮＡ断片を静電伸長し、前記静電伸長された
前記２本鎖ＤＮＡ断片と前記探触針の先端との相対的な
位置を前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向に変化させる。
静電伸長により、２本鎖ＤＮＡ断片の解離位置を配列方
向に拡張する際に溶液中で回転するＤＮＡの回転の抵抗
を減少できる。(Structure 2) In the structure 1, the electrode pair is present in the solution, and the double-stranded DNA fragment into which the tip of the probe is inserted in the measurement state by the electric field generated by the electrode pair. Is electrostatically extended, and the relative position between the electrostatically extended double-stranded DNA fragment and the tip of the probe is changed in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment.
The electrostatic extension can reduce the resistance of the DNA rotating in the solution when the dissociation position of the double-stranded DNA fragment is extended in the sequence direction.

【００１５】（構成３） 構成２において、前記静電伸
長された前記２本鎖ＤＮＡ断片が前記電極対の内のどち
らか一方の電極に引っ張られる力を利用して、前記２本
鎖ＤＮＡ断片と前記探触針の先端との相対的な位置を前
記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向に変化させる。これによ
り、簡単な装置構成でＤＮＡ断片と前記探触針の先端と
の相対的な位置をＤＮＡの伸長方向、即ち配列方向に容
易に変化できる。(Structure 3) In Structure 2, the double-stranded DNA fragment that has been subjected to electrostatic extension is pulled by one of the electrodes of the pair of electrodes to use the double-stranded DNA fragment. The relative position between the probe and the tip of the probe is changed in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment. Thus, the relative position between the DNA fragment and the tip of the probe can be easily changed in the extending direction of the DNA, that is, in the arrangement direction, with a simple device configuration.

【００１６】（構成４） 構成１〜３のＤＮＡシーケン
シング方法において、前記２本鎖ＤＮＡ断片の少なくと
も一部を２本の１本鎖に解離し、前記探触針の先端を前
記２本の１本鎖間に挿入し、前記探触針の先端を前記２
本の１本鎖間に挿入したまま前記基板に接触し、前記探
触針の先端を前記基板に接触した状態で前記解離を再結
合させて、前記計測状態を生成して、ＤＮＡを破壊する
ことなく、容易に計測状態を生成できる。(Structure 4) In the DNA sequencing method of Structures 1 to 3, at least a part of the double-stranded DNA fragment is dissociated into two single strands, and the tip of the probe is connected to the two single strands. Insert between the single strands, and
The probe is brought into contact with the substrate while being inserted between the single strands of the book, and the dissociation is recombined with the tip of the probe being in contact with the substrate to generate the measurement state and destroy the DNA. The measurement state can be easily generated without any need.

【００１７】（構成５） 構成４において、前記２本鎖
ＤＮＡ断片の少なくとも一部を２本の１本鎖に解離した
状態で前記基板上に静電固定し、前記静電固定の状態を
保持したまま前記探触針の先端を前記２本の１本鎖に囲
まれる前記基板上の位置に接触し、前記探触針の先端が
前記基板上に接触している状態で前記静電固定を解除し
て、前記探触針の先端を前記２本の１本鎖間に挿入した
まま前記基板に接触させ、ＤＮＡの解離位置を基板上で
探触針を走査して容易に発見できる。(Structure 5) In the structure 4, the at least a part of the double-stranded DNA fragment is electrostatically fixed on the substrate in a state of being dissociated into two single strands, and the electrostatically fixed state is maintained. While holding the probe, the tip of the probe contacts the position on the substrate surrounded by the two single strands, and the electrostatic fixing is performed in a state where the tip of the probe contacts the substrate. When the probe is released, the probe is brought into contact with the substrate while the tip of the probe is inserted between the two single strands, and the dissociation position of DNA can be easily found by scanning the probe on the substrate.

【００１８】（構成６） 構成１〜構成５において、前
記アデニン−チミン結合対及びグアニン−シトシン結合
対の結合力の差に起因する前記探触針の先端の振動の大
きさの違いを計測して、前記２本鎖ＤＮＡ断片の結合対
に関する配列を決定する。(Structure 6) In the structure 1 to the structure 5, the difference in the magnitude of vibration of the tip of the probe caused by the difference in the binding force between the adenine-thymine binding pair and the guanine-cytosine binding pair is measured. Then, the sequence relating to the binding pair of the double-stranded DNA fragment is determined.

【００１９】（構成７） 構成６において、同一の塩基
配列を持つＤＮＡを切断して生成される長さ、塩基配列
の異なる様々なＤＮＡ断片について前記結合対に関する
配列を決定し、異なるＤＮＡ断片に対して決定された前
記結合対に関する配列が部分的に同一の配列を有する場
合は、前記部分的に同一の配列を有するＤＮＡ断片同士
を、前記の同一の配列部分において繋ぎ合わせて、より
長いＤＮＡに対して結合対に関する配列を決定する。(Structure 7) In the structure 6, a sequence relating to the binding pair is determined for various DNA fragments having different lengths and base sequences generated by cutting DNA having the same base sequence, and In the case where the determined sequence relating to the binding pair has a partially identical sequence, the DNA fragments having the partially identical sequence are joined together at the same sequence portion to form a longer DNA. Is determined for the binding pair.

【００２０】（構成８） 構成７において、結合対に関
する配列が決定されているＤＮＡ断片（母断片）の一部
であり、かつ従来の電気泳動により塩基配列が完全に決
定されているＤＮＡ断片（部分断片）の結合対に関する
配列を前記母断片の結合対に関する配列上で検索し、前
記部分断片の前記母断片中における位置を決定し、既に
完全に配列決定されている部分断片の位置を、より長い
母断片上でマッピングできる。(Structure 8) In Structure 7, a DNA fragment (part of a DNA fragment (mother fragment) whose sequence relating to a binding pair has been determined and whose base sequence has been completely determined by conventional electrophoresis ( The sequence for the binding pair of the partial fragment is searched on the sequence for the binding pair of the mother fragment, the position of the partial fragment in the mother fragment is determined, and the position of the partial fragment that has already been completely sequenced is determined. Can be mapped on longer mother fragments.

【００２１】（構成９） 基板上に１本鎖ＤＮＡ断片を
固定し、前記基板上をＳＴＭあるいはＡＦＭで走査して
走査画像を作成し、前記ＤＮＡ断片の塩基配列を構成す
る各塩基がプリン基かピリミジン基であるかを前記走査
画像から判別し、前記判別に基づいて前記ＤＮＡ断片の
プリン基、ピリミジン基に関する配列を決定する。(Structure 9) A single-stranded DNA fragment is fixed on a substrate, and a scan image is created by scanning the substrate with STM or AFM, and each base constituting the base sequence of the DNA fragment is a purine group. Whether the DNA fragment is a pyrimidine group or not is determined from the scanned image, and a sequence relating to a purine group or a pyrimidine group of the DNA fragment is determined based on the determination.

【００２２】（構成１０） 構成９において、同一の塩
基配列を持つＤＮＡを切断して生成される長さ、塩基配
列の異なる様々なＤＮＡ断片についてプリン基、ピリミ
ジン基に関する配列を決定し、異なるＤＮＡ断片に対し
て決定されたプリン基、ピリミジン基に関する配列が部
分的に同一の配列を有する場合は、部分的に同一の配列
を有するＤＮＡ断片同士を同一の配列部分において繋ぎ
合わせて、より長いＤＮＡに対してプリン基、ピリミジ
ン基に関する配列を決定する。(Structure 10) In Structure 9, purine group and pyrimidine group sequences are determined for various DNA fragments having different lengths and base sequences generated by cutting DNA having the same base sequence, and different DNA sequences are determined. When the sequences relating to the purine group and the pyrimidine group determined for the fragments have partially identical sequences, DNA fragments having partially identical sequences are joined to each other at the same sequence portion to form a longer DNA. The sequence for the purine and pyrimidine groups is determined.

【００２３】（構成１１） 構成１０において、プリン
基、ピリミジン基に関する配列が決定されているＤＮＡ
断片（母断片）の一部であり、かつ従来の電気泳動によ
り塩基配列が完全に決定されているＤＮＡ断片（部分断
片）のプリン基、ピリミジン基に関する配列を前記母断
片のプリン基、ピリミジン基に関する配列上で検索し、
前記部分断片の前記母断片中における位置を決定し、既
に完全に配列決定されている部分断片の位置を、より長
い母断片上でマッピングできる。(Structure 11) The DNA according to structure 10, wherein the sequence relating to a purine group or a pyrimidine group is determined.
A sequence relating to purine and pyrimidine groups of a DNA fragment (partial fragment) which is a part of a fragment (mother fragment) and whose base sequence is completely determined by conventional electrophoresis is converted to a purine group or pyrimidine group of the mother fragment. Search on the array for
The position of the subfragment in the mother fragment can be determined, and the position of the already fully sequenced subfragment can be mapped on the longer mother fragment.

【００２４】（構成１２） 構成６〜構成１１におい
て、同一の塩基配列を持つＤＮＡ断片に対して結合対及
びプリン基、ピリミジン基に関する配列を決定し、前記
結合対に関する配列情報とプリン基、ピリミジン基に関
する配列情報から前記ＤＮＡ断片の配列を完全に決定す
る。(Structure 12) In Structures 6 to 11, the sequence relating to the binding pair and the purine and pyrimidine groups is determined for DNA fragments having the same base sequence, and the sequence information relating to the binding pair and the purine and pyrimidine groups are determined. The sequence of the DNA fragment is completely determined from the sequence information on the groups.

【００２５】（構成１３） 構成１２において、結合対
及びプリン基、ピリミジン基に関する配列が決定されて
いるＤＮＡ断片（母断片）の一部であり、かつ従来の電
気泳動により塩基配列が完全に決定されているＤＮＡ断
片（部分断片）の結合対及びプリン基、ピリミジン基に
関する配列を各々前記母断片の結合対及びプリン基、ピ
リミジン基に関する配列上で検索し、前記母断片の結合
対及びプリン基、ピリミジン基に関する各々の配列上に
おける前記部分断片の位置に基づいて前記母断片の結合
対に対する配列と前記母断片のプリン基、ピリミジン基
に対する配列との位置関係を決定する。これにより、結
合対及びプリン基、ピリミジン基に関して各々別々に決
定された配列に対し、これらの相対的な位置関係を決定
でき、これら２つの配列情報を組み合わせて配列を完全
に決定できる。(Structure 13) In Structure 12, a part of a DNA fragment (mother fragment) in which a sequence relating to a binding pair and a purine group or a pyrimidine group is determined, and the base sequence is completely determined by conventional electrophoresis. The binding pair of the DNA fragment (partial fragment) and the sequence relating to the purine group and the pyrimidine group are searched on the binding pair of the mother fragment and the sequence relating to the purine and pyrimidine groups, respectively. The positional relationship between the sequence for the binding pair of the mother fragment and the sequences for the purine and pyrimidine groups of the mother fragment is determined based on the position of the partial fragment on each sequence with respect to the pyrimidine group. This makes it possible to determine the relative positional relationship between sequences determined separately for the binding pair, the purine group, and the pyrimidine group, and to completely determine the sequence by combining these two sequence information.

【００２６】（構成１４） ２本鎖ＤＮＡ断片の塩基対
の配列を決定する工程と、前記２本鎖ＤＮＡ断片を構成
する１本鎖のプリン基、ピリミジン基の配列を決定する
工程とを有し、前記塩基対の配列と前記プリン基、ピリ
ミジン基の配列とから、前記２本鎖ＤＮＡ断片の塩基配
列を、完全に高速に決定できる。(Constitution 14) A step of determining the base pair sequence of the double-stranded DNA fragment and a step of determining the sequence of the single-stranded purine group or pyrimidine group constituting the double-stranded DNA fragment. Then, the base sequence of the double-stranded DNA fragment can be completely and rapidly determined from the base pair sequence and the purine and pyrimidine group sequences.

【００２７】[0027]

【発明の実施の形態】以下、本発明の実施例を図面に基
づいて詳細に説明する。図１は、本発明の一実施例に係
るＤＮＡシーケンシング装置構成を示す図である。この
ＤＮＡシーケンシング装置は、ＡＦＭ支持フレーム１
０、振動板１１、ＡＦＭ探触針１２、ＳＴＭ探触針１
３、ＳＴＭ制御手段１４、ＡＦＭ制御手段１５、ガラス
基板５０、ガラス突起５１、電極５２、導電性基板５
３、電極対５４、直流電源５５、スイッチ５６、交流電
源５７等により構成される。なお、上記の各装置及び手
段は公知のものを用いる。ガラス基板５０上に溶液２の
層を張る。溶液２は水であり、導電率を低くするために
イオンを取り除いてある。溶液２の導電率は２（μＳ／
ｃｍ）程度である。溶液２中には同一の塩基配列を持つ
ＤＮＡを切断して得られる長さ、塩基配列の異なる様々
なＤＮＡ断片１が存在する。次に、各部の概要を説明す
る。Embodiments of the present invention will be described below in detail with reference to the drawings. FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a DNA sequencing apparatus according to one embodiment of the present invention. This DNA sequencing apparatus uses an AFM support frame 1
0, diaphragm 11, AFM probe 12, STM probe 1
3, STM control means 14, AFM control means 15, glass substrate 50, glass protrusion 51, electrode 52, conductive substrate 5
3, an electrode pair 54, a DC power supply 55, a switch 56, an AC power supply 57 and the like. Note that known devices are used for the above-described devices and means. A layer of the solution 2 is provided on the glass substrate 50. Solution 2 is water, from which ions have been removed to reduce conductivity. Solution 2 has a conductivity of 2 (μS /
cm). In the solution 2, there are various DNA fragments 1 having different lengths and base sequences obtained by cutting DNA having the same base sequence. Next, an outline of each unit will be described.

【００２８】ＡＦＭ支持フレーム１０は、振動板１１及
びＳＴＭ制御手段１４を固定する。振動板１１は厚さ
（Ｚ方向）０．２５（μｍ）、長さ（Ｘ方向）０．８
（ｍｍ）、幅（Ｙ方向）０．２５（ｍｍ）程度の金のホ
イールであるが、これに限定されるものではない。振動
板１１の一端にはＡＦＭ探触針１２が固定してある。Ａ
ＦＭ探触針１２の材料はダイアモンドであるが、二酸化
硅素（ＳｉＯ₂）や窒化硅素（Ｓｉ₃Ｎ₄）等の材料を用
いてもよく、振動板１１と一体型として形成してもよ
い。ＡＦＭ制御手段１５はＸ、Ｙ、Ｚ方向を変位方向と
するピエゾ素子から構成され、ＡＦＭ探触針１２の先端
の空間的な位置を制御する。ＡＦＭ探触針１２の先端
を、導電性基板５３上をＺ方向に移動しながら走査す
る。この走査において、ＡＦＭ探触針１２の先端の原子
と導電性基板５３上の原子との原子間力により、振動板
１１がＺ方向に反る。振動板１１のＺ方向の反りは、Ｓ
ＴＭ探触針１３により検出される。なお走査は、ガラス
基板５０全体をＡＦＭ探触針１２の先端に対して移動し
て実現してもよい。The AFM support frame 10 fixes the diaphragm 11 and the STM control means 14. The diaphragm 11 has a thickness (Z direction) of 0.25 (μm) and a length (X direction) of 0.8.
(Mm) and a gold wheel having a width (Y direction) of about 0.25 (mm), but is not limited thereto. An AFM probe 12 is fixed to one end of the diaphragm 11. A
The material of the FM probe 12 is diamond, but a material such as silicon dioxide (SiO ₂ ) or silicon nitride (Si ₃ N ₄ ) may be used, and may be formed integrally with the diaphragm 11. The AFM control unit 15 includes a piezo element having displacement directions in the X, Y, and Z directions, and controls the spatial position of the tip of the AFM probe 12. The tip of the AFM probe 12 is scanned while moving on the conductive substrate 53 in the Z direction. In this scanning, the diaphragm 11 warps in the Z direction due to the interatomic force between the atom at the tip of the AFM probe 12 and the atom on the conductive substrate 53. The warp of the diaphragm 11 in the Z direction is S
It is detected by the TM probe 13. The scanning may be realized by moving the entire glass substrate 50 with respect to the tip of the AFM probe 12.

【００２９】ＳＴＭ探触針１３の材料はタングステンで
あるが、白金とイリジウムの混合物や金等を用いてもよ
い。ＳＴＭ探触針１３の先端は振動板１１の表面上に配
置され、振動板１１とＳＴＭ探触針１３の先端との間の
トンネル電流を測定する。ＳＴＭ制御手段１４はＸ、
Ｙ、Ｚ方向を変位方向とするピエゾ素子から構成され、
ＳＴＭ探触針１３の先端の空間的な位置を制御する。こ
の制御には、針先位置一定制御モードと電流値一定制御
モード等が存在する。針先位置一定モードでは、ＡＦＭ
支持フレーム１０に対するＳＴＭ探触針１３の位置を常
に一定に保ち、振動板１１の反りに伴って変化する振動
板１１とＳＴＭ探触針１３の先端との距離を、トンネル
電流の変化として検出して図示しないメモリに記録す
る。また電流値一定制御モードでは、上記のトンネル電
流が一定値に保たれるように、即ち振動板１１とＳＴＭ
探触針１３の先端との距離が常に一定に保たれるよう
に、ＳＴＭ制御手段１４によりＳＴＭ探触針１３のＺ方
向の位置を制御する。ＳＴＭ探触針１３のＺ方向の位置
の変化は、図示しないメモリに記録される。なお本実施
例では、振動板１１の反りの量をＳＴＭを用いて検出す
る装置構成を示したが、これに限定されるものではな
い。例えば、レーザー光の位相の変化や、振動板１１に
平行に配置された金属板のキャパシタンスの変化等を用
いて、これを検出してもよい。Although the material of the STM probe 13 is tungsten, a mixture of platinum and iridium, gold or the like may be used. The tip of the STM probe 13 is disposed on the surface of the diaphragm 11, and measures a tunnel current between the diaphragm 11 and the tip of the STM probe 13. The STM control means 14 has X,
It is composed of a piezo element having displacement directions in the Y and Z directions,
The spatial position of the tip of the STM probe 13 is controlled. This control includes a stylus tip position control mode and a constant current value control mode. In the fixed tip position mode, the AFM
The position of the STM probe 13 with respect to the support frame 10 is always kept constant, and the distance between the diaphragm 11 and the tip of the STM probe 13 that changes with the warp of the diaphragm 11 is detected as a change in tunnel current. In a memory (not shown). In the constant current value control mode, the tunnel current is maintained at a constant value, that is, the diaphragm 11 and the STM
The STM control means 14 controls the position of the STM probe 13 in the Z direction so that the distance from the tip of the probe 13 is always kept constant. A change in the position of the STM probe 13 in the Z direction is recorded in a memory (not shown). In this embodiment, the device configuration for detecting the amount of warpage of the diaphragm 11 using the STM has been described, but the present invention is not limited to this. For example, this may be detected by using a change in the phase of the laser beam, a change in the capacitance of a metal plate arranged parallel to the diaphragm 11, or the like.

【００３０】ガラス基板５０の中央にはガラス突起５１
が存在する。ガラス突起５１中には導電性基板５３及び
電極５２が埋め込まれている。導電性基板５３は半球状
の形状であり、その頂点部分が平面状にカットされてい
る。また、導電性基板５３はその頂点付近がガラス突起
５１の先端付近でむき出しになっており、導電性基板５
３の頂点部分の平面部分が溶液２と直接接触する。導電
性基板５３の材料はグラファイトであるが、金、又は白
金等の材料を用いてもよい。導電性基板５１及び電極５
２は接触しており、グランドに接続されている。導電性
基板５１及び電極５２は同一の材料を用いて一体型の構
成としてもよい。A glass projection 51 is provided at the center of the glass substrate 50.
Exists. A conductive substrate 53 and an electrode 52 are embedded in the glass projection 51. The conductive substrate 53 has a hemispherical shape, and its apex portion is cut into a planar shape. In addition, the conductive substrate 53 is exposed near the apex near the tip of the glass projection 51, and the conductive substrate 5
The flat portion of the vertex of 3 comes into direct contact with the solution 2. The material of the conductive substrate 53 is graphite, but a material such as gold or platinum may be used. Conductive substrate 51 and electrode 5
2 are in contact and connected to ground. The conductive substrate 51 and the electrode 52 may be formed integrally using the same material.

【００３１】電極対５４は、ガラス突起５１の先端位置
に対して点対称の位置に配置される。電極対の材料は金
であるが、白金等の材料を用いてもよい。電極対５４に
はスイッチ５６が各々接続されている。スイッチ５６は
電極対５４を直流電源５５、グランド、又は交流電源５
７の何れかに接続する。直流電源５５は電圧を自由に調
整でき、交流電源５７は電圧及び周波数を自由に調整で
きる。The electrode pair 54 is disposed at a point-symmetric position with respect to the tip of the glass projection 51. The material of the electrode pair is gold, but a material such as platinum may be used. A switch 56 is connected to each of the electrode pairs 54. The switch 56 connects the electrode pair 54 to the DC power supply 55, the ground, or the AC power supply 5
7 The DC power supply 55 can freely adjust the voltage, and the AC power supply 57 can freely adjust the voltage and frequency.

【００３２】次に、ＤＮＡシーケンシング装置によるＤ
ＮＡシーケンス方法の概要を説明する。先ず前準備とし
て、同一の塩基配列を持つＤＮＡの複数を切断して得ら
れた長さ、塩基配列の異なる様々な２本鎖ＤＮＡ断片１
を、試験管中で５（μｇ／ｍｌ）程度の割合で溶液２に
混ぜる。次に、試験管を５０〜７０度Ｃ程度の温度に暖
め、２本鎖ＤＮＡ断片１を塩基配列中の一部において１
本鎖に解離する。解離は、結合の弱いＡ−Ｔ結合を多く
含む塩基配列部分において生じやすく、結合の強いＧ−
Ｃ結合を多く含む塩基配列部分において生じにくい。こ
のため温度調節により、Ａ−Ｔ結合を多く含む塩基配列
部分においてのみ２本鎖が解離される部分的１本鎖の状
態のＤＮＡ断片を作成する。Next, D by a DNA sequencing device
The outline of the NA sequence method will be described. First, as a preparation, various double-stranded DNA fragments 1 having different lengths and base sequences obtained by cutting a plurality of DNAs having the same base sequence are prepared.
Is mixed with solution 2 at a ratio of about 5 (μg / ml) in a test tube. Next, the test tube was warmed to a temperature of about 50 to 70 ° C., and the double-stranded DNA fragment 1 was partially removed from the base sequence.
Dissociates into main chains. Dissociation is likely to occur in the base sequence portion containing many AT bonds with weak bonds, and G-
It is unlikely to occur in the base sequence portion containing many C bonds. Therefore, by controlling the temperature, a DNA fragment in a partially single-stranded state is prepared in which the double strand is dissociated only in the base sequence portion containing a large amount of AT bonds.

【００３３】次に、部分的１本鎖の状態の長さ、塩基配
列の異なる様々なＤＮＡ断片１を含む溶液２をスポイト
に取り、ガラス基板５０上に滴下する。この滴下は、溶
液２が電極対５４、ガラス突起５１及び導電性基板５３
のむき出し部分を全て覆うように行う。この時ＤＮＡ断
片１は、溶液２中を浮遊している。滴下が終了すると同
時に、スイッチ５６を直流電源５５に接続する。直流電
源５５は電極対５４の電圧が共に−２（Ｖ）程度となる
ように設定する。この電圧印加により、溶液２中を浮遊
していた長さ、塩基配列の異なる様々なＤＮＡ断片１
は、部分的１本鎖の状態のまま導電性基板５３のむき出
し部分に集まり、塊となって導電性基板５３の表面に静
電固定される。ＤＮＡ断片１が導電性基板５３の表面に
静電固定された後に、装置系全体を比較的低い温度（０
〜４０度Ｃ程度）に保ち、溶液２の温度を下げる。Next, a solution 2 containing various DNA fragments 1 having different lengths and base sequences in a partially single-stranded state is taken into a dropper and dropped on a glass substrate 50. This dripping causes the solution 2 to pass through the electrode pair 54, the glass protrusion 51 and the conductive substrate 53.
To cover the entire exposed part of At this time, the DNA fragment 1 is floating in the solution 2. At the same time when the dropping is completed, the switch 56 is connected to the DC power supply 55. The DC power supply 55 is set so that the voltage of both electrode pairs 54 is about -2 (V). By this voltage application, various DNA fragments 1 having different lengths and different base sequences were suspended in the solution 2.
Are collected in the exposed portion of the conductive substrate 53 in a partially single-stranded state, and are electrostatically fixed to the surface of the conductive substrate 53 as a lump. After the DNA fragment 1 is electrostatically fixed on the surface of the conductive substrate 53, the entire system is cooled to a relatively low temperature (0
-40 ° C), and the temperature of the solution 2 is lowered.

【００３４】次に、ＤＮＡ断片１を導電性基板５３の表
面に静電固定したまま、ＡＦＭ探触針１２の先端を導電
性基板５３の表面上で走査する。図３は、ＡＦＭ探触針
の走査により得られる導電性基板５３上のＤＮＡ断片１
の画像の一例を示す模式図である。長さ、塩基配列の異
なる様々な２本鎖ＤＮＡ断片１は、その塩基配列中の一
部が２本の１本鎖３に解離されたまま導電性基板５３上
に静電固定されている。この時、画面上には２本の１本
鎖３に囲まれた領域４が存在する。次に、任意の２本鎖
ＤＮＡ断片１に対して画面上の２本の１本鎖３に囲まれ
た領域４の内の１つを任意に選択し、ＡＦＭ探触針１２
の先端位置を移動して、先端を選択した領域４の内部の
導電性基板５３上に接触させる。次にこの接触状態を保
持したまま、スイッチ５６をグランドに接続する。電極
対５４の電位を０（Ｖ）とするので、導電性基板５３上
のＤＮＡ断片１は静電固定から解除され、ブラウン運動
により再び溶液２中を浮遊し始める。また、この時溶液
２を含む装置系全体が比較的低い温度（０〜４０度Ｃ程
度）に保たれているため、部分的に解離した１本鎖部分
は再び結合して２本鎖を形成する。但し、ＡＦＭ探触針
１２の先端が挿入された位置付近では、２本の１本鎖間
にＡＦＭ探触針１２の先端が挟まれているため、２本鎖
が解離された状態（以下、計測状態）が形成されてい
る。この計測状態が形成された後に、スイッチ５６を交
流電源５７に接続する。この時交流電源５７は電極対５
４間の電界が１（ＭＶ／ｍ）程度、交流周波数が１〜２
（ＭＨｚ）程度となるように設定する。この電界により
ＡＦＭ探触針１２の先端が挿入されたＤＮＡ断片を含む
全てのＤＮＡ断片１は溶液２中でＺ方向に静電伸長され
る。Next, the tip of the AFM probe 12 is scanned over the surface of the conductive substrate 53 while the DNA fragment 1 is electrostatically fixed on the surface of the conductive substrate 53. FIG. 3 shows a DNA fragment 1 on a conductive substrate 53 obtained by scanning with an AFM probe.
FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of the image of FIG. Various double-stranded DNA fragments 1 having different lengths and base sequences are electrostatically immobilized on the conductive substrate 53 while a part of the base sequence is dissociated into two single strands 3. At this time, an area 4 surrounded by two single strands 3 exists on the screen. Next, one of the regions 4 surrounded by the two single strands 3 on the screen is arbitrarily selected for an arbitrary double-stranded DNA fragment 1, and the AFM probe 12 is selected.
Is moved to a position on the conductive substrate 53 inside the selected region 4. Next, the switch 56 is connected to the ground while maintaining this contact state. Since the potential of the electrode pair 54 is set to 0 (V), the DNA fragment 1 on the conductive substrate 53 is released from the electrostatic fixation, and starts to float in the solution 2 again by Brownian motion. At this time, since the entire system including the solution 2 is kept at a relatively low temperature (about 0 to 40 ° C.), the partially dissociated single-stranded portion is recombined to form a double-stranded portion. I do. However, in the vicinity of the position where the tip of the AFM probe 12 is inserted, the tip of the AFM probe 12 is sandwiched between two single strands, so that the two strands are dissociated (hereinafter, referred to as “the two strands”). Measurement state) is formed. After the measurement state is formed, the switch 56 is connected to the AC power supply 57. At this time, the AC power supply 57
Electric field between 4 is about 1 (MV / m), AC frequency is 1-2
(MHz). Due to this electric field, all DNA fragments 1 including the DNA fragment into which the tip of the AFM probe 12 has been inserted are electrostatically elongated in the solution 2 in the Z direction.

【００３５】一般に静電伸長されたＤＮＡ断片１は、そ
の一端が電極対５４のどちらか一方の電極に接触するま
で、電界により引っ張られる。なお、電極対５４をガラ
ス突起５１の先端位置に対して正確に点対称の位置に配
置するので、基板５３のむき出し部分の電位は常に一定
となり、導電性基板５３のむき出し部分にＤＮＡ断片１
の一端が固定されるのを防止できる。従って、ＡＦＭ探
触針１２の先端が挿入されたＤＮＡ断片を含む全てのＤ
ＮＡ断片１は、上記の引っ張られる力により溶液２中を
Ｚ方向に移動し始める。In general, the DNA fragment 1 that has been electrostatically extended is pulled by an electric field until one end thereof contacts one of the electrodes of the electrode pair 54. Since the electrode pair 54 is arranged at a position exactly symmetrical with respect to the tip of the glass projection 51, the potential of the exposed portion of the substrate 53 is always constant, and the DNA fragment 1 is placed on the exposed portion of the conductive substrate 53.
Can be prevented from being fixed at one end. Therefore, all D including the DNA fragment into which the tip of the AFM probe 12 is inserted
The NA fragment 1 starts to move in the solution 2 in the Z direction due to the above-described pulling force.

【００３６】図２は、ＡＦＭ探触針１２の先端付近での
２本鎖ＤＮＡ断片１の解離状態を示すモデル図である。
図２において、２本鎖ＤＮＡ断片１は電界方向２００に
全体的に引っ張られており、この力によってＡＦＭ探触
針１２の先端が僅かに電界方向２００に移動し、振動板
１１が反る。振動板１１がある程度反ると、反りに対す
る反発力により振動板１１がこれ以上反らない平衡状態
に達する。この平衡状態において、更に２本鎖ＤＮＡ断
片１が電界方向２００に引っ張られると、２本鎖ＤＮＡ
１中の塩基対の間の水素結合対が引っ張られる力に耐え
きれずに解離する。この解離により再び反りが戻された
振動板１１は、再び隣の塩基対の間の水素結合対に対し
て平衡状態及び塩基対の間の水素結合の解離を繰り返す
ことにより、その塩基対の間の水素結合の解離位置を電
界方向２００と反対の方向にシフトして行く。またこの
シフトにより、ＤＮＡ断片１はその二重螺旋の回転方向
と同一の方向２０１に回転しながら電界方向２００に移
動する。FIG. 2 is a model diagram showing the dissociation state of the double-stranded DNA fragment 1 near the tip of the AFM probe 12.
In FIG. 2, the double-stranded DNA fragment 1 is pulled entirely in the direction of the electric field 200, and the tip of the AFM probe 12 moves slightly in the direction of the electric field 200 by this force, and the diaphragm 11 warps. When the diaphragm 11 warps to some extent, the diaphragm 11 reaches an equilibrium state in which the diaphragm 11 does not warp any more due to a repulsive force against the warping. In this equilibrium state, when the double-stranded DNA fragment 1 is further pulled in the electric field direction 200, the double-stranded DNA fragment 1
The hydrogen bond pairs between the base pairs in 1 dissociate without being able to withstand the pulling force. The diaphragm 11 whose warp has been returned again by this dissociation repeats the equilibrium state for the hydrogen bond pair between the adjacent base pairs and the dissociation of the hydrogen bond between the base pairs again, thereby causing the base pair to dissociate. Are shifted in the direction opposite to the electric field direction 200. Due to this shift, the DNA fragment 1 moves in the electric field direction 200 while rotating in the same direction 201 as the rotation direction of the double helix.

【００３７】振動板１１の反りは、その回数をＳＴＭ探
触針１３で計測することにより、ＤＮＡ断片１の塩基の
結合対（塩基対）の個数を数えることができる。また、
上記の平衡状態時の振動板１１の反りの大きさは塩基対
の間の水素結合の結合力によって決まるが、この結合力
はＡ−Ｔ結合対では水素結合が２つ存在するのに対し、
Ｇ−Ｃ結合対では水素結合が３つ存在するため結合力が
強く、この結合力の差が振動板１１の反りの大きさの差
に反映される。このため反りの大きさの違いからＤＮＡ
断片１の結合対の配列を測定できる。なお上記の計測状
態においては、はじめにＡＦＭ探触針１２の先端位置を
ＡＦＭ制御手段１５により調節して、この調整が完了し
た後はこの調整値を保持する。この調整は上記の反りが
スムーズに起こり、かつＡＦＭ探触針１２の先端と導電
性基板５３との間の隙間からＤＮＡ断片１が外れてない
程度に導電性基板５３とＡＦＭ探触針１２の先端とのＸ
方向の距離を調整する。The number of warping of the vibration plate 11 can be counted by using an STM probe 13 to count the number of base bonding pairs (base pairs) of the DNA fragment 1. Also,
The magnitude of the warpage of the diaphragm 11 in the above equilibrium state is determined by the bonding force of hydrogen bonds between base pairs. This bonding force is two hydrogen bonds in an AT bond pair,
Since three hydrogen bonds are present in the GC bond pair, the bonding force is strong, and the difference in the bonding force is reflected in the difference in the degree of warpage of the diaphragm 11. Due to the difference in the size of the warp, DNA
The sequence of the binding pair of fragment 1 can be determined. In the above measurement state, the position of the tip of the AFM probe 12 is first adjusted by the AFM control means 15, and after the adjustment is completed, the adjustment value is held. In this adjustment, the warpage occurs smoothly, and the conductive substrate 53 and the AFM probe 12 are moved to such an extent that the DNA fragment 1 does not come off from the gap between the tip of the AFM probe 12 and the conductive substrate 53. X with tip
Adjust the distance in the direction.

【００３８】上記の結合対の計測は、溶液２中に存在す
る長さ、塩基配列の異なる様々のＤＮＡ断片１に対して
繰り返し行うことができる。具体的には、上記の計測に
おいて、ＡＦＭ探触針１２の先端が挿入されたＤＮＡ断
片１は、その水素結合対の解離位置がＤＮＡ断片１の端
部までくるとＡＦＭ探触針１２の先端から外れ、静電伸
長されたまま、その一端が電極対５４のどちらか一方の
電極に接触するまで電界により引っ張られる。また、Ａ
ＦＭ探触針１２の先端が挿入されていない他のＤＮＡ断
片１も、その一端が電極対５４のどちらか一方の電極に
接触するまで電界により引っ張られる。全てのＤＮＡ断
片１の一端が電極対５４のどちらか一方の電極に接触し
た時点で、スイッチ５６をグランドに接続すると、再び
溶液２中のＤＮＡ断片１は溶液２中を浮遊し始める。こ
の時点で、装置系全体を５０〜７０度Ｃ程度に暖め、Ｄ
ＮＡ断片１を部分的１本鎖の状態する。ＤＮＡ断片１の
部分的１本鎖の状態が形成された時点で、スイッチ５６
を直流電源５５に接続し、ＤＮＡ断片１を再び導電静基
板５３のむき出し部分に静電固定する。次に、装置系全
体を０〜４０度Ｃ程度に冷やした後に、ＡＦＭ探触針１
２の先端を導電静基板５３の表面上で走査して、任意の
２本鎖ＤＮＡ断片１に対して２本の１本鎖３に囲まれた
領域４の内の１つを任意に選択する。以上の操作より計
測状態を生成した後に、再び塩基対の計測を開始する。
上記の操作を繰り返して、溶液２中に存在する長さ、塩
基配列の異なる様々のＤＮＡ断片１の一部または全体の
結合対の配列を決定できる。The above-mentioned measurement of the binding pair can be repeated for various DNA fragments 1 having different lengths and different base sequences in the solution 2. Specifically, in the above measurement, when the dissociation position of the hydrogen bond pair reaches the end of the DNA fragment 1, the tip of the AFM probe 12 is inserted into the DNA fragment 1 into which the tip of the AFM probe 12 is inserted. And one end thereof is pulled by the electric field until it comes into contact with one of the electrodes of the electrode pair 54 while being electrostatically extended. Also, A
The other DNA fragment 1 into which the tip of the FM probe 12 is not inserted is also pulled by the electric field until one end thereof contacts one of the electrodes of the electrode pair 54. When the switch 56 is connected to the ground when one end of all the DNA fragments 1 is in contact with one of the electrodes of the electrode pair 54, the DNA fragments 1 in the solution 2 start to float in the solution 2 again. At this point, the entire system is warmed to about 50-70 ° C.
NA fragment 1 is partially single-stranded. When the partial single-stranded state of the DNA fragment 1 is formed, the switch 56
Is connected to the DC power supply 55, and the DNA fragment 1 is electrostatically fixed to the exposed portion of the conductive static substrate 53 again. Next, after cooling the entire apparatus system to about 0 to 40 ° C., the AFM probe 1
2 is scanned on the surface of the conductive static substrate 53 to arbitrarily select one of the regions 4 surrounded by two single strands 3 for an arbitrary double-stranded DNA fragment 1. . After the measurement state is generated by the above operation, base pair measurement is started again.
By repeating the above operation, it is possible to determine the sequence of a part or the entire binding pair of various DNA fragments 1 having different lengths and different base sequences in the solution 2.

【００３９】以下では簡単のためＡ−Ｔ結合対を２Ｈ
（２つの水素結合を意味する）、Ｇ−Ｃ結合対を３Ｈ
（３つの水素結合を意味する）で表し、結合対の配列を
２Ｈ３Ｈ３Ｈ２Ｈ…という形で表現する。上記の方法で
決定された長さ、塩基配列の異なる様々なＤＮＡ断片１
の結合対の配列に対して共通の配列部分を検索し、共通
の配列部分において配列を繋ぎ合わせて、より長い配列
に対して結合対の配列を決定できる。この繋ぎ合わせを
誤る確率Ｐは、共通部分の配列長をＮとすると、２のＮ
乗分の１であり、Ｎが大きくなる程確率Ｐは０に近づ
く。例えば、Ｎが１０の場合はＰは０．００１程度であ
り、Ｎが５０の場合はＰは１０~¹⁵程度である。ＡＦＭ
探触針１２で検出できる最小の力は、室温で１０~¹⁵〜
１０~¹²（Ｎ）程度である。これに対して、１つの水素
結合間に働くエネルギーは１０~²⁰〜１０~¹⁹（Ｊ）であ
り、上記の平衡状態においてＡＦＭ探触針１２の先端位
置が０．１（ｎｍ）程度移動したと仮定すると、ＡＦＭ
探触針１２にかかる力は１０~¹⁰〜１０~⁹（Ｎ）程度で
あり、検出可能である。In the following, for simplicity, the AT bonding pair is 2H
(Meaning two hydrogen bonds), the GC bond pair is 3H
(Meaning three hydrogen bonds), and the sequence of the bond pair is expressed as 2H3H3H2H. Various DNA fragments 1 differing in length and base sequence determined by the above method
Search for a common sequence portion for the sequence of the binding pair, and join the sequences in the common sequence portion to determine the sequence of the binding pair for a longer sequence. The probability P of erroneous joining is N = 2, where N is the array length of the common portion.
The probability P is closer to 0 as N increases. For example, when N is 10, P is about 0.001, and when N is 50, P is about 10 to ¹⁵ . AFM
The minimum force that can be detected by the probe 12 is 10 to ¹⁵
It is about 10 to ¹² (N). On the other hand, the energy acting between one hydrogen bond is 10 to ²⁰ to 10 to ¹⁹ (J), and the tip position of the AFM probe 12 has moved about 0.1 (nm) in the above equilibrium state. Assuming that AFM
Force on the probe stylus 12 is about ^{10 ~ 10 ~10 ~ 9 (N} ), is detectable.

【００４０】図４は、静電伸長され基板上に固定された
１本鎖ＤＮＡ５をＳＴＭ又はＡＦＭで観測して得られる
画像の一例を示す模式図である。ここで、静電伸長され
た１本鎖ＤＮＡ５を基板上に固定する方法は文献１に詳
細が記載されているので、説明を省略する。基板として
はアルミニウム等を用いる。静電伸長された１本鎖ＤＮ
Ａ５をＳＴＭ又はＡＦＭで観測した場合、もしＤＮＡを
構成するＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４つの塩基を区別するのに十
分な空間分解能が得られれば、ＤＮＡ塩基配列を直接測
定できるが、実際には文献３に記述されるように、これ
らをＰｕグループ（Ａ、Ｇ）とＰｙグループ（Ｔ、Ｃ）
に分類できる程度の分解能に留まっている。これはＰｕ
分子が２つの環を有し、Ｐｙ分子が１つの環を有するの
で、これらの大きさ及び形状の違いが比較的区別できる
ためである。このため図４に示すように、得られる画像
からＰｕとＰｙの違いを認識して、これらの配列をＰｕ
ＰｙＰｙＰｕ…という形で計測できる。FIG. 4 is a schematic diagram showing an example of an image obtained by observing the single-stranded DNA 5 electrostatically elongated and fixed on the substrate by STM or AFM. Here, the method of fixing the single-stranded DNA 5 that has been electrostatically extended onto the substrate is described in detail in Document 1, and thus the description thereof is omitted. Aluminum or the like is used as the substrate. Electrostatically extended single-stranded DN
When A5 is observed by STM or AFM, if the spatial resolution sufficient to distinguish the four bases A, G, T, and C constituting DNA can be obtained, the DNA base sequence can be directly measured. As described in Document 3, these are referred to as Pu group (A, G) and Py group (T, C).
It is limited to a resolution that can be classified into. This is Pu
This is because the molecule has two rings and the Py molecule has one ring, so that the difference in size and shape between them can be relatively distinguished. Therefore, as shown in FIG. 4, the difference between Pu and Py is recognized from the obtained image, and these arrangements are changed to Pu.
It can be measured in the form of PyPyPu.

【００４１】上記のＰｕ、Ｐｙの配列は、同一の塩基配
列を持つＤＮＡの複数を切断して得られる長さ、塩基配
列の異なる様々のＤＮＡ断片の１本鎖に対して決定でき
る。このため、長さ、塩基配列の異なる様々のＤＮＡ断
片に対して決定されたＰｕ、Ｐｙの配列に対して共通の
配列部分を検索し、共通の配列部分において配列を繋ぎ
合わせて、より長い配列に対して結合対の配列を決定で
きる。繋ぎ合わせを誤る確率Ｐは、結合対の配列と同
様、共通部分の配列長をＮとすると、２のＮ乗分の１で
ある。The above-mentioned Pu and Py sequences can be determined for single strands of various DNA fragments having different lengths and base sequences obtained by cutting a plurality of DNAs having the same base sequence. For this reason, a common sequence portion is searched for the Pu and Py sequences determined for various DNA fragments having different lengths and base sequences, and the common sequence portions are joined to form a longer sequence. The sequence of the binding pair can be determined for The probability P of erroneous joining is 1 / N 2, where N is the sequence length of the common portion, similarly to the sequence of the coupling pair.

【００４２】図５は、上記の方法で計測された結合対及
びＰｕ、Ｐｙの配列から塩基配列を決定する方法を説明
するための図である。塩基はＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃの４つの種
類があるので、各塩基の持つ情報量は２ビットである。
この情報量は塩基が作る相補結合がＡ−Ｔ結合（即ち２
Ｈ）であるかＧ−Ｃ結合（即ち３Ｈ）であるかという１
ビットの情報と、塩基がＰｕグループに属するか、Ｐｙ
グループに属するかという１ビットの情報とに分けら
れ、各々の情報は独立である。従って、Ａはｐｕ・２
Ｈ、ＧはＰｕ・３Ｈ、ＴはＰｙ・２Ｈ、ＣはＰｙ・３Ｈ
と表記できる。いま、長いＤＮＡ断片の塩基配列５０１
対して、従来の電気泳動に基づく方法でその部分断片の
塩基配列５０２を完全に決定したとすると、塩基配列５
０２は上記の表記方法によりＰｕ、Ｐｙの配列５０３と
結合対の配列５０４との積として表現できる。FIG. 5 is a diagram for explaining a method for determining a base sequence from the binding pair and Pu and Py sequences measured by the above method. Since there are four types of bases, A, G, T and C, the information amount of each base is 2 bits.
This amount of information indicates that the complementary bond formed by the base is an AT bond (ie, 2 bonds).
H) or a GC bond (ie, 3H).
Bit information and whether the base belongs to the Pu group or Py
The information is divided into 1-bit information indicating whether the information belongs to a group, and each information is independent. Therefore, A is pu · 2
H, G are Pu · 3H, T is Py · 2H, C is Py · 3H
Can be written as Now, the base sequence 501 of a long DNA fragment
On the other hand, if the base sequence 502 of the partial fragment is completely determined by a conventional method based on electrophoresis, the base sequence 5
02 can be expressed as the product of the sequence 503 of Pu and Py and the sequence 504 of the binding pair according to the above notation.

【００４３】ここで、長いＤＮＡ断片に対して本実施例
に示した方法によりＰｕ、Ｐｙの配列５０５及び結合対
の配列５０６を計測したとする。この時Ｐｕ、Ｐｙの配
列５０５上で、部分断片のＰｕ、Ｐｙの配列５０３を検
索して、部分断片の位置を長いＤＮＡ断片上でマッピン
グできる。この時、マッピングが間違って行われる確率
Ｐは部分断片の配列長をＮとすると、２のＮ乗分の１で
ある。また同様にして、結合対の配列５０６上で部分断
片の結合対の配列５０４を検索して、部分断片の位置を
長いＤＮＡ断片上でマッピングできる。部分断片の塩基
配列５０２に対して、その位置をＰｕ、Ｐｙの配列５０
５及び結合対の配列５０６上でマッピングして、別々に
計測されたＰｕ、Ｐｙの配列５０５と結合対の配列５０
６との相対的な位置関係が分かる。従って、これらの情
報の積として、長いＤＮＡ断片の塩基配列５０７を完全
に決定できる。Here, it is assumed that the sequence 505 of Pu and Py and the sequence 506 of the binding pair are measured for a long DNA fragment by the method described in this embodiment. At this time, the Pu, Py sequence 503 of the partial fragment is searched on the Pu, Py sequence 505, and the position of the partial fragment can be mapped on the long DNA fragment. At this time, the probability P that the mapping is erroneously performed is 1 / N 2, where N is the sequence length of the partial fragment. Similarly, by searching the binding pair sequence 504 on the binding pair sequence 506, the position of the partial fragment can be mapped on the long DNA fragment. With respect to the base sequence 502 of the partial fragment, the position thereof is designated by the sequence 50 of Pu or Py.
5 and the binding pair sequence 505 and the binding pair sequence 50
6. The relative positional relationship with No. 6 can be understood. Therefore, the base sequence 507 of a long DNA fragment can be completely determined as the product of these pieces of information.

【００４４】また、上記のマッピングを用いて、従来の
電気泳動に基づく塩基配列決定を高速化できる。従来法
では、長さ、塩基配列の異なる様々な部分断片に対して
決定したＤＮＡ塩基配列の同一配列部分を繋ぎ合わせ
て、全体の塩基配列を決定していた。このため、沢山の
断片を繋ぎ合わせる手間がかかり、配列全体を高速に決
定することが困難であった。これに対して上記のマッピ
ングでは、上記の繋ぎ合わせを行うことなく、決定され
た部分配列の全ての配列の情報を用いて、各々の部分断
片の位置を決定できる。従って、従来技術における繋ぎ
合わせを行うための全ての操作を省略できので、この繋
ぎ合わせを行うために要していた時間分塩基配列決定を
高速化できる。また、特に繋ぎ合わせ部分が存在しない
場合でも、各々の部分断片の相対的な位置関係がわかる
ため、高速に全体像を把握できる。Further, the above-described mapping can be used to speed up the base sequence determination based on the conventional electrophoresis. In the conventional method, the entire base sequence is determined by connecting the same sequence portions of the DNA base sequence determined for various partial fragments having different lengths and base sequences. For this reason, it took time and effort to join many fragments, and it was difficult to determine the entire sequence at high speed. On the other hand, in the above-mentioned mapping, the position of each partial fragment can be determined using the information of all the determined partial sequences without performing the above-mentioned joining. Therefore, all the operations for performing the connection in the prior art can be omitted, and the base sequence determination can be speeded up by the time required for performing the connection. In addition, even when there are no joined portions, since the relative positional relationship between the respective partial fragments can be known, the entire image can be grasped at high speed.

【００４５】以上、本発明を実施例に基づき具体的に説
明したが、本発明は実施例に限定されるものではなく、
その要旨を逸脱しない範囲において種々変更しうること
は言うまでもない。Although the present invention has been described in detail based on the embodiments, the present invention is not limited to the embodiments.
It goes without saying that various changes can be made without departing from the scope of the invention.

【００４６】[0046]

【発明の効果】長いＤＮＡに対し、塩基対の間の水素結
合対の配列（即ち塩基対の配列）、及びプリン基、ピリ
ミジン基の配列を高速にシーケンシングできる。これら
配列情報を用いて、従来技術により配列決定されたＤＮ
Ａ断片を、長いＤＮＡの水素結合対の配列対（即ち塩基
対の配列）、又はプリン基、ピリミジン基の配列上でマ
ッピングできる。また、塩基対の配列とプリン基、ピリ
ミジン基の配列から、塩基配列を完全に決定でき、塩基
配列決定を高速化できる。According to the present invention, the sequence of hydrogen bond pairs between base pairs (that is, the sequence of base pairs) and the sequences of purine and pyrimidine groups can be sequenced at high speed for long DNA. Using these sequence information, the DN sequenced by the prior art is determined.
The A fragment can be mapped on a long DNA hydrogen bond pair sequence (ie, a base pair sequence) or a purine group or pyrimidine group sequence. In addition, the base sequence can be completely determined from the base pair sequence and the sequences of the purine group and the pyrimidine group, and the speed of base sequence determination can be increased.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の一実施例に係るＤＮＡシーケンシング
装置構成を示す図。FIG. 1 is a diagram showing a configuration of a DNA sequencing apparatus according to one embodiment of the present invention.

【図２】ＡＦＭ探触針の先端付近での２本鎖ＤＮＡ断片
の解離状態を示すモデル図。FIG. 2 is a model diagram showing a dissociation state of a double-stranded DNA fragment near the tip of an AFM probe.

【図３】ＡＦＭ探触針の走査により得られる導電性基板
上のＤＮＡ断片の画像の一例を示す模式図。FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of an image of a DNA fragment on a conductive substrate obtained by scanning with an AFM probe.

【図４】静電伸長され基板上に固定された１本鎖ＤＮＡ
をＳＴＭ又はＡＦＭで観測して得られる画像の一例を示
す模式図。FIG. 4: Single-stranded DNA that has been electrostatically extended and fixed on a substrate
FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of an image obtained by observing the image with STM or AFM.

【図５】計測された結合対及びＰｕ、Ｐｙの配列から塩
基配列を決定する方法を説明するための図。FIG. 5 is a diagram for explaining a method of determining a base sequence from a measured binding pair and sequences of Pu and Py.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

１…ＤＮＡ断片、２…溶液、３…１本鎖ＤＮＡ、４…２
本の１本鎖に囲まれた領域、５…静電伸長された１本鎖
ＤＮＡ、１０…ＡＦＭ支持フレーム、１１…振動板、１
２…ＡＦＭ探触針、１３…ＳＴＭ探触針、１４…ＳＴＭ
制御手段、１５…ＡＦＭ制御手段、５０…ガラス基板、
５１…ガラス突起、５２…電極、５３…導電性基板、５
４…電極対、５５…直流電源、５６…スイッチ、５７…
交流電源、２０１…二重螺旋の回転方向、２００…電界
方向、５０１…長いＤＮＡ断片の塩基配列、５０２…部
分断片の塩基配列、５０３…部分断片のＰｕ、Ｐｙの配
列、５０４…部分断片の結合対の配列、５０５…Ｐｕ、
Ｐｙの配列、５０６…結合対の配列、５０７…長いＤＮ
Ａ断片の塩基配列。1 ... DNA fragment, 2 ... solution, 3 ... single-stranded DNA, 4 ... 2
Region surrounded by a single strand of a book, 5: single-stranded DNA that has been electrostatically extended, 10: AFM support frame, 11: diaphragm, 1
2 ... AFM probe, 13 ... STM probe, 14 ... STM
Control means, 15: AFM control means, 50: glass substrate,
51: glass projection, 52: electrode, 53: conductive substrate, 5
4 ... electrode pair, 55 ... DC power supply, 56 ... switch, 57 ...
AC power supply, 201: rotation direction of double helix, 200: electric field direction, 501: base sequence of long DNA fragment, 502: base sequence of partial fragment, 503: sequence of Pu and Py of partial fragment, 504: partial sequence of Pu Sequence of binding pair, 505 ... Pu,
Py sequence, 506: sequence of binding pair, 507: long DN
Base sequence of fragment A.

Claims (14)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】溶液中に配置された基板上に２本鎖ＤＮＡ
断片を配置する工程と、前記２本鎖ＤＮＡ断片が配置さ
れた前記基板の上方に、探触プローブ型顕微鏡の探触針
の先端を配置し、前記２本鎖ＤＮＡ断片及び前記探触針
の先端の位置を操作して、前記２本鎖ＤＮＡ断片の１本
鎖間の結合が一部解離された２本の１本鎖間に挟まれる
領域で、前記探触針の先端を前記基板に接触させた計測
状態を生成する工程と、前記計測状態で、前記２本鎖Ｄ
ＮＡ断片と前記探触針の先端との相対的な位置を前記２
本鎖ＤＮＡ断片の配列方向に変化させ、前記変化に基づ
き前記探触針により、前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向
で、前記２本鎖ＤＮＡ断片のアデニン−チミン結合対又
はグアニン−シトシン結合対を解離させて、前記アデニ
ン−チミン結合対又はグアニン−シトシン結合対の解離
により生じる前記探触針の振動を、探触プローブ型顕微
鏡により検出する工程とを有し、前記振動の回数から前
記２本鎖ＤＮＡの塩基配列長を測定することを特徴とす
るＤＮＡシーケンシング方法。1. Double-stranded DNA is placed on a substrate placed in a solution.
Arranging a fragment, and disposing a tip of a probe of a probe-type microscope above the substrate on which the double-stranded DNA fragment is disposed; By manipulating the position of the tip, the tip of the probe is attached to the substrate in the region between the two single strands in which the bond between the single strands of the double-stranded DNA fragment is partially dissociated. Generating a contacted measurement state; and
The relative position between the NA fragment and the tip of the probe
The adenine-thymine bond pair or the guanine-cytosine bond pair of the double-stranded DNA fragment is changed in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment by the probe based on the change in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment. Dissociating the adenine-thymine bond pair or the guanine-cytosine bond pair to detect vibration of the probe caused by the dissociation of the probe with a probe-type microscope. A DNA sequencing method comprising measuring the base sequence length of a single-stranded DNA. 【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡシーケンシング方
法において、前記溶液中に配置された電極対で生成され
る電界により、前記計測状態において前記探触針の先端
が挿入された前記２本鎖ＤＮＡ断片を静電伸長し、静電
伸長された前記２本鎖ＤＮＡ断片と前記探触針の先端と
の相対的な位置を前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向で変
化させることを特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。2. The DNA sequencing method according to claim 1, wherein the tip of the probe is inserted in the measurement state by an electric field generated by an electrode pair arranged in the solution. Electrostatically extending the strand DNA fragment, and changing the relative position between the electrostatically extended double-stranded DNA fragment and the tip of the probe in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment. DNA sequencing method. 【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡシーケンシング方
法において、静電伸長された前記２本鎖ＤＮＡ断片が前
記電極対の一方の電極に引っ張られる力を利用して、前
記２本鎖ＤＮＡ断片と前記探触針の先端との相対的な位
置を前記２本鎖ＤＮＡ断片の配列方向で変化させること
を特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。3. The DNA sequencing method according to claim 2, wherein the double-stranded DNA fragment that has been electrostatically extended is pulled by one electrode of the electrode pair. A DNA sequencing method, wherein the relative position between the fragment and the tip of the probe is changed in the sequence direction of the double-stranded DNA fragment. 【請求項４】請求項１から請求項３の何れかに記載のＤ
ＮＡシーケンシング方法において、前記２本鎖ＤＮＡ断
片の少なくとも一部を２本の１本鎖に解離し、前記探触
針の先端を前記２本の１本鎖間に挿入し、前記探触針の
先端を前記２本の１本鎖間に挿入したまま前記基板に接
触し、前記探触針の先端を前記基板に接触した状態で前
記解離を再結合させて、前記計測状態を生成することを
特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。4. The D according to claim 1, wherein
In the NA sequencing method, at least a part of the double-stranded DNA fragment is dissociated into two single strands, and the tip of the probe is inserted between the two single strands. Contacting the substrate with the tip of the probe inserted between the two single strands, and recombining the dissociation with the tip of the probe in contact with the substrate to generate the measurement state. A DNA sequencing method, characterized in that: 【請求項５】請求項４に記載のＤＮＡシーケンシング方
法において、前記２本鎖ＤＮＡ断片の少なくも一部を２
本の１本鎖に解離した状態で、前記基板上に静電固定
し、前記静電固定の状態を保持したまま前記探触針の先
端を前記２本の１本鎖に囲まれる前記基板上の位置に接
触し、前記探触針の先端が前記基板上に接触している状
態で前記静電固定を解除して、前記探触針の先端を前記
２本の１本鎖間に挿入したまま前記基板に接触すること
を特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。5. The DNA sequencing method according to claim 4, wherein at least a part of the double-stranded DNA fragment is
In a state where the probe is dissociated into single strands, the probe is electrostatically fixed on the substrate, and the tip of the probe is surrounded by the two single strands while maintaining the electrostatically fixed state. And the electrostatic fixation was released in a state where the tip of the probe was in contact with the substrate, and the tip of the probe was inserted between the two single chains. A DNA sequencing method comprising contacting the substrate as it is. 【請求項６】請求項１から請求項５の何れかに記載のＤ
ＮＡシーケンシング方法において、前記アデニン−チミ
ン結合対およびグアニン−シトシン結合対の結合力の差
に起因する前記探触針の先端の前記振動の大きさの違い
を計測して、前記２本鎖ＤＮＡ断片の塩基対の配列を決
定することを特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。6. The D according to claim 1, wherein
In the NA sequencing method, the difference in the magnitude of the vibration of the tip of the probe caused by the difference in the binding force between the adenine-thymine binding pair and the guanine-cytosine binding pair is measured, and the double-stranded DNA is measured. A DNA sequencing method comprising determining the base pair sequence of a fragment. 【請求項７】請求項６に記載のＤＮＡシーケンシング方
法において、前記２本鎖ＤＮＡ断片が、同一の塩基配列
を持つＤＮＡ試料の切断から得られる複数の２本鎖ＤＮ
Ａ断片であり、前記複数の２本鎖ＤＮＡ断片の各々につ
いて前記塩基対の配列を決定し、異なる前記２本鎖ＤＮ
Ａ断片について決定された前記塩基対の配列で部分的に
同一の塩基対の配列を求めて、前記部分的に同一の塩基
対の配列を有するＤＮＡ断片同士を前記同一の塩基対の
配列部分において繋ぎ合わせて、前記ＤＮＡ試料の塩基
対の配列を決定することを特徴とするＤＮＡシーケンシ
ング方法。7. The DNA sequencing method according to claim 6, wherein the double-stranded DNA fragment comprises a plurality of double-stranded DNAs obtained by cutting a DNA sample having the same base sequence.
A, wherein the sequence of the base pair is determined for each of the plurality of double-stranded DNA fragments,
A sequence of a partially identical base pair is determined from the sequence of the base pair determined for the fragment A, and the DNA fragments having the partially identical base pair sequence in the sequence portion of the same base pair are determined. A DNA sequencing method, comprising: determining a base pair sequence of the DNA sample by joining together. 【請求項８】請求項７に記載のＤＮＡシーケンシング方
法において、前記ＤＮＡ試料の塩基対の配列が既知であ
り、前記２本鎖ＤＮＡ断片の塩基対の配列を前記ＤＮＡ
試料の塩基対の配列上で検索し、前記２本鎖ＤＮＡ断片
の前記ＤＮＡ試料での位置を決定することを特徴とする
ＤＮＡシーケンシング方法。8. The DNA sequencing method according to claim 7, wherein the base pair sequence of the DNA sample is known, and the base pair sequence of the double-stranded DNA fragment is
A DNA sequencing method comprising: searching on a base pair sequence of a sample to determine the position of the double-stranded DNA fragment in the DNA sample. 【請求項９】１本鎖ＤＮＡ断片が固定された基板上を探
触プローブ型顕微鏡の探触針で走査して、前記１本鎖Ｄ
ＮＡ断片に関する画像を作成する工程と、前記１本鎖Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を構成する各塩基がプリン基かピリ
ミジン基であるかを前記画像から判別する工程とを有
し、前記判別の結果に基づいて前記１本鎖ＤＮＡ断片の
プリン基、ピリミジン基に関する配列を決定することを
特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。9. The single-stranded DNA fragment is fixed on the substrate, and the substrate is scanned with a probe of a probe-type microscope.
Creating an image of the NA fragment;
Discriminating, from the image, whether each base constituting the base sequence of the NA fragment is a purine group or a pyrimidine group, based on the result of the discrimination, the purine group, pyrimidine group of the single-stranded DNA fragment A DNA sequencing method comprising determining a sequence related to DNA. 【請求項１０】請求項９に記載のＤＮＡシーケンシング
方法において、前記１本鎖ＤＮＡ断片が、同一の塩基配
列を持つＤＮＡ試料の切断から得られる複数の１本鎖Ｄ
ＮＡ断片であり、前記複数の１本鎖ＤＮＡ断片の各々に
ついて前記プリン基、ピリミジン基の配列を決定し、異
なる前記１本鎖ＤＮＡ断片について決定された前記プリ
ン基、ピリミジン基の配列で部分的に同一のプリン基、
ピリミジン基の配列を求めて、前記部分的に同一のプリ
ン基、ピリミジン基の配列を有するＤＮＡ断片同士を前
記同一のプリン基、ピリミジン基の配列部分において繋
ぎ合わせて、前記ＤＮＡ試料のプリン基、ピリミジン基
の配列を決定することを特徴とするＤＮＡシーケンシン
グ方法。10. The DNA sequencing method according to claim 9, wherein said single-stranded DNA fragments are obtained by cutting a plurality of single-stranded DNA fragments having the same nucleotide sequence.
An NA fragment, wherein the sequence of the purine group and the pyrimidine group is determined for each of the plurality of single-stranded DNA fragments, and the sequence of the purine group and the pyrimidine group determined for the different single-stranded DNA fragment is partially determined. The same purine group,
The sequence of the pyrimidine group is determined, the partially identical purine group, the DNA fragments having the sequence of the pyrimidine group are joined together at the same purine group, the sequence portion of the pyrimidine group, and the purine group of the DNA sample is A DNA sequencing method comprising determining the sequence of a pyrimidine group. 【請求項１１】請求項１０に記載のＤＮＡシーケンシン
グ方法において、前記ＤＮＡ試料のプリン基、ピリミジ
ン基の配列が既知であり、前記ＤＮＡ試料の切断から得
られる複数のＤＮＡ断片の塩基配列を従来の電気泳動法
に基づくＤＮＡシーケンシング方法で決定し、前記ＤＮ
Ａ断片のプリン基、ピリミジン基の配列を前記ＤＮＡ試
料のプリン基、ピリミジン基の配列上で検索し、前記Ｄ
ＮＡ断片の前記ＤＮＡ試料での位置を決定することを特
徴とするＤＮＡシーケンシング方法。11. The DNA sequencing method according to claim 10, wherein the sequences of purine groups and pyrimidine groups of the DNA sample are known, and the base sequences of a plurality of DNA fragments obtained by cutting the DNA sample can be used. Determined by a DNA sequencing method based on the electrophoresis method of
The sequence of the purine group and pyrimidine group of the fragment A was searched on the sequence of the purine group and pyrimidine group of the DNA sample,
A DNA sequencing method comprising determining the position of an NA fragment in the DNA sample. 【請求項１２】請求項６から請求項１１の何れかに記載
のＤＮＡシーケンシング方法において、前記ＤＮＡ試料
の塩基対の配列と、前記ＤＮＡ試料のプリン基、ピリミ
ジン基の配列とから、前記ＤＮＡ試料の塩基配列を決定
することを特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。12. The DNA sequencing method according to claim 6, wherein the DNA sequence is determined from a base pair sequence of the DNA sample and a purine group or pyrimidine group sequence of the DNA sample. A DNA sequencing method comprising determining a base sequence of a sample. 【請求項１３】請求項１２に記載のＤＮＡシーケンシン
グ方法において、前記ＤＮＡ試料の塩基対の配列及びプ
リン基、ピリミジン基の配列が既知であり、電気泳動に
基づくＤＮＡシーケンシング方法で決定された、前記Ｄ
ＮＡ試料の切断から得られる前記ＤＮＡ断片の塩基配列
の塩基対の配列を前記ＤＮＡ試料の塩基対の配列上で検
索し、前記ＤＮＡ断片のプリン基、ピリミジン基の配列
を前記ＤＮＡ試料のプリン基、ピリミジン基の配列上で
検索し、前記ＤＮＡ試料の塩基対の配列中における前記
ＤＮＡ断片の位置と前記ＤＮＡ試料のプリン基、ピリミ
ジン基の配列中における前記ＤＮＡ断片の位置を合わせ
て、前記ＤＮＡ試料の塩基対の配列と前記ＤＮＡ試料の
プリン基、ピリミジン基の配列との相対的な位置関係を
求め、前記ＤＮＡ試料の塩基配列を決定することを特徴
とするＤＮＡシーケンシング方法。13. The DNA sequencing method according to claim 12, wherein the sequence of base pairs and the sequences of purine and pyrimidine groups of the DNA sample are known and determined by a DNA sequencing method based on electrophoresis. , Said D
The base pair sequence of the DNA fragment obtained from the cleavage of the NA sample is searched on the base pair sequence of the DNA sample, and the sequence of the purine group or pyrimidine group of the DNA fragment is determined by the purine group of the DNA sample. Searching on the sequence of the pyrimidine group, aligning the position of the DNA fragment in the sequence of base pairs of the DNA sample with the position of the DNA fragment in the sequence of the purine group and pyrimidine group of the DNA sample, A DNA sequencing method comprising: determining a relative positional relationship between a sequence of a base pair of a sample and a sequence of a purine group or a pyrimidine group of the DNA sample, and determining a base sequence of the DNA sample. 【請求項１４】２本鎖ＤＮＡ断片の塩基対の配列を決定
する工程と、前記２本鎖ＤＮＡ断片を構成する１本鎖の
プリン基、ピリミジン基の配列を決定する工程とを有
し、前記塩基対の配列と前記プリン基、ピリミジン基の
配列とから、前記２本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列を決定す
ることを特徴とするＤＮＡシーケンシング方法。14. A method comprising the steps of: determining a base pair sequence of a double-stranded DNA fragment; and determining a sequence of a single-stranded purine or pyrimidine group constituting the double-stranded DNA fragment. A DNA sequencing method, comprising determining a base sequence of the double-stranded DNA fragment from the base pair sequence and the purine group and pyrimidine group sequences.