JPH1080300A - Reagent for measuring cholesterol - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain the subject reagent capable of simply and precisely measuring cholesterol in LDL by compounding a cholesterol esterase and a cholesterol oxidase in which at least either one of both enzymes is bound to a sugar compound. SOLUTION: When a cholesterol esterase is blended with a cholesterol oxidase, a modified cholesterol esterase or modified cholesterol oxidase prepared by covalently bonding an amino group of cholesterol esterase or cholesterol oxidase to amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde or 2,3- epoxypropyl group is used as at least either one of these enzymes to provide the objective reagent for measuring cholesterol, useful as an important judgment factor for arteriosclerosis and lipid metabolism abnormality in a region of clinical chemical test and capable of directly, simply and precisely measuring cholesterol in a low density lipoprotein(LDL).

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は臨床化学検査の領域にお
いて動脈硬化疾患、脂質代謝異常の重要な判断因子とし
て利用される、低比重リポ蛋白質（ＬＤＬ）中のコレス
テロールを測定する方法及びそれに用いられる試薬に関
する。The present invention relates to a method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein (LDL), which is used as an important determinant of arteriosclerosis and abnormalities in lipid metabolism in the field of clinical chemistry tests. Reagents to be used.

【０００２】[0002]

【従来の技術】血清中の脂質はリポ蛋白質として存在
し、比重の違いからキロミクロン、超低比重リポ蛋白質
（ＶＬＤＬ）、ＬＤＬ、高比重リポ蛋白質（ＨＤＬ）に
分類されている。これらは蛋白質と脂質が非共有的に会
合した粒子で、トリアシルグリセロールとコレステロー
ルエステルの非極性コアを蛋白質、コレステロール、リ
ン脂質が取り囲むミセル状の球状構造をしており、夫々
のリポ蛋白によって構成するアポ蛋白や脂質成分が異な
る。ＬＤＬは粒子直径が約１８０〜２８０オングストロ
−ム、比重が１．００６〜１．０６３（ｇ／ｍｌ）の範
囲で、そのアポ蛋白は主にアポＢ−１００からなり、脂
質が８割を占め、それにはコレステロールが多く含まれ
ている。これに対してＨＤＬは粒子直径が約５０〜１２
０Å、比重が１．０６３〜１．１２５（ｇ／ｍｌ）と小
さく、 主にりん脂質とコレステロールからなる脂質が
約５割を占める蛋白質（主にアポＡ）に富んだ最も小さ
いリポ蛋白である。ＬＤＬ−は肝臓で合成されたコレス
テロールを末端細胞に運搬し、ＨＤＬは逆に末梢組織か
ら肝臓への転送を行う役目を担っている。2. Description of the Related Art Serum lipids exist as lipoproteins and are classified into kilomicrons, very low density lipoproteins (VLDL), LDL, and high density lipoproteins (HDL) due to differences in specific gravity. These are particles in which proteins and lipids are non-covalently associated, and have a micellar spherical structure surrounding the non-polar core of triacylglycerol and cholesterol ester with proteins, cholesterol, and phospholipids. Apoprotein and lipid components are different. LDL has a particle diameter of about 180 to 280 angstroms and a specific gravity of 1.006 to 1.063 (g / ml), and its apoprotein is mainly composed of apo B-100, and the lipid accounts for 80%. , It is high in cholesterol. On the other hand, HDL has a particle diameter of about 50 to 12
0Å, specific gravity of 1.063 to 1.125 (g / ml), which is the smallest lipoprotein rich in protein (mainly apo A), which is composed mainly of phospholipids and cholesterol, accounting for about 50% of lipids . LDL- transports cholesterol synthesized in the liver to terminal cells, and HDL plays a role in transferring it from peripheral tissues to the liver.

【０００３】これらリポ蛋白質のうち、ＬＤＬは動脈硬
化の中で最も多いアテローム性動脈硬化（動脈内壁内
の、特に冠状動脈の平滑筋細胞内に脂質が沈着して始ま
る進行性の疾患）を引き起こす作用を有しているため、
これに由来するコレステロール（ＬＤＬ−コレステロー
ル）量は動脈硬化のリスクファクターとして注目されて
いる。しかしながら、現在のところＬＤＬ−コレステロ
ールを簡便にかつ精度良く測定し得る方法は存在しな
い。[0003] Among these lipoproteins, LDL causes atherosclerosis (a progressive disease which is initiated by deposition of lipids in the inner wall of arteries, particularly in smooth muscle cells of coronary arteries), which is the most common type of atherosclerosis. Has an action,
The amount of cholesterol (LDL-cholesterol) derived therefrom has attracted attention as a risk factor for arteriosclerosis. However, at present, there is no method capable of simply and accurately measuring LDL-cholesterol.

【０００４】例えば、フリーデワルド（Friedewald）ら
の提唱した式１ ＬＤＬ−コレステロール量 ＝ トータルコレステロール量− HDL-コレステロール量 − 1/5 ×トリク゛リセライト゛量 （式１） （注：単位は全て mg/dl）で求められるＬＤＬ−コレ
ステロール量は、約10％の誤差を含んでいるといわれて
いる。そのため、この方法により求められた値には、
通常、１回に10〜15％のＬＤＬ−コレステロールの低下
が見られれば、効果ありと判定される、食事療法や投薬
を行う場合の効果の有無の指標として用いることは危険
である、冠状動脈疾患の診断にこの値を用いれば、高
い確率で誤診の原因となる、等の問題点がある。また、
その他の分析方法である、例えば1950年代半ばから用い
られている超遠心法には、操作が複雑で、手間やコスト
がかかり、熟練を必要とする上、一度に処理できる量が
少ない、サンプル量を多く要する等の問題点が、電気泳
動法にも、やはり時間およびコストがかかる上、染色用
色素の取り込み量が各リポ蛋白質の種類により異なるた
め定量性に問題がある、等の問題を有している。For example, formula 1 LDL-cholesterol amount = total cholesterol amount−HDL-cholesterol amount−1 / 5 × triculcerite amount proposed by Friedewald et al. (Equation 1) (Note: All units are mg / dl) It is said that the amount of LDL-cholesterol obtained in the above includes an error of about 10%. Therefore, the value obtained by this method includes:
Usually, if LDL-cholesterol is reduced by 10 to 15% at one time, it is judged to be effective, and it is dangerous to use it as an indicator of the effect in the case of dietary treatment or medication. If this value is used for diagnosing a disease, there is a problem that a misdiagnosis is caused with a high probability. Also,
Other analytical methods, such as ultracentrifugation, which has been used since the mid-1950s, are complicated, labor-intensive, costly, require skill, and have a small volume that can be processed at one time. However, the electrophoresis method also requires time and cost, and the amount of dye for incorporation differs depending on the type of each lipoprotein. doing.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した如
き状況に鑑みなされたもので、ＬＤＬ−コレステロール
を直接測定することができ、しかもこれを簡便、高精度
に、かつ通常の自動分析装置を用いて測定し得る方法及
びそのための試薬の提供をその課題とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and enables direct measurement of LDL-cholesterol. It is an object of the present invention to provide a method which can be measured by using the method and a reagent for the method.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】上述した如き課題を解決
するため、本発明は、コレステロールエステラーゼとコ
レステロールオキシダーゼとを含有し、これらの酵素の
うち少なくとも一方が糖化合物と結合した修飾酵素であ
る、ＬＤＬ中のコレステロール測定用試薬、の発明であ
る。Means for Solving the Problems In order to solve the above-mentioned problems, the present invention provides a modified enzyme comprising cholesterol esterase and cholesterol oxidase, wherein at least one of these enzymes is bound to a sugar compound. It is an invention of a reagent for measuring cholesterol in LDL.

【０００７】また、本発明は、コレステロールエステラ
ーゼおよびコレステロールオキシダーゼとを使用するＬ
ＤＬ中のコレステロールの測定方法であって、これら酵
素のうち少なくとも一方が糖化合物と結合した修飾酵素
である、該測定方法、の発明である。[0007] The present invention also relates to L-proteinases using cholesterol esterase and cholesterol oxidase.
The present invention relates to a method for measuring cholesterol in DL, wherein at least one of these enzymes is a modified enzyme bound to a sugar compound.

【０００８】更にまた、本発明は、生体試料と、緩衝剤
を含有する第１液とを混合して、得られた反応液の吸光
度（ＯＤ1）を測定し、次いで、該反応液と、コレステ
ロールエステラ−ゼ、コレステロールオキシダ−ゼを含
有する第２液とを混合した後、吸光度（ＯＤ2）を測定
し、得られたＯＤ2からＯＤ1に補正係数を掛けて求めた
値を差し引いた吸光度 （ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ
3を、予め所定濃度のコレステロールを含有する標準液
を用いて上記と同様にして求めた、コレステロール濃度
とＯＤ3との関係を示す検量線に当てはめて、該生体試
料中の低比重リポ蛋白中のコレステロール量を求めるこ
とを特徴とする、生体試料中の低比重リポ蛋白中のコレ
ステロールの測定方法であって、コレステロールエステ
ラーゼとコレステロールオキシダーゼの少なくとも一方
は糖化合物と結合した修飾酵素であり、カプラー、デベ
ロパー及びパーオキシダーゼは夫々第１液と第２液の何
れかに含有されている該測定法、の発明である。Furthermore, the present invention provides a method of mixing a biological sample with a first solution containing a buffer, measuring the absorbance (OD1) of the obtained reaction solution, and then mixing the reaction solution with cholesterol. After mixing with a second liquid containing esterase and cholesterol oxidase, the absorbance (OD2) was measured, and the absorbance (OD3) obtained by subtracting the value obtained by multiplying OD1 by a correction coefficient from the obtained OD2. And the resulting OD
3 was applied to a calibration curve showing the relationship between cholesterol concentration and OD3, which was obtained in the same manner as described above using a standard solution containing cholesterol at a predetermined concentration in advance, and the concentration of lipoprotein in the low-density lipoprotein in the biological sample was determined. A method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a biological sample, which comprises determining the amount of cholesterol, wherein at least one of cholesterol esterase and cholesterol oxidase is a modified enzyme bound to a sugar compound, and a coupler, a developer. And peroxidase are inventions of the measurement method, which are contained in either the first solution or the second solution, respectively.

【０００９】即ち、本発明者らは酵素を化学修飾してそ
の機能を変化させることを鋭意研究の結果、コレステロ
ールエステラーゼ又は／及びコレステロールオキシダー
ゼのアミノ基またはカルボキシル基を糖化合物で修飾し
て得た修飾酵素には、ＨＤＬ中のコレステロール（ＨＤ
Ｌ−コレステロール）とは反応せず、ＬＤＬ−コレステ
ロールに対してのみ特異的に反応する性質があることを
見出し、これに基づいてさらに研究を行った結果、本発
明を完成するに至った。That is, the present inventors have made intensive studies on chemically modifying enzymes to change their functions, and as a result, obtained by modifying the amino group or carboxyl group of cholesterol esterase and / or cholesterol oxidase with a sugar compound. Modification enzymes include cholesterol in HDL (HD
(L-cholesterol) and found to have a property of specifically reacting only with LDL-cholesterol. Based on this, further studies were conducted, and as a result, the present invention was completed.

【００１０】本発明に係わるコレステロールオキシダー
ゼは、その由来は特に限定されず、通常この分野で使用
されているもの、例えば、ノカルディア属、シュードモ
ナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に
由来するもの等は全て使用可能である。[0010] The origin of the cholesterol oxidase according to the present invention is not particularly limited, and those usually used in this field, for example, those derived from microorganisms such as Nocardia and Pseudomonas, and animal organs such as bovine pancreas And the like can be used.

【００１１】本発明に係わるコレステロールエステラー
ゼは、その由来は特に限定されず、通常この分野で使用
されているもの、例えば、キャンディダ属、シュードモ
ナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動物臓器に
由来するもの等は全て使用可能である。[0011] The origin of the cholesterol esterase according to the present invention is not particularly limited, and those usually used in this field, for example, those derived from microorganisms such as Candida and Pseudomonas, and animal organs such as bovine pancreas And the like can be used.

【００１２】本発明において、コレステロールエステラ
ーゼまたはコレステロールオキシダーゼに結合させるた
めに用いられる糖化合物としては、例えばグルコ−ス，
マンノース，フルクトース，ガラクトース，フコース，
ソルビトール，アロース，キシロース，アライノース，
リキソース，リボース，タロース，グロース，イドー
ス，アルトロース等の単糖類、例えばサッカロース，マ
ンノース，ラクトース，マルト−ス，イソマルトース，
ツラノース，ゲンチオビオース，メルビオース，プラン
テオビオース，プリメベロース，ビシアノース，ニゲロ
ース，ラミナリビオース，トレハロース，ルチノース，
セロビオース，キシロビオース等の二糖類、例えばマル
トトリオース，ラフィノース，ゲンチアノース，メレジ
トース，プランテオース，ケストース等の三糖類、例え
ばグルコサミン，ガラクトサミン等のアミノ糖類、例え
ばアミロ−ス，デキストラン，プルラン，デキストリ
ン，デンプン，フィコール等の水溶性多糖類、例えばα
−シクロデキストリン，β−シクロデキストリン，γ−
シクロデキストリン等の環状オリゴ糖等の糖類やその誘
導体が好ましく挙げられる。また、水溶性多糖類の分子
量は特に限定されず、市販されているものはいずれのも
のでも用いることができるが、通常1000〜200万、好ま
しくは１万〜50万のものが挙げられる。糖類の誘導体と
しては、例えばその水酸基の水素原子が、例えば硫酸残
基，燐酸残基等の酸残基、例えばカルボキシメチル基等
のカルボキシアルキル基、例えばアセチル基等のアシル
基、例えばメチル基、エチル基等のアルキル基、例えば
ヒドロキシメチル基、ヒドロキシエチル基等のヒドロキ
シアルキル基等で置換されているものや水酸基が例えば
アミノ基、カルボキシル基等の基に置き換わっているも
の、或いは例えばアミノ基、カルボキシル基、イミノ
基、アルデヒド基、シアヌリル基、２，３−エポキシプ
ロピル基等の酵素のアミノ基に対する活性基を有する糖
類等が挙げられる。また、誘導体の具体例としては、例
えば、デキストラン硫酸、ペクチン酸、アルギン酸、ヘ
パリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン、グリコ−ルキ
チン、カルボキシメチルキチン、デルマタン酸、カルボ
キシメチルセルロ−ス、カルボキシメチルデキストラ
ン、α−，β−又はγ−メチル化シクロデキストリン、
α−，β−又はγ−ヒドロキシメチル化シクロデキスト
リン、α−，β−又はγ−アセトキシ化シクロデキスト
リン、α−，β−又はγ−硫酸化シクロデキストリン等
が挙げられる。In the present invention, sugar compounds used for binding to cholesterol esterase or cholesterol oxidase include, for example, glucose,
Mannose, fructose, galactose, fucose,
Sorbitol, allose, xylose, allinose,
Monosaccharides such as lyxose, ribose, talose, gulose, idose and altrose, such as saccharose, mannose, lactose, maltose, isomaltose,
Turanose, gentiobiose, melbiose, planteobiose, primeverose, bicyanose, nigerose, laminaribiose, trehalose, rutinose,
Disaccharides such as cellobiose and xylobiose; trisaccharides such as maltotriose, raffinose, gentianose, melezitose, planteose, and kestose; aminosaccharides such as glucosamine and galactosamine; Water-soluble polysaccharides such as ficoll, for example α
-Cyclodextrin, β-cyclodextrin, γ-
Saccharides such as cyclic oligosaccharides such as cyclodextrin and derivatives thereof are preferred. In addition, the molecular weight of the water-soluble polysaccharide is not particularly limited, and any commercially available one can be used, and the molecular weight is usually 1,000 to 2,000,000, preferably 10,000 to 500,000. As the saccharide derivative, for example, a hydrogen atom of the hydroxyl group is an acid residue such as a sulfuric acid residue or a phosphoric acid residue, for example, a carboxyalkyl group such as a carboxymethyl group, an acyl group such as an acetyl group, for example, a methyl group, An alkyl group such as an ethyl group, for example, a hydroxymethyl group, those substituted with a hydroxyalkyl group such as a hydroxyethyl group or a hydroxyl group replaced with a group such as an amino group or a carboxyl group, or an amino group, Examples include saccharides having an active group for an amino group of an enzyme such as a carboxyl group, an imino group, an aldehyde group, a cyanuryl group, and a 2,3-epoxypropyl group. Further, specific examples of the derivative include, for example, dextran sulfate, pectic acid, alginic acid, heparin, heparan sulfate, chondroitin, glyco-lquitin, carboxymethyl chitin, dermatanic acid, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl dextran, α-, β- or γ-methylated cyclodextrin,
α-, β- or γ-hydroxymethylated cyclodextrin, α-, β- or γ-acetoxylated cyclodextrin, α-, β- or γ-sulfated cyclodextrin and the like.

【００１３】上記の糖化合物の内、例えばアミノ基、カ
ルボキシル基、イミノ基、アルデヒド基、シアヌリル
基、２，３−エポキシプロピル基等の酵素のアミノ基に
対する活性基（以下、単に活性基という場合がある）を
有しているものはそのままコレステロールエステラーゼ
又はコレステロールオキシダーゼとの結合反応に供して
も良い。Among the above saccharide compounds, an active group for an amino group of an enzyme such as an amino group, a carboxyl group, an imino group, an aldehyde group, a cyanuryl group, a 2,3-epoxypropyl group (hereinafter simply referred to as an active group) May be directly subjected to a binding reaction with cholesterol esterase or cholesterol oxidase.

【００１４】活性基を有さない糖化合物は、後述する活
性基を導入する方法により活性化して用いればよい。
尚、活性基は、例えば炭素数１〜６のアルキレン基等の
スペーサーを介して導入されてもよい。The sugar compound having no active group may be used after being activated by a method for introducing an active group described later.
The active group may be introduced via a spacer such as an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.

【００１５】糖化合物に活性基を導入するための方法と
しては、この分野で広く知られている方法は全て使用可
能であり、具体的には例えば塩化シアヌルを用いるシア
ヌリル基の導入方法（例えば、J.Solid-phase Bioche
m., 4 巻, 2128頁, 1976年等）、メタ過沃素酸を用いる
アルデヒド基の導入方法（例えば、Proc.Nati.Acad.Sc
i.U.S.A.,73 巻，2128頁，1976年等）、ブロムシアンを
用いるイミノ基の導入方法（例えば、Nature, 214巻, 1
302頁, 1967年等）、エピクロルヒドリンを用いる２，
３−エポキシプロピル基の導入方法（例えば、J.Chroma
tog.,51巻,479頁,1970年等）、カルボン酸無水物を用い
るカルボキシル基の導入方法（例えば、特開平５−２６
８９５０号公報等）、モノブロモカルボン酸を用いるカ
ルボキシル基の導入方法（例えば、Arc.Biochem.Biophy
s.,147巻,788頁,1971年等）等が挙げられる。尚、この
ような活性化方法の中からどの方法を採用するかは、例
えば糖化合物の種類、反応させるコレステロールエステ
ラーゼ又はコレステロールオキシダーゼの性質等を勘案
して適宜選択すればよい。As a method for introducing an active group into a sugar compound, any method widely known in this field can be used, and specifically, a method for introducing a cyanuryl group using, for example, cyanuric chloride (for example, J. Solid-phase Bioche
m., 4, 2128, 1976), a method for introducing an aldehyde group using metaperiodic acid (for example, Proc. Nati. Acad. Sc.
iUSA, vol. 73, p. 2128, 1976, etc., and a method for introducing an imino group using bromocyan (for example, Nature, vol. 214, 1).
P. 302, 1967), using epichlorohydrin,
A method for introducing a 3-epoxypropyl group (for example, J. Chroma
tog., vol. 51, p. 479, 1970, etc.) and a method for introducing a carboxyl group using a carboxylic anhydride (for example, see JP-A-5-26).
No. 8950), a method for introducing a carboxyl group using a monobromocarboxylic acid (for example, Arc. Biochem. Biophy
147, 788, 1971). Which of the activation methods to use may be appropriately selected in consideration of, for example, the type of the sugar compound and the properties of cholesterol esterase or cholesterol oxidase to be reacted.

【００１６】酵素との反応性を増加させるために、元々
活性基を有する糖化合物を上記した如き活性基の導入方
法により処理し、活性基を更に導入して用いてもよい。
尚、糖化合物を上記した如き方法により処理した後にコ
レステロールエステラーゼ又はコレステロールオキシダ
ーゼと反応させるに当たっては、予め活性化された糖化
合物を含む溶液を適宜透析する等して、脱塩、ｐＨの調
整、イオン種の調整等を行った後に反応に供しても良
い。In order to increase the reactivity with the enzyme, the sugar compound originally having an active group may be treated by the method for introducing an active group as described above, and the active group may be further introduced for use.
When the sugar compound is treated by the above-described method and then reacted with cholesterol esterase or cholesterol oxidase, a solution containing the sugar compound which has been activated in advance is appropriately dialyzed, for example, for desalting, pH adjustment, ionization, and the like. After adjusting the seeds, the reaction may be performed.

【００１７】活性基を有する糖化合物は、下記に示す如
き公知の方法に準じて、コレステロールエステラーゼ又
はコレステロールオキシダーゼと接触させることにより
容易にこれらと共有結合するが、酵素と反応させる前に
これら酵素と結合させるリガンドとなり得る化合物を更
に結合させた後にこれら酵素との反応に供しても何れに
ても良い。The saccharide compound having an active group is easily covalently bonded to cholesterol esterase or cholesterol oxidase by contact with cholesterol esterase or cholesterol oxidase according to a known method as described below. After further binding a compound which can be a ligand to be bound, the compound may be subjected to a reaction with these enzymes or may be used in any case.

【００１８】糖化合物と、コレステロールエステラーゼ
又はコレステロールオキシダーゼとを共有結合させるた
めに用いられる公知方法としては、例えば以下のような
方法が挙げられる。即ち、例えば、反応に関与する反応
基が、アミノ基とカルボキシル基の場合には、例えばカ
ルボジイミド法（例えば、J.Biol.Chem.,245巻,3059頁,
1970年等）、活性化エステル法（例えば、Cancer Bioch
em.,7巻,175頁,1984年等）、酸無水物法（例えば、J.Bi
ol.Chem.,237巻,1825頁,1962年等）、アジド法（例え
ば、Eur.J.Biochem.,25巻,129頁,1972年等）、カルボシ
キクロリド法（例えば、Angew.Chem,67巻,661頁,1955年
等）、イソシアナート法（例えば、Nature,210巻,367
頁,1966年等）、ウッドワード試薬法（例えば、Biochi
m.Biophys.Acta,178巻,626頁,1969年等）、ウギ（Ｕｇ
ｉ）反応（例えば、Angew.Chem.,74巻,9頁,1962年等）
等が挙げられ、該反応基がアミノ基とアミノ基の場合に
は、例えばグルタルアルデヒド法（例えば、Experienti
a,28巻,958頁,1973年等）、アルキル化法（例えば、Bio
chem.Biophys.Acta,198巻,276頁,1970年等）等が挙げら
れ、該反応基が水酸基とアミノ基の場合には、例えばア
ルキル化法（例えば、Biochem.Biophys.Acta,198巻,276
頁,1970年等）等が挙げられる。Known methods used for covalently bonding a sugar compound to cholesterol esterase or cholesterol oxidase include, for example, the following methods. That is, for example, when the reactive groups involved in the reaction are an amino group and a carboxyl group, for example, the carbodiimide method (for example, J. Biol. Chem., 245, 3059,
Activated ester method (eg, Cancer Bioch)
em., 7, 175, 1984), acid anhydride method (for example, J. Bi
ol. Chem., 237, 1825, 1962, etc.), azide method (for example, Eur. J. Biochem., 25, 129, 1972, etc.), and carboxychloride method (for example, Angew. 67, 661, 1955, etc.), isocyanate method (for example, Nature, 210, 367).
Pp. 1966), the Woodward reagent method (eg, Biochi
m. Biophys. Acta, 178, 626, 1969, etc.)
i) Reaction (for example, Angew. Chem., vol. 74, p. 9, 1962)
When the reactive group is an amino group, for example, a glutaraldehyde method (for example, Experimental
a, vol. 28, p. 958, 1973), alkylation method (for example, Bio
Chem. Biophys. Acta, vol. 198, p. 276, 1970 and the like. When the reactive group is a hydroxyl group and an amino group, for example, an alkylation method (for example, Biochem. Biophys. Acta, vol. 276
P. 1970).

【００１９】また、該反応基がアミノ基とアルデヒド基
の場合には、例えば過沃素酸酸化法（例えば、Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,73巻,2128頁,1978年等）等が挙げら
れ、該反応基がアミノ基とイミノ基の場合には、例えば
ブロムシアン法（例えば、Nature, 214巻, 1302頁, 196
7年等）等が挙げられる。酵素と糖化合物との結合方法
の一部を、反応式として示すと以下の如くになる。When the reactive groups are an amino group and an aldehyde group, for example, a periodate oxidation method (for example, Proc. Nat.
USA, vol. 73, p. 2128, 1978). When the reactive group is an amino group and an imino group, for example, the Bromcian method (for example, Nature, vol. 214, p. 1302) , 196
7 years). A part of the method of binding an enzyme and a sugar compound is represented as a reaction formula as follows.

【００２０】１）カルボジイミド法1) Carbodiimide method

【反応式１】 [Reaction formula 1]

【００２１】２）ブロムシアン法2) Bromcian method

【反応式２】 [Reaction formula 2]

【００２２】３）過沃素酸酸化法3) Periodic acid oxidation method

【反応式３】 [Reaction formula 3]

【００２３】上記した、糖化合物と、コレステロールエ
ステラーゼ又はコレステロールオキシダーゼとの結合方
法は、例えば以下の如くして行われる。The above-described method of binding a sugar compound to cholesterol esterase or cholesterol oxidase is performed, for example, as follows.

【００２４】即ち、コレステロールエステラーゼ又はコ
レステロールオキシダーゼと、上記した如き酵素と反応
し得る糖化合物とを重量比で酵素対糖化合物が１対０．
１〜１００となるように、適当な溶媒、例えばｐＨが４
〜１０、好ましくは６〜９の緩衝液中で、更に要すれば
グルタルアルデヒド、例えばN,N'-フェニレンジマレイ
ミド等のジマレイミド化合物等の２価性架橋試薬、例え
ば1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイ
ミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイ
ミド試薬、例えばN-エチル-5-フェニルイソオキサゾリ
ウム-3'-スルホナート等のウッドワード試薬等の縮合試
薬を必要量共存させて、通常１〜５０℃、好ましくは４
〜４０℃で、通常３０分〜１週間、好ましくは１時間〜
３日間反応させることにより、目的の糖化合物と結合し
たコレステロールエステラーゼ又はコレステロールオキ
シダーゼを容易に得ることができる。That is, cholesterol esterase or cholesterol oxidase and a sugar compound capable of reacting with the enzyme as described above are used in a weight ratio of enzyme to sugar compound of 1: 0.
An appropriate solvent such as pH 4 to be 1 to 100.
In a buffer solution of 10 to 10, preferably 6 to 9, a divalent cross-linking reagent such as glutaraldehyde, for example, a dimaleimide compound such as N, N'-phenylenedimaleimide, for example, 1-ethyl-3- ( A required amount of a carbodiimide reagent such as 3-dimethylaminopropyl) carbodiimide or dicyclohexylcarbodiimide, for example, a condensing reagent such as a Woodward reagent such as N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate, is usually used in an amount of 1: 1. ~ 50 ° C, preferably 4
~ 40 ° C, usually 30 minutes to 1 week, preferably 1 hour to
By reacting for 3 days, cholesterol esterase or cholesterol oxidase bound to the target sugar compound can be easily obtained.

【００２５】このようにして得られた、修飾されたコレ
ステロールエステラーゼ又はコレステロールオキシダー
ゼは、要すれば、適当な緩衝液に対して透析してもよ
く、要すれば透析後更に適当な方法によって濃縮や凍結
乾燥等を行ってもよい。このようにして得られた修飾コ
レステロールエステラーゼ或いは修飾コレステロールオ
キシダーゼは、糖化合物と酵素との重量比が通常１０
０：１〜１：５，好ましくは２０：１〜１：１であり、
糖化合物と酵素とのモル比が通常５００：１〜１：５
０、好ましくは６５：１〜１：５０である。また、酵素
分子と糖化合物の構成糖単位（例えばグルコース単位、
マンノース単位、フルクトース単位、ガラクトース単
位、フコース単位等）との比率は、通常１：２８０００
００〜１：１００、好ましくは１：３６００００〜１：
１００である。The thus obtained modified cholesterol esterase or cholesterol oxidase may be dialyzed against a suitable buffer, if necessary, and after dialysis, concentrated or concentrated by a suitable method. Freeze-drying or the like may be performed. The modified cholesterol esterase or modified cholesterol oxidase thus obtained usually has a weight ratio of sugar compound to enzyme of 10%.
0: 1 to 1: 5, preferably 20: 1 to 1: 1;
The molar ratio between the sugar compound and the enzyme is usually 500: 1 to 1: 5
0, preferably 65: 1 to 1:50. In addition, constituent sugar units of the enzyme molecule and the sugar compound (for example, glucose unit,
Mannose unit, fructose unit, galactose unit, fucose unit, etc.).
00 to 1: 100, preferably 1: 360000 to 1:
100.

【００２６】上記の修飾反応を行う際には、反応溶液中
に酵素の失活を防ぐために安定化剤となり得るものを更
に添加してもよい。このような目的で使用し得る物質と
しては、例えば牛血清アルブミン等の蛋白質、グリセロ
−ル等のポリオ−ル、基質類似化合物、補酵素、ＥＤＴ
Ａ、金属塩等一般に安定化剤として知られているものは
全て挙げられる。At the time of performing the above modification reaction, a substance which can serve as a stabilizer may be further added to the reaction solution in order to prevent the inactivation of the enzyme. Examples of substances that can be used for such purposes include proteins such as bovine serum albumin, polyols such as glycerol, substrate analogs, coenzymes, and EDT.
A, a metal salt and the like generally known as a stabilizer can be mentioned.

【００２７】糖化合物と、コレステロールエステラーゼ
又はコレステロールオキシダーゼとを反応の際に反応溶
媒として用いられる緩衝液としては、通常この分野で用
いられる緩衝液は特に限定されることなく使用可能であ
るが、例えばグッド緩衝剤、リン酸塩、ホウ酸塩等から
調製された、ｐＨが４〜１０、好ましくは６〜９で、５
ｍＭ〜0.5Ｍ、好ましくは10〜100ｍＭの緩衝液等が好ま
しく挙げられる。As the buffer used as a reaction solvent in the reaction between the sugar compound and cholesterol esterase or cholesterol oxidase, buffers used in this field can be used without particular limitation. PH of 4-10, preferably 6-9, prepared from Good buffer, phosphate, borate, etc.
Buffers such as mM to 0.5 M, preferably 10 to 100 mM are preferred.

【００２８】本発明の方法によるＬＤＬ−コレステロー
ルの測定は、上記した如くして得られる、糖化合物と結
合した修飾コレステロールエステラーゼ（以下、単に修
飾コレステロールエステラーゼと略記する。）及び糖化
合物と結合した修飾コレステロールオキシダーゼ（以
下、単に修飾コレステロールオキシダーゼと略記す
る。）の内の少なくとも一種、好ましくは２種を用いる
以外は、通常この分野でコレステロール測定試薬として
自体公知の試薬、例えばコレステロールオキシダーゼ、
コレステロールエステラーゼ、ペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）、被酸化性の発色剤等を含有する試薬の調製方法に
準じて調製された試薬を用い、通常この分野で行われる
操作法に準じて実施すればよい。The measurement of LDL-cholesterol according to the method of the present invention is carried out by measuring a modified cholesterol esterase (hereinafter simply referred to as modified cholesterol esterase) bound to a sugar compound and a modified compound bound to a sugar compound, which are obtained as described above. Except for using at least one, and preferably two, of cholesterol oxidase (hereinafter simply referred to as modified cholesterol oxidase), a reagent known per se as a cholesterol measuring reagent in this field, for example, cholesterol oxidase,
Cholesterol esterase, peroxidase (PO
D), using a reagent prepared according to a method for preparing a reagent containing an oxidizable color former and the like, may be carried out according to an operation method usually performed in this field.

【００２９】また、これら測定試薬の各成分の使用濃度
としては、通常この分野で測定の際に使用される濃度範
囲から適宜選択して用いれば足りる。本発明の測定に使
用可能な緩衝液も通常この分野で通常使用されているも
のであればよく、特に限定されない。また、その濃度も
特に限定されないが、通常２ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは５
０ｍＭ〜０．５Ｍの範囲から適宜選択され、また、その
ｐＨ範囲も、酵素の安定領域であれば、いずれのｐＨで
も使用可能であるが、好ましくはｐＨ６〜８、より好ま
しくは７前後から適宜選択すればよい。The concentration of each component of these measuring reagents may be appropriately selected from the range of concentrations usually used for measurement in this field. The buffer which can be used for the measurement of the present invention is not particularly limited as long as it is usually used in this field. The concentration is not particularly limited, but is usually 2 mM to 1 M, preferably 5 mM.
The pH range is appropriately selected from the range of 0 mM to 0.5 M, and the pH range can be used at any pH as long as it is a stable region of the enzyme, but is preferably from pH 6 to 8, more preferably from about 7 Just choose.

【００３０】尚、修飾コレステロールエステラーゼ及び
修飾コレステロールオキシダーゼの本発明の測定方法に
於ける使用量としては、その起源、糖化合物と結合させ
る際の糖化合物の種類や結合方法等によって糖化合物と
結合させた後の酵素活性が変動するため、目的の測定を
実施し得る量であれば良く特に限定されないが、修飾コ
レステロールエステラーゼの使用量としては、コレステ
ロール測定時の反応液中の濃度として、通常０．１〜１
０ｕ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２ｕ／ｍｌの範囲から
適宜選択される。また、修飾コレステロールオキシダー
ゼの使用量としては、コレステロール測定時の反応液中
の濃度として、通常０．１〜１０ｕ／ｍｌ、好ましくは
０．５〜２ｕ／ｍｌの範囲から適宜選択される。また、
これらの酵素は別々の試薬にいれても、同じ試薬に入れ
てもよい。The amount of the modified cholesterol esterase and the modified cholesterol oxidase used in the measuring method of the present invention is determined based on the origin thereof, the type of the saccharide compound to be conjugated with the saccharide compound, the bonding method, and the like. The amount of the modified cholesterol esterase to be used is usually not more than 0.1 as the concentration in the reaction solution at the time of cholesterol measurement, since the enzyme activity after the reaction is fluctuated, so long as the target measurement can be carried out. 1 to 1
0 u / ml, preferably in the range of 0.5 to 2 u / ml. The amount of the modified cholesterol oxidase to be used is appropriately selected as a concentration in the reaction solution at the time of measuring cholesterol, usually from 0.1 to 10 u / ml, preferably from 0.5 to 2 u / ml. Also,
These enzymes may be in separate reagents or in the same reagent.

【００３１】本発明の測定法に用いられる被酸化性呈色
試薬としては、パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下、
過酸化水素と反応して呈色するものであれば何れにても
良いが、４−アミノアンチピリン等のカプラー及び、該
カプラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロパーとの組
合せ、即ち、例えば４−アミノアンチピリンとフェノー
ル系化合物，ナフトール系化合物若しくはアニリン系化
合物の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒ
ドラゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフ
ェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイ
ミダゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−
フェニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が
発色する発色剤等が挙げられる。The oxidizable color reagent used in the assay method of the present invention may be in the presence of peroxidase (POD).
Any material may be used as long as it reacts with hydrogen peroxide to produce a color, but a combination of a coupler such as 4-aminoantipyrine and a developer which oxidatively condenses with the coupler to produce a dye, for example, 4- A combination of aminoantipyrine and a phenolic compound, a naphthol compound or an aniline compound, a combination of 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone and an aniline compound,
2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-
Sulfonic acid), triphenylmethane leuco dye, diphenylamine derivative, benzidine derivative, triallylimidazole derivative, leucomethylene blue derivative, o-
A coloring agent which itself develops a color by oxidation of a phenylenediamine derivative or the like can be used.

【００３２】デベロパーとしてのフェノール系化合物の
具体例としては、例えばフェノール、ｐ−クロロフェノ
ール、２，４−ジクロロフェノール等が挙げられ、ナフ
トール系化合物の具体例としては、例えば１−ナフトー
ル、１−ナフトール−２−スルホン酸、１−ナフトール
−２−カルボン酸等が挙げられ、また、アニリン系化合
物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジエチルアミン、
Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキシエチル）−ｍ−トル
イジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリ
ン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’−サクシニル−エ
チレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げられる。Specific examples of the phenol compound as a developer include, for example, phenol, p-chlorophenol, 2,4-dichlorophenol and the like. Specific examples of the naphthol compound include, for example, 1-naphthol and 1-naphthol. Examples thereof include naphthol-2-sulfonic acid and 1-naphthol-2-carboxylic acid. Specific examples of the aniline-based compound include, for example, N, N-diethylamine,
N-ethyl-N- (β-hydroxyethyl) -m-toluidine, N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAO
S), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-4-fluoroaniline (FDAOS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5 -Dimethoxyaniline (HDAO)
S), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine (TOOS), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N'-succinyl-ethylenediamine (EMSE) and the like Is mentioned.

【００３３】カプラーとデベロパーとの組合せを用いる
場合、カプラーの使用量としては、用いるカプラーの種
類や組み合わせるデベロパーの種類等により異なるため
一概には言えないが、コレステロール測定時の反応液中
の濃度として、通常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mM
の範囲から適宜選択され、カプラーとして４−アミノア
ンチピリンを使用する場合の使用量としては、コレステ
ロール測定時の反応液中の濃度として、通常0.01〜50m
M、好ましくは0.1〜５mMの範囲から適宜選択される。When a combination of a coupler and a developer is used, the amount of the coupler depends on the type of the coupler to be used and the type of the developer to be combined. , Usually 0.01 to 100 mM, preferably 0.1 to 10 mM
The amount used when 4-aminoantipyrine is used as the coupler is usually 0.01 to 50 m as the concentration in the reaction solution when measuring cholesterol.
M, preferably in the range of 0.1 to 5 mM.

【００３４】また、デベロパーの使用量としては、用い
るデベロパーの種類や組み合わせるカプラーの種類等に
より異なるため一概には言えないが、コレステロール測
定時の反応液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好まし
くは0.1〜５mMの範囲から適宜選択される。Further, the amount of the developer used is different depending on the type of the developer used, the type of the coupler to be used, and the like, and cannot be specified unconditionally. However, the concentration in the reaction solution at the time of measuring cholesterol is usually 0.01 to 50 mM, preferably, 50 mM. It is appropriately selected from the range of 0.1 to 5 mM.

【００３５】トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例
としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ
−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタ
ン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジ
スルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が
挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、
例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２
−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチ
ルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエン
スルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブ
ルー誘導体の具体例としては、例えば10−（カルボキシ
メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルア
ミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、10−〔３−（メ
トキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノ
カルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノ
チアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具
体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−
ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，
３’，５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げら
れ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、
例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチ
ルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフ
ェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエ
チルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−
４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール等が挙げられる。これら発色剤の使用
量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲から適
宜選択される。Specific examples of the triphenylmethane leuco dye include, for example, leucomalachite green, bis (p
-Diethylaminophenyl) -2-sulfophenylmethane, bis (p-diethylaminophenyl) -3,4-disulfopropoxyphenylmethane disodium salt and the like. Specific examples of the diphenylamine derivative include
For example, bis [4-di (2-butoxyethyl) amino-2
-Methylphenyl] amine, N, N-bis (4-diethylamino-2-methylphenyl) -N'-p-toluenesulfonylurea and the like, and specific examples of leucomethylene blue derivatives include 10- ( (Carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt, 10- [3- (methoxycarbonylaminomethyl) phenylmethylaminocarbonyl] -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine and the like. Can be Further, specific examples of the benzidine derivative include, for example, benzidine, o-tolidine, o-
Dianisidine, 3,3′-diaminobenzidine, 3,
3 ′, 5,5′-tetraaminobenzidine and the like. Specific examples of the triallylimidazole derivative include:
For example, 2- (4-carboxyphenyl) -3-N-methylcarbamoyl-4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole, 2- (3-methoxy-4-diethylaminophenyl) -3-N-methylcarbamoyl-
4,5-bis (2-methyl-4-diethylaminophenyl) imidazole and the like. The amount of these color formers used is appropriately selected from the concentration ranges usually used in this field.

【００３６】また、本発明のＬＤＬ−コレステロール測
定方法を実施するために用いられる試薬は、１液法用と
して調製されたものでも２液法用として調製されたもの
でも又それ以上に分けたものでも何れにてもよく、特に
限定されない。The reagents used for carrying out the method for measuring LDL-cholesterol of the present invention may be those prepared for the one-pack method, those prepared for the two-pack method, or those further divided. However, it may be any one and is not particularly limited.

【００３７】本発明の方法によりＬＤＬ−コレステロー
ル測定を実施するための試薬中には界面活性剤が含まれ
ていてもよい。このような目的で添加し得る界面活性剤
としては、ＬＤＬ−コレステロールの測定を阻害するよ
うな性質を有さないものであれば、非イオン界面活性
剤、両性界面活性剤、陽イオン界面活性剤、陰イオン界
面活性剤の何れにてもよく、特に限定されないが、例え
ば、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテ
ル，ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル等のポ
リオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、例えばポ
リオキシエチレンセチルエーテル，ポリオキシエチレン
オレイルエーテル，ポリオキシエチレンラウリルエーテ
ル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリエチ
レングリコールモノラウレート等の非イオン性界面活性
剤、例えば、ステアリルベタイン、2-アルキル-N-カル
ボキシメチル-N-ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベ
タイン等の両性界面活性剤、例えば、塩化ステアリルト
リメチルアンモニウム、アルキルベンジルジメチル等の
陽イオン性界面活性剤、例えば、コール酸、デオキシコ
ール酸、ポリオキシエチレンアルキルフェノールエーテ
ル硫酸ナトリウム等の陰イオン性界面活性剤等が好まし
く挙げられる。これら界面活性剤は単独で用いても、あ
るいは数種混合して用いても良い。これら界面活性剤の
使用濃度としては、特に限定されないが、通常、反応液
中の濃度が、０．００１〜１（ｗ／ｖ％）の範囲で使用
される。A surfactant may be contained in the reagent for measuring LDL-cholesterol according to the method of the present invention. Surfactants that can be added for such purposes include nonionic surfactants, amphoteric surfactants, and cationic surfactants as long as they do not have properties that inhibit LDL-cholesterol measurement. And anionic surfactants, and are not particularly limited. Examples thereof include polyoxyethylene alkylphenyl ethers such as polyoxyethylene isooctyl phenyl ether and polyoxyethylene nonyl phenyl ether, for example, polyoxyethylene cetyl ether, Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene oleyl ether and polyoxyethylene lauryl ether, and polyethylene glycol monolaurate, for example, stearyl betaine, 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxy Ethyl imida Amphoteric surfactants such as linium betaine, for example, cationic surfactants such as stearyltrimethylammonium chloride and alkylbenzyldimethyl, for example, anionic surfactants such as cholic acid, deoxycholic acid and sodium polyoxyethylene alkylphenol ether sulfate Surfactants and the like are preferred. These surfactants may be used alone or as a mixture of several types. The use concentration of these surfactants is not particularly limited, but usually the concentration in the reaction solution is in the range of 0.001 to 1 (w / v%).

【００３８】また、本発明のＬＤＬ−コレステロール測
定を実施するための試薬中には、イオン性化合物が含ま
れていても良い。このような目的で添加し得るイオン性
化合物としては、例えばデキストラン硫酸、ヘパリン、
ヘパラン硫酸、リンタングステン酸等のアニオン性化合
物が挙げられ、これらは単独または混合して使用するこ
とができる。更に、これらは、例えばＭｇ²⁺、Ｍｎ²⁺、
Ｃａ²⁺等のカチオン（或いはこれらカチオンを生じさせ
る金属塩）と組み合わせて使用してもよい。これらイオ
ン性化合物の使用濃度としては、特に限定されないが、
通常、反応液中の濃度が、０．０１〜１０（ｗ／ｖ％）
の範囲で使用される。The reagent for measuring LDL-cholesterol of the present invention may contain an ionic compound. Ionic compounds that can be added for such purposes include, for example, dextran sulfate, heparin,
Examples include anionic compounds such as heparan sulfate and phosphotungstic acid, and these can be used alone or in combination. Further, they are, for example, Mg ²⁺ , Mn ²⁺ ,
It may be used in combination with a cation such as Ca ²⁺ (or a metal salt generating these cations). The use concentration of these ionic compounds is not particularly limited,
Usually, the concentration in the reaction solution is 0.01 to 10 (w / v%)
Used in the range.

【００３９】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定を実
施するための試薬中には、ＬＤＬ−以外のリポ蛋白質中
のコレステロールが反応に関与することを防止するため
に、ポリクロナ−ル抗体またはモノクロナ−ル抗体の１
種または複数を共存させてもよい。このような目的で使
用可能な抗体としては、例えば抗アポリポ蛋白質Ａ抗
体、抗αリポ蛋白質抗体等が挙げられる。これら抗体の
使用濃度としては、ＬＤＬ以外のリポ蛋白質中に含まれ
るコレステロールが反応に関与するのを防止し得る濃度
以上であればよく、特に限定されないが、最終の反応液
中の濃度が通常0.001〜10mgAb/ml、好ましくは0.01〜１
mgAb/mlとなるように反応液中に添加される。The reagent for measuring LDL-cholesterol of the present invention contains a polyclonal antibody or a monoclonal antibody in order to prevent cholesterol in lipoproteins other than LDL- from participating in the reaction. Of 1
Species or multiple species may coexist. Antibodies that can be used for such purposes include, for example, anti-apolipoprotein A antibodies, anti-α lipoprotein antibodies, and the like. The concentration of these antibodies used is not particularly limited as long as it can prevent cholesterol contained in lipoproteins other than LDL from participating in the reaction, and is not particularly limited, but the concentration in the final reaction solution is usually 0.001. ~ 10mgAb / ml, preferably 0.01 ~ 1
It is added to the reaction solution so as to become mgAb / ml.

【００４０】本発明のＬＤＬ−コレステロールの測定法
を、２液法により実施する場合には、コレステロールエ
ステラーゼ又はコレステロールオキシダーゼのすくなく
とも一方、好ましくは何れもが糖化合物と結合した修飾
酵素であり、また、被酸化性呈色試薬として用いられる
カプラー及びデベロパー、並びにパーオキシダーゼは、
夫々第１液と第２液の何れかに含まれていればよい。本
発明のＬＤＬ−コレステロールの測定法を２液法により
実施する場合の具体例を示すと、例えば以下の如くにな
る。即ち、例えば血清、 血漿等の生体試料と、例えば
カプラー及び緩衝剤、要すれば金属塩、アニオン性物質
等を含有する第１液とを混合し、２〜４０℃で１〜３０
分間反応させた後に吸光度（ＯＤ1）を測定する。次い
で、該反応液と、例えば修飾コレステロールエステラー
ゼ、修飾コレステロールオキシダーゼ、パーオキシダー
ゼ、デベロパー及び緩衝剤、要すれば界面活性剤を含有
する第２液とを混合し、２〜４０℃で１〜６０分反応さ
せた後に吸光度（ＯＤ2）を測定する。上記のＯＤ2から
ＯＤ1 に由来する値（例えばＯＤ1に補正係数を掛けて
求めた値）を差し引いた吸光度 （ＯＤ3）を求め、得ら
れたＯＤ3を、例えば予め所定濃度のコレステロールを
含有する標準液を用いて上記と同様にして求めた、コレ
ステロール濃度とＯＤ3との関係を示す検量線に当ては
めることにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロール
の値が求められる。When the method for measuring LDL-cholesterol of the present invention is carried out by the two-part method, at least one of cholesterol esterase or cholesterol oxidase, preferably both are modified enzymes bound to a sugar compound, Couplers and developers used as oxidizable color reagents, and peroxidase,
What is necessary is just to be contained in either the 1st liquid or the 2nd liquid, respectively. A specific example in the case where the method for measuring LDL-cholesterol of the present invention is carried out by a two-liquid method is as follows, for example. That is, for example, a biological sample such as serum or plasma is mixed with a first liquid containing, for example, a coupler and a buffer, if necessary, a metal salt, an anionic substance, and the like.
After reacting for 1 minute, the absorbance (OD1) is measured. Next, the reaction solution is mixed with a second solution containing, for example, a modified cholesterol esterase, a modified cholesterol oxidase, a peroxidase, a developer and a buffer, and, if necessary, a surfactant, and is mixed at 2 to 40 ° C. for 1 to 60 minutes. After the reaction, the absorbance (OD2) is measured. Absorbance (OD3) is calculated by subtracting the value derived from OD1 from OD2 (for example, the value obtained by multiplying OD1 by a correction coefficient), and the obtained OD3 is subjected to, for example, a standard solution containing a predetermined concentration of cholesterol in advance. The value of LDL-cholesterol in the biological sample is determined by applying the calibration curve showing the relationship between the cholesterol concentration and OD3 obtained in the same manner as above.

【００４１】また、本発明のＬＤＬ−コレステロールの
測定法は、１液法により実施しても良く、例えば以下の
如く行えばよい。即ち、例えば血清、 血漿等の生体試
料と、例えば修飾コレステロールエステラーゼ、修飾コ
レステロールオキシダーゼ、被酸化性呈色試薬（又はカ
プラー及びデベロパー）、緩衝剤、要すれば金属塩、ア
ニオン性物質、界面活性剤等を含有する試液とを混合
し、２〜４０℃で１〜３０分間反応させた後に吸光度
（ＯＤ1'）を測定する。また、生体試料 の代わりに生
理食塩水等を使用する以外は上記と同じ試薬を用い同様
の操作を行って盲検値（ＯＤBl）を求める。次いで、Ｏ
Ｄ1からＯＤBl差し引いた吸光度（ ＯＤ2'）を求め、こ
れを、例えば予め所定濃度のコレステロールを含有 す
る標準液を用いて上記と同様にして求めた、コレステロ
ール濃度とＯＤ2'との関係を示す検量線に当てはめるこ
とにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値が
求められる。The method for measuring LDL-cholesterol of the present invention may be carried out by a one-liquid method, for example, as follows. That is, for example, a biological sample such as serum or plasma, a modified cholesterol esterase, a modified cholesterol oxidase, an oxidizable color reagent (or a coupler and a developer), a buffer, a metal salt if necessary, an anionic substance, and a surfactant And a reaction solution containing 2 to 40 ° C. for 1 to 30 minutes, and then absorbance (OD1 ′) is measured. In addition, a blind value (ODBl) is obtained by performing the same operation using the same reagent as above except that physiological saline or the like is used instead of the biological sample. Then O
The absorbance (OD2 ') obtained by subtracting ODBl from D1 was determined, and this was used as a calibration curve showing the relationship between the cholesterol concentration and OD2', for example, using a standard solution containing a predetermined concentration of cholesterol. To determine the value of LDL-cholesterol in the biological sample.

【００４２】本発明のＬＤＬ−コレステロール成分測定
用試薬は、例えば血清や血漿等の生体由来試料中のＬＤ
Ｌ−コレステロールを測定するために使用されるもの
で、夫々の構成要件の好ましい態様、具体例については
上に述べた通りである。本発明の特徴は、ＬＤＬ−コレ
ステロールを測定する際に使用するコレステロールエス
テラーゼ又はコレステロールオキシダーゼのうち少なく
とも一方が糖化合物と結合した修飾酵素である点にある
が、このような酵素を使用してＬＤＬ−コレステロー
ル、ＶＬＤＬ−コレステロールおよびＨＤＬ−コレステ
ロールの測定を行うと、ＬＤＬ−コレステロール、ＶＬ
ＤＬ−コレステロール及びＨＤＬ−コレステロールに対
する反応速度に明らかな差が生じ、ＬＤＬ−コレステロ
ールを特異的に分別測定し得るようになったことは全く
以外なことであった。更に、本発明に係わるこれら修飾
酵素は未修飾のものより水溶液中での安定性が向上し、
溶液中での保存安定性に優れていることも判明した。The reagent for measuring LDL-cholesterol component of the present invention can be used for detecting LD in a biological sample such as serum or plasma.
It is used for measuring L-cholesterol, and the preferred embodiments and specific examples of the respective constituent elements are as described above. A feature of the present invention resides in that at least one of cholesterol esterase and cholesterol oxidase used when measuring LDL-cholesterol is a modifying enzyme bound to a sugar compound. When cholesterol, VLDL-cholesterol and HDL-cholesterol are measured, LDL-cholesterol, VL
There was a clear difference between the reaction rates for DL-cholesterol and HDL-cholesterol, which enabled LDL-cholesterol to be specifically fractionated and measured. Furthermore, these modified enzymes according to the present invention have improved stability in aqueous solution as compared with unmodified ones,
It was also found that the storage stability in the solution was excellent.

【００４３】以下に参考例、実施例等を挙げ、本発明を
更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより特に制
ｄｓ限されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Reference Examples and Examples, but the present invention is not particularly limited by these.

【００４４】[0044]

【実施例】以下の参考例、実施例に於いて、酵素の活性
は以下の方法により求めた。 ａ）コレステロールエステラーゼ リノ−ル酸コレステロール：０．４ｍｇ、４−アミノア
ンチピリン：０．６ｍｇ、フェノ−ル：２ｍｇ、ＰＯ
Ｄ：６ｕを含む０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）３
ｍｌを分光光度計のセルに入れ、３７℃で５分間加温す
る。これに酵素溶液１０μl 添加し、反応を開始する。
５００ｎｍでの３〜６分間の吸光度変化(ΔＡ500)を測
定し、式２の計算式によって酵素活性値を求める。 u/ml＝(ΔＡ500 − ΔＡ500 blank)× 1/3 × 1/6.8 × 3.01/0.01 （式２） ｂ）コレステロールオキシダーゼ コレステロール：１１５μｇ、４−アミノアンチピリ
ン：１６０μｇ、フェノ−ル：１．６ｍｇ、トリトンＸ
−１００（ローム アンド ハース社商品名）：８．４
ｍｇ、ＰＯＤ：８．２ｕを含む０．１Ｍりん酸緩衝液
（ｐＨ７．０）３ｍｌを分光光度計のセルに入れ、３７
℃で５分間加温する。これに酵素溶液１０μl 添加し、
反応を開始する。５００ｎｍでの３〜６分間の吸光度変
化(ΔＡ500)を測定し、式３の計算式によって酵素活性
値を求める。 u/ml ＝ ΔＡ500 × 1/3 × 1/6.8 × 3.01/0.01 （式３） ｃ）パ−オキシダーゼ 酵素活性値の測定は、「メソッズ オブ エンザイマテ
ィック アナリシス（第３版、１９８３刊）」のII巻、
２６７頁記載の方法に準じて行った。EXAMPLES In the following Reference Examples and Examples, the activity of the enzyme was determined by the following method. a) Cholesterol esterase Cholesterol linoleate: 0.4 mg, 4-aminoantipyrine: 0.6 mg, phenol: 2 mg, PO
D: 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 6u3
ml into a spectrophotometer cell and warm at 37 ° C. for 5 minutes. To this, 10 μl of the enzyme solution is added to start the reaction.
The change in absorbance (ΔA500) at 500 nm for 3 to 6 minutes is measured, and the enzymatic activity value is determined by the formula of Equation 2. u / ml = (ΔA500−ΔA500 blank) × 1/3 × 1 / 6.8 × 3.01 / 0.01 (Formula 2) b) Cholesterol oxidase Cholesterol: 115 μg, 4-aminoantipyrine: 160 μg, phenol: 1.6 mg, Triton X
-100 (trade name of Rohm and Haas Company): 8.4
3 ml of a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) containing mg, POD: 8.2 u was placed in a cell of a spectrophotometer.
Warm for 5 minutes at ° C. Add 10 μl of enzyme solution to this,
Initiate the reaction. The change in absorbance (ΔA500) at 500 nm for 3 to 6 minutes is measured, and the enzymatic activity value is determined by the equation (3). u / ml = ΔA500 x 1/3 x 1 / 6.8 x 3.01 / 0.01 (Equation 3) c) Peroxidase The enzyme activity is measured by the method II of "Methods of Enzymatic Analysis (3rd edition, 1983)". roll,
Performed according to the method described on page 267.

【００４５】参考例１．デキストラン（分子量：１００
０００）１ｇを１０ｍｌの水に溶解した。この溶液にメ
タ過沃素酸ナトリム１ｇを添加し、室温で１０時間反応
した。これを０．２Ｍ Ｎ、Ｎ−ビス（ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．
５）で透析（１リットル ×３回）して活性化デキストラン
９００ｍｇを得た。得られた活性化デキストラン１０ｍ
ｇを含有する２０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）の溶
液にコレステロールエステラーゼ（Pseudomonas属由
来、天野製薬（株）製）５ｍｇを 加え、２５℃で１日
反応させた。反応終了後、２０ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ
７．０）に対して透析（１リットル ×３回）し、修飾コレ
ステロールエステラーゼを得た。 修飾コレステロールエステラーゼに於けるモル比； デキストラン：コレステロールエステラーゼ＝約１６：
３ 修飾コレステロールエステラーゼに於ける酵素分子と糖
化合物の構成糖単位（グルコース単位）との比率＝約
１：３００Reference Example 1 Dextran (molecular weight: 100
000) was dissolved in 10 ml of water. 1 g of sodium metaperiodate was added to this solution and reacted at room temperature for 10 hours. This was added to a 0.2 M N, N-bis (hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid buffer (pH 7.
Dialysis (1 liter x 3 times) was performed to obtain 900 mg of activated dextran. The obtained activated dextran 10m
5 mg of cholesterol esterase (derived from the genus Pseudomonas, manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to a solution of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing g, and reacted at 25 ° C. for 1 day. After completion of the reaction, a 20 mM phosphate buffer (pH
7.0) was dialyzed (1 liter x 3 times) to obtain a modified cholesterol esterase. Molar ratio in modified cholesterol esterase; dextran: cholesterol esterase = about 16:
3 Ratio of enzyme molecule in modified cholesterol esterase to constituent sugar unit (glucose unit) of sugar compound = about 1: 300

【００４６】参考例２．プルラン（分子量：１０００
０）５００ｍｇを２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液３０ｍｌに
溶解させたものにアセトニトリル１ｍｌに溶解したブロ
ムシアン５００ｍｇを添加し、５分間反応させた。反応
終了後、反応液を０．１Ｍ炭酸水素ナリウム水溶液で透
析（１リットル ×３回）した。得られた活性化プルラン溶
液に５−アミノカプロン酸２ｇを加 えて、４℃で２０
時間反応させた後、これをイオン交換水に対して透析
し、５−アミノカプロン酸修飾プルランを得た。この５
−アミノカプロン酸修飾プルラン５０ｍｇを含む５０ｍ
Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．０）と同緩衝液５ｍｌに溶解
したコレステロールオキシダーゼ（Nocardia属由来、ベ
−リンガ−マンハイム株式会社）５０ｍｇ溶液とを混合
し、さらに水溶性カルボジイミド８５ｍｇを加えて、１
５℃で１８時間反応させた。これを２０ｍＭの燐酸緩衝
液（ｐＨ７．０）に対して透析（１リットル ×３回）して
修飾コレステロールオキシダーゼを得た。 修飾コレステロールオキシダーゼに於けるモル比； デキストラン：コレステロールオキシダーゼ＝約６：１
０ 修飾コレステロールオキシダーゼに於ける酵素分子と糖
化合物の構成糖単位（グルコース単位）との比率＝約
１：３４０Reference Example 2 Pullulan (molecular weight: 1000
0) 500 mg of bromocyanin dissolved in 1 ml of acetonitrile was added to a solution of 500 mg in 30 ml of a 2M aqueous sodium carbonate solution, and reacted for 5 minutes. After completion of the reaction, the reaction solution was dialyzed (1 liter x 3 times) against a 0.1 M aqueous solution of sodium hydrogen carbonate. To the obtained activated pullulan solution was added 2 g of 5-aminocaproic acid, and the mixture was added at 4 ° C for 20 minutes.
After reacting for an hour, this was dialyzed against ion-exchanged water to obtain 5-aminocaproic acid-modified pullulan. This 5
-50 m containing 50 mg of aminocaproic acid-modified pullulan
M phosphate buffer (pH 7.0) and a 50 mg solution of cholesterol oxidase (derived from Nocardia, Boehringer-Mannheim) dissolved in 5 ml of the same buffer, and 85 mg of water-soluble carbodiimide was added thereto.
The reaction was performed at 5 ° C. for 18 hours. This was dialyzed (1 liter x 3 times) against a 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) to obtain a modified cholesterol oxidase. Molar ratio of modified cholesterol oxidase; dextran: cholesterol oxidase = about 6: 1
0 Ratio of the enzyme molecule in the modified cholesterol oxidase to the constituent sugar unit (glucose unit) of the sugar compound = about 1: 340

【００４７】実施例１． （試薬液）参考例１で得られた修飾コレステロールエス
テラーゼ：２ｕ／ｍｌ、参考例２で得られた修飾コレス
テロールオキシダーゼ：２ｕ／ｍｌ、４−アミノアンチ
ピリン ３ｍＭ、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−
３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン・
ナトリウム塩（ＤＡＯＳ）：０．６ｍＭ、パ−オキシダ
ーゼ：５ｕ／ｍｌを含有する５０ｍＭ ２−モルフォリ
ノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）を
調製し、試薬液とした。尚、対照として、修飾酵素の代
わりに未修飾酵素を用いた以外は、上記と同じ試薬を用
い、同様の方法により、未修飾酵素を用いた試薬液を調
製した。 （試料）人血清から超遠心法（F.J.Hatch,R.S.Lees,Ad
v.Lipid Res.,6,1(1968))によって分画して得たＨＤ
Ｌ、ＬＤＬ又はＶＬＤＬを所定濃度含有する０．１５Ｍ
ＮａＣｌ溶液（１Ｍ ＥＤＴＡ含有）を試料とした。 （コレステロールの測定）予め３７℃で５分間予備加温
した試薬液３ｍｌと試料１０μl とを混合し、混合液の
６００ｎｍに於ける吸光度変化を分光光度計を用いて測
定した。 （結果）結果を第１図に示す。尚、図１において、−◆
−はＬＤＬを含む試料１（ＬＤＬ−濃度：10μg/ml）に
ついての結果を、−☆−はＬＤＬを含む試料２（ＬＤＬ
−濃度：20μg/ml）についての結果を、−●−はＬＤＬ
を含む試料３（ＬＤＬ−濃度：30μg/ml）についての結
果を、−◇−はＨＤＬを含む試料４（ＨＤＬ濃度：５μ
g/ml）についての結果を、−△−はＨＤＬを含む試料５
（ＨＤＬ濃度：10μg/ml）についての結果を、−○−は
ＨＤＬを含む試料６（ＨＤＬ濃度：15μg/ml）について
の結果を、夫々示す。尚、対照として、未修飾酵素を含
有する試薬液と、ＨＤＬを含む試料６と用いて同様の測
定を行った。結果を図１に併せて示す（−×−）。図１
の結果から、ＬＤＬを含む試料の場合、反応開始時間の
経過と共に吸光度が上昇し、試料中のＬＤＬの濃度に応
じた呈色が生じることが判る。一方、ＨＤＬを含む試料
の場合、反応開始後も吸光度の上昇は殆どみられないこ
とが判る。また、対照として未修飾酵素を使用した試薬
液で測定した場合には、反応開始後時間の経過と共に吸
光度が上昇していき、試料中のＨＤＬ濃度に応じた呈色
が生じることが判る（図１中の−×−）。また、図２に
ＶＬＤＬについて未修飾酵素を使用した場合と、参考例
１及び２で得られた修飾酵素を使用した場合の測定結果
を示す。図中、−●−はＶＬＤＬを含む試料７（ＶＬＤ
Ｌ濃度：１０μｇ／ｍｌ）について未修飾酵素を含有す
る試薬液を使用して測定した結果を、−◆−はＶＬＤＬ
を含む試料７（ＶＬＤＬ濃度：１０μｇ／ｍｌ）につい
て修飾酵素を含有する試薬液を使用して測定した結果を
夫々示す。図１及び２の結果から、本発明の方法によ
り、ＬＤＬ中のコレステロールを特異的に測定し得るこ
とが判る。また、上記の試薬液を用い同様の操作法によ
って、ＬＤＬの検量線を作成した結果を図３に、また、
ＨＤＬの検量線を作成した結果を図４に夫々示す。図３
及び４の結果から、本発明の方法により、ＬＤＬ中のコ
レステロールを特異的に且つ定量性良く測定し得ること
が判る。Embodiment 1 (Reagent solution) Modified cholesterol esterase obtained in Reference Example 1: 2 u / ml, Modified cholesterol oxidase obtained in Reference Example 2: 2 u / ml, 4-aminoantipyrine 3 mM, N-ethyl-N- (2-hydroxy −
3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline.
A 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) buffer (pH 7.0) containing sodium salt (DAOS): 0.6 mM and peroxidase: 5 u / ml was prepared and used as a reagent solution. As a control, a reagent solution using an unmodified enzyme was prepared in the same manner as described above, except that an unmodified enzyme was used instead of the modified enzyme. (Sample) Ultracentrifugation (FJHatch, RSLees, Ad
v. Lipid Res., 6, 1 (1968))
0.15M containing predetermined concentration of L, LDL or VLDL
A sample was a NaCl solution (containing 1 M EDTA). (Measurement of Cholesterol) 3 ml of the reagent solution preliminarily heated at 37 ° C. for 5 minutes was mixed with 10 μl of the sample, and the change in absorbance of the mixture at 600 nm was measured using a spectrophotometer. (Results) The results are shown in FIG. In FIG. 1, −１
-Indicates the results for sample 1 containing LDL (LDL-concentration: 10 μg / ml), and-☆-indicates the results for sample 2 containing LDL (LDL
-Concentration: 20 μg / ml),-●-indicates LDL
The results for sample 3 containing LDL (LDL-concentration: 30 μg / ml),-、-for sample 4 containing HDL (HDL concentration: 5 μg / ml)
g / ml),-△-indicates sample 5 containing HDL.
(HDL concentration: 10 μg / ml), and-○-show the result for HDL-containing sample 6 (HDL concentration: 15 μg / ml). As a control, the same measurement was performed using a reagent solution containing an unmodified enzyme and Sample 6 containing HDL. The results are also shown in FIG. 1 (− × −). FIG.
From the results, it can be seen that, in the case of the sample containing LDL, the absorbance increases with the elapse of the reaction start time, and coloration occurs according to the concentration of LDL in the sample. On the other hand, in the case of the sample containing HDL, it is found that the absorbance hardly increases even after the start of the reaction. In addition, when the measurement was performed using a reagent solution using an unmodified enzyme as a control, the absorbance increased with the passage of time after the start of the reaction, and it was found that coloration occurred according to the HDL concentration in the sample (FIG. -X- in 1). FIG. 2 shows the measurement results when the unmodified enzyme is used for VLDL and when the modified enzymes obtained in Reference Examples 1 and 2 are used. In the figure,-●-indicates Sample 7 containing VLDL (VL
L concentration: 10 μg / ml), using a reagent solution containing an unmodified enzyme,-◆-indicates VLDL
The results of measurements on Sample 7 (VLDL concentration: 10 μg / ml) containing the same using a reagent solution containing a modifying enzyme are shown. From the results of FIGS. 1 and 2, it is found that cholesterol in LDL can be specifically measured by the method of the present invention. FIG. 3 shows the result of preparing a calibration curve of LDL by the same operation method using the above reagent solution.
The results of preparing the HDL calibration curve are shown in FIG. FIG.
From the results of and 4, it can be seen that the method of the present invention can specifically and quantitatively measure cholesterol in LDL.

【００４８】実施例２．実施例１で調製した修飾酵素を
含む試薬液と、未修飾酵素を含む試薬液とを、３７℃の
インキュベーターで１ヶ月保存した後に、各酵素の残存
活性率（調製直後の酵素活性を夫々１００％とした時の
相対活性率）を調べた。結果を表１に示す。Embodiment 2 FIG. After the reagent solution containing the modified enzyme prepared in Example 1 and the reagent solution containing the unmodified enzyme were stored in an incubator at 37 ° C. for one month, the residual activity ratio of each enzyme (the enzyme activity immediately after preparation was 100%, respectively). % Relative activity). Table 1 shows the results.

【００４９】[0049]

【表１】 [Table 1]

【００５０】表１の結果から、本発明に係わる修飾酵素
は未修飾酵素に比べて溶液中での安定性が著しく向上し
ていること、言い換えれば、本発明の試薬は、溶液状態
で良好な保存安定性を有していることが判る。From the results shown in Table 1, the stability of the modified enzyme according to the present invention in the solution is remarkably improved as compared with the unmodified enzyme. In other words, the reagent of the present invention shows good stability in solution. It turns out that it has storage stability.

【００５１】[0051]

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は試料中のＬＤ
Ｌ−コレステロールを選択的に且つ精度良く測定し得る
方法並びにそれに用いられる試薬を提供するものであ
り、本発明を利用することにより、従来の方法では不可
能であった、ＬＤＬ−コレステロールを直接、しかも汎
用の自動分析装置を用いて測定し得るという効果を奏す
るものであるので、斯業に貢献するところ大なる発明で
ある。As described above, according to the present invention, LD in a sample is
It is intended to provide a method capable of selectively and accurately measuring L-cholesterol and a reagent used therefor. By utilizing the present invention, LDL-cholesterol, which was impossible with the conventional method, can be directly obtained. In addition, the present invention has an effect that measurement can be performed using a general-purpose automatic analyzer, and is a great invention that contributes to the industry.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１で得られた、低比重リポ蛋白（ＬＤ
Ｌ）又は高比重リポ蛋白（ＨＤＬ）を所定濃度含む各種
試料と本発明の試薬とを反応させた場合の反応曲線を示
す。FIG. 1 shows a low-density lipoprotein (LD) obtained in Example 1.
3 shows a reaction curve when various samples containing L) or high-density lipoprotein (HDL) at a predetermined concentration were reacted with the reagent of the present invention.

【図２】実施例１で得られた、超低比重リポ蛋白（ＶＬ
ＤＬ）を所定濃度含む各種試料と本発明の試薬とを反応
させた場合の反応曲線を示す。FIG. 2 shows a very low density lipoprotein (VL) obtained in Example 1.
4 shows reaction curves when various samples containing DL) at a predetermined concentration were reacted with the reagent of the present invention.

【図３】実施例１で得られた、本発明の方法によるＬＤ
Ｌ−コレステロールの検量線を示す。FIG. 3 shows an LD obtained by the method of the present invention obtained in Example 1.
3 shows a calibration curve of L-cholesterol.

【図４】実施例１で得られた、本発明の方法によるＨＤ
Ｌ−コレステロールの検量線を示す。FIG. 4 shows the HD obtained by the method of the present invention obtained in Example 1.
3 shows a calibration curve of L-cholesterol.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

図１において、−◆−はＬＤＬを含む試料１（ＬＤＬ濃
度：１０μｇ／ｍｌ）についての結果を、−☆−はＬＤ
Ｌを含む試料２（ＬＤＬ濃度：２０μｇ／ｍｌ）につい
ての結果を、−●−はＬＤＬを含む試料３（ＬＤＬ濃
度：３０μｇ／ｍｌ）についての結果を、−◇−はＨＤ
Ｌを含む試料４（ＨＤＬ濃度： ５μｇ／ｍｌ）につい
ての結果を、−△−はＨＤＬを含む試料５（ＨＤＬ濃
度：１０μｇ／ｍｌ）についての結果を、−○−はＨＤ
Ｌを含む試料６（ＨＤＬ濃度：１５μｇ／ｍｌ）につい
ての結果を夫々示す。また、−×−は、未修飾のコレス
テロールエステラーゼ及びコレステロールオキテダ−ゼ
を用いて調製した試薬液を使用して得られた、ＨＤＬを
含む試料６についての結果を示す。図２において、−●
−はＶＬＤＬを含む試料７（ＶＬＤＬ濃度：１０μｇ／
ｍｌ）と未修飾酵素を使用した試薬液とを反応させた場
合の測定結果を、−◆−は試料７と修飾酵素を使用した
試薬液とを反応させた場合の測定結果を夫々示す。In FIG. 1,-◆-indicates the results for LDL-containing sample 1 (LDL concentration: 10 μg / ml), and-☆-indicates the results for LD.
L, the results for sample 2 containing LDL (LDL concentration: 20 μg / ml);-●-, the results for sample 3 containing LDL (LDL concentration: 30 μg / ml);-◇-, HD
The results for sample 4 containing L (HDL concentration: 5 μg / ml),-△-for the results of sample 5 containing HDL (HDL concentration: 10 μg / ml), and-○-for HD
The results for Sample 6 containing L (HDL concentration: 15 μg / ml) are shown. In addition, -x- shows the result of the sample 6 containing HDL, obtained using the reagent solution prepared using unmodified cholesterol esterase and cholesterol oxidase. In FIG. 2, − ●
− Indicates sample 7 containing VLDL (VLDL concentration: 10 μg /
ml) and the reagent solution using the unmodified enzyme, and-◆-shows the measurement result when the sample 7 was reacted with the reagent solution using the modified enzyme.

Claims (13)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】コレステロールエステラーゼとコレステロ
ールオキシダーゼとを含有し、これらの酵素のうち少な
くとも一方が糖化合物と結合した修飾酵素である、低比
重リポ蛋白質中のコレステロール測定用試薬。1. A reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, which comprises a cholesterol esterase and a cholesterol oxidase, wherein at least one of these enzymes is a modified enzyme bound to a sugar compound. 【請求項２】コレステロールエステラーゼとコレステロ
ールオキシダーゼが、何れも糖化合物と結合した修飾酵
素である、請求項１に記載の測定用試薬。2. The measuring reagent according to claim 1, wherein both cholesterol esterase and cholesterol oxidase are modified enzymes bound to a sugar compound. 【請求項３】修飾コレステロールエステラーゼが、コレ
ステロールエステラーゼのアミノ基と、糖化合物のアミ
ノ基、イミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基又は
２，３−エポキシプロピル基とを共有結合させることに
より得られたものである、請求項１又は２に記載の測定
用試薬。3. A modified cholesterol esterase obtained by covalently bonding an amino group of cholesterol esterase to an amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde group or 2,3-epoxypropyl group of a sugar compound. The reagent for measurement according to claim 1 or 2, wherein 【請求項４】修飾コレステロールオキシダーゼが、コレ
ステロールオキシダーゼのアミノ基と、糖化合物のアミ
ノ基、イミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基又は
２，３−エポキシプロピル基とを共有結合させることに
より得られたものである、請求項１〜３の何れかに記載
の測定用試薬。4. A modified cholesterol oxidase obtained by covalently linking an amino group of cholesterol oxidase to an amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde group or 2,3-epoxypropyl group of a sugar compound. The measuring reagent according to any one of claims 1 to 3, wherein 【請求項５】更にパーオキシダーゼと被酸化性呈色試薬
とを含有する、請求項１〜４の何れかに記載の測定用試
薬。5. The measuring reagent according to claim 1, further comprising a peroxidase and an oxidizable color reagent. 【請求項６】被酸化性呈色試薬がカプラーとデベロパー
とからなる、請求項５に記載の測定用試薬。6. The measuring reagent according to claim 5, wherein the oxidizable color reagent comprises a coupler and a developer. 【請求項７】更に緩衝剤と界面活性剤とを含有する、請
求項５又は６に記載の測定用試薬。7. The measuring reagent according to claim 5, further comprising a buffer and a surfactant. 【請求項８】コレステロールエステラーゼとコレステロ
ールオキシダーゼとを使用する低比重リポ蛋白質中のコ
レステロールの測定方法であって、これら酵素のうち少
なくとも一方が糖化合物と結合した修飾酵素である、該
測定方法。8. A method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein using cholesterol esterase and cholesterol oxidase, wherein at least one of these enzymes is a modified enzyme bound to a sugar compound. 【請求項９】生体試料と、緩衝剤を含有する第１液とを
混合して、得られた反応液の吸光度（ＯＤ1）を測定
し、次いで、該反応液と、コレステロールエステラ−
ゼ、コレステロールオキシダ−ゼを含有する第２液とを
混合した後、吸光度（ＯＤ2）を測定し、得られたＯＤ2
からＯＤ1に補正係数を掛けて求めた値を差し引いた吸
光度 （ＯＤ3）を求め、得られたＯＤ3を、予め所定濃
度のコレステロールを含有する標準液を用いて上記と同
様にして求めた、コレステロール濃度とＯＤ3との関係
を示す検量線に当てはめて、該生体試料中の低比重リポ
蛋白中のコレステロール量を求めることを特徴とする、
生体試料中の低比重リポ蛋白中のコレステロールの測定
方法であって、コレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼの少なくとも一方は糖化合物と結合
した修飾酵素であり、カプラー、デベロパー及びパーオ
キシダーゼは夫々第１液と第２液の何れかに含有されて
いる該測定法。9. A mixture of a biological sample and a first solution containing a buffer, the absorbance (OD1) of the obtained reaction solution is measured, and then the reaction solution is mixed with cholesterol esterase.
And a second liquid containing cholesterol oxidase, and then absorbance (OD2) was measured.
(OD3) was calculated by subtracting the value obtained by multiplying OD1 by a correction coefficient from OD1, and the obtained OD3 was determined in advance in the same manner as described above using a standard solution containing a predetermined concentration of cholesterol. And OD3 is applied to a calibration curve showing the relationship between the cholesterol in the low-density lipoprotein in the biological sample to determine the amount of cholesterol,
A method for measuring cholesterol in a low-density lipoprotein in a biological sample, wherein at least one of cholesterol esterase and cholesterol oxidase is a modifying enzyme bound to a sugar compound, and the coupler, developer and peroxidase are the first and second liquids, respectively. The measurement method contained in any one of the two liquids. 【請求項１０】カプラーとデベロパーの一方が第１液に
含有されており、他方が第２液に含有されている、請求
項９に記載の測定方法。10. The method according to claim 9, wherein one of the coupler and the developer is contained in the first liquid, and the other is contained in the second liquid. 【請求項１１】コレステロールエステラーゼとコレステ
ロールオキシダーゼが、何れも糖化合物と結合した修飾
酵素である、請求項９又は１０に記載の測定方法。11. The method according to claim 9, wherein the cholesterol esterase and the cholesterol oxidase are both modified enzymes bound to a sugar compound. 【請求項１２】修飾コレステロールエステラーゼが、コ
レステロールエステラーゼのアミノ基と、糖化合物のア
ミノ基、イミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基又は
２，３−エポキシプロピル基とを共有結合させることに
より得られたものである、請求項９〜１１の何れかに記
載の測定方法。12. A modified cholesterol esterase obtained by covalently bonding an amino group of cholesterol esterase to an amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde group or 2,3-epoxypropyl group of a sugar compound. The measurement method according to any one of claims 9 to 11, wherein 【請求項１３】修飾コレステロールオキシダーゼが、コ
レステロールオキシダーゼのアミノ基と、糖化合物のア
ミノ基、イミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基又は
２，３−エポキシプロピル基とを共有結合させることに
より得られたものである、請求項９〜１２の何れかに記
載の測定方法。13. A modified cholesterol oxidase obtained by covalently bonding an amino group of cholesterol oxidase to an amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde group or 2,3-epoxypropyl group of a sugar compound. The measurement method according to any one of claims 9 to 12, wherein