JP2000060600A - Determination of ldl-cholesterol - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a process for the determination of cholesterol in low- density lipoprotein(LDL) directly with an autoanalyzer, etc., without using a complicate pretreatment necessary in conventional process to separate the LDL from unnecessary proteins other than LDL. SOLUTION: Cholesterol in a specimen originated from living body is determined by reacting the specimen with (1) cholesterol esterase and cholesterol oxidase or (2) cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and NAD(P) and determining the cholesterol content based on the produced hydrogen peroxide or NAD(P)H. In the above process, the reaction system is incorporated with a polyanion and an ampholytic surfactant.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、血清、血漿などの生体
試料中に存在する低比重リポタンパク（以下、ＬＤＬと
略記する。）中のコレステロールの測定法及びそのため
の試薬並びにキットに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein (hereinafter abbreviated as LDL) present in biological samples such as serum and plasma, and a reagent and a kit therefor.

【０００２】[0002]

【発明の背景】血清中の脂質の主な成分はコレステロー
ル、トリグリセライド、リン脂質等であり、これら血清
脂質はアポタンパクと結合してリポタンパクを形成し血
中を循環する。該リポタンパクは比重の差により高比重
リポタンパク（ＨＤＬ）、ＬＤＬ、超低比重リポタンパ
ク(ＶＬＤＬ）、カイロミクロン（ＣＭ）等に分類され
る。これらリポタンパクのうち、ＨＤＬは組織に沈着し
た過剰なコレステロールを肝臓へ運搬する作用があり、
抗動脈硬化作用を有し、一方、ＬＤＬは肝臓から各組織
へのコレステロールの主たる運搬体であり、ＬＤＬの増
加は動脈硬化発生と密接な関係があると考えられる。従
って、ＬＤＬ中のコレステロール（以下、ＬＤＬ−コレ
ステロールと略記する。）は、動脈硬化症、虚血性心疾
患（冠動脈疾患）の危険因子と考えられ、ＬＤＬ−コレ
ステロール量は、これら疾患の診断・治療及び予防の重
要な指標となる。BACKGROUND OF THE INVENTION The main components of lipids in serum are cholesterol, triglycerides, phospholipids, etc. These serum lipids combine with apoproteins to form lipoproteins and circulate in blood. The lipoprotein is classified into high-density lipoprotein (HDL), LDL, ultra-low-density lipoprotein (VLDL), chylomicron (CM), etc. according to the difference in specific gravity. Of these lipoproteins, HDL has the effect of transporting excess cholesterol deposited in tissues to the liver,
It has an anti-atherosclerotic effect, while LDL is the main carrier of cholesterol from the liver to each tissue, and an increase in LDL is considered to be closely related to the development of arteriosclerosis. Therefore, cholesterol in LDL (hereinafter abbreviated as LDL-cholesterol) is considered to be a risk factor for arteriosclerosis and ischemic heart disease (coronary artery disease), and the amount of LDL-cholesterol is used for diagnosis and treatment of these diseases. And become an important indicator of prevention.

【０００３】従来、ＬＤＬ−コレステロールの測定法と
しては、沈殿法、超遠心法、電気泳動法、算出式による
算出法等が知られている。これら従来法のうち、沈殿
法、超遠心法及び電気泳動法は、沈殿・遠心分離処理、
超遠心分離処理或いは電気泳動処理により、ＬＤＬとＬ
ＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離する前処理工程
が必要であるため、操作が煩雑であり、現在、臨床検査
の分野で広く普及している自動分析装置だけで直接測定
を実施することができないという問題点を有している。
また、フリーデワルド（Friedewald）の式で知られてい
る総コレステロール値、ＨＤＬ−コレステロール値及び
トリグリセライド値から算出する算出法も、トリグリセ
ライドを400mg／dl以上含有する試料を用いた場合に
は、正確なＬＤＬ−コレステロール量を測定することが
できないという問題を有している。Conventionally, as a method for measuring LDL-cholesterol, a precipitation method, an ultracentrifugation method, an electrophoresis method, a calculation method using a calculation formula and the like are known. Among these conventional methods, the precipitation method, ultracentrifugation method and electrophoresis method are precipitation / centrifugation treatment,
LDL and L by ultracentrifugation or electrophoresis
Since a pretreatment step for separating unnecessary lipoproteins other than DL is required, the operation is complicated, and direct measurement can be performed only with an automatic analyzer that is currently widely used in the field of clinical examination. It has a problem that it cannot be done.
Moreover, the calculation method for calculating from total cholesterol value, HDL-cholesterol value and triglyceride value known by the Friedewald equation is also accurate when a sample containing 400 mg / dl or more of triglyceride is used. There is a problem that the amount of LDL-cholesterol cannot be measured.

【０００４】近年、従来法に於ける上記の如き問題点を
解消するために、種々の方法が開発されており、例えば
特開平７−２８０８１２号公報に開示された方法もその
一つである。即ち、ＬＤＬを凝集剤又は／及び抗体を使
用して凝集させた後に、ＬＤＬ以外のリポタンパクに含
まれるコレステロールを定量反応に関与しない別の反応
系に導いて消去（消費）させた後、界面活性剤又は／及
び無機塩類を使用して、凝集させたＬＤＬを定量反応が
できる程度に溶解させ、ＬＤＬ−コレステロールを定量
反応に付し該溶液の吸光度を測定するという方法がそれ
である。In recent years, various methods have been developed in order to solve the above-mentioned problems in the conventional method, and for example, the method disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 7-280812 is one of them. That is, after aggregating LDL with an aggregating agent and / or an antibody, cholesterol contained in lipoproteins other than LDL is introduced into another reaction system not involved in the quantitative reaction to be erased (consumed), The method is to dissolve the agglomerated LDL to an extent that a quantitative reaction can be performed using an activator and / or an inorganic salt, subject LDL-cholesterol to a quantitative reaction, and measure the absorbance of the solution.

【０００５】しかしながら、この方法は、測定に３又は
４種の試液が必要であるため、３又は４種の試液を用い
て測定が可能なごく一部の自動分析装置にしか適用でき
ず、通常の臨床検査に於いて用いられている２種の試液
までしか使用できない自動分析装置を用いては測定を実
施することができないという問題点がある。また、この
方法には、３又は４種の試液を用いて測定を行うため、
測定値の再現性が低下するという問題点もあった。However, since this method requires 3 or 4 kinds of reagent solutions for measurement, it can be applied only to a small part of automatic analyzers that can measure using 3 or 4 kinds of reagent solutions. However, there is a problem that the measurement cannot be carried out by using an automatic analyzer which can be used only up to two kinds of test solutions used in the clinical test. In addition, in this method, since measurement is performed using 3 or 4 types of reagent solutions,
There is also a problem that the reproducibility of measured values is reduced.

【０００６】更に、煩雑な前処理操作なしでＬＤＬ−コ
レステロールを測定する方法として特開昭５８−１６５
８００号公報に開示されている方法がある。しかしなが
ら、この方法は、試薬中の例えば界面活性剤やコレステ
ロールエステラーゼ（以下、ＣＨＥと略記する。）の使
用濃度が限定されるため試薬の調製が煩雑であり、更に
測定時のｐＨや、測定時間間隔等測定条件を厳密に設定
しなくてはならず、しかもＨＤＬ中のコレステロールも
ある程度反応することから、動力学的測定、すなわち、
レイト・アッセイでしかＬＤＬ−コレステロールの測定
を行うことができないため、実用的な測定方法とは言い
難い方法であった。Further, as a method for measuring LDL-cholesterol without a complicated pretreatment operation, JP-A-58-165 is known.
There is a method disclosed in Japanese Patent Publication No. 800. However, in this method, the concentration of the surfactant or cholesterol esterase (hereinafter abbreviated as CHE) used in the reagent is limited, so that the preparation of the reagent is complicated, and the pH at the time of measurement and the measurement time are further reduced. Since the measurement conditions such as the interval must be set strictly, and cholesterol in HDL also reacts to some extent, kinetic measurement, that is,
Since the LDL-cholesterol can be measured only by the late assay, it was difficult to say a practical measuring method.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】上記した如き状況に鑑
み、本発明が解決しようとする課題は、生体試料中のＬ
ＤＬ−コレステロールを、従来法に於いて必要であっ
た、ＬＤＬとＬＤＬ以外の不要のリポタンパクとを分離
するための煩雑な前処理操作なしに直接自動分析装置等
を用いて測定することを可能とする方法及びそれに用い
られる試薬の提供にある。In view of the above situation, the problem to be solved by the present invention is to solve the problem of L in a biological sample.
It is possible to directly measure DL-cholesterol using an automatic analyzer etc. without the complicated pretreatment operation for separating LDL and unnecessary lipoproteins other than LDL, which was required in the conventional method. And a reagent used therefor.

【０００８】[0008]

【発明を解決するための手段】本発明は、生体由来試料
をＣＨＥ及びコレステロールオキシダーゼ（以下、Ｃ
Ｏと略記する。）、又はＣＨＥ、コレステロールデヒ
ドロゲナーゼ（以下、ＣＨＤと略記する。）及びＮＡＤ
（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ
（Ｐ）Ｈに基づいて生体由来試料中のコレステロールを
測定する方法に於いて、反応系にポリアニオン及び両性
界面活性剤を存在させることを特徴とする、低比重リポ
タンパク中のコレステロールの測定法の発明である。In the present invention, a biological sample is treated with CHE and cholesterol oxidase (hereinafter referred to as C
Abbreviated as O. ), Or CHE, cholesterol dehydrogenase (hereinafter abbreviated as CHD) and NAD.
Hydrogen peroxide or NAD produced by reacting with (P)
A method for measuring cholesterol in a biological sample based on (P) H, characterized in that a polyanion and an amphoteric surfactant are present in a reaction system, the method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein It is an invention.

【０００９】また、本発明は、生体由来試料をＣＨＥ
及びＣＯ、又はＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）と反
応させ、生成する過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づ
いて生体由来試料中のコレステロールを測定するための
試薬に、ポリアニオン及び両性界面活性剤を含有させて
なることを特徴とする、低比重リポタンパク中のコレス
テロール測定用試薬の発明である。Further, the present invention uses a CHE for a biological sample.
And CO, or CHE, CHD, and NAD (P), and a reagent for measuring cholesterol in a biological sample based on hydrogen peroxide or NAD (P) H produced and polyanion and amphoteric surfactant It is an invention of a reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, characterized by comprising:

【００１０】更に、本発明は、ポリアニオン及び両性
界面活性剤、ＣＨＥ、ＣＯ、ペルオキシダーゼ（以
下、ＰＯＤと略記する。）、及びカップラー又は／及び
デベロッパー、及び水性媒体を含んでなる第一試液
と、水性媒体及び要すればデベロッパー又はカップラー
を含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク
中のコレステロール測定用キットの発明である。The present invention further includes a first reagent solution containing a polyanion and an amphoteric surfactant, CHE, CO, peroxidase (hereinafter abbreviated as POD), a coupler or / and a developer, and an aqueous medium, It is an invention of a kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, which comprises an aqueous medium and, if necessary, a second reagent solution containing a developer or a coupler.

【００１１】また、本発明は、ポリアニオン及び両性
界面活性剤、ＣＨＥ、ＣＯ、カタラーゼ（以下、
ＣＡＴと略記する。）、及び水性媒体を含んでなる第
一試液と、ＣＡＴ阻害剤と水性媒体とを含んでなる第二
試液とからなるものであって、ＰＯＤ、カップラー、デ
ベロッパーが夫々第一試液と第二試液の少なくとも一方
に含まれている、低比重リポタンパク中のコレステロー
ル測定用キットの発明である。The present invention also provides polyanion and amphoteric surfactants, CHE, CO, catalase (hereinafter
Abbreviated as CAT. ), And a second reagent containing a CAT inhibitor and an aqueous medium, wherein the POD, the coupler and the developer are respectively the first reagent and the second reagent. Is an invention of a kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein contained in at least one of the above.

【００１２】更にまた、本発明は、ポリアニオン、
両性界面活性剤、ＣＨＥ、ＣＨＤ、ＮＡＤ
（Ｐ）、及び水性媒体を含んでなる第一試液と、水
性媒体を含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタ
ンパク中のコレステロール測定用キットの発明である。Furthermore, the present invention provides a polyanion,
Amphoteric surfactant, CHE, CHD, NAD
It is an invention of a kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, which comprises (P) and a first reagent solution containing an aqueous medium and a second reagent solution containing an aqueous medium.

【００１３】即ち、本発明者らは、ＬＤＬ−コレステロ
ールを、ＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別す
るための前処理操作なしに直接自動分析装置で測定し得
る方法を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、生体試料中
のコレステロールの測定を、ポリアニオン及び両性界面
活性剤の存在下で行えば、ＬＤＬ−コレステロールの反
応のみを阻害、言い換えれば、遅延ないしは一時的に停
止させて、ＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロー
ルの反応を先行させて、これを消去することができ、か
くしてＬＤＬ以外の不要なリポタンパクを分離分別する
ことなくＬＤＬ中のコレステロールを特異的に測定する
ことが可能となることを見出し、本発明を完成するに至
った。That is, the inventors of the present invention have conducted earnest studies to find a method capable of directly measuring LDL-cholesterol by an automatic analyzer without a pretreatment operation for separating and fractionating unnecessary lipoproteins other than LDL. As a result, if the cholesterol in the biological sample is measured in the presence of the polyanion and the amphoteric surfactant, only the reaction of LDL-cholesterol is inhibited, in other words, delayed or temporarily stopped, and the lipoprotein other than LDL is inhibited. It is possible to precede the reaction of cholesterol in protein and eliminate it, thus making it possible to specifically measure cholesterol in LDL without separating and fractionating unnecessary lipoproteins other than LDL. Heading out, the present invention has been completed.

【００１４】生体由来試料中のコレステロールを測定す
る方法としては、原理的には、生体由来試料中のコレス
テロールをＣＨＥと反応させて遊離コレステロールと脂
肪酸に分解し、次いでＣＯを反応させて生成する過酸
化水素を測定するか、或いはＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）
を反応させて生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを測定する方法が
挙げられ、より具体的には、酵素反応を利用する、
（１）例えば生体由来試料中のコレステロールエステル
をＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分解
し、初めから存在する遊離コレステロールと共に、ＣＯ
によって酸化して、コレステ−４−エン−３−オンと過
酸化水素とにし、ＰＯＤの存在下、生成した過酸化水素
で被酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパー
との組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤
等）を酸化発色させて、生じた酸化色素を比色定量する
酸化呈色法、（２）例えば生体由来試料中のコレステロ
ールをＣＨＥによって遊離コレステロールと脂肪酸に分
解し、初めから存在する遊離コレステロールと共にＣＨ
Ｄの存在下、ＮＡＤ（Ｐ）と反応させて、生成するＮＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈを340nmで測定する紫外部測定法等が挙げら
れる。As a method for measuring cholesterol in a biological sample, in principle, the cholesterol in the biological sample is reacted with CHE to decompose it into free cholesterol and fatty acid, and then CO is reacted to generate the excess cholesterol. Measure hydrogen oxide, or CHD and NAD (P)
A method for measuring NAD (P) H produced by reacting
(1) For example, cholesterol ester in a biological sample is decomposed into free cholesterol and fatty acid by CHE, and free cholesterol existing from the beginning and CO
Oxidation to cholest-4-en-3-one and hydrogen peroxide, and in the presence of POD the oxidizable color reagent (eg coupler / developer combination, oxidizable by the generated hydrogen peroxide). An oxidative coloring method for colorimetrically quantifying the resulting oxidative dye, by (2) oxidatively coloring a coloring agent that itself develops color, and (2) decomposing cholesterol in a biological sample into free cholesterol and fatty acid by CHE, CH with free cholesterol present from
NA produced by reacting with NAD (P) in the presence of D
The ultraviolet measuring method etc. which measure D (P) H at 340 nm are mentioned.

【００１５】本発明は、これらの方法の何れにも適用す
ることができる。即ち、本発明は、これらの方法を行う
に際して、反応系に、ポリアニオン及び両性界面活性剤
を存在させればよい。より具体的には、先ず、生体由来
試料とポリアニオン及び両性界面活性剤とを接触させ
て、該試料中のＬＤＬ−コレステロールの反応を阻害、
言い換えれば、遅延ないしは一時的に停止させ、その結
果としてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロール
の反応を先行させてこれらを消去（消費）し、しかる
後、ＬＤＬ−コレステロールの反応によって生成される
前記生成物のみを測定する。The present invention can be applied to any of these methods. That is, in the present invention, when these methods are carried out, the polyanion and the amphoteric surfactant may be present in the reaction system. More specifically, first, a biological sample is brought into contact with a polyanion and an amphoteric surfactant to inhibit the reaction of LDL-cholesterol in the sample,
In other words, it is delayed or temporarily stopped, and as a result, the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL is preceded to eliminate (consume) them, and then the above-mentioned production produced by the reaction of LDL-cholesterol. Only measure things.

【００１６】本発明方法の具体的な測定手段としては、
以下の如き方法が挙げられる。Specific measuring means of the method of the present invention include:
The following methods may be mentioned.

【００１７】〔方法１〕ポリアニオン及び両性界面活性
剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて
過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤと被
酸化性呈色試薬（例えばカップラーとデベロッパーとの
組合せ、酸化によってそれ自体が発色する発色剤等）を
作用させて酸化色素を生じさせ、相異なる二つの時点で
の吸光度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中の
ＬＤＬ−コレステロール量を算出する。[Method 1] In the presence of a polyanion and an amphoteric surfactant, CHE and CO are caused to act on a biological sample to generate hydrogen peroxide, and POD and an oxidizable color reagent ( For example, the combination of a coupler and a developer, a coloring agent that itself develops color by oxidation, etc.) is caused to act to generate an oxidative dye, and the absorbance at two different time points is measured. The amount of LDL-cholesterol is calculated.

【００１８】〔方法２〕ポリアニオン及び両性界面活性
剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ
（Ｐ）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを生じさせ、相異な
る二つの時点での吸光度を測定し、これらに基づいて生
体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。[Method 2] CHE, CHD and NAD were applied to a biological sample in the presence of a polyanion and an amphoteric surfactant.
(P) is caused to act to generate NAD (P) H, the absorbances at two different time points are measured, and the LDL-cholesterol amount in the biological sample is calculated based on these.

【００１９】〔方法３〕ポリアニオン及び両性界面活性
剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥとＣＯを作用させて
過酸化水素を生じさせ、生じた過酸化水素にＰＯＤとカ
ップラー（又はデベロッパー）、又はＣＡＴを作用さ
せ、次いでデベロッパー（又はカップラー）、又はＣＡ
Ｔ阻害剤及び被酸化性呈色試薬を作用させて酸化色素を
生じさせ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試
料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出する。[Method 3] In the presence of a polyanion and an amphoteric surfactant, CHE and CO are allowed to act on a biological sample to generate hydrogen peroxide, and the generated hydrogen peroxide is POD and a coupler (or developer), or Act on CAT, then Developer (or Coupler), or CA
The T inhibitor and the oxidizable color reagent are allowed to act to generate an oxidative dye, the absorbance is measured, and the amount of LDL-cholesterol in the biological sample is calculated based on this.

【００２０】〔方法４〕ポリアニオン及び両性界面活性
剤の存在下、生体由来試料にＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ
（Ｐ）（或いはＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及びカップラー又
は／及びデベロッパー）を作用させてＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
（或いは過酸化水素）を生じさせる反応系に導いた後、
次いで、ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬及びＣＨＤ阻
害剤（或いはＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）及びＣＯ阻害剤）を
作用させて酸化色素（或いはＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を生じさ
せ、吸光度を測定し、これに基づいて生体由来試料中の
ＬＤＬ−コレステロール量を算出する。[Method 4] CHE, CHD and NAD were applied to a biological sample in the presence of a polyanion and an amphoteric surfactant.
(P) (or CHE, CO, POD and coupler or / and developer) to act on NAD (P) H
(Or hydrogen peroxide) is introduced into the reaction system,
Then, CO, POD, an oxidizable color reagent and a CHD inhibitor (or CHD, NAD (P) and CO inhibitor) are caused to act to generate an oxidation dye (or NAD (P) H), and the absorbance is measured. Then, based on this, the LDL-cholesterol amount in the biological sample is calculated.

【００２１】上記方法１及び２に於いて、相異なる二つ
の時点とは、具体的には、ＬＤＬ以外のリポタンパク中
のコレステロールの反応が実質的に終了し、且つＬＤＬ
−コレステロールの反応が開始される前の時点と、ＬＤ
Ｌ−コレステロールの反応が実質的に終了した時点の二
つの時点のことである。尚、上記方法３及び４に於いて
は、一つの時点、即ち、ＬＤＬ−コレステロールの反応
が実質的に終了した時点のみの吸光度の測定によっても
生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を測定し得
るが、より測定精度を上げるために、上記方法１及び２
と同様の相異なる二つの時点での吸光度を測定するのが
好ましい。また、これら相異なる二つの時点は、測定方
法の違いや、使用するポリアニオン、両性界面活性剤の
種類及び使用濃度、その他酵素等の試薬類の種類及び使
用濃度等により異なるため、例えば各リポタンパク分画
に対する反応性（反応曲線等）を検討し、適宜設定すれ
ばよい。In the above-mentioned methods 1 and 2, the two different time points specifically mean that the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL is substantially completed, and
-Before the cholesterol reaction is initiated and LD
It is two times when the reaction of L-cholesterol is substantially completed. In the above methods 3 and 4, the amount of LDL-cholesterol in the biological sample can be measured by measuring the absorbance only at one time point, that is, when the reaction of LDL-cholesterol is substantially completed. However, in order to further improve the measurement accuracy, the above methods 1 and 2
It is preferable to measure the absorbance at two different time points similar to the above. In addition, these two different time points differ depending on the difference in the measurement method, the polyanion used, the type and concentration of the amphoteric surfactant, and the type and concentration of other reagents such as enzymes. The reactivity with respect to the fraction (reaction curve, etc.) may be examined and set appropriately.

【００２２】本発明方法は、１液法でも２液法でも又そ
れ以上の試液を用いる方法の何れでもよい。但し、上記
方法３及び４は、２液法又はそれ以上の試液を用いる方
法が実用的である。尚、２液以上の試液を用いる方法に
於いては、ポリアニオンと両性界面活性剤とを、生体由
来試料と直接混合させる試液中に含有させればよい。ま
た、上記方法１、２及び４に於いては、ＰＯＤとカップ
ラー又は／及びデベロッパー、又はＮＡＤ（Ｐ）を、Ｌ
ＤＬ−コレステロールの反応が開始するより前の時点で
添加する試液中に含有させればよく、また、上記方法３
に於いては、ＰＯＤとカップラー、ＰＯＤとデベロッパ
ー、又はＣＡＴを、ＬＤＬ−コレステロールの反応が開
始するより前の時点で添加する試液中に含有させればよ
い。The method of the present invention may be a one-liquid method, a two-liquid method, or a method using more than two reagent solutions. However, the above methods 3 and 4 are practically a method using a two-component method or more reagent solutions. In the method using two or more test solutions, the polyanion and the amphoteric surfactant may be contained in the test solution to be directly mixed with the biological sample. Further, in the above methods 1, 2 and 4, the POD, the coupler or / and the developer, or the NAD (P) is mixed with L
It may be contained in a reagent solution added before the start of the DL-cholesterol reaction.
In this case, POD and the coupler, POD and the developer, or CAT may be contained in the reagent solution added before the reaction of LDL-cholesterol starts.

【００２３】本発明方法を２液法で行う場合の具体例
は、例えば以下の如である。例えば上記方法１又は２を
実施する場合には、生体由来試料と、ポリアニオン及
び両性界面活性剤、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸
化性呈色試薬、（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））及び
水性媒体を含んでなる第一試液とを混合した後に吸光度
（ＯＤ₁）を測定し、次いで、該混合液と、水性媒体を
含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ₂）
を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中の
ＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。Specific examples of the case where the method of the present invention is carried out by the two-liquid method are as follows. For example, when carrying out the above method 1 or 2, a biological sample, a polyanion and an amphoteric surfactant, CHE, CO, POD, and an oxidizable color reagent (or CHD and NAD (P)) and an aqueous medium are used. absorbance after mixing the first reagent solution comprising an (OD ₁₎ is measured and then, the mixture and the absorbance after mixing the second reagent solution comprising an aqueous medium (OD ₂₎
And the amount of LDL-cholesterol in the biological sample is calculated based on these absorbances.

【００２４】また、例えば上記方法３を実施する場合に
は、生体由来試料と、ポリアニオン及び両性界面活性
剤、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤとカップラー（又はデ
ベロッパー）（或いはＣＡＴ）、及び水性媒体を含
んでなる第一試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ₁）を
測定し、次いで、該混合液と、デベロッパー（又はカ
ップラー）（或いはＣＡＴ阻害剤）と水性媒体を含
んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（ＯＤ₂）を
測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試料中のＬ
ＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。尚、第一試
液にＣＡＴを含有させる場合には、ＰＯＤ、カップラ
ー、デベロッパーは、夫々第一試液と第二試液の少なく
とも一方に含有させる。Further, for example, when carrying out the above-mentioned Method 3, the sample derived from a living body, polyanion and an amphoteric surfactant, CHE, CO, POD and a coupler (or developer) (or CAT), and an aqueous medium are contained. And the absorbance (OD ₁ ) was measured, and then the mixed solution was mixed with a second sample solution containing a developer (or coupler) (or CAT inhibitor) and an aqueous medium. After that, the absorbance (OD ₂ ) was measured, and L in the biological sample was measured based on these absorbances.
The amount of DL-cholesterol may be calculated. When CAT is contained in the first reagent solution, POD, coupler and developer are contained in at least one of the first reagent solution and the second reagent solution, respectively.

【００２５】更に、例えば上記方法４を実施する場合に
は、生体由来試料と、ポリアニオン及び両性界面活性
剤、ＣＨＥ、ＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ）（又はＣ
Ｏ、ＰＯＤ、及びカップラー又は／及びデベロッパ
ー）、及び水性媒体を含んでなる第一試液とを混合し
た後に吸光度（ＯＤ₁）を測定し、次いで、水性媒
体、ＣＯ、ＰＯＤ、被酸化性呈色試薬、及びＣＨＤ阻
害剤（或いはＣＨＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、及びＣＯ阻害
剤）を含んでなる第二試液とを混合した後に吸光度（Ｏ
Ｄ ₂）を測定し、これらの吸光度に基づいて生体由来試
料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよい。Further, for example, when performing the above method 4,
Is a biological sample, polyanion and amphoteric surfactant
Agent, CHE, CHD and NAD (P) (or C
O, POD, and / or coupler
-), And a first reagent solution containing an aqueous medium.
Absorbance (OD₁), Then the aqueous medium
Body, CO, POD, oxidizable color reagent, and CHD inhibitor
Harmful agent (or CHD, NAD (P), and CO inhibition)
Agent) and then mixed with a second reagent solution containing
D ₂) Is measured and the biological sample is
The amount of LDL-cholesterol in the food may be calculated.

【００２６】尚、上記方法に於いて、ＯＤ₁とＯＤ₂を測
定する時点は、測定方法の違いや、使用するポリアニオ
ン、両性界面活性剤の種類及び使用濃度、その他酵素等
の試薬類の種類及び使用濃度等により異なるため、例え
ば各リポタンパク分画に対する反応性（反応曲線等）を
検討し、適宜設定すればよい。In the above method, OD ₁ and OD ₂ are measured at different points in time, the difference in the measuring method, the type of polyanion used, the type and concentration of amphoteric surfactant, and the type of other reagents such as enzymes. Also, since it varies depending on the concentration to be used and the like, the reactivity (reaction curve etc.) to each lipoprotein fraction may be examined and set appropriately.

【００２７】また、本発明方法を１液法（上記方法１又
は２）で行う場合、より具体的には、以下の如く行えば
よい。即ち、例えば生体由来試料と、ポリアニオン及
び両性界面活性剤、ＣＨＥ、ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸
化性呈色試薬（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））、及び
水性媒体を含有する試液とを混合し、ＬＤＬ以外のリポ
タンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了し、
且つＬＤＬ−コレステロールの反応が開始される前の時
点で吸光度（ＯＤ₁）を測定し、次いで、ＬＤＬ−コレ
ステロールの反応が実質的に終了した時点で吸光度（Ｏ
Ｄ₂）を再度測定し、これらの吸光度に基づいて生体由
来試料中のＬＤＬ−コレステロール量を算出すればよ
い。When the method of the present invention is carried out by the one-liquid method (the above method 1 or 2), more specifically, it may be carried out as follows. That is, for example, a biological sample is mixed with a sample solution containing a polyanion and an amphoteric surfactant, CHE, CO, POD, an oxidizable color reagent (or CHD and NAD (P)), and an aqueous medium, and LDL is mixed. The reactions of cholesterol in lipoproteins other than
The absorbance (OD ₁ ) is measured before the LDL-cholesterol reaction is started, and then the absorbance (O ₁ ) is measured when the LDL-cholesterol reaction is substantially completed.
D ₂ ) may be measured again, and the LDL-cholesterol amount in the biological sample may be calculated based on these absorbances.

【００２８】尚、上記の方法に於いて、ＯＤ₁及びＯＤ₂
に基づいて生体由来試料中のＬＤＬ−コレステロール量
を算出するには、ＯＤ₂からＯＤ₁〔又はＯＤ₁に由来す
る値（例えばＯＤ₁に液量補正係数を掛けて求めた
値）〕を差し引いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得られた
ＯＤ₃を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度既知
の標準液等の標準品を試料として上記方法と同様にして
求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ₃との関係
を示す検量線に当てはめることにより、生体由来試料中
のＬＤＬ−コレステロールの値を算出すればよい。In the above method, OD ₁ and OD ₂
On the basis to calculate the LDL- cholesterol content of biological samples is subtracted from the OD ₂ OD ₁ [a value derived or OD ₁ (e.g. a value obtained by multiplying the amount of liquid correction coefficient OD _1)] Absorbance (OD ₃ ) was determined, and the obtained OD ₃ was determined in the same manner as the above method using a standard product such as a standard solution having a known LDL-cholesterol concentration in advance as the LDL-cholesterol concentration and OD ₃ . The value of LDL-cholesterol in the biological sample may be calculated by fitting it to the calibration curve showing the above relationship.

【００２９】本発明に於いては、コレステロール反応を
促進させるために、非イオン性界面活性剤や陰イオン性
界面活性剤等を共存させてもよく、また、ＬＤＬ以外の
リポタンパク中のコレステロールの反応を促進させる目
的で、ＬＤＬ以外のリポタンパクに結合する抗体を共存
させてもよい。In the present invention, in order to promote the cholesterol reaction, a nonionic surfactant, an anionic surfactant or the like may be allowed to coexist, and cholesterol in lipoproteins other than LDL may be added. Antibodies that bind to lipoproteins other than LDL may coexist for the purpose of promoting the reaction.

【００３０】以下に、本発明に於ける構成要件の好まし
い態様及びその使用濃度等について説明する。The preferred embodiments of the constituents in the present invention and the concentrations used will be described below.

【００３１】本発明に於いて用いられる、ポリアニオン
としては、両性界面活性剤と共存させることによりＬＤ
Ｌ−コレステロールの反応を阻害させてＬＤＬ以外のリ
ポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得るも
のであればよい。尚、阻害とは、ＬＤＬ−コレステロー
ルの反応をＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロー
ルの反応に比べて遅延或いはＬＤＬ−コレステロールの
反応を一時的に停止させることをいい、これ以降もこの
意味で用いる。これらポリアニオンの具体例としては例
えば、ヘパリン、リンタングステン酸、デキストラン硫
酸、硫酸化シクロデキストリン、ヘパラン硫酸、コンド
ロイチン硫酸、ヒアルロン酸、硫酸化オリゴ糖、硫酸化
ポリアクリルアミド、カルボキシメチル化ポリアクリル
アミド、又はこれらの塩等が挙げられる。塩としては、
Ｎａ塩、Ｋ塩等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩等が
挙げられる。上記した如きポリアニオンのうち、ヘパリ
ン、リンタングステン酸、デキストラン硫酸、又はこれ
らの塩が好ましい。また、これらポリアニオンの使用濃
度としては、両性界面活性剤と共存させることによりＬ
ＤＬ−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外
のリポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得
る濃度であればよく、生体由来試料と直接混合させる試
液中の濃度として、通常0.0001％〜10％（W/V）、好ま
しくは0.001％〜1％（W/V）である。尚、これらポリア
ニオンは単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせ
て用いてもよい。As the polyanion used in the present invention, LD can be prepared by coexisting with an amphoteric surfactant.
Any substance can be used as long as it can inhibit the reaction of L-cholesterol and precede the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL. Inhibition refers to delaying the reaction of LDL-cholesterol as compared with the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL or temporarily stopping the reaction of LDL-cholesterol, and is also used in this meaning thereafter. Specific examples of these polyanions include, for example, heparin, phosphotungstic acid, dextran sulfate, sulfated cyclodextrin, heparan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid, sulfated oligosaccharides, sulfated polyacrylamide, carboxymethylated polyacrylamide, or these. And the like. As salt,
Examples thereof include alkali metal salts such as Na salt and K salt, ammonium salt and the like. Of the polyanions as described above, heparin, phosphotungstic acid, dextran sulfate, or salts thereof are preferable. Further, the concentration of these polyanions to be used is L when coexisting with an amphoteric surfactant.
The concentration may be such that it inhibits the reaction of DL-cholesterol and precedes the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL, and the concentration in the reagent solution directly mixed with the biological sample is usually 0.0001% to 10% ( W / V), preferably 0.001% to 1% (W / V). In addition, these polyanions may be used alone or in combination of two or more kinds.

【００３２】本発明に於いて用いられる両性界面活性剤
としては、ポリアニオンと共存させることによりＬＤＬ
−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外のリ
ポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得るも
のであればよく、例えばアルキルベタイン誘導体（例え
ばラウリルベタイン、ステアリルベタイン、ラウリルジ
メチルアンモニウムベタイン、ココナットベタイン、ヤ
シ油脂肪酸アミドプロピルベタイン、ラウリン酸アミド
プロピルベタイン等）、イミダゾリニウムベタイン誘導
体（例えば２−ラウリル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−
ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン、２−ウン
デシル−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル
イミダゾリニウムベタイン等の２−アルキル−Ｎ−カル
ボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウム
ベタイン、例えば２−アルキル−Ｎ−カルボキシエチル
−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイン
等）、スルホベタイン誘導体（例えばＮ−オクチル−
Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスル
ホン酸、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニ
オ−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−
ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸、
Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ
−１−プロパンスルホン酸、Ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ
−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸
等）等のベタイン誘導体、例えばアルキルグリシン、ア
ルキルビス（アミノエチル）グリシン、ジオクチルポリ
アミノエチルグリシン、Ｎ−アルキルポリアミノエチル
グリシン、β−アラニン誘導体等のアミノカルボン酸誘
導体、例えばビス（２−ウンデシル−Ｎ−ヒドロキシエ
チルイミダゾリン）クロル酢酸錯体、アルキルイミダゾ
リン誘導体等のイミダゾリン誘導体、例えばラウリルジ
メチルアミンオキサイド等のアミンオキサイド誘導体等
が挙げられる。上記した如き両性界面活性剤のうち、ラ
ウリルベタイン、ヤシ油脂肪酸アミドプロピルベタイ
ン、ラウリン酸アミドプロピルベタイン、２−アルキル
−Ｎ−カルボキシメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダ
ゾリニウムベタイン及び２−アルキル−Ｎ−カルボキシ
エチル−Ｎ−ヒドロキシエチルイミダゾリニウムベタイ
ン、アルキルグリシン、アルキルビス（アミノエチル）
グリシン、ジオクチルポリアミノエチルグリシン、Ｎ−
アルキルポリアミノエチルグリシン、β−アラニン誘導
体が好ましい。また、これら両性界面活性剤の使用濃度
としては、ポリアニオンと共存させることによりＬＤＬ
−コレステロールの反応を阻害させて、ＬＤＬ以外のリ
ポタンパク中のコレステロールの反応を先行させ得る濃
度であればよく、生体由来試料と直接混合させる試液中
の濃度として、通常0.0001％〜10％（W／V）、好ましく
は0.001％〜１％（W／V）である。尚、これら両性界面
活性剤は単独で用いても、或は二種以上適宜組み合わせ
て用いてもよい。As the amphoteric surfactant used in the present invention, LDL can be used by coexisting with a polyanion.
-It suffices that it can inhibit the reaction of cholesterol and precede the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL, and examples thereof include alkyl betaine derivatives (e.g., lauryl betaine, stearyl betaine, lauryl dimethyl ammonium betaine, coconut betaine, Coconut oil fatty acid amide propyl betaine, lauric acid amide propyl betaine, etc.), imidazolinium betaine derivative (eg 2-lauryl-N-carboxymethyl-N-)
2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaines such as hydroxyethylimidazolinium betaine and 2-undecyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine, for example 2-alkyl-N -Carboxyethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine, etc.), sulfobetaine derivative (for example, N-octyl-
N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid, N-decyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid, N-dodecyl-N, N-
Dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid,
N-tetradecyl-N, N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid, N-hexadecyl-N, N
-Dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonic acid, etc.) and other betaine derivatives, such as alkylglycine, alkylbis (aminoethyl) glycine, dioctylpolyaminoethylglycine, N-alkylpolyaminoethylglycine, β-alanine derivative, and other amino acids. Examples thereof include carboxylic acid derivatives, for example, bis (2-undecyl-N-hydroxyethylimidazoline) chloroacetic acid complex, imidazoline derivatives such as alkylimidazoline derivatives, and amine oxide derivatives such as lauryldimethylamine oxide. Among the amphoteric surfactants as described above, lauryl betaine, coconut oil fatty acid amide propyl betaine, lauric acid amide propyl betaine, 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydroxyethyl imidazolinium betaine and 2-alkyl-N- Carboxyethyl-N-hydroxyethylimidazolinium betaine, alkylglycine, alkylbis (aminoethyl)
Glycine, dioctyl polyaminoethyl glycine, N-
Alkyl polyaminoethyl glycine and β-alanine derivatives are preferred. The concentration of these amphoteric surfactants used is LDL when coexisting with polyanion.
-A concentration that can inhibit the reaction of cholesterol and precede the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL, is usually 0.0001% to 10% (W / V), preferably 0.001% to 1% (W / V). Incidentally, these amphoteric surfactants may be used alone, or may be used in combination of two or more kinds as appropriate.

【００３３】本発明に於いて用いられるＣＯとしては、
通常この分野で使用されているもの、例えば、ノカルデ
ィア属、シュードモナス属等の微生物に由来するもの、
牛膵臓等動物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＯ
の使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中の
濃度として、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜13
0u／ml、より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、
最終の反応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好
ましくは0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／ml
である。尚、一液法の場合は、上記最終の反応液中の濃
度範囲から適宜選択される。（以下、同様。） 本発明に於いて用いられるＣＨＥとしては、通常この分
野で使用されているもの、例えば、キャンディダ属、シ
ュードモナス属等の微生物に由来するもの、牛膵臓等動
物臓器に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＥの使用量
としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度とし
て、通常0.03〜330u／ml、好ましくは0.07〜130u／ml、
より好ましくは0.13〜65u／mlであり、又は、最終の反
応液中の濃度として、通常0.02〜250u／ml、好ましくは
0.05〜100u／ml、より好ましくは0.1〜50u／mlである。As CO used in the present invention,
Those usually used in this field, for example, those derived from microorganisms such as Nocardia and Pseudomonas,
Examples include those derived from animal organs such as bovine pancreas. CO
The amount of the compound used is, for example, 0.03 to 330 u / ml, preferably 0.07 to 13 u as the concentration in the first reagent solution in the two-component method.
0u / ml, more preferably 0.13-65u / ml, or
The final concentration in the reaction solution is usually 0.02 to 250 u / ml, preferably 0.05 to 100 u / ml, more preferably 0.1 to 50 u / ml.
Is. In the case of the one-liquid method, it is appropriately selected from the concentration range in the final reaction solution. (The same shall apply hereinafter.) As CHE used in the present invention, those usually used in this field, for example, those derived from microorganisms such as Candida and Pseudomonas, and those derived from animal organs such as bovine pancreas There are things to do. The amount of CHE used is, for example, 0.03 to 330 u / ml, preferably 0.07 to 130 u / ml, as the concentration in the first reagent solution in the two-liquid method.
It is more preferably 0.13 to 65u / ml, or the concentration in the final reaction solution is usually 0.02 to 250u / ml, preferably
It is 0.05 to 100 u / ml, more preferably 0.1 to 50 u / ml.

【００３４】本発明に於いて用いられるＰＯＤとして
は、通常この分野で使用されているもの、例えば、西洋
ワサビ、大根等の植物に由来するもの、カビ、酵母等の
微生物に由来するもの、動物の白血球、甲状腺等に由来
するもの等が挙げられる。ＰＯＤの使用量としては、例
えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、通常0.1
〜1000u／ml、好ましくは0.25〜400u／ml、より好まし
くは0.5〜200u／mlであり、又は、最終の反応液中の濃
度として、通常0.1〜250u／ml、好ましくは0.25〜100u
／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。As the POD used in the present invention, those usually used in this field, for example, those derived from plants such as horseradish and radish, those derived from microorganisms such as mold and yeast, animals Those derived from the white blood cells, thyroid, etc. The amount of POD used is, for example, usually 0.1 as the concentration in the first reagent solution in the two-component method.
~ 1000u / ml, preferably 0.25-400u / ml, more preferably 0.5-200u / ml, or the concentration in the final reaction solution is usually 0.1-250u / ml, preferably 0.25-100u.
/ Ml, more preferably 0.5 to 50 u / ml.

【００３５】本発明に於いて用いられる被酸化性呈色試
薬としては、ＰＯＤの存在下、過酸化水素と反応して呈
色するものであればよく、例えば４−アミノアンチピリ
ン（以下、４−ＡＡと略記する。）等のカップラー及
び、該カップラーと酸化縮合して色素を生ずるデベロッ
パーとの組合せ、即ち、例えば４−ＡＡとフェノール系
化合物，ナフトール系化合物若しくはアニリン系化合物
の組合せ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラ
ゾンとアニリン系化合物の組合せ等や、例えば２，２’
−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スル
ホン酸）、トリフェニルメタン系ロイコ色素、ジフェニ
ルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダ
ゾール誘導体、ロイコメチレンブルー誘導体、ｏ−フェ
ニレンジアミン誘導体等の酸化によってそれ自体が発色
する発色剤等が挙げられる。デベロッパーとしてのフェ
ノール系化合物の具体例としては、例えばフェノール、
ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール等
が挙げられ、ナフトール系化合物の具体例としては、例
えば１−ナフトール、１−ナフトール−２−スルホン
酸、１−ナフトール−２−カルボン酸等が挙げられ、ま
た、アニリン系化合物の具体例としては、例えばＮ，Ｎ
−ジエチルアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−（β−ヒドロキ
シエチル）−ｍ−トルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−
４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシア
ニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−メチルフェニル）−Ｎ’
−サクシニル−エチレンジアミン（ＥＭＳＥ）等が挙げ
られる。カップラーとデベロッパーとの組合せを用いる
場合、カップラーの使用量としては、用いるカップラー
の種類や組み合わせるデベロッパーの種類等により異な
るが、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、
通常0.01〜400mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ましく
は0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度として、通
常0.01〜100mM、好ましくは0.1〜10mMの範囲である。ま
た、カップラーとして４−ＡＡを使用する場合の使用量
としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度とし
て、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1〜40mM、より好ま
しくは0.2〜10mMであり、最終の反応液中の濃度とし
て、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜５mMである。ま
た、デベロッパーの使用量としては、用いるデベロッパ
ーの種類や組み合わせるカップラーの種類等により異な
るため一概には言えないが、例えば２液法に於ける第一
試液中の濃度として、通常0.01〜200mM、好ましくは0.1
〜40mM、より好ましくは0.2〜10mMであり、最終の反応
液中の濃度として、通常0.01〜50mM、好ましくは0.1〜
５mMである。トリフェニルメタン系ロイコ色素の具体例
としては、例えばロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ
−ジエチルアミノフェニル）−２−スルホフェニルメタ
ン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジ
スルホプロポキシフェニルメタン・ジナトリウム塩等が
挙げられ、ジフェニルアミン誘導体の具体例としては、
例えばビス〔４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２
−メチルフェニル〕アミン、Ｎ，Ｎ−ビス（４−ジエチ
ルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエン
スルホニル尿素等が挙げられ、また、ロイコメチレンブ
ルー誘導体の具体例としては、例えば10−（カルボキシ
メチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルア
ミノ）フェノチアジン・ナトリウム塩、10−〔３−（メ
トキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノ
カルボニル〕−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノ
チアジン等が挙げられる。更に、ベンジジン誘導体の具
体例としては、例えばベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−
ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、３，
３’，５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げら
れ、トリアリルイミダゾール誘導体の具体例としては、
例えば２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチ
ルカルバモイル−４，５−ビス（４ージエチルアミノフ
ェニル）イミダゾール、２−（３−メトキシ−４−ジエ
チルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−
４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニ
ル）イミダゾール等が挙げられる。これら発色剤の使用
量としては、通常この分野で用いられる濃度範囲であ
る。The oxidizable color reagent used in the present invention may be any reagent that reacts with hydrogen peroxide in the presence of POD to produce a color, such as 4-aminoantipyrine (hereinafter referred to as 4-aminoantipyrine). AAA)) and a developer that forms a dye by oxidative condensation with the coupler, that is, for example, 4-AA and a phenol compound, a naphthol compound or an aniline compound, 3-methyl. -2-benzothiazolinone hydrazone and aniline compound combination, for example, 2,2 '
-Develops itself by oxidation of azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), triphenylmethane-based leuco dye, diphenylamine derivative, benzidine derivative, triallylimidazole derivative, leucomethylene blue derivative, o-phenylenediamine derivative, etc. And a coloring agent. Specific examples of the phenolic compound as a developer include phenol,
Examples thereof include p-chlorophenol and 2,4-dichlorophenol, and specific examples of the naphthol compound include 1-naphthol, 1-naphthol-2-sulfonic acid, 1-naphthol-2-carboxylic acid and the like. Further, specific examples of the aniline-based compound include, for example, N, N
-Diethylaniline, N-ethyl-N- (β-hydroxyethyl) -m-toluidine, N-ethyl-N- (2-
Hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (DAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-
4-Fluoroaniline (FDAOS), N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxyaniline (HDAOS), N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m- Toluidine (TOO
S), N-ethyl-N- (3-methylphenyl) -N '
-Succinyl-ethylenediamine (EMSE) and the like. When a combination of a coupler and a developer is used, the amount of the coupler used varies depending on the type of the coupler used, the type of the developer to be combined, and the like. For example, as the concentration in the first reagent solution in the two-component method,
It is usually 0.01 to 400 mM, preferably 0.1 to 40 mM, more preferably 0.2 to 10 mM, and the concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 100 mM, preferably 0.1 to 10 mM. The amount of 4-AA used as a coupler is, for example, usually 0.01 to 200 mM, preferably 0.1 to 40 mM, more preferably 0.2 to 10 mM as the concentration in the first reagent solution in the two-component method. The concentration in the final reaction solution is usually 0.01 to 50 mM, preferably 0.1 to 5 mM. The amount of the developer used cannot be generally stated because it varies depending on the type of developer used and the type of coupler to be combined, but for example, the concentration in the first reagent solution in the two-component method is usually 0.01 to 200 mM, preferably Is 0.1
~ 40 mM, more preferably 0.2 ~ 10 mM, the concentration in the final reaction solution is usually 0.01 ~ 50 mM, preferably 0.1 ~
It is 5 mM. Specific examples of the triphenylmethane-based leuco dye include, for example, leuco marachite green and bis (p
-Diethylaminophenyl) -2-sulfophenylmethane, bis (p-diethylaminophenyl) -3,4-disulfopropoxyphenylmethane disodium salt, and the like. Specific examples of the diphenylamine derivative include:
For example, bis [4-di (2-butoxyethyl) amino-2
-Methylphenyl] amine, N, N-bis (4-diethylamino-2-methylphenyl) -N'-p-toluenesulfonylurea, and the like, and specific examples of the leuco methylene blue derivative include 10- ( Carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine sodium salt, 10- [3- (methoxycarbonylaminomethyl) phenylmethylaminocarbonyl] -3,7-bis (dimethylamino) phenothiazine and the like. To be Further, specific examples of the benzidine derivative include, for example, benzidine, o-tolidine, o-
Dianisidine, 3,3'-diaminobenzidine, 3,
3 ′, 5,5′-tetraaminobenzidine and the like are mentioned, and specific examples of the triallylimidazole derivative include
For example, 2- (4-carboxyphenyl) -3-N-methylcarbamoyl-4,5-bis (4-diethylaminophenyl) imidazole, 2- (3-methoxy-4-diethylaminophenyl) -3-N-methylcarbamoyl-
Examples include 4,5-bis (2-methyl-4-diethylaminophenyl) imidazole and the like. The amount of these color formers used is within the concentration range usually used in this field.

【００３６】本発明に於いて用いられるＣＡＴとして
は、通常この分野で使用されているもの、例えば、牛肝
臓等の動物臓器に由来するもの、クロロプラスト等の植
物に由来するもの、ミクロコッカス属、ロドシュードモ
ナス属等の微生物に由来するもの等が挙げられる。ＣＡ
Ｔの使用量としては、例えば２液法に於ける第一試液中
の濃度として、通常10〜50000u／ml、好ましくは100〜5
000u／ml、より好ましくは0.5〜50u／mlである。As the CAT used in the present invention, those usually used in this field, for example, those derived from animal organs such as bovine liver, those derived from plants such as chloroplast, and Micrococcus spp. , Those derived from microorganisms such as Rhodopseudomonas. CA
The amount of T used is, for example, usually 10 to 50,000 u / ml, preferably 100 to 5 as the concentration in the first reagent solution in the two-component method.
It is 000u / ml, more preferably 0.5 to 50u / ml.

【００３７】本発明に於いて用いられるＣＨＤは、通常
この分野で使用されているもの、例えば、ノカルディア
属に由来するもの等が挙げられる。ＣＨＤの使用量とし
ては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度として、
通常0.1〜150u／ml、好ましくは0.3〜100u／ml、より好
ましくは0.5〜60u／mlであり、最終の反応液中の濃度と
して、通常0.1〜100u／ml、好ましくは0.5〜50u／mlで
ある。The CHD used in the present invention includes those usually used in this field, for example, those derived from the genus Nocardia. The amount of CHD used is, for example, the concentration in the first reagent solution in the two-liquid method,
Usually, it is 0.1 to 150u / ml, preferably 0.3 to 100u / ml, more preferably 0.5 to 60u / ml, and the final concentration in the reaction solution is usually 0.1 to 100u / ml, preferably 0.5 to 50u / ml. is there.

【００３８】本発明に於いて用いられるＮＡＤ（Ｐ）
は、通常この分野で使用されているもの、例えば、酵母
に由来するもの等が挙げられる。ＮＡＤ（Ｐ）の使用量
としては、例えば２液法に於ける第一試液中の濃度とし
て、通常0.2〜70mM、好ましくは0.5〜50mM、より好まし
くは１〜20mMであり、最終の反応液中の濃度として、通
常0.2〜50mM、好ましくは１〜10mMである。NAD (P) used in the present invention
Include those usually used in this field, for example, those derived from yeast. The amount of NAD (P) used is, for example, usually 0.2 to 70 mM, preferably 0.5 to 50 mM, more preferably 1 to 20 mM, as the concentration in the first reagent solution in the two-component method. The concentration is usually 0.2 to 50 mM, preferably 1 to 10 mM.

【００３９】本発明に於いて用いられるＣＡＴ阻害剤と
しては、通常この分野で使用されているもの、例えばＮ
ａＮ₃、3-アミノ-1,2,4-トリアソ゛ール等が挙げられる。これらＣ
ＡＴ阻害剤の使用量としては、用いるＣＡＴ阻害剤の種
類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法
に於ける第二試液中の濃度として、通常0.01〜10％（W/
V）、好ましくは0.02〜５％（W/V）、より好ましくは0.
03〜３％（W/V）である。As the CAT inhibitor used in the present invention, those usually used in this field, for example, N
Examples thereof include aN ₃ , 3-amino-1,2,4-triazole and the like. These C
The amount of the AT inhibitor used cannot be generally determined because it depends on the type of the CAT inhibitor used, but for example, the concentration in the second reagent solution in the two-component method is usually 0.01 to 10% (W /
V), preferably 0.02 to 5% (W / V), more preferably 0.
It is 03 to 3% (W / V).

【００４０】本発明に於いて用いられるＣＯ阻害剤とし
ては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡｇ
＋イオン、Ｚｎ２＋イオン、グルタチオン等が挙げられ
る。これらＣＯ阻害剤の使用量としては、用いるＣＯ阻
害剤の種類により異なるため一概には言えないが、例え
ば２液法に於ける第二試液中の濃度として、通常0.0000
2〜40％（W/V）、好ましくは0.0002〜４％（W/V）、よ
り好ましくは0.002〜0.4％（W/V）である。The CO inhibitors used in the present invention are those commonly used in this field, such as Ag.
+ Ion, Zn2 + ion, glutathione and the like can be mentioned. The amount of these CO inhibitors used cannot be generally stated because it depends on the type of CO inhibitor used, but for example, the concentration in the second reagent solution in the two-component method is usually 0.0000.
It is 2 to 40% (W / V), preferably 0.0002 to 4% (W / V), and more preferably 0.002 to 0.4% (W / V).

【００４１】本発明に於いて用いられるＣＨＤ阻害剤と
しては、通常この分野で使用されているもの、例えばＡ
ｇ＋イオン、Ｚｎ２＋イオン等が挙げられる。これらＣ
ＨＤ阻害剤の使用量としては、用いるＣＨＤ阻害剤の種
類により異なるため一概には言えないが、例えば２液法
に於ける第二試液中の濃度として、通常0.00001〜70％
（W/V）、好ましくは0.0001〜７％（W/V）、より好まし
くは0.001〜0.7％（W/V）である。As the CHD inhibitor used in the present invention, those usually used in this field, for example, A
Examples thereof include g + ion and Zn2 + ion. These C
The amount of the HD inhibitor used cannot be generally determined because it depends on the type of the CHD inhibitor used. However, for example, the concentration in the second reagent solution in the two-component method is usually 0.00001 to 70%.
(W / V), preferably 0.0001 to 7% (W / V), more preferably 0.001 to 0.7% (W / V).

【００４２】本発明に於いて用いられる非イオン性界面
活性剤及び陰イオン性界面活性剤としては、コレステロ
ール反応を促進させ得る性質を有するものであればよ
く、非イオン性界面活性剤としては、例えばポリオキシ
エチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキ
ルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコー
ルエーテル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリ
オキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン
脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪
酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、グリ
セリン脂肪酸エステル等が挙げられ、陰イオン性界面活
性剤としてはコール酸およびその誘導体等が挙げられ
る。さらに、ポリオキシエチレンアルキルエーテルの具
体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、
ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレ
ンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエ
ーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキルフェ
ニルエーテルの具体例としては、ポリオキシエチレンオ
クチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフ
ェニルエーテル等が挙げられ、ポリオキシエチレン脂肪
酸エステルの具体例としては、ポリエチレングリコール
モノラウレート、ポリエチレングリコールモノステアレ
ート、ポリエチレングリコールジステアレート、ポリエ
チレングリコールモノオレエート等が挙げられ、ポリオ
キシエチレンソルビタン脂肪酸エステルの具体例として
は、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオ
キシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシ
エチレンソルビタントリステアレート、ポリオキシエチ
レンソルビタンモノオレエート、ポリオキシエチレンソ
ルビタントリオレエート等が挙げられ、ソルビタン脂肪
酸エステルの具体例としては、ソルビタンモノラウレー
ト、ソルビタンモノパルミテート、ソルビタンモノステ
アレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタントリ
ステアレート、ソルビタンモノオレエート、ソルビタン
トリオレエート、ソルビタンセスキオレエート等が挙げ
られ、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル
の具体例としては、テトラオレイン酸ポリオキシエチレ
ンソルビット等が挙げられ、ポリオキシエチレンアルキ
ルアミンの具体例としては、ポリオキシエチレンラウリ
ルアミン、ポリオキシエチレンステアリルアミン等が挙
げられ、グリセリン脂肪酸エステルの具体例としては、
ステアリン酸モノグリセライド、オレイン酸モノグリセ
ライド等が挙げられる。また、陰イオン性界面活性剤の
具体例としては、コール酸、デオキシコール酸、ポリオ
キシエチレンアルキルフェノールエーテル硫酸塩、ドデ
シルベンゼンスルホン酸塩、ラウロイルサルコシン等が
挙げられる。The nonionic surfactant and the anionic surfactant used in the present invention may be any one having the property of promoting the cholesterol reaction, and the nonionic surfactant is For example, polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, polyoxyethylene higher alcohol ether, polyoxyethylene fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine , Glycerin fatty acid ester and the like, and examples of the anionic surfactant include cholic acid and its derivatives. Furthermore, specific examples of polyoxyethylene alkyl ethers include polyoxyethylene lauryl ether,
Examples thereof include polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene oleyl ether, and the like. Specific examples of polyoxyethylene alkylphenyl ethers include polyoxyethylene octyl phenyl ether and polyoxyethylene nonyl phenyl ether. Specific examples of the polyoxyethylene fatty acid ester include polyethylene glycol monolaurate, polyethylene glycol monostearate, polyethylene glycol distearate, polyethylene glycol monooleate and the like, and specific examples of the polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester. As, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sol Tan monostearate, polyoxyethylene sorbitan tristearate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, etc., and specific examples of sorbitan fatty acid ester include sorbitan monolaurate and sorbitan monopalmitate. , Sorbitan monostearate, sorbitan distearate, sorbitan tristearate, sorbitan monooleate, sorbitan trioleate, sorbitan sesquioleate, and the like. Specific examples of polyoxyethylene sorbitol fatty acid ester include tetraoleic acid poly Oxyethylene sorbit, etc., and specific examples of the polyoxyethylene alkylamine include polyoxyethylene lauryl amine and polyoxyethylene styrene. Riruamin and the like, specific examples of glycerine fatty acid ester,
Examples thereof include stearic acid monoglyceride and oleic acid monoglyceride. Specific examples of the anionic surfactant include cholic acid, deoxycholic acid, polyoxyethylene alkylphenol ether sulfate, dodecylbenzene sulfonate, lauroyl sarcosine and the like.

【００４３】上記した如き非イオン性界面活性剤の使用
濃度としては、一液法で用いる場合、試液中の濃度とし
て、通常0.0001％〜10％、好ましくは0.001％〜１％で
あり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量
比等により異なるが、第一試液中の濃度としては、通常
0.0001〜５％（W/V）、好ましくは0.001〜0.5％（W/V）
であり、第二試液中の濃度としては、通常0.01〜20％
（W/V）、好ましくは0.05〜５％（W/V）である。The concentration of the nonionic surfactant as described above is usually 0.0001% to 10%, preferably 0.001% to 1% in the test solution when used in the one-liquid method. When used in the method, it depends on the volume ratio of the first and second reagents, etc., but the concentration in the first reagent is usually
0.0001 to 5% (W / V), preferably 0.001 to 0.5% (W / V)
The concentration in the second reagent is usually 0.01 to 20%.
(W / V), preferably 0.05 to 5% (W / V).

【００４４】上記した如き陰イオン性界面活性剤の使用
濃度としては、一液法で用いる場合、試液中の濃度とし
て、通常0.0001％〜10％、好ましくは0.001％〜１％で
あり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試液の液量
比等により異なるが、第一試液中の濃度としては、通常
0.0001〜５％（W/V）、好ましくは0.001〜0.5％（W/V）
であり、第二試液中の濃度としては、通常0.01〜20％
（W/V）、好ましくは0.05〜５％（W/V）である。The concentration of the anionic surfactant as described above is usually 0.0001% to 10%, preferably 0.001% to 1% in the test solution when used in the one-liquid method. When used in the method, it depends on the volume ratio of the first and second reagents, etc., but the concentration in the first reagent is usually
0.0001 to 5% (W / V), preferably 0.001 to 0.5% (W / V)
The concentration in the second reagent is usually 0.01 to 20%.
(W / V), preferably 0.05 to 5% (W / V).

【００４５】また、上記した如き非イオン性界面活性剤
と陰イオン性界面活性剤とを併用した場合の使用濃度と
しては、一液法で用いる場合、試液中の界面活性剤の総
濃度として、通常0.0001％〜20％、好ましくは0.001％
〜２％であり、２液法で用いる場合、第一試液と第二試
液の液量比等により異なるが、第一試液中の界面活性剤
の総濃度としては、通常0.0001〜10％（W/V）、好まし
くは0.001〜１％（W/V）であり、第二試液中の界面活性
剤の総濃度としては、通常0.01〜40％（W/V）、好まし
くは0.05〜10％（W/V）である。尚、上記した如き界面
活性剤は単独または二種以上併用してもよい。When the nonionic surfactant and the anionic surfactant are used in combination as described above, when used in the one-liquid method, the total concentration of the surfactants in the test solution is: Usually 0.0001% to 20%, preferably 0.001%
When used in the two-component method, the total concentration of the surfactant in the first reagent is usually 0.0001 to 10% (W, although it depends on the liquid ratio of the first reagent and the second reagent when used in the two-component method. / V), preferably 0.001 to 1% (W / V), and the total concentration of the surfactant in the second reagent is usually 0.01 to 40% (W / V), preferably 0.05 to 10% (W / V). W / V). The above-mentioned surfactants may be used alone or in combination of two or more kinds.

【００４６】本発明に於いて用いられるＬＤＬ以外のリ
ポタンパクに結合する抗体としては、ＬＤＬ以外のリポ
タンパク中のコレステロールの反応を促進させ得る性質
を有するものであればよく例えば抗ＨＤＬ抗体、抗アポ
リポタンパクＡ抗体、抗アポリポタンパクＣ抗体、抗ア
ポリポタンパクＥ抗体、抗αリポタンパク抗体、抗ＶＬ
ＤＬ抗体、抗プレβリポタンパク抗体等が挙げられる。
尚、これら抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナ
ル抗体でもよく、一種でも或いは２種以上組み合わせて
用いてもよい。また、これらを酵素的或いは化学的に分
解した例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）₂等や、
酵素により標識された酵素標識抗体等も、ＬＤＬ以外の
リポタンパクに結合する抗体に包含される。また、本発
明に於いては、上記した如き抗体に適当な化合物を結合
させてＬＤＬ以外のリポタンパク中のコレステロールの
反応を促進させ得る性質を付加或いは増強させた、修飾
抗体を用いるのが好ましい。このような化合物としては
天然化合物でも化学合成化合物でも良く、例えば糖類、
脂肪酸類、各種配糖体（アルカロイド配糖体、ステロイ
ド配糖体、テルペノイド配糖体）、水溶性の合成高分子
等が挙げられる。尚、これら化合物は、自体公知の方法
により、抗体のアミノ基、カルボキシル基、スルフヒド
リル基と当該化合物中のアミノ基、イミノ基、カルボキ
シル基、アルデヒド基又は２，３−エポキシプロピル基
とを共有結合させるか、或いは修飾のための活性基がな
い場合には、これら化合物を活性化して修飾する方法、
架橋剤を介して修飾する方法により容易に抗体に結合さ
せ得る。The antibody that binds to lipoproteins other than LDL used in the present invention may be any antibody that has the property of promoting the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL, such as anti-HDL antibody and anti-HDL antibody. Apolipoprotein A antibody, anti-apolipoprotein C antibody, anti-apolipoprotein E antibody, anti-α-lipoprotein antibody, anti-VL
DL antibody, anti-pre-β lipoprotein antibody and the like can be mentioned.
These antibodies may be polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, and may be used alone or in combination of two or more. Further, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) ₂ and the like obtained by enzymatically or chemically decomposing these,
Enzyme-labeled antibodies labeled with enzymes and the like are also included in the antibodies that bind to lipoproteins other than LDL. Further, in the present invention, it is preferable to use a modified antibody in which an appropriate compound is bound to the antibody as described above to add or enhance the property capable of promoting the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL. . Such compounds may be natural compounds or chemically synthesized compounds, for example sugars,
Examples thereof include fatty acids, various glycosides (alkaloid glycosides, steroid glycosides, terpenoid glycosides) and water-soluble synthetic polymers. These compounds are covalently bonded to the amino group, carboxyl group, sulfhydryl group of the antibody and the amino group, imino group, carboxyl group, aldehyde group or 2,3-epoxypropyl group of the compound by a method known per se. Or when there is no active group for modification, a method of activating and modifying these compounds,
The antibody can be easily bound by a method of modifying via a cross-linking agent.

【００４７】これら化合物の具体例としては、デキスト
ラン、プルラン、フィコール、デキストリン、シクロデ
キストリン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、
ペクチン酸、プロスベリン酸、アルギン酸、カルボキシ
メチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、ポ
リリジン、アルブミン、ラミナン、リケナン、レクチ
ン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリ
ン、グルコース、ガラクトース、キシロース、フルクト
ース、ラクトース、マルトース、パラチノース、トレハ
ロース、マンノース、フコース、グルクロン酸、グルコ
サミン、ガラクトサミン、イノシトール、シアル酸、ム
ラミン酸、グリチルリチン酸、アルブチン、ダイズイ
ン、ポリビニールアルコール、ポリエチレングリコー
ル、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。上記化合物
のうち、例えばアミノ基、カルボキシル基、イミノ基、
アルデヒド基、スルフヒドリル基等の抗体のアミノ基、
カルボキシル基、スルフヒドリル基に対する活性基を有
しているものはそのまま抗体との結合反応に供してもよ
く、また、活性基を有さないものは、次に挙げる活性基
を導入する方法により活性化して用いればよい。尚、活
性基は、適当な分子長を有する、例えば炭素数１〜６の
アルキレン基等のスペーサーを介して導入されてもよ
い。上記化合物に活性基を導入するための方法として
は、例えば塩化シアヌルを用いるシアヌリル基の導入法
（例えば、Ｊ．Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，４巻，２１２８頁，１９７６年等）、メタ過沃素
酸を用いるアルデヒド基の導入方法（例えば、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，７３巻，
２１２８頁，１９７６年等）、ブロムシアンを用いるイ
ミノ基の導入方法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻，
１３０２頁，１９６７年等）、エピクロルヒドリンを用
いる２，３−エポキシプロピル基の導入方法（例えば、
Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．，５１巻，４７９頁，１９７
０年等）、カルボン酸無水物を用いるカルボキシル基の
導入方法（例えば、特開平５−２６８９５０号公報等）
モノブロモカルボン酸を用いるカルボキシル基の導入方
法（例えば、Ａｒｃ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．，１４７巻，７８８頁，１９７１年等）等の自体公
知の導入方法が挙げられる。活性基を有する化合物と、
抗体とを共有結合させる方法としては、自体公知の結合
方法は全て挙げられ、例えば、反応に関与する反応基
が、アミノ基とカルボキシル基の場合には、例えば、カ
リボジイミド法（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，
２４５巻，３０５９頁，１９７０年等）、活性化エステ
ル法（例えば、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７
巻、１７５頁、１９８４年等）、酸無水物法（例えば、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３７巻，１８２５頁，１
９６２年等）、アジド法（例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．，２５巻，１２９頁，１９７２年等）、カル
ボシキクロリド法（例えば、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ，６
７巻，６６１頁，１９５５年等）、イソシアナート法
（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１０巻，３６７頁，１９６
６年等）、ウッドワード試薬法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１７８巻，６２６頁，
１９６９年等）、ウギ（Ｕｇｉ）反応（例えば、Ａｎｇ
ｅｗ．Ｃｈｅｍ．，７４巻，９頁，１９６２年等）等が
挙げられる。また、該反応基がアミノ基同士の場合に
は、例えば、グルタルアルデヒド法（例えば、Ｅｘｐｅ
ｒｉｅｎｔｉａ，２８巻，９５８頁，１９７３年等）、
アルキル化法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ，１９８巻，２７６頁，１９７０年等）等
が挙げられ、該反応基が水酸基とアミノ基の場合には、
例えば、アルキル化法（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９８巻、２７６頁，１９７０
年等）等が挙げられる。また、該反応基がアミノ基とア
ルデヒド基の場合には、例えば過沃素酸酸化法（例え
ば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，
７３巻，２１２８頁，１９７８年等）等が挙げられ、該
反応基がアミノ基とイミノ基の場合には、例えばブロム
シアン法（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，２１４巻，１３０２
頁，１９６７年等）等が挙げられる。Specific examples of these compounds include dextran, pullulan, ficoll, dextrin, cyclodextrin, polyglutamic acid, polyaspartic acid,
Pectic acid, prosveric acid, alginic acid, carboxymethyl dextran, carboxymethyl cellulose, polylysine, albumin, laminan, lichenan, lectin, dextran sulfate, chondroitin sulfate, heparin, glucose, galactose, xylose, fructose, lactose, maltose, palatinose, trehalose, mannose. , Fucose, glucuronic acid, glucosamine, galactosamine, inositol, sialic acid, muramic acid, glycyrrhizinic acid, arbutin, soybean, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone and the like. Among the above compounds, for example, amino group, carboxyl group, imino group,
Amino group of antibody such as aldehyde group and sulfhydryl group,
Those having an active group for a carboxyl group or a sulfhydryl group may be directly subjected to a binding reaction with an antibody, and those having no active group may be activated by the method of introducing an active group described below. You can use it. The active group may be introduced through a spacer having an appropriate molecular length, such as an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms. Examples of the method for introducing an active group into the above compound include a method for introducing a cyanuryl group using cyanuric chloride (for example, J. Solid-phase Bioche.
m. , 4, 2128, 1976, etc.), a method for introducing an aldehyde group using metaperiodic acid (for example, Pro.
c. Nati. Acad. Sci. USA. , Volume 73,
2128, 1976, etc.), a method for introducing an imino group using bromocyan (for example, Nature, 214,
1302, 1967, etc.), a method of introducing a 2,3-epoxypropyl group using epichlorohydrin (for example,
J. Chromatog. , 51, 479, 197
0 years, etc.), a method for introducing a carboxyl group using a carboxylic acid anhydride (for example, JP-A-5-268950).
A method for introducing a carboxyl group using monobromocarboxylic acid (for example, Arc. Biochem. Biophy).
s. , 147, pp. 788, 1971, etc.) and the like. A compound having an active group,
Examples of the method for covalently binding an antibody include all known binding methods. For example, when the reactive groups involved in the reaction are an amino group and a carboxyl group, for example, the carbodiimide method (for example, J. Biol Chem.,
245, p. 3059, 1970, etc.), activated ester method (for example, Cancer Biochem., 7).
Vol. 175, 1984, etc.), acid anhydride method (for example,
J. Biol. Chem. , 237, 1825, 1
962), the azide method (for example, Eur. J. Bio).
chem. , Vol. 25, p. 129, 1972, etc.), carbocyclide method (eg Angew. Chem, 6).
7, 661, 1955, etc.), isocyanate method (eg, Nature, 210, 367, 196).
6 years), Woodward reagent method (for example, Biochi
m. Biophys. Acta, 178, 626,
1969, etc., Ugi reaction (eg Ang
ew. Chem. , 74, page 9, 1962, etc.) and the like. Further, when the reactive groups are amino groups, for example, the glutaraldehyde method (for example, Expe
Orientia, 28, 958, 1973, etc.),
Alkylation methods (eg, Biochim. Biophy.
s. Acta, vol. 198, page 276, 1970 etc.) and the like, and when the reactive group is a hydroxyl group and an amino group,
For example, alkylation methods (eg, Biochim. Bi
ophys. Acta, 198, 276, 1970
Year etc.) etc. When the reactive group is an amino group and an aldehyde group, for example, a periodate oxidation method (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
73, 2128, 1978, etc., etc., and when the reactive group is an amino group and an imino group, for example, the Bromcia method (for example, Nature, 214, 1302).
Page, 1967, etc.) and the like.

【００４８】上記の如き抗体の使用濃度としては、ＬＤ
Ｌ以外のリポタンパク中のコレステロールの反応を促進
し得る濃度以上であればよく、生体由来試料と直接混合
させる試薬中の濃度として、通常0.001〜10mgAb/ml、好
ましくは0.01〜１mgAb/mlである。The concentration of the antibody used as described above is LD
The concentration in the lipoprotein other than L is not limited as long as it can promote the reaction of cholesterol, and the concentration in the reagent directly mixed with the biological sample is usually 0.001 to 10 mgAb / ml, preferably 0.01 to 1 mgAb / ml. .

【００４９】本発明に於いて用いられる水性媒体として
は、水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液を構成する緩衝
剤としては、pH５〜11の範囲で緩衝作用を有し、コレス
テロール測定反応を阻害しないものであればよく、例え
ばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン、グッドの緩
衝剤、リン酸塩、ホウ酸塩等、通常この分野で用いられ
るものが挙げられ、その使用濃度としては、通常１mM〜
２Ｍ、好ましくは10mM〜１Ｍの範囲であり、また、pH
は、通常５〜11、好ましくは６〜８、より好ましくは７
付近である。Examples of the aqueous medium used in the present invention include water and buffer solutions. The buffer constituting the buffer solution may be any as long as it has a buffering action in the range of pH 5 to 11 and does not inhibit the cholesterol measurement reaction. For example, tris (hydroxymethylaminomethane, Good's buffer, phosphate) , Borate and the like, which are usually used in this field, and the concentration used is usually 1 mM to
2M, preferably 10 mM to 1M, and pH
Is usually 5 to 11, preferably 6 to 8, and more preferably 7
It is in the vicinity.

【００５０】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定用試
液及びキットは、例えば血清や血漿等の生体由来試料中
のＬＤＬ−コレステロ−ルを測定するために使用される
もので、ポリアニオンと両性界面活性剤とを使用する以
外は、上記した如き生体由来試料中のコレステロールを
測定する方法に使用される試薬類、例えばＣＯ、ＣＨ
Ｅ、ＣＨＤ、ＰＯＤ、ＮＡＤ（Ｐ）、被酸化性呈色試
薬、ＣＡＴ、ＣＡＴ阻害剤、ＣＯ阻害剤、ＣＨＤ阻害
剤、水性媒体、要すれば非イオン性界面活性剤、陰イオ
ン性界面活性剤、抗体等を、この分野で通常使用される
濃度範囲で含有するように調製されたものでよく、構成
要件の好ましい態様や使用濃度等は、上で述べた通りで
ある。また、当該キットには、必要に応じて、ＬＤＬ−
コレステロール標準品等が組み合わされていてもよい。
尚、該標準品は、例えばヒトや動物等の血清を用いて調
製された標準血清やこれらに由来するＬＤＬ分画を含有
するもの等を標準品として使用することができる。The LDL-cholesterol measuring reagent and kit of the present invention are used for measuring LDL-cholesterol in a biological sample such as serum or plasma, and contain polyanion and amphoteric surfactant. Reagents other than those used in the method for measuring cholesterol in a biological sample as described above, such as CO and CH
E, CHD, POD, NAD (P), oxidizable color reagent, CAT, CAT inhibitor, CO inhibitor, CHD inhibitor, aqueous medium, non-ionic surfactant if necessary, anionic surfactant The agent, antibody, etc. may be prepared so as to be contained in a concentration range usually used in this field, and preferable aspects of constituent requirements, concentration used, etc. are as described above. In addition, if necessary, the kit may include LDL-
Cholesterol standards and the like may be combined.
As the standard product, for example, a standard serum prepared using human or animal serum or a product containing an LDL fraction derived therefrom can be used as the standard product.

【００５１】本発明のＬＤＬ−コレステロール測定法及
び測定用試液並びに測定用キットは、ポリアニオン及び
両性界面活性剤を共存させることにより、ＬＤＬ−コレ
ステロールの反応を阻害させてＬＤＬ以外のリポタンパ
ク中のコレステロールの反応を先行させた後に、ＬＤＬ
−コレステロールの反応を進行させて、ＬＤＬ−コレス
テロールの反応で生じる過酸化水素又はＮＡＤ（Ｐ）Ｈ
のみを特異的に測定するため、従来法では困難であった
通常の自動分析装置を用いるエンドポイント・アッセイ
でのＬＤＬ−コレステロール測定を可能ならしめるもの
である。The LDL-cholesterol assay method, assay reagent solution and assay kit of the present invention inhibit the reaction of LDL-cholesterol by allowing a polyanion and an amphoteric surfactant to coexist, and thus cholesterol in lipoproteins other than LDL. After preceding the reaction of LDL,
-Hydrogen peroxide or NAD (P) H generated by the reaction of LDL-cholesterol by promoting the reaction of cholesterol
Since it specifically measures only LDL-cholesterol, it is possible to measure LDL-cholesterol in an end point assay using an ordinary automatic analyzer, which has been difficult with the conventional method.

【００５２】本発明の好ましい実施態様としては、例え
ば以下の如きものが挙げられる。即ち、例えば血清、血
漿等の生体試料と、ポリアニオン及び両性界面活性
剤、ＣＨＥ、ＣＯ、デベロッパー、カップラー及び
ＰＯＤ（又はＣＨＤ及びＮＡＤ（Ｐ））及び緩衝剤、
要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界
面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混合し、２〜
40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ₁）を測
定する。次いで該反応液と、緩衝剤要すれば非イオン性
界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤を含有する
第二試液とを混合し、２〜40℃で１〜60分間反応させた
後に吸光度（ＯＤ₂）を測定する。上記のＯＤ₂からＯＤ
₁に由来する値（例えば、ＯＤ₁に液量補正係数を掛けて
求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得ら
れたＯＤ₃を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度
既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして
求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ₃との関係
を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬ
ＤＬ−コレステロールの値を求める。Preferred embodiments of the present invention include the following, for example. That is, for example, biological samples such as serum and plasma, polyanions and amphoteric surfactants, CHE, CO, developers, couplers and PODs (or CHD and NAD (P)) and buffers,
If necessary, a nonionic surfactant or / and an anionic surfactant, a first reagent solution containing an antibody and the like are mixed,
After reacting at 40 ° C. for 1 to 30 minutes, the absorbance (OD ₁ ) is measured. Then, the reaction solution is mixed with a second reagent solution containing a buffer, if necessary, a nonionic surfactant or / and an anionic surfactant, and after reacting at 2 to 40 ° C. for 1 to 60 minutes, Absorbance (OD ₂ ) is measured. OD ₂ to OD above
_The absorbance (OD ₃ ) obtained by subtracting the value derived from ₁ (for example, the value obtained by multiplying OD ₁ by the liquid volume correction coefficient) is obtained, and the obtained OD ₃ is, for example, a standard solution with a known LDL-cholesterol concentration. L in the biological sample was applied to a calibration curve showing the relationship between the LDL-cholesterol concentration and OD ₃ , which was determined in the same manner as above using standard products such as
Determine the value of DL-cholesterol.

【００５３】また、例えば血清、血漿等の生体試料と、
ポリアニオン及び両性界面活性剤、ＣＨＥ、Ｃ
Ｏ、デベロッパー（又はカップラー）及びＰＯＤ、及び
緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰
イオン性界面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混
合し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（Ｏ
Ｄ₁）を測定する。次いで該反応液と、デベロッパー
（又はカップラー）及び緩衝剤、要すれば非イオン性界
面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤を含有する第
二試液とを混合し、２〜40℃で１〜60分間反応させた後
に吸光度（ＯＤ₂）を測定する。上記のＯＤ₂からＯＤ₁
に由来する値（例えば、ＯＤ₁に液量補正係数を掛けて
求めた値）を差し引いた吸光度（ＯＤ₃）を求め、得ら
れたＯＤ₃を、例えば予めＬＤＬ−コレステロール濃度
既知の標準液等の標準品を試料として上記と同様にして
求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度とＯＤ₃との関係
を示す検量線に当てはめることにより、生体試料中のＬ
ＤＬ−コレステロールの値を求める。Further, for example, a biological sample such as serum or plasma,
Polyanion and amphoteric surfactant, CHE, C
O, a developer (or coupler) and POD, and a buffer, if necessary, a nonionic surfactant or / and an anionic surfactant, a first reagent solution containing an antibody, etc. are mixed, and the temperature is 2 to 40 ° C. After reacting for 1 to 30 minutes, the absorbance (O
D ₁ ) is measured. Then, the reaction solution is mixed with a developer (or coupler) and a buffer, and optionally a second reagent solution containing a nonionic surfactant and / or anionic surfactant, and the mixture is mixed at 2 to 40 ° C for 1 absorbance after reacting 60 min (OD ₂₎ is measured. OD ₂ to OD ₁ above
The absorbance (OD ₃ ) obtained by subtracting the value derived from (for example, the value obtained by multiplying OD ₁ by the liquid volume correction coefficient) is obtained, and the obtained OD ₃ is, for example, a standard solution of known LDL-cholesterol concentration in advance. L in the biological sample was applied to a calibration curve showing the relationship between the LDL-cholesterol concentration and OD ₃ , which was determined in the same manner as above using the standard product of
Determine the value of DL-cholesterol.

【００５４】更に、例えば血清、血漿等の生体試料と、
ポリアニオン及び両性界面活性剤、ＣＨＥ、Ｃ
Ｏ、デベロッパー（又はカップラー）、ＣＡＴ及び
緩衝剤、要すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イ
オン性界面活性剤、抗体等を含有する第一試液とを混合
し、２〜40℃で１〜30分間反応させた後に吸光度（ＯＤ
₁）を測定する。次いで該反応液と、カップラー（又は
デベロッパー）、ＰＯＤ、ＣＡＴ阻害剤及び緩衝剤、要
すれば非イオン性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面
活性剤を含有する第二試液とを混合し、２〜40℃で１〜
60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ₂）を測定する。上
記のＯＤ₂からＯＤ₁に由来する値（例えば、ＯＤ₁に補
正係数を掛けて求めた値）を差し引いた吸光度（Ｏ
Ｄ₃）を求め、得られたＯＤ₃を、例えば予めＬＤＬ−コ
レステロール濃度既知の標準液等の標準品を試料として
上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロール濃度
とＯＤ₃との関係を示す検量線に当てはめることによ
り、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値を求め
る。また、１液法の場合は、例えば血清、血漿等の生体
試料と、ポリアニオン及び両性界面活性剤、ＣＨ
Ｅ、ＣＯ、ＰＯＤ及び被酸化性呈色試薬（又はＣＨＤ
及びＮＡＤ（Ｐ））、及び緩衝剤、要すれば非イオン
性界面活性剤又は／及び陰イオン性界面活性剤、抗体等
を含有する試液とを混合し、２〜40℃で１〜30分間反応
させた後に吸光度（ＯＤ_{1 ’}）を測定する。更に、２〜4
0℃で１〜60分間反応させた後に吸光度（ＯＤ_{2 ’}）を測
定する。上記のＯＤ_{2 ’}からＯＤ_{1 ’}を差し引いた吸光度
（ＯＤ_{3 ’}）を求め、得られたＯＤ_{3 ’}を、例えば予めＬ
ＤＬ−コレステロール濃度既知の標準液等の標準品を試
料として上記と同様にして求めた、ＬＤＬ−コレステロ
ール濃度とＯＤ_{3 ’}との関係を示す検量線に当てはめる
ことにより、生体試料中のＬＤＬ−コレステロールの値
を求める。Further, for example, a biological sample such as serum or plasma,
Polyanion and amphoteric surfactant, CHE, C
O, developer (or coupler), CAT and
A buffer, optionally a non-ionic surfactant or / and an animate
Mix with the first reagent solution containing on-surfactant, antibody, etc.
And react at 2-40 ° C for 1-30 minutes and then the absorbance (OD
₁) Is measured. Then, the reaction solution and a coupler (or
Developer), POD, CAT inhibitor and buffer, required
Nonionic surfactant and / or anionic interface
Mix with a second reagent solution containing an activator and
After reacting for 60 minutes, the absorbance (OD₂) Is measured. Up
Note OD₂From OD₁Values derived from (eg OD₁To
Absorbance (O value obtained by multiplying the positive coefficient)
D₃) Was obtained and the obtained OD₃In advance, for example, LDL-co
Use standard products such as standard solutions with known resterol concentrations as samples
LDL-cholesterol concentration determined in the same manner as above
And OD₃By fitting to the calibration curve showing the relationship with
The LDL-cholesterol value in the biological sample
It In the case of the one-liquid method, a living body such as serum or plasma is used.
Sample, polyanion and amphoteric surfactant, CH
E, CO, POD and oxidizable color reagent (or CHD
And NAD (P)), and buffer, if necessary non-ionic
Surfactants and / or anionic surfactants, antibodies, etc.
Mix with a test solution containing
And then the absorbance (OD_{1 '}) Is measured. Furthermore, 2-4
After reacting at 0 ° C for 1 to 60 minutes, the absorbance (OD_{2 '})
Set. OD above_{2 '}From OD_{1 '}Absorbance minus
(OD_{3 '}) Was obtained and the obtained OD_{3 '}Is, for example, L
Try standard products such as standard solutions with known DL-cholesterol concentration
LDL-cholestero obtained as above
Concentration and OD_{3 '}Fit to a calibration curve showing the relationship with
The value of LDL-cholesterol in the biological sample
Ask for.

【００５５】上記の実施態様に於いて、ＯＤ₁（又はＯ
Ｄ_{1 ’}）とＯＤ₂（又はＯＤ_{2 ’}）を測定する時点は、例
えば各リポタンパク分画に対する反応性（反応曲線等）
を検討し、上記範囲から最適な時点を適宜設定すればよ
い。In the above embodiment, OD ₁ (or O
The time point at which D _{1 '} ) and OD ₂ (or OD _{2 '} ) are measured is, for example, the reactivity (reaction curve, etc.) to each lipoprotein fraction.
Then, the optimum time point may be set appropriately from the above range.

【００５６】以下に、実施例及び参考例を挙げて本発明
を更に詳細に説明するが、本発明はこれらにより何ら限
定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００５７】[0057]

〔試薬〕〔reagent〕

（試液１〜１３）ＣＯ（コード番号：C00-321、東洋紡
績(株)製）１U／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成
工業（株）製）１U／ml、N-(2-ヒト゛ロキシ-3-スルホフ゜ロヒ゜ル)-3,
5-シ゛メトキシアニリン（HDAOS）0.5mM、４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ
（コード番号：PEO-302、東洋紡（株）製）1.5U／ml、
所定のポリアニオン 0.04％（W/V）及び所定の両性界面
活性剤0.008％（W/V）を含有する25mM 2-ヒト゛ロキシ-N-トリス
（ヒト゛ロキシメチル）メチル-3-アミノフ゜ロハ゜ンスルホン酸（TAPSO）−NaOH
緩衝液（pH7.0）を試液とした。尚、表１に各試液で用
いたポリアニオン及び両性界面活性剤の具体名を夫々示
す。(Reagents 1 to 13) CO (code number: C00-321, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) 1U / ml, CHE (product number: T-18, manufactured by Asahi Kasei Corporation) 1U / ml, N- (2 -Human oxy-3-sulfopropyl) -3,
5-dimethoxyaniline (HDAOS) 0.5 mM, 4-AA 1 mM, POD
(Code number: PEO-302, Toyobo Co., Ltd.) 1.5U / ml,
25 mM 2-human oxy-N-tris (human oxymethyl) methyl-3-aminoprophyl sulfonic acid (TAPSO) containing the specified polyanion 0.04% (W / V) and the specified amphoteric surfactant 0.008% (W / V) −NaOH
A buffer solution (pH 7.0) was used as a test solution. Table 1 shows the specific names of the polyanion and amphoteric surfactant used in each sample solution.

【００５８】[0058]

【表１】表１ [Table 1] Table 1

【００５９】〔測定条件〕測定パラメータを以下のよう
に設定して測定を行った。 測定方法；１ポイント エンド[３４]−[０] 試料量 ；２．５μｌ 試液量 ；３００μｌ 測定波長；７００／６００ｎｍ 測定温度；３７℃ 〔結果〕試液１〜１３を使用して得られた測定結果を、
図１〜１３に夫々示す。尚、図１〜13に於いて、−□−
はＬＤＬ画分試料について得られた結果を、−○−はＨ
ＤＬ画分試料について得られた結果を、−△−はＶＬＤ
Ｌ画分試料について得られた結果を、また、−●−は生
理食塩水を試料として得られた結果を夫々示す。図１の
結果から明らかな如く、ポリアニオン及び両性界面活性
剤を添加していない試液（試液１）では、試液と混合後
すぐにＬＤＬ、ＨＤＬ及びＶＬＤＬとの反応が開始さ
れ、２〜５分以内で反応はほぼプラトーに達することが
判る。これに対して、図２〜１３から明らかなように、
ポリアニオン及び両性界面活性剤の共存下でリポタンパ
ク中のコレステロールの測定を行うと（試液２〜13）、
ＬＤＬとの反応が阻害されること、即ち、ＨＤＬ、ＶＬ
ＤＬとの反応が殆ど終了しているにも係わらずＬＤＬと
の反応はいまだ進行中であったり（試液２及び３）、或
いはＨＤＬ、ＶＬＤＬとの反応が実質的に終了した後
に、ＬＤＬとの反応が始まる（試液４〜13）ことが判
る。以上のことから、ポリアニオンおよび両性界面活性
剤を共存させることによりＬＤＬ−コレステロールの反
応を遅延或いは一時的に停止させてＬＤＬ以外のリポタ
ンパク中コレステロールの反応を先行させた後に、ＬＤ
Ｌ中コレステロールの反応を進行させることができるこ
と、即ち、ＬＤＬ−コレステロールを特異的に測定し得
ることが判る。[Measurement Conditions] The measurement was performed by setting the measurement parameters as follows. Measurement method: 1 point End [34]-[0] Sample volume; 2.5 μl Reagent volume; 300 μl Measurement wavelength; 700/600 nm Measurement temperature; 37 ° C. [Result] Measurement results obtained using Reagents 1-13 To
1 to 13 respectively. In addition, in FIGS.
Is the result obtained for the LDL fraction sample,-○-is H
The results obtained for the DL fraction samples are -Δ- is VLD
The results obtained for the L fraction sample and-●-show the results obtained using physiological saline as a sample, respectively. As is clear from the results shown in FIG. 1, in the test solution containing no polyanion and amphoteric surfactant (Test solution 1), the reaction with LDL, HDL and VLDL was started immediately after mixing with the test solution, and within 2 to 5 minutes. It turns out that the reaction almost reaches a plateau. On the other hand, as is clear from FIGS.
When cholesterol in lipoproteins is measured in the presence of polyanion and amphoteric surfactant (reagents 2 to 13),
Inhibition of reaction with LDL, ie HDL, VL
Although the reaction with LDL is almost completed, the reaction with LDL is still in progress (reagents 2 and 3), or after the reaction with HDL and VLDL is substantially completed, with LDL. It is understood that the reaction starts (reagents 4 to 13). From the above, by coexisting a polyanion and an amphoteric surfactant, the reaction of LDL-cholesterol is delayed or temporarily stopped to precede the reaction of cholesterol in lipoproteins other than LDL, and then LD
It can be seen that the reaction of cholesterol in L can proceed, that is, LDL-cholesterol can be specifically measured.

【００６０】実施例２ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、血清中のＬＤＬ−コ
レステロール量を測定した。 〔試料〕 新鮮血清10検体 〔試薬〕 （試液１４） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、トリトンＸ−１０
０ 0.02％、４−ＡＡ １mM及びＰＯＤ（コード番号：PE
O-302、東洋紡（株）製）10U／mlを含有する25mM TAPSO
−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；エマルゲン７０９（花王(株)商品名：ホ゜リオキシエチ
レン高級アルコールエーテル）0.5％（W/V）を含有する25mM TAPSO
−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 〔測定条件〕測定パラメータを以下のように設定して測
定を行った。 測定方法；２ポイント エンド[１６]−[３４] 試料量 ；３μｌ Ｒ−１量；２７０μｌ Ｒ−２量；９０μｌ 測定波長；７００／６００ｎｍ 測定温度；３７℃ 〔結果〕結果を表２に示す。Example 2 The amount of LDL-cholesterol in serum was measured by the measuring method of the present invention using a Hitachi 7170 type automatic analyzer [manufactured by Hitachi, Ltd.]. [Sample] 10 samples of fresh serum [Reagent] (Reagent 14) R-1; CO (CHO "Amano VW" Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), heparin 0.03% (W / V), Triton X-10
0 0.02%, 4-AA 1 mM and POD (code number: PE
25 mM TAPSO containing O-302, Toyobo Co., Ltd. 10U / ml
-NaOH buffer (pH 7.0) was designated as R-1. R-2; 25 mM TAPSO containing 0.5% (W / V) of Emulgen 709 (Kao Corporation trade name: polyoxyethylene higher alcohol ether)
-NaOH buffer (pH 7.0) was designated as R-2. [Measurement conditions] Measurement was performed by setting the measurement parameters as follows. Measurement method: 2 points End [16]-[34] Sample amount; 3 μl R-1 amount; 270 μl R-2 amount; 90 μl Measurement wavelength; 700/600 nm Measurement temperature; 37 ° C. [Results] The results are shown in Table 2.

【００６１】参考例１ 実施例２で用いた血清検体について、従来法のＦｒｉｅ
ｄｅｗａｌｄ式によりＬＤＬ−コレステロール値を算出
した。尚、測定操作は、CLINICAL CHEMISTRY, Vol.18,
No.6, p499-502,(1972)に従って行った。 〔結果〕測定結果を表２に併せて示す。Reference Example 1 With respect to the serum sample used in Example 2, Frie of the conventional method was used.
The LDL-cholesterol value was calculated by the Dewald formula. The measurement operation is CLINICAL CHEMISTRY, Vol.18,
No. 6, p499-502, (1972). [Results] The measurement results are also shown in Table 2.

【００６２】[0062]

【表２】表２ [Table 2] Table 2

【００６３】表２の結果から明らかな如く、本発明のポ
リアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１
４）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロール値は、従
来法であるFriedewald式で算出したＬＤＬ−コレステロ
ール値と良好な相関関係を示すこと、即ち、特異的にＬ
ＤＬ−コレステロールを測定し得ることが判る。As is clear from the results shown in Table 2, a reagent containing the polyanion of the present invention and the amphoteric surfactant (Test solution 1)
The LDL-cholesterol value obtained using 4) shows a good correlation with the LDL-cholesterol value calculated by the conventional Friedewald equation, that is, L
It turns out that DL-cholesterol can be measured.

【００６４】実施例３ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、ＢＱ法（Beta quant
ification method）による測定値既知のコントロール血
清〔ＰＢＩ（Pacific Biometrics，Inc．）社製）中の
ＬＤＬ−コレステロール量を測定した。 〔試料〕コントロール血清５検体 〔試薬〕 （試液１５） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、エマルゲン７０５
（花王(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.02％
及びＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム(株)製）1000U／mlを含有
する25mM TAPSO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−１とし
た。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-30
2、東洋紡（株）製）20U／ml、エマルゲン７０９（花王
(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.5％（W/V）
及びＮａＮ₃ 0.1％（W/V）を含有する25mM TAPSO−NaOH
緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （試液１６） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、エマルゲン７０５
（花王(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.02％
及びＰＯＤ（コード番号：PEO-302、東洋紡（株）製）2
0U／mlを含有する25mMTAPSO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ
−１とした。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM及びエマルゲン７０９（花王
(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.5％（W/V）
を含有する25mM TAPSO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２
とした。 〔測定条件〕実施例２同じ。 〔結果〕結果を表３に示す。Example 3 A BQ method (Beta quant) was used according to the measuring method of the present invention using an Hitachi 7170 type automatic analyzer [manufactured by Hitachi, Ltd.].
The amount of LDL-cholesterol in a control serum (PBI (Pacific Biometrics, Inc.)) of which the measurement value was known by the measurement method was measured. [Sample] Control serum 5 samples [Reagent] (Test solution 15) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), Heparin 0.03% (W / V), Emulgen 705
(Kao Corporation trade name: polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.02%
And 25 mM TAPSO-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 1000 U / ml of CAT (manufactured by Berliner Mannheim KK) was designated as R-1. R-2; 4-AA 1 mM, POD (code number: PEO-30
2, Toyobo Co., Ltd. 20U / ml, Emulgen 709 (Kao)
Product name: Polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.5% (W / V)
And 25 mM TAPSO-NaOH containing 0.1% (W / V) of NaN ₃
The buffer solution (pH 7.0) was designated as R-2. (Test solution 16) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), Heparin 0.03% (W / V), Emulgen 705
(Kao Corporation trade name: polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.02%
And POD (code number: PEO-302, Toyobo Co., Ltd.) 2
R of 25 mM TAPSO-NaOH buffer (pH 7.0) containing 0 U / ml
-1 was set. R-2; 4-AA 1 mM and Emulgen 709 (Kao
Product name: Polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.5% (W / V)
Containing 25 mM TAPSO-NaOH buffer (pH 7.0) containing R-2
And [Measurement conditions] The same as in Example 2. [Results] The results are shown in Table 3.

【００６５】[0065]

【表３】表３ [Table 3] Table 3

【００６６】表３の結果から明らかな如く、本発明のポ
リアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１
５及び試液１６）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロ
ール値は、ＢＱ法（Beta quantification method）によ
る測定値が付されたコントロール血清の表示値と殆ど同
等であることが判る。As is clear from the results shown in Table 3, the reagent containing the polyanion of the present invention and the amphoteric surfactant (Test solution 1)
It can be seen that the LDL-cholesterol value obtained by using 5 and Reagent 16) is almost the same as the indicated value of the control serum to which the measured value by the BQ method (Beta quantification method) is added.

【００６７】実施例４ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法により、ＢＱ法（Beta quant
ification method）による測定値既知のコントロール血
清〔ＰＢＩ（Pacific Biometrics，Inc．）社製）中の
ＬＤＬ−コレステロール量を測定した。 〔試料〕実施例３と同じ。 〔試薬〕 （試液１７） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、トリトンＸ−１０
０（HLB：13.5）0.02％及びＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム
(株)製）1000U／mlを含有する25mM 2-モルフォリノエタンスルホン酸
（MES）−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-30
2、東洋紡（株）製）20U／ml、エマルゲン７０９（花王
(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.5％（W/V）
及びＮａＮ₃ 0.1％（W/V）を含有する25mM MES−NaOH緩
衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （試液１８） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、エマルゲン７０５
（花王(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル、HLB：1
2.8）0.02％及びＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム(株)製）1000
U／mlを含有する25mM TAPSO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ
−１とした。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-30
2、東洋紡（株）製）20U／ml、エマルゲン７０９（花王
(株)商品名：ホ゜リオキシエチレン高級アルコールエーテル）0.5％（W/V）
及びＮａＮ₃ 0.1％（W/V）を含有する25mM TAPSO−NaOH
緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （試液１９） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、トリトンＸ−１０
０（HLB：13.5）0.02％及びＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム
(株)製）1000U／mlを含有する25mM ヒ゛ス（2-ヒト゛ロキシエチル）
イミノトリス（ヒト゛ロキシメチル）メタン（Bis-Tris）−NaOH緩衝液（pH
7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-30
2、東洋紡（株）製）20U／ml、トリトンＸ−１００ 0.5
％（W/V）及びＮａＮ₃ 0.1％（W/V）を含有する25mM Bi
s-Tris−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 〔測定条件〕実施例２と同じ。 〔結果〕結果を表４に示す。Example 4 A BQ method (Beta quant) was used according to the measuring method of the present invention using an Hitachi 7170 type automatic analyzer [manufactured by Hitachi, Ltd.].
The amount of LDL-cholesterol in a control serum (PBI (Pacific Biometrics, Inc.)) of which the measurement value was known by the measurement method was measured. [Sample] Same as in Example 3. [Reagent] (Reagent 17) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), heparin 0.03% (W / V), Triton X-10
0 (HLB: 13.5) 0.02% and CAT (Beringer Mannheim)
25 mM 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) -NaOH buffer (pH 7.0) containing 1000 U / ml was used as R-1. R-2; 4-AA 1 mM, POD (code number: PEO-30
2, Toyobo Co., Ltd. 20U / ml, Emulgen 709 (Kao)
Product name: Polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.5% (W / V)
And a 25 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing NaN ₃ 0.1% (W / V) was designated as R-2. (Reagent 18) R-1; CO (CHO "Amano VW" Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), Heparin 0.03% (W / V), Emulgen 705
(Kao Corporation trade name: polyoxyethylene higher alcohol ether, HLB: 1
2.8) 0.02% and CAT (Beringer Mannheim Co., Ltd.) 1000
R of 25 mM TAPSO-NaOH buffer (pH 7.0) containing U / ml
-1 was set. R-2; 4-AA 1 mM, POD (code number: PEO-30
2, Toyobo Co., Ltd. 20U / ml, Emulgen 709 (Kao)
Product name: Polyoxyethylene higher alcohol ether) 0.5% (W / V)
And 25 mM TAPSO-NaOH containing 0.1% (W / V) of NaN ₃
The buffer solution (pH 7.0) was designated as R-2. (Test solution 19) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), heparin 0.03% (W / V), Triton X-10
0 (HLB: 13.5) 0.02% and CAT (Beringer Mannheim)
25 mM bis (2-human oxyethyl) containing 1000 U / ml
Iminotris (human oxymethyl) methane (Bis-Tris) -NaOH buffer (pH
7.0) was designated as R-1. R-2; 4-AA 1 mM, POD (code number: PEO-30
2, Toyobo Co., Ltd.) 20U / ml, Triton X-100 0.5
% MM (W / V) and NaN ₃ 0.1% (W / V) 25 mM Bi
The s-Tris-NaOH buffer (pH 7.0) was designated as R-2. [Measurement conditions] The same as in Example 2. [Results] The results are shown in Table 4.

【００６８】[0068]

【表４】表４ [Table 4] Table 4

【００６９】表４の結果から明らかな如く、本発明のポ
リアニオン及び両性界面活性剤を含有する試薬（試液１
７〜１９）を用いて得られたＬＤＬ−コレステロール値
は、ＢＱ法（Beta quantification method）による測定
値が付されたコントロール血清の表示値と殆ど同等であ
ることが判る。As is clear from the results shown in Table 4, a reagent containing the polyanion of the present invention and the amphoteric surfactant (Test solution 1)
It is understood that the LDL-cholesterol value obtained by using 7 to 19) is almost the same as the indicated value of the control serum to which the measured value by the BQ method (Beta quantification method) is added.

【００７０】参考例２ 自体公知の方法により修飾抗体の作成を行った。 （１）デキストラン修飾抗体の作製 羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）15mlとシ
゛アルテ゛ヒト゛テ゛キストラン300mgとを混合し、50mM リン酸緩衝液
（pH6.0）中、30℃で反応させた後、更に200mgのホ゛ランヒ゜
リシ゛ンを加えて５時間反応させた。この反応液をセロハン
チューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理し、デキス
トラン修飾抗体（10mg protein Ab／ml×12.6ml）を得
た。Reference Example 2 A modified antibody was prepared by a method known per se. (1) Preparation of dextran-modified antibody 15 ml of sheep-derived anti-HDL antibody (10 mg protein Ab / ml) and 300 mg of dialdihitate dextran were mixed and reacted at 30 ° C in 50 mM phosphate buffer (pH 6.0). After that, 200 mg of borane phosphorus was further added and the reaction was carried out for 5 hours. The reaction solution was packed in a cellophane tube, desalted, and concentrated by ultrafiltration to obtain a dextran-modified antibody (10 mg protein Ab / ml × 12.6 ml).

【００７１】（２）ヘパリン修飾抗体の作製 過ヨウ素酸酸化処理したヘパリン 100mgに、6-アミノカフ゜ロン
酸 500mgを加えて透析した。これに羊由来の抗ＨＤＬ抗
体（10mg protein Ab／ml）5mlと1-エチル-3-（3-シ゛メチルアミノ
フ゜ロヒ゜ル）-カルホ゛シ゛イミト゛ 300mgを加え、５℃で一晩反応さ
せた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、
限外濾過濃縮処理し、ヘパリン修飾抗体（10mg protein
Ab／ml×3.6ml）を得た。(2) Preparation of Heparin-Modified Antibody 500 mg of 6-aminocaproic acid was added to 100 mg of periodate-oxidized heparin and dialyzed. To this, 5 ml of sheep-derived anti-HDL antibody (10 mg protein Ab / ml) and 300 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid were added and reacted overnight at 5 ° C. After packing this reaction solution in cellophane tube and desalting,
After ultrafiltration and concentration, heparin-modified antibody (10mg protein
Ab / ml × 3.6 ml) was obtained.

【００７２】（３）アルギン酸修飾抗体の作製 アルギン酸 50mgを20mlの20mM リン酸緩衝液（pH7.0）
に溶解し、これに羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein
Ab／ml）5mlと1-エチル-3-（3-シ゛メチルアミノフ゜ロヒ゜ル）-カルホ゛シ゛イ
ミト゛ 500mgを加え、５℃で一晩反応させた。この反応液
をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処理
し、アルギン酸修飾抗体（10mg proteinAb／ml×3.4m
l）を得た。(3) Preparation of alginic acid-modified antibody 50 mg of alginic acid was added to 20 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 7.0).
, And sheep-derived anti-HDL antibody (10mg protein
Ab / ml) (5 ml) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid 500 mg were added, and the mixture was reacted overnight at 5 ° C. The reaction solution was packed in cellophane tube, desalted, and then concentrated by ultrafiltration to obtain an alginate-modified antibody (10 mg proteinAb / ml × 3.4 m).
l) got.

【００７３】（４）グルクロン酸修飾抗体の作製 羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg protein Ab／ml）10mlと4
00mgのグルクロン酸を0.1M リン酸緩衝液（pH7.0）に溶
解し、250mgのシアンホ゛ロハイト゛ライト゛を加えて37℃で５時間反
応させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩
後、限外濾過濃縮処理し、グルクロン酸修飾抗体（10mg
protein Ab／ml×7.6ml）を得た。(4) Preparation of glucuronic acid-modified antibody 10 ml and 4 of sheep-derived anti-HDL antibody (10 mg protein Ab / ml)
00 mg of glucuronic acid was dissolved in 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0), 250 mg of cyanborohydride was added, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 hours. This reaction solution was packed in cellophane tube, desalted, and concentrated by ultrafiltration to obtain glucuronic acid-modified antibody (10 mg
protein Ab / ml × 7.6 ml) was obtained.

【００７４】（５）ホ゜リク゛ルタミン酸修飾抗体の作製ホ゜リク゛ルタミン 酸 20mgを20mM リン酸緩衝液（pH6.5）４mlに
溶解し、該溶解液に羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10mg prote
in Ab／ml）１mlと1-エチル-3-（3-シ゛メチルアミノフ゜ロヒ゜ル）-カルホ゛
シ゛イミト゛40mgとを加え、５℃で一晩反応させた。この反応
液をセロハンチューブに詰めて脱塩後、限外濾過濃縮処
理し、ホ゜リク゛ルタミン酸修飾抗体を（10mg protein Ab／ml×
0.72ml）を得た。(5) Preparation of polyglutamic acid-modified antibody 20 mg of polyglutamic acid was dissolved in 4 ml of 20 mM phosphate buffer (pH 6.5), and the anti-HDL antibody (10 mg prote
in Ab / ml) and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -carbodiimid 40 mg were added and reacted at 5 ° C. overnight. The reaction solution was packed in a cellophane tube, desalted, and then subjected to ultrafiltration concentration treatment to obtain polyglutamic acid-modified antibody (10 mg protein Ab / ml x
0.72 ml) was obtained.

【００７５】（６）ク゛リチルリチン酸修飾抗体の作製ク゛リチルリチン 酸 100mgを50mM リン酸緩衝液（pH6.5）２mlに
溶解し、該溶解液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム 100mgを
加えて５℃で24時間反応させた後、セファデックスG-25
のカラムで脱塩した。これと羊由来の抗ＨＤＬ抗体（10
mg protein Ab／ml）10mlを混合して30℃で48時間反応
させた。この反応液をセロハンチューブに詰めて脱塩
後、限外濾過濃縮処理し、ク゛リチルリシン酸修飾抗体を（10mg
protein Ab／ml×7.3ml）を得た。(6) Preparation of glycyrrhizinate-modified antibody 100 mg of glycyrrhizinate was dissolved in 2 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 6.5), 100 mg of sodium metaperiodate was added to the solution, and the mixture was reacted at 5 ° C. for 24 hours. After letting go, Sephadex G-25
Column was desalted. This and sheep-derived anti-HDL antibody (10
10 ml of (mg protein Ab / ml) was mixed and reacted at 30 ° C. for 48 hours. This reaction solution was packed in a cellophane tube, desalted, and then concentrated by ultrafiltration to obtain a glycyrrhizinic acid-modified antibody (10 mg).
protein Ab / ml × 7.3 ml) was obtained.

【００７６】実施例５ 日立７１７０形自動分析装置〔（株）日立製作所製〕を
使用して、本発明の測定法によりＬＤＬ−コレステロー
ル測定値を求め、基準法であるＢＱ法でのＬＤＬ−コレ
ステロール測定値との比較を行った。 〔試料〕ＰＢＩ社（Pacific Biometrics，Inc．）より
入手した、ＢＱ法（Beta quantification method）によ
る測定値既知の人血清（トリグリセライド400mg／dl以
下）15検体及び人血清（トリグリセライド400mg／dl以
上）８検体を試料とした。尚、血清中のトリグリセライ
ド量は、該人血清に付された表示値による。 〔試薬〕 （試液２０） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、トリトンＸ−１０
０（HLB：13.5）0.02％及びＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム
(株)製）1000U／mlを含有する25mM TAPSO−NaOH緩衝液
（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；４−ＡＡ １mM、ＰＯＤ（コード番号：PEO-30
2、東洋紡（株）製）20U／ml、トリトンＸ−１００ 0.5
％（W/V）及びＮａＮ₃ 0.1％（W/V）を含有する25mM TA
PSO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−２とした。 （試液２１） Ｒ−１；ＣＯ（CHO“Amano VW”天野製薬（株）製）５U
／ml、ＣＨＥ（製品番号：T-18、旭化成工業（株）製）
５U／ml、ＨＤＡＯＳ １mM、レボンＬＡＧ４０ 0.04％
（W/V）、ヘパリン 0.03％（W/V）、トリトンＸ−１０
０（HLB：13.5）0.02％、ＣＡＴ（ヘ゛ーリンカ゛ー・マンハイム(株)
製）1000U／ml及び参考例２の（４）で得られたグルク
ロン酸修飾抗ＨＤＬ抗体（羊由来）を含有する25mM TAP
SO−NaOH緩衝液（pH7.0）をＲ−１とした。 Ｒ−２；試液２０と同じ。 〔測定条件〕実施例２と同じ。 〔結果〕トリグリセライド400mg／dl以下の血清につい
ての結果を表５に、また、トリグリセライド400mg／dl
以上の血清についての結果を表６に夫々示す。Example 5 An LDL-cholesterol measurement value was obtained by the measuring method of the present invention using an Hitachi 7170 type automatic analyzer (manufactured by Hitachi, Ltd.), and LDL-cholesterol according to the BQ method, which is a standard method. A comparison with the measured value was made. [Sample] Human serum (triglyceride 400 mg / dl or less) 15 samples and human serum (triglyceride 400 mg / dl or more) 15 known by BQ method (Beta quantification method) obtained from PBI (Pacific Biometrics, Inc.) 8 The specimen was used as a sample. The amount of triglyceride in the serum depends on the indicated value given to the human serum. [Reagent] (Reagent 20) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), heparin 0.03% (W / V), Triton X-10
0 (HLB: 13.5) 0.02% and CAT (Beringer Mannheim)
25 mM TAPSO-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 1000 U / ml was used as R-1. R-2; 4-AA 1 mM, POD (code number: PEO-30
2, Toyobo Co., Ltd.) 20U / ml, Triton X-100 0.5
% MM (W / V) and NaN ₃ 0.1% (W / V) in 25 mM TA
The PSO-NaOH buffer solution (pH 7.0) was designated as R-2. (Test solution 21) R-1; CO (CHO "Amano VW" manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) 5U
/ Ml, CHE (product number: T-18, Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd.)
5U / ml, HDAOS 1mM, Levon LAG40 0.04%
(W / V), heparin 0.03% (W / V), Triton X-10
0 (HLB: 13.5) 0.02%, CAT (Beringer Mannheim Co., Ltd.)
25 mM TAP containing 1000 U / ml and the glucuronic acid-modified anti-HDL antibody (derived from sheep) obtained in (4) of Reference Example 2
The SO-NaOH buffer solution (pH 7.0) was designated as R-1. R-2: Same as test solution 20. [Measurement conditions] The same as in Example 2. [Results] Table 5 shows the results for the serum of triglyceride 400 mg / dl or less, and also triglyceride 400 mg / dl.
The results of the above sera are shown in Table 6, respectively.

【００７７】[0077]

【表５】表５ [Table 5] Table 5

【００７８】[0078]

【表６】表６ [Table 6] Table 6

【００７９】表５の結果から、トリグリセライドの値が
400mg／dl以下の血清を検体とした場合は、試液２０及
び試液２１の何れもそのＬＤＬ−コレステロール値は、
ＢＱ法（Beta quantification method）により測定され
た表示値と殆ど同等であることが判る。また、表６の結
果から、トリグリセライドの値が400mg／dl以上の血清
を検体とした場合は、試液２１、即ち、ポリアニオン及
び両性界面活性剤に、更にＬＤＬ以外のリポタンパクに
結合する抗体を共存させて測定を行う方が、より表示値
に近いこと、即ち、よりＬＤＬ−コレステロールを特異
的に測定し得ることが判る。From the results in Table 5, the value of triglyceride is
When serum of 400 mg / dl or less is used as the sample, the LDL-cholesterol value of both Reagent 20 and Reagent 21 is
It can be seen that it is almost equivalent to the display value measured by the BQ method (Beta quantification method). In addition, from the results of Table 6, when serum having a triglyceride value of 400 mg / dl or more was used as a sample, the test solution 21, that is, the polyanion and the amphoteric surfactant coexisted with an antibody that binds to a lipoprotein other than LDL. It can be seen that performing the measurement in such a manner makes the value closer to the displayed value, that is, the LDL-cholesterol can be more specifically measured.

【００８０】[0080]

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は生体由来試料
中のＬＤＬ−コレステロ−ルを特異的に且つ精度良く測
定し得る方法並びにそれに用いられる試薬を提供するも
のであり、本発明を利用することにより、従来の方法で
は不可能であったＬＤＬ−コレステロ−ルを直接、しか
も汎用の自動分析装置を用いて測定し得る。INDUSTRIAL APPLICABILITY As described above, the present invention provides a method for specifically and accurately measuring LDL-cholesterol in a biological sample and a reagent used therefor. By doing so, LDL-cholesterol, which was impossible by the conventional method, can be directly measured using a general-purpose automatic analyzer.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】実施例１に於いて、試液１を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 1 was obtained using Test Solution 1 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図２】実施例１に於いて、試液２を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 2 was obtained using Test Solution 2 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図３】実施例１に於いて、試液３を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 3 was obtained using Test Solution 3 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図４】実施例１に於いて、試液４を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 4 was obtained using Test Solution 4 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図５】実施例１に於いて、試液５を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 5 was obtained by using Test Solution 5 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図６】実施例１に於いて、試液６を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 6 was obtained using Test Solution 6 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図７】実施例１に於いて、試液７を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 7 is a graph obtained by using the reagent solution 7 in Example 1.
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図８】実施例１に於いて、試液８を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 8 was obtained using Test Solution 8 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図９】実施例１に於いて、試液９を用いて得られた、
各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示す。FIG. 9 was obtained using Test Solution 9 in Example 1,
The reaction curve about various lipoprotein fraction samples is shown.

【図１０】実施例１に於いて、試液１０を用いて得られ
た、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示
す。FIG. 10 shows reaction curves for various lipoprotein fraction samples obtained by using Reagent 10 in Example 1.

【図１１】実施例１に於いて、試液１１を用いて得られ
た、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示
す。FIG. 11 shows reaction curves for various lipoprotein fraction samples obtained using Test Solution 11 in Example 1.

【図１２】実施例１に於いて、試液１２を用いて得られ
た、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示
す。FIG. 12 shows reaction curves for various lipoprotein fraction samples obtained by using Reagent 12 in Example 1.

【図１３】実施例１に於いて、試液１３を用いて得られ
た、各種リポタンパク画分試料についての反応曲線を示
す。FIG. 13 shows reaction curves for various lipoprotein fraction samples obtained by using Reagent 13 in Example 1.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

図１〜１３に於いて、−□−は低比重リポタンパク（Ｌ
ＤＬ）画分試料について得られた結果を、−○−は高比
重リポタンパク（ＨＤＬ）画分試料について得られた結
果を、−△−は超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）画分
試料について得られた結果を、また、−●−は生理食塩
水を試料として得られた結果を夫々示す。1 to 13,-□-is a low-density lipoprotein (L
The results obtained for the DL) fraction sample,-○-are the results obtained for the high-density lipoprotein (HDL) fraction sample, and-△-are the results for the ultra-low-density lipoprotein (VLDL) fraction sample. The results are shown, and-●-shows the results obtained using physiological saline as a sample.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/92 Ｂ (72)発明者 二木 政幸 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内 (72)発明者 花田 寿郎 兵庫県尼崎市高田町６番１号 和光純薬工 業株式会社大阪研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI theme code (reference) G01N 33/92 G01N 33/92 B (72) Inventor Masayuki Futaki 6-1 Takada-cho, Amagasaki-shi, Hyogo Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka Research Institute (72) Inventor Toshiro Hanada 6-1, Takadacho, Amagasaki City, Hyogo Prefecture Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Osaka Research Institute

Claims (15)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 生体由来試料をコレステロールエステ
ラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又はコレス
テロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又
はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいて生体由来試料中のコレステ
ロールを測定する方法に於いて、反応系にポリアニオン
及び両性界面活性剤を存在させることを特徴とする、低
比重リポタンパク中のコレステロールの測定法。1. Cholesterol in a biological sample based on hydrogen peroxide or NAD (P) H produced by reacting a biological sample with cholesterol esterase and cholesterol oxidase, or cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and NAD (P) H. A method for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, which comprises allowing a polyanion and an amphoteric surfactant to be present in the reaction system. 【請求項２】 生体由来試料とポリアニオン及び両性界
面活性剤を接触させた後、相異なる二つの時点での吸光
度を測定し、これらに基づいて生体由来試料中の低比重
リポタンパク中のコレステロール量を算出する、請求項
１に記載の方法。2. After contacting a biological sample with a polyanion and an amphoteric surfactant, the absorbances at two different time points are measured, and the amount of cholesterol in low-density lipoprotein in the biological sample is measured based on the measured absorbances. The method according to claim 1, wherein 【請求項３】 生体由来試料とポリアニオン及び両性界
面活性剤を接触させ、低比重リポタンパク以外のリポタ
ンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了し、且
つ低比重リポタンパク中のコレステロールの反応が開始
される前に反応系の吸光度を測定し、更に低比重リポタ
ンパク中のコレステロールの反応が実質的に終了した後
に再度反応系の吸光度を測定し、これらの結果に基づい
て生体由来試料中の低比重リポタンパク中のコレステロ
ール量を算出する、請求項２に記載の方法。3. When a biological sample is brought into contact with a polyanion and an amphoteric surfactant, the reaction of cholesterol in lipoproteins other than low-density lipoprotein is substantially completed, and the reaction of cholesterol in low-density lipoprotein is The absorbance of the reaction system is measured before it is started, and the absorbance of the reaction system is measured again after the reaction of cholesterol in the low-density lipoprotein is substantially completed, and based on these results, the biological sample The method according to claim 2, wherein the amount of cholesterol in the low-density lipoprotein is calculated. 【請求項４】 ２試液法で測定を行う、請求項１〜３に
記載の方法。4. The method according to claim 1, wherein the measurement is carried out by a two-reagent method. 【請求項５】 第一試液にカタラーゼが含まれ、第二試
液にカタラーゼ阻害剤が含まれる、請求項４に記載の方
法。5. The method according to claim 4, wherein the first reagent contains catalase and the second reagent contains a catalase inhibitor. 【請求項６】 更に、非イオン性界面活性剤又は／及び
陰イオン性界面活性剤の共存下に測定を行う、請求項１
〜５に記載の測定法。6. The measurement is further carried out in the presence of a nonionic surfactant and / or an anionic surfactant.
~ The measurement method according to 5 above. 【請求項７】 更に、低比重リポタンパク以外のリポタ
ンパクに結合する抗体の共存下に測定を行う、請求項１
〜６に記載の方法。7. The measurement is further carried out in the presence of an antibody that binds to a lipoprotein other than the low-density lipoprotein.
~ 6. 【請求項８】 生体由来試料をコレステロールエステ
ラーゼ及びコレステロールオキシダーゼ、又はコレス
テロールエステラーゼ、コレステロールデヒドロゲナー
ゼ及びＮＡＤ（Ｐ）と反応させ、生成する過酸化水素又
はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに基づいて生体由来試料中のコレステ
ロールを測定するための試薬に、ポリアニオン及び両性
界面活性剤を含有させてなることを特徴とする、低比重
リポタンパク中のコレステロール測定用試薬。8. Cholesterol in a biological sample based on hydrogen peroxide or NAD (P) H produced by reacting the biological sample with cholesterol esterase and cholesterol oxidase, or cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase and NAD (P) H. A reagent for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, which comprises a polyanion and an amphoteric surfactant in the reagent for measuring. 【請求項９】 更に、非イオン性界面活性剤又は／及び
陰イオン性界面活性剤を含有させてなる、請求項８に記
載の試薬。9. The reagent according to claim 8, which further comprises a nonionic surfactant and / or an anionic surfactant. 【請求項１０】 更に、低比重リポタンパク以外のリポ
タンパクに結合する抗体を含有させてなる、請求項８又
は９に記載の試薬。10. The reagent according to claim 8 or 9, further comprising an antibody that binds to a lipoprotein other than the low-density lipoprotein. 【請求項１１】 ポリアニオン及び両性界面活性剤、
コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びカップラー又は／及
びデベロッパー、及び水性媒体を含んでなる第一試液
と、水性媒体及び要すればデベロッパー又はカップラー
を含んでなる第二試液とからなる、低比重リポタンパク
中のコレステロール測定用キット。11. A polyanion and amphoteric surfactant,
A low specific gravity lipoprotein comprising a first reagent solution containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, peroxidase, and a coupler or / and a developer, and an aqueous medium, and a second reagent solution containing an aqueous medium and optionally a developer or coupler. Kit for measuring cholesterol in protein. 【請求項１２】 ポリアニオン及び両性界面活性剤、
コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキ
シダーゼ、カタラーゼ、及び水性媒体を含んでなる
第一試液と、カタラーゼ阻害剤と水性媒体とを含んでな
る第二試液とからなるものであって、ペルオキシダー
ゼ、カップラー、デベロッパーが夫々第一試液と第二試
液の少なくとも一方に含まれている、低比重リポタンパ
ク中のコレステロール測定用キット。12. A polyanion and amphoteric surfactant,
A first reagent solution containing cholesterol esterase, cholesterol oxidase, catalase, and an aqueous medium, and a second reagent solution containing a catalase inhibitor and an aqueous medium, each of which comprises a peroxidase, a coupler, and a developer. A kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein contained in at least one of a first test solution and a second test solution. 【請求項１３】 ポリアニオン、両性界面活性剤、
コレステロールエステラーゼ、コレステロールデヒ
ドロゲナーゼ、ＮＡＤ（Ｐ）、及び水性媒体を含ん
でなる第一試液と、水性媒体を含んでなる第二試液と
からなる、低比重リポタンパク中のコレステロール測定
用キット。13. A polyanion, an amphoteric surfactant,
A kit for measuring cholesterol in low-density lipoprotein, comprising a first reagent solution containing cholesterol esterase, cholesterol dehydrogenase, NAD (P), and an aqueous medium, and a second reagent solution containing an aqueous medium. 【請求項１４】 更に、非イオン性界面活性剤又は／及
び陰イオン性界面活性剤が夫々第一試液と第二試液の少
なくとも一方に含まれている、請求項１１〜１３に記載
のキット。14. The kit according to claim 11, further comprising a nonionic surfactant and / or an anionic surfactant in at least one of the first reagent solution and the second reagent solution, respectively. 【請求項１５】 第一試液が、更に低比重リポタンパク
以外のリポタンパクに結合する抗体を含むものである、
請求項１１〜１４に記載のキット。15. The first reagent solution further contains an antibody that binds to a lipoprotein other than the low-density lipoprotein,
The kit according to claim 11.