JPH1075786A - Primer for amplifying specific part on hybridized type gene - Google Patents
Primer for amplifying specific part on hybridized type geneInfo
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- JPH1075786A JPH1075786A JP8231066A JP23106696A JPH1075786A JP H1075786 A JPH1075786 A JP H1075786A JP 8231066 A JP8231066 A JP 8231066A JP 23106696 A JP23106696 A JP 23106696A JP H1075786 A JPH1075786 A JP H1075786A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、菌類の交配型遺伝
子上に存在する特定の塩基配列を増幅するためのプライ
マーに関する。より詳細には、菌類の交配型遺伝子上に
存在するＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボックスを）増幅する
ためのプライマー、このプライマーを用いた菌類の交配
型の識別方法、およびこのプライマーを用いて増幅した
ＤＮＡ断片の塩基配列を用いた菌の進化の推測方法に関
する。[0001] The present invention relates to a primer for amplifying a specific nucleotide sequence present on a mating type gene of a fungus. More specifically, a primer for amplifying a DNA binding site (HMG box) present on a fungal mating type gene, a method for identifying a fungal mating type using the primer, and a DNA amplified using the primer The present invention relates to a method for estimating the evolution of a bacterium using a fragment base sequence.
【０００２】[0002]
【従来の技術】菌類は分類学上菌界と呼ばれるが、この
菌類は、通常その生活環のほとんどを単相（n ）で経過
する。しかし、これらのうちには、細胞融合や核融合に
よって複相（２n ）のステージを作り、組み換え等の後
単相（n ）に戻るものがある。こうした複相世代は完全
世代と称される。菌類は、完全世代を形成するか否かで
２つのグループに分けることができる。１つは、完全世
代を形成するsexualなグループであり、他の１つは完全
世代を形成しないasexual なグループである。sexualな
グループは、完全世代の形成方法によって、さらに２つ
のグループに分けることができる。すなわち、２つの交
配型の株の交配により完全世代を形成するヘテロタリッ
クなグループと、交配を必要としないホモタリックなグ
ループとに分けられる。BACKGROUND OF THE INVENTION Fungi are taxonomically referred to as the fungal kingdom, and usually pass most of their life cycle in a single phase (n). However, among these, there are those that form a biphasic (2n) stage by cell fusion or nuclear fusion and return to monophasic (n) after recombination or the like. Such a duplex generation is referred to as a full generation. Fungi can be divided into two groups depending on whether they form a complete generation. One is a sexual group that does not form a full generation, and the other is an asexual group that does not form a full generation. Sexual groups can be further divided into two groups, depending on how the full generation is formed. That is, it is divided into a heterothalic group that forms a complete generation by crossing two crossing type strains, and a homothalic group that does not require crossing.
【０００３】これらヘテロタリックな菌類のうち数種か
ら交配型を決定する交配型遺伝子が単離されている。こ
うした交配型遺伝子が単離された菌類としては、Cochli
obolus heterostrophus 、Neurospora crassa およびPo
dospora anserina等を挙げることができる。そして、こ
れらの菌類からはMAT1とMAT2、mta-1 とmtA-1 、mat+と
mat-という相対立する２つずつの交配型遺伝子が単離さ
れ、これらの塩基配列およびアミノ酸配列が決定され、
報告されている。[0003] Among these heterothallic fungi, mating-type genes that determine the mating type have been isolated from several species. Fungi from which such mating-type genes have been isolated include Cochli
obolus heterostrophus, Neurospora crassa and Po
dospora anserina and the like. And from these fungi, MAT1 and MAT2, mta-1 and mtA-1, mat +
Two mating-type genes, mat-, which stand opposite each other, were isolated, their base sequences and amino acid sequences were determined,
It has been reported.
【０００４】既報の交配型遺伝子の塩基配列情報より、
２つの交配型遺伝子の片方の上に共通してＤＮＡ結合部
位（ＨＭＧボックス）が存在すること、および塩基配列
がその一部で比較的類似していることが明らかになっ
た。ＨＭＧボックスが存在するのは、上記のC. heteros
trophus ではmat2、N. crassa ではmta-1 、そしてP. a
nserina ではmat+(FPR1)の上である。こうした交配型遺
伝子の片方の上に存在するＨＭＧボックスのアミノ酸配
列を図２に示す。図２中にこれらの配列に共通する部分
を枠を付けて示したが、塩基配列もその一部で比較的類
似している。[0004] From the previously reported nucleotide sequence information of mating type genes,
It was revealed that a DNA binding site (HMG box) was present in common on one of the two mating-type genes, and that the nucleotide sequences were relatively similar in part. The HMG box is present in the above C. heteros
mat2 in trophus, mta-1 in N. crassa, and P. a
In nserina, it is on mat + (FPR1). FIG. 2 shows the amino acid sequence of the HMG box present on one of the mating type genes. Although portions common to these sequences are shown with a frame in FIG. 2, the base sequences are relatively similar in part.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】上述したように、これ
までは、数種の交配型遺伝子上のＨＭＧボックスの塩基
配列およびアミノ酸配列が明らかにされたに過ぎない。
菌類の交配型遺伝子を得るためには、膨大な時間を要
し、またも煩雑な操作が必要であった。さらに、交配型
遺伝子の全長や周囲のクローニング、あるいはシークエ
ンシングを行うことも困難であった。As described above, only the nucleotide and amino acid sequences of the HMG box on several types of mating-type genes have been disclosed so far.
In order to obtain a cross-type gene of a fungus, an enormous amount of time was required, and a complicated operation was required. Furthermore, it has been difficult to clone or sequence the full length and surroundings of the hybrid gene.
【０００６】また、ヘテロタリックな菌類の交配型の相
違を調べて、こうした菌類の交配型の検定、あるいは識
別をすることができないという問題点があった。この結
果、菌類の完全世代であるきのこなどを交配する場合に
は、交配型の異なる２つの株が必要であるが、交配型の
識別ができないために生産効率を挙げることが難しかっ
た。さらに、交配が不可能な菌類、すなわち、ホモタリ
ックな菌類およびasexualな菌類では、交配型遺伝子の
存在を調べることもできず、単離を行うこともできなか
った。さらにまた、菌類の分類や進化の過程の推測など
の点に関しても問題が残されていた。Another problem is that it is not possible to examine or discriminate the mating type of such fungi by examining the difference in the mating type of the heterothallic fungus. As a result, when crossing a mushroom or the like which is a full generation of fungi, two strains having different crossing types are required, but it has been difficult to increase the production efficiency because the crossing type cannot be identified. Furthermore, in the case of fungi that cannot be crossed, that is, homothallic fungi and asexual fungi, the existence of mating-type genes could not be examined and isolation could not be performed. Furthermore, there still remain problems regarding the classification of fungi and estimation of the evolution process.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】以上のような課題を解決
すべく、本発明の発明者は鋭意研究を進め、菌類の片方
の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部位が保存性が高く、塩
基配列に一部で類似することを見い出し、これに基づい
て本発明を完成したものである。すなわち、本発明の第
一の態様は、菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結
合部位を増幅するためのプライマーである。また、上記
プライマーは図１に示す塩基配列からなるオリゴマーで
あることを特徴とする。Means for Solving the Problems To solve the above problems, the inventors of the present invention have made intensive studies and found that the DNA binding site on one of the mating type genes of fungi is highly conserved and the base sequence Have been found to be partially similar to the above, and the present invention has been completed based on this. That is, a first aspect of the present invention is a primer for amplifying a DNA binding site present on a mating gene of a fungus. Further, the primer is an oligomer having the base sequence shown in FIG.
【０００８】本発明の第二の態様は、菌類の交配型遺伝
子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライ
マーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、ホモタリッ
クまたは完全世代を形成しない菌類から交配型遺伝子を
単離する方法である。また、上記単離方法で使用される
前記プライマーが、図１に示す塩基配列からなるオリゴ
マーであることを特徴とする。本発明の第三の態様は、
菌類の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅
するためのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を
行い、前記菌類の片方の交配型遺伝子上に存在するＤＮ
Ａ結合部位を増幅することによって菌類の交配型を識別
する方法である。また、上記識別方法で使用されるプラ
イマーは図１に示す塩基配列からなるオリゴマーである
ことを特徴とする。[0008] In a second aspect of the present invention, a polymerase chain reaction is carried out using a primer for amplifying a DNA binding site present on a mating type gene of a fungus, so that a hybrid type from a fungus that does not form a homothallic or complete generation can be obtained. This is a method for isolating a gene. Further, the primer used in the isolation method is an oligomer having the base sequence shown in FIG. A third aspect of the present invention provides:
A polymerase chain reaction is carried out using primers for amplifying a DNA binding site present on the hybrid gene of the fungus, and the DN present on one of the hybrid genes of the fungus is detected.
This is a method for identifying the mating type of fungi by amplifying the A-binding site. Further, the primer used in the above identification method is an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
【０００９】本発明の第四の態様は、菌類の交配型遺伝
子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅するためのプライ
マーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行い、前記菌類の
片方の交配型遺伝子上に存在するＤＮＡ結合部位を増幅
する工程と、前記増幅されたＤＮＡ結合部位を比較する
工程とを有する菌の進化の推測方法である。上記菌の進
化の推測方法において使用されるプライマーは、図１に
示す塩基配列からなるオリゴマーであることを特徴とす
る。[0009] In a fourth aspect of the present invention, a polymerase chain reaction is carried out using a primer for amplifying a DNA binding site present on a hybrid gene of a fungus, and the polymerase chain reaction is performed on one of the hybrid genes of the fungus. And a step of comparing the amplified DNA binding site. The primer used in the method for estimating the evolution of the bacterium is characterized by being an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
【００１０】[0010]
【発明の実施の形態】以下に本発明を具体的に説明す
る。本発明において用いられる菌類は、sexualなグルー
プに属する菌類、asexualなグループに属する菌類のい
ずれをも使用することができる。特に、asexual なグル
ープに属する菌類およびsexualなグループに属する菌類
のうち、ホモタリックな菌類を使用することができると
いう利点を有する。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The present invention will be specifically described below. As the fungi used in the present invention, both fungi belonging to the sexual group and fungi belonging to the asexual group can be used. In particular, among the fungi belonging to the asexual group and the fungi belonging to the sexual group, there is an advantage that homothallic fungi can be used.
【００１１】本発明においては、上記菌類の交配型遺伝
子上のＤＮＡ結合部位を所定の塩基配列からなるＤＮＡ
オリゴマーを設計、作製し、これをプライマーとして所
定のＰＣＲ条件の下で増幅する。菌類の片方の交配型遺
伝子上に共通して存在するＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボッ
クス）のアミノ酸配列を図２に示す。図２中、Ch MAT2
はCochliobolus heterostrophus の交配型遺伝子である
MAT2を表わし、以下同様に、Ncmt a-1はNeurospora cra
ssa のmt a-1、PaFPR1はPodospora anserinaのmat+(FPR
1)、SpmatMc はSchizosaccharomyces pombe のmat-(M
c)、そしてHuSRYはhuman のSRY を表わす。枠を付けた
部分は、これら５種類の各交配型遺伝子上のアミノ酸配
列の類似性の高い部分を示す。上記プライマーは、完全
世代を形成するグループに属する菌類に存在する交配型
遺伝子の片方の交配型遺伝子上にあり、上記のようにア
ミノ酸配列からそれらの塩基配列が明らかにされたＨＭ
Ｇボックスの塩基配列を元に作製することができる。Co
chliobolus spp.(Loculoascomycetes 綱) あるいはNeur
ospora crassa(Pyrenomycetes 綱) の交配型遺伝子上に
あるＨＭＧボックスの塩基配列（図２）などを、好適に
使用することができる。[0011] In the present invention, the DNA binding site on the mating type gene of the fungus is a DNA having a predetermined base sequence.
An oligomer is designed and prepared, and is amplified under predetermined PCR conditions using the oligomer as a primer. FIG. 2 shows the amino acid sequence of a DNA binding site (HMG box) commonly present on one mating type gene of fungi. In FIG. 2, Ch MAT2
Is a cross-type gene of Cochliobolus heterostrophus
Ncmt a-1 represents Neurospora cra
ssa mt a-1 and PaFPR1 are Podospora anserina mat + (FPR
1), SpmatMc is mat- (M) of Schizosaccharomyces pombe.
c), and HuSRY represents human SRY. The framed portions indicate portions with high similarity of amino acid sequences on each of these five types of mating type genes. The above primer is located on one of the mating-type genes of the mating-type genes present in the fungi belonging to the group forming the complete generation, and HM whose nucleotide sequence has been determined from the amino acid sequence as described above is used.
It can be prepared based on the base sequence of the G box. Co
chliobolus spp. (Class Loculoascomycetes) or Neuro
The base sequence of the HMG box (FIG. 2) on the mating type gene of ospora crassa (Class Pyrenomycetes) can be suitably used.
【００１２】上記プライマーは、ＨＭＧボックスの塩基
配列を増幅させることができるものであればよく、特に
長さは限定されないが、ターゲット遺伝子を特異的に増
加させやすいとの理由から18〜30塩基程度であることが
好ましい。特に、21〜23塩基程度にすると、上記プライ
マーの設計に使用した菌類のＨＭＧボックスの塩基配列
とある程度共通部分を有する他の菌類のＨＭＧボックス
の増幅にも使用できるプライマーを得ることができる。The above primer may be any one capable of amplifying the base sequence of the HMG box, and is not particularly limited in length, but is preferably about 18 to 30 bases because it is easy to specifically increase the target gene. It is preferred that In particular, when it is about 21 to 23 bases, it is possible to obtain a primer which can be used for amplifying the HMG box of another fungus having a part in common with the base sequence of the HMG box of the fungus used for designing the primer.
【００１３】上記プライマーの塩基配列を修飾して、他
の菌類のＨＭＧボックスの増幅にも使用できるプライマ
ーとするためには、他の菌類の遺伝子上にあるＨＭＧボ
ックスの塩基配列を以下のようにして推定してこれらを
用いる。すなわち、図２から推定される菌類のＨＭＧボ
ックスの共通部分を、上述したC. heterostrophus とN.
crassa のＨＭＧボックスのアミノ酸を基本にし、上記
プライマーのこの部分に対する塩基配列を仮定する。つ
いで、各アミノ酸の第三コドンの一般化等により修飾す
べき部分を確定し、プライマー全体の塩基配列を決定し
て、他の菌類のＨＭＧボックスの増幅にも使用できるプ
ライマーを設計することができる。In order to modify the base sequence of the above primer so that it can be used for amplification of the HMG box of another fungus, the base sequence of the HMG box on the gene of another fungus is as follows. These are estimated and used. That is, the common part of the fungal HMG box deduced from FIG.
Based on the amino acids of the HMG box of crassa, the base sequence for this part of the primer is assumed. Then, the portion to be modified is determined by generalization of the third codon of each amino acid, etc., the base sequence of the entire primer is determined, and a primer that can be used for amplification of the HMG box of other fungi can be designed. .
【００１４】こうしたプライマーは、ＤＮＡ合成機を用
いて常法に従って合成することができる。このようにし
て得られたプライマーを脱塩し、プライマーとして使用
する。このようにして得たプライマーと、所望の菌類の
染色体ＤＮＡを鋳型として用いて、所定の条件でポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なう。例えば、10mMのTr
is-HCl(pH8.3) 、50mMのKCl 、2.5mM のMgCl2 、 0.2 μ
M のdNTPs 、 2μM のプライマー、0.25μl のmpli Taq
DNAポリメラーゼ（Perkin-Elmer社）および約20mgの菌
類の染色体ＤＮＡを含む50μl の混合液を用いて、以下
の温度条件で30サイクル程度行う。90℃ ２分、（94℃
１分，47-55 ℃ 30秒，72℃ １分）×30〜35サイク
ル、72℃ １分。These primers can be synthesized using a DNA synthesizer according to a conventional method. The primer thus obtained is desalted and used as a primer. Using the primer thus obtained and chromosomal DNA of a desired fungus as a template, a polymerase chain reaction (PCR) is performed under predetermined conditions. For example, 10mM Tr
is-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 μ
M dNTPs, 2 μM primer, 0.25 μl mpli Taq
Using a mixture of DNA polymerase (Perkin-Elmer) and 50 μl of a chromosomal DNA of about 20 mg of fungi, about 30 cycles are performed under the following temperature conditions. 90 ° C for 2 minutes, (94 ° C
1 minute, 47-55 ° C 30 seconds, 72 ° C 1 minute) × 30-35 cycles, 72 ° C 1 minute.
【００１５】以上のようにして、菌類の交配型遺伝子上
に存在するＨＭＧボックスを増幅させることができ、こ
れによって交配型遺伝子の一部をクローンし、塩基配列
を決定する。特に、本発明のプライマーを用いると、従
来、交配型遺伝子が存在するかどうかを調べることもで
きず、交配型遺伝子を単離することもできなかった交配
が不可能な菌類、すなわち、ホモタリックな菌類あるい
はasexual な菌類について、これらの菌類が交配型遺伝
子上にＤＮＡ結合部位を有するかを調べることが可能と
なるという利点がある。As described above, the HMG box existing on the hybrid gene of fungi can be amplified, whereby a part of the hybrid gene is cloned and its nucleotide sequence is determined. In particular, with the use of the primers of the present invention, it has not been possible to determine whether or not a hybrid gene is present, and it is not possible to isolate the hybrid gene. For fungi or asexual fungi, there is an advantage that it is possible to examine whether these fungi have a DNA binding site on the mating type gene.
【００１６】さらに、これらのＤＮＡ結合部位から増幅
されたＤＮＡ断片に関するデータに基づいて、TAIL-PCR
法などの様々な方法を採用することにより、上記交配型
遺伝子のさらに長い部分をクローンすると、交配型遺伝
子の全長が得られる。ここでTAIL-PCR法とは、Liu ら(G
enomics,25:674,1995)が報告した方法で、既知配列情報
に従ってデザインした特異プライマーとランダムプライ
マーを利用して既知配列の外側の所望のＤＮＡ断片を得
る方法である。Further, based on data on DNA fragments amplified from these DNA binding sites, TAIL-PCR
By employing various methods such as the above method, by cloning a longer portion of the above-mentioned hybrid gene, the full length of the hybrid gene can be obtained. Here, the TAIL-PCR method refers to Liu et al. (G
enomics, 25: 674, 1995), using a specific primer and a random primer designed in accordance with known sequence information to obtain a desired DNA fragment outside the known sequence.
【００１７】すなわち、決定されたＨＭＧボックスの塩
基配列に従って上流、下流方向に複数の20〜25塩基の特
異プライマーをデザインし、これと14〜16塩基のランダ
ムプライマー（ＡＤプライマー）を用いて、表４の条件
で複数回ポリメラーゼ連鎖反応を行うことでＨＭＧボッ
クス外側の遺伝子を上流、下流それぞれ増幅させること
ができ、より長い遺伝子配列を得ることができる。所望
の菌類の交配型遺伝子から増幅されたＤＮＡ断片につい
てクローンした後、ジデオキシ法、マクサムギルバート
法などを用いてこれらのＤＮＡ断片の塩基配列を決定す
る。すなわち、ＤＮＡ断片をクローンしたベクター上あ
るいは増幅に用いた特異プライマーにより増幅された断
片を電気泳動で分離、あるいはＤＮＡを特異的に切断し
ながら電気泳動で分離して、塩基配列を決定する。That is, a plurality of specific primers of 20 to 25 bases are designed in the upstream and downstream directions in accordance with the determined base sequence of the HMG box, and a random primer (AD primer) of 14 to 16 bases is used. By performing the polymerase chain reaction a plurality of times under the conditions of 4, a gene outside the HMG box can be amplified upstream and downstream, respectively, and a longer gene sequence can be obtained. After cloning the DNA fragments amplified from the mating-type gene of the desired fungus, the base sequences of these DNA fragments are determined using the dideoxy method, the Maxam-Gilbert method, or the like. That is, the base sequence is determined by separating the fragment amplified on the vector from which the DNA fragment was cloned or by the specific primer used for amplification or by electrophoresis while specifically cutting the DNA.
【００１８】本発明のプライマーを使用すると、ヘテロ
タリックな菌類の片方の交配型遺伝子上のＤＮＡ結合部
位が増幅されるので、ここでＤＮＡ結合部位が増幅され
る株と増幅されない株とに分けることができる。したが
って、増幅される株とされない株とでは交配型が異なる
ことになり、この相違を利用してこれら菌類の交配型を
識別する。特に、交配型の異なる２つの株の交配を行う
必要がある場合には、交配型を容易に識別できるので、
こうした場合に好適である。さらに、各種の菌から上記
のようにして増幅し、こうして得られたＤＮＡ結合部位
の塩基配列を比較することにより、菌類の分類、進化の
過程を推測する。すなわち、塩基配列やアミノ酸配列の
相違の度合を時間軸で計算することで、菌の近縁性や種
としての分化時期を数的に導くことにより、この推測を
行う。When the primer of the present invention is used, the DNA-binding site on one of the mating-type genes of a heterothallic fungus is amplified. Therefore, the DNA-binding site is divided into a strain where the DNA-binding site is amplified and a strain where the DNA-binding site is not amplified. Can be. Therefore, the mating type differs between the strain to be amplified and the non-amplified strain, and the difference is used to identify the mating type of these fungi. In particular, when it is necessary to cross two strains having different mating types, the crossing type can be easily identified.
It is suitable in such a case. Furthermore, by amplifying from various bacteria as described above and comparing the nucleotide sequences of the DNA binding sites thus obtained, the process of classification and evolution of fungi is estimated. That is, this estimation is made by calculating the degree of difference between the base sequence and the amino acid sequence on the time axis, thereby numerically deriving the closeness of the bacterium and the differentiation time as a species.
【００１９】[0019]
（実施例１）プライマーの調製 （１）プライマーの設計 Cochliobolus spp.(Loculoascomycetes 綱) およびNeur
ospora crassa(Pyrenomycetes 綱) の交配型遺伝子上に
は、多くの微生物で保存性の高いＤＮＡ結合部位（ＨＭ
Ｇボックス）が存在する。Cochliobolus spp. のC. het
erostrophus の一方の交配型遺伝子上の MAT2 およびN.
crassa のそれのmt a-1の交配型遺伝子上にあるＨＭＧ
ボックスの位置を図３に示した。これらの配列を基に、
このＤＮＡ結合部位のインナーフラグメントを増幅する
ために、21-23merの２組のオリゴマーのセット、ChHMG1
およびChHMG2、NcHMG1およびNcHMG2をＰＣＲプライマー
用に設計した。(Example 1) Preparation of primers (1) Design of primers Cochliobolus spp. (Class Loculoascomycetes) and Neuro
On the mating type gene of ospora crassa (Pyrenomycetes), a DNA binding site (HM
G box). C. het from Cochliobolus spp.
MAT2 and N. on one mating type gene of erostrophus.
HMG on the mt a-1 mating type gene of that of crassa
The position of the box is shown in FIG. Based on these sequences,
To amplify the inner fragment of this DNA binding site, two sets of 21-23mer oligomers, ChHMG1
And ChHMG2, NcHMG1 and NcHMG2 were designed for PCR primers.
【００２０】セット１ ＣｈＨＭＧ１ ＡＡＧＧＣＮＣＣＮＣＧＹＣＣＮＡＴＧ
ＡＡＣ ＣｈＨＭＧ２ ＣＴＮＧＧＮＧＴＧＴＡＹＴＴＧＴＡＲ
ＴＴＮＧＧ セット２ ＮｃＨＭＧ１ ＣＣＹＣＧＹＣＣＹＣＣＹＡＡＹＧＣＮ
ＴＡＹＡＴ ＮｃＨＭＧ２ ＣＧＮＧＧＲＴＴＲＴＡＲＣＧＲＴＡＲ
ＴＮＲＧＧSet 1 ChHMG1 AAGGCNCCCNCGYCCNATG
AAC ChHMG2 CTNGGNGTGTAYTTGTAR
TTNGG set 2 NcHMG1 CCYCGYCCYCCYAAYAGCCN
TAYAT NcHMG2 CGNGGRTTRTARCGRTAR
TNRGG
【００２１】セット１および２において、Ｎは、Ａ、
Ｔ、Ｇ、Ｃの混合あるいはイノシンとの混合であること
を、Ｙは、ＣとＴとの混合、ＲはＡとＧとの混合である
ことを示す。上記プライマーの塩基配列の一部をこのよ
うに一般化させることにより、菌類に広く応用すること
が可能となる。 （２）プライマーの合成 上記セット１および２に示すオリゴマーのセットは、常
法に従って作製した。このようにして得られたオリゴマ
ーをプライマーとして用いて、下記の条件でＰＣＲを行
い、各種の菌のＤＮＡ結合部位を増幅した。In sets 1 and 2, N is A,
Y indicates a mixture of C and T, and R indicates a mixture of A and G, that is, a mixture of T, G, and C or a mixture with inosine. By generalizing a part of the base sequence of the primer in this way, it can be widely applied to fungi. (2) Synthesis of primers The oligomer sets shown in the above sets 1 and 2 were prepared according to a conventional method. Using the oligomer thus obtained as a primer, PCR was performed under the following conditions to amplify DNA binding sites of various bacteria.
【００２２】（実施例２）セット１のプライマーを用い
たＰＣＲによる各種の菌のＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボッ
クス）の増幅 （１）使用した菌類 表１に示す、交配型遺伝子未知の病原菌19種を使用し
た。Cochloboulus spp.、Mycosphaerella zeae-maydi
s、Neurospora crassa 、Bipolaris sacchariおよびSet
osphaeria rostrata およびPodospora anserinaはCorne
ll 大学のDr.O.C.Yoder、Setosphaeria turcicaはDr.N.
Keller 、Pyrenophora teres は、Dr.T.Peever 、Pyren
ophora tritici-repentisはDr.D.Kalb 、Alternaria al
ternataは児玉基一朗博士、Nectria haematococcaはDr.
Van Etten、Cryphonectria parasiticaはDr.B.Marra、G
aeumannomyces graminis はDr.G.Bryanより入手した。(Example 2) Amplification of DNA binding site (HMG box) of various bacteria by PCR using primers of set 1 (1) Fungi used 19 pathogenic bacteria of unknown mating type gene shown in Table 1 used. Cochloboulus spp., Mycosphaerella zeae-maydi
s, Neurospora crassa, Bipolaris sacchari and Set
osphaeria rostrata and Podospora anserina are Corne
II Dr. OCYoder and Setosphaeria turcica of the University are Dr. N.
Keller, Pyrenophora teres, Dr. T. Peever, Pyren
ophora tritici-repentis is Dr.D.Kalb, Alternaria al
ternata is Dr. Motoichiro Kodama and Nectria haematococca is Dr.
Van Etten, Cryphonectria parasitica by Dr. B. Marra, G
aeumannomyces graminis was obtained from Dr. G. Bryan.
【００２３】（２）ＰＣＲ条件 ＰＣＲ条件は以下の通りである。10mMのTris-HCl(pH8.
3), 50mM のKCl, 2.5mMのMgCl2 , 0.2 μM のdNTPs, 2
μM のセット１のプライマー、0.25μl のAmpli Taq DN
A ポリメラーゼ（Perkin-Elmer社）、および約20ngの上
記表１に示す菌類の染色体ＤＮＡを含む50μl の混合液
を使用した。上記混合液を90℃で２分、（94℃で１分，
47−55℃で30秒，72℃で１分）を30〜35サイクル、つい
で72℃で１分の条件で増幅させた。 （３）増幅結果 使用した各種の菌のＨＭＧボックスの増幅結果を表１に
示す。(2) PCR conditions The PCR conditions are as follows. 10 mM Tris-HCl (pH 8.
3), 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 0.2 μM dNTPs, 2
μM set 1 primer, 0.25 μl Ampli Taq DN
A 50 μl mixture containing A polymerase (Perkin-Elmer) and about 20 ng of the chromosomal DNA of the fungi shown in Table 1 above was used. The above mixture was heated at 90 ° C for 2 minutes, (at 94 ° C for 1 minute,
(47-55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 1 minute) for 30-35 cycles and then at 72 ° C for 1 minute. (3) Amplification results Table 1 shows the results of amplification of the HMG boxes of the various bacteria used.
【００２４】（実施例３）セット２のプライマーを用い
たＰＣＲによる各種の菌のＤＮＡ結合部位（ＨＭＧボッ
クス）の増幅 （１）使用した菌類 表１に示す、交配型遺伝子未知の病因菌19種を使用し
た。これらの菌は、実施例２と同様にして入手した。 （２）ＰＣＲ条件 実施例２と同様の条件で行った。 （３）増幅結果 使用した各種の菌のＨＭＧボックスの増幅結果を、実施
例２の結果と共に表１に示す。(Example 3) Amplification of DNA binding site (HMG box) of various bacteria by PCR using primers of set 2 (1) Fungi used 19 types of pathogenic bacteria of unknown mating type gene shown in Table 1 It was used. These bacteria were obtained in the same manner as in Example 2. (2) PCR conditions The PCR was performed under the same conditions as in Example 2. (3) Amplification results Table 1 shows the results of amplification of the HMG boxes of the various bacteria used together with the results of Example 2.
【００２５】[0025]
【表１】 [Table 1]
【００２６】＋は増幅されたことを示し、−は増幅され
なかったことを示す。以上の結果より、セット１は Loc
uloascomyctes に属する菌類（図11）および近縁の菌
類、セット２は Pyrenomycetesに属する菌類および近縁
の菌類の交配型遺伝子上のＨＭＧボックスを増幅させる
ことが明らかになった。+ Indicates that amplification was performed, and-indicates that amplification was not performed. From the above results, set 1 is Loc
It was revealed that fungi belonging to uloascomyctes (FIG. 11) and related fungi, set 2, amplify the HMG box on mating-type genes of fungi belonging to Pyrenomycetes and related fungi.
【００２７】（実施例４）セット１およびセット２のプ
ライマーを用いたときのＰＣＲのまとめ セット１およびセット２のプライマーを用いたときにＨ
ＭＧボックスが増幅される各菌の交配型、交配性状、お
よびそれらの塩基配列の増幅が既に報告されているかど
うかを表２に示す。(Example 4) Summary of PCR using primers of set 1 and set 2 When primers of set 1 and set 2 were used,
Table 2 shows the mating types and mating properties of each bacterium in which the MG box is amplified, and whether amplification of their base sequences has already been reported.
【００２８】[0028]
【表２】 [Table 2]
【００２９】以上より、セット１のChHMG1プライマーに
より、Loculoascomycetes 綱に属するSetosphaeria tur
cicaなどのヘテロタリックな菌の片方の交配型株、Myco
sphaerlla zede-maydis などのホモタリックな菌の全
株、asexual なAlternaria alternataの一部の株から、
各々約270bp のＤＮＡ断片が増幅された。また、セット
２のNcＨＭＧプライマーにより、Pyrenomycetes 綱に属
すNectria haematococca、Gaumannomyces graminisなど
から、各々約270bp のＤＮＡ断片が増幅されたことが明
らかになった。各ＤＮＡ結合部位をクローニング・シー
クエンシングし、塩基配列を決定した。From the above, Setosphaeria tur belonging to the class Loculoascomycetes was obtained by using the ChHMG1 primer of set 1.
Myco, a heterozygous strain such as cica,
From all strains of homothallic bacteria such as sphaerlla zede-maydis, and some strains of asexual Alternaria alternata,
A DNA fragment of about 270 bp was amplified in each case. Further, it was revealed that a DNA fragment of about 270 bp was amplified from Nectria haematococca, Gaumannomyces graminis, etc. belonging to the class Pyrenomycetes by the NcHMG primer of set 2. Each DNA binding site was cloned and sequenced, and the nucleotide sequence was determined.
【００３０】（実施例５）ＨＭＧボックスのクローニン
グと塩基配列の決定 （１）クローニング・シークエンシング ＨＭＧボックスのクローニングは、常法に従って行っ
た。すなわち、ＰＣＲで増幅させた断片をインビトロゲ
ン社の販売するｐＣＲIIベクターに挿入した後、このベ
クターでコンピタントセルを形質転換し、ブルースクリ
プト選択とコロニーハイブリダイゼーションによりクロ
ーニングを行い、図４に示すような菌類から各々のＨＭ
Ｇボックスを増幅した。Example 5 Cloning of HMG Box and Determination of Nucleotide Sequence (1) Cloning and Sequencing Cloning of the HMG box was carried out according to a conventional method. That is, after the fragment amplified by PCR was inserted into a pCRII vector sold by Invitrogen, competent cells were transformed with this vector and cloned by Bluescript selection and colony hybridization, as shown in FIG. HM from various fungi
The G box was amplified.
【００３１】（２）塩基配列の決定 得られたＨＭＧボックスの塩基配列をｐＣＲIIベクター
上のプライマーM13(-20)、M13(-40)、Ｔ７、M13Revers
e、Ｓｐ６などを用い、ＡＢＩシークエンサーを用いて
決定した。結果を図４に示す。図４中の略号は下記表３
の通りである。(2) Determination of Nucleotide Sequence The nucleotide sequence of the obtained HMG box was determined using the primers M13 (-20), M13 (-40), T7, M13Revers on the pCRII vector.
e, Sp6, etc., and were determined using an ABI sequencer. FIG. 4 shows the results. The abbreviations in FIG.
It is as follows.
【００３２】[0032]
【表３】 [Table 3]
【００３３】この増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列は、
既報のＨＭＧボックスのものと相同性が高かった。上記
の菌について得られたＤＮＡ断片の塩基配列に基づい
て、推定アミノ酸配列を決定し、図５に示した。これら
の菌のあいだにおけるこのＤＮＡ断片のアミノ酸配列の
相同性も高いことが示された。The base sequence of the amplified DNA fragment is
The homology was high with that of the previously reported HMG box. The deduced amino acid sequence was determined based on the nucleotide sequence of the DNA fragment obtained for the above bacteria, and is shown in FIG. It was also shown that the homology of the amino acid sequence of this DNA fragment among these bacteria was high.
【００３４】（３）遺伝的解析 S. turcicaを用いて、以下のようにして遺伝的解析を行
った。すなわち、２つの交配型MAT1、MAT2の親株NK22と
NK72を交配して得た９株の子孫について、親株と戻し交
配して交配型を調べるとともに、各々の染色体ＤＮＡを
用いて、ChHMG1とChHMG2プライマーによりＰＣＲを行っ
た結果を図８に、また、制限酵素消化した染色体ＤＮＡ
を0.6 ％アガロースゲルで分離し、ニトランプラス膜へ
移し、クローンした断片とハイブリダイズさせたサザン
ブロットの結果を図９に示す。(3) Genetic analysis Genetic analysis was performed as follows using S. turcica. That is, the parent strain NK22 of two mating types MAT1 and MAT2
FIG. 8 shows the results of PCR using the chromosomal DNA and the ChHMG1 and ChHMG2 primers for the progeny of the nine strains obtained by crossing NK72 and backcrossing with the parent strain. Chromosomal DNA digested with restriction enzymes
Was separated on a 0.6% agarose gel, transferred to a Nitranplus membrane, and hybridized with the cloned fragment. The results of a Southern blot are shown in FIG.
【００３５】図８に示したように、ＰＣＲにより、12R
８、12R13 、12R16 、12R17 および、12R20 でNK72と同
じバンドが検出された。交配により、各子孫の交配型
は、12R4:MAT1 、12R6:MAT1 、12R7:MAT2 、12R8:MAT2
、12R13:MAT2、12R16:MAT2、12R17:MAT2、12R20:MAT
1、12R35:MAT1であることが判明した。交配型と図８お
よび図９の結果の断片の存在が同調するため、得られた
ＤＮＡ断片が交配型遺伝子上にあることが確認された。As shown in FIG. 8, 12R
The same band as NK72 was detected in 8, 12R13, 12R16, 12R17 and 12R20. By mating, the mating type of each progeny is 12R4: MAT1, 12R6: MAT1, 12R7: MAT2, 12R8: MAT2.
, 12R13: MAT2, 12R16: MAT2, 12R17: MAT2, 12R20: MAT
1, 12R35: turned out to be MAT1. Since the hybrid type and the presence of the fragments of the results shown in FIGS. 8 and 9 were synchronized, it was confirmed that the obtained DNA fragment was on the hybrid type gene.
【００３６】（４）TAIL-PCRによる遺伝子の取得 実際にホモタリックな菌類であるMycosphaerella zeae-
maydisについて、交配型遺伝子を調べた。この株の菌糸
を凍結乾燥し、フェノール法でＤＮＡを抽出し、ＰＥＧ
沈殿法により染色体ＤＮＡを精製した。ChHMG1とChHMG2
とをプライマーとして用いたＰＣＲによりＨＭＧボック
スを増幅し、得られた塩基配列データに基づいて、M. z
ede-maydisからTAIL-PCR法で、交配型遺伝子により、長
い部分をクローンした。TAIL-PCRの条件は、表４に示し
た通りである。(4) Acquisition of Gene by TAIL-PCR Mycosphaerella zeae-
For maydis, mating type genes were examined. The mycelium of this strain is lyophilized, DNA is extracted by the phenol method, and PEG
The chromosomal DNA was purified by the precipitation method. ChHMG1 and ChHMG2
And the HMG box was amplified by PCR using as primers, and M.z was determined based on the obtained nucleotide sequence data.
The long part was cloned from ede-maydis by the TAIL-PCR method using a mating type gene. TAIL-PCR conditions are as shown in Table 4.
【００３７】[0037]
【表４】 [Table 4]
【００３８】以上のようにしてTAIL-PCRをおこなったと
ころ、ＨＭＧボックス周囲の上流2.5 kb、下流1.5 kbが
得られ（図７）、さらに上流にCochliobolus heterostr
ophus のMAT1相同部位が検出された。また実際にTAIL-P
CRによりPyrenophria teres +ve 株よりＨＭＧボックス
周囲の1721bpの配列を得た（図10）。この断片はCochli
obolus heterostrophus MAT2と一部相同で、交配型遺伝
子と考えられた。以上、新規な交配型遺伝子取得法の可
能性を示した。When TAIL-PCR was carried out as described above, 2.5 kb upstream and 1.5 kb downstream of the HMG box were obtained (FIG. 7), and furthermore, Cochliobolus heterostr.
The homologous site of MAT1 of ophus was detected. Also actually TAIL-P
By CR, a 1721 bp sequence around the HMG box was obtained from Pyrenophria teres + ve strain (FIG. 10). This fragment is Cochli
obolus heterostrophus MAT2 was partially homologous and was considered to be a mating type gene. As described above, the possibility of a novel method for obtaining a crossed gene was shown.
【００３９】（実施例６）菌類の識別 上記のようにして得た菌のＨＭＧボックスの塩基配列を
比較して、下記表５に示すように識別を行った。(Example 6) Identification of fungi The nucleotide sequences of the HMG boxes of the bacteria obtained as described above were compared and identified as shown in Table 5 below.
【００４０】[0040]
【表５】 [Table 5]
【００４１】表中、（８／８）などの記載は、何株中何
株が陽性であったかを示す。asexual 、ホモタリックな
ものでも、ＨＭＧボックスを含む交配型遺伝子を持つこ
とが判明した。In the table, the description such as (8/8) indicates how many of the strains were positive. It has been found that even asexual and homothallic ones have mating-type genes containing an HMG box.
【００４２】（実施例７）菌類の進化の推測 実施例１〜５のようにして得た塩基配列をPAM250 resid
ue weight table によるクラスター法で解析した結果の
例を図12に示す。実施例２〜５で使用した菌類の進化の
過程は図12に示したように推測された。(Example 7) Estimation of fungal evolution The base sequence obtained as in Examples 1 to 5 was
FIG. 12 shows an example of the result of analysis by the cluster method using the ue weight table. The evolution process of the fungi used in Examples 2 to 5 was estimated as shown in FIG.
【００４３】[0043]
【発明の効果】本発明によれば、交配型遺伝子未知の菌
類の片方交配型遺伝子上のＤＮＡバインディングドメイ
ンをクローニング、シークエンシングすることが可能で
あった。これを元に、ウオーキングやＴＡＩＬ−ＰＣＲ
などでその交配型遺伝子の全長及び周囲を容易にクロー
ニング、シークエンシングすることができる。また、そ
の情報を元にもう片方の交配型遺伝子全長をクローニン
グ、シークエンシングすることもできる。さらに、本発
明のプライマーを用いると、これまで菌類の交配型遺伝
子を得るのに、デイスラプション等で非常に時間がかか
っていたが、短時間のうちに交配型遺伝子を得ることが
できる。According to the present invention, it was possible to clone and sequence a DNA binding domain on a one-way mating type gene of a fungus whose mating type gene is unknown. Based on this, walking and TAIL-PCR
For example, it is possible to easily clone and sequence the full length and periphery of the mating type gene. Further, based on the information, the other full-length mating type gene can be cloned and sequenced. Furthermore, when the primer of the present invention is used, it has conventionally been very time-consuming to obtain a hybrid gene of a fungus by desorption, but the hybrid gene can be obtained in a short time.
【００４４】また、菌類の交配型の検定、識別を行うこ
とができる。ヘテロタリックな菌類の片方の交配型遺伝
子上のＤＮＡ結合部位が増幅されるため、増幅される
株、増幅されない株で交配型が異なる。したがって、こ
れを利用して種々の菌類の交配型の検定あるいは識別が
可能である。このため、きのこなどの菌類の完全世代を
交配するさいに必要な交配型の異なる２つの株を確実に
選ぶことができ、交配が容易になり、生産効率も上昇す
る。したがって、本発明は、ヘテロタリックな菌の交配
型はいにおいて、その交配型の識別に有用である。さら
に、良好な形質を持った株の育種にも必須とさる交配の
ための重要な情報は重要を得ることができる。In addition, it is possible to test and identify the hybridization type of fungi. Since the DNA binding site on one of the mating type genes of the heterothallic fungi is amplified, the mating type differs between the amplified strain and the non-amplified strain. Therefore, this can be used to test or discriminate the crossing types of various fungi. For this reason, when crossing the full generation of fungi such as mushrooms, two strains having different crossing types required for crossing can be reliably selected, crossing is facilitated, and production efficiency increases. Therefore, the present invention is useful for discriminating a hybrid type of a heterothallic bacterium. In addition, important information for crossing, which is essential for breeding of strains having good traits, can be important.
【００４５】さらに、本発明の単離方法を使用すること
により、従来、交配型遺伝子の存在を調べることもでき
ず、また、それらの単離も不可能であった交配が不可能
な菌類（ホモタリックな菌およびasexual な菌）での交
配型遺伝子の存在を調べること、およびそれら交配型遺
伝子の単離が可能となる。加えて、そのような情報を用
いて、交配型遺伝子の全長を取得することもでき、菌類
の交配能、homothallicity、asexualityのメカニズム解
析に利用できる。完全世代を作れない菌に完全世代を作
らせることも可能になり、従来培地上で菌糸状しかとり
得なかった菌にきのこ等の生産も可能となる。さらにま
た、増幅されるＤＮＡ結合部位の塩基配列を比較するこ
とで、菌類の分類、進化過程を推測することが可能とな
る。Furthermore, by using the isolation method of the present invention, the existence of mating-type genes cannot be examined conventionally, and it is impossible to isolate the fungal ( (Homothallic and asexual fungi) to determine the presence of mating-type genes and to isolate these mating-type genes. In addition, using such information, the full length of the mating type gene can also be obtained, which can be used for analyzing the mechanism of fungal mating ability, homothallicity, and asexuality. It is also possible to cause a bacterium that cannot produce a complete generation to produce a complete generation, and it is also possible to produce mushrooms and the like for a bacterium that could only take a mycelial form on a conventional medium. Furthermore, it is possible to estimate the classification and evolution process of fungi by comparing the nucleotide sequences of the DNA binding sites to be amplified.
【図１】本発明のプライマーの２つのセットの塩基配列
を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the base sequences of two sets of primers of the present invention.
【図２】配列が既知となっている５種の菌類のＨＭＧボ
ックスのアミノ酸配列を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the amino acid sequences of HMG boxes of five kinds of fungi whose sequences are known.
【図３】C. heterostrophus のMAT2およびN. Crassa の
mt a-1の遺伝子上におけるＨＭＧボックスの位置、およ
び各々のプライマーの位置と方向を示す図である。FIG. 3. MAT2 of C. heterostrophus and N. Crassa
FIG. 2 is a diagram showing the position of an HMG box on the gene of mt a-1, and the position and direction of each primer.
【図４】実施例４で使用した22種類の菌のＨＭＧボック
スの塩基配列のアライメントを示す図である。FIG. 4 is a view showing alignment of base sequences of HMG boxes of 22 kinds of bacteria used in Example 4.
【図５】実施例４で使用した22種類の菌のＨＭＧボック
スのアミノ酸配列のアライメントを示す図である。FIG. 5 is a view showing alignment of amino acid sequences of HMG boxes of 22 kinds of bacteria used in Example 4.
【図６】ＨＭＧボックス（277bp ）の塩基配列をベース
に周囲の遺伝子をTAIL-PCRにより取得する方法を示した
ものであり、得られた産物（≡）が正しいものかどうか
を211bp の増幅で確認できることを示した図である。FIG. 6 shows a method of obtaining surrounding genes by TAIL-PCR based on the nucleotide sequence of an HMG box (277 bp). It is determined whether the obtained product (≡) is correct by 211 bp amplification. It is a figure showing that it can be confirmed.
【図７】ホモタリックな菌であるMycosphaerella zeae-
maydisのTAIL-PCRによる交配型遺伝子のクローニングを
示す図である。FIG. 7: Mycosphaerella zeae-, a homothallic bacterium
FIG. 4 is a diagram showing cloning of a hybrid gene by TAIL-PCR of maydis.
【図８】Setosphaeria turcica の親株と交配した子孫
とにおける交配型遺伝子の保有をChHMG1とChHMG2プライ
マーを用いたＰＣＲの結果を示す電気泳動写真である。FIG. 8 is an electrophoretic photograph showing the result of PCR using ChHMG1 and ChHMG2 primers to determine the possession of a hybrid gene in a progeny crossed with a parent strain of Setosphaeria turcica.
【図９】Setosphaeria turcica の親株と交配した子孫
とにおけるｇＤＮＡのサザンブロットの結果を示す電気
泳動写真である。FIG. 9 is an electrophoretic photograph showing the results of Southern blot of gDNA in a progeny crossed with a parent strain of Setosphaeria turcica.
【図１０】P. teres +veのスプライスされた仮のオープ
ンリーディングフレームの転写を示す図である。FIG. 10 shows the transcription of a spliced temporary open reading frame of P. teres + ve.
【図１１】本文中で用いたLoculoascomycetes およびPy
renomycetes の分類（The Fungi1973に従う）の分類学
的位置を示す図である。FIG. 11: Locloascomycetes and Py used in the text
FIG. 3 shows the taxonomic position of the classification of renomycetes (according to The Fungi1973).
【図１２】ＨＭＧボックスの塩基配列から推定した進化
の系統樹を示す図である。FIG. 12 is a diagram showing a phylogenetic tree of evolution estimated from the nucleotide sequence of the HMG box.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｒ 1:645） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Agency reference number FI Technical indication (C12Q 1/68 C12R 1: 645)
Claims (8)
結合部位を増幅するためのプライマー。1. A DNA present on a fungal mating type gene
Primers for amplifying binding sites.
らなるオリゴマーである請求項１に記載のプライマー。2. The primer according to claim 1, wherein the primer is an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行い、ホモタリックまたは完全世代を形
成しない菌類から交配型遺伝子を単離する交配型遺伝子
の単離方法。3. A DNA present on a fungal mating type gene.
A method for isolating a hybrid gene from a fungus that does not form a homothallic or complete generation by performing a polymerase chain reaction using a primer for amplifying a binding site.
からなるオリゴマーである請求項３に記載の交配型遺伝
子の単離方法。4. The method according to claim 3, wherein the primer is an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行い、前記菌類の片方の交配型遺伝子上
に存在するＤＮＡ結合部位を増幅することによって菌類
の交配型を識別する菌類の交配型の識別方法。5. DNA present on a fungal mating type gene
Identification of fungal mating type by performing a polymerase chain reaction using primers for amplifying the binding site and amplifying a DNA binding site present on one of the mating type genes of the fungus to thereby discriminate the fungal mating type Method.
らなるオリゴマーである請求項５に記載の菌類の交配型
の識別方法。6. The method according to claim 5, wherein the primer is an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
結合部位を増幅するためのプライマーを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応を行い、前記菌類の片方の交配型遺伝子上
に存在するＤＮＡ結合部位を増幅する工程と、前記増幅
されたＤＮＡ結合部位を比較する工程とを有する菌類の
進化の推測方法。7. A DNA present on a fungal mating-type gene
Performing a polymerase chain reaction using primers for amplifying the binding site, amplifying a DNA binding site present on one of the mating-type genes of the fungus, and comparing the amplified DNA binding site; Method for estimating the evolution of fungi having
らなるオリゴマーである請求項７に記載の菌類の進化の
推測方法。8. The method according to claim 7, wherein the primer is an oligomer having the nucleotide sequence shown in FIG.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23106696A JP3718755B2 (en) | 1996-08-30 | 1996-08-30 | Primers for amplifying specific sites on mating type genes |
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|---|---|---|---|
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|---|---|
| JPH1075786A true JPH1075786A (en) | 1998-03-24 |
| JP3718755B2 JP3718755B2 (en) | 2005-11-24 |
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ID=16917759
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|---|---|
| JP (1) | JP3718755B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024157A1 (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Channel assigning device and method in cdma communication system |
-
1996
- 1996-08-30 JP JP23106696A patent/JP3718755B2/en not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000024157A1 (en) * | 1998-10-19 | 2000-04-27 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Channel assigning device and method in cdma communication system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3718755B2 (en) | 2005-11-24 |
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