JPH1066571A - Reaction inhibitor inhibiting reaction of phenylalanine dehyddrogenase with tyrosine and reagent for quantitative determination of phenylalanine - Google Patents
Reaction inhibitor inhibiting reaction of phenylalanine dehyddrogenase with tyrosine and reagent for quantitative determination of phenylalanineInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は、フェニルアラニン
脱水素酵素のチロシンに対する反応を阻害する反応阻害
剤及びそれを用いたフェニルアラニン定量用試薬に関す
るものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a reaction inhibitor which inhibits the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine, and a reagent for quantifying phenylalanine using the same.
【０００２】[0002]
【従来の技術】フェニルアラニン脱水素酵素は、下記反
応式に示す反応を触媒する酵素である。2. Description of the Related Art Phenylalanine dehydrogenase is an enzyme that catalyzes a reaction represented by the following reaction formula.
【０００３】[0003]
【化１】 Embedded image
【０００４】この反応において、減少したフェニルアラ
ニンと増加したＮＡＤ（Ｐ）Ｈとが化学量論的に等量で
あることから、フェニルアラニン脱水素酵素を用いたフ
ェニルアラニン定量用試薬が提案されている。しかし、
フェニルアラニン脱水素酵素はフェニルアラニンと構造
が類似した化合物であるチロシンに対しても反応性を有
することから、チロシンが常に存在しているような溶液
中、例えば、血漿中のフェニルアラニンの定量には不向
きであることが指摘されている。この問題を解決するた
めに、これまで、比較的チロシンに対する反応性の低い
フェニルアラニン脱水素酵素をスクリーニングにより選
択すること〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー誌、第２６２巻、１０３４６〜１０３５４（１
９８７年）〕、フェニルアラニンとチロシンに対する反
応速度の違いに着目し、チロシンの影響の少ない反応初
期の反応速度でフェニルアラニンを測定すること〔アナ
リティカル・バイオケミストリー誌、第１７０巻、３９
７〜４０１（１９８８年）〕が提案されている。In this reaction, since the decreased phenylalanine and the increased NAD (P) H are stoichiometrically equivalent, a reagent for quantifying phenylalanine using phenylalanine dehydrogenase has been proposed. But,
Since phenylalanine dehydrogenase also has reactivity with tyrosine, a compound similar in structure to phenylalanine, it is not suitable for quantification of phenylalanine in solutions where tyrosine is always present, for example, plasma. It is pointed out that there is. To solve this problem, a phenylalanine dehydrogenase having relatively low reactivity to tyrosine has been selected by screening [Journal of Biological Chemistry, Vol. 262, 10346-10354 (1)].
987)], focusing on the difference in the reaction rate between phenylalanine and tyrosine, and measuring phenylalanine at the initial reaction rate with little influence of tyrosine [Analytical Biochemistry, Vol. 170, 39]
7-401 (1988)].
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの提案
でも、やはり、チロシンの影響を受けやすいという問題
があった。また、遺伝子操作の技術により、フェニルア
ラニン脱水素酵素のフェニルアラニンに対する反応特異
性を向上させるために、基質認識部位を改変することが
提案されているが、実際には基質認識部位が特定されて
いるに過ぎない〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー誌、第１１４巻、６９〜７５（１９９３年）〕。However, these proposals still have a problem that they are easily affected by tyrosine. In addition, it has been proposed to modify the substrate recognition site in order to improve the reaction specificity of phenylalanine dehydrogenase to phenylalanine by a genetic engineering technique. [Journal of Biochemistry, Vol. 114, 69-75 (1993)].
【０００６】本発明は、チロシンを含む試料中のフェニ
ルアラニンの定量を正確に行うための反応阻害剤を提供
することを目的とするものである。また、本発明は、試
料中に含まれるチロシンの影響をほとんど受けずに、正
確にフェニルアラニンの定量を行うことのできるフェニ
ルアラニン定量用試薬を提供することを目的とするもの
である。[0006] It is an object of the present invention to provide a reaction inhibitor for accurately determining phenylalanine in a sample containing tyrosine. Another object of the present invention is to provide a reagent for quantifying phenylalanine that can accurately quantify phenylalanine without being substantially affected by tyrosine contained in a sample.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討の結果、フェノール誘導体が
フェニルアラニン脱水素酵素のチロシンに対する反応を
特異的に阻害するということを見出し、本発明に到達し
た。すなわち、第１の発明は、フェノール誘導体を含有
してなることを特徴とするフェニルアラニン脱水素酵素
のチロシンに対する反応を阻害する反応阻害剤を要旨と
するものである。また、第２の発明は、フェニルアラニ
ン脱水素酵素と、上記の反応阻害剤とを含有してなるこ
とを特徴とするフェニルアラニン定量用試薬を要旨とす
るものである。Means for Solving the Problems The present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have found that phenol derivatives specifically inhibit the reaction of phenylalanine dehydrogenase with tyrosine. The invention has been reached. That is, a first aspect of the present invention provides a reaction inhibitor that inhibits the reaction of phenylalanine dehydrogenase with tyrosine, which comprises a phenol derivative. Further, a second invention provides a reagent for quantifying phenylalanine, comprising a phenylalanine dehydrogenase and the above-mentioned reaction inhibitor.
【０００８】[0008]
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の反応阻害剤は、フェノール誘導体を含有してな
るものであり、そのフェノール誘導体としては、一価の
フェノール誘導体、多価のフェノール誘導体が挙げら
れ、一価のフェノール誘導体としては、フェノール、パ
ラクレゾール（以下ｐ−クレーゾルと略する）、メタク
レゾール（以下ｍ−クレゾールと略す）、オルトクレゾ
ール（以下ｏ−クレゾールと略す）等が挙げられる。こ
れらは単独で含有してもよいし、また複数を含有しても
よい。複数を含有する場合の混合比としては、特に限定
されるものではないが、それぞれの成分が０〜１００容
量％となるように混合すればよく、好ましくは２０〜６
０容量％となるように混合すればよい。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The reaction inhibitor of the present invention contains a phenol derivative. Examples of the phenol derivative include a monovalent phenol derivative and a polyvalent phenol derivative. Examples thereof include paracresol (hereinafter abbreviated as p-cresol), meta-cresol (hereinafter abbreviated as m-cresol), and ortho-cresol (hereinafter abbreviated as o-cresol). These may be contained alone or in combination. The mixing ratio in the case of containing a plurality of components is not particularly limited, but they may be mixed so that each component becomes 0 to 100% by volume, preferably 20 to 6%.
What is necessary is just to mix so that it may become 0 volume%.
【０００９】また、本発明の反応阻害剤はこのような成
分をそのまま用いて反応阻害剤としてもよいし、またこ
れらの成分を水や緩衝液等に溶解又は混合して反応阻害
剤としてもよい。このときに用いられる緩衝液として
は、リン酸、クエン酸、ホウ酸、酢酸、アンモニア、炭
酸、ペロナール、イミダゾール、トリエタノールアミ
ン、グリシン、各種グッド緩衝液が挙げられる。このよ
うな成分の濃度としては、特に限定されるものではない
が、０．００１〜１００重量％が好ましく、特に、０．
０１〜１０重量％が好ましい。The reaction inhibitor of the present invention may be used as a reaction inhibitor by using such components as they are, or may be used as a reaction inhibitor by dissolving or mixing these components in water or a buffer solution. . Buffers used at this time include phosphoric acid, citric acid, boric acid, acetic acid, ammonia, carbonic acid, peronal, imidazole, triethanolamine, glycine, and various good buffers. The concentration of such a component is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 100% by weight, and particularly preferably 0.1 to 100% by weight.
It is preferably from 0.01 to 10% by weight.
【００１０】次に、本発明のフェニルアラニン定量用試
薬について説明すると、本発明のフェニルアラニン定量
用試薬は、下記反応式で示されるようにフェニルアラニ
ン脱水素酵素の作用によりフェニルアラニンがフェニル
ピルビン酸に変換される際に生成するＮＡＤ（Ｐ）Ｈを
定量することによりフェニルアラニンを定量するもので
ある。Next, the phenylalanine quantification reagent of the present invention will be described. The phenylalanine quantification reagent of the present invention converts phenylalanine to phenylpyruvic acid by the action of phenylalanine dehydrogenase as shown in the following reaction formula. Phenylalanine is quantified by quantifying NAD (P) H generated at that time.
【００１１】[0011]
【化２】 Embedded image
【００１２】本発明のフェニルアラニン定量用試薬は、
上記の反応阻害剤を含有してなるものであり、その含有
量としては、通常０．０００１〜９０容量％、好ましく
は０．００１〜２０容量％、さらに好ましくは０．０１
〜５容量％である。The reagent for quantifying phenylalanine of the present invention comprises:
The reaction inhibitor is contained, and its content is usually 0.0001 to 90% by volume, preferably 0.001 to 20% by volume, more preferably 0.01% by volume.
~ 5% by volume.
【００１３】本発明に用いられるフェニルアラニン脱水
素酵素としては、市販のもの、フェニルアラニン脱水素
酵素を含有する菌体を破砕した溶液、破砕した溶液より
精製を行ったもの等どのようなものを用いてもよく、ま
た、その由来も特に限定されるものではない。市販のフ
ェニルアラニン脱水素酵素としては、サーモアクチノミ
セス由来のフェニルアラニン脱水素酵素（ユニチカ社
製）、スポロサルキナ由来のフェニルアラニン脱水素酵
素（シグマ社製）等が挙げられる。フェニルアラニン脱
水素酵素の濃度としては、通常０．００１〜１００００
０Ｕ／ｍｌが好ましく、さらに０．０１〜１０００Ｕ／
ｍｌが好ましく、特に０．１〜１００Ｕ／ｍｌが好まし
い。As the phenylalanine dehydrogenase used in the present invention, any commercially available phenylalanine dehydrogenase, a solution obtained by crushing cells containing phenylalanine dehydrogenase, or a product obtained by purifying a crushed solution can be used. And its origin is not particularly limited. Examples of commercially available phenylalanine dehydrogenases include phenylalanine dehydrogenase derived from Thermoactinomyces (manufactured by Unitika), phenylalanine dehydrogenase derived from sporosarkina (manufactured by Sigma), and the like. The concentration of phenylalanine dehydrogenase is usually 0.001 to 10,000
0 U / ml is preferable, and 0.01 to 1000 U /
ml is preferable, and 0.1 to 100 U / ml is particularly preferable.
【００１４】本発明においては、フェニルアラニン脱水
素酵素の反応を速やかに進行させるために、試薬中にＮ
ＡＤ又はＮＡＤＰを加えてもよい。ＮＡＤ又はＮＡＤＰ
の濃度としては、特に限定されるものではなく、通常０
〜１０００ｍＭ、好ましくは０．００１〜２００ｍＭ、
さらに好ましくは０．０１〜５０ｍＭ添加すればよい。In the present invention, in order to promptly progress the reaction of phenylalanine dehydrogenase, N
AD or NADP may be added. NAD or NADP
Is not particularly limited, and is usually 0.
~ 1000 mM, preferably 0.001-200 mM,
More preferably, 0.01 to 50 mM may be added.
【００１５】さらに、本発明においては、試薬中に各種
添加剤を加えてもよい。添加剤としては、例えば、ｐＨ
を調整するための緩衝剤、フェニルアラニン脱水素酵素
の反応を促進させる活性化剤、フェニルアラニン脱水素
酵素の活性を維持するための安定化剤、試薬を取り扱い
やすくするための増粘剤等が挙げられる。Further, in the present invention, various additives may be added to the reagent. As an additive, for example, pH
Buffer, an activator for accelerating the reaction of phenylalanine dehydrogenase, a stabilizer for maintaining the activity of phenylalanine dehydrogenase, a thickener for facilitating the handling of the reagent, and the like. .
【００１６】緩衝剤としては、リン酸、クエン酸、ホウ
酸、酢酸、アンモニア、炭酸、ペロナール、イミダゾー
ル、トリエタノールアミン、グリシン、各種グッド緩衝
剤等が挙げられる。このような緩衝剤の濃度としては、
特に限定されるものではなく、通常０〜２０００ｍＭが
好ましく、さらに０．１〜５００ｍＭが好ましく、特に
１〜２００ｍＭが好ましい。[0016] Examples of the buffer include phosphoric acid, citric acid, boric acid, acetic acid, ammonia, carbonic acid, peronal, imidazole, triethanolamine, glycine, various good buffers and the like. As the concentration of such a buffer,
It is not particularly limited and is usually preferably 0 to 2000 mM, more preferably 0.1 to 500 mM, and particularly preferably 1 to 200 mM.
【００１７】活性化剤としては、例えば、ステアリン酸
塩、パルミチン酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、
アルキルスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸
塩、アルキルアリルスルホン酸塩等の陰イオン性界面活
性剤、アルキルアンモニウム塩、アルキルアミン酸塩等
の陽イオン性界面活性剤、レシチン、アルキルジメチル
ベタイン等の両性界面活性剤、ポリエチレングリコール
誘導体、多価アルコール誘導体等の非イオン性界面活性
剤等の各種界面活性剤、リチウム、カリウム、ナトリウ
ム、マグネシウム、カルシウム、バリウム、マンガン、
亜鉛等の金属イオン、塩素、フッ素、臭素、ヨウ素等の
陰イオン等の各種イオン等が挙げられる。このような活
性化剤の濃度としては、特に限定されるものではなく、
通常０〜９０重量％が好ましく、さらに０〜２０重量％
が好ましく、特に０．０１〜１０重量％が好ましい。Examples of the activator include stearate, palmitate, laurate, lauryl sulfate,
Anionic surfactants such as alkyl sulfonates, alkyl benzene sulfonates and alkyl allyl sulfonates; cationic surfactants such as alkyl ammonium salts and alkyl aminates; amphoteric interfaces such as lecithin and alkyl dimethyl betaine Surfactants, polyethylene glycol derivatives, various surfactants such as nonionic surfactants such as polyhydric alcohol derivatives, lithium, potassium, sodium, magnesium, calcium, barium, manganese,
Various ions such as metal ions such as zinc, and anions such as chlorine, fluorine, bromine and iodine are exemplified. The concentration of such an activator is not particularly limited,
Usually, it is preferably 0 to 90% by weight, more preferably 0 to 20% by weight.
Is preferred, and particularly preferably 0.01 to 10% by weight.
【００１８】安定化剤や増粘剤としては、例えば、ウシ
血清アルブミン等のタンパク質やマルトース、グルコー
ス、スクロース等の糖類、ポリエチレングリコール等の
高分子化合物、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、
エチレングリコール（βーアミノエチルエーテル）四酢
酸（ＥＧＴＡ）等が挙げられる。このような安定化剤や
増粘剤の濃度としては、特に限定されるものではなく、
通常、それぞれ０〜９０重量％が好ましく、さらに０〜
２０重量％が好ましく、特に０．０１〜１０重量％が好
ましい。Examples of stabilizers and thickeners include proteins such as bovine serum albumin, sugars such as maltose, glucose and sucrose, high molecular compounds such as polyethylene glycol, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA),
Ethylene glycol (β-aminoethyl ether) tetraacetic acid (EGTA) and the like. The concentration of such a stabilizer or thickener is not particularly limited,
Usually, each is preferably from 0 to 90% by weight, and more preferably from 0 to 90% by weight.
It is preferably 20% by weight, particularly preferably 0.01 to 10% by weight.
【００１９】本発明のフェニルアラニン定量用試薬を用
いてフェニルアラニンを定量するには、例えば、本発明
のフェニルアラニン定量用試薬にフェニルアラニンを含
む試料を添加して反応を行い、次いで、生成したＮＡＤ
（Ｐ）Ｈを分光光度計を用いて測定すればよい。また、
測定感度をさらに高めるために、生成したＮＡＤ（Ｐ）
Ｈをジアホラーゼと反応させて発色物質や蛍光物質に変
換させて測定してもよい。In order to quantify phenylalanine using the reagent for quantifying phenylalanine of the present invention, for example, a sample containing phenylalanine is added to the reagent for quantifying phenylalanine of the present invention, and a reaction is carried out.
(P) H may be measured using a spectrophotometer. Also,
Generated NAD (P) to further increase measurement sensitivity
The reaction may be measured by reacting H with diaphorase to convert it to a coloring substance or a fluorescent substance.
【００２０】このときの反応の温度及び反応の時間とし
ては、反応が進行しうる温度及び時間であれば特に限定
されるものではなく、反応の温度としては、通常０．５
〜８０℃で行えばよい。また、反応の時間としては、通
常０．０００００１〜１００時間、好ましくは０．００
００１〜２４時間、さらに好ましくは０．０００１〜６
時間である。The reaction temperature and the reaction time at this time are not particularly limited as long as the reaction can proceed, and the reaction temperature is usually 0.5
It may be performed at ~ 80 ° C. The reaction time is usually 0.000001 to 100 hours, preferably 0.000001 hours.
001 to 24 hours, more preferably 0.0001 to 6
Time.
【００２１】[0021]
【実施例】次に、本発明を実施例により具体的に説明す
る。なお、フェニルアラニン脱水素酵素の活性を表すユ
ニット数（Ｕ）は、光路長１ｃｍの分光光度計（日立製
作所製、Ｕ−３２１０）中で、３４０ｎｍの吸光度変化
を測定する際、吸光度が３０℃で１分間に６．２２増加
するのに必要なフェニルアラニン脱水素酵素量を１Ｕと
した。また、フェニルアラニンの定量は、光路長１ｃｍ
の分光光度計（日立製作所製、Ｕ−３２１０）中で、３
４０ｎｍの吸光度変化を測定する際、最終到達点におい
て吸光度が３０℃で６．２２だけ増加するフェニルアラ
ニンの量を１ｍＭの濃度とした。Next, the present invention will be described in detail with reference to examples. The number of units (U) representing the activity of phenylalanine dehydrogenase was determined by measuring the change in absorbance at 340 nm in a spectrophotometer (U-3210, manufactured by Hitachi, Ltd.) having an optical path length of 1 cm. The amount of phenylalanine dehydrogenase required to increase 6.22 per minute was 1 U. In addition, the quantification of phenylalanine was performed using an optical path length of 1 cm.
In a spectrophotometer (H-3210, manufactured by Hitachi, Ltd.)
When measuring the change in absorbance at 40 nm, the amount of phenylalanine at which the absorbance increased by 6.22 at 30 ° C. at the final point was taken as the concentration of 1 mM.
【００２２】実施例１、比較例１ フェニルアラニン１０ｍＭ又はチロシンを１２ｍＭと、
反応阻害剤としてフェノールを０．５〜１．０容量％含
むグリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）を調製し、これに、
サーモアクチノミセス（Thermoactinomyces ）由来のフ
ェニルアラニン脱水素酵素（ユニチカ社製）を５Ｕ／ｍ
ｌとなるように添加して、フェニルアラニン脱水素酵素
の活性を測定した（実施例１）。また、比較のため、反
応阻害剤としてのフェノールを添加しないでフェニルア
ラニン脱水素酵素の活性を測定した（比較例１）。その
結果を図１に示す。図１は、フェニルアラニンを基質と
した場合（●）及びチロシンを基質とした場合（○）
の、フェノールの添加量とフェニルアラニン脱水素酵素
の活性の測定値の関係を示す図であり、横軸に添加した
フェノールの濃度を、縦軸に吸光度変化より算出したフ
ェニルアラニン脱水素酵素の活性を示している。図１に
示すように、反応阻害剤としてのフェノールを添加する
ことによりチロシンを基質とした場合のフェニルアラニ
ン脱水素酵素の活性の測定値のみが減少していることか
ら、反応液中に反応阻害剤としてのフェノールを添加す
ることでフェニルアラニン脱水素酵素のチロシンに対す
る反応を特異的に阻害できることがわかる。Example 1, Comparative Example 1 Phenylalanine 10 mM or tyrosine 12 mM
A glycine buffer (pH 10.0) containing 0.5 to 1.0% by volume of phenol as a reaction inhibitor was prepared.
5 U / m of phenylalanine dehydrogenase (manufactured by Unitika) derived from Thermoactinomyces
and the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured (Example 1). For comparison, the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured without adding phenol as a reaction inhibitor (Comparative Example 1). The result is shown in FIG. FIG. 1 shows the case where phenylalanine was used as a substrate (●) and the case where tyrosine was used as a substrate (○).
It is a diagram showing the relationship between the amount of phenol added and the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase, the horizontal axis represents the concentration of added phenol, and the vertical axis represents the activity of phenylalanine dehydrogenase calculated from the change in absorbance. ing. As shown in FIG. 1, the addition of phenol as a reaction inhibitor reduced only the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase when tyrosine was used as a substrate. It can be seen that the addition of phenol as above can specifically inhibit the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine.
【００２３】実施例２、比較例２ 反応阻害剤としてｐ−クレゾールを用いた以外は実施例
１と同様にしてフェニルアラニン脱水素酵素の活性を測
定した（実施例２）。また、比較のため、反応阻害剤と
してのｐ−クレゾールを添加しないでフェニルアラニン
脱水素酵素の活性を測定した（比較例２）。その結果を
図２に示す。図２は、フェニルアラニンを基質とした場
合（●）及びチロシンを基質とした場合（○）の、ｐ−
クレゾールの添加量とフェニルアラニン脱水素酵素の活
性の測定値の関係を示す図であり、横軸に添加したｐ−
クレゾールの濃度を、縦軸に吸光度変化より算出したフ
ェニルアラニン脱水素酵素の活性を示している。図２に
示すように、反応阻害剤としてのｐ−クレゾールを添加
することによりチロシンを基質とした場合のフェニルア
ラニン脱水素酵素の活性の測定値のみが減少しているこ
とから、反応液中に反応阻害剤としてのｐ−クレゾール
を添加することでフェニルアラニン脱水素酵素のチロシ
ンに対する反応を特異的に阻害できることがわかる。Example 2, Comparative Example 2 The activity of phenylalanine dehydrogenase was measured in the same manner as in Example 1 except that p-cresol was used as a reaction inhibitor (Example 2). For comparison, the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured without adding p-cresol as a reaction inhibitor (Comparative Example 2). The result is shown in FIG. FIG. 2 shows p- and p-types when phenylalanine was used as a substrate (●) and when tyrosine was used as a substrate (○).
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the amount of cresol added and the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase, with p-added on the horizontal axis.
The concentration of cresol is shown on the vertical axis, which indicates the activity of phenylalanine dehydrogenase calculated from the change in absorbance. As shown in FIG. 2, the addition of p-cresol as a reaction inhibitor reduces only the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase using tyrosine as a substrate. It can be seen that the addition of p-cresol as an inhibitor can specifically inhibit the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine.
【００２４】実施例３、比較例３ 反応阻害剤としてｏ−クレゾールを用いた以外は実施例
１と同様にしてフェニルアラニン脱水素酵素の活性値を
測定した（実施例３）。また、比較のため、反応阻害剤
としてのｏ−クレゾールを添加しないでフェニルアラニ
ン脱水素酵素の活性を測定した（比較例３）。その結果
を図３に示す。図３は、フェニルアラニンを基質とした
場合（●）及びチロシンを基質とした場合（○）の、ｏ
−クレゾールの添加量とフェニルアラニン脱水素酵素の
活性の測定値の関係を示す図であり、横軸に添加したｏ
−クレゾールの濃度を、縦軸に吸光度変化より算出した
フェニルアラニン脱水素酵素の活性を示している。図３
に示すように、反応阻害剤としてのｏ−クレゾールを添
加することによりチロシンを基質とした場合のフェニル
アラニン脱水素酵素の活性の測定値のみが減少している
ことから、反応液中に反応阻害剤としてのｏ−クレゾー
ルを添加することでフェニルアラニン脱水素酵素のチロ
シンに対する反応を特異的に阻害できることがわかる。Example 3, Comparative Example 3 The activity of phenylalanine dehydrogenase was measured in the same manner as in Example 1 except that o-cresol was used as a reaction inhibitor (Example 3). For comparison, the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured without adding o-cresol as a reaction inhibitor (Comparative Example 3). The result is shown in FIG. FIG. 3 shows the results for o when phenylalanine was used as a substrate (●) and when tyrosine was used as a substrate (○).
-It is a diagram showing the relationship between the amount of added cresol and the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase, the horizontal axis added o
The cresol concentration and the activity of phenylalanine dehydrogenase calculated from the change in absorbance are shown on the vertical axis. FIG.
As shown in the figure, by adding o-cresol as a reaction inhibitor, only the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase when tyrosine was used as a substrate was reduced. It can be seen that the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine can be specifically inhibited by the addition of o-cresol.
【００２５】実施例４、比較例４ 反応阻害剤としてｍ−クレゾールを用いた以外は実施例
１と同様にしてフェニルアラニン脱水素酵素の活性を測
定した（実施例４）。また、比較のため、反応阻害剤と
してのｍ−クレゾールを添加しないでフェニルアラニン
脱水素酵素の活性を測定した（比較例４）。その結果を
図４に示す。図４は、フェニルアラニンを基質とした場
合（●）及びチロシンを基質とした場合（○）の、ｍ−
クレゾールの添加量とフェニルアラニン脱水素酵素の活
性の測定値の関係を示す図であり、横軸に添加したｍ−
クレゾールの濃度を、縦軸に吸光度変化より算出したフ
ェニルアラニン脱水素酵素の活性を示している。図４に
示すように、反応阻害剤としてのｍ−クレゾールを添加
することによりチロシンを基質とした場合のフェニルア
ラニン脱水素酵素の活性の測定値のみが減少しているこ
とから、反応液中に反応阻害剤としてのｍ−クレゾール
を添加することでフェニルアラニン脱水素酵素のチロシ
ンに対する反応を特異的に阻害できることがわかる。Example 4, Comparative Example 4 The activity of phenylalanine dehydrogenase was measured in the same manner as in Example 1 except that m-cresol was used as a reaction inhibitor (Example 4). For comparison, the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured without adding m-cresol as a reaction inhibitor (Comparative Example 4). FIG. 4 shows the results. FIG. 4 shows the results obtained when m-- and phenylalanine were used as substrates (基質) and tyrosine (○), respectively.
FIG. 4 is a graph showing the relationship between the amount of cresol added and the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase;
The concentration of cresol is shown on the vertical axis, which indicates the activity of phenylalanine dehydrogenase calculated from the change in absorbance. As shown in FIG. 4, only the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase when tyrosine was used as a substrate was reduced by adding m-cresol as a reaction inhibitor. It can be seen that the addition of m-cresol as an inhibitor can specifically inhibit the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine.
【００２６】実施例５、比較例５ 反応阻害剤としてフェノール、ｐ−クレゾール、ｏ−ク
レゾール及びｍ−クレゾールの混合液（体積比１：１：
１：１）を用いた以外は実施例１と同様にしてフェニル
アラニン脱水素酵素の活性を測定した（実施例５）。ま
た、反応阻害剤としての上記の混合液を添加しないでフ
ェニルアラニン脱水素酵素の活性を測定した（比較例
５）。その結果を図５に示す。図５は、フェニルアラニ
ンを基質とした場合（●）及びチロシンを基質とした場
合（○）の、混合液の添加量とフェニルアラニン脱水素
酵素の活性の測定値の関係を示す図であり、横軸に添加
した混合液の濃度を、縦軸に吸光度変化より算出したフ
ェニルアラニン脱水素酵素の活性を示している。図５に
示すように、反応阻害剤としてのフェノール、ｐ−クレ
ゾール、ｏ−クレゾール及びｍ−クレゾールの混合液を
添加することによりチロシンを基質とした場合のフェニ
ルアラニン脱水素酵素の活性の測定値のみが減少してい
ることから、反応液中に反応阻害剤としての混合液を添
加することでフェニルアラニン脱水素酵素のチロシンに
対する反応を特異的に阻害できることがわかる。Example 5, Comparative Example 5 A mixture of phenol, p-cresol, o-cresol and m-cresol as a reaction inhibitor (volume ratio 1: 1:
The activity of phenylalanine dehydrogenase was measured in the same manner as in Example 1 except that 1: 1) was used (Example 5). Further, the activity of phenylalanine dehydrogenase was measured without adding the above-mentioned mixture as a reaction inhibitor (Comparative Example 5). The result is shown in FIG. FIG. 5 is a graph showing the relationship between the amount of the mixed solution added and the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase when phenylalanine was used as the substrate (●) and when tyrosine was used as the substrate (）). The ordinate shows the concentration of the mixed solution added, and the ordinate shows the activity of phenylalanine dehydrogenase calculated from the change in absorbance. As shown in FIG. 5, only the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase when tyrosine was used as a substrate by adding a mixture of phenol, p-cresol, o-cresol and m-cresol as a reaction inhibitor It is understood that the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine can be specifically inhibited by adding a mixed solution as a reaction inhibitor to the reaction solution.
【００２７】実施例６〜７、比較例６ グリシン緩衝液（ｐＨ１０．０）にサーモアクチノミセ
ス（Thermoactinomyces ）由来のフェニルアラニン脱水
素酵素（ユニチカ社製）を２Ｕ／ｍｌと、ＮＡＤを１ｍ
Ｍと、反応阻害剤としてのフェノールを０容量％（比較
例６）、０．５容量％（実施例６）、０．７５容量％
（実施例７）となるように溶解してフェニルアラニン定
量用試薬を作製した。この試薬に、フェニルアラニンが
１０μＭと、チロシンが０〜１ｍＭとなるように添加し
て、フェニルアラニンの定量を行った。その結果を図６
に示す。図６は反応阻害剤としてフェノールを０容量％
（○）、０．５容量％（▲）及び０．７５容量％（■）
含むフェニルアラニン定量用試薬を用いてフェニルアラ
ニンの定量を行ったときの定量値とチロシン濃度の関係
を示す図であり、横軸にチロシン濃度を、縦軸にフェニ
ルアラニンの定量値を示している。図６から、フェニル
アラニン定量用試薬に、反応阻害剤としてのフェノール
を添加することにより、チロシンの影響を受けることな
く正確にフェニルアラニンを定量できることがわかる。Examples 6 to 7 and Comparative Example 6 A glycine buffer (pH 10.0) was added with 2 U / ml of phenylalanine dehydrogenase derived from Thermoactinomyces (manufactured by Unitika) and 1 m of NAD.
M and phenol as a reaction inhibitor in 0% by volume (Comparative Example 6), 0.5% by volume (Example 6), 0.75% by volume
(Example 7) A phenylalanine quantification reagent was prepared by dissolving so as to be as described above. To this reagent, phenylalanine was added at 10 μM and tyrosine at 0 to 1 mM, and phenylalanine was quantified. The result is shown in FIG.
Shown in FIG. 6 shows phenol as a reaction inhibitor at 0% by volume.
(○), 0.5% by volume (▲) and 0.75% by volume (■)
FIG. 4 is a diagram showing the relationship between the quantified value of phenylalanine and the tyrosine concentration when quantifying phenylalanine using the reagent for quantifying phenylalanine contained therein, in which the horizontal axis represents the tyrosine concentration and the vertical axis represents the quantitative value of phenylalanine. FIG. 6 shows that phenylalanine can be accurately quantified without being affected by tyrosine by adding phenol as a reaction inhibitor to the reagent for quantifying phenylalanine.
【００２８】実施例８〜９、比較例７ フェニルアラニン脱水素酵素としてスポロサルキナ（Sp
orosarcinia ）属由来のフェニルアラニン脱水素酵素
（シグマ社製）を用いた以外は実施例６、７及び比較例
６と同様にしてフェニルアラニン定量用試薬を作製し
た。この試薬に、フェニルアラニンが１０μＭと、チロ
シンが０〜１ｍＭとなるように添加して、フェニルアラ
ニンの定量を行った。その結果を図７に示す。図７は反
応阻害剤としてフェノールを０容量％（比較例７、
○）、０．５容量％（実施例８、▲）及び０．７５容量
％（実施例９、■）含むフェニルアラニン定量用試薬を
用いてフェニルアラニンの定量を行ったときの定量値と
チロシン濃度の関係を示す図であり、横軸にチロシン濃
度を、縦軸にフェニルアラニンの定量値を示している。
図７から、フェニルアラニン定量用試薬に、反応阻害剤
としてのフェノールを添加することにより、チロシンの
影響を受けることなく正確にフェニルアラニンを定量で
きることがわかる。Examples 8 to 9 and Comparative Example 7 As a phenylalanine dehydrogenase, sporosarkina (Sp
orosarcinia) phenylalanine dehydrogenase (manufactured by Sigma) was used in the same manner as in Examples 6, 7 and Comparative Example 6, except that a phenylalanine quantitative reagent was prepared. To this reagent, phenylalanine was added at 10 μM and tyrosine at 0 to 1 mM, and phenylalanine was quantified. FIG. 7 shows the result. FIG. 7 shows 0% by volume of phenol as a reaction inhibitor (Comparative Example 7,
）), The quantitative value and the tyrosine concentration when phenylalanine was quantified using the reagent for quantifying phenylalanine containing 0.5% by volume (Example 8, ▲) and 0.75% by volume (Example 9, Δ). It is a figure which shows a relationship, and a horizontal axis shows the tyrosine density | concentration and the vertical axis | shaft has shown the quantitative value of phenylalanine.
FIG. 7 shows that phenylalanine can be accurately quantified without being affected by tyrosine by adding phenol as a reaction inhibitor to the reagent for quantifying phenylalanine.
【００２９】[0029]
【発明の効果】本発明の反応阻害剤は、フェニルアラニ
ン脱水素酵素のチロシンに対する反応を特異的に阻害す
ることができるため、チロシンを含む試料中のフェニル
アラニンの定量を正確に行うためのものとして利用でき
る。また、本発明のフェニルアラニン定量用試薬は、試
料中に含まれるチロシンの影響をほとんど受けずに、正
確にフェニルアラニンの定量を行うことができる。Industrial Applicability The reaction inhibitor of the present invention can specifically inhibit the reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine, and is therefore used as a method for accurately determining phenylalanine in a sample containing tyrosine. it can. In addition, the reagent for quantifying phenylalanine of the present invention can accurately quantify phenylalanine without being substantially affected by tyrosine contained in a sample.
【図１】基質としてフェニルアラニン又はチロシンを用
いたときのフェニルアラニン脱水素酵素の活性の測定値
とフェノールの濃度の関係を示す図である。FIG. 1 is a graph showing the relationship between the measured value of phenylalanine dehydrogenase activity and the concentration of phenol when phenylalanine or tyrosine is used as a substrate.
【図２】基質としてフェニルアラニン又はチロシンを用
いたときのフェニルアラニン脱水素酵素の活性の測定値
とｐ−クレゾールの濃度の関係を示す図である。FIG. 2 is a graph showing the relationship between the measured value of phenylalanine dehydrogenase activity and the concentration of p-cresol when phenylalanine or tyrosine is used as a substrate.
【図３】基質としてフェニルアラニン又はチロシンを用
いたときのフェニルアラニン脱水素酵素の活性の測定値
とｏ−クレゾールの濃度の関係を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the relationship between the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase and the concentration of o-cresol when phenylalanine or tyrosine is used as a substrate.
【図４】基質としてフェニルアラニン又はチロシンを用
いたときのフェニルアラニン脱水素酵素の活性の測定値
とｍ−クレゾールの濃度の関係を示す図である。FIG. 4 is a graph showing the relationship between the measured value of the activity of phenylalanine dehydrogenase and the concentration of m-cresol when phenylalanine or tyrosine is used as a substrate.
【図５】基質としてフェニルアラニン又はチロシンを用
いたときのフェニルアラニン脱水素酵素の活性の測定値
とフェノール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール及びｍ
−クレゾールの混合液の濃度の関係を示す図である。FIG. 5 shows measured values of phenylalanine dehydrogenase activity when phenylalanine or tyrosine was used as a substrate and phenol, p-cresol, o-cresol and m.
It is a figure which shows the relationship of the concentration of the mixed solution of cresol.
【図６】本発明のフェニルアラニン定量用試薬及び従来
のフェニルアラニン定量用試薬を用いてフェニルアラニ
ンの定量を行ったときの定量値に与えるチロシン影響を
示す図である。FIG. 6 is a diagram showing the effect of tyrosine on the quantified value when phenylalanine is quantified using the reagent for quantifying phenylalanine of the present invention and the conventional reagent for quantifying phenylalanine.
【図７】本発明のフェニルアラニン定量用試薬及び従来
のフェニルアラニン定量用試薬を用いてフェニルアラニ
ンの定量を行ったときの定量値に与えるチロシンの影響
を示す図である。FIG. 7 is a graph showing the effect of tyrosine on the quantified value when phenylalanine is quantified using the reagent for quantifying phenylalanine of the present invention and the conventional reagent for quantifying phenylalanine.
Claims (2)
特徴とするフェニルアラニン脱水素酵素のチロシンに対
する反応を阻害する反応阻害剤。1. A reaction inhibitor which inhibits a reaction of phenylalanine dehydrogenase to tyrosine, which comprises a phenol derivative.
１記載の反応阻害剤とを含有してなることを特徴とする
フェニルアラニン定量用試薬。2. A reagent for quantifying phenylalanine, comprising phenylalanine dehydrogenase and the reaction inhibitor according to claim 1.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22642096A JPH1066571A (en) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | Reaction inhibitor inhibiting reaction of phenylalanine dehyddrogenase with tyrosine and reagent for quantitative determination of phenylalanine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22642096A JPH1066571A (en) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | Reaction inhibitor inhibiting reaction of phenylalanine dehyddrogenase with tyrosine and reagent for quantitative determination of phenylalanine |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1066571A true JPH1066571A (en) | 1998-03-10 |
Family
ID=16844850
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22642096A Pending JPH1066571A (en) | 1996-08-28 | 1996-08-28 | Reaction inhibitor inhibiting reaction of phenylalanine dehyddrogenase with tyrosine and reagent for quantitative determination of phenylalanine |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1066571A (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9181296B2 (en) | 2008-03-26 | 2015-11-10 | Novozymes A/S | Stabilized liquid enzyme compositions |
-
1996
- 1996-08-28 JP JP22642096A patent/JPH1066571A/en active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9181296B2 (en) | 2008-03-26 | 2015-11-10 | Novozymes A/S | Stabilized liquid enzyme compositions |
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