JPH1060000A - Purification of antibody - Google Patents

Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for rapidly, easily purifying an antibody at low cost without impairing its physiological activities. SOLUTION: An antibody-contg. solution is brought into contact with a separatory agent consisting of a metal phosphate (e.g. aluminum orthophosphate, magnesium pyrophosphate, zirconium pyrophosphate) to effect adsorption of the antibody to the separatory agent followed by separating the separatory agent from the solution and then eluting and recovering the aimed antibody from the separatory agent.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明が属する技術】本発明は、抗体の精製方法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for purifying an antibody.

【０００２】[0002]

【従来技術】動物の生体防御機構に関して重要な役割を
担っている抗体は、医療や臨床診断をはじめとする幅広
い分野で利用されている。例えば、１９世紀末に開発さ
れた抗血清療法は、抗体の作用を利用した治療方法であ
る。また、抗体は微量物質の特異的測定方法としての利
用も盛んで、酵素免疫測定法や蛍光免疫測定法などに用
いられている。これらの測定方法は、臨床検査薬に応用
されているほか、医学・薬学・生化学分野などにおける
基礎研究に欠くことのできないものとなっている。この
ように抗体の利用の拡大に伴って、抗体を効率よく作製
し、精製する技術に対する要求が高まっている。2. Description of the Related Art Antibodies that play an important role in animal body defense mechanisms are used in a wide range of fields including medical treatment and clinical diagnosis. For example, antiserum therapy developed at the end of the 19th century is a therapeutic method utilizing the action of antibodies. Antibodies are also actively used as specific methods for measuring trace substances, and are used in enzyme immunoassays, fluorescence immunoassays, and the like. These measurement methods have been applied to clinical test drugs and have become indispensable for basic research in the fields of medicine, pharmacy, and biochemistry. As the use of antibodies has thus expanded, there has been an increasing demand for techniques for efficiently producing and purifying antibodies.

【０００３】一般的な抗体の作製方法としては、マウ
ス、ウサギ、ヒツジなどの動物を免疫することによって
抗血清を作製し、その抗血清からポリクローナル抗体を
精製する方法、または抗体産生能を有するＢ細胞と増殖
能を有するミエローマ細胞とを細胞融合して調製したハ
イブリドーマをマウスまたはラットなどの腹腔にて増殖
させ、モノクローナル抗体を含む腹水を作製し、その腹
水から抗体を精製する方法、または同様にして調製した
ハイブリドーマを血清培地または無血清培地などを用い
て細胞培養することによってモノクローナル抗体を含む
培養液を作製し、その培養液から抗体を精製する方法な
どがある。抗血清や腹水、培養液中に作製した抗体を精
製する方法としては、試薬の添加による方法および分離
材を用いる方法に大別される。[0003] As a general method for preparing an antibody, a method of preparing an antiserum by immunizing animals such as mice, rabbits, and sheep, and purifying a polyclonal antibody from the antiserum, or a method of producing B having antibody-producing ability. A hybridoma prepared by cell fusion of cells and myeloma cells having proliferative ability is grown in the peritoneal cavity of a mouse or rat, and ascites containing a monoclonal antibody is prepared, and the antibody is purified from the ascites, or in a similar manner. There is a method of preparing a culture solution containing a monoclonal antibody by culturing the hybridoma prepared as described above in a cell culture using a serum medium or a serum-free medium, and purifying the antibody from the culture solution. Methods for purifying antibodies prepared in antiserum, ascites, and culture solution are roughly classified into a method by adding a reagent and a method using a separating material.

【０００４】試薬の添加による方法には、硫酸アンモニ
ウムなどの中性塩の添加による塩析法や、アルコール沈
殿法など、抗体とそれ以外の成分との溶解度差を利用し
た沈殿分別法が知られている。こうした方法に用いる試
薬類は比較的安価で、精製条件も温和ではあるが、操作
が煩雑であるために処理に長時間を要し、抗体の回収率
や純度が低い場合も多いので、結果的に精製コストは高
くなる。[0004] As a method by adding a reagent, a salting out method by adding a neutral salt such as ammonium sulfate, an alcohol precipitation method, and a precipitation separation method utilizing a difference in solubility between an antibody and other components are known. I have. Although the reagents used in such a method are relatively inexpensive and the purification conditions are mild, the operation is complicated, which requires a long time for the treatment, and the antibody recovery and purity are often low. In addition, the purification cost is high.

【０００５】分離材を用いる方法には、カラム法とバッ
チ法による２種の精製方法が知られている。カラム法と
は、分離材を充填したカラムに、抗体を含有する血清や
腹水、培養上清などを送液して導入した後、更に抗体と
そのほかの成分とに分離する方法である。したがって、
分離材はカラムに充填しなければ使用できないことに加
えて、送液ポンプ、検出器、フラクションコレクターな
どの特別な設備を必要とするために、精製に要するコス
トは高い。また、大量の培養上清などをカラムに導入す
る際に要する時間は、カラムの特性や送液ポンプの能力
などによって制約されるため、カラム法による大量処理
には長時間が必要であり、問題が多い。[0005] As a method using a separation material, two types of purification methods by a column method and a batch method are known. The column method is a method in which serum containing antibody, ascites, culture supernatant, and the like are introduced into a column filled with a separating material by liquid transfer, and then further separated into antibodies and other components. Therefore,
The separation material cannot be used unless it is packed in a column, and requires special equipment such as a liquid sending pump, a detector and a fraction collector, so that the cost required for purification is high. In addition, the time required to introduce a large amount of culture supernatant, etc., into the column is limited by the characteristics of the column and the capacity of the liquid pump, so large-scale processing by the column method requires a long time. There are many.

【０００６】一方、バッチ法は、抗体を含有する血清や
腹水、培養上清などをビーカーなどの容器に入れ、それ
に分離材を加えて抗体を吸着させた後、分離材を取り出
し抗体を分離材から溶離・回収する方法であり、血清や
腹水、培養上清などの処理量の多少にかかわらず簡便に
短時間で処理することができる有用な方法である。ま
た、カラム法のように特別な設備を必要としないので、
精製コストも非常に低いという利点がある。しかしなが
ら、バッチ法による精製方法に用いる分離材は、抗体を
吸着させる工程における撹拌や振盪などの操作、または
培養上清などから分離材を分別する際の遠心分離などの
操作に耐え得る高い機械的強度、また培養上清などから
の分離材の分別操作を容易にするための分離材の十分な
沈降性などが要求されるため適切な分離材を求めること
は容易ではない。例えば免疫グロブリンクラスＧ（Ｉｇ
Ｇ）に対して親和性を持つとされているプロテインＡや
プロテインＧをリガンドとして固定化したゲルは、カラ
ム法による抗体の精製に広く用いられているが、バッチ
法による抗体の精製用分離材としてもしばしば用いられ
る。ところがこの場合、リガンドを固定化する基材であ
るゲルが軟質で機械的強度が小さく、またゲルの材質が
多糖類であるために比重が小さく沈降性に乏しいこと、
更に、撹拌操作における分離材同士の接触によるリガン
ドの損失なども起こり易く、元来バッチ法に用いる分離
材としては不適当である。それに加えて、抗体とプロテ
インＡまたはプロテインＧとの結合が強固であるがため
に、抗体の回収にはｐＨ３程度の強酸性の溶離液を使用
しなければならず、そのために、抗体の変性や失活が起
こり易いという難点がある。このように、バッチ法によ
っても、精製方法に用いる分離材として適当なものが存
在しないため、同法による抗体の適切な分離精製方法に
も問題があるというのが現状である。On the other hand, in the batch method, serum containing antibody, ascites, culture supernatant, etc. are put into a container such as a beaker, a separating material is added thereto, and the antibody is adsorbed. This is a useful method that can be easily and quickly processed regardless of the processing amount of serum, ascites, culture supernatant, and the like. In addition, since special equipment is not required unlike the column method,
There is an advantage that the purification cost is very low. However, the separation material used in the purification method by the batch method has a high mechanical strength that can withstand operations such as stirring and shaking in the step of adsorbing the antibody, and operations such as centrifugation when separating the separation material from the culture supernatant or the like. Since strength and sufficient sedimentation of the separating material for facilitating the operation of separating the separating material from the culture supernatant and the like are required, it is not easy to find an appropriate separating material. For example, immunoglobulin class G (Ig
Gels in which protein A or protein G, which is known to have affinity for G), are immobilized as ligands, are widely used for the purification of antibodies by the column method. Often used as. However, in this case, the gel which is the base material on which the ligand is immobilized is soft and has low mechanical strength, and the specific gravity is small and the sedimentation is poor because the material of the gel is a polysaccharide.
Further, the loss of the ligand due to the contact between the separation materials in the stirring operation is liable to occur, which is originally unsuitable as the separation material used in the batch method. In addition, since the binding between the antibody and protein A or protein G is strong, a strongly acidic eluent having a pH of about 3 must be used to recover the antibody. There is a drawback that deactivation easily occurs. As described above, even with the batch method, there is no suitable separation material to be used in the purification method, and thus, at present, there is a problem in an appropriate separation and purification method for antibodies by the same method.

【０００７】さらに、前述のプロテインＡやプロテイン
Ｇは、ＩｇＧ以外の免疫グロブリンクラスの抗体、例え
ば免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）や免疫グロブリン
クラスＡ（ＩｇＡ）には親和性を持たないために、Ｉｇ
Ｇ以外の抗体の分離精製には使用できないし、抗体を産
生する動物の種類によっては、ＩｇＧであってもプロテ
インＡやプロテインＧに対する親和性を持たないため
に、分離精製には使用できない。このように、プロテイ
ンＡやプロテインＧを固定化したゲルを用いる分離精製
方法の適用範囲は狭い。更にプロテインＡやプロテイン
Ｇは菌類から産生されるものであるので量産化が困難で
あるために、それらを固定化したゲルは高価であり、こ
うしたゲルを用いるバッチ法による抗体の精製方法のコ
ストは高い。また、プロテインＡの原料である黄色ブド
ウ球菌に由来する毒性物質の混入が懸念されるために、
特に、抗体を医療分野へ応用する場合には、安全性の面
での不安は解消されない。Further, the above-mentioned protein A and protein G have no affinity for antibodies of immunoglobulin class other than IgG, for example, immunoglobulin class M (IgM) and immunoglobulin class A (IgA).
It cannot be used for separation and purification of antibodies other than G, and depending on the type of animal producing the antibody, even IgG cannot be used for separation and purification because it has no affinity for protein A or protein G. As described above, the applicable range of the separation and purification method using the gel on which the protein A or the protein G is immobilized is narrow. Furthermore, since protein A and protein G are produced from fungi and are difficult to mass-produce, gels immobilizing them are expensive, and the cost of antibody purification by batch method using such gels is low. high. In addition, toxic substances derived from Staphylococcus aureus, which is a raw material for Protein A, are
In particular, when antibodies are applied to the medical field, concerns about safety cannot be solved.

【０００８】以上のとおり、従来の抗体の分離精製方法
には数多くの問題があり、未だそれが解決されていな
い。こうした状況下、抗体を迅速に、簡便に、かつ安価
に、変性・失活のない状態で精製するための技術の開発
が望まれている。As described above, the conventional methods for separating and purifying antibodies have a number of problems, which have not yet been solved. Under these circumstances, development of a technique for purifying antibodies quickly, conveniently, and inexpensively without denaturation or inactivation is desired.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
の背景の技術に鑑み、動物の血清や腹水、または培養液
にて作製した抗体を、その生理活性を損なうことなく、
迅速に、簡便に、かつ、安価に精製しうるバッチ法によ
る抗体の精製方法において用いる分離材粒子を提供する
ことにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide an antibody prepared from animal serum or ascites or a culture solution without impairing its physiological activity.
An object of the present invention is to provide a separation material particle used in a method for purifying an antibody by a batch method, which can be rapidly, simply, and inexpensively purified.

【００１０】[0010]

【解決すべき課題の解決手段】本発明者らは、これまで
に、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩が、タンパク
質、酵素、核酸などの生体物質を分離対象とするクロマ
トグラフィー用固定相として好適な性質を有することを
明らかにし（特願平５−２２９７０３）、また、鳥類の
卵黄に産生される抗体であるＩｇＹの分離精製に対して
も有用であることを見出した（特願平８−７８１３
９）。その後、動物の血清や腹水または培養液にて作製
した抗体の精製にあたって、迅速に、簡便に、かつ、安
価に精製しうるバッチ法による精製方法の開発について
検討を進めたところ、オルトリン酸、ピロリン酸または
メタリン酸の金属塩からなる分離材粒子が、バッチ法に
よる精製に好適な機械的強度や沈降性を有し、該分離材
を用いることによって、上記の課題を一挙に解決できる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。The present inventors have previously reported that metal salts of pyrophosphate or metaphosphate are suitable as stationary phases for chromatography for separation of biological substances such as proteins, enzymes and nucleic acids. (Japanese Patent Application No. 5-229703) and also found to be useful for the separation and purification of IgY, an antibody produced in the yolk of birds (Japanese Patent Application No. Hei 8-229703). 7813
9). After that, when purifying antibodies produced from animal serum or ascites or culture solution, we investigated the development of a purification method using a batch method that can be purified quickly, simply, and inexpensively. Separation material particles composed of a metal salt of an acid or metaphosphoric acid have mechanical strength and sedimentation properties suitable for purification by a batch method, and by using the separation material, it has been found that the above problems can be solved at once. The present invention has been completed.

【００１１】すなわち、本発明は、抗体を含有する溶液
をリン酸の金属塩からなる分離材と接触させ、抗体を該
分離材に吸着させた後、溶液と該分離材を分別し、更に
該分離材から抗体を溶離・回収してなるバッチ法による
抗体の分離精製方法である。That is, according to the present invention, a solution containing an antibody is brought into contact with a separating material made of a metal salt of phosphoric acid, and after the antibody is adsorbed on the separating material, the solution is separated from the separating material. This is a method for separating and purifying antibodies by a batch method in which antibodies are eluted and recovered from a separation material.

【００１２】本発明における分離材は、バッチ法による
抗体の分離材として使用するに十分な機械的強度、具体
的には抗体の吸着工程における撹拌または振盪などの操
作や分別時における濾別、デカンテーション、遠心分離
などの操作に十分耐え得る機械的強度を具備しているこ
とが望ましく、そのような機械的強度を付与するため
に、５００〜１２００℃の焼成温度で加熱することによ
って分離材粒子を強固にする方法を用いることができ
る。バッチ法で効率よく抗体を精製するためには、大き
な表面積を有する分離材を用いて、分離材の単位量あた
りの抗体の吸着負荷量を高めるのがよく、分離材の表面
積を大きくするためには、例えば、粒子表面あるいは粒
子全体がリン酸の金属塩からなる数ミクロン以下の大き
さの微細粒子を凝集させ、多孔質の凝集体とする方法が
あるが、そのような多孔質の凝集体はそのままでは機械
的強度に弱く、撹拌または振盪などの処理によって容易
に凝集体が壊れてしまい、バッチ法による抗体の分離材
として使用するには不適当なものである。しかしなが
ら、５００〜１２００℃の焼成温度で加熱して微細粒子
同士を焼結させることによって、分離材の単位量あたり
の抗体の吸着負荷量が大きく、しかも機械的強度の高
い、バッチ法による精製方法に用いるに適した分離材を
調製することが可能である。ただし、本発明におけるバ
ッチ法による抗体の精製法に用いる分離材の多孔性は、
抗体と分離材との間の静電的な吸着作用とは直接には関
係ないので、無孔質の材料と多孔質の材料のいずれであ
ってもよいが、１回の操作でより多量の抗体を精製する
ためには、分離材の単位量あたりの抗体の吸着負荷量が
大きい、少なくとも１ｍ²／ｇ以上の大きな表面積を有
するものが好ましい。The separating material of the present invention has sufficient mechanical strength to be used as a separating material for antibodies by a batch method, specifically, operations such as stirring or shaking in the antibody adsorption step, filtration during separation, and decane. It is desirable to have mechanical strength enough to withstand operations such as filtration and centrifugation, and in order to impart such mechanical strength, the separation material particles are heated at a firing temperature of 500 to 1200 ° C. Can be used. In order to efficiently purify antibodies by the batch method, it is preferable to use a separation material having a large surface area to increase the antibody adsorption load per unit amount of the separation material, and to increase the surface area of the separation material. For example, there is a method of aggregating fine particles having a size of several microns or less in which the particle surface or the entire particle is made of a metal salt of phosphoric acid to form a porous aggregate, such a porous aggregate Is weak in mechanical strength as it is, and aggregates are easily broken by treatment such as stirring or shaking, which is unsuitable for use as a material for separating antibodies by a batch method. However, by heating at a sintering temperature of 500 to 1200 ° C. to sinter the fine particles, the purification load by the batch method is high in the adsorption load of the antibody per unit amount of the separating material and high in mechanical strength. It is possible to prepare a separating material suitable for use in the above. However, the porosity of the separation material used in the antibody purification method by the batch method in the present invention is:
Since it is not directly related to the electrostatic adsorption action between the antibody and the separating material, either a nonporous material or a porous material may be used. In order to purify the antibody, it is preferable to use a material having a large surface area of at least 1 m ² / g or more, which has a large adsorption load of the antibody per unit amount of the separation material.

【００１３】本発明におけるバッチ法による抗体の精製
法に用いる分離材は、リン酸の金属塩が抗体に対する吸
着材として作用するものであり、そのためには抗体と接
触する該分離材表面がリン酸の金属塩であることが必要
であり、該リン酸の種類としてはオルトリン酸、ピロリ
ン酸、メタリン酸が望ましく、該金属塩の金属としては
マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、マンガ
ン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウム、ジルコニ
ウム、チタン、イットリウム、ランタン、珪素などの金
属が望ましい。特に、ピロリン酸マグネシウムおよびピ
ロリン酸ジルコニウム、ピロリン酸チタンは本発明に係
わる分離材といて好適である。オルトリン酸またはピロ
リン酸またはメタリン酸の金属塩は結晶学的には非晶質
であっても結晶質であってもよい。また、完全にオルト
リン酸、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩だけから
成る物質である必要はなく、実質的にオルトリン酸、ピ
ロリン酸、メタリン酸の金属塩が抗体の分離材として機
能し、使用する溶離液中で安定に存在する物質であれば
よい。すなわち、オルトリン酸、ピロリン酸またはメタ
リン酸の金属塩に、別種のリン酸塩が少量混在している
場合も、本発明における「オルトリン酸の金属塩」、
「ピロリン酸の金属塩」または「メタリン酸の金属塩」
として夫々理解されるべきである。なお、珪素は厳密に
は非金属として分類されるが、リン酸塩の金属成分と同
様に振舞い、リン酸珪素を形成し、ピロリン酸マグネシ
ウムやピロリン酸ジルコニウムなどと同様に、本発明に
おけるバッチ法による抗体の分離材として有用な性質を
有することから、本発明においては、珪素を「オルトリ
ン酸、ピロリン酸またはメタリン酸の金属塩」の金属と
して含むものとする。In the present invention, the separating material used in the method for purifying antibodies by the batch method is one in which a metal salt of phosphoric acid acts as an adsorbing material for the antibodies. It is necessary that the phosphoric acid is orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid, metaphosphoric acid, and as the metal of the metal salt, magnesium, calcium, strontium, manganese, iron, nickel, copper, Metals such as zinc, aluminum, zirconium, titanium, yttrium, lanthanum, and silicon are desirable. In particular, magnesium pyrophosphate, zirconium pyrophosphate, and titanium pyrophosphate are suitable as the separating material according to the present invention. The metal salt of orthophosphoric acid or pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid may be amorphous or crystalline in crystallography. Further, the substance does not need to be completely composed of only a metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid, or metaphosphoric acid. Any substance can be used as long as it is a substance stably present in the eluent. That is, orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid metal salt, even when a small amount of another type of phosphate is mixed, in the present invention "orthophosphoric acid metal salt",
"Metal salt of pyrophosphoric acid" or "Metal salt of metaphosphoric acid"
Each should be understood as. Although silicon is strictly classified as a nonmetal, it behaves similarly to the metal component of phosphate, forms silicon phosphate, and, like magnesium pyrophosphate and zirconium pyrophosphate, uses the batch method of the present invention. In the present invention, silicon is included as a metal of “metal salts of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid, or metaphosphoric acid”, since it has useful properties as a material for separating antibodies by the above method.

【００１４】本発明に係わる分離材は、抗体との吸着に
関与する材料表面がオルトリン酸、、ピロリン酸または
メタリン酸の金属塩であればよく、抗体の吸着に関与し
ない内部の材質は金属やガラス、セラミックスなどの無
機物質であってもよく、あるいはアガロースゲルなどの
有機物質であってもよい。もちろん材料表面も材料内部
もすべてがオルトリン酸、ピロリン酸またはメタリン酸
の金属塩であってもよい。これらの場合、分離材として
の比重が１よりも大きい場合、沈降性が高くなり、抗体
を吸着した分離材の分別回収が容易であるという利点が
ある。また分離材の形状は粒子状であることが望ましい
が、実施状況に応じてペレット状、繊維状など様々な形
状にして用いることができる。分離材を粒子状にして使
用する場合の分離材の大きさは、使用状況に応じて適当
な大きさを選択するのが望ましい。例えば、０.１〜２
ｍｌ程度の少量の腹水から抗体を回収・精製する場合に
は、平均粒子径が０.５〜15μｍ、殊に望ましくは４〜
１０μｍの範囲の粒子径の粒子を用いて吸着させ、遠心
分離によって抗体を吸着した分離材を分別し、更に抗体
を回収する方法が好適である。また、１０ｍｌ以上の大
量の抗血清や培養液などから抗体を回収する場合には、
抗体を含有する抗血清や培養液に該分離材を懸濁させる
ことによって分離材に抗体を吸着させ、更に、抗体を吸
着させた分離材を回収するためには、濾別またはデカン
テーションによる分別が望ましいが、この工程において
は、平均粒子径が３０μｍ〜５ｍｍの範囲の、十分な沈
降性を有する大きさの粒子を用いるのが好適である。The separation material according to the present invention may be such that the surface of a material involved in the adsorption with the antibody is a metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphate or metaphosphoric acid. It may be an inorganic substance such as glass or ceramics, or an organic substance such as agarose gel. Of course, both the material surface and the inside of the material may be metal salts of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid. In these cases, when the specific gravity of the separating material is larger than 1, the sedimentation property is increased, and there is an advantage that the separating material having the antibody adsorbed thereon can be easily separated and collected. The shape of the separating material is desirably in the form of particles, but it can be used in various shapes such as pellets and fibers depending on the state of operation. When the separating material is used in the form of particles, it is desirable to select an appropriate size for the separating material according to the use condition. For example, 0.1-2
When recovering and purifying the antibody from a small amount of ascites of about ml, the average particle diameter is 0.5 to 15 μm, particularly preferably 4 to 15 μm.
A method of adsorbing particles having a particle diameter in the range of 10 μm, separating the separating material adsorbed with the antibody by centrifugation, and further recovering the antibody is preferable. When recovering antibodies from a large amount of antiserum or culture solution of 10 ml or more,
The antibody is adsorbed to the separating material by suspending the separating material in an antiserum or a culture solution containing the antibody, and further, in order to collect the separating material having the antibody adsorbed thereon, separation by filtration or decantation is performed. In this step, it is preferable to use particles having an average particle diameter in the range of 30 μm to 5 mm and having a sufficient sedimentation property.

【００１５】オルトリン酸、ピロリン酸またはメタリン
酸の金属塩の製法は特に限定されず、様々な公知の方法
を用いることができる。例えば、ピロリン酸マグネシウ
ムを得るのに、マグネシウムとリンの原子比が１：１と
なるように硝酸マグネシウムの水溶液とピロリン酸アン
モニウムの水溶液とを混合撹拌して調製したスラリー
に、更にメタノールを加えてホモジナイザーで処理した
後、噴霧熱分解して球状粒子を得て、これを６００〜１
０００℃で焼成することによって、粒子全体がピロリン
酸マグネシウムから成る本発明の分離材を得ることがで
きる。分離材の材料表面だけがオルトリン酸、ピロリン
酸またはメタリン酸の金属塩から成る態様の分離材を作
製することも可能である。例えば、分離材の内部の材料
として使用するために３次元網目状に連続した細孔を有
するアルミナなどのセラミックスの多孔体を公知の技術
を用いて作製し、この多孔体をサブミクロンの微細なピ
ロリン酸マグネシウム粒子を水などに分散して調製した
スラリーに浸漬し、多孔体の全表面をスラリーで覆うよ
うにしてから、引き上げて余分なスラリーを除去した
後、乾燥、焼成することによって、分離材表面がピロリ
ン酸マグネシウムから成る態様の分離材を作製すること
ができる。The method for producing the metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid is not particularly limited, and various known methods can be used. For example, to obtain magnesium pyrophosphate, methanol is added to a slurry prepared by mixing and stirring an aqueous solution of magnesium nitrate and an aqueous solution of ammonium pyrophosphate so that the atomic ratio of magnesium to phosphorus is 1: 1. After treatment with a homogenizer, spray pyrolysis was performed to obtain spherical particles.
By calcining at 000 ° C., the separation material of the present invention in which the whole particles are composed of magnesium pyrophosphate can be obtained. It is also possible to prepare a separating material in which only the material surface of the separating material is made of a metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid. For example, a porous body of ceramics such as alumina having pores continuous in a three-dimensional network is prepared by using a known technique to use the porous body as a material inside the separating material, and the porous body is formed into submicron fine particles. Immerse in a slurry prepared by dispersing magnesium pyrophosphate particles in water, etc., cover the entire surface of the porous body with the slurry, pull up to remove excess slurry, dry, and bake to separate. A separating material in which the material surface is made of magnesium pyrophosphate can be produced.

【００１６】本発明に係わるバッチ法による抗体の精製
法において、抗体は分離材であるオルトリン酸、ピロリ
ン酸またはメタリン酸の金属塩に、静電的相互作用によ
って穏やかに吸着されているものと推定され、更に抗体
の脱着には抗体を変性・失活させる恐れのない、中性付
近にｐＨを調製した緩衝液を用いることが可能であるた
めに、抗体と分離材との一連の吸脱着作用によって抗体
を変性・失活させる恐れがないという格別の利点があ
る。特に、分離材に吸着した抗体を回収するために使用
する溶離液は、抗体に対して好適なｐＨ６〜８の範囲の
溶液を用いることができる。溶液のｐＨを６以下または
８以上にして抗体を回収することも可能であるが、一般
にアルカリ条件下では分離材に対する抗体の吸着量が低
下し分離も悪くなる、あるいは酸性条件下で行えば抗体
の活性を損なう恐れがあるなど、中性付近のｐＨの条件
下で抗体の回収を行う以上に格別のメリットが得られる
ことはほとんどない。したがって、本発明に係わるバッ
チ法による抗体の精製方法において、ｐＨ６〜８の条件
下で抗体を回収するのが望ましい。In the method for purifying an antibody by the batch method according to the present invention, it is presumed that the antibody is gently adsorbed to a metal salt of orthophosphate, pyrophosphate or metaphosphate as a separating material by electrostatic interaction. In addition, since a buffer solution whose pH has been adjusted to near neutrality can be used for desorption of the antibody without fear of denaturing or deactivating the antibody, a series of adsorption and desorption actions between the antibody and the separating material can be used. There is a special advantage that there is no possibility of denaturing or inactivating the antibody. In particular, as an eluent used for collecting the antibody adsorbed on the separation material, a solution having a pH in a range of 6 to 8 suitable for the antibody can be used. It is also possible to recover the antibody by adjusting the pH of the solution to 6 or less or 8 or more. However, in general, the amount of the antibody adsorbed on the separation material decreases under alkaline conditions, resulting in poor separation. There is hardly any particular advantage over recovering the antibody under conditions of near neutral pH, such as the possibility of impairing the activity of the antibody. Therefore, in the method for purifying an antibody by the batch method according to the present invention, it is desirable to recover the antibody under conditions of pH 6 to 8.

【００１７】[0017]

【実施の形態】本発明に係わる精製材料を用いた抗体の
精製は、以下のようにして行うことができる。DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS Purification of an antibody using the purified material according to the present invention can be performed as follows.

【００１８】まず公知の方法により、ウサギやヒツジな
どの動物を免疫して抗血清を作製する。抗血清は採取し
適当な容器に入れ、本発明に係わる分離材を加えて数分
間振盪することによって抗体を分離材に吸着させる。次
いで、分離材を加えた抗血清から、抗体を吸着した分離
材を濾別する。濾別した分離材は、リン酸ナトリウムや
リン酸カリウムでｐＨを６〜８に調製した塩化ナトリウ
ム溶液や塩化カリウム溶液や、ｐＨ６〜８に調製したリ
ン酸ナトリウム緩衝液やリン酸カリウム緩衝液で抗体を
脱着させ、精製・回収することができる。抗体の脱着の
工程において、溶離液の種類を使い分けることによって
免疫グロブリンクラスの異なる抗体を分離・回収するこ
とができる。例えば、初めに３００〜５００ｍＭの塩化
ナトリウム溶液または塩化カリウム溶液を溶離液として
用いることによって免疫グロブリンクラスＧの抗体を脱
着・回収し、次いで３００〜５００ｍＭのリン酸ナトリ
ウム緩衝液またはリン酸カリウム緩衝液を溶離液として
用いることによって免疫グロブリンクラスＭの抗体を脱
着・回収することができる。同様の方法で、抗血清のほ
か、血清や腹水、培養液などからも抗体を簡便に回収・
精製することが可能である。First, an animal such as a rabbit or sheep is immunized by a known method to prepare an antiserum. The antiserum is collected, placed in an appropriate container, the separation material according to the present invention is added, and the mixture is shaken for several minutes to adsorb the antibody to the separation material. Next, the separating material to which the antibody has been adsorbed is separated from the antiserum to which the separating material has been added by filtration. Separation materials filtered out are sodium chloride solution or potassium chloride solution adjusted to pH 6 to 8 with sodium phosphate or potassium phosphate, or sodium phosphate buffer or potassium phosphate buffer adjusted to pH 6 to 8. Antibodies can be desorbed and purified and recovered. In the step of desorbing an antibody, antibodies having different immunoglobulin classes can be separated and recovered by using different types of eluents. For example, immunoglobulin class G antibodies are first desorbed and recovered by using a 300-500 mM sodium chloride solution or potassium chloride solution as an eluent, and then a 300-500 mM sodium phosphate buffer or potassium phosphate buffer. By using as an eluent, antibodies of immunoglobulin class M can be desorbed and recovered. In a similar manner, antibodies can be easily recovered from serum, ascites, culture, etc. in addition to antisera.
It is possible to purify.

【００１９】[0019]

【実施例】以下に、本発明の実施例を掲げ、本発明を具
体的に説明する。ただし、本発明は下記の実施例に限定
されるものではない。 実施例１ ピロリン酸マグネシウム組成となるように塩基性炭酸マ
グネシウムスラリーとピロリン酸水溶液を混合撹拌し、
更にメタノールを加えて調製したスラリーを６５０℃で
噴霧熱分解した。得られた生成物を更に７００℃で４時
間熱処理した後、分級して４〜１０μｍの球状粒子を得
た。この球状粒子をＸ線回折分析をした結果、ピロリン
酸マグネシウムの結晶だった。また、このピロリン酸マ
グネシウムを走査型電子顕微鏡で観察した結果、多数の
サブミクロンの球状粒子が凝集・焼結して多孔質な４〜
１０μｍの球状体を形作っていた。The present invention will be specifically described below with reference to examples of the present invention. However, the present invention is not limited to the following examples. Example 1 A basic magnesium carbonate slurry and a pyrophosphoric acid aqueous solution were mixed and stirred so that a magnesium pyrophosphate composition was obtained,
The slurry prepared by further adding methanol was spray pyrolyzed at 650 ° C. The obtained product was further heat-treated at 700 ° C. for 4 hours, and then classified to obtain spherical particles of 4 to 10 μm. X-ray diffraction analysis of the spherical particles revealed that the particles were magnesium pyrophosphate crystals. Observation of the magnesium pyrophosphate with a scanning electron microscope revealed that a large number of submicron spherical particles were aggregated and sintered to form
A 10 μm sphere was formed.

【００２０】免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）のモノ
クローナル抗体を含有するマウス腹水１ｍｌをマイクロ
チューブ（容量２.２ｍｌ）に入れ、ピロリン酸マグネ
シウム球状粒子０.５ｇを加えて３分間振盪し、ＩｇＭ
抗体をピロリン酸マグネシウムに吸着させた。次いで、
腹水を１０００rpmで３分間遠心処理し、ＩｇＭ抗体を
吸着したピロリン酸マグネシウムを沈降させた。腹水は
パスツールピペットでマイクロチューブから除去した。
ピロリン酸マグネシウムに吸着したホスト動物由来のＩ
ｇＧを取り除くために、マイクロチューブにリン酸ナト
リウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリ
ウム溶液１.５ｍｌを加えて３分間振盪した後、１００
０rpm×３分間遠心処理し、上澄みを取り除いた。この
工程を合計５回行った後、ＩｇＭ抗体を精製・回収する
ために、ｐＨ６.８に調整した３００ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液１.５ｍｌをマイクロチューブに入れ、同様
に振盪および遠心処理をし、上澄みを試験管に移した。
この工程を合計３回行い、精製されたＩｇＭ抗体溶液約
４.５ｍｌを得た。このＩｇＭ抗体溶液の純度をＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べた結果、Ｉｇ
Ｍ抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由来する２本のバンドのほか
には、バンドは検出されなかった。また吸光度測定法に
よる、この精製処理工程におけるＩｇＭ抗体の回収率は
ほぼ１００％であった。このように本発明に係わるバッ
チ法による抗体の精製法によって、マウス腹水からモノ
クローナルＩｇＭ抗体を損失することなく高純度に分離
精製することができた。 実施例２ ピロリン酸ジルコニウム組成となるようにオキシ酢酸ジ
ルコニウム水溶液とリン酸を混合撹拌して精製したスラ
リーを、２００℃で噴霧乾燥して４０〜６０μｍの球状
粒子を得た。この生成物を更に９００℃で６時間熱処理
してピロリン酸ジルコニウムの多孔質な球状粒子を得
た。1 ml of mouse ascites containing a monoclonal antibody of immunoglobulin class M (IgM) was placed in a microtube (volume: 2.2 ml), 0.5 g of magnesium pyrophosphate spherical particles were added, and the mixture was shaken for 3 minutes.
Antibodies were adsorbed on magnesium pyrophosphate. Then
The ascites was centrifuged at 1000 rpm for 3 minutes to precipitate the magnesium pyrophosphate adsorbed with the IgM antibody. Ascites was removed from the microtube with a Pasteur pipette.
I from host animals adsorbed on magnesium pyrophosphate
To remove gG, 1.5 ml of a 500 mM sodium chloride solution adjusted to pH 6.8 with sodium phosphate was added to the microtube, and the mixture was shaken for 3 minutes.
The mixture was centrifuged at 0 rpm for 3 minutes, and the supernatant was removed. After performing this step a total of 5 times, 1.5 ml of 300 mM sodium phosphate buffer adjusted to pH 6.8 was placed in a microtube, and shaken and centrifuged in the same manner to purify and collect the IgM antibody. The supernatant was transferred to a test tube.
This step was performed three times in total to obtain about 4.5 ml of a purified IgM antibody solution. The purity of this IgM antibody solution was determined by SDS.
As a result of examination by polyacrylamide gel electrophoresis, Ig
No band was detected other than the two bands derived from the H and L chains of the M antibody. The recovery rate of the IgM antibody in this purification step by the absorbance measurement method was almost 100%. As described above, the monoclonal IgM antibody could be separated and purified to high purity from the mouse ascites without loss by the batch antibody purification method according to the present invention. Example 2 A slurry obtained by mixing and stirring an aqueous solution of zirconium oxyacetate and phosphoric acid so as to have a zirconium pyrophosphate composition was spray-dried at 200 ° C. to obtain spherical particles of 40 to 60 μm. The product was further heat-treated at 900 ° C. for 6 hours to obtain porous spherical particles of zirconium pyrophosphate.

【００２１】免疫グロブリンクラスＧ２ａ（ＩｇＧ２
ａ）のモノクローナル抗体を含有するラット腹水１０ｍ
ｌを試験管に入れ、ピロリン酸ジルコニウム球状粒子
４.０ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ａ抗体をピロ
リン酸ジルコニウムに吸着させた。次いで、孔径１０μ
ｍのフィルターを底部に装着したシリンジに腹水を注ぎ
こみ、ＩｇＧ２ａ抗体を吸着させたピロリン酸ジルコニ
ウムを濾別した。更に、腹水中の夾雑成分である血清ア
ルブミンなどを除去するためにｐＨ６.８に調整した１
０ｍＭリン酸カリウム緩衝液２０ｍｌでピロリン酸ジル
コニウムを洗浄した。その後、ＩｇＧ２ａ抗体を回収す
るために、リン酸カリウムでｐＨを６.８に調整した４
００ｍＭ塩化カリウム溶液５ｍｌをシリンジに注ぎこ
み、シリンジ下部から留出する溶出液を回収し、ラット
ＩｇＧ２ａ抗体溶液約５ｍｌを得た。このＩｇＧ２ａ抗
体溶液の純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動で調べた結果、ＩｇＧ２ａ抗体のＨ鎖およびＬ鎖に由
来する２本のバンドのほかには、バンドは検出されなか
った。また吸光度測定法による、この精製処理工程にお
けるＩｇＧ２ａ抗体の回収率はほぼ１００％であった。
このように本発明に係わるバッチ法による抗体の精製方
法によって、ラット腹水からモノクローナルＩｇＧ２ａ
抗体を損失することなく高純度に分離精製することがで
きた。 実施例３ オルトリン酸アルミニウム組成となるように硝酸アルミ
ニウム水溶液とリン酸三アンモニウム水溶液を混合撹拌
して調製したスラリーを、２００℃で噴霧乾燥して３０
〜８０μｍの球状粒子を得た。この生成物を更に１００
０℃で１２時間熱処理してオルトリン酸アルミニウムの
多孔質な球状粒子を得た。The immunoglobulin class G2a (IgG2
a) 10 m of rat ascites containing the monoclonal antibody of a)
was placed in a test tube, 4.0 g of zirconium pyrophosphate spherical particles were added, and the mixture was shaken for 5 minutes to adsorb the IgG2a antibody to zirconium pyrophosphate. Then, a pore diameter of 10μ
The ascitic fluid was poured into a syringe equipped with a filter of m at the bottom, and zirconium pyrophosphate to which the IgG2a antibody had been adsorbed was filtered off. Further, the pH was adjusted to 6.8 to remove serum albumin and the like, which are contaminants in ascites.
The zirconium pyrophosphate was washed with 20 ml of 0 mM potassium phosphate buffer. Thereafter, the pH was adjusted to 6.8 with potassium phosphate to recover the IgG2a antibody.
5 ml of a 00 mM potassium chloride solution was poured into the syringe, and the eluate distilled off from the lower part of the syringe was collected to obtain about 5 ml of a rat IgG2a antibody solution. As a result of examining the purity of the IgG2a antibody solution by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, no band was detected other than the two bands derived from the H chain and L chain of the IgG2a antibody. The recovery rate of the IgG2a antibody in this purification step by the absorbance measurement method was almost 100%.
As described above, the monoclonal IgG2a was isolated from rat ascites by the method for purifying antibodies by the batch method according to the present invention.
The antibody could be separated and purified to high purity without losing the antibody. Example 3 A slurry prepared by mixing and stirring an aqueous solution of aluminum nitrate and an aqueous solution of triammonium phosphate so as to have an aluminum orthophosphate composition was spray-dried at 200 ° C. and dried.
８０80 μm spherical particles were obtained. The product is further added to 100
Heat treatment was performed at 0 ° C. for 12 hours to obtain porous spherical particles of aluminum orthophosphate.

【００２２】免疫グロブリンクラスＧ２ｂ（ＩｇＧ２
ｂ）のモノクローナル抗体を含有するマウス腹水５ｍｌ
を試験管に入れ、オルトリン酸アルミニウム球状粒子
２.５ｇを加えて５分間振盪し、ＩｇＧ２ｂ抗体をオル
トリン酸アルミニウムに吸着させた後、５分間静置して
分離材粒子を自然沈降させ、上澄みを捨てた。腹水中の
夾雑成分である血清アルブミンなどを除去するためにｐ
Ｈ７.０に調整した１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液２
０ｍｌを加え、振盪させた後、５分間静置して分離材粒
子を自然沈降させ、上澄みを捨てた。その後、ＩｇＧ２
ｂ抗体を回収するために、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩
衝液でｐＨを７.０に調整した３００ｍＭ塩化ナトリウ
ム溶液１０ｍｌを加え、振盪させた後、５分間静置して
分離材粒子を自然沈降させ、上澄みを回収し、マウスＩ
ｇＧ２ｂ抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のマウスモ
ノクローナルＩｇＧ３抗体の純度と回収率は実施例２と
同じであった。 実施例４ リン酸マグネシウムアンモニウム・六水和物を６００℃
で６時間反応させた後、生成物をボールミルで粉砕して
ピロリン酸マグネシウム微粒子を得た。この微粒子を水
に分散して調製したスラリーを原料として、公知の撹拌
造粒法によって平均粒子径５００μｍ〜３ｍｍの球状粒
子を作製し、それを７００℃で６時間熱処理してピロリ
ン酸マグネシウムの球状粒子を得た。The immunoglobulin class G2b (IgG2
5 ml of mouse ascites containing the monoclonal antibody of b)
Was placed in a test tube, 2.5 g of aluminum orthophosphate spherical particles were added, and the mixture was shaken for 5 minutes. The IgG2b antibody was adsorbed to aluminum orthophosphate, and then allowed to stand for 5 minutes to allow the separation material particles to sediment spontaneously. Threw away. In order to remove serum albumin and the like, which are contaminants in ascites fluid,
10 mM sodium phosphate buffer 2 adjusted to H 7.0
After adding 0 ml and shaking, the mixture was allowed to stand still for 5 minutes to spontaneously settle the separating material particles, and the supernatant was discarded. After that, IgG2
b) In order to collect the antibody, 10 ml of a 300 mM sodium chloride solution adjusted to pH 7.0 with a 10 mM sodium phosphate buffer was added, and the mixture was shaken. The supernatant was collected and mouse I
About 10 ml of a gG2b antibody solution was obtained. Purity and recovery of the purified mouse monoclonal IgG3 antibody were the same as in Example 2. Example 4 Magnesium ammonium phosphate hexahydrate at 600 ° C.
After 6 hours, the product was pulverized with a ball mill to obtain magnesium pyrophosphate fine particles. Using a slurry prepared by dispersing the fine particles in water as a raw material, spherical particles having an average particle diameter of 500 μm to 3 mm are produced by a known stirring granulation method, and heat-treated at 700 ° C. for 6 hours to form spherical particles of magnesium pyrophosphate. Particles were obtained.

【００２３】免疫グロブリンクラスＧ３（ＩｇＧ３）の
マウスモノクローナル抗体を含有する血清培地（１０％
ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地、抗体濃度：約３０mg／リッ
トル）から得た培養上清２リットルに、１Ｎ塩酸を加え
ｐＨを６.８に調整した。ピロリン酸マグネシウム球状
粒子１０ｇを培養上清に入れて５分間オーバーヘッドス
ターラーで撹拌し、ＩｇＧ３抗体をピロリン酸マグネシ
ウムに吸着させた。次いで、孔径１０μｍのフィルター
を底部に装着したシリンジに培養上清を注ぎこみ、Ｉｇ
Ｇ３抗体を吸着させたピロリン酸マグネシウムを濾別し
た。更に、血清培地中の夾雑成分である血清アルブミン
などを除去するためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液３０ｍｌでピロリン酸マグネシウム
を洗浄した。その後、ＩｇＧ３抗体を回収するために、
リン酸カリウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩
化カリウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリン
ジ下部から留出する溶出液を回収し、マウスＩｇＧ３抗
体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のマウスモノクローナ
ルＩｇＧ３抗体の純度と回収率は実施例２と同じであっ
た。A serum medium containing a mouse monoclonal antibody of immunoglobulin class G3 (IgG3) (10%
1N hydrochloric acid was added to 2 liters of the culture supernatant obtained from a DMEM medium containing FCS (antibody concentration: about 30 mg / liter) to adjust the pH to 6.8. 10 g of magnesium pyrophosphate spherical particles were put into the culture supernatant and stirred with an overhead stirrer for 5 minutes to adsorb the IgG3 antibody to magnesium pyrophosphate. Next, the culture supernatant was poured into a syringe equipped with a filter having a pore size of 10 μm at the bottom, and Ig was added.
The magnesium pyrophosphate adsorbed with the G3 antibody was separated by filtration. Further, magnesium pyrophosphate was washed with 30 ml of 10 mM potassium phosphate buffer adjusted to pH 6.8 in order to remove serum albumin and the like as contaminants in the serum medium. Then, in order to collect the IgG3 antibody,
10 ml of a 500 mM potassium chloride solution whose pH was adjusted to 6.8 with potassium phosphate was poured into the syringe, and the eluate distilled out from the lower part of the syringe was collected to obtain about 10 ml of a mouse IgG3 antibody solution. Purity and recovery of the purified mouse monoclonal IgG3 antibody were the same as in Example 2.

【００２４】なお、本実施例において使用した分離材を
回収し、その使用前後の粒子の形状を走査型電子顕微鏡
で観察したところ、粒子の破壊などは認められず、撹拌
を含むバッチ法による一連の精製操作で使用するに十分
な機械的強度を有することが確認できた。 実施例５ メタリン酸アルミニウム組成となるようにアルミナとリ
ン酸アンモニウムを配合して６００℃で８時間反応させ
た後、生成物を粉砕して微粒子を得た。この微粒子を水
に分散して調製したスラリーを２００℃で噴霧乾燥して
６０〜９０μｍの球状粒子を作製し、それを８００℃で
８時間熱処理した。この球状粒子をＸ線回折分析した結
果、メタリン酸アルミニウム（Ａ型）の結晶であった。The separation material used in this example was recovered, and the shape of the particles before and after use was observed by a scanning electron microscope. As a result, no destruction of the particles was observed. It was confirmed that the resin had sufficient mechanical strength to be used in the purification operation. Example 5 Alumina and ammonium phosphate were blended so as to have an aluminum metaphosphate composition and reacted at 600 ° C. for 8 hours. The product was pulverized to obtain fine particles. The slurry prepared by dispersing the fine particles in water was spray-dried at 200 ° C. to prepare spherical particles of 60 to 90 μm, which were heat-treated at 800 ° C. for 8 hours. As a result of X-ray diffraction analysis, the spherical particles were found to be aluminum metaphosphate (A type) crystals.

【００２５】免疫グロブリンクラスＭ（ＩｇＭ）のマウ
スモノクローナル抗体を含有する無血清培地（ＲＰＭＩ
１６４０培地、抗体濃度：約４０mg／リットル）から
得た培養上清５リットルに、１Ｎ塩酸を加えｐＨを６.
８に調整した。メタリン酸アルミニウム球状粒子２５ｇ
を培養上清に入れて５分間オーバーヘッドスターラーで
撹拌し、ＩｇＭ抗体をメタリン酸アルミニウムに吸着さ
せた。次いで、孔径２０μｍのフィルターを底部に装着
したシリンジに培養上清を注ぎこみ、ＩｇＭ抗体を吸着
させたメタリン酸アルミニウムを濾別した。更に、無血
清培地に添加されている血清アルブミンなどを除去する
ためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸ナトリウム
緩衝液５０ｍｌでメタリン酸アルミニウムを洗浄した。
その後、ＩｇＭ抗体を回収するために、リン酸ナトリウ
ムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ塩化ナトリウム
溶液１５ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリンジ下部から
留出する溶出液を回収し、マウスＩｇＭ抗体溶液約１５
ｍｌを得た。精製後のマウスモノクローナルＩｇＭ抗体
の純度と回収率は実施例１と同じであった。 実施例６ ピロリン酸亜鉛組成となるように酸化マグネシウムとリ
ン酸アンモニウムを７５０℃で８時間反応させた後、生
成物をボールミルで粉砕して平均粒径１００〜２００μ
ｍの粒子を得た。A serum-free medium (RPMI) containing a mouse monoclonal antibody of immunoglobulin class M (IgM)
1N hydrochloric acid was added to 5 liters of the culture supernatant obtained from 1640 medium (antibody concentration: about 40 mg / liter) to adjust the pH to 6.
Adjusted to 8. Aluminum metaphosphate spherical particles 25g
Was put into the culture supernatant, and stirred with an overhead stirrer for 5 minutes to adsorb the IgM antibody to aluminum metaphosphate. Next, the culture supernatant was poured into a syringe equipped with a filter having a pore size of 20 μm at the bottom, and the aluminum metaphosphate to which the IgM antibody had been adsorbed was filtered off. Further, aluminum metaphosphate was washed with 50 ml of 10 mM sodium phosphate buffer adjusted to pH 6.8 to remove serum albumin and the like added to the serum-free medium.
Thereafter, in order to collect the IgM antibody, 15 ml of a 500 mM sodium chloride solution adjusted to pH 6.8 with sodium phosphate was poured into the syringe, and the eluate distilled out from the lower part of the syringe was collected. Fifteen
ml were obtained. Purity and recovery of the purified mouse monoclonal IgM antibody were the same as in Example 1. Example 6 Magnesium oxide and ammonium phosphate were reacted at 750 ° C. for 8 hours to obtain a zinc pyrophosphate composition, and the product was pulverized with a ball mill to obtain an average particle diameter of 100 to 200 μm.
m particles were obtained.

【００２６】免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）のポリ
クローナル抗体を含有するウサギ抗血清１０ｍｌに、リ
ン酸１ナトリウムおよびリン酸２カリウムを混合して調
整したｐＨ７.０の１０ｍＭ酸緩衝液で５倍に希釈した
もの５０ｍｌに、ピロリン酸亜鉛粒子１０ｇを入れて５
分間オーバーヘッドスターラーで撹拌し、ＩｇＧ抗体を
ピロリン酸亜鉛に吸着させた。次いで、孔径１０μｍの
フィルターを底部に装着したシリンジに希釈した抗血清
を注ぎこみ、ＩｇＧ抗体を吸着させたピロリン酸亜鉛を
濾別した。更に、血清中の夾雑成分である血清アルブミ
ンなどを除去するためにリン酸１ナトリウムおよびリン
酸２カリウムでｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸緩
衝液２０ｍｌでピロリン酸亜鉛を洗浄した。その後、Ｉ
ｇＧ抗体を回収するために、リン酸１ナトリウムおよび
リン酸２カリウムでｐＨを６.８に調整した５００ｍＭ
塩化ナトリウム溶液１０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シ
リンジ下部から留出する溶出液を回収し、ウサギＩｇＧ
抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後のウサギポリクロー
ナルＩｇＧ抗体の純度と回収率は実施例２と同じであっ
た。10 ml of rabbit antiserum containing a polyclonal antibody of immunoglobulin class G (IgG) was diluted 5-fold with 10 mM acid buffer of pH 7.0 adjusted by mixing monosodium phosphate and dipotassium phosphate. 10 g of zinc pyrophosphate particles were added to 50 ml of
The mixture was stirred with an overhead stirrer for minutes, and the IgG antibody was adsorbed on zinc pyrophosphate. Subsequently, the diluted antiserum was poured into a syringe equipped with a filter having a pore size of 10 μm at the bottom, and the zinc pyrophosphate adsorbed with the IgG antibody was separated by filtration. Further, zinc pyrophosphate was washed with 20 ml of 10 mM phosphate buffer adjusted to pH 6.8 with monosodium phosphate and dipotassium phosphate in order to remove serum albumin and the like, which are contaminants in the serum. Then I
To recover the gG antibody, 500 mM adjusted to pH 6.8 with monosodium phosphate and dipotassium phosphate.
10 ml of a sodium chloride solution was poured into the syringe, and the eluate distilled out from the lower part of the syringe was collected.
About 10 ml of the antibody solution was obtained. Purity and recovery of rabbit polyclonal IgG antibody after purification were the same as in Example 2.

【００２７】本実施例は、全工程を低温条件下で行った
が、ほかの実施例における常温条件下での精製と比較し
ても、精製材料に対する抗体の吸着特性に違いは認めら
れず、本発明における抗体の精製方法が、温度条件に依
存することなく利用できることを示すものである。 実施例７ ピロリン酸チタン組成となるように酸化チタンとリン酸
アンモニウムを８５０℃で１２時間反応させた後、生成
物をボールミルで粉砕して平均粒径６０〜１５０μｍの
ピロリン酸チタン粒子を得た。In this example, all the steps were performed under low temperature conditions, but no difference was observed in the adsorption characteristics of the antibody to the purified material even when compared with the purification under normal temperature conditions in the other examples. FIG. 6 shows that the antibody purification method of the present invention can be used without depending on temperature conditions. Example 7 Titanium oxide and ammonium phosphate were reacted at 850 ° C. for 12 hours to obtain a titanium pyrophosphate composition, and the product was pulverized with a ball mill to obtain titanium pyrophosphate particles having an average particle size of 60 to 150 μm. .

【００２８】ヤギ血清５００ｍｌをｐＨ６.６に調整し
た１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で２倍に希釈したも
の１リットルに、ピロリン酸チタン粒子５０ｇを入れて
５分間オーバーヘッドスターラー撹拌し、抗体をピロリ
ン酸チタンに吸着させた。次いで、孔径５０μｍのフィ
ルターを底部に装着したシリンジに希釈した血清を注ぎ
こみ、抗体を吸着させたピロリン酸チタンを濾別した。
更に、血清中の夾雑成分である血清アルブミンなどを除
去するためにリン酸ナトリウムでｐＨ６.６に調整した
１０ｍＭリン酸緩衝液１００ｍｌでピロリン酸チタンを
洗浄した。その後、ＩｇＧ抗体を回収するために、リン
酸ナトリウムでｐＨを６.６に調整した５００ｍＭ塩化
ナトリウム溶液５０ｍｌをシリンジに注ぎこみ、シリン
ジ下部から留出する溶出液を回収し、ヤギＩｇＧ抗体溶
液約５０ｍｌを得た。次いでｐＨ６.６に調整した５０
０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液５０ｍｌをシリンジに注
ぎこみ、シリンジ下部から留出する溶出液を回収し、ヤ
ギＩｇＧ抗体溶液５０ｍｌを得た。ヤギＩｇＧ抗体およ
びＩｇＭ抗体の純度と回収率は実施例１および２と同じ
であった。 実施例８ カルシウムとマグネシウムの原子比が１：１となるよう
にリン酸水素カルシウムとリン酸水素マグネシウムを希
硝酸に溶解し、１５０℃でドライアップ後、８５０℃で
熱分解して、金属成分がカルシウムとマグネシウムの２
成分から成るピロリン酸塩を作製した。生成物はボール
ミルで粉砕して平均粒径８０〜２５０μｍの粒子を得
た。このピロリン酸塩のＸ線回折データはＡＳＴＭのデ
ータ集に収録されているＣａＭｇＰ₂Ｏ₇のＸ線回折デー
タ（X-ray Powder Diffraction File No. 24-135）に一
致した。500 g of goat serum was diluted 2-fold with 10 mM sodium phosphate buffer adjusted to pH 6.6, and 50 g of titanium pyrophosphate particles were added to 1 liter, and the mixture was stirred with an overhead stirrer for 5 minutes, and the antibody was titrated with titanium pyrophosphate. Was adsorbed. Next, the diluted serum was poured into a syringe equipped with a filter having a pore size of 50 μm at the bottom, and the titanium pyrophosphate to which the antibody was adsorbed was separated by filtration.
Further, titanium pyrophosphate was washed with 100 ml of 10 mM phosphate buffer adjusted to pH 6.6 with sodium phosphate in order to remove serum albumin and the like as contaminant components in the serum. Thereafter, in order to collect the IgG antibody, 50 ml of a 500 mM sodium chloride solution adjusted to pH 6.6 with sodium phosphate was poured into the syringe, and the eluate distilled out from the lower part of the syringe was collected. 50 ml were obtained. Then adjusted to pH 6.6 50
50 ml of 0 mM sodium phosphate buffer was poured into the syringe, and the eluate distilled off from the lower part of the syringe was collected to obtain 50 ml of a goat IgG antibody solution. The purity and recovery of goat IgG and IgM antibodies were the same as in Examples 1 and 2. Example 8 Calcium hydrogen phosphate and magnesium hydrogen phosphate were dissolved in dilute nitric acid so that the atomic ratio of calcium to magnesium was 1: 1. After drying at 150 ° C., thermal decomposition at 850 ° C. Is calcium and magnesium 2
A pyrophosphate composed of the components was prepared. The product was pulverized with a ball mill to obtain particles having an average particle size of 80 to 250 μm. The X-ray diffraction data of this pyrophosphate coincided with the X-ray diffraction data of CaMgP ₂ O ₇ (X-ray Powder Diffraction File No. 24-135) included in the ASTM data collection.

【００２９】免疫グロブリンクラスＧ（ＩｇＧ）のポリ
クローナル抗体を含有するラット抗血清５ｍｌをｐＨ
６.８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で１０倍に希
釈したもの５０ｍｌに、ピロリン酸カルシウムマグネシ
ウム粒子１０ｇを入れて５分間振盪し、ＩｇＧ抗体をピ
ロリン酸カルシウムマグネシウムに吸着させた。次い
で、孔径４０μｍのフィルターを底部に装着したシリン
ジに希釈した抗血清を注ぎこみ、ＩｇＧ抗体を吸着させ
たピロリン酸カルシウムマグネシウムを濾別した。更
に、血清中の夾雑成分である血清アルブミンなどを除去
するためにｐＨ６.８に調整した１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液２０ｍｌでピロリン酸カルシウムマグネシウ
ムを洗浄した。その後、ＩｇＧ抗体を回収するために、
１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨを６.８に調整
した５００ｍＭ塩化ナトリウム溶液１０ｍｌをシリンジ
に注ぎこみ、シリンジ下部から留出する溶出液を回収
し、ラットＩｇＧ抗体溶液約１０ｍｌを得た。精製後の
ラットポリクローナルＩｇＧ抗体の純度と回収率は実施
例２と同じであった。5 ml of rat antiserum containing a polyclonal antibody of immunoglobulin class G (IgG) was
Calcium magnesium pyrophosphate particles (10 g) were added to 50 ml of a 10-fold diluted solution of 6.8 10 mM sodium phosphate buffer, shaken for 5 minutes, and the IgG antibody was adsorbed on calcium magnesium pyrophosphate. Subsequently, the diluted antiserum was poured into a syringe equipped with a filter having a pore size of 40 μm at the bottom, and calcium magnesium phosphate adsorbed with the IgG antibody was filtered off. Further, calcium magnesium phosphate was washed with 20 ml of 10 mM sodium phosphate buffer adjusted to pH 6.8 in order to remove serum albumin and the like as contaminant components in the serum. Then, in order to collect IgG antibodies,
10 ml of a 500 mM sodium chloride solution whose pH was adjusted to 6.8 with a 10 mM sodium phosphate buffer was poured into the syringe, and the eluate distilled off from the lower part of the syringe was collected to obtain about 10 ml of a rat IgG antibody solution. Purity and recovery of rat polyclonal IgG antibody after purification were the same as in Example 2.

【００３０】[0030]

【発明の効果】以上のように本発明に係わる抗体の精製
方法は、治療薬、診断薬、高感度試薬、触媒などに応用
が期待されている抗体を効率よく簡単に、かつ安価に回
収・精製できるため、工業的に大量生産する方法として
利用できるものである。更に本発明の方法は中性付近に
ｐＨを調製した溶離液を使用することができるため、抗
体にとって極めて温和な分離条件となり、得られる抗体
の活性を損なう恐れがないという優れた効果を奏する。As described above, the method for purifying antibodies according to the present invention can efficiently and simply and inexpensively recover antibodies expected to be applied to therapeutic agents, diagnostic agents, highly sensitive reagents, catalysts, and the like. Since it can be purified, it can be used as a method for industrial mass production. Furthermore, since the method of the present invention can use an eluent whose pH has been adjusted to around neutrality, the separation conditions are extremely mild for the antibody, and have an excellent effect of not impairing the activity of the obtained antibody.

Claims (5)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 抗体を含有する溶液をリン酸の金属塩か
らなる分離材と接触させ、抗体を該分離材に吸着させた
後、溶液と該分離材を分別し、更に該分離材から抗体を
溶離・回収してなるバッチ法による抗体の分離精製方
法。1. A solution containing an antibody is brought into contact with a separating material comprising a metal salt of phosphoric acid, and after the antibody is adsorbed on the separating material, the solution and the separating material are separated, and the antibody is separated from the separating material. A method for separating and purifying antibodies by a batch method comprising eluting and recovering antibodies. 【請求項２】 リン酸の金属塩がオルトリン酸、ピロリ
ン酸またはメタリン酸の金属塩である請求項１に記載の
抗体の分離精製方法。2. The method for separating and purifying an antibody according to claim 1, wherein the metal salt of phosphoric acid is a metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid. 【請求項３】 オルトリン酸、ピロリン酸またはメタリ
ン酸の金属塩がマグネシウム、カルシウム、ストロンチ
ウム、マンガン、鉄、ニッケル、銅、亜鉛、アルミニウ
ム、ジルコニウム、チタン、イットリウム、ランタン、
珪素から選ばれた金属の塩である請求項１、２に記載の
抗体の分離精製方法。3. The method according to claim 1, wherein the metal salt of orthophosphoric acid, pyrophosphoric acid or metaphosphoric acid is magnesium, calcium, strontium, manganese, iron, nickel, copper, zinc, aluminum, zirconium, titanium, yttrium, lanthanum,
3. The method for separating and purifying an antibody according to claim 1, which is a salt of a metal selected from silicon. 【請求項４】 分離材が、バッチ法による抗体の分離精
製方法における一連の操作において使用するに十分な機
械的強度を持ち、かつ比重が１より大きいことを特徴と
する、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体の分離精製
方法。4. The separation material according to claim 1, wherein the separation material has sufficient mechanical strength to be used in a series of operations in a method for separating and purifying an antibody by a batch method, and has a specific gravity of more than 1. The method for separating and purifying an antibody according to any one of the above. 【請求項５】 分離材への抗体の吸着および分離材から
の抗体の溶離・回収に、ｐＨ６〜８の範囲のｐＨに調整
した溶液を用いることを特徴とする、請求項１〜４のい
ずれかに記載の抗体の分離精製方法。5. The method according to claim 1, wherein a solution adjusted to a pH in the range of 6 to 8 is used for adsorption of the antibody to the separation material and elution and recovery of the antibody from the separation material. Or a method for separating and purifying an antibody.