JPH10513052A

JPH10513052A - ヒト・ヒスタミンｈ▲下２▼ レセプターの新規対立遺伝子およびｈ▲下２▼ レセプター変異種の検出方法

Info

Publication number: JPH10513052A
Application number: JP8523254A
Authority: JP
Inventors: ヒース，ポール，ロイ; オレンジ，ポール，リチャード; ピアソン，ロナルド，カール，アラン; ライト，サイモン，ラルフ
Original assignee: ザユニヴァーシティオブシェフィールド
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 1998-12-15
Also published as: GB2297328B; WO1996023880A2; GB9522889D0; US6015888A; GB2297328A; WO1996023880A3; GB9601844D0; EP0809696A1; AU4785796A; GB9503866D0

Abstract

(57)【要約】ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列であって、Ｇantz et al．（1991）Ｂiochem．biophys．Ｒes．Ｃomm．178，3，1386-1392により公表されたcＤＮＡ塩基配列（位置表示はこれにならった）と比べて６個以下の単一の塩基を下記のように置換したヌクレオチド塩基配列：塩基変更部位：３９８Ｃ、５２５−Ｔ、６２０−Ｇ、６４９−Ｇ、６９２−Ｇ、８０２−Ａ。また、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの特異的領域に対応するＤＮＡの増幅または塩基配列決定のためのプライマーとして適しているオリゴヌクレオチド、およびこれらのオリゴヌクレオチドの少なくとも１種以上を含んでなる診断キットも含まれる。

Description

【発明の詳細な説明】ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの新規対立遺伝子およびＨ₂レセプター変異種の検出方法技術分野本発明はヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの変異種の検出に関し、さらに詳しくはヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの塩基配列決定（sequencing）および同定に役立つ化合物並びにそれらの化合物の特定のヒトの疾病例えば脳障害の診断及び治療における使用に関するものである。本発明は、また、ヒスタミンＨ₂をコードする遺伝子についてのヒトの母集団内の対立遺伝子多型変異（allelic poly morphic variation）を検出するための新規な化合物および方法並びにそれらのヒトの疾病の診断および治療における使用に関するものである。背景技術ヒトＨ₂レセプターは最初にブラックら（Ｂlack et al．Ｎature（1972），23 6,385-390）により同定された。これに続いて、ほ乳類の脳のレセプターがＢaud ry et al.，（1975）Ｎature 253,362-363およびＨaas and Ｂucher（1975）Ｎa ture,255,634-635により実証された。最近、Ｇantz et al．（1991）Ｂiochem．Ｂiophys．Ｒes．Ｃomm．178,3，1386-1392 は胃壁細胞からヒトＨ₂レセプターc ＤＮＡの塩基配列を同定したが、これにはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびイヌＨ₂レセプターからその塩基配列を得て本発明者らのグループがあらかじめクローン化した変性オリゴヌクレオチドプライマー（Ｇants etal．（1991）Ｐroc．Ｎat．Ａcad．Ｓci．ＵＳＡ 88，429-433）を用いた。この塩基配列は、典型的な７つの膜横断領域アミン感受性（aminergic）レセプタータンパクをコードする無イントロン遺伝子として特徴づけられた。このレセプターはヘテロトライマーＧＴＰアーゼ類（Ｇタンパク類）に連結しているが、他のモノアミンレセプターとはこのＧタンパク連結スーパーファミリーがいくつかの点で異なっている。ヒト胃Ｈ₂レセプターはこのクラスの他のレセプターのほとんどのものよりも短く（アミン酸３５９個）、第５番目の膜横断領域（ＴＭ5）に２つのセリン残基を欠いている。その代わりにアスパラギン酸塩残基とスレオニン残基が、これまではこの領域に特異的に、存在する。これら２つの残基は、Ｂirdsall（1991）Ｔrends in Ｐharmacological Ｓci，Ｊan，12, 9-10が示唆しているように、ヒスタミンのイミダゾール環の窒素原子と結合するのに重要であることが考えられる。ヒスタミンは胃腸管、免疫系および脳を含む多くの器官および組織の天然の構成成分である（Ｇreen et al．（1987）Ａgents and Ａctions 22，1-15）。ヒスタミンは脳の中心的神経伝達物質であり、後部視床下部（posterior hypo thallamus）においてヒスチジンデカルボキシラーゼ（ＨＤＣ）により外来性ヒスチジンから形成される。引き続き、ヒスタミンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）により代謝される（Ｐrell et al．（1986）Ａnn.Ｒev.Ｎerosci．9,209- 254）。細胞本体とヒスタミンに対する神経経路はＰanula et al.（1990）の免疫細胞化学を用いて、ヒトの脳についてマッピングされている。その細胞群は後部視床下部の乳頭状核（tuberomamillary nucleus）から脳のほとんどすべての領域に突出している。３つのヒスタミンレセプターＨ₁，Ｈ₂，およびＨ₃、が知られている。後者は自己レセプター（autoreceptor）として機能する。Ｈ₂レセプターはＴraiffort et al．（1992）Ｊ．of Ｎeurochem．59，1，290-299によりオートラジオグラフィを用いてヒト脳に特異的に局在していることが確認された。ヒスタミンは中枢神経系（ＣＮＳ）に顕著な効果を持つことが知られている。ヒスタミンは、Ｈ₁レセプター拮抗剤（例えば、クロルフェニラミン、クロロプロマジン）の鎮静効果が臨床的に認められて以来、ＣＮＳに媒介された興奮の機構に関与していることが知られている。Ｈ₂レセプター拮抗剤をヒト脳に用いて、これらの化合物はＨ₁レセプターに作用するものとは異なり、健常者における精神運動機能、または鎮静または興奮の主観的感情に対してなんら効果がないことが示された（Ｗhite et al．（1988）Ｐsychopharmacology 95，1-14）。Ｈ₂ レセプター拮抗剤のあるもの（例えば、シメチジン）は、高齢のまたは重篤な病気にかかった患者に混乱を引き起こすことが知られているが、これはおそらく一部は共存する抗コリン作動性（anti-chohnergic）効果によるものと考えられる。Ｈ₁およびＨ₂レセプター拮抗剤は大薬用量で幻覚（hallucinations）を引き起こすことが報告されている（Ｃsillag et al．（1973）Ｍed.Ｊ.Ａust.1,653- 654、Ａrgawal（1978）Ｊ．Ａm．Ｍed．Ａssoc．240，214.）動物実験により、ヒスタミンを最高レベルのＨ₂レセプター活性がみられる海馬（hippocampus）に直接投与すると、精神運動の後退と探求行動の減退が引き起こされる。上述の証拠から結論されることは、Ｈ₁レセプター系は興奮と動機づけられた行動の意味で興奮性であるのに対してＨ₂レセプター系は個の点で抑制性である（Ａlvarez and Ｂanzan（1985）Ｐhysiol.Ａnd Ｂeh.34,661-664 and（1986）Ｐhysiol．Ａ nd Ｂeh．37，39-45、Ｗhite et al．（1988）supra.）ということである。Ｈ₂レセプターは精神医学的障害において使用される種々の化合物、例えばアミトリプチリン（amitriptyline）およびミアンセリン（mianserin）、の作用するサイトである（Ｔraiffort et al．（1992）supra.）Ｋaminsky et al．（199 0）Ｔhe Ｌancet 335，1351-1352 および（1991）Ｓchizophrenia Ｂull.4,318- 319は慢性の、陰性タイプの優越する精神***病患者が特異性の高いＨ₂レセプター拮抗剤ファモチジン（famotidine）にうまく応答することを報告している。例えば、一人の患者では***症の欠損症状（例えば、無感動、社会生活からの引きこもり、および無愛想な精神状態（blunted affects）がファモチジン投与中実質的な改善をみせたが、投与を中止すると、これらの症状が再発し、そしてこの薬を再投与すると改善する（Ｋaminski，米国特許第５０７０１０１号および同第５１７７０８１号）。Ｐrell et al．（1992）アブストラクトパート１、199 .6Ｓoc．Ｆor Ｎeurosci．Ａnnual Ｍeeting，Ａnaheim Ｃal．はＮ-テレ-メチルヒスタミン、精神***病患者の脳脊髄液（cerebrospinal fluid）中のヒスタミン代謝物、のレベルが実質的に高まっていることを示しており、このことはこれらの患者で精神医学的症状評価スケールを用いて評価されたこの病気の陰性症状が起きていることと相関関係がある。これらのレベルは投薬を必要としない患者と神経弛緩薬（neuroleptic）を投与中の患者との間に有意の差はなかった。従って、慢性精神***病患者におけるヒスタミン作動活性の増加があることが仮定される。上述の刊行物の記載内容はすべて引用することによりすべての目的でここに導入される。さらに、ヒスタミンはＨ₂レセプターを含むそのレセプターを介して作用するが、脳以外の器官の多数の病気に決定的に関与していると考えられる。これらの病気には消化管潰瘍、喘息を含むアレルギー反応、免疫媒介障害およびおそらく若干の腫瘍が含まれる。ヒスタミンＨ₂レセプターは体内の多くのレセプターの一つである。多くの病気を治療するのに用いられる化合物が働くのは、レセプターを活性化するか、あるいは天然のリガンドであればその作用を阻害することによる。母集団内のレセプターの変異は対立遺伝子変異により引き起こされることが知られており、この変異は患者間の病気の薬剤に対する応答を変えることができる。これの一例としては、Ａrranz et al．（1995）Ｌancet，346(8970)，281-282 により実証された、5-ＨＴ2Ａレセプターにおける対立遺伝子変異と関連した精神***病を治療するのに用いられるクロザピン（chlozapine）に対する応答が挙げられる。発明の開示本発明は、一つの形態において、ヒトの神経学的および神経医学的障害の診断および／または治療の改善に関し、さらに詳しくは精神***病の診断および治療に関する。他の形態においては、本発明は人体の他の系統または器官の病気の診断および／または治療の改善に関する。本発明に至る第一段階として、本出願人はヒトＨ₂レセプターmＲＮＡの新規なオリゴヌクレオチド・プローブを胃壁細胞について入手可能な公表されたcＤＮＡ塩基配列に従って作成した。意外にも、このプローブをその場（in-situ）ハイブリッド形成組織化学をともにヒトの死後脳組織に用いた研究により、脳Ｈ２レセプターのヌクレオチド塩基配列と胃壁細胞Ｈ₂レセプターに不整合があるという証拠が得られた。この発見は、Ｄavis et al．（1986）“Ｂasic Ｍethods in Ｍolecular Ｂiology”page 77 Ｅlsevier Ｓcience Ｐublishing Ｃo.の方法を用いて、最適のハイブリッド形成インキュベーション時間に対するメルトカーブ評価を記録することによりなされた。塩基配列の不整合率は１０％のオーダーであることが見出された。従って、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプター遺伝子のこれまで認識されなかった、脳に特異的であることが考えられる対立遺伝子またはサブタイプが存在することが明らかとなった。第一の形態において、本発明は、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプター遺伝子の新規対立遺伝子に対する塩基配列であって、Ｇantz et al．（1991）Ｂiochem．bi ophys．Ｒes．Ｃomm．178，3，1386-1392により公表されたcＤＮＡ塩基配列と比べて６個以下の単一の塩基を下記のように置換した塩基配列を提供する。もう一つの形態において、本発明はヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列であって、Ｇantz et al．（1991）supraの公表された塩基配列（ここから位置表示法を借用した）と比べて下記の塩基の置換の一つまたは二つ以上を含んでなる塩基配列を提供する。本発明のヌクレオチド塩基配列は、例えば、下記の塩基配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：１としてもリストされている）を含んでいてもよい。特別の例としては、本発明のヌクレオチド塩基配列は下記の塩基配列（ＳＥＱＩＤＮＯ：２としてもリストされている）を含んでいてもよい。本発明のもう一つの形態において、組織サンプルまたは体液に由来するヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターＤＮＡ、cＤＮＡ、またはＲＮＡを含むサンプルの塩基配列を同定するために一連の新規オリゴヌクレオチドプライマーが開発されている。この形態においては、本発明は、から選ばれるヌクレオチド塩基配列を有する、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域に相当するＤＮＡを増幅するためのプライマーとして適している新規オリゴヌクレオチドおよびこれら新規オリゴヌクレオチドの一つまたは二つ以上を含んでなる診断キットを提供する。上述の新規オリゴヌクレオチドプライマーのための方向と開始塩基番号は下記の通りである。プライマー開始塩基番号１）上流８２）下流１０３６および１０９５３）上流９９５４）下流１０１２（Ｎo.３逆順）５）下流８９８および１１７１６）上流５２７７）下流５４４（Ｎo.６逆順）８）上流６３８９）下流６５５（Ｎo.８逆順）上述のヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターについての情報はＭＲＣデアズベリ（Ｄaresbury）データベースアクセッシング“Ｇenem61”ＦileＮo.Ｍ64799 から得た。上述の置換により、特異的制限エンドヌクレアーゼによる切断の部位が、下記のように、変更され、新しく導入されまたは除去される。さらに、本発明は上述の新規オリゴヌクレオチドプライマーの一つまたは二つ以上を含んでなる診断キット、および好ましくは上述のエンドヌクレアーゼの一つまたは二つ以上を、任意的に他の一種または二種以上の緩衝液とともに含んでなる診断キットを提供する。キットは遺伝子型（ゲノタイプ）または塩基の変異を確認するのに使用することができる。この情報は、ここに含まれている開示から当業者に了解されるように、個人の病気罹患性、病気の推移、予後および／または治療に対する応答を予測するのに用いることができる。予測することができる治療応答または有効性は例えば、ファモチジンのようなＨ₂レセプター拮抗剤の使用のような薬物治療、あるいは社会的または心理学的介入のような他の治療形態を含んでいてもよい。本発明のタンパクおよび／またはペプチドをコードするＤＮＡ塩基配列を含んでなる真核表現ベクターは新規材料であり、これらも本発明に含まれる。ホスト細胞は、例えば、Ｎtera ２ c.dl のようなヒト・セルラインをクローニングしたものであるが、本発明の新規表現ベクターを用いて形質転換することができ、これらも本発明に含まれる。本発明の表現ベクターおよびそれにより形質転換されたホスト細胞は、例えば、上に詳述したように調製することができ、コードされたタンパクは下記の例示的方法の一つまたは二つ以上により検査することができる。１．ホモジナイズしたヒト組織、例えば脳、から酸性グアニジンチオシアネート法（Ｃhomczynski ＆Ｓaach（1987），Ａnal．Ｂiochem．161，156-159）により全ＲＮＡを抽出する。これからメッセンジャＲＮＡ（mＲＮＡ）を精製するが、この精製は、例えばプロメガポリアトラクト（Ｐromega ＰolyＡttract（登録商標））系を用いて、mＲＮＡの大部分に存在するオリゴ（ｄ）Ｔのポリアデニレート・テイルにハイブリッド形成することにより行う。特異的逆転写酵素、例えばＳuperscript II、Ｇibco ＢＲＬ,を用いてmＲＮＡの逆転写をした後、得られた生成物を、特異的オリゴヌクレオチドプライマー、例えば上述したもの、を用いて、ＰＣＲ増幅する。得られた増幅cＤＮＡを表現ベクター、例えばプロメガ社から入手できるpＧＥＭＥＸ（登録商標）-1 ベクターに連結する。コンピーテント細胞、例えばバクテリア株ＪＭ109（ＤＥ3）もプロメガ社から入手できるが、これらをこのベクターを用いて形質転換し、有効な形質転換体を選択し培養する、適当なプロモータ、例えばＩＰＴＧ、を用いて、コードされたタンパクの表現を誘起し、表現されたタンパクを標準の生化学的手順、例えば細胞溶解およびポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて細胞培養物から精製する。２．上述のcＤＮＡによりコードされた機能性タンパクを検査する別の方法としては、クローニングされたcＤＮＡの転写を上述のように誘起し、上述のように細胞培養物から特異的mＲＮＡを精製する。精製されたmＲＮＡをコンピーテント細胞、例えばカエル卵母細胞（oocyte）またはチャイニーズハムスター卵細胞、に導入し、コードされたタンパクの機能を標準の薬理学的および生理学的手法、例えば微小電極記録手法およびレセプター連結手法、により検査する。３．上述の１と同様であるが、cＤＮＡを連結された転写−翻訳系、例えばＴＮＴ（プロメガ社製）、に導入し、ついでコードされたタンパクを上述のように精製および分析する。本発明を下記の実施例により説明する。実施例１この実施例は、本発明による特定の新規なオリゴヌクレオチド・プライマーを用いた、対立ヒトＨ₂レセプター遺伝子の同定および塩基配列決定を説明する。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の生成物は、ヒトＤＮＡから調製する。ＤＮＡは、ヒト脳組織から、まず最初に液体窒素中で約１ｇの組織を粉砕し、次いで１０ｍlの溶解緩衝液（０．３２Ｍのスクロース、１０ｍＭのトリス、５ｍＭの塩化マグネシウム、１％のトリトン(Ｔriton)Ｘ−１００、ｐＨ８．０）を添加することにより抽出した。この溶液を遠心分離し（９，０００ｒｐｍ、１５分間）、組織をペレット化し、上記溶解緩衝液を除去し、該ペレットを４．５ｍｌの７５ｍＭ塩化ナトリウムおよび２４ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁した。次いで、この溶液を３時間にわたって、２５０μｌの１０％ＳＤＳおよび２ｍｇのプロテイナーゼＫで５６℃でインキュベートした。次いで、この水相を、５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で２回抽出した。次いで、酢酸ナトリウムを０．３Ｍ、ｐＨ７．５まで、および２倍容のエタノール（−２０℃で）を、上記水相に添加し、ＤＮＡをＴＥ緩衝液にすくいだした（hooked out）。このＤＮＡの濃度は、サンプルの光学濃度を２６０ｎｍの波長で測定することにより決定した。上記ＤＮＡは、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応により、上記のオリゴヌクレオチド・プライマー１）および２）を用いて３６サイクルにわたって増幅した。各サイクルの時間的調節は、９４℃で１分間、５６℃で１．５分間および７２℃で２分間であり、これに続いて、７２℃で１０分間伸張した（Ａmplitaq ＤＮＡポリメラーゼ；Ｐerkin-Ｅlmer Ｃetus）。この反応は、ゲル電気泳動により分析したところ、１０４７塩基対のＤＮＡフラグメントを生じた。ＤＮＡのＰＣＲ増幅に続いて、ＰＣＲ生成物を直ちに連結し、ＴＡクローニング系(ＩnvitroＧen)にクローニングした。この形質転換した細胞を、５０μｌ／ｍｌのアンピシリンおよび１．６ｍｇのＸ−Ｇａｌを含有するＬuria-Ｂertani プレートに広げた。次いで、このプレートを、３７℃で一夜インキュベートした後、４℃で４時間にわたって発色させた。陽性のもの（白色コロニー）は、５ｍｌの培養物(culture)を一夜にわたって３７℃で増幅させ、プラスミドを抽出し［Ｑiaspin minipreps(Ｑiagen)］、ＥｃｏＲＩ消化を行って、正しい大きさの生成物が該プラスミドに含有されていることを確認することにより分析した。ＰＣＲ生成物のクローニングに用いたプラスミドは、ｐＣＲ（登録商標）IIベクターであり、これは、ワン・ショット（Ｏne Ｓhot；登録商標）ＩｎＶａＦ′コンピーテント細胞に形質転換される。クローン化されたＰＣＲ生成物の両ストランドは、ジデオキシヌクレオチド連鎖末端法(dideoxynucleotide chain-terminated method)を用いて塩基配列を決定した（シーケナーゼ(Ｓequenase)バージョン２．０(Ａmersham/ＵＳＢ)を用いて行った）。クローン化されたＤＮＡの短いストレッチの部分的な配列決定には、上記のオリゴヌクレオチド・プライマー１）〜９）の全部を用いた。クローン化されたＰＣＲ生成物は、先述の６個の単一塩基の置換を除いては、Ｇantzらの胃部のｃＤＮＡと同一であることがわかった。結果および検討上記の方法から誘導される塩基配列を以下および配列番号２（ＳＥＱＩＤＮＯ：２）に一覧する。実施例２この実施例は、大きな母集団における塩基変化の存在の確認を説明する。これは、ヒトＤＮＡ由来のＨ₂レセプター遺伝子の９０９塩基対フラグメントのＰＣＲ増幅に基づくアッセイ、および続いて行われる特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いた開裂により可能になる。単一の塩基変更は、当業者にとって公知の他の技術（例えば、一重鎖確認多形性（single stranded confirmational polymor phisms；ｓｓｃｐ）、化学的開裂、ＰＣＲサーモリガーゼ反応、他）を用いても検出可能であることは、当業者には明らかであろう。血液のサンプルをヒト志願者からＥＤＴＡで被覆した管に集め、この血液の１ｍｌを１００℃に１５分間にわたって加熱し、次いでマイクロ遠心機で１３，０００×ｇで１５分間にわたって遠心する。この上清を集め、細胞の破砕物を捨てる。次に、０．５〜３μｌのこの上清を、ＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡとして用いて、レセプター遺伝子の８〜９１５番目の塩基の一部を増幅する。このＰＣＲ反応の条件は、３ｍＭＭｇＣｌ₂(Ｇibco ＢＲＬ)、１×ＰＣＲ緩衝液(Ｇibco ＢＲＬ)、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ(Ｐromega)の各々を１ｍＭ、オリゴヌクレオチド・プライマー１）および５）（上記のもの）の各々を１ピコモル、および１ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ(Ｇibco ＢＲＬ) であり、ＤＮアーゼを含有しない滅菌水によって全量を５０μｌに調整する。この混合物を、以下の条件にかける：９６℃で５分間；次に、９６℃で１分間、５６℃で１分間、７２℃で１分間および２０秒間、を３５サイクル。得られた生成物の１０μｌを、１％アガロースゲル上で分析して、上記反応のターゲットであるＤＮＡフラグメントが正確に増幅しているのを確かめる。次に、１１．５μｌの上記ＰＣＲ混合物を、２ユニットのＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼ(Ｆermentas)および１．５μｌの１０×緩衝液に添加して、６５℃で３〜２４時間にわたってインキュベートする。この反応の生成物を、２．５％アガロースゲル上で分析する。Ｇantsにより記載された元の塩基配列（Ｈ₂Ａと名付けられる）が増幅されている場合には、５７４および３３５塩基対のバンドが見え、これは、個体がＡ／Ａホモ接合体であることを示す。実施例１で記載されている配列（Ｈ₂Ｂと名付けられる）が増幅されている場合には、ＰＣＲ生成物のＴａｑＩ開裂の後で、３３５、３０６および２６８塩基対のバンドが見られ、これは、個体がＢ／Ｂホモ接合体であることを示す。５７４、３３５、３０６および２６８塩基対のバンドが見える場合には、個体がＡ／Ｂヘテロ接合体であることを示す。典型的な結果を図１に示すが、この図は、４つの別の個体からの、臭化エチジウムで染色した２.５％ＴＢＥアガロースゲルを示し、これは９０９塩基対のＰＣＲフラグメントのＴａｑＩ消化パターンを示す。レーンＡ＋Ｇ − １００塩基対のＤＮＡマーカー(Ｇibco ＢＲＬ) レーンＢ＋Ｆ − Ａ／Ｂヘテロ接合体を示すバンドパターンレーンＣ＋Ｅ − Ｂ／Ｂホモ接合体を示すバンドパターンレーンＤ − ブランク矢印は、レーンＢ〜ＦにおけるＤＮＡフラグメントの大きさを示す。実施例３実施例２に記載の方法を、精神***症の個体、彼らの一親等の血縁者、および正常な対照者から抽出した一連のＤＮＡサンプルに適用する。下記の表に記載されているように、これらの個体の遺伝子型において見られるパターンには、Ｐ０．０１未満の統計学上有意な差が観察される。検討Ｈ₂レセプター蛋白質をコードする遺伝子に対するヒト母集団内の多形性の対立遺伝子のバリエーションによって、種々の塩基配列が説明される。この対立遺伝子の多形性により、ヒスタミンによるコード化レセプターの活性化の効果（ヒスタミン結合の効能、活性化の持続性、あるいはそのような活性化の細胞内における効果のいずれか）における実質的なバリエーションが生じる。対立遺伝子の多形性から生じるそのようなバリエーションは、特異的な障害（疾患）に対する感受性を予告(underline)し、脳に作用し、および／または他の系統および器官に影響を及ぼす。つまり、ヒトＨ₂レセプター遺伝子およびその産生物（例えば、ｍＲＮＡおよび蛋白質）におけるこのバリエーションは、特定の精神病または神経病または他の疾患（例えば、精神***症）に対する個体の危険率(risk)を確定する方法として用いることが可能であろう。当業者であれば、本明細書において包含される情報から、本発明の他の具体例を考えることができるであろう。そのような他の具体例は、本出願の範疇にあると意図される。本明細書と同時に提出され、かつ本明細書と共に公表される全ての論文および書類に注目されたい（そのような論文および書類の全ての内量は、ここにおいて引用することにより、本明細書の一部を構成するものとする）。本明細書（添付の請求項、要約書、および図面を含む）において開示される特徴の全て、および／またはそのような開示された工程、または方法またはプロセスの全ては、少なくともそのような特徴および／または工程の少なくとも幾つかが相互に相入れないような組合せでないかぎり、どのような組合せで組合せてもよい。本明細書（添付の請求項、要約書および図面を含む）において開示される各特徴は、特に明確に記載しない限り、同一、同等または類似の目的を満足する別の特徴と置き換えてもよい。したがって、特に明確に記載しない限り、開示される各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の１つの例にすぎない。本発明は、上述の具体例の詳説に限定されない。本発明は、本明細書（添付の請求項、要約書、および図面を含む）に開示される特徴の新規な１つあるいはそれらの新規な組み合わせ、あるいは、そのように開示される方法またはプロセスの工程の新規な１つまたは新規な組み合わせにまで及ぶ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91）Ｇ０１Ｎ 33/50 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ピアソン，ロナルド，カール，アラン英国エヌイー２３エヌエスニューカッスル−アポン−タインジェスモンドキングズウッドロード 12 (72)発明者ライト，サイモン，ラルフ英国エス11 ８ユーイーシェフィールドハンターズバーハンターヒルロード 56

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列であって、Ｇantz et al．（1991）Ｂiochem．biophys．Ｒes．Ｃomm．178，3 ，1386-1392により公表されたcＤＮＡ塩基配列と比べて６個以下の単一の塩基を下記のように置換したヌクレオチド塩基配列：２．ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列であって、下記の塩基配列：（ＳＥＱＩＤＮＯ：１としてもリストされている）を含んでなることを特徴とするヌクレオチド塩基配列。３．ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列であって、下記の塩基配列：（ＳＥＱＩＤＮＯ：２としてもリストされている）を含んでなることを特徴とするヌクレオチド塩基配列。４．請求項１〜３のいずれか一項に記載のヌクレオチド塩基配列を含んでなるＤＮＡから誘導されることを特徴とするタンパクおよび／またはペプチド。５．請求項４記載のタンパクまたはペプチドをコードするヌクレオチド塩基配列を含んでなることを特徴とする表現または組み換えベクター。６．下記：から選ばれる、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域に対応するＤＮＡの増幅または塩基配列決定のためのプライマーとして適当なオリゴヌクレオチド。７．下記：から選ばれるオリゴヌクレオチドの、ヒト・ヒスタミンＨ₂レセプターの領域に対応するＤＮＡの増幅または塩基配列決定のためのプライマーとしての使用。８．下記工程を備えたことを特徴とする、生物学的サンプルのヒトＨ₂レセプターの領域をコードするヌクレオチド塩基配列またはその転写生成物に対応する cＣＮＡの同定方法：ａ）請求項６記載のオリゴヌクレオチドから選ばれる少なくとも一対のプライマーでＤＮＡを増幅する工程、およびｂ）電気泳動ゲル上で前記増幅された塩基配列を検出する工程。９．請求項６記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を含んでなることを特徴とする診断キット。１０．前記１種または２種以上の単一の塩基の置換を実証することができる１種または２種以上の制限エンドヌクレアーゼを含んでなることを特徴とする請求項９記載の診断キット。１１．前記６つの塩基置換の一つまたは二つ以上を含んでなるヒトＨ₂レセプターをコードするＤＮＡのサンプルにおける先天的または後天的対立遺伝子多型変異の検出方法であって、ＤＮＡ塩基配列のＰＣＲ増幅を含むことを特徴とする方法。１２．前記ＰＣＲ増幅工程の後にヒトＨ₂レセプターの単一塩基変異検出工程を行うことを特徴とする請求項１１記載の方法。１３．前記ＰＣＲ増幅工程の後に特異的制限エンドヌクレアーゼ消化を行うことを特徴とする請求項１１または１２記載の方法。１４．請求項６記載のオリゴヌクレオチドの少なくとも１種を、病気への罹患性、病気の推移、予後および／または治療への応答に関する情報を提供するために、個人のヒトＨ₂レセプターの塩基変異を決定するための使用。１５．個体の病気への罹患性、病気の推移、予後および／または治療への応答に関する情報を提供するために、請求項１に記載の塩基変異のいずれかを決定するのに有用なオリゴヌクレオチドを誘導することを特徴とするヌクレオチド塩基配列の使用。１６．実質的に前記されたヌクレオチド塩基配列を含んでなるcＤＮＡから誘導されたことを特徴とするヌクレオチド塩基配列、タンパクまたはペプチド。１７．実施的に前述されたヒトＨ₂レセプターの領域に対応するＤＮＡの増幅のためのプライマーとして適していることを特徴とするオリゴヌクレオチド。１８．実施例に実質的に記載されていることを特徴とする請求項８記載の方法。１９．請求項５記載の表現または組み換えベクターを含有することを特徴とするホスト細胞。