JPH10511644A - アシル化インシュリン類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は糖尿病の分野に関する。より詳しくは、本発明は、Ａ鎖がヒトインシュリンＡ鎖の天然に存在する配列であり、Ｂ鎖が位置Ｂ２８およびＢ２９のいずれかで修飾されているモノマー性のインシュリンアナログに関する。そのアナログは、ＡまたはＢ鎖のＮ末端またはリジンでモノアシル化されている。アシル化されたインシュリンアナログは延長された作用時間を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 アシル化インシュリン類似体 本発明は、糖尿病の分野に関する。より詳しくは、本発明は延長された作用期 間を有するアシル化インシュリン類似体に関する。 インシュリン置き換え治療（insulin replacement therapy）の有効性によっ て、真性糖尿病の急性合併症による死亡および罹患が予防されている。しかし、 慢性の糖尿病合併症は、血中グルコースの制御が悪いことから主に引き起こされ る永続的代謝不良（persistern metabolic derangement）により、いまだに重大 な健康問題として残されている。Diabetes Control and Complications Trial（ DCCT）からの結果は、Hb Alcの１％の減少が、網膜症の発生率の３５％を越える 改良と相関することを示している。 正常血糖にするために、正常な個人の内生的インシュリン分泌パターンにでき る限る近似するように治療を設計する必要がある。インシュリンに対する一日の 生理的な要求は変動し、２つの相に分けることができる：（ａ）食事に関連する 血中グルコース急増を処理するために、インシュリンのパルスを必要とする吸収 相、および（ｂ）最適な空腹時血糖グルコースを維持するために、肝臓グルコー ス産生を調節するためにインシュリンの維持量を必要とする後吸収相。 従って、有効な治療は、外因性インシュリンの２つの種類：高速作用食事時間 インシュリン、および長期作用基礎インシュリンを、組み合わせて使用すること を含む。 長期作用の基底時間作用を得るために、現在のところ、不溶性結晶状態におい てヘキサマーコンホメーションを形成するのに有利な条件下でインシュリンが製 剤化されている。これらの長期作用製剤は、ウルトラレンテ（Ultralente）、レ ンテ（Lente）およびセミーレンテ（semi−Lente）である。しかし、現在の長期 作用製剤の不溶解性は、用量反応における非一貫性および時間作用における非予 測性に関連する問題を生じることが示されている。さらに、現在入手可能な長期 作用インシュリン製剤の１つであるウシ−ウルトラレンテは、免疫原性である。 ウシ−ウルトラレンテの免疫原性の結果として生じる抗体の存在は、急速作用イ ンシュリンの薬物動態を変化させる。 不溶解性ウルトラレンテ製剤の時間作用は、便利な１日１回の基礎インシュリ ンを作るが、多くの医師は事実上、中間時間作用インシュリン、一般にインシュ リン−NPHと称されるインシュリン−プロタミン製剤の使用を好む。インシュリ ン−NPHは、より短い時間作用の薬剤を用いて、最適投与量を調節するのが比較 的容易であるので、基礎インシュリンとして一日に２回使用される。その結果、 中間作用インシュリンが、米国インシュリン市場の７０％を占め、日本では６４ ％、欧州では４５％、および世界的インシュリン市場全体では５５％を占める。 しかし、不溶性インシュリン−NPHおよび不溶性ウルトラレンテインシュリン はどちらも、懸濁製剤である。従って、これらの製剤は本質的に可溶性製剤より も低い予測性であり、その結果、血液グルコーズの適切な制御ができず、生命を 脅かす低血糖症への罹病率が高くなる。従って、集中的インシュリン置き換え治 療を成功させるために、可溶性の長期作用基礎インシュリンが今なお必要とされ ている。本発明は、可溶性基礎インシュリン治療を行うために製剤化することが できるアシル化インシュリン類似体を提供するものである。 ブタ、ウシ、またはヒトインシュリンのアシル化が、MuranishiおよびKisoに よる日本特許出願第１−２５４６９９号に開示されている。下記化合物が具体的 に開示されている：Ｂ２９−Ｎε−パルミトイルインシュリン（εアミノ基がア シル化されている）、Ｂ１−Ｎα−パルミトイルインシュリン（Ｂ鎖のＮ末端α アミノ基がアシル化されている）、およびＢ１、Ｂ２９−Ｎα,Ｎε−ジパルミ トイルインシュリン（εアミノおよびＮ末端αアミノ基の両方がアシル化されて いる）。MuranishiおよびKisoは、アシル化インシュリンがインシュリンと同様 の生物学的プロフィールを有することを開示しているが、投与量、投与ルート、 または当業者がアシル化インシュリンの活性または作用期間を評価するための生 体内モデルの他の条件を開示していない。 同様に、Hashimotoらは、Pharmaceutical Research 6：171-176(1989)におい て、Ｂ１−Ｎα−パルミトイルインシュリン（Ｎ末端αアミノ基がアシル化され ている）、およびＢ１,Ｂ２９−Ｎα,Ｎε−ジパルミトイルインシュリン（εア ミノおよびＮ末端αアミノ基の両方がアシル化されている）を開示している。Ha shimotoらは、Ｂ１−Ｎα−パルミトイルインシュリンおよびＢ１,Ｂ２９−Ｎα ,Ｎε−ジパルミトイルインシュリンの低血糖効果を、雄ラットにおいて、非常 に高い用量である２５Ｕ/ｍＬで調査した。図５は、このような投与量において 静脈内投与した場合に、非常に低い活性であることを示している。図６は、筋肉 内投与した場合の、Ｂ１−Ｎα−パルミトイルインシュリンの短期間のみの低血 糖効果およびＢ１,Ｂ２９−Ｎα,Ｎε−ジパルミトイルインシュリンの無視でき る効果を示している。 MuranishiおよびKiso、ならびにHashimotoらによる生体内での報告に加え、Wa lderらは、ＰＣＴ公開第ＷＯ ９２/０１４７６号において、タンパク質を非極性 基、特に脂肪酸誘導体と化学的に結合することによって、タンパク質およびペプ チドの半減期を、生体内において延長することができることを開示している。脂 肪酸が、タンパク質とアルブミンとの間に架橋基を与える。Walderらはさらに、 非極性基がタンパク質の１つまたは複数の特定部位に限定されるのが好ましいこ とを開示し、ヘモグロビンのシステイン残基の結合を例示している。この文献は 一般に、インシュリンの脂肪酸誘導体を開示している。しかし、どのようなイン シュリンの脂肪酸誘導体も具体的に開示または例示されておらず、インシュリン の脂肪酸誘導体の生物学的活性が維持されることを示すデータも開示されていな い。 モノマーインシュリン類似体の遊離アミノ基の選択的アシル化が、有効な基礎 インシュリン活性を提供することが見い出された。本明細書に記載される非アシ ル化インシュリン類似体は、急速な作用開始および急速な排出（rapid clearanc e）を提供するように設計されている。これらの類似体は、この分野において、 モノマーインシュリン類似体として既知である。そのような類似体を基底活性を 提供するように改質することは、最も予期できないことである。 本発明は、使用時に延長した作用期間を生じるモノアシル化インシュリン類似 体を提供するものである。この類似体は、可溶性製剤として製造することができ るので、現在の基礎インシュリン治療にまさる長所を提供する。本発明の類似体 はまた、用量反応において優れた予測可能性、時間作用における優れた予測可能 性を有し、時間−作用プロフィールにおける明確なピークを有さず、インシュリ ン類似体およびアシル化インシュリン類似体を含んで成る混合製剤の製造に非常 に適している。発明の要旨 本発明は、式： に適切に架橋された、 ［式中、 配列番号１（インシュリンＡ鎖）の１位のXaaは、Gly；あるいは、配列番号２ の１位のXaaがPhe、配列番号２の２８位のXaaがAsp、Lys、Leu、ValまたはAla、 および配列番号２の２９位のXaaがLysまたはProであるときは、アシル化Glyであ り； 配列番号２（インシュリンＢ鎖）の１位のXaaは、Phe；あるいは、配列番号１ の１位のXaaがGly、配列番号２の２８位のXaaがAsp、LyS、Leu、ValまたはAla、 および配列番号２の２９位のXaaがLysまたはProであるときは、アシル化Pheであ り； 配列番号２の２８位のXaaは、Asp、Lys、Leu、Val、Ala；あるいは、配列番号 １の１位のXaaがGly、配列番号２の１位のXaaがPhe、および配列番号２の２９位 のXaaがProであるときは、アシル化Lysであり；および 配列番号２の２９位のXaaは、Lys、Pro；あるいは、配列番号２の２８位のXaa がAsp、Lys、Leu、ValまたはAla、配列番号１の１位のXaaがGly、および配列番 号２の１位のXaaがPheであるときは、アシル化Lysである］ で示されるモノアシル化インシュリン、またはその医薬的に許容される塩を提供 する。 本発明はさらに、本発明のアシル化インシュリン類似体の有効量と１種または それ以上の医薬的に許容される賦形剤とを組み合わせて含有する医薬組成物を、 必要とする患者に投与することによって、高血糖症を治療する方法を提供する。 本発明のアシル化インシュリン類似体と共に、１種またはそれ以上の医薬的に 許容される防腐剤、等張剤、または緩衝剤を含んで成る非経口医薬製剤も、開示 および特許請求されている。 本明細書において使用されているアミノ酸の略語はすべて、37 C.F.R.§1.822 (B)(2)に示されるように、米国特許商標庁によって認められているものである。 「架橋」という語は、システイン残基間のジスルフィド結合の形成を意味する 。適切に架橋されたヒトインシュリンまたはインシュリン類似体は３つのジスル フィド架橋を含んでいる。第一ジスルフィド架橋はＡ鎖の６位および１１位のシ ステイン残基間に形成される。第二ジスルフィド架橋は、Ａ鎖の７位のシステイ ン残基を、Ｂ鎖の７位のシステインに結合させている。第三ジスルフィド架橋は 、Ａ鎖の２０位のシステインを、Ｂ鎖の１９位のシステインに結合させている。 「アシル化Gly」、「アシル化Phe」、および「アシル化Lys」という語は、Ｃ₆ −Ｃ₂₁脂肪酸でアシル化されたGly、Phe、またはLysを意味する。「アシル化基 」という語は、インシュリン類似体のαアミノ基またはεアミノ基に化学的に結 合された脂肪酸を意味する。Ａ１およびＢ１位の遊離アミノ基はαアミノ基であ る。Ｂ２８またはＢ２９位のLysの遊離アミノ基は、εアミノ基である。 「アシル化」という語は、タンパク質の遊離アミノ基に共有結合される１つの アシル基の導入を意味する。「選択的アシル化」という語は、αアミノ基よりも 、εアミノ基を優先的にアシル化することを意味する。 「脂肪酸」という語は、飽和または不飽和Ｃ₆−Ｃ₂₁脂肪酸を意味する。好ま しい脂肪酸は飽和脂肪酸であり、ミリスチン酸(Ｃ₁₄)、ペンタデシル酸(Ｃ₁₅)、 パルミチン酸（Ｃ₁₆）、ヘプタデシル酸（Ｃ₁₇）およびステアリン酸（Ｃ₁₈）を 包含する。脂肪酸がパルミチン酸であるのが最も好ましい。本発明の化合物は、 モノアシル化インシュリン類似体である。このインシュリン類似体は、αアミノ 基またはεアミノ基部位において、Ｃ₆−Ｃ₂₁脂肪酸でアシル化されている。こ の類似体は、リジンのεアミノ基部位においてモノアシル化されているのが好ま しい。 「活性化脂肪酸エステル」という語は、Methods of Enzymology，25，494-499 (1972)およびLapidotら、J ．of Lipid Res. 8: 142-145(1967)に記載されている 一般的方法を用いて活性化された脂肪酸を意味する。活性脂肪酸エステルは、ヒ ドロキシベンゾトリアジド（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドおよび それらの誘導体のような、一般に使用されるアシル化剤を包含する。好ましい活 性化エステルは、Ｎ−スクシンイミジルパルミテートである。 「可溶性」という語は、インシュリン類似体をアシル化するのに充分な量のエ ステルが、液相に存在することを意味する。類似体１モル当たり１〜２モル当量 の活性化エステルが、液相に存在するのが好ましい。 本明細書において使用される「モノマーインシュリン類似体」または「インシ ュリン類似体」という語は、二量化または自己会合（self-association）しにく い急速作用インシュリン類似体を意味する。モノマーインシュリン類似体は、Ｂ ２８位のProがAsp、Lys、Leu、Val、またはAlaで置換され、Ｂ２９位のLysがリ ジンまたはプロリンである、ヒトインシュリンである。モノマーインシュリン類 似体は、Chanceらの米国特許出願第０７/３８８２０１号（ＥＰＯ公開第３８３ ４７２号）および、BrangeらのＥＰＯ公開第２１４８２６号に開示されている。 当業者は、このモノマーインシュリン類似体への他の改質が可能であり、この分 野において広く認められていることを理解するであろう。これらの改質は、Ｂ１ ０ 位のヒスチジン残基のアスパラギン酸での置換；Ｂ１位のフェニルアラニン残基 のアスパラギン酸での置換；Ｂ３０位のスレオニン残基のアラニンでの置換；Ｂ ９位のセリン残基のアスパラギン酸での置き換え；Ｂ１位のみの、またはＢ２位 での削除と組み合わせた、アミノ酸の削除；および、Ｂ３０位からのスレオニン の削除；を包含する。 本明細書において使用される「塩基性条件」という語は、反応の塩基性度を意 味する。εアミノ基部位においてインシュリン類似体を選択的にアシル化するた めに、実質的に全ての遊離アミノ基を脱プロトン化して、反応を実施しなければ ならない。水性溶媒または補助溶媒（co-solvent）において、塩基性条件とは、 ９.０より高いｐＨにおいて、反応が行われることを意味する。有機溶媒中、水 中１０.７５より大きいかまたはそれに等しいｐＫａに相当する塩基性度を有す る塩基の存在下に、反応が行われる。 配列番号１は、前記配列表に示された第一配列を意味し、下記配列： ［配列中、配列番号１（インシュリンＡ鎖）の１位のXaaは、Gly；あるいは、配 列番号２の１位のXaaがPhe、配列番号２の２８位のXaaがAsp、Lys、Leu、Valま たはAla、および配列番号２の２９位のXaaがLysまたはProであるときは、アシル 化Glyである］ を有するヒトインシュリンＡ鎖の類似体を意味する。 配列番号２は、前記配列表に示された第二配列を意味し、下記配列： ［配列中、 配列番号２（インシュリンＢ鎖）の１位のXaaは、Phe；あるいは、配列番号１ の１位のXaaがGly、配列番号２の２８位のXaaがAsp、Lys、Leu、ValまたはAla、 および配列番号２の２９位のXaaがLysまたはProであるときは、アシル化Pheであ り； 配列番号２の２８位のXaaは、Asp、Lys、Leu、Val、Ala；あるいは、配列番号 １（インシュリンＡ鎖）の１位のXaaがGly、配列番号２（インシュリンＢ鎖）の １位のXaaがPhe、および配列番号２の２９位のXaaがProであるときは、アシル化 Lysであり；および 配列番号２の２９位のXaaは、Lys、Pro；あるいは、配列番号２の２８位のXaa がAsp、Lys、Leu、ValまたはAla、配列番号１（インシュリンＡ鎖）の１位のXaa がGly、および配列番号２（インシュリンＢ鎖）の１位のXaaがPheであるときは 、アシル化Lysである］ を有するヒトインシュリンＢ鎖の類似体を意味する。 前記のように、本発明は、式：配列番号２に適切に架橋された配列番号１、で 示されるモノアシル化インシュリン類似体、またはその医薬的に許容される塩、 を提供する。配列番号１（インシュリンＡ鎖）の１位における好ましいアミノ酸 残基は、Glyである。フェニルアラニンが、配列番号２（インシュリンＢ鎖）の １位における好ましいアミノ酸である。配列番号２の２８位における好ましいア ミノ酸残基は、Asp；または配列番号２の２９位におけるアミノ酸残基がProであ るときは、アシル化Lysである。配列番号２の２９位における好ましいアミノ酸 残基は、Lys；または、配列番号２の２８位のアミノ酸残基がアシル化Lysである ときは、Proである。当業者に既知の標準的生化学用語では、好ましい類似体は 、モノアシル化Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンである。最も好ましいアシル化 インシュリン類似体は、Ｃ₈〜Ｃ₁₈脂肪酸、好ましくはＣ₁₄〜Ｃ₁₆脂肪酸でモノ アシル化されている。従って、好ましい脂肪酸は、オクタノニル（Ｃ８）、ノナ ノイル（Ｃ９）、デカノイル（Ｃ１０）、ウンデカノイル（Ｃ１１）、ラウロイ ル（Ｃ１２）、トリデカノイル（Ｃ１３）、ミリストイル（Ｃ１４）、ペンタデ カ ノイル（Ｃ１５）、パルミトイル（Ｃ１６）を包含する。従って、本発明の好ま しい化合物は、Ｂ２９−Ｎε−Asp^B28−パルミトイルヒトインシュリン（Ｂ²⁸が Asp；Ｂ²⁹がアシル化Lys）、Ｂ２８−Ｎε−パルミトイル−Lys^B28Pro^B29−ヒト インシュリン（Ｂ²⁸がアシル化Lys；Ｂ²⁹がPro）、Ｂ２８−Ｎε−オクタノイル −Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン、Ｂ２８−Ｎε−デカノイル−Lys^B28Pro^B29 −ヒトインシュリン、Ｂ２８−Ｎε−ミリストイル−Lys^B28Pro^B29−ヒトインシ ュリン、およびＢ２８−Ｎε−ウンデカノイル−Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリ ン、を包含する。 インシュリンを含むタンパク質の遊離アミノ基のアシル化は、この分野におい て既知である。アシル化の一般的方法が、Methods of Enzymology，25: 494-499 (1972)に記載されており、活性エステル、酸ハロゲン化物、または酸無水物の使 用を包含する。活性エステル、特に脂肪酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス テルの使用が、脂肪酸を用いる遊離アミノ酸のアシル化の有益な手段である。La pidotら、J ．of Lipid Res. 8: 142-145(1967)参照。Lapidotらは、Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステルおよびＮ−ラウロイル−グリシン、Ｎ−ラウロイル −Ｌ−セリン、およびＮ−ラウロイル−Ｌ−グルタミン酸の製造におけるそれら の使用を記載している。 εアミノ基を選択的にアシル化するために、種々の保護基を用いて、結合の間 にαアミノ基をブロックすることができる。適切な保護基の選択は、当業者に既 知であり、ｐ−メトキシベンゾオキシカルボニル（ｐｍＺ）を包含する。アミノ 保護基を用いずに、εアミノ基を一段法合成でアシル化するのが好ましい。極性 溶媒中の塩基性条件下で、活性脂肪酸エステルをタンパク質のεアミノ基と反応 させることによって、アシル化が行われる。反応の塩基性度は、インシュリン類 似体の全ての遊離アミノ基を脱プロトン化するのに充分な塩基性度でなければな らない。弱い塩基性条件下においては、全ての遊離アミノ基が脱プロトン化され ず、Ｎ末端またはαアミノ基の優先的アシル化が生じる。水性溶媒または補助溶 媒中において、塩基性条件は、反応が９.０より高いｐＨで行われることを意味 する。１２.０を越えるｐＨ範囲において、タンパク質分解が結果として生じる ので、反応混合物のｐＨは好ましくは１０.０〜１１.５、最も好ましくは１０. ５である。混合有機および水性溶媒中における、反応混合物の反応のｐＨ値は、 混合前の水性溶媒のｐＨである。 非水性溶媒中において、εアミノ基を充分に脱プロトン化するために、水中１ ０.７５より大きいかまたは等しいｐＫａに相当する塩基性度を有する塩基の存 在下で、εアミノ基の選択的アシル化が行われる。即ち、塩基が少なくともトリ エチルアミンと同じ強さでなければならない。好ましくは、塩基は、テトラメチ ルグアニジン、ジイソプロピルエチルアミン、または水酸化テトラブチルアンモ ニウムである。より弱い塩基の使用は、αアミノ基のアシル化を結果として生じ る。 溶媒の選択は重要ではないが、インシュリン類似体および脂肪酸エステルの溶 解性にほぼ依存する。溶媒は全体的に有機溶媒でなければならない。一般に、許 容される有機溶媒は、ＤＭＳＯ、ＤＭＦなどを包含する。水性溶媒、および水性 および有機溶媒の混合物も使用可能である。極性溶媒の選択は、試薬の溶解性に よってのみ制限される。好ましい溶媒は、ＤＭＳＯ；ＤＭＦ；アセトリトリルお よび水；アセトンおよび水；エタノールおよび水；イソプロピルアルコールおよ び水；イソプロピルアルコール、エタノールおよび水；ならびに、エタノール、 プロパノールおよび水である。好ましくは、溶媒はアセトニトリルおよび水であ り、最も好ましくは５０％アセトニトリルである。当業者は、他の極性基も使用 できることを理解するであろう。 一般に、活性脂肪酸エステルがモル過剰であるのが好ましい。エステルの１〜 ４モル当量、最も好ましくは１〜２モル当量で、反応が行われるのが好ましい。 当業者は、活性エステルの非常に高い濃度において、ビス−またはトリ−アシル 化生成物が有意量で生成されることを理解するであろう。 反応温度は重要ではない。反応は、２０℃〜４０℃で行われ、一般に、１５分 〜２４時間で完了する。 アシル化後、逆相または疎水クロマトグラフィーのような標準的方法によって 、生成物を精製する。その後、凍結乾燥または結晶化のような標準的方法によっ て、 生成物を回収する。 本発明のモノマーインシュリン類似体は、古典（溶液）法、固相法、半合成法 、およびより最近の組換えＤＮＡ法を含む種々の認知されたペプチド合成法のい ずれかによって、製造することができる。例えば、Chanceらの米国特許出願第０ ７/３８８２０１号、ＥＰＯ公開第３８３４７２号、およびBrangeらのＥＰＯ２ １４８２６号は、種々のインシュリン類似体の製造を開示しており、それらに開 示の内容は本発明の開示の一部を構成するものとする。本発明のインシュリン類 似体のＡ鎖およびＢ鎖は、組換えＤＮＡ法を用いて、プロインシュリン様前駆体 分子を経て製造することもできる。本発明の開示の一部を構成する、Frankら、P eptides: Synthesis-Structure-Function ，Proc．Seventh Am．Pept．Symp.，Ed s.D．RichおよびE．Gross(1981)を参照。 下記実施例は、本発明をさらに説明するためにのみ記載されている。本発明の 範囲が、下記実施例のみから構成されると理解すべきではない。実施例１ アセトニトリルおよび水中においてＮ−スクシンイミジルパルミテートを用いる Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンのアシル化 Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン結晶（２.２２ｇ）を、ｐＨ２.５の５０ｍＭ 硼酸溶液１００ｍＬ中に溶解させた。１０％ＨＣｌを用いて溶液のｐＨを２.５ に再調節し、結晶が視覚検査によって充分に溶解するまで溶液を攪拌した。固体 活性エステル２７０ｍｇを、約５０℃に予熱したアセトニトリル２７ｍＬに加え ることによって、活性エステル（Ｎ−スクシンイミジルパルミテート）の溶液を 製造し、全ての活性エステル粒子が視覚検査によって溶解状態になるまで激しく 攪拌した。１０％ＮａＯＨを加えることによって、溶液のｐＨを約１０.２２に 調節し、溶液を４℃で1５分間攪拌した。アセトニトリル（７３ｍＬ）を、ｐＨ を調節した溶液に加え、続いて前もって製造した活性エステル溶液を加えた。反 応を４℃で８５分間行い、１Ｎ酢酸（６００ｍＬ）を加えることによって急冷し 、その結果ｐＨが２.３５となった。Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンの初期量 で割ったＢ２８−Ｎε−パルミトイル−Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンの量、 と して計算された反応収率は、７２.５％であった。実施例２ Ｃ８（Ｂ２８）Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン Lys（Ｂ２８）、Pro（Ｂ２９）ヒトインシュリン（ＫＰＢ）結晶（２.０ｇ） を、ｐＨ２.５の５０ｍＭ硼酸緩衝液２００ｍＬ中に溶解させた。１０％ＨＣｌ を用いて溶液のｐＨを２.５に再調節し、結晶が視覚検査によって充分に溶解す るまで、溶液を攪拌した。固体活性エステル１７５ｍｇを、アセトニトリル２５ ．６２ｍＬに加えることによって、活性エステル（１−オクタノイル−Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミドエステル）の溶液を製造し、全ての活性エステル粒子が視 覚検査によって溶解状態になるまで激しく攪拌した。１０％ＮａＯＨを加えるこ とによって、ＫＰＢ溶液のｐＨを約１０.４に調節し、溶液を周囲温度で約５分 間攪拌した。アセトニトリル（１７６ｍＬ）を、ｐＨを調節したＫＰＢ溶液に加 え、続いて前もって製造した活性エステル溶液を加えた。反応を周囲温度で９０ 分間行い、１０％ＨＣｌ（２.７５％ｖ/ｖ）５.５ｍＬおよび冷ｄＨ２０の３容 量（１２００ｍＬ）を加えることによって急冷し、その結果、最終ｐＨが２.７ ０となった。ＢＨＩの初期量で割った、急冷反応におけるLysＢ２９（Ｃ８）Ｋ ＰＢの量、として計算された反応収率は、７５.５％であった。疎水クロマトグ ラフィー（SP20SS）によって精製するために、溶液を２つの８００ｍＬアリコー トに分けた。カラムクロマトグラフィーに引き続いて、限外濾過および凍結乾燥 を行った。 前記のように、モノアシル化インシュリン類似体の有効量を、必要としている 患者に投与することによって高血糖症を治療するのに、本発明のアシル化インシ ュリン類似体は有効である。本明細書において使用される「有効量」という語は 、治療的または予防的に血糖値を下げるかまたは維持するために必要とされる本 発明のアシル化類似体１種またはそれ以上の量を意味する。この量は一般に、１ 日当たり約１０単位またはそれ以上の範囲である（または、１ｍｇにつき約２９ 単位として、約０.３ｍｇ〜約２ｍｇである）。しかし、実際に投与されるアシ ル化類似体の量は、治療を受けている健康状態（即ち、高血糖の原因）、投与さ れる特定の類似体、選択された非経口投与ルート、個々の患者の年齢、体重、反 応、 および患者の症状の程度に照らして、医師によって決められるものであると理解 すべきである。従って、前記投与量範囲は、いかなる方法においても、本発明の 範囲を制限することを意図するものではない。 本発明のアシル化インシュリン類似体は、有効量の少なくとも１種のモノアシ ル化インシュリン類似体と、１種またはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤ま たは担体とを組み合わせて含有する医薬組成物として、必要とする患者（即ち、 高血糖症の患者）に投与される。このような目的のために、その医薬組成物は一 般に、１ｍＬ当たり約１００単位、または有効量のアシル化インシュリン類似体 を含有する類似の濃度を有するように、製剤化される。これらの組成物は一般に 、必ずではないが、性質上、非経口的であり、この分野で既知の非経口製剤のた めの通常の賦形剤または担体を用いる種々の方法のうちのいずれかの方法によっ て製造することができる。例えば、本発明の開示の一部を構成する、Remington' s Pharmaceutical Sciences ，17th Edition，Mack Publishing Company，Easton ，PA，USA(1985)を参照。例えば、非経口投与のための投与形態は、少なくとも １種のモノアシル化インシュリン類似体の所望量を水性媒体のような注射に適し た非毒性液体賦形剤中に懸濁または溶解させ、懸濁液または溶液を滅菌する、こ とによって製造することができる。または、測定量の化合物をバイアルに入れ、 バイアルおよびその内容物を滅菌および密封してもよい。付随するバイアルまた は賦形剤は、投与前の混合のために使用してもよい。非経口投与に適合する医薬 組成物は、稀釈剤、賦形剤および担体、例えば、水および水混和性有機溶媒、例 えば、グリセリン、ゴマ油、グランドナッツ油（groundnut oil）、水性プロピ レングリコール、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドなどを使用する。そのような医 薬組成物の例は、医薬的に許容される緩衝剤で緩衝することができ、発熱物質を 含まない、モノアシル化インシュリン類似体の、滅菌、等張性、生理食塩水溶液 を包含する。さらに、経口医薬製剤は、メタクレゾールのような防腐剤、または 水酸化ナトリウムまたは塩酸のような最終生成物のｐＨを調節する他の薬剤を含 有することもできる。 本発明のアシル化インシュリン類似体は、混合物として製剤にすることもでき る。混合製剤は、非アシル化インシュリンまたはインシュリン類似体、およびア シル化インシュリン類似体を含んで成る。インシュリンまたはインシュリン類似 体とアシル化類似体との比は、重量ベースで１：９９〜９９：１である。好まし くは、この比は、７５：２５〜２５：７５、最も好ましくは４０：６０〜６０： ４０、さらに好ましくは５０：５０である。混合製剤は、標準的な経口製剤の稀 釈剤中に、所望容量の成分を混合することによって、製造することができる。標 準的な稀釈剤は、等張剤、亜鉛、生理学的に許容される緩衝剤および防腐剤を含 む。生理学的に許容される緩衝剤は、二塩基性燐酸ナトリウムのような燐酸塩緩 衝剤であるのが好ましい。他の生理学的に許容される緩衝剤は、ＴＲＩＳまたは 酢酸ナトリウムを包含する。緩衝剤の選択および濃度は、この分野において既知 である。医薬的に許容される防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、レゾルシ ノール、およびメチルパラベンを包含する。本発明の混合製剤は、比較的速い作 用のインシュリンまたはインシュリン類似体、およびモノアシル化インシュリン 類似体の両方が製剤中で可溶性であるので、特に有益である。したがって、予測 できる作用期間プロフィールを提供する。 下記製剤例は、単に例示的なものであって、いかなる方法においても本発明の 範囲を制限することを意図するものではない。製剤１ 経口製剤を下記のように製造する： 量 フェノール ３０ｍＭ グリセリン １６ｍｇ/ｍＬ アシル化Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン １００Ｕ 亜鉛 ０.７％ 酢酸ナトリウム ３.８ｍｇ/ｍＬ 前記成分の溶液を、治療を必要とする患者に注射によって投与する。 本発明の化合物の有効性を示すために、Ｂ２８−Ｎε−パルミトイルLys^B28Pr o^B29−ヒトインシュリンを、覚醒イヌモデルにおいて試験した。体重８〜１５ｋ ｇの一夜絶食した、覚醒、成長（１〜２年）雌雄ビーグルに関して、実験を行っ た。実験の少なくとも１０日前に、動物にイソフランで麻酔をかけ、右または左 鼠径部に切開部を作った。シラスチックカテーテルを大腿動脈、近位尾側大腿部 静脈に挿入し、４−０絹縫糸で固定した。套管針を用いて、カテーテルの自由端 を皮下から背に通した。次に、カテーテルを、グリセロール/ヘパリン溶液（３ ：１、ｖ/ｖ；最終ヘパリン濃度２５０ＫＩＵ/ｍｌ）で満たし、自由端を結んで 皮下ポケットに入れて、皮膚が完全に閉じるようにした。ケフレックス（Keflex ）を、手術前（２０ｍｇ/ｋｇ、静脈内、および２０ｍｇ/ｋｇ、筋肉内）および 手術後（２５０ｍｇ、経口、１日１回、７日間）に投与して、感染を防止した。 トルブゲシック（Torbugesic）（１.５ｍｇ/ｋｇ、筋肉内）を手術後に投与して 痛みを抑えた。 実験日の直前に採血して、動物の健康状態を判断した。３８％を越すヘマトク リット、および１６０００/ｍｍ³未満の白血球数の動物のみを使用した。実験前 の午後、カテーテルの自由端を、局部麻酔（２％リドカイン）下に作った小さい 切開部を経て皮下ポケットから体外に出し、イヌにテザーシステムジャケット（ tether system jacket）およびカラーアセンブリ（collar assembly）を取り付 けた。 実験の朝、動脈のカテーテルの内容物を吸引し（これらの実験では動脈ライン のみを使用した）、カテーテルを生理食塩水でフラッシュし、延長ライン（ステ ンレス鋼テザーによって保護されている）をカテーテルにつないだ。イヌを代謝 ケージに入れ、カテーテル延長ラインおよびテザーをスイベルシステム（swivel system）につないで、イヌがケージの回りを自由に動けるようにした。１５分 の休息時間後（４５分、対照標準）、血漿グルコース濃度を求めるために採血（ ２〜３.５ｍＬ）した。第二基線サンプルを１５分後に引き出した（０時）。試 験物質（燐酸緩衝生理食塩水、またはＢ２８−Ｎε−パルミトイルLys^B28Pro^B29 −ヒトインシュリン１０.５ミリモル/ｋｇ；この用量は、ヒトインシュリン１. ７５Ｕ/ｋｇのモル当量である）を首の背側に皮下投与した。 次に、次の２時間（対照標準）から６時間（Ｂ２８−Ｎε−パルミトイルLys^{B 28} Pro^B29−ヒトインシュリン）の間、少なくとも３０分毎に、動脈血サンプル（ ２〜３.５ｍＬ）を採った。二ナトリウムＥＤＴＡを含有する真空採血管に集め 、直ぐに氷の上に置いた。サンプルを遠心分離にかけ、得られる血漿をポリプロ ピレン試験管に移し、実験の間、氷上で保管、または冷蔵した。 実験の終わりに、動物に麻酔をかけ（イソフルラン）；カテーテルを新たな生 理食塩水でフラッシュし、グリセロール/ヘパリン混合物で満たし；カテーテル の末端を結び、前記のように皮下に入れ；抗生物質を投与した（３００ｍｇケフ レックス、筋肉内）。実験の日に、ベックマングルコース分析器で、グルコース オキシダーゼ法を用いて、血漿グルコース濃度を求めた。値を、平均＋平均標準 誤差（ＳＥＭ）として表に示す。 血漿グルコース濃度は、、燐酸緩衝生理食塩水の注射に続く２時間の観察期間 中に、基線から有意に変化しなかった（表１）。同じ期間において、Ｂ２８−Ｎ ε−パルミトイルLys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンの皮下投与の結果、血漿グル コース濃度が１５％（１７ｍｇ/ｄＬ）減少した。Ｂ２８−Ｎε−パルミトイルL ys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンで処理した動物の血漿グルコース濃度は、次の ４時間においても徐々に低下し続け、注射後６時間では、基線よりも低いグルコ ース濃度４１ｍｇ/ｄＬに低下した（３５％減少）。 正常なイヌの血漿グルコース濃度は、絶食１週間後でさえも有意に低下しない ことが文献において確認されている。この実験におけるグルコースの減少は、Ｂ ２８−Ｎε−パルミトイルLys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンの投与によるもので あり、従って、この化合物のインシュリン様活性を証明するものである。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式：配列番号２に適切に架橋された配列番号１、で示されるモノアシル化 インシュリン類似体、およびその医薬的に許容される塩。 ２．配列番号２の２８位のXaaがアシル化Lys、および配列番号２の２９位のXa aがProである請求項１に記載のモノアシル化インシュリン類似体。 ３．アシル化基がＣ₆〜Ｃ₁₇脂肪酸である請求項２に記載のモノアシル化イン シュリン類似体。 ４．アシル化基がＣ₁₃〜Ｃ₁₇脂肪酸である請求項２に記載のモノアシル化イン シュリン類似体。 ５．Ｂ２８−Ｎε−パルミトイル−Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン。 ６．Ｂ２８−Ｎε−ミリストイル−Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリン。 ７．請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノアシル化インシュリン類似体と 共に、１種またはそれ以上の医薬的に許容される防腐剤、等張剤、または緩衝剤 を含んで成る非経口医薬製剤。 ８．インシュリンまたはインシュリン類似体と、請求項１〜７のいずれか１項 に記載のモノアシル化インシュリン類似体との混合物を含んで成り、２つの成分 の重量比が約１〜９９：９９〜１である非経口医薬製剤。 ９．混合物がLys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンおよびＢ２８−Ｎε−アシル化 Lys^B28Pro^B29−ヒトインシュリンである請求項８に記載の非経口医薬製剤。 １０．請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノアシル化インシュリン類似体 の有効量を含有する医薬組成物を患者に投与することを含んで成る高血糖症の患 者の治療方法。 １１．請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物、等張剤、および生理学的 に許容される緩衝剤を混合することを含んで成る非経口医薬製剤の製造方法。 １２．真性糖尿病の治療に使用するための、請求項１〜７のいずれか１項に記 載のモノアシル化インシュリン類似体。 １３．実質的に実施例のいずれかに関して記載したようなモノアシル化インシ ュリン類似体。