JPH10510720A

JPH10510720A - タンパク質検出法

Info

Publication number: JPH10510720A
Application number: JP9514730A
Authority: JP
Inventors: デンブレークヘンリエッテカタリーナファン; グラーフレーンデルトヘンドリックデ; ヤコブヴィーゼル; オーイェンアルベルトヨハネスヨゼフファン
Original assignee: ギストブロカデスベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1995-10-13
Filing date: 1996-10-14
Publication date: 1998-10-20
Also published as: WO1997013853A3; AU7294396A; WO1997013853A2; EP0796328A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、関心の対象となっているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法で、この方法においては該タンパク質の産生が可能な真核生物から入手できるDNA によって形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現についてスクリーニングし、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後に行われることを特徴とする方法を提供する。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来するものが好ましい。この真核生物は、好ましくは、真菌又は酵母細胞であり、より好ましくはアスペルギルス属であり、最も好ましくは多くのアスペルギルス・ニガー群の一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。

Description

【発明の詳細な説明】タンパク質検出法発明の分野本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 配列を決定する方法に関する。発明の背景最近のバイオテクノロジーの大きな試みのひとつは、ある機能を果たす新規酵素を発見することである。酵素には、例えば食品産業、洗剤、デンプン転化、動物飼料、及び各種産業における加工助剤のような領域において、多くの用途がある。それに加え、酵素的転化は、いくつかの医薬化合物の合成などの様々な作業のための化学的転化の代用となる。一般に酵素は、費用効果的であり、特異的かつ環境に優しい触媒として、一般性を増しつつある。従って、酵素の用途の範囲を広げるような新規酵素活性を見つけること、又は特定の用途により適した酵素を見つけることは、酵素産業のひとつの大きな試みである。新規酵素の探求は、従来は、天然の多様性を研究することで行われてきた。現在市販されているほとんどの酵素は、微生物を起源としている。細菌、酵母及び真菌のような微生物は、特定の活性を持つ酵素を分泌する。様々な生態環境の適所(ecological niches)に由来する微生物をスクリーニングすることによって、今日使用されている酵素類が発見された。しかしこのスクリーニング法には、いくつかの欠点がある。例えば、天然に見出された微生物は、通常、酵素の全配列 (whole array)を分泌する。従って必要とされる酵素は、合成された酵素のごくわずかな割合に相当する。更に微生物は、毒素又は所望でない酵素のような、必要としない化合物を合成する。興味のある遺伝子をクローニングし、その後適当な宿主に導入するために、組換えDNA 技術が適用される。従来の遺伝子クローニング法は、コードされたタンパク質（例えば酵素）の精製、部分的アミノ酸の配列決定、及びその後の興味のある遺伝子の分子クローニングを含み、退屈な作業であった。クローニング後に、興味のある遺伝子を、大規模発酵に適した宿主において発現することができる。この従来の酵素クローニング法に加え、他の方法も使用されている。特定の生物に由来するゲノムDNA は、大腸菌(E．コリ)におけるクローニング、その後の特異的活性のスクリーニングによって、同定することができる。セルラーゼ及びキシラナーゼを含む多数の酵素が、この方法で同定された（Sashihar a N.らの論文、Bact、158:503-506 頁(1984)；Fukumori Fらの論文、Gene、76:2 89-298頁(1989)；Sakka K らの論文、Agric.Biol.Chem.、53:905-910頁(1989)； Zappe H らの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.、27:57-63頁(1987)；Sakka K らの論文、Agric.Biol.Chem.、54:337-342頁(1990)；Srivastava Rらの論文、FE MSMicrobiol.Lett．、78:201-206頁(1991)；Shendye A 及びRao M の論文、FEMS Microbiol.Lett.、108:297-302頁(1993)）。しかしこの方法は、そのDNA が大腸菌において直接発現されるような微生物に限定されている。通常、例えば真菌及び酵母などの真核生物のような無関係の生物に由来した遺伝子は、調節配列の無効又はイントロンの存在のために、発現されない。これらの問題点のいくつかを克服するために、cDNAが、大腸菌ファージにおいて発現されていて、これは、抗体又は酵素活性によって検出されるような機能的タンパク質をもたらしている。しかし抗体の使用（例えば、欧州特許第EP 05061 90号及びその係属出願第EP94202442.3号を参照）には、純粋な酵素が利用可能であることが必要である一方で、溶菌斑の酵素活性は、非常に低く（Karlovsky 及びWolfの論文、Methods Mol.Cell.Biol.、4:40-45 頁(1993)）、酵素活性の即時検出に不適なものにしている。第三の方法は、酵母におけるcDNAの発現である（第WO 93/11249 号；Dalboge 及びHeldt-Hansenの論文、Mol.Gen.Genet 、243:253-260 頁(1994)）。しかしこの方法は、活性酵素を産生するコロニーの割合が少ないために、効果的でない：この方法では、2.5 ×10⁵〜5 ×10⁵クローンが、スクリーニングされなければならない。別の欠点は、この方法が、スクリーニングを行う前に、大腸菌から酵母へ遺伝物質を転移し、かつその後このクローニング操作の停止のために酵母から大腸菌へと戻し転移することが必要な点である。それに加え、酵素活性のレベルは、低い。発明の要約本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片を同定する方法を提供し、この方法では、該タンパク質を産生可能な真核生物から入手できるcDNAで形質転換された細菌の宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現に関してスクリーニングし、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後に行われることを特徴とする。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来することが好ましい。前記真核生物は、好ましくは真菌又は酵母細胞であり、より好ましくはアスペルギルス種であり、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー群の一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。発明の詳細な説明本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法を提供する。この方法は、関心を持たれているタンパク質を産生することが可能な真核生物から入手することができるDNA で形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、該タンパク質の発現に関してスクリーニングすることを含む。この目的のために、該タンパク質の存在を示す試験が用いられる。この宿主細胞のスクリーニングは、形質転換DNA が、プラスミドの一部となった後に行われる。微生物における真核生物遺伝子の発現クローニングの現在の方法と比べ、この方法は、迅速であり、直接的でありかつ非常に効果的である。驚くべきことに、現在の方法の10⁵〜10⁶クローンではなく、10²〜10⁴クローンのスクリーニングによって、多くの陽性クローンが認められてる。本方法の別の驚くべき利点は、現在のコロニースクリーニング法のほとんどとは対照的に、関心を持たれている可能性のある遺伝子産物を含む細菌の内容物が放出されるような、更なる溶菌工程を導入する必要が無いという点である。本発明の方法は全て、原核細胞において行うことができ、遺伝物質を、この方法のいずれかの時点で真核生物に転移する必要が無い。このcDNAライブラリーは、関心を持たれている真核生物の、好ましくは真菌の mRNAから調製される。特に関心を持たれている真菌の例は、アスペルギルス属のものであり、更に詳細に述べると、アスペルギルス・ニガーである。黒色アスペルギルスの名称に関する最近の変化から、本願明細書の用語アスペルギルス・ニガーは、Raper 及びFennell によって定義されたアスペルギルス・ニガー群に認めることができる全ての（黒色）アスペルギルスを含むと定義される（1965年、アスペルギルス属(The Genus Aspergillus)、The Williams & Wilkins Company 、ボルチモア、293-344 頁）。 cDNA調製に使用されるmRNAは、構成的に存在するか、もしくは誘導することができる。本発明の方法は非常に効率的であるので、コロニーの大部分は、関心を持たれているタンパク質を産生するであろう。従って、現在の方法と比べて、本方法は、低レベルのmRNAを有するタンパク質を取扱う際にも、使用することができる。このライブラリーは、ベクターにおいて作製される。このベクターは、例えばプラスミド及びファージベクターのような、遺伝物質の転移及び／又は発現に適したいずれかのビヒクルであることができる。このライブラリーが、ファージベクターによって作製される場合は、ZAP （登録商標）ベクター又はその誘導体が好ましく、λUni-ZAP （登録商標）XRがより好ましい。この方法で得られた一次ライブラリーは、適当な宿主細胞、好ましくはE.coli、更に好ましくはE.coli XL1 Blue MRF’を用いて、増幅される。その後このファージは、好ましくは、糸状菌ヘルパーファージ及びE.coli SO LRのようなE.coli宿主菌株による重複感染によって、ファージミドへと変換される。この方法において、二本鎖ファージミドが形成される。本願明細書において用語“ファージミド”は、プラスミドに変換されたファージゲノムを意味する。スクリーニング以前に、全てのプラークがファージミドに変換されるので、低レベルmRNAを有する興味のあるクローンが、活性に関して、陰性として誤って退けられることはない。従って当業者には、プラーク期のスクリーニングが不必要であることは明らかであろう。本発明の同定法において、関心を持たれているDNA は、該タンパク質の精製、アミノ酸配列決定及び該遺伝子の分子クローニングという、退屈な作業を通じてではなく、これがコードしているタンパク質の発現によって、同定される。発現クローニングのひとつの技術は、プレートアッセイであり、これはcDNAライブラリーを、陽性コロニーのスクリーニングが可能な組成の培地上に播種する。関心を持たれているタンパク質のスクリーニングは、純化タンパク質を必要とせず、活性検出に適したアッセイの入手のみが必要である。これは、例えばセルラーゼ活性が、カルボキシメチルセルロースを含有する上層(overlay)を用い、その後コンゴレッドで染色して肉眼で見えるようにすることで検出できるというような、標準的アッセイであることができる。同様に、アラビノキシラン分解酵素の検出は、エンバクスペルト(oat spelt)キシランを含有するプレートに形成された沈殿によって達成することができる。ヨウ素を用いるデンプンの透明化画分(cle aring zone）によるアミラーゼの検出、４級アンモニウムイオンを用いるペクチンの透明化画分によるポリガラクツロナーゼの検出などを含む、多くの適当なプレートアッセイが、文献に公表されている。しかしDNA がコードしているタンパク質の発現によってDNA を同定することができるような適当な種類のアッセイのいずれかを、本発明の方法で使用することができる。あるいは、例えば適当な標準的アッセイが適用できないような場合には、目的に合わせたアッセイを、タンパク質活性の検出のために開発することができる。本発明の方法を用いて検出される酵素の例は、アミラーゼ、アラビノキシラン分解酵素、カタラーゼ、セルラーゼ、ガラクタナーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、ペクチナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ及びキシラナーゼを含む。関心を持たれているクローンの同定は、更なる溶菌工程を導入せずに可能である。従って本発明は、原核微生物における、真核生物遺伝子の発現クローニングの、迅速で、効果的かつ直接的方法を提供する。更に、本発明は、本発明の方法を用いて同定することができる、単離された核酸断片を提供する。本発明の核酸断片は、DNA 又はRNA を含み、好ましくはDNA を含む。この核酸断片には、１回以上の単離工程が施される。このような単離工程は、当該技術分野で公知のいずれかの適当な手段により行うことができる。本発明の好ましいDNA 断片は、配列番号１、３、５、７及び９に示された配列を有する。しかし本発明の核酸断片は、これらの好ましい断片に限定されるものではない。むしろ本発明は、配列番号１、３、５、７及び９のDNA 配列によってコードされたポリペプチドの活性の一部又は全てを有するポリペプチドをコードしているような、関連した核酸断片を包含し；すなわち、配列番号１又は３のDN A 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）CMCase活性を有するポリペプチドをコードし；配列番号５又は７のDNA 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし；並びに配列番号９のDNA 配列に関連した本発明の配列は、（少なくとも）アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている。従って、本発明は、配列番号１、３、５、７又は９の核酸配列と、高い配列の相同性を有する、単離された核酸、好ましくはDNA の断片の変異体も提供する。従ってこれらは、典型的には、配列番号１、３、５、７又は９と、実質的に相同である。典型的にはこのような変異体断片は、配列番号１、３、５、７又は９と、少なくとも80％の配列の相同性を有する。同様にこのような変異体断片は、欠失、置換又は挿入がコードされたポリペプチドの活性を損なわない限りは、１個以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入により、配列番号１、３、５、７又は９とは異なることができる。従って、これらのコードされたポリペプチドは、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドの活性の一部又は全てを保持する。本発明は、更に、配列番号１、３、５、７及び９の分解変異体；すなわち、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドをコードしているが、異なる核酸配列を有する変異体を包含している。本発明の変異体の核酸断片は、いずれかの微生物から得ることができるが、これらは好ましくは、真菌又は酵母から得、更に好ましくはアスペルギルス属の真菌から、最も好ましくはA ・ニガーvar.ニガー、A ・ニガーvar.ツビゲンシス又はA ・アキュレアツスから得る。本発明の方法を用いて同定される核酸は、組換え核酸の構成に使用することができる。典型的には、これらは、組換え核酸ベクターの形態である。当業者は、関心を持たれている宿主細胞において（過剰に）産生される適当なベクターを調製することができるであろう。好ましい宿主細胞は、細菌（例えばE.coli）、酵母（例えばK.ラクチス）、及び真菌（例えばアスペルギルス）細胞を含む。ベクターは、典型的には１個以上の複製起点を含むので、細菌、酵母又は真菌細胞のような宿主細胞において複製される（これは、分子生物学の標準的技術により、例えば大腸菌において、構成体が複製及び操作されるのを可能にする。）。更にベクター、特に発現ベクターは、通常5'末端から3'末端へと配列した、少なくとも下記の要素を含む：核酸配列の発現を指示するプロモーター、及び任意にプロモーターの調節部位、転写開始部位、翻訳開始コドン、並びに本発明の核酸配列である。このベクターは、更に１種以上の選択マーカー遺伝子、例えば１種以上の抗生物質耐性遺伝子なども含む。このようなマーカー遺伝子は、形質転換体の同定を可能にする。任意に、この構成体は、該プロモーターのエンハンサーも含むことができる。このベクターは、更にポリアデニル化シグナルを、典型的にはこの機能的ポリペプチドをコードしている核酸の3'末端側に含むことができる。このベクターは、更に関心を持たれているポリペプチドをコードしている配列の3'末端側に、転写ターミネーターを含むことができる。このベクターは、更に１個以上のイントロン又は他の非コード配列を、例えば本発明のポリペプチドをコードしている配列の3'末端側に含むことができる。典型的なベクターは、本発明の核酸配列が、該配列の発現が可能なプロモーターに、操作できるように連結している。“操作できるような連結”とは、プロモーター、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸配列が、そのコード配列を該プロモーターの制御下で発現することができるような関係を持つような接合部位を意味する。従って、プロモーター及びコード配列の間の、5'末端側の非コード配列のような要素であることができる。このような配列が、プロモーターによるコード配列の正確な制御を増強するか、もしくは損なわないような場合には、これらを前記ベクターに含むことができる。更に本発明は、本発明の核酸でコードされたポリペプチド類を提供する。これらのポリペプチドは、部分的、実質的又は完全に単離されていて、前述のようにセルラーゼ、キシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を有す。本発明の好ましいポリペプチドは、その配列が配列番号２、４、６、８又は10であるものを含む。しかし本発明は、これらの配列に限定されるものではなく；むしろ、前述の活性の一部又は全てを、典型的には配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチド活性を実質的に有する、本発明の核酸断片によってコードされた全てのポリペプチドを包含している。従って、配列番号２又は４のポリペプチドに関連した本発明の変異体ポリペプチドは、セルラーゼ活性を有し；配列番号６又は８のポリペプチドに関連した変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し；並びに、配列番号10のポリペプチドに関連した変異体ポリペプチドは、アラビノキシラン分解活性を有す。特に本発明は、配列番号２、４、６、８又は10に関連した配列を有する変異体ポリペプチドを提供する。典型的には、このような変異体は、配列番号２、４、６、８又は10と高度の配列同一性、例えば少なくとも70％の相同性を有し、その結果、これらは典型的には、配列番号２、４、６、８又は10のポリペプチドと実質的に相同である。同様に本発明の変異体ポリペプチドは、前述のように、欠失、挿入又は置換が該ポリペプチドの活性を損なわない限りは、１個以上のアミノ酸の欠失、挿入又は置換によって、配列番号２、４、６、８又は10と異なることができる。本発明のポリペプチドは、本発明の組換え核酸から、本発明のポリペプチドの発現をもたらすような条件下での、適当な宿主細胞の培養によって；及び任意に、こうして産生されたポリペプチドの回収によって、産生することができる。このポリペプチドは、当該技術分野において公知のいずれか適当な方法で、回収することができる。実験細菌の増殖、DNA 単離、ハイブリダイゼーション、制限酵素による消化及びDN A 配列決定のような、標準的組換えDNA 技術は、Sambrookらの論文（分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク、19 89年）に従った。実施例実施例I E.coliにおけるアスペルギルス・ニガーのcDNA発現ライブラリーの作製実施例I.1 mRNAの導入及び単離欧州特許出願公開第EP-A-0463706号に記載された方法で、酵母エキスを含まないもの、及びエンバクスペルトのキシランの代わりに粗コムギのアラビノキシラン分画を２％含むものについて、A.ニガーN 400 培養体を、各々69及び81時間培養し、その後ろ過により菌糸体を収集し、次に滅菌した生理食塩水で洗浄した。その後この菌糸体を、液体窒素下で凍結し、次にミクロディスメンブレーター(M icrodismembrator)（ブラウン社）を用いて粉末とした。RNA をCsCl勾配を用いて２回遠心分離した以外は、Sambrookらの論文(1989)に記載されたグアニジンチオシアネート／CsClプロトコールに従って、全RNA を、菌糸粉末から単離した。ポリA+ mRNA を、下記の点を変更したオリゴ(dT)- セルロースクロマトグラフィー(Aviv及びLeder の論文(1972)、Sambrookらの論文(1989))により、全RNA 5mg から単離した：SDS を、全ての溶液から省き、かつ試料負荷バッファーには、ジメチルスルホキシド9 容量％を添加した。実施例I.2 cDNA ライブラリーの作製ポリA+ mRNA ７μg から、cDNAを合成し、かつZAP（登録商標）-cDNA 合成キット（ストラータジーン社）を用い、製造業者の使用説明書に従って、バクテリオファージλUni-ZAP XRに結合した。該cDNAをUni-ZAP XRベクターアームに結合した後、このファージDNA を、Packagene （登録商標）抽出物（プロメガ社）を用いて、製造業者の使用説明書に従って、パッケージングした。ベクターアーム 1.2 μg へのcDNA 120ngの結合、及びその後のこの反応混合物のパッケージングにより、3.5 ×10⁴の組換えファージからなる一次ライブラリーを得た。この一次ライブラリーを、E.coli XL1- Blue MRF'を用いて増幅し、滴定し、かつ４℃ で保存した。実施例I.3 ファージのファージミドへの変換 Maniatisらによって明らかにされた方法で（Maniatisらの論文(1982)、分子クローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、64頁）、プレーティング細菌としてE.coli B B4 を用い、直径85mmのNZYCM （1.5％寒天）プレート上で、アガロース0.7 ％を含有するNZYCM トパガロース(topagarose)中にファージを播種することによって、ファージを増殖した。一晩37℃でインキュベートした後、密集したプレートが得られ、これからファージを、SMバッファー5ml を添加することによって溶出し、かつこのプレートを、４℃で２時間、断続的に振盪し続けた。上清を収集した後、4,000 ×g、４℃で、10分間遠心分離し、溶液から細菌を除去した。その上清に、クロロホルム0.3 ％を添加し、プラーク形成単位(pfu)を測定した。このファージストックは、約10¹⁰pfu/mlを含んでいた。 A.ニガーのcDNAを有する組換えUni-ZAP XRクローンを、ストラータージーン社のcDNA合成キットに含まれた糸状菌ヘルパーファージEXASSIST（登録商標）及び E.coli SOLR 菌株で、製造業者の使用説明書に従って、重複感染し、Bluescript ファージミドに変換した。長期保存のために、約100 クローン／μl の懸濁液を含むグリセロールストックを、-80℃で保存した。実施例II E.coliにおけるアスペルギルス・アキュレアツスのcDNAの発現ライブラリーの作製アスペルギルス・アキュレアツスCBS 101.43の発現ライブラリーを、実施例I のA.ニガーのライブラリーの場合と同様の方法で作製した。A.アキュレアツスCB S 101.43は、Timberlake微量元素、酵母エキス0.1 ％及びダイズオカラ１％を含有する最少培地を用い、30℃で、40、52、64及び76時間増殖した。最少培地は、１リットルにつき、NaNO₃6g、KH₂PO₄1.5g、KCl 0.5g 及びMgSO₄0.5gを含有した。 40及び52時間の菌糸体から、全RNA 及びポリA+ RNAを、実施例I の方法で単離した。このcDNAライブラリーから、約150,000 の一次プラークを増幅した。ファージは、濃度2.2 ×10⁷pfu/ml で保存した。ファージを、実施例I の方法で、ファージミドに変換した。24のランダムクローンからプラスミドを単離した。これらは全て、大きさが0.6 〜2.0kb の間で変動する挿入断片を有した。実施例III セルラーゼ産生コロニーに関するプラスミドcDNAライブラリーのスクリーニングこのスクリーニング法は、Woodらの方法（酵素学的方法(Methods in Enzymolo gy)、160:59-74頁）を基に変更した。 20mlの 2×TY、CMC(シグマ社C-4888)0.2 ％、寒天1.5 ％及び100 μg/mlアンピシリンを含むプレートを用いた。細胞を、１プレートにつき約200 コロニーを含む5ml の上層に播種した。この上層を、50℃に保ち、かつ2×TY、0.2 ％ CMC 、0.75％寒天及び100 μg/mlアンピシリンを含んだ。プレートを、50℃に保たれた、0.5 ％アガロース、0.2 ％CMC及び100 μg/mlアンピシリンを含む5ml で覆った。プレートを乾燥し、かつ37℃で48時間インキュベートした。次に、コンゴレッド0.1 ％（アルドリッヒ社、C8,445.3）5ml を、このプレートに注いだ。１〜２時間染色した後、プレートを、5M NaCl 5ml で、0.5 〜１時間脱色した。 A.ニガーcDNAライブラリー（実施例I ）の約12,000コロニーを播種した。CMC に関するスクリーニングは、89コロニーが、コンゴレッドでの染色後にハロ(hal o)を生じることを示した。コロニーを、大、中及び小ハロの３種類に分けた。各種類から、３コロニーを増殖し、プラスミドを単離し、かつcDNAを配列決定した。いずれも、完全な長さのcDNAの複製を構成していた。これらのプラスミドを、２種のクラスに分けた。各クラスから、１個のコロニーを、CBS(バーン(Baarn) 、オランダ)に寄託した。小ハロを形成するコロニーは、1995年８月３日に寄託し、かつ寄託番号はCBS 589.95であった。大ハロを形成するコロニーは、1995年９月21日に寄託し、かつ寄託番号はCBS 662.95であった。挿入部分のDNA 配列を、これらによってコードされたアミノ酸配列と共に、それぞれ配列番号１及び３に示した。実施例IV アラビノキシラン分解活性を生じるコロニーにおけるプラスミドcDNA ライブラリーのスクリーニング実施例IV.1 エンドキシラナーゼ活性のスクリーニングこの方法は、実施例III において、セルラーゼ産生コロニーについて用いたものと同様の方法であった。下層は、2×TY、寒天1.5％及びアンピシリン100μg/m lを含む。細胞は、2×TY、エンバクスペルトキシラン（シグマ社、X-062 7）0.2 ％、寒天0.75％及びアンピシリン100 μg/mlを含む上層に播種した。最上層は、 pH7.4 の25mMリン酸バッファー中に、アガロース0.5 ％、RBB-キシラン（シグマ社、M5019）0.1 ％及びアンピシリン100 μg/mlを含んでいた。実施例I で得られたA.ニガーcDNAライブラリーから、約2000コロニーを播種した。46コロニーが、ハロを生じた。RBB-キシラン0.3 ％の最上層を伴う2 ×TYプレート上で再度スクリーニングした後には、24コロニーが、再びハロを生じた。これらを、制限酵素による消化で分析し、かつ２種のクラスに分けた。各クラスの６個のコロニーについて、一部配列決定した。両方の（クローンの）cDNA型を、1995年８月３日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 590.95及びCBS591.9であった。挿入部分のDNA 配列を、これらがコードしたアミノ酸配列と共に、それぞれ配列番号５及び７に示した。実施例IV.2 エンバクスペルトのキシランのスクリーニングこのプラスミドライブラリーを、更に、エンバクスペルトのキシラン２％を含有する最少培地プレート上に播種した。37℃で２日間保った後、いくつかのコロニーがハロを生じ、これはエンドキシラナーゼの産生を示した。他のコロニーは、コロニーの周囲に沈殿環を生じた。後者のコロニーの５個について、部分的に配列決定した。これらは、その単離が係属出願である欧州特許第EP94202442.3号に開示された、アラビノキシランを分解するcDNAに類似していた。A.ニガーaxdA cDNAを含むコロニーを、1995年８月３日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 592 .95であった。この挿入部分のDNA 配列を、これがコードしているアミノ酸配列と共に、配列番号９に示した。これらの実施例は、明らかにされたシステムが、原核生物における、真核生物 DNA の、迅速で、直接的かつ効果的な発現クローニングのために使用することができることを示している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｎ 9/42 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者デグラーフレーンデルトヘンドリックオランダエヌエル−6862セーカーオーステルベークコルネリスコーニングストラート８ (72)発明者ヴィーゼルヤコブオランダエヌエル−6703セーカーワーヘニンヘンヒンケロールドセウェーグ５ (72)発明者ファンオーイェンアルベルトヨハネスヨゼフオランダエヌエル−2275イックスイックスフォールブルフオーヴェルブルフカーデ 78

Claims

【特許請求の範囲】１．関心の対象となっているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法であって、該タンパク質の発現に関して、該タンパク質の存在を示すことができる試験を用いて、該タンパク質の産生が可能な真核生物から入手できるDNA によって形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーをスクリーニングすることを含み、このスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後で行われる方法。２．前記真核生物が真菌又は酵母細胞である、請求項１記載の方法。３．前記真菌が、アスペルギルス属、好ましくはA.ニガーである、請求項２記載の方法。４．前記タンパク質が、酵素、好ましくはセルラーゼ活性、アラビノキシラン分解活性又はキシラナーゼ活性を有する酵素である、請求項１〜３項のいずれか１項記載の方法。５．セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、単離された核酸断片であって、配列番号１又は３に示された配列、もしくは配列番号１又は３に示された配列と少なくとも90％の配列同一性を有するような配列を含む、断片。６．キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、単離された核酸断片であって、配列番号５又は７に示された配列、もしくは配列番号５又は７に示された配列と少なくとも90％の配列同一性を有するような配列を含む、断片。７．アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている、単離された核酸断片であって、配列番号９に示された配列、もしくは配列番号９に示された配列と少なくとも90％の配列同一性を有するような配列を含む、断片。８．１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつセルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項５記載の断片の変異体である、単離された核酸断片。９．１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつキシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項６記載の断片の変異体である、単離された核酸断片。 10．１個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつアラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項７記載の断片の変異体である、単離された核酸断片。 11．請求項５〜10項のいずれか１項記載の核酸断片を含む、組換え核酸。 12．実質的に純粋な形の、請求項５〜10項のいずれか１項記載の核酸、もしくは１個以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入によって異なるが、依然実質的に同じ活性を有しているそれらの変異体によってコードされた、ポリペプチド。 13．請求項１〜４項のいずれか１項記載の方法によって同定された核酸断片、又は請求項８〜10項のいずれか１項記載の断片、又は請求項11記載の組換え核酸を含む(harbour)、組換え宿主細胞。 14．請求項13記載の宿主細胞の、該ポリペプチドの発現をもたらすような条件下での培養、並びに該ポリペプチドの回収を含む、請求項12記載のポリペプチドの産生法。