JPH10510720A - タンパク質検出法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、関心の対象となっているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法で、この方法においては該タンパク質の産生が可能な真核生物から入手できるDNA によって形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現についてスクリーニングし、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後に行われることを特徴とする方法を提供する。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来するものが好ましい。この真核生物は、好ましくは、真菌又は酵母細胞であり、より好ましくはアスペルギルス属であり、最も好ましくは多くのアスペルギルス・ニガー群の一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。
Description
【発明の詳細な説明】
タンパク質検出法
発明の分野
本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 配列を決定す
る方法に関する。
発明の背景
最近のバイオテクノロジーの大きな試みのひとつは、ある機能を果たす新規酵
素を発見することである。酵素には、例えば食品産業、洗剤、デンプン転化、動
物飼料、及び各種産業における加工助剤のような領域において、多くの用途があ
る。それに加え、酵素的転化は、いくつかの医薬化合物の合成などの様々な作業
のための化学的転化の代用となる。一般に酵素は、費用効果的であり、特異的か
つ環境に優しい触媒として、一般性を増しつつある。従って、酵素の用途の範囲
を広げるような新規酵素活性を見つけること、又は特定の用途により適した酵素
を見つけることは、酵素産業のひとつの大きな試みである。
新規酵素の探求は、従来は、天然の多様性を研究することで行われてきた。現
在市販されているほとんどの酵素は、微生物を起源としている。細菌、酵母及び
真菌のような微生物は、特定の活性を持つ酵素を分泌する。様々な生態環境の適
所(ecological niches)に由来する微生物をスクリーニングすることによって、
今日使用されている酵素類が発見された。しかしこのスクリーニング法には、い
くつかの欠点がある。例えば、天然に見出された微生物は、通常、酵素の全配列
(whole array)を分泌する。従って必要とされる酵素は、合成された酵素のごく
わずかな割合に相当する。更に微生物は、毒素又は所望でない酵素のような、必
要としない化合物を合成する。
興味のある遺伝子をクローニングし、その後適当な宿主に導入するために、組
換えDNA 技術が適用される。従来の遺伝子クローニング法は、コードされたタン
パク質(例えば酵素)の精製、部分的アミノ酸の配列決定、及びその後の興味の
ある遺伝子の分子クローニングを含み、退屈な作業であった。クローニング後に
、興味のある遺伝子を、大規模発酵に適した宿主において発現することができる
。
この従来の酵素クローニング法に加え、他の方法も使用されている。
特定の生物に由来するゲノムDNA は、大腸菌(E.コリ)におけるクローニング
、その後の特異的活性のスクリーニングによって、同定することができる。セル
ラーゼ及びキシラナーゼを含む多数の酵素が、この方法で同定された(Sashihar
a N.らの論文、Bact、158:503-506 頁(1984);Fukumori Fらの論文、Gene、76:2
89-298頁(1989);Sakka K らの論文、Agric.Biol.Chem.、53:905-910頁(1989);
Zappe H らの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.、27:57-63頁(1987);Sakka K
らの論文、Agric.Biol.Chem.、54:337-342頁(1990);Srivastava Rらの論文、FE
MSMicrobiol.Lett.、78:201-206頁(1991);Shendye A 及びRao M の論文、FEMS
Microbiol.Lett.、108:297-302頁(1993))。しかしこの方法は、そのDNA が大
腸菌において直接発現されるような微生物に限定されている。通常、例えば真菌
及び酵母などの真核生物のような無関係の生物に由来した遺伝子は、調節配列の
無効又はイントロンの存在のために、発現されない。
これらの問題点のいくつかを克服するために、cDNAが、大腸菌ファージにおい
て発現されていて、これは、抗体又は酵素活性によって検出されるような機能的
タンパク質をもたらしている。しかし抗体の使用(例えば、欧州特許第EP 05061
90号及びその係属出願第EP94202442.3号を参照)には、純粋な酵素が利用可能で
あることが必要である一方で、溶菌斑の酵素活性は、非常に低く(Karlovsky 及
びWolfの論文、Methods Mol.Cell.Biol.、4:40-45 頁(1993))、酵素活性の即時
検出に不適なものにしている。
第三の方法は、酵母におけるcDNAの発現である(第WO 93/11249 号;Dalboge
及びHeldt-Hansenの論文、Mol.Gen.Genet 、243:253-260 頁(1994))。しかしこ
の方法は、活性酵素を産生するコロニーの割合が少ないために、効果的でない:
この方法では、2.5 ×105〜5 ×105クローンが、スクリーニングされなければな
らない。別の欠点は、この方法が、スクリーニングを行う前に、大腸菌から酵母
へ遺伝物質を転移し、かつその後このクローニング操作の停止のために酵母から
大腸菌へと戻し転移することが必要な点である。それに加え、酵素活性のレベル
は、低い。
発明の要約
本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片を同定す
る方法を提供し、この方法では、該タンパク質を産生可能な真核生物から入手で
きるcDNAで形質転換された細菌の宿主細胞の形態のcDNAライブラリーを、タンパ
ク質の存在を示す試験によって、該タンパク質の発現に関してスクリーニングし
、この宿主細胞のスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった
後に行われることを特徴とする。このcDNAライブラリーは、真核生物に由来する
ことが好ましい。前記真核生物は、好ましくは真菌又は酵母細胞であり、より好
ましくはアスペルギルス種であり、最も好ましくはアスペルギルス・ニガー群の
一員である。スクリーニングされる酵素は、好ましくはセルラーゼ、エンドキシ
ラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を示す酵素である。
発明の詳細な説明
本発明は、関心を持たれているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法
を提供する。この方法は、関心を持たれているタンパク質を産生することが可能
な真核生物から入手することができるDNA で形質転換された細菌宿主細胞の形態
のcDNAライブラリーを、該タンパク質の発現に関してスクリーニングすることを
含む。この目的のために、該タンパク質の存在を示す試験が用いられる。この宿
主細胞のスクリーニングは、形質転換DNA が、プラスミドの一部となった後に行
われる。
微生物における真核生物遺伝子の発現クローニングの現在の方法と比べ、この
方法は、迅速であり、直接的でありかつ非常に効果的である。驚くべきことに、
現在の方法の105〜106クローンではなく、102〜104クローンのスクリーニングに
よって、多くの陽性クローンが認められてる。
本方法の別の驚くべき利点は、現在のコロニースクリーニング法のほとんどと
は対照的に、関心を持たれている可能性のある遺伝子産物を含む細菌の内容物が
放出されるような、更なる溶菌工程を導入する必要が無いという点である。
本発明の方法は全て、原核細胞において行うことができ、遺伝物質を、この方
法のいずれかの時点で真核生物に転移する必要が無い。
このcDNAライブラリーは、関心を持たれている真核生物の、好ましくは真菌の
mRNAから調製される。特に関心を持たれている真菌の例は、アスペルギルス属の
ものであり、更に詳細に述べると、アスペルギルス・ニガーである。黒色アスペ
ルギルスの名称に関する最近の変化から、本願明細書の用語アスペルギルス・ニ
ガーは、Raper 及びFennell によって定義されたアスペルギルス・ニガー群に認
めることができる全ての(黒色)アスペルギルスを含むと定義される(1965年、
アスペルギルス属(The Genus Aspergillus)、The Williams & Wilkins Company
、ボルチモア、293-344 頁)。
cDNA調製に使用されるmRNAは、構成的に存在するか、もしくは誘導することが
できる。本発明の方法は非常に効率的であるので、コロニーの大部分は、関心を
持たれているタンパク質を産生するであろう。従って、現在の方法と比べて、本
方法は、低レベルのmRNAを有するタンパク質を取扱う際にも、使用することがで
きる。
このライブラリーは、ベクターにおいて作製される。このベクターは、例えば
プラスミド及びファージベクターのような、遺伝物質の転移及び/又は発現に適
したいずれかのビヒクルであることができる。
このライブラリーが、ファージベクターによって作製される場合は、ZAP (登
録商標)ベクター又はその誘導体が好ましく、λUni-ZAP (登録商標)XRがより
好ましい。この方法で得られた一次ライブラリーは、適当な宿主細胞、好ましく
はE.coli、更に好ましくはE.coli XL1 Blue MRF’を用いて、増幅される。
その後このファージは、好ましくは、糸状菌ヘルパーファージ及びE.coli SO
LRのようなE.coli宿主菌株による重複感染によって、ファージミドへと変換され
る。この方法において、二本鎖ファージミドが形成される。本願明細書において
用語“ファージミド”は、プラスミドに変換されたファージゲノムを意味する。
スクリーニング以前に、全てのプラークがファージミドに変換されるので、低レ
ベルmRNAを有する興味のあるクローンが、活性に関して、陰性として誤って退け
られることはない。従って当業者には、プラーク期のスクリーニングが不必要で
あることは明らかであろう。
本発明の同定法において、関心を持たれているDNA は、該タンパク質の精製、
アミノ酸配列決定及び該遺伝子の分子クローニングという、退屈な作業を通じて
ではなく、これがコードしているタンパク質の発現によって、同定される。発現
クローニングのひとつの技術は、プレートアッセイであり、これはcDNAライブラ
リーを、陽性コロニーのスクリーニングが可能な組成の培地上に播種する。関心
を持たれているタンパク質のスクリーニングは、純化タンパク質を必要とせず、
活性検出に適したアッセイの入手のみが必要である。これは、例えばセルラーゼ
活性が、カルボキシメチルセルロースを含有する上層(overlay)を用い、その後
コンゴレッドで染色して肉眼で見えるようにすることで検出できるというような
、標準的アッセイであることができる。同様に、アラビノキシラン分解酵素の検
出は、エンバクスペルト(oat spelt)キシランを含有するプレートに形成された
沈殿によって達成することができる。ヨウ素を用いるデンプンの透明化画分(cle
aring zone)によるアミラーゼの検出、4級アンモニウムイオンを用いるペクチ
ンの透明化画分によるポリガラクツロナーゼの検出などを含む、多くの適当なプ
レートアッセイが、文献に公表されている。しかしDNA がコードしているタンパ
ク質の発現によってDNA を同定することができるような適当な種類のアッセイの
いずれかを、本発明の方法で使用することができる。
あるいは、例えば適当な標準的アッセイが適用できないような場合には、目的
に合わせたアッセイを、タンパク質活性の検出のために開発することができる。
本発明の方法を用いて検出される酵素の例は、アミラーゼ、アラビノキシラン
分解酵素、カタラーゼ、セルラーゼ、ガラクタナーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ
、ペクチナーゼ、ホスファターゼ、プロテアーゼ及びキシラナーゼを含む。
関心を持たれているクローンの同定は、更なる溶菌工程を導入せずに可能であ
る。従って本発明は、原核微生物における、真核生物遺伝子の発現クローニング
の、迅速で、効果的かつ直接的方法を提供する。
更に、本発明は、本発明の方法を用いて同定することができる、単離された核
酸断片を提供する。本発明の核酸断片は、DNA 又はRNA を含み、好ましくはDNA
を含む。この核酸断片には、1回以上の単離工程が施される。このような単離工
程は、当該技術分野で公知のいずれかの適当な手段により行うことができる。
本発明の好ましいDNA 断片は、配列番号1、3、5、7及び9に示された配列
を有する。しかし本発明の核酸断片は、これらの好ましい断片に限定されるもの
ではない。むしろ本発明は、配列番号1、3、5、7及び9のDNA 配列によって
コードされたポリペプチドの活性の一部又は全てを有するポリペプチドをコード
しているような、関連した核酸断片を包含し;すなわち、配列番号1又は3のDN
A 配列に関連した本発明の配列は、(少なくとも)CMCase活性を有するポリペプ
チドをコードし;配列番号5又は7のDNA 配列に関連した本発明の配列は、(少
なくとも)キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードし;並びに配列番号
9のDNA 配列に関連した本発明の配列は、(少なくとも)アラビノキシラン分解
活性を有するポリペプチドをコードしている。
従って、本発明は、配列番号1、3、5、7又は9の核酸配列と、高い配列の
相同性を有する、単離された核酸、好ましくはDNA の断片の変異体も提供する。
従ってこれらは、典型的には、配列番号1、3、5、7又は9と、実質的に相同
である。典型的にはこのような変異体断片は、配列番号1、3、5、7又は9と
、少なくとも80%の配列の相同性を有する。
同様にこのような変異体断片は、欠失、置換又は挿入がコードされたポリペプ
チドの活性を損なわない限りは、1個以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入によ
り、配列番号1、3、5、7又は9とは異なることができる。従って、これらの
コードされたポリペプチドは、配列番号2、4、6、8又は10のポリペプチドの
活性の一部又は全てを保持する。
本発明は、更に、配列番号1、3、5、7及び9の分解変異体;すなわち、配
列番号2、4、6、8又は10のポリペプチドをコードしているが、異なる核酸配
列を有する変異体を包含している。
本発明の変異体の核酸断片は、いずれかの微生物から得ることができるが、こ
れらは好ましくは、真菌又は酵母から得、更に好ましくはアスペルギルス属の真
菌から、最も好ましくはA ・ニガーvar.ニガー、A ・ニガーvar.ツビゲンシス又
はA ・アキュレアツスから得る。
本発明の方法を用いて同定される核酸は、組換え核酸の構成に使用することが
できる。典型的には、これらは、組換え核酸ベクターの形態である。当業者は、
関心を持たれている宿主細胞において(過剰に)産生される適当なベクターを調
製することができるであろう。好ましい宿主細胞は、細菌(例えばE.coli)、酵
母(例えばK.ラクチス)、及び真菌(例えばアスペルギルス)細胞を含む。
ベクターは、典型的には1個以上の複製起点を含むので、細菌、酵母又は真菌
細胞のような宿主細胞において複製される(これは、分子生物学の標準的技術に
より、例えば大腸菌において、構成体が複製及び操作されるのを可能にする。)
。更にベクター、特に発現ベクターは、通常5'末端から3'末端へと配列した、少
なくとも下記の要素を含む:核酸配列の発現を指示するプロモーター、及び任意
にプロモーターの調節部位、転写開始部位、翻訳開始コドン、並びに本発明の核
酸配列である。
このベクターは、更に1種以上の選択マーカー遺伝子、例えば1種以上の抗生
物質耐性遺伝子なども含む。このようなマーカー遺伝子は、形質転換体の同定を
可能にする。任意に、この構成体は、該プロモーターのエンハンサーも含むこと
ができる。このベクターは、更にポリアデニル化シグナルを、典型的にはこの機
能的ポリペプチドをコードしている核酸の3'末端側に含むことができる。このベ
クターは、更に関心を持たれているポリペプチドをコードしている配列の3'末端
側に、転写ターミネーターを含むことができる。
このベクターは、更に1個以上のイントロン又は他の非コード配列を、例えば
本発明のポリペプチドをコードしている配列の3'末端側に含むことができる。
典型的なベクターは、本発明の核酸配列が、該配列の発現が可能なプロモータ
ーに、操作できるように連結している。“操作できるような連結”とは、プロモ
ーター、及び該ポリペプチド又はタンパク質をコードしている核酸配列が、その
コード配列を該プロモーターの制御下で発現することができるような関係を持つ
ような接合部位を意味する。従って、プロモーター及びコード配列の間の、5'末
端側の非コード配列のような要素であることができる。このような配列が、プロ
モーターによるコード配列の正確な制御を増強するか、もしくは損なわないよう
な場合には、これらを前記ベクターに含むことができる。
更に本発明は、本発明の核酸でコードされたポリペプチド類を提供する。これ
らのポリペプチドは、部分的、実質的又は完全に単離されていて、前述のように
セルラーゼ、キシラナーゼ又はアラビノキシラン分解活性を有す。本発明の好ま
しいポリペプチドは、その配列が配列番号2、4、6、8又は10であるものを含
む。
しかし本発明は、これらの配列に限定されるものではなく;むしろ、前述の活
性の一部又は全てを、典型的には配列番号2、4、6、8又は10のポリペプチド
活性を実質的に有する、本発明の核酸断片によってコードされた全てのポリペプ
チドを包含している。従って、配列番号2又は4のポリペプチドに関連した本発
明の変異体ポリペプチドは、セルラーゼ活性を有し;配列番号6又は8のポリペ
プチドに関連した変異体ポリペプチドは、キシラナーゼ活性を有し;並びに、配
列番号10のポリペプチドに関連した変異体ポリペプチドは、アラビノキシラン分
解活性を有す。
特に本発明は、配列番号2、4、6、8又は10に関連した配列を有する変異体
ポリペプチドを提供する。典型的には、このような変異体は、配列番号2、4、
6、8又は10と高度の配列同一性、例えば少なくとも70%の相同性を有し、その
結果、これらは典型的には、配列番号2、4、6、8又は10のポリペプチドと実
質的に相同である。
同様に本発明の変異体ポリペプチドは、前述のように、欠失、挿入又は置換が
該ポリペプチドの活性を損なわない限りは、1個以上のアミノ酸の欠失、挿入又
は置換によって、配列番号2、4、6、8又は10と異なることができる。
本発明のポリペプチドは、本発明の組換え核酸から、本発明のポリペプチドの
発現をもたらすような条件下での、適当な宿主細胞の培養によって;及び任意に
、こうして産生されたポリペプチドの回収によって、産生することができる。こ
のポリペプチドは、当該技術分野において公知のいずれか適当な方法で、回収す
ることができる。
実験
細菌の増殖、DNA 単離、ハイブリダイゼーション、制限酵素による消化及びDN
A 配列決定のような、標準的組換えDNA 技術は、Sambrookらの論文(分子クロー
ニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク、19
89年)に従った。
実施例
実施例I E.coliにおけるアスペルギルス・ニガーのcDNA発現ライブラリーの作
製
実施例I.1 mRNAの導入及び単離
欧州特許出願公開第EP-A-0463706号に記載された方法で、酵母エキスを含まな
いもの、及びエンバクスペルトのキシランの代わりに粗コムギのアラビノキシラ
ン分画を2%含むものについて、A.ニガーN 400 培養体を、各々69及び81時間培
養し、その後ろ過により菌糸体を収集し、次に滅菌した生理食塩水で洗浄した。
その後この菌糸体を、液体窒素下で凍結し、次にミクロディスメンブレーター(M
icrodismembrator)(ブラウン社)を用いて粉末とした。RNA をCsCl勾配を用い
て2回遠心分離した以外は、Sambrookらの論文(1989)に記載されたグアニジンチ
オシアネート/CsClプロトコールに従って、全RNA を、菌糸粉末から単離した。
ポリA+ mRNA を、下記の点を変更したオリゴ(dT)- セルロースクロマトグラフィ
ー(Aviv及びLeder の論文(1972)、Sambrookらの論文(1989))により、全RNA 5mg
から単離した:SDS を、全ての溶液から省き、かつ試料負荷バッファーには、ジ
メチルスルホキシド9 容量%を添加した。
実施例I.2 cDNA ライブラリーの作製
ポリA+ mRNA 7μg から、cDNAを合成し、かつZAP(登録商標)-cDNA 合成キ
ット(ストラータジーン社)を用い、製造業者の使用説明書に従って、バクテリ
オファージλUni-ZAP XRに結合した。該cDNAをUni-ZAP XRベクターアームに結合
した後、このファージDNA を、Packagene (登録商標)抽出物(プロメガ社)を
用いて、製造業者の使用説明書に従って、パッケージングした。ベクターアーム
1.2 μg へのcDNA 120ngの結合、及びその後のこの反応混合物のパッケージング
により、3.5 ×104の組換えファージからなる一次ライブラリーを得た。この一
次ライブラリーを、E.coli XL1- Blue MRF'を用いて増幅し、滴定し、かつ4℃
で保存した。
実施例I.3 ファージのファージミドへの変換
Maniatisらによって明らかにされた方法で(Maniatisらの論文(1982)、分子ク
ローニング、実験マニュアル、コールドスプリングハーバー研究所、コールドス
プリングハーバー、ニューヨーク、64頁)、プレーティング細菌としてE.coli B
B4 を用い、直径85mmのNZYCM (1.5%寒天)プレート上で、アガロース0.7 %
を含有するNZYCM トパガロース(topagarose)中にファージを播種することによっ
て、ファージを増殖した。一晩37℃でインキュベートした後、密集したプレート
が得られ、これからファージを、SMバッファー5ml を添加することによって溶出
し、かつこのプレートを、4℃で2時間、断続的に振盪し続けた。上清を収集し
た後、4,000 ×g、4℃で、10分間遠心分離し、溶液から細菌を除去した。その
上清に、クロロホルム0.3 %を添加し、プラーク形成単位(pfu)を測定した。こ
のファージストックは、約1010pfu/mlを含んでいた。
A.ニガーのcDNAを有する組換えUni-ZAP XRクローンを、ストラータージーン社
のcDNA合成キットに含まれた糸状菌ヘルパーファージEXASSIST(登録商標)及び
E.coli SOLR 菌株で、製造業者の使用説明書に従って、重複感染し、Bluescript
ファージミドに変換した。長期保存のために、約100 クローン/μl の懸濁液を
含むグリセロールストックを、-80℃で保存した。
実施例II E.coliにおけるアスペルギルス・アキュレアツスのcDNAの発現ライブ
ラリーの作製
アスペルギルス・アキュレアツスCBS 101.43の発現ライブラリーを、実施例I
のA.ニガーのライブラリーの場合と同様の方法で作製した。A.アキュレアツスCB
S 101.43は、Timberlake微量元素、酵母エキス0.1 %及びダイズオカラ1%を含
有する最少培地を用い、30℃で、40、52、64及び76時間増殖した。最少培地は、
1リットルにつき、NaNO36g、KH2PO41.5g、KCl 0.5g 及びMgSO40.5gを含有した
。
40及び52時間の菌糸体から、全RNA 及びポリA+ RNAを、実施例I の方法で単離
した。このcDNAライブラリーから、約150,000 の一次プラークを増幅した。ファ
ージは、濃度2.2 ×107pfu/ml で保存した。ファージを、実施例I の方法で、フ
ァージミドに変換した。24のランダムクローンからプラスミドを単離した。これ
らは全て、大きさが0.6 〜2.0kb の間で変動する挿入断片を有した。
実施例III セルラーゼ産生コロニーに関するプラスミドcDNAライブラリーのス
クリーニング
このスクリーニング法は、Woodらの方法(酵素学的方法(Methods in Enzymolo
gy)、160:59-74頁)を基に変更した。
20mlの 2×TY、CMC(シグマ社C-4888)0.2 %、寒天1.5 %及び100 μg/mlアン
ピシリンを含むプレートを用いた。細胞を、1プレートにつき約200 コロニーを
含む5ml の上層に播種した。この上層を、50℃に保ち、かつ2×TY、0.2 % CMC
、0.75%寒天及び100 μg/mlアンピシリンを含んだ。プレートを、50℃に保たれ
た、0.5 %アガロース、0.2 %CMC及び100 μg/mlアンピシリンを含む5ml で 覆
った。
プレートを乾燥し、かつ37℃で48時間インキュベートした。次に、コンゴレッ
ド0.1 %(アルドリッヒ社、C8,445.3)5ml を、このプレートに注いだ。1〜2
時間染色した後、プレートを、5M NaCl 5ml で、0.5 〜1時間脱色した。
A.ニガーcDNAライブラリー(実施例I )の約12,000コロニーを播種した。CMC
に関するスクリーニングは、89コロニーが、コンゴレッドでの染色後にハロ(hal
o)を生じることを示した。コロニーを、大、中及び小ハロの3種類に分けた。各
種類から、3コロニーを増殖し、プラスミドを単離し、かつcDNAを配列決定した
。いずれも、完全な長さのcDNAの複製を構成していた。これらのプラスミドを、
2種のクラスに分けた。各クラスから、1個のコロニーを、CBS(バーン(Baarn)
、オランダ)に寄託した。小ハロを形成するコロニーは、1995年8月3日に寄託
し、かつ寄託番号はCBS 589.95であった。大ハロを形成するコロニーは、1995年
9月21日に寄託し、かつ寄託番号はCBS 662.95であった。挿入部分のDNA 配列を
、これらによってコードされたアミノ酸配列と共に、それぞれ配列番号1及び3
に示した。
実施例IV アラビノキシラン分解活性を生じるコロニーにおけるプラスミドcDNA
ライブラリーのスクリーニング
実施例IV.1 エンドキシラナーゼ活性のスクリーニング
この方法は、実施例III において、セルラーゼ産生コロニーについて用いたも
のと同様の方法であった。下層は、2×TY、寒天1.5%及びアンピシリン100μg/m
lを含む。細胞は、2×TY、エンバクスペルトキシラン(シグマ社、X-062 7)0.2
%、寒天0.75%及びアンピシリン100 μg/mlを含む上層に播種した。最上層は、
pH7.4 の25mMリン酸バッファー中に、アガロース0.5 %、RBB-キシラン(シグマ
社、M5019)0.1 %及びアンピシリン100 μg/mlを含んでいた。
実施例I で得られたA.ニガーcDNAライブラリーから、約2000コロニーを播種し
た。46コロニーが、ハロを生じた。RBB-キシラン0.3 %の最上層を伴う2 ×TYプ
レート上で再度スクリーニングした後には、24コロニーが、再びハロを生じた。
これらを、制限酵素による消化で分析し、かつ2種のクラスに分けた。各クラス
の6個のコロニーについて、一部配列決定した。両方の(クローンの)cDNA型を
、1995年8月3日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 590.95及びCBS591.9であっ
た。挿入部分のDNA 配列を、これらがコードしたアミノ酸配列と共に、それぞれ
配列番号5及び7に示した。
実施例IV.2 エンバクスペルトのキシランのスクリーニング
このプラスミドライブラリーを、更に、エンバクスペルトのキシラン2%を含
有する最少培地プレート上に播種した。37℃で2日間保った後、いくつかのコロ
ニーがハロを生じ、これはエンドキシラナーゼの産生を示した。他のコロニーは
、コロニーの周囲に沈殿環を生じた。後者のコロニーの5個について、部分的に
配列決定した。これらは、その単離が係属出願である欧州特許第EP94202442.3号
に開示された、アラビノキシランを分解するcDNAに類似していた。A.ニガーaxdA
cDNAを含むコロニーを、1995年8月3日に、CBS に寄託し、寄託番号はCBS 592
.95であった。この挿入部分のDNA 配列を、これがコードしているアミノ酸配列
と共に、配列番号9に示した。
これらの実施例は、明らかにされたシステムが、原核生物における、真核生物
DNA の、迅速で、直接的かつ効果的な発現クローニングのために使用することが
できることを示している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
C12N 9/42 C12N 9/42
//(C12N 15/09 ZNA
C12R 1:66)
(C12N 1/21
C12R 1:19)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,S
Z,UG),UA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD
,RU,TJ,TM),AL,AM,AT,AU,AZ
,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,CN,
CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB,GE,H
U,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ
,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,MG,
MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,R
O,RU,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM
,TR,TT,UA,UG,US,UZ,VN
(72)発明者 デ グラーフ レーンデルト ヘンドリッ
ク
オランダ エヌエル−6862セーカー オー
ステルベーク コルネリス コーニングス
トラート 8
(72)発明者 ヴィーゼル ヤコブ
オランダ エヌエル−6703セーカー ワー
ヘニンヘン ヒンケロールドセウェーグ
5
(72)発明者 ファン オーイェン アルベルト ヨハネ
ス ヨゼフ
オランダ エヌエル−2275イックスイック
ス フォールブルフ オーヴェルブルフカ
ーデ 78
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.関心の対象となっているタンパク質をコードしているDNA 断片の同定法であ って、該タンパク質の発現に関して、該タンパク質の存在を示すことができる試 験を用いて、該タンパク質の産生が可能な真核生物から入手できるDNA によって 形質転換された細菌宿主細胞の形態のcDNAライブラリーをスクリーニングするこ とを含み、このスクリーニングが、形質転換DNA がプラスミドの一部となった後 で行われる方法。 2.前記真核生物が真菌又は酵母細胞である、請求項1記載の方法。 3.前記真菌が、アスペルギルス属、好ましくはA.ニガーである、請求項2記載 の方法。 4.前記タンパク質が、酵素、好ましくはセルラーゼ活性、アラビノキシラン分 解活性又はキシラナーゼ活性を有する酵素である、請求項1〜3項のいずれか1 項記載の方法。 5.セルラーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、単離された核酸断 片であって、配列番号1又は3に示された配列、もしくは配列番号1又は3に示 された配列と少なくとも90%の配列同一性を有するような配列を含む、断片。 6.キシラナーゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、単離された核酸 断片であって、配列番号5又は7に示された配列、もしくは配列番号5又は7に 示された配列と少なくとも90%の配列同一性を有するような配列を含む、断片。 7.アラビノキシラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている、単離さ れた核酸断片であって、配列番号9に示された配列、もしくは配列番号9に示さ れた配列と少なくとも90%の配列同一性を有するような配列を含む、断片。 8.1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつセルラーゼ 活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項5記載の断片の変異体であ る、単離された核酸断片。 9.1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつキシラナー ゼ活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項6記載の断片の変異体で ある、単離された核酸断片。 10.1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は欠失によって異なり、かつアラビノキ シラン分解活性を有するポリペプチドをコードしている、請求項7記載の断片の 変異体である、単離された核酸断片。 11.請求項5〜10項のいずれか1項記載の核酸断片を含む、組換え核酸。 12.実質的に純粋な形の、請求項5〜10項のいずれか1項記載の核酸、もしくは 1個以上のアミノ酸の欠失、置換又は挿入によって異なるが、依然実質的に同じ 活性を有しているそれらの変異体によってコードされた、ポリペプチド。 13.請求項1〜4項のいずれか1項記載の方法によって同定された核酸断片、又 は請求項8〜10項のいずれか1項記載の断片、又は請求項11記載の組換え核酸を 含む(harbour)、組換え宿主細胞。 14.請求項13記載の宿主細胞の、該ポリペプチドの発現をもたらすような条件下 での培養、並びに該ポリペプチドの回収を含む、請求項12記載のポリペプチドの 産生法。
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