HU217410B - A Lactococcus lactis malolaktikus enzimének génje, a génnel transzformált gazdasejtek és eljárás malolaktikus fermentálásra a transzformált gazdasejtek alkalmazásával - Google Patents

A Lactococcus lactis malolaktikus enzimének génje, a génnel transzformált gazdasejtek és eljárás malolaktikus fermentálásra a transzformált gazdasejtek alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HU217410B
HU217410B HU9500139A HU9500139A HU217410B HU 217410 B HU217410 B HU 217410B HU 9500139 A HU9500139 A HU 9500139A HU 9500139 A HU9500139 A HU 9500139A HU 217410 B HU217410 B HU 217410B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
gene
malolactic
gly
leu
thr
Prior art date
Application number
HU9500139A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT72190A (en
HU9500139D0 (en
Inventor
Virginie Ansanay
Pierre Barre
Sylvie Dequin
Original Assignee
Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) filed Critical Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
Publication of HU9500139D0 publication Critical patent/HU9500139D0/hu
Publication of HUT72190A publication Critical patent/HUT72190A/hu
Publication of HU217410B publication Critical patent/HU217410B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12G—WINE; PREPARATION THEREOF; ALCOHOLIC BEVERAGES; PREPARATION OF ALCOHOLIC BEVERAGES NOT PROVIDED FOR IN SUBCLASSES C12C OR C12H
    • C12G1/00—Preparation of wine or sparkling wine
    • C12G1/02—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation
    • C12G1/0203—Preparation of must from grapes; Must treatment and fermentation by microbiological or enzymatic treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12H—PASTEURISATION, STERILISATION, PRESERVATION, PURIFICATION, CLARIFICATION OR AGEING OF ALCOHOLIC BEVERAGES; METHODS FOR ALTERING THE ALCOHOL CONTENT OF FERMENTED SOLUTIONS OR ALCOHOLIC BEVERAGES
    • C12H1/00—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages
    • C12H1/003—Pasteurisation, sterilisation, preservation, purification, clarification, or ageing of alcoholic beverages by a biochemical process

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány tárgya a Lactőcőccűs lactis malőlaktikűs enzimestrűktúrgénjének klónőzásával kapcsőlatős. A találmány tárgyátközelebbről a gén teljes nűkleőtidszekvenciája, az abból levezethetőaminősavszekvencia, valamint őlyan DNS-fragmensek képezik, melyek agént kódőló szekvenciát tartalmazzák. A találmány tárgyát képeziktővábbá a találmány szerinti gént tartalmazó nűkleinsavmőlekűlákkaltranszfőrmált gazdasejtek, különösen Saccharőmyces ésSchizősaccharőmyces gazdasejtek. A találmány tárgyát képezi tővábbáegy eljárás malőlaktikűs fermentáció végrehajtására, a találmányszerinti gazdasejtek alkalmazásával. A találmány szerinti megőldásalkalmas bőrők savtartalmának csökkentésére és mikrőbiőlógiaistabilizálására. ŕ

Description

A találmány tárgya a Lactococcus lactis-ban található malolaktikus enzim struktúrgénjének klónozásával kapcsolatos.
A találmány tárgyát közelebbről a gén teljes nukleotidszekvenciája, az abból levezethető aminosavszekvencia, valamint olyan DNS-fragmensek képezik, melyek a gént kódoló szekvenciát tartalmazzák. A találmány tárgyát képezik továbbá a találmány szerinti gént tartalmazó nukleinsavmolekulákkal transzformált gazdasejtek, különösen Saccharomyces és Schizosaccharomyces gazdasejtek.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás a találmány szerinti gazdasejtek alkalmazásával malolaktikus fermentáció végrehajtására.
A találmány szerinti megoldás előnyösen alkalmazható borok savtartalmának csökkentésére és mikrobiológiai stabilizálására.
A malolaktikus fermentáció, mely a borkészítés során az élesztők által végbemenő alkoholos erjedés mellett másodlagos fermentációs folyamatként figyelhető meg, a borokban található almasav bizonyos tejsavbaktériumok általi tejsavvá és CO2-dá való bontását jelenti. Baktériumfajok természetesen előfordulnak a fermentációs flórában, melyek közül a malolaktikus fermentációért a Lactobacillus, a Leuconostoc és a Pediococcus nemzetség felelős.
A reakciónak két fő előnye van:
- a bor savtartalmának csökkenéséhez vezet a dikarbonsav (L-malát) monokarbonsavvá (L-iaktát) történő átalakításával, mely organoleptikus szinten jelent előnyt a vörösborok többségénél és néhány fehérbor esetében, és
- lehetővé teszi a bor mikrobiológiai stabilizálását, ennek következtében a jobb tartósítást egy olyan fermentálható szubsztrát felhasználásával, mely megakadályozza a nemkívánatos baktériumtörzsek általi további erjedést. Végül a malolaktikus fermentáció kedvezően befolyásolhatja a borok minőségét annak aromája szempontjából.
Problémákat jelenthet azonban a reakció lassúsága és szabályozatlansága.
A spontán malolaktikus fermentáció a borkészítés folyamatának csak a végén zajlik le, a borban a pH, az etanoltartalom és a kén-dioxid jelentősen lelassítják a tej savbaktériumok növekedését, melyek természetesen fordulnak elő a bor fermentációja során, és melyek felelősek a malolaktikus fermentációért. Ennek a fermentációs folyamatnak a felgyorsítása érdekében a legáltalánosabban alkalmazott módszer az, hogy a fermentációs oldatot tejsavbaktériumokkal beoltják.
A tejsavbaktériumok elszaporításának problémájára azonban ez a technika sem jelent minden esetben megoldást, mivel a tejsavbaktériumok nehezen alkalmazkodnak a borhoz mint tápoldathoz.
Továbbá a tejsavbaktériumok bevitele azt is jelenti, hogy a kívánatos enzimaktivitáson kívül számos olyan enzimet is viszünk a borba, melyek a borban található szubsztrátokkal reakcióba lépve a termékben olyan érzékszervi úton észlelhető minőségi tulajdonságok kifejlődéséhez vezethetnek, melyek kialakulása nehezen szabályozható.
Kívánatos lenne ezért, ha rendelkeznénk a malolaktikus fermentáció egy olyan lehetséges megvalósítási módjával, mellyel a kapott termék gyors javulását lehetne elérni, miközben a nem kívánt szabályozhatatlan faktorok kiküszöbölhetővé válnának.
A malolaktikus fermentáció jobb szabályozása céljából javasolták a tejsavbaktériumok malolaktikus enzimét kódoló gén klónozását, beépítését és expresszáltatását olyan mikroorganizmusban, mely normálisan is jelen van a bor előállításánál, mint például a S. cerevisiae.
Williams és munkatársai [App. Environ. Microbiol. 47, 288 (1984)] - valamint a 103399 számú európai közrebocsátási irat - leírják egy olyan 5 kb DNS-fragmens S. cerevisiae-ben és E. co/i-ban történő klónozását, mely a L. delbrueckii malolaktikus enzimének génjét hordozza.
A L. oenos malolaktikus enzimét kódoló gént is klónozták E. coli-ban [Lautenach és munkatársai: Microbiol. 39, 29 (1984)].
A transzformált mikroorganizmusok azonban a gént olyan alacsony szinten expresszálják, hogy nem alkalmasak bor gyártásában történő felhasználásra.
Ezenfelül mindkét esetben az E. coli-ban klónozott DNS instabilitását figyelték meg, mely akár közel a teljes gén elvesztését is jelentheti.
Továbbá, legújabban egy Lactococcus lactis-bó\ származó malolaktikus enzimet tisztítottak meg, melynek enzimaktivitása összevethető mértékű a fent említett Leuconostoc, Pediococcus és Lactobacillus nemzetségekből származó enzimével. Ez egy olyan 230 kD molekulatömegű fehérje, mely 56 kD méretű alegységekből áll. A pl-je 4,3 körüli érték, az almasavra vonatkozó Km-érték pedig 10-12 mmol/1. Az N-terminális szekvenciáját is meghatározták [Renault: „Malolactic fermentation: Genetics and Genetic Engineering, GIM90, 6th Synposium on Genetics of Industrial Microorganisms”, Strasbourg (1990)].
A tisztított preparátum felhasználásával az enzimmel specifikusan reagáló ellenanyagot állítottunk elő. Ezt követően a Lactococcus lactis DNS-könyvtárát készítettük Ágtl 1-vektorban, E. coli-ban. Ennek a könyvtárnak a kapott ellenanyaggal történő szűrése lehetővé tette, hogy olyan DNS-ffagmenseket klónozzunk, melyek a Lactococcus lactis genomiális DNSének egy 4,5 kb hosszúságú, a malolaktikus gént és a malát permeáz génjének egy fragmensét tartalmazó régióját reprezentálták. Az említett gének egy operonba vannak rendeződve. Azonosítottunk egy 2684 bp hoszszúságú DNS-fragmenst, mely a malolaktikus enzim teljes génjét tartalmazza, a fragmens szekvenciáját meghatároztuk, a szekvencia a szekvencialistában az 1. szekvenciaazonosító számon szerepel. Továbbá a malolaktikus enzim génjét különböző prokarióta és eukarióta gazdaszervezetekben expresszáltattuk. Ennek során megvalósítottuk a Lactococcus lactis malolaktikus génjének E. coli-ba történő beépítését a saját szabályozóelemeinek irányítása alatt, valamint az említett gén élesztőbe történő beépítését az élesztő szabályozóelemeinek irányítása alatt.
HU 217 410 Β
A találmány tárgyát képezi egy nukleinsavfragmens, amely a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének szekvenciáját tartalmazza.
A „Lactococcus lactis malolaktikus génjének szekvenciája” alatt pontosan az a szekvencia értendő, mely a szekvencialistában az 1. szekvenciaazonosító számon szereplő szekvencia 466.-tól a 2085. nukleotidjáig terjed, valamint bármilyen szekvencia, mely a genetikai kód degenerált változataként ugyanazt a polipeptidet kódolja, továbbá a definíció kiterjed azokra a szekvenciákra, melyek kisebb módosításokat hordoznak annak érdekében, hogy egy adott gazdaszervezet esetében jobb expressziót tegyünk lehetővé.
A találmány tárgyát képezik továbbá a fent definiált Lactococcus lactis malolaktikus gén szekvenciájával homológ vagy komplementer szekvenciákat tartalmazó nukleinsavfragmensek, valamint ezek legalább 10, előnyösen legalább 20 nukleotidból álló fragmensei, melyek az említett gén detektálására alkalmas hibridizációs próbaként és/vagy amplifikációs láncindító molekulaként alkalmazhatók.
A találmány tárgyát képezik a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének szekvenciáját tartalmazó expressziós egységek is, melyek az illető gén expreszszióját szabályozni képes szekvenciák vezérlése alatt állnak.
A „gén expresszióját reguláló gén” alatt azok a promoter és terminátor típusú szekvenciák értendők, melyek abban a gazdaszervezetben fejtik ki hatásukat, melyben a gén expresszióját kívánjuk elérni. A különböző gének promoterei és terminátorai különböző variációkban összekapcsolva is alkalmazhatók.
Élesztők esetében a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének expressziója során alkalmazható szekvenciák közül anélkül, hogy igényünket az ismertetett példákra korlátoznánk, megemlíthetők az önmagukban ismert alkohol dehidrogenáz I (ADHI) foszfoglicerol kináz (PGK) és a glicerinaldahid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) gének promoterei és terminátorszekvenciái.
A találmány szerinti expressziós egységeket hordozhatják plazmidok, vagy beépülhetnek a gazdaélesztő kromoszomális DNS-ébe.
A találmány tárgyát képezik továbbá olyan rekombináns vektorok, melyek legalább egy olyan DNS-fragmenst tartalmaznak, mely a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének szekvenciáját tartalmazza, egy fent definiált értelemben.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az említett vektorok olyan expressziós vektorok, melyek egy fent definiált expressziós egységet tartalmaznak.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az említett vektorok olyan regulátorszekvenciákat tartalmaznak, melyek élesztőben aktívak.
A találmány szerinti vektorok előnyösen olyan ingázóvektorok, melyek egyaránt rendelkeznek bakteriális replikációs origóval, valamint szelekciós markerrel (például egy antibiotikum-rezisztenciagénnel).
A vektorok az expressziós egységbe épített regulátorelemek természete és erőssége szerint szelektálhatok. Kiválaszthatók a fent leírt promoterek és terminátorszekvenciák, illetve bármilyen más olyan szekvencia, mely lehetővé teszi élesztőben a gén expreszsziójának irányítását és szabályozását.
A vektorok kiválasztásának egy másik kritériuma a kópiaszám, melyet a replikációs origó megválasztása határoz meg.
Kiválaszthatjuk például a következő típusú vektorok valamelyikét:
- Nagy kópiaszámú replikálódó vektor (YEp), mely élesztő replikációs origóként az endogén 2p-plazmid egy részletét tartalmazza.
- Nagy kópiaszámú replikálódó vektor (YRp), mely replikációs origóként kromoszomális ARS-szekvenciát tartalmaz.
- Nagy kópiaszámú lineáris replikálódó vektor (YLp), mely replikációs origóként telomerszekvenciát tartalmaz.
- Kis kópiaszámú replikálódó vektor (YCp), mely kromoszomális ARS-szekvenciát és centromerszekvenciát tartalmaz.
A találmány szerinti vektorok előnyösen tartalmaznak élesztőben szelektálható markereket is, úgymint auxotrofiamarkereket: URA3, LEU2, HIS3, TRP1, ADE és hasonlók, és/vagy antibiotikumokkal (G418, higromicin B, kloramfenikol, fleomicin) szembeni, herbicidekkel (szulfometuron-metil) szembeni és rézzel szembeni rezisztenciamarkereket és hasonlókat.
A találmány szerinti vektorok, melyek a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjét hordozzák, bejuttathatok bármelyik élesztőtörzsbe különböző transzformációs technikák alkalmazásával.
A legáltalánosabb alkalmazható technikák közül megemlíthető a protoplasztos eljárás, a lítiumsóval történő permeabilizálás és az elektroporáció.
A találmány szerinti gazdasejteket minden esetben a következő lépésekben alakítjuk ki:
- a malolaktikus enzim génjét és különböző erősségű szabályozóelemeket tartalmazó expressziós egység felépítése;
- az expressziós egység élesztőbe juttatása egy vagy több kópiában.
Azt a megoldást is választhatjuk, mely szerint a Lactococcus lactis malolaktikus enzimjét kódoló gént a saját szabályozószekvenciáival együtt bejuttatjuk az élesztő genomjába, mely esetben például egy élesztő replikációs origóval nem rendelkező integrálódó vektort (YIp) választhatunk; de integrálhatjuk a gént más technika alkalmazásával is, például kotranszformációval.
Lehetséges a Lactococcus lactis malolaktikus enzimet kódoló gén expressziójának modulálása az élesztőbe bevitt génkópiák számának szabályozásával és/vagy a génhez kapcsolt regulálóelemek erősségének változtatásával.
A találmány tárgyát képezik továbbá transzformált eukarióta és prokarióta sejtek, melyek legalább egy olyan heterológ DNS-ffagmenst tartalmaznak, mely a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének legalább egy kópiáját hordozza, a gén expresszióját az adott sejtben szabályozni képes szekvenciák vezérlése alatt.
HU 217 410 Β
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az említett sejtek élesztősejtek.
A találmány szerinti élesztősejtek az élelmiszeripar számos területén alkalmazhatók, különösképpen az oenológia területén, a malolaktikus fermentáció végrehajtására.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az élesztősejtek a Saccharmyces nemzetséghez tartoznak.
A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint az élesztősejtek a Schizosaccharomyces nemzetséghez tartoznak.
A Schizosaccharomyces fajokat alkalmazzák az oenológiában, mivel képesek almasavat bontani. Ez az alkalmazási lehetőség azonban korlátozott, mivel a lebontási folyamat, melyet az almasavbontó enzim végez, nem tejsavat eredményez, hanem etanolt és CO2-ot, ami jelentős savtartalom-csökkenést eredményez, és ez a bor sajátságait kedvezőtlenül befolyásolhatja.
A találmány szerinti, malolaktikus enzimet kódoló gént expresszáló Schizosaccharomyces törzsek olyan malolaktikus fermentációt folytatnak, melynek során az L-malát L-laktáttá alakul, ami azzal az előnnyel jár, hogy sokkal kisebb mértékben csökken a savtartalom, mint a malát/etanol átalakulás esetén.
A találmány szerinti Schizosaccharomyces törzsek számos területen alkalmazhatók az oenológiában; alkalmazhatók például:
- együtt tenyésztve a Sacchariomyces cerevisiae oenológiában alkalmazott törzseivel;
- immobilizált mikroorganizmusként.
A találmány szerinti megoldás még világosabban érthetővé fog válni a leírás további része alapján, melyben olyan kísérleti példákat mutatunk be, melyekben feltárjuk a Lactococcus lactis malolaktikus enzim génjének klónozását, valamint baktériumokban és élesztőkben történő expresszióját.
Általános módszerek
A malolaktikus enzim tisztítását Renault [már idézett publikációja (1990)] és C. Roulland [,,DEA in oenology-ampelography”, University of Bordeaux II (1988. szeptember)] módszere szerint végeztük.
A genetikai manipuláció és a molekuláris klónozás általános módszereit, melyekre az alábbi példákban hivatkozunk, Sambrook és munkatársai leírása szerint végeztük [„Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (második kiadás), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. (1989)].
1. példa
A malolaktikus enzim tisztítása
Az alábbiakban röviden ismertetjük az extrakciós eljárást:
Törzstenyésztési körülmények
A Lactococcus lactis (IL 1441) törzset az alábbi tápoldatban tenyésztjük:
élesztőkivonat 6g
tripton 2g
glükóz 15 g
DL-almasav 15 g
K2HPO 40,5 g
KH7PO 40,5 g
MgSO 40,4 g
NaCl 0,02 g
FeSO4 0,004 g
MnSO4 0,02 g
H2O ad 11
A pH-t 5-re állítjuk. A steril tápoldatot 10% (térfogati) előtenyészettel oltjuk be.
A nyers extraktum előállítása és vizsgálata
A sejteket a fenti tápoldat 3 1-ében 28 °C-on 24 órán át szaporítjuk, 10 percig, 1000 g-vel történő centrifugálással begyűjtjük, majd kétszer mossuk 0,9%-os NaCl-dal.
Az üledéket 30 ml foszfát pufferben (0,1 mol/1, pH=6,0) vesszük fel. A sejteket ultrahanggal 6 percig 0 °C-on táljuk fel. Centrifugálás után (30000 g, 15 perc, 4 °C) a felülúszó képezi a nyers extraktumot.
A fehérjekoncentrációt „BCA protein assay reagent” (Pierce) alkalmazásával határozzuk meg.
A malolaktikus enzim aktivitását CO2-elektród (Eischweiler) segítségével méljük az almasav dekarboxilezése alapján.
Az enzim tisztítása
DN-áz-I-enzimes kezelés után (1 mg/ml, 15 perc, szobahőmérsékleten) a nyers extraktumot ammóniumszulfátos kicsapás alkalmazásával frakcionáljuk (3 5%os, majd 70%-os telítés).
A 70%-os kicsapásnál a felülúszó nem tartalmaz enzimaktivitást. Az üledéket, mely az összes malolaktikus enzimaktivitást tartalmazza 2 ml 0,1 mol/l-es foszfát pufferben vesszük fel (pH=6,0), AcA 34 töltetet tartalmazó gélszűrő oszlopra visszük (Ultrogel; frakcionálási tartomány 20000 D-től 350000 D-ig), mely 40 cm hosszú és 2,6 cm az átmérője. Az oszlopot előzetesen az elúciós pufferrel ekvilibráljuk: 0,01 mol/1 foszfát puffer, pH=6,0; 0,1 mol/1 KC1. Az elúciót 18 ml/óra térfogatárammal végezzük, 2,4 ml-es frakciókat gyűjtünk.
Ilyen körülmények között a legtöbb aktivitást az 50-54. frakciók tartalmazzák, melyeket a továbbiakban izoelektro-fokuszálással tisztítunk.
Az izoelektro-fokuszálást 110 ml-es LKB oszlopon végezzük. A gradienst 2%-ban alkalmazott amfolin pufferek segítségével alakítjuk ki, és glicerin sűrűség gradienssel stabilizáljuk, melyet az oszlop töltésekor alakítunk ki. A legaktívabb frakciót, mely pH=3-nál, a fehérje pl-jénél gyűlik össze, kinyerjük, és egy további lépésben ioncserés kromatográfiával (Sepharose Q anioncserélő oszlop Pharmacia) tisztítjuk.
Az elúciót O-tól 0,5 mol/1 NaCl-ot tartalmazó 50 mmol/l-es TRIS-HC1 pufferrel pH=7,6 végezzük, melyben még EDTA és 1 mmol/1 β-merkapto-etanol is található.
A malolaktikus aktivitást tartalmazó frakció 0,33 mol/1 NaCl-koncentrációnál eluálható. Ez az a frakció, melyet ellenanyag előállítására alkalmazunk.
2. példa
A Lactococcus lactis malolaktikus enzimére specifikus poliklonális ellenanyag előállítása
Az ellenanyagokat a tisztított preparátum két nyúlba történő beoltásával kapjuk a következő eljárás szerint:
HU 217 410 Β
- A malolaktikus fehérje 2 ml-nyi oldatát (100 pg 0,3 mol/1 NaCl-pufferben) teljes Freund-adjuvánssal kiegészítve bőr alá oltjuk.
- A második injekciót 40 nappal később adjuk be, ugyanolyan mennyiségű malolaktikus proteinnel és 2 ml inkomlett Freund-adjuvánssal.
A két nyúl vérét 18 nappal a 2. injekció után levesszük, majd 24 órán át 4 °C-on hagyjuk koagulálni, ezt követően 10 000 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk, majd a kapott szérumot -20 °C-onalikvotokba osztva tároljuk.
A malolaktikus enzimre specifikus ellenanyagokat ELISA-teszt alkalmazásával vizsgáljuk mindkét szérum esetében (jelölésük: 120 és 119), melyeket a nyúlszérumból Sambrook és munkatársai (1989) által leírt eljárással nyerünk. Ez az analízis tette lehetővé, hogy meghatározzuk az ellenanyag felhasználásához szükséges optimális hígítást, mely 1000-szeresnek bizonyult.
Az ellenanyagok, specifitását immunelektroforetikus transzfer eljárással („Western biot”) határoztuk meg.
Egyfelől a Lactococcus lactis nyers extraktumának fehérjéit (melynek készítését az első példában írtuk le), másfelől a malolaktikus enzim tisztított preparátumának fehérjéit SDS-PAGE-elektroforézissel elválasztjuk, majd nitrocellulóz membránra visszük át.
Ezt követően a kapott poliklonális ellenanyagokat a membránra visszük és alkalikus foszfatázzal jelzett anti-nyúl-ellenanyaggal hívjuk elő.
A 120-as szérum mind a nyers extraktumból, mind a tisztított frakcióból egy körülbelül 60 kD móltömegű domináns csíkot és néhány alacsony móltömegű szenynyező anyaghoz tartozó csíkot ismer fel.
Másfelől a 119-es szérum mind a tisztított frakcióból, mind a nyers extraktumból egyetlen csíkot ismer fel, mely a malolaktikus enzimhez tartozik. Ennek értelmében ezt a nagy specificitású szérumot alkalmazzuk a további kísérletekben.
3. példa
A Lactococcus lactis genomiális DNS-ének expressziójához szükséges génkönyvtár létrehozása E. coliban,
a) A Lactococcus lactis DNS-ének extrakciója
A Lactococcuc lactis genomiális DNS-könyvtárt a Ágtll-vektorban alakítottuk ki.
A Lactococcus lactis IL1441 genomiális DNS-ét első lépésként extraháltuk és tisztítottuk. Ennek érdekében az exponenciális fázisban levő tenyészetből 500 ml-t 5000 g-vel 10 percig centrifugáltunk. A csapadékot 5 ml TE-ben (10 mmol/1 TRIS, 1 mmol/1 EDTA, pH=8) vesszük fel, és 10 percig 37 °C-on inkubáljuk. Ezután 1 ml, 0,1 mol/1, pH=8 EDTA-ban oldott 25%-os SDS-t adunk hozzá, majd a keveréket 15 percig 60 °C-on inkubáljuk. A DNS-t előbb kétszeri fenol-kloroformos, majd kétszeri kloroform-isoamil-alkoholos (24:1) extrakcióval tisztítjuk. A végső tisztítást cézium-klorid gradienssel ethidium-bromid jelenlétében végezzük. Az ethidium-bromidot izoamil-alkohollal extraháljuk. Kétszeres térfogatú, vízzel történő hígítás után 6-szoros térfogatú etanolos hígítással kicsapjuk a DNS-t. A csapadékot egy pálca segítségével nyerjük ki, és 1 ml TE-ben oldjuk. Az oldott DNS koncentrációját (1 pg/pl) a 260 nm-en mért OD alapján határoztuk meg.
b) A Lactococcus lactis DNS emésztése
125 pg Lactococcus lactis DNS-t részlegesen emésztünk két egység Alul- és két egység HaelII-enzimmel 35 percig 37 °C-on annak érdekében, hogy tompa végeket kapjunk. Az emésztést 0,1 mol/1 végkoncentrációban alkalmazott EDTA hozzáadásával állítjuk le.
Az emésztett DNS-t 1/20 térfogat 3 mol/l-es nátrium-acetáttal és 2 térfogat etanollal kicsapjuk. Centrifugálás után a DNS-t 300 μΐ TE-ben vesszük fel, majd a fragmenseket szukrózgradiensen szeparáljuk, 15 órán át 25 000 fordulatszámmal. A gradiensből 0,5 ml-es frakciókat szedünk, majd azokat 0,8%-os agaróz gélben analizáljuk. Az 1,5 és 4 kb fragmenseket tartalmazó frakciókat TE-vel szemben 4 órán át dializáljuk.
c) Az emésztett DNS bevitele a fgtll-vektorba
Az expressziós könyvtár elkészítéséhez a Ágtllvektort (amely a λ-bakteriofágból származik) választottuk ki. A könyvtár előállításának lényege, hogy a βgalaktozidáz génjének 3’-végi régiójába DNS-fragmenseket építünk be azért, hogy a ββ^Ιε^οζίόέζ-ρΓΟΓηοter szabályozása alatt álló hibrid fehérjéket expresszáltassunk.
pg (tompa végű) DNS-t, melyet a fent említett módon emésztettünk és dializáltunk, kötöttünk a Ágtl 1vektorhoz a következő elv szerint:
A DNS-t defoszforilált adapterekhez kötjük, hogy egy tompa és egy EcoRI ragadós véget kapjunk. A szabad adapterek gélszűrő oszlopon történő eltávolítása után az adapterhez kötött DNS-fragmenseket foszforiláljuk, és egy, a vektor előzőleg szintén EcoRI-gyel emésztett és defoszforilált karjához kötjük.
A fág részecskéket ezután in vitro burkoljuk. Az így kapott könyvtárt E. coli 1090 [hSd (r-km+k) lac U169, ProA + , Ion-, araDI39, StrA, SupF, trpC22: TnlO (pMC9)] baktériumtörzseknek a megfelelő fágszuszpenzióval történő fertőzésével titráltuk, és a transzformánsokat LB+ampicillin (50 pg/ml) táptalajon (baktotripton: 10 g/1, élesztőkivonat: 5 g/1, NaCl: 10 g/1) 43 °Con (hogy a baktérium lízisét elősegítsük) szelektáltuk. A lízisplakkokat 4 órás inkubálás után kaptuk meg.
Az ily módon kapott könyvtár körülbelül 3-szorosan reprezentálja a Lactococcus lactis genomot.
4. példa
A genomiális DNS-könyvtár átvizsgálása
a) A könyvtár lemezeken történő szélesztése, filterek készítése
A könyvtár LB+ampicillin+MgCl2 táptalajon történő szélesztése, és 3 óra 30 perces 43 °C-on történő inkubálása útján (nem expressziós körülmények) 75 000 lízisplakkot kaptunk. A lemezeket 10 mmol/1 IPTG-vel átitatott nitrocellulóz filterekkel lefedtük, és 4 órán át 37 °C-on inkubáltuk az expresszió indukálása céljából.
A filtereket TNT-ben (10 mmol/1 TRIS-HC1, pH=8, 150 mmol/1 NaCl, 0,05% Tween 20) áztatjuk, majd 30 percig szobahőmérsékleten óvatos kevertetés közben inkubáljuk ugyanazon pufferben.
A kiónok kiválasztásánál a hamis pozitív eredmények elkerülése érdekében, melyet a könyvtár átvizsgálásakor a nem specifikusan hibridizálódott kiónok adnak, egy másik sorozat filtert - az első sorozat másolatait - helyeztük a lemezekre, és az előzővel azonos módon inkubáltuk és kezeltük.
b) A 119-es szérum kimerítése
A könyvtár immunológiai szűrését a 119-es szérummal végezzük, melyet előzetesen az E. coli fehérjéivel szemben merítünk ki. A szérum kimerítését a következőképpen végezzük:
Az Y1090 E. coli törzset 100 ml LB + ampicillin táptalajon tenyésztjük 24 órán át 37 °C-on. A tenyészetet 5000 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A csapadékot 3 ml pufferben vesszük fel (50 mmol/1 TRIS, 10 mmol/1 EDTA, pH = 8), majd a szuszpenziót lefagyasztjuk -20 °C-on, majd felolvasztjuk, és ezt néhányszor megismételjük. A sejteket 0 °C-on, ultrahanggal tökéletesen lizáljuk (6x20 mp), majd 12 000 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk. A lizátumot kinyeijük, majd 4 órán át szobahőmérsékleten inkubáljuk 1 ml 10-szeres hígítású 119-es ellenanyag jelenlétében, TNT pufferben +1% zselatin +3% BSA +5% sovány (skim) tejporban.
A kimerített szérumot 4 °C-os 0,05% nátrium-azid hozzáadásával tároljuk.
c) A könyvtár immunológiai szűrővizsgálata
A nitrocellulóz filtereket ezután a 119-es szérummal inkubáljuk, és a kötött ellenanyagot alkalikus foszfatázzal jelzett anti-nyúl-ellenanyag segítségével hívjuk elő, amint azt a korábbiakban leírtuk.
Csak azokat a kiónokat vesszük figyelembe, melyek esetében mindkét filteren pozitív jelet kapunk. Ennek alapján 24 pozitív kiónt választottunk ki.
Annak érdekében, hogy a kapott jel specificitását megerősítsük, a pozitív klónokból szubklónokat hozunk létre, és azokat is ellenanyaggal történő vizsgálatnak vetjük alá. A pozitív lízisplakkok körüli gyűrűt eltávolítjuk, majd 500 μΐ SM pufferben (NaCl 6 g/1, MgSO4.7H2O 2 g/1, TRIS bázis 6 g/1, zselatin 0,01%, pH=7,5) inkubáljuk 2 órán át 4 °C-on, annak érdekében, hogy a gyűrűkből a fágrészecskék kidiffundálhassanak. Ezzel a szuszpenzióval ismét megfertőzzük az E. coli 1090-et, majd a keveréket LB+ampicillin+MgCl2 lemezekre szélesztjük az előzőekkel azonos módon azért, hogy jól elkülönült lízisplakkokat kapjunk. A 119-es szérummal történő második szűrővizsgálat az ellenőrzött 24 klónból 14 klón elhagyását tette lehetővé, melyek már nem mutattak egyértelmű jelet. A többi 10 kiónt, melyek tisztán pozitívak voltak, kiválasztottuk.
d) A rekombináns klánok jellemzése
A 10 pozitív klónból származó fág DNS-t extraháltuk és analizáltuk. A jól elkülönült lízisplakk (szubklón) szolgált rendszeresen kiindulási anyagként.
AZ LB+ampicillin lemezekről származó egyesített plakkokból a DNS-t extraháljuk. A lemezeket 5 ml SM-pufferrel lefedjük, majd 4 °C-on 2 órán át kevertetjük. A kapott szuszpenzióhoz néhány csepp kloroformot adunk, majd 4000 g-vel 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk, hogy a bakteriális sejttörmeléket eltávolítsuk. A fág szuszpenzióból extraháljuk a DNS-t, miáltal azt tisztítjuk is.
Az analízis első lépése a rekombináns fágok inszertjeinek PCR-amplifikációja, méretük meghatározása céljából.
Két oligonukleotidot [Xgtll láncindító (előre) 24 tagból álló oligomer és a Ág ti 1 láncindító (vissza) 24 tagból álló oligomer, Biolabs], melyek az EcoRI klónozóhelyet körülvevő β-galaktozidáz-szekvenciáknak felelnek meg, használtunk az inszertek amolifikálásához láncindítóként.
Az amplifikált termékek agaróz gélben (1,6%) történő analízise lehetővé tette, hogy a 10 kiválasztott Ágtl 1 klón méretét meghatározzuk, melyet 2-3,5 kb-nak találtunk.
Annak érdekében, hogy a klónozott DNS-ek restrikciós térképét meghatározzuk, a Ágtl 1-vektor inszertjeit pUC18-plazmidba klónoztuk [Yanish-Penon és munkatársai: Gene 33 103, (1985)]. Ily módon 6 inszert szubklónját kaptuk meg.
A 6 inszert restrikciós térképét elkészítettük; a 6 közül 5 esetben közös régiót találtunk, mely arra utal, hogy ez az 5 inszert azonos genomiális ffagmensből származik. Ezt megerősítette a Lactococcus lactis genomiális DNS restrikciós fragmenseivel történő Suthem-féle hibridizáció, melynek során a fragmenseket agaróz gélben választottuk el, majd 32P-vel radioaktívan jelzett inszertekkel együtt nejlonmembránra vittük.
Az 5 inszert közül 4-nek a restrikciós térképe az 1. ábrán látható.
A bemutatott inszertek mérete 3 kb, 2,7 kb, 2 kb és 3 kb. Mivel az inszertek átfedik egymást, a klónozott régió teljes mérete 4,5 kb.
A 6. klón, mely egy olyan inszertet tartalmaz, mely semmilyen hasonlóságot nem mutat a másik 5 klón megfelelő inszertjeivel, egy másik genomiális DNSffagmensből származik.
Annak eldöntésére, hogy vajon a két klónozott DNSfragmens közül az egyik tartalmazza-e a Lactococcus lactis malolaktikus enzimét kódoló gén 5 ’-régióját, Southem-féle hibridizációt alkalmaztunk, melynek során az inszerteket agaróz gélben választottuk el, majd a malolaktikus enzim N-terminális szekvenciájából származó oligonukleotid hibridizációs próbával nejlonmembránra vittük (P. Renault: korábban idézett közlése). A kiválasztott hibridizációs próba az első 6 aminosavat tartalmazó szekvenciából levezethető oligonukleotidok keveréke:
ATG(A,C)G(G,A,T,C)GC(G,A,T,C)CA(T,C,)GA(G,A)AT.
Az azonos DNS-fragmensekből származó 5 inszert hibridizálódott a hibridizációs próbával, ami azt bizonyítja, hogy a Lactococcus lactis malolaktikus enzimet kódoló gén 5’-vége benne van az 5 klónozott inszertben. Másfelől, a 6. klón esetében hibridizáció nem volt megfigyelhető.
HU 217 410 Β
e) A P153A klón szekvenciája
Az 5 klón közül a 2,7 kb inszertet tartalmazó P153Anak meghatároztuk a nukleotidszekvenciáját. A szekvenálást dideoxi-teminációs módszerrel, Applied Biosystem által forgalmazott szekvenátorral végeztük. Az inszert teljes szekvenciáját, valamint az abból levezethető aminosavszekvenciát az 1. szekvenciaazonosító számon közöljük. A malolaktikus gént kódoló régió 1620 nukleotidból áll. Az első 20 aminosav, melyet a kapott nukleotidszekvenciából vezettünk le, azonos a tisztított enzim szekvenálásakor kapottal, azzal az eltéréssel, hogy a tisztított enzim 14. aminosava cisztein, a nukleotidszekvenciából levezethető lizinnel szemben. Ez a nyitott leolvasási fázis egy 53 kD móltömegű fehéijét kódol, mely tökéletesen összeegyeztethető a Lactococcus lactis malolaktikus enzimjének gélszűréssel és SDS-PAGE-eljárással kapott molekulatömegével (60 kD).
Az 1. azonosítószámú szekvencia tartalmaz további 465 nukleotidot a transzlációs iniciációs kodontól 5’irányban. Ez a szekvencia tartalmazza a malolaktikus enzim gén egész promoterét. A Lactococcus lactis promoterei 150 nukleotid nagyságrendűek az iniciációs kodontól 5’-irányban. Továbbá a Lactococcus lactis gének transzkripciójának iniciálására jellemző szignálok is megtalálhatók.
A nyitott leolvasási fázistól 3’-irányban 596 nukleotidot szekvenáltunk meg, és a malolaktikus géntől 3’irányban - eltérő leolvasási fázisban - egy másik, 581 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási fázist találtunk.
A génekhez, vagy az ismert fehéijékhez viszonyított hasonlóság meghatározását az 1. azonosítószámú nukleotidszekvenciának adatbázisokból származó fehérjeszekvenciákkal történő összehasonlításával végeztük.
Ami az 1620 nukleotid hosszúságú nyitott leolvasási fázist illeti, a különböző malátenzimekkel összehasonlítva jelentős mértékű az olyan konzervatív aminosav- és nukleotidszekvenciák jelenléte, melyek a malát piruváttá történő dekarboxilezéséért felelősek.
Találtunk ezenfelül NAD-kötésért felelős konszenzusszekvenciát is.
Ezek a homológiák tökéletesen összeegyeztethetőek a malolaktikus enzim funkciójával, miszerint - lévén malátenzim - szubsztrátja az almasav (malát), és a szubsztrát tej savvá (laktáttá) történő átalakításához NAD-ot igényel.
A malolaktikus géntől 3’-irányban azonosított nyitott leolvasási fázis szintén jelentős (körülbelül 40%-os) aminosavhomológiát mutat, a citrát permeázzal összehasonlítva. Nagyon valószínűnek látszik, hogy ez a nyitott leolvasási fázis a malát permeáz 5 ’-régióját tartalmazhatja.
Ennek megfelelően úgy tűnik, hogy a szekvenált DNS-ffagmens a malolaktikus enzimet kódoló struktúrgént és a malát permeáz gén egy részét tartalmazza, valamint, hogy ezek a gének egy operonba vannak rendeződve.
5. példa
A malolaktikus gén expressziója E. coliban
A malolaktikus gén E. coli-lxai történő expresszióját a DH5a baktériumtörzs különböző transzformánsaíban vizsgáltuk: pl53A (szekvenált klón), p5A, pl91A (a restrikciós térképek az 1. ábrán láthatók).
A transzformánsokat és a pUC18-cal transzformált kontrolitörzset egyaránt egy sor növekvő malátkoncentrációval rendelkező táptalajon szaporítottuk: 3 ml M9 táptalaj (Na2HPO4.7H2O 6 g/1, KH2PO4 3 g/1, NaCl 0,5 g/1, NH4C1 1 g/1, glükóz 4 g/1), 1 mg/ml tiaminnal, 20 mg/ml aszparaginsawal és 20 mg/ml ampicillinnel kiegészítve, továbbá 0; 0,3; 0,5 vagy 1% (vegyes%) malátkoncentrációval. A táptalaj pH-ját 6,5-re állítottuk citromsav felhasználásával.
A tenyészetet 37 °C-on kevertetve inkubáltuk 48 órán át.
Kontroliképpen Lactococcus lactisA tenyésztettünk 8 ml M9-táptalajon, mely 5 g/1 élesztőkivonatot tartalmaz, továbbá a malátot az előzővel azonos koncentrációtartományban. A tenyészetet 28 °C-on 48 órán át inkubáltuk anaerob körülmények között.
A tenyészetet ezután 10 percig 1000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, majd L-laktáttartalomra vizsgáltuk. Az L-laktát mérését egy kereskedelmi forgalomban beszerezhető reagenskészlettel (Boeringer) végeztük, a gyártó erre vonatkozó előírásai szerint.
Az eredmények, melyeket az 1. táblázat tartalmaz (g/l-ben kifejezve), a transzformáns pl53A és pl91A tenyészet felülúszóiban nagyon tisztán tej savtermelést mutatnak, míg a laktát nyomokban sem mutatható ki a kontrolitörzs (E. coli DH5 pUC18-cal transzformálva) felülúszójában. Egy másik transzformáns - a P5A - azonban, melyet azonos körülmények között vizsgáltunk, nem termel tej savat. Ez azzal a ténnyel magyarázható, hogy a p5A rekombináns vektor által hordozott malolaktikus gén 3’-végéről 200 nukleotid hiányzik. Ezért úgy tűnik, hogy ennek a régiónak a megléte feltétlenül szükséges a malolaktikus aktivitáshoz.
A malátot nem tartalmazó tenyészetekben, sem a pl53A és pl91A transzformánsok, sem a pUC18-cal transzformált kontrolitörzs tenyészeteiben nem termelődött tej sav. Ez azzal magyarázható, hogy az E. coli ilyen körülmények között nem termel L-laktátot.
Malát jelenlétében a kontrolitörzs esetében nem figyelhető meg laktáttermelés. Másfelől azonban, a transzformáns pl53A és pl91A törzsek esetében egyértelmű tej savtermelést lehet megfigyelni 0,1; 0,3 és 1% malátkoncentráció esetében.
A termelt tejsav koncentrációja meglehetősen alacsony a L. lactis kontrolihoz képest, melyet azonos módon és ugyanazon kiinduló malátkoncentrációk esetében vizsgáltunk. Meg kell azonban említeni, hogy a L. lactis a malolaktikus fermentáción kívül nagy mennyiségben termel L-laktátot a cukrok lebontásával is, az L-LDH közvetítésével, mely a piruvátot tej savvá alakítja.
Nehéz meghatározni továbbá a malátnak azt a hányadát, mely ténylegesen elérhető a malolaktikus fermentáció számára. Valójában lehetséges, hogy az E. coli tenyésztési körülményei között a malát jelentős hányada a trikarbonsav ciklusban vesz részt.
HU 217 410 Β
1. táblázat
Baktériumtörzs % malát a táptalajban
E. coli DH5a (pUC18) 0,001 0,017 0,008 0,015
E. coli (pl53A) 0,015 0,12 0,23 0,31
E. colHp\9\A) 0,017 0,17 0,15 0,2
Lactococcus lactis 2,6 5,09 8,5 -
6. példa
A malolaktikus gén expressziója élesztőben
Annak érdekében, hogy a malolaktikus enzim élesztőben klónozott génjét expresszáltassuk, a kódolórégiót az élesztő szabályozóelemeinek (promoterek és terminátorok) irányítása alá helyeztük élesztő /E. coli ingázó vektorokban (shuttle vektorokban).
a) A malolaktikus enzim bevitele apVTIOO-U nagy kó- 20 piaszámú plazmidba
A pVTIOO-U expressziós plazmidot alkalmaztuk.
Ez a plazmid tartalmazza az élesztő 2μ replikációs origóját, a szelektálható URA3 markert, az erős ADH szabályozóelemeket (alkohol dehidrogenáz I promoter és 25 terminátor), valamint a bakteriális elemeket (az ampicillin rezisztencia gén replikációs origóját).
A plazmidot Vemet és munkatársai írták le [Gene 52, 225 (1987)].
A malolaktikus gén kódolórégióját, a pl53A-plaz- 30 middal kezdve PCR-rel amplifikáltuk, a malolaktikus gén szekvenciájából származó oligonukleotidokat tartalmazó láncindítók alkalmazásával.
A klónozást elősegítendő, az amplifikáció során a kódolórégiótól 5’-irányban egy Xhol restrikciós helyet, a kódolórégiótól 3 ’-irányban pedig egy Xbal helyet építettünk be. A következő oligonukleotidokat alkalmaztuk láncindítóként:
- egy olyan oligonukleotid, mely lehetővé teszi a kódolórégió izolálását az ATG transzlációs iniciációs kodon szintjén (1. láncindító), továbbá tartalmaz egy Xhol helyet,
- a 3’-oldalra választott oligonukleotid pedig (3’láncindító) a transzlációs stopkodontól néhány nukleotidnyira 3’-irányban képes hibridizálódni.
Az alkalmazott láncindítók szekvenciája és pontos elhelyezkedése a 2. ábrán található.
Az amplifikációt a következő leirat szerint végeztük:
1. láncindító 4 μΐ (30 pmol)
2. láncindító 4 μΐ (30 pmol)
10X Taqpuffer 10 μΐ
Taq polimeráz (5 Ε/μΙ) 0,5 μΐ
dNTP 2 μιηοΐ/ΐ 10 μΐ
MgCl2 25 mmol/1 6 μΐ
pl53A 4 μΐ (40 ng)
H2O 62 μΐ
Az amplifikáció körülményei: 30 mp 94 °C-on.
mp 40 °C-on, 1 perc 72 °C-on, 30 ciklusban.
Az amplifikált fragmensek méretét a belőlük vett mintákból agaróz gélben határoztuk meg.
Az amplifikált fragmensekből 100 ng-ot Xhol és Xbal restrikciós endonukleázokkal emésztettünk, majd a pVTIOO-U-vektor 50 ng-jával ligáltuk, mely vektort előzetesen Xhol- és Xbal-enzimekkel emésztettünk, majd defoszforiláltunk.
A kapott, pM 1-nek nevezett pVTlOO-U-vektorszármazékot a 3. ábra mutatja be.
b) Az élesztő transzformálása
A Saccharomyces cerevisiae SCV5M élesztőtörzset 10 a pMl-vektorral transzformáltuk. Az SCVM törzset 1992. jún. 18-án helyeztük letétbe a „Collection Nationale de Cultures de Microorganismes”-ben, melyet a Pasteur Intézet tart fenn, 1-1222 deponálási számon. Ez egy laboratóriumi törzs, mely haploid, ura-, MATa és 15 egy oenologiai törzsből származik.
Az alkalmazott transzformációs eljárás az Ito és munkatársai által leírt lítium-acetátos módszer [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)].
c) A malolaktikus fermentáció kivitelezése élesztővel
A kapott transzformánsok közül kettőt, melyek megjelölése ScV5M/pMIa és ScV5M/pMIb, malolaktikus fermentációs kapacitásuk (a malát tejsavvá alakítása) szempontjából vizsgáltunk. A transzformánsokat a következő feltételek között tenyésztettük:
- egyrészt az YNB szintetikus minimáltáptalajban (6,7 g/1 „yeast nitrogén base without amino acid” (DIFCO), 20 g/1 glükóz], mely 0; 0,6 vagy 1% malátot tartalmazott, melynek pH ját 3-ra vagy 6-ra állítottuk be, mindkét esetben citromsavval (6,3 g/1),
- másrészt a szőlőmust összetételét imitáló szintetikus táptalajban [Sablayrolles és Barre: Sciences des Aliments, 6, 373 (1986)], melyet pH=3,3-ra puffereltünk.
A két alkalmazott táptalaj nem tartalmaz uracilt, 35 mely lehetővé teszi a plazmidok szelekcióját.
Az inszertet nem tartalmazó pVTIOO-U-plazmiddal transzformált ScV5M törzs volt a negatív kontroll.
A tenyésztés és az analízis körülményei
Az élesztőtörzsekkel (transzformánsok és a kont40 roll) 8 ml tápoldatot oltunk be.
A tenyésztést steril 10 ml-es csövekben, 28 °C-on, 60 órán át, kevertetés nélkül végeztük.
Ezután a tenyészetet 5 percig 4000 g-vel centrifugáltuk és a felülúszót L-laktát-tartalomra az 5. példában 45 leírtak szerint Boeringer-reagenskészlettel vizsgáltuk. Eredmények
A kapott eredményeket a 2. táblázat mutatja be.
Az YNB szintetikus minimáltáptalajban a kontroll élesztő esetében (2. táblázat) sem malát hiányában, sem 50 annak jelenlétében nem lehetett L-laktózt nyomokban sem kimutatni.
Ez teljesen összhangban áll azzal a ténnyel, hogy az S. cerevisiae nem képes a malátot laktáttá alakítani, továbbá azzal, hogy anaerob körülmények között is csak nagyon kevés laktátot termel glükózból, és az főleg D-laktát.
A pMla és pMlb transzformált törzsek malát hiányában csak nyomokban termelnek laktátot, körülbelül 50-100 mg-ot. Valószínű, hogy ez a csekély termelés a malolaktikus enzim működésének eredménye, mely az
HU 217 410 Β élesztőben a glükóz metabolizmusa során keletkező endogén malát felhasználásán alapul. Ha a táptalaj és a pH=3-ra beállított YNB-táptalaj malátot is tartalmaz (0,6 és 1% malát), vagy a szintetikus táptalaj esetében (pH=3,3; 3 g/1 malát), szignifikáns L-laktát-termelés tapasztalható (0,5-0,7 g/1 a pMla-klón esetében, azonos kísérleti körülmények között).
A legnagyobb mértékű termelés a szintetikus táptalaj esetében tapasztalható, melynek összetétele nagyon hasonló a szőlőmustéhoz (0,7 g/1 laktát, mely 7,7 pmol/mlnek felel meg).
Ugyanilyen tenyésztési körülmények esetében (YNB), de pH=6-nál az L-laktát-termelés nagyon csekély, nagyságrendileg azonos tartományba esik, mint a malátot nem tartalmazó táptalajok esetében.
Az L-laktát-termelésben a pH függvényében tapasztalható eltérés azzal magyarázható, hogy pH=6-nál a malát nehezebben kerül be a 5. cerevisiae-be. pH=3nál, illetve pH=3,3-nál a malát nagy hányada (pK 3,5) disszociálatlan formában van, mely könnyebben tud a sejtbe diffundálni. Másfelől azonban, pH=6-nál a malát főleg disszociált formában van, mely sokkal nehezebben kerülhet a sejt belsejébe.
A rekombináns törzsek tehát képesek lebontani a malátot laktáttá a malolaktikus fermentáció révén, továbbá savas pH-η - vagyis az oenológiaiakhoz hasonló körülmények között - nagyobb hatékonysággal teszik mindezt.
2. táblázat
Laktát meghatározása S. cerevisiae-ben
Élesztőtörzs Termelt L-laktát (&Ί) Termelt L-laktát (pmol/ml)
ScVRM/pVTIOO-U
pH=3 esetében:
0% malát 2,4x10-5 0,02
0,6% malát 7xl0-3 0,07
1 % malát 9x10-3 0,1
pH=6 esetében:
0% malát 3x10-3 0,03
0,6% malát 6x10-3 0,06
1 % malát 10x10-3 0,11
Szintetikus táptalaj
esetében:
pH=3,3 9x10-3 0,1
ScVSM/pMla
pH=3 esetében:
0% malát 0,15 1,66
0,6% malát 0,4 4,4
1% malát 0,52 5,7
pH=6 esetében:
0% malát 0,1 1,1
0,6% malát 0,07 0,77
1 % malát 0,05 0,55
Élesztőtörzs Termelt L-laktát (g/1) Termelt L-laktát (pmol/ml)
Szintetikus táptalaj
esetében:
pH=3,3 0,7 7,7
ScVSM/pmlb
pH=3 esetében:
0% malát 0,15 1,66
0,6% malát 0,40 4,4
1 % malát 0,48 5,3
pH=6 esetében:
0% malát 0,11 1,22
0,6% malát 0,08 0,88
1 % malát 0,056 0,62
Szintetikus táptalaj
esetében:
pH=3,3 0,51 5,66
Ugyanezen kísérleteket végeztük el szintetikus táptalajon is, és a laktáttermelést a tenyésztés 10. napja után mértük; 1,5 g/1 (mely 17 pmol/ml-nek felel meg) laktát termelődött ilyen kísérleti körülmények között.
7. példa
A malolaktikus gén expressziója
Schizosaccharomyces pombe-ban
A malolaktikus gén expresszióját Schizosaccharomyces pombe-ban is vizsgáltuk. Ebben az esetben a malolaktikus gén kódolórégióját egy S. pombe promoter szabályozása alá helyeztük, egy 5. pombe/E. coli ingázó vektorban.
a) A malolaktikus gén beépítése a nagy kópiaszámú pARTl -plazmidba
Expressziós plazmidként a pARTl-et alkalmaztuk. Ez a plazmid az élesztő ARS1 replikációs origóját és a LEU szelekciós markert, továbbá az alkohol dehidrogenáz promotert tartalmazza, valamint rendelkezik bakteriális elemekkel is (az ampicillin rezisztencia gén és replikációs origó).
Ezt a plazmidot McLeod és munkatársai írták le [Embo J. 6, 729 (1987)].
A malolaktikus gén kódolórégióját pl53A-plazmidból kiindulva, PCR-rel amplifikáltuk, a malolaktikus gén szekvenciájából származó oligonukleotidokat tartalmazó láncindítók segítségével. A klónozás elősegítése céljából az amplifikáció során a kódolórégiótól 5’-irányban BamHI restrikciós helyet, 3’-irányban pedig SacI restrikciós helyet építettünk be.
Láncindítóként a következő oligonukleotidokat alkalmaztuk:
- egy olyan oligonukleotid, mely lehetővé teszi kódolórégió izolálását az ATG transzlációs iniciációs kodon szintjén (12. láncindító) és BamHI helyet tartalmaz,
- a 3’-végi választott oligonukleotid (13. láncindító) a transzlációs stopkódontól néhány nukleotidnyira 3’-irányban hibridizálódik, és SacI helyet tartalmaz.
A szekvenciákat és az alkalmazott láncindítók pontos elhelyezkedését a 2. ábra mutatja be.
Az amplifikációt a következő leirat szerint végeztük:
12. láncindító
13. láncindító lOxTaq puffer
Taq polimeráz (5Ε/μ1) dNTP 2 μηιο1/1 MgCl2 25 mmol/1 pl53A
H2O μΐ (20 pmol) μΐ (20 pmol) 10 μΐ 0,5 μΐ 10 μΐ 6 μΐ μΐ (100 ng)
65,5 μΐ
Az amplifikáció körülményei: 30 mp 94 °C-on, 30 mp 37 °C-on, 1 perc 72 °C-on, 30 ciklusban.
Az amplifikált fragmensek 100 ng-ját BamHI és SacI restrikciós enzimekkel emésztettük, majd 50 ng, előzetesen BamHI-gyel és Sacl-gyel emésztett és defoszforilált pARTl-vektorral ligáltuk.
A kapott vektort, melyet pD4-nek neveztünk, a 4. ábra mutatja be. b) A S. pombe transzformálása
Egy leucin-auxotrof S. pombe törzset pD4- és pARTl-vektorokkal transzformáltunk. Ez egy laboratóriumi leu-132h+törzs, mely J. Kohli-tól („Institute of
General Microbiology”, Raltzerstrasse 4, CH-3012, Bem, Switzerland) származik.
Az alkalmazott transzformációs eljárás egy lítiumacetátos transzformációs eljárás, melyet Ito és munkatársai [J. Bacteriol. 153, 163 (1983)] írtak le. c) A malolaktikus fermentációs termelés az S. pombe esetében
A kapott transzformánsok közül egynek, melyet Sp/D42-nek neveztünk, vizsgáltuk a malolaktikus fermentációs kapacitását (a malát átalakítása laktáttá). A transzformánsokat az alábbi körülmények között tenyésztettük.
- YND szintetikus minimáltáptalaj, mely 50 g/1 glükózt és 5,5 g/1 malátot tartalmaz, melyet pH=3,5-re vagy pH=6-ra puffereltünk. Ez a táptalaj nem tartalmaz leucint, ami lehetővé teszi a beépített plazmidok szelekcióját.
Negatív kontrollként ugyanezen törzs inszertet nem tartalmazó pARTl-plazmiddal transzformált változata szolgált.
Az élesztőtörzsekkel (transzformánsok és kontroll) 8 ml táptalajt oltunk be. A tenyésztést 10 ml-es steril csövekben végeztük, 40 °C-on, egy héten keresztül, kevertetés nélkül.
A tenyészeteket 5 percig 4000 g-vel centrifugáltuk, és a felülúszót L-laktát-termelésre Boeringer-reagenskészlet alkalmazásával vizsgáltuk, a fent leírtakkal azonos módon. Az L-malát bomlását az L-malát-maradék mérésén keresztül (Boeringer-reagenskészlet) számítottuk.
A kapott eredményeket a 3. táblázat mutatja be.
A különböző vizsgált tenyésztési körülmények között a kontroll Sp/pARTl élesztő nagyon kevés laktátot termelt (20-40 mg/1 nagyságrendben). Továbbá az ó. pombe az 5. cerevisiaeAtoz hasonlóan nem képes a malátot laktáttá alakítani, másfelől pedig anaerob körülmények között is csak igen kevés laktátot termel glükóz felhasználásával.
A malolaktikus génnel transzformált törzs (Sp/D42) malát hiányában nagyon kis mennyiségű laktátot termel 170-300 mg/1 nagyságrendben. Ez az alacsony szintű termelés valószínűleg a glükózból származó endogén malát egy részének malolaktikus fermentációja által következik be. Ezt a S. cerevisiae transzformánsok esetében is megfigyeltük (2. táblázat). A táptalajban lévő 5,5 g/1 maláttartalom esetén nagymértékű L-laktát-termelés figyelhető meg az Sp/D42 transzformáns eseté15 ben, mely 2,4-3 g/1, a táptalaj pH-jától függően. A legintenzívebb termelés savas pH-η, azaz oenológiai pHviszonyok között figyelhető meg. A pH=6 értéken kapott termelés szintén nagyon nagy mértékű, a S. cerevisiae azonos pH-η mért termeléséhez képest.
Másrészt, 5,5 g/1 L-malát jelenlétében savas pH-n az Sp/D42 transzformáns képes gyakorlatilag a táptalajban lévő összes malát lebontására (pH=3,5-nél csak 150 mg/1 malát nem bomlott le), sőt a jelen lévő malátnak több mint 80%-át képes L-laktáttá alakítani (3,05 g/1).
3. táblázat
Laktát meghatározása S. pombe-ban
Élesztőtörzs Termelt L-laktát (g/1) Maradék L-laktát (pmol/ml)
Sp/pARTl
pH=3,5 esetében:
0% malát nem kimutatható
0,55% malát 0,04 1,4
pH=6 esetében:
0% malát 0,02
0,55% malát 0,03 4,6
Sp/D42
pH=3,5 esetében:
0% malát 0,17
0,55% malát 3,5 0,15
pH=6 esetében:
0% malát 0,3
0,55% malát 2,4 1,5
SZEKVENCIALISTA
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADA55 TAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 2684 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HU 217 410 Β
MOLEKULATÍPUS: DNS (genomiális) HIPOTETIKUS: nem ANTISZENSZ: nem EREDETI FORRÁS:
ORGANIZMUS TOVÁBBI SAJÁTSÁG: NÉV/MEGJELÖLÉS: CDS ELHELYEZKEDÉS: 466-2085
EGYÉB INFORMÁCIÓ: termék=„malolaktikus enzim”
TOVÁBBI SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: -35jel
ELHELYEZKEDÉS: 392-397 TOVÁBBI SAJÁTSÁG:
NÉV/MEGJELÖLÉS: -lOjel ELHELYEZKEDÉS: 416-421
AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TTTTGTTGAA AAAATTTCTA AAAAGTAGAG TGATTTTACT TAAAGCAAAG CGCACAATTT ACCATTGACA AAAAATCTTA ATAGGAGGAG GACAGTTTAT GATTAATATC ATCTATTTTT TTATAAATTA AATTTATCAA TAATAAAGTA ATAACATTAA
ATCAAATTAT TAACCTAAAA CTACTTTTTT AGAATACTTT TGGTTTTATT TAAAAAAATG ATCCTAAATT GGTTGAAACC CATTTAATAG TTATAAGCTA ATATAGAGAC TTTTAAATAA CACTAAGGAA TTTGACTATA TTATAATTTT AATGGAGGTT
GATACATAAA TTTAAAAAAT TATATAATAG GAAATATGAA GATACCTTAG ATACACAACC CTGATAAATT AGGGATAGTA ATTTTTACTA CCATTTCTTT ACATTGACAT TATTTATGCG ACGATAAAAG AAGTTTATAG GTACG ATG CGT GCA
Met Arg Alá 1
CAT GAA ATT TTA AAC AAT CCT TTT TTA AAT AAA GGA ACA GCT TTT ACT
Hi s Glu 5 I le Leu Asn Asn Pro 10 Phe Leu Asn Ly s Gly 15 Thr Al a Phe Thr
ATG AAA GAC CGT CAA GAA TTG GGG TTG ATT GGT CTT CTT CCA CCA ACT
Me t 20 Lys As p Arg Gin Glu 25 Leu Gly Leu I le Gly 30 Leu Leu Pro Pro Thr 35
GTT CAA ACA ATT GAG GAA CAA GCT GAA CAA ACT TAC GAA CAA TAT TTG
Val Gin Thr I le Glu 40 Glu Gin Al a Glu Gin 45 Thr Tyr Glu Gin Tyr 50 Leu
ACA AAA CCA TCT GAT TTA GAA AAA CGT CAT TTC TTG ATG GAA ATT TTT
Thr Ly s Pro Ser 55 As p Leu Glu Lys Arg 60 Hi s Phe Leu Me t Glu 65 I 1 e Phe
AAT ACA AAC CGT ACT TTG TTT TAC TAC TTA TTC AAC AAA CAT ATT GTA
Asn Thr Asn 70 Arg Thr Leu Phe Tyr 75 Tyr Leu Phe Asn Lys 80 Hi s I 1 e Va 1
GAA TTT AAT CCA GTT GTT TAT GAT CCA ACA ATT GCT GAT ACA ATT GAA
Glu Phe 85 Asn Pro Va 1 Va 1 Tyr 90 As p Pro Thr I le Al a 95 As p Thr I le Glu
AAC TAC AGT CAT TTG TTC GTA GAT CCA CAA TAT GCT GCT TAT CTT GAT
Asn 100 Tyr Ser Hi s Leu Phe 105 Va 1 As p Pro Gin Tyr 110 Al a Al a Tyr Leu As p 115
ATT AAC CAC CCT GAA AAC ATT ACT GAA ACA TTG AAA AGT GCA GCA GGT
I le Asn Hi s Pro Glu 120 Asn 11 e Thr Glu Thr 125 Leu Ly s Ser Al a Al a 130 Gly
GAC AGA GAA ATT CGT CCT ATT GTT GTA ACT GAT GCT GAA GGA ACC CTT
As p Arg Glu 11 e 135 Arg Pro 11 e Va 1 Va 1 140 Thr As p Al a Glu Gly 145 Thr Leu
GGT ATT GGA GAC TGG GGA ACT CAA GGT GTT GAT ATC TCA GTT GGT AAA
Gly I le Gly 150 As p Trp Gly Thr Gin 155 Gly Va 1 As p 11 e Ser 160 Va 1 Gly Ly s
TTA ATG ATT TAT ACA GCC GCA GCA GGT ATT GAT CCA GCG TCT GTA CTT
Leu Me t 165 I 1 e Tyr Thr Al a Al a 170 Al a Gly I 1 e As p Pro 175 Al a Ser Va 1 Leu
CCA GTT GTT ATT GAT GCA GGG ACA AAT AGG AAA GGA CTT TTA GAA GAT
Pro 180 Va 1 Va 1 I 1 e As p Al a 185 Gly Thr Asn Arg Ly s 190 Gly Leu Leu Glu As p 195
CAT TTG TAT CTT GGA AAT CAT CAA GAA CGT ATT TAC GGT GAT CAA TAC
Hi s Leu Tyr Leu Gly 200 Asn Hi s Gin Glu Arg 205 I 1 e Tyr Gly As p Gin 210 Tyr
TAC AGT TTC GTC GAT CAA TTT GTA GAA ACT GCA GAA TCA ATT TTC CCT
Tyr Ser Phe Va 1 As p Gin Phe Va 1 G1 u Thr Al a Glu Ser 11 e Phe Pro
215 220 225
AAA TTG TAC CTT CAC TGG GAA GAT TTC GGA CGT TCA AAT GCT GCA ACA
Lys Leu Tyr Leu Hi s Trp Glu As p Phe Gly Arg Ser Asn Al a Al a Thr
230 235 240
ATT TTA AAT AAC TAC AAA ACA AAA ATC CCA ACA TTT AAT GAT GAC ATT
I 1 e Leu Asn Asn Tyr Ly s Thr Ly s I le Pro Thr Phe As n As p As p I le
245 250 255
CAA GGA ACT GGT ATT GTT GTT TTA GGT GGT ATT TTC GGA TCA CTT GAC
Gin Gly Thr Gly 11 e Va 1 Va 1 Leu Gly Gly 11 e Phe Gly Ser Leu Asp
260 265 270 275
ATT ACA GGT GAA AAA TTA ACT GAT CAA GTA TAT CTT TGC TAT GGT GGT
I le Thr Gly Glu Ly s Leu Thr As p Gin Va 1 Tyr Leu Cys Tyr Gly Gly
280 285 290
GGT TCA GCC GGT GCA GGG ATT GCT GGT CGT GTT CAT GCT GAA ATG GTT
Gly Ser Al a Gly Aln Gly I le Aln Gly Arg Va 1 Hi s Al a Glu Me t Va 1
295 300 305
AGT GAA GGT CTT TCT GAA GAA GAA GCT TAC AAA CAT TTC TTC ATG ATT
Ser Glu Gly Leu Ser Glu Glu Glu Al a Tyt Ly s Hi s Phe Phe Me t 11 e
3 10 315 320
GAT CAA CAA GGT TTA CTT TTT GAT GAT ATG GAA GAC CTT ACA CCA GCT
As p Gin Gin Gly Leu Leu Phe As p Asp Me t Glu Asp Leu Thr Pro Al a
325 330 335
CAA AAA CCA TTT GCT AAA AAA CGT GCT GAT TAT AAA GAT GCT GGA GAT
Gin Ly s Pro Phe Al a Ly s Ly s Arg Al a As p Tyr Ly s As p Al a Gly As p
340 345 350 355
ATG ACT GAC CTT CTT AAC GTT GTT AAG ACA GTA AAA CCA ACT ATT TTA
Me t Thr Asp Leu Leu Asn Val Val Lys Thr Val Ly s Pro Thr I le Leu
360 365 370
GTA GGA ACT TCA ACT AAT CCA GGT GCC TTT ACA AAA GAA GTT GTT GAA
Va 1 Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Al a Phe Thr Ly s Glu Va 1 Va 1 Glu
375 380 385
GCA ATG TGT GCT AAT ACA GAA CGC CCA GTA ATC TTC CCT ATC TCA AAT
Al a Me c Cy s Al a Asn Thr Glu Arg Pro Va 1 I le Phe Pro I le Ser Asn
390 395 400
CCA ACT AAA AAA ATG GAA ACT ACA GCT GAA CAA GTT ATT GAG TGG TCT
Pro Thr Ly s Lys Me t Glu Thr Thr Al a Glu Gin Va 1 I 1 e Glu Trp Ser
405 410 415
GAT GGA AAA GCT TTT GTC GCT ACT GGT GTT CCT TCA GGA ACA ATC AGC
As p Gly Lys Al a Phe Val Al a Thr Gly Val Pro Ser Gly Thr I 1 e Ser
420 425 430 435
TAC AAA GGT GTT GAT TAT CAA ATT GGT CAA GCA AAT AAC TCA CTT ATC
Tyr Ly s Gly Va 1 As p Tyr Gin I le Gly Gin Al a Asn As n Ser Leu I le
440 445 450
CAC CCA GGT TTG GGC TTA GGA ATG TTG GCA TCT GAA GCA AAA CTT TTG
Hi s Pro Gly Leu Gly Leu Gly Me t Leu Al a Ser Glu Al a Ly s Leu Leu
455 460 465
ACA GAT GAA ATG ATC GGT GCA GCT GCA CAT TCA TTG AGC GGT TTA GTA
Thr Asp Glu Me t I le Gly Al a Al a Al a Hi s Ser Leu Ser Gly Leu Va 1
470 475 480
GAT CCA GGT AAA CCA GGT GCT CCT GTT CTT CCT CCA TTT GAA TTT GTT
As p Pro Gly Ly s Pro Gly Al a Pro Val Leu Pro Pro Phe Glu Phe Val
485 490 495
GCT GAT GTA TCA ATT AAA GTT GCA GAA GCA GTT GCT AAG AAA GCT CAA
Al a As p Val Ser I 1 e Lys Va 1 Al a Glu Alá Va 1 Alá Lys Lys Al a Gin
500 505 510 515
GAA CAA GGT CTT ACT GAA TCT AAA GAA ACT GAT ATG GCT AAA GCA GTT
Glu G1 n Gly Leu Thr Glu Ser Ly s Glu Thr As p Me t Al a Lys Al a Va 1
520 525 530
HU 217 410 Β
CGT GAT CTT AAA TGG TAT CCA GAG TAC TAAGGGGAAT ATCTTAAATG Arg Asp Leu Lys Trp Tyr Pro Glu Tyr
535 540
AAAAAACTTA AAGAAACGAA AATATCGGGA ATTAGTCTTC CCTTATATGC CTTTTTCGTA GCTGTCATCA TAGTTGTAAC ACTATTAGGA AAACTTCCAC TTGATATGGT AGGGTTAACT CTCCTACTTG TAACATTAGG CCACCTATTA TACTTCATAG GAGAAAAATT CCCTATTATG AATTCATACT TAGGTGGGGG ATCTGTTTTC ACTTTAATTG GTGCTACTCT ATTATCTTTC TTCCACATTG TTCCTTCAAA TGTTATTGGA GCAGTTTCCA ATTTTATGGG TGGAAAATTT GGATTTCTTG ATTTTTATAT AGCTGCACTT ATCTGTGGAT CTATTTTAGG AATGAACAGA AATCTTTTGG TTAAAGCTTC CAAGAAATTT ATTCCGATTG CTTTAATCAC TATGGTTATT GGTTTCTTCT CAGTAGGTCT TGTAGGAATG CTTATTGGTA ATGGATTTGC TGATTCTGTA ATGTATGTTT CTATGCCAAT GATGTCAGGT GGTATGGGAG CCGGAATTAC TCACTCTCTC AAATCTATGC AGCCGGATTG GCTCATGGAA ACCAAGCAG
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: 15 TÍPUSA: aminosav A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: TOPOLÓGIÁJA: lineáris
HOSSZA: 540 aminosav MOLEKULATÍPUS: protein
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
Me t 1 Arg Al a Hi s Glu 5 I le Leu As n As n Pro 10 Phe Leu Asn Ly s Gly 15 Thr
Al a Phe Thr Me t 20 Ly s As p Arg Gin Glu 25 Leu Gly Leu I le Gly 30 Leu Leu
Pro Pro Thr 35 Va 1 Gin Thr I le Glu 40 Glu Gin Al a Glu Gin 45 Thr Tyr Glu
Gin Tyr 50 Leu Thr Lys Pro Ser 55 As p Leu Glu Lys Arg 60 Hi s Phe Leu Me t
Glu 65 I le Phe Asn Thr Asn 70 Arg Thr Leu Phe Tyr 75 Tyr Leu Phe Asn Lys 80
Hi s I le Val Glu Phe 85 Asn Pro Va 1 Val Tyr 90 Asp Pro Thr I le Al a 95 As p
Thr I 1 e Glu As n 100 Tyr Ser Hi s Leu Phe 105 Va 1 As p Pro Gin Tyr 110 Al a Al a
Tyr Leu As p 1 15 I le Asn Hi s Pro Glu 120 Asn I le Thr Glu Thr 125 Leu Ly s Ser
Al a Al a 130 Gly As p Arg Glu I 1 e 135 Arg Pro I 1 e Va 1 Va 1 140 Thr As p Al a Glu
Gly 145 Thr Leu Gly 11 e Gly 150 As p Trp Gly Thr Gin 155 Gly Val As p 11 e Ser 160
Va 1 Gly Ly s Leu Me t 165 I 1 e Tyr Thr Al a Al a 170 Al a Gly I le As p Pro 175 Al a
Ser Va 1 Leu Pro 180 Va 1 Va 1 I le As p Al a 185 Gly Thr Asn Arg Ly s 190 Gly Leu
Leu Glu Asp 195 Hi s Leu Tyr Leu Gly 200 Asn Hi s Gin G1 u Arg 205 I 1 e Tyr Gly
As p Gin 210 Tyr Tyr Ser Phe Va 1 215 As p Gin Phe Va 1 Glu 220 Thr Al a Glu Ser
I le 225 Phe Pro Ly s Leu Tyr 230 Leu Hi s Trp Glu As p 235 Phe Gly Arg Ser Asn 240
Al a Al a Thr I 1 e Leu 245 Asn Asn Tyr Ly s Thr 250 Lys 11 e Pro Thr Phe 255 Asn
As p As p 11 e Gin 260 Gly Thr Gly I 1 e Va 1 265 Val Leu Gly Gly I le 270 Phe Gly
Ser Leu As p 275 I le Thr Gly Glu Ly s 280 Leu Thr As p Gin Va 1 285 Tyr Leu Cy s
Tyr Gly 290 Gly Gly Ser Al a Gly 295 Al a Gly I le Al a Gly 300 Arg Val Hi s Al a
Glu 305 Me t Va 1 Ser Glu Gly 3 10 Leu Ser Glu Glu Glu 315 Al a Tyr Lys Hi s Phe 320
HU217 410B
Phe Me t 11 e Asp Gin 325 Gin Gly Leu Leu Phe 330 As p Asp Me t Glu As p 335 Leu
Thr Pro Al a Gin Ly s Pro Phe Alá Ly s Ly s Arg Al a As p Tyr Ly s As p
340 345 350
Al a Gly As p Me t Thr As p Leu Leu As n Va 1 Va 1 Ly s Thr Val Ly s Pro
355 360 365
Thr I 1 e Leu Va 1 Gly Thr Ser Thr Asn Pro Gly Al a Phe Thr Ly s Glu
370 375 380
Va 1 Va 1 Glu Al a Me t Cys Alá Asn Thr Glu Arg Pro Val I le Phe Pro
385 390 395 400
I 1 e Ser Asn Pro Thr Ly s Ly s Me t G1 u Thr Thr Al a Glu G1 n Va 1 11 e
405 410 415
Glu Trp Ser As p Gly Ly s Al a Phe Va 1 Al a Thr Gly Va 1 Pro Ser Gly
420 425 430
Thr I le Ser Tyr Ly s Gly Va 1 As p Tyr Gin I le Gly Gin Al a Asn Asn
435 440 445
Ser Leu I le Hi s Pro Gly Leu Gly Leu Gly Me t Leu Al a Ser Glu Al a
450 455 460
Ly s Leu Leu Thr As p Glu Me t I le G1 y Al a Al a Al a Hi s Ser Leu Ser
465 470 475 480
Gly Leu Va 1 As p Pro Gly Ly s Pro Gly Al a Pro Va 1 Leu Pro Pro Ph e
485 490 495
Glu Phe Va 1 Al a Asp Va 1 Ser I le Ly s Val Al a Glu Aln Va 1 Alá Ly s
500 505 510
Ly s Al a Gin Glu Gin Gly Leu Thr Glu Ser Ly s Glu Thr As p Me t Al a
5 1 5 520 525
Ly s Al a Va 1 Arg As p Leu Ly s Trp Tyr Pro Glu Tyr
530 535 540
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (11)

1. Nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy Lactococcus lactis malolaktikus enzimét kódoló 1620 bp hosszúságú szekvenciát, és adott esetben az enzim expresszióját megfelelő gazdasejtben biztosítani képes szabályozószekvenciákat és/vagy a molekula replikációját megfelelő gazdasejtben biztosítani képes szekvenciaelemeket tartalmaz.
2. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a 2. szekvenciaazonosító számon megadott polipeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy az 1. szekvenciaazonosító számon megadott szekvencia 466-2085. nukleotidjait tartalmazza.
4. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a malolaktikus enzimet kódoló gént a gén expresszióját szabályozni képes szekvenciákhoz funkcionálisan kapcsoltan tartalmazza.
5. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy élesztőben működőképes szabályozószekvenciákat tartalmaz.
6. Az 1. igénypont szerint nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy a molekula replikációját megfelelő gazdasejtben biztosítani képes szekvenciaelemeket tartalmaz.
35
7. Az 1. igénypont szerinti nukleinsavmolekula, azzal jellemezve, hogy az enzim expresszióját megfelelő gazdasejtben biztosítani képes szabályozószekvenciákat, valamint a molekula replikációját megfelelő gazdasejtben biztosítani képes szekvenciaelemeket tartalmaz.
40
8. Transzformált eukarióta vagy prokarióta sejt, azzal jellemezve, hogy legalább egy, az 1 -7. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsavmolekulát tartalmaz.
9. A 8. igénypont szerinti transzformált sejt, azzal jellemezve, hogy élesztősejt.
45
10. A 9. igénypont szerint élesztősejt, azzal jellemezve, hogy a Saccharomyces nemzetséghez tartozik.
11. A 9. igénypont szerinti élesztősejt, azzal jellemezve, hogy a Schizosaccharomyces nemzetséghez tartozik.
50 12. Eljárás malolaktikus fermentáció végrehajtására, azzal jellemezve, hogy a fermentációt a 9-11. igénypontok bármelyike szerinti élesztősejt alkalmazásával hajtjuk végre.
HU9500139A 1993-05-18 1994-05-18 A Lactococcus lactis malolaktikus enzimének génje, a génnel transzformált gazdasejtek és eljárás malolaktikus fermentálásra a transzformált gazdasejtek alkalmazásával HU217410B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9306003A FR2705362B1 (fr) 1993-05-18 1993-05-18 Clônage et expression du gêne de l'enzyme malolactique de Lactococcus lactis.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9500139D0 HU9500139D0 (en) 1995-03-28
HUT72190A HUT72190A (en) 1996-03-28
HU217410B true HU217410B (hu) 2000-01-28

Family

ID=9447261

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9500139A HU217410B (hu) 1993-05-18 1994-05-18 A Lactococcus lactis malolaktikus enzimének génje, a génnel transzformált gazdasejtek és eljárás malolaktikus fermentálásra a transzformált gazdasejtek alkalmazásával

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5587304A (hu)
EP (1) EP0656056A1 (hu)
JP (1) JPH07509142A (hu)
AU (1) AU687406B2 (hu)
CA (1) CA2139665A1 (hu)
FR (1) FR2705362B1 (hu)
HU (1) HU217410B (hu)
WO (1) WO1994026879A1 (hu)
ZA (1) ZA943422B (hu)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE449176T1 (de) 1995-05-18 2009-12-15 Univ Stellenbosch Nukleinsäure für eine malat permease aus s.pombe kodierend und deren verwendungen
US5698396A (en) * 1995-06-07 1997-12-16 Ludwig Institute For Cancer Research Method for identifying auto-immunoreactive substances from a subject
FR2738016B1 (fr) * 1995-08-21 1997-10-24 Inst Oenologie Procede d'integration stable de genes dans la levure
AU2002323213B2 (en) * 2001-08-16 2008-03-13 Stratagene California Compositions and methods comprising control nucleic acid
CN111139193B (zh) * 2019-12-05 2022-04-22 天津科技大学 一种低产高级醇和强降解苹果酸的葡萄汁酵母菌株及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4472502A (en) * 1982-08-16 1984-09-18 The Regents Of The University Of California Malolactic gene
FR2533099A1 (fr) * 1982-09-14 1984-03-16 Radiotechnique Procede de brouillage d'images de television et dispositif de dechiffrage d'images ainsi brouillees
FR2705687B1 (fr) * 1993-05-28 2002-09-20 Inst Oenologie Identification clonage et expression de l'enzyme malolactique.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2139665A1 (fr) 1994-11-24
WO1994026879A1 (fr) 1994-11-24
FR2705362A1 (fr) 1994-11-25
ZA943422B (en) 1995-02-20
US5587304A (en) 1996-12-24
AU6848694A (en) 1994-12-12
JPH07509142A (ja) 1995-10-12
HUT72190A (en) 1996-03-28
FR2705362B1 (fr) 1995-08-04
EP0656056A1 (fr) 1995-06-07
HU9500139D0 (en) 1995-03-28
AU687406B2 (en) 1998-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019250216B2 (en) Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast
Lonvaud-Funel Microbiology of the malolactic fermentation: molecular aspects
JP3950196B2 (ja) アルコールデヒドロゲナーゼ及びキラルヒドロキシ化合物の酵素的生産へのその使用
Volschenk et al. Malolactic fermentation in grape musts by a genetically engineered strain of Saccharomyces cerevisiae
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
JP2571119B2 (ja) 細胞膜結合型アルデヒド脱水素酸素の構造遺伝子、これを含むプラスミド、形質転換した酢酸菌及び酢酸発酵法
EP0248637A2 (en) Induction of galactose regulated gene expression in yeast
JP3363197B2 (ja) アルコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子およびその利用
JP2000342289A (ja) ペニシリン生合成遺伝子の単離法
CN114667346B (zh) EanB酶突变体及其应用
US5712152A (en) Yeast strains expressing the lactic lacticodeshydrogenase gene and vectors useful in producing said strains
HU217410B (hu) A Lactococcus lactis malolaktikus enzimének génje, a génnel transzformált gazdasejtek és eljárás malolaktikus fermentálásra a transzformált gazdasejtek alkalmazásával
US7696333B1 (en) Promoter in the presence of organic acid and utilization thereof
JP2018033399A (ja) 酢酸イソアミル高生産性、酢酸生産性低生産性かつイソアミルアルコール高生産性の醸造酵母の作出方法
JP4094232B2 (ja) 新規なアミダーゼ遺伝子
JPH06253826A (ja) エステル香味の低減した酒類の製造
FR2735145A1 (fr) Souches de levures presentant un bilan de fermentation alcoolique des sucres modifie et leurs applications, vecteurs utilisables pour l'obtention desdites souches.
Kaiser et al. Identification of a gene encoding the pyruvate decarboxylase gene regulator CaPdc2p from Candida albicans
CN111073864B (zh) 提高苹果酸产量的新突变蛋白
IL98544A (en) Oxidic reductase system obtained from NUNEGOSYRHC .P, preparation and use
US5459046A (en) Cytochrome C gene derived from hydrogen bacterium
FR2736652A1 (fr) Levures et bacteries transformees pour operer la fermentation malolactique dans les vins
JP3549551B2 (ja) Ｓ．セレビシエのリボフラビンシンテターゼ活性をコードするｄｎａ化合物および組換えｄｎａ発現ベクター
US5753435A (en) Oxido reductase enzyme system obtainable from P. chrysogenum, the set of genes encoding the same and the use of oxido reductase enzyme systems or genes encoding the same for increasing antibiotic production
JPH11508450A (ja) ペニシリウム・クリソゲナム由来のフェニルアセチル−ＣｏＡリガーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee