JPH10509305A - 神経細胞アポトーシスの抑制タンパクとその遺伝子配列、並びに脊髄性筋萎縮症の原因となる当該遺伝子の突然変異 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 常染色体性劣性神経変性異常である脊髄性筋萎縮症の遺伝子が第５染色体の領域にマッピングされた。この遺伝子は、ウイルスのアポトーシス抑制タンパクと相同性を有するタンパクをコードすることから、このコードされたタンパクは、神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)と指定された。Ｉ型、II型、III型脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)の患者は(ＮＡＩＰ)領域に欠失があり、正常な非ＳＭＡ母集団にはそのような欠失は認められなかった。

Description

【発明の詳細な説明】 神経細胞アポトーシスの抑制タンパクとその遺伝子配列、並びに 脊髄性筋萎縮症の原因となる当該遺伝子の突然変異発明の分野 神経細胞アポトーシスの抑制タンパク(ＮＡＩＰ)の遺伝子が、第５染色体のq1 3領域に同定された。この遺伝子の突然変異がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋 萎縮症患者に認められた。この発明は、この神経細胞アポトーシス抑制タンパク のアミノ酸配列を提供し、ウイルス性アポトーシスタンパクとの相同性を証明す る。発明の背景 この発明に係る様々な態様を説明する際に、種々の刊行誌の論文を容易に参照 できるように、明細書の最後に参考文献一覧表を付した。また、これらの参考文 献はその最初の著者名および出版年を明細書中に明記した。 小児期の脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡs)は、常染色体性劣性神経変性疾患のグルー プに含まれ、発症および臨床的進行に基づいて３タイプに分類される(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz et al.，1991)。これら３タイプはすベて、近位随意 筋の弱化および摩滅として顕在化する脊髄α運動ニューロンの変性によって特徴 づけられる。Ｉ型ＳＭＡは最も重篤なタイプであり、胎児期(in utero)または生 後数カ月で発症する。発症児は座位保持が不可能で、呼吸が不十分なために胸部 感染症を再発し易いため、生後数年間を生き延びることは滅多にない(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz et al.，1991)。保因頻度が1/60から1/80のこの急性 疾患は、最も頻度が高い致命的常染色体性変性疾患の1つである。II型ＳＭＡ発 症児は歩行には介助を必要とし、予後はさまざまであるが、青年期に死亡する場 合がある。III型発症児は自力歩行を続けられるが、３才から17才までの時期に 弱化し始め、症状が緩やかに進行していく(Ｄubowitz et al.，1978; Ｄubowitz .，1991)。 1990年には、ＳＭＡのこれら３つの小児期形態がすべて第５染色体長腕の5q11 .2-13.3に遺伝学的にマッピングされた(Ｂrustowitcz et al.，1990;Ｇilliam e t al.，1990; Ｍelki et al.，1990)。その後、多点連鎖分析と組換え現象の同 定を行ったところ、その遺伝子欠損はＤ5Ｓ435/Ｄ5Ｓ629によってセントロメア 側に位置する領域に局在化され(Ｓoares et al.，1993; Ｗirth et al.，1993， Ｃlermont et al.，1991)、ＭＡＰ1Ｂ/Ｄ5Ｓ112によってテロメア側に位置する 領域に局在化された(Ｗirth et al.，1994，ＭacＫenzie et al.， 1993; Ｌien et al.，1991)。この区間は、さらに最近の組換え現象の同定によ って明確になり、ＳＭＡ遺伝子がＣＭＳ-１の遠位に存在し(Ｙaraghi et al.， Ｈuman Ｇeneticsに投稿; van der Ｓteege et al.，Ｈuman Ｇeneticsに投稿) 、Ｄ5Ｓ557の近位に存在する(Ｆrancis et al,，1993)ことが明らかにされた。 我々やその他の研究者等は、クローンおよび単純縦列反復の単離ならびに順序付 けを阻害するＤ5Ｓ629/ＣＭＳ-Ｄ5Ｓ557領域に特に豊富な第５染色体の特異反復 配列を検出した(Ｆrancis et al.，1993; Ｔhompson et al.，1993)。この区間 内では、200kbのＣＭＳ-１領域(Ｋleyn et al.，1993)/ＣＡＴＴ-１領域(Ｂurgh es et al.，1994，ＭcＬean et al.，印刷中)/Ｄ5Ｆ150領域/Ｄ5Ｆ149領域/Ｄ5 Ｆ153領域(Ｍelki et al.，1994)に及ぶコスミドクローン系列が構成されている 。 我々は、5q13.1のＳＭＡ含有Ｄ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112区間を含むＹＡＣクローンの 連続系列を構築した。その後、我々は、5q13.1のこの区間に存在し、神経細胞ア ポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子を発見した。さらに研究 を行った結果、この遺伝子の欠失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症に 認められることが確認された。発明の要約 神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子がヒト染色 体の5q13領域で見出された。この発明の一つの態様によれば、神経細胞アポトー シス抑制タンパクのcＤＮＡ配列表４に開示されたとおりに提供さる。この発明 の別の態様によれば、このcＤＮＡ配列から予測される神経細胞アポトーシス抑 制タンパクのアミノ酸配列が提供される。 この発明の別の態様によれば、神経細胞アポトーシス抑制タンパク遺伝子の欠 失がＩ型、II型およびIII型の脊髄性筋萎縮症患者に認められた。この神経細胞 アポトーシス抑制タンパク遺伝子欠失の発見によって、脊髄性筋萎縮症の診断に 使用する診断指示薬が提供される。 以下、図面を参照してこの発明の様々な態様をさらに詳細に説明する。また、 図面の簡単な説明はこの発明の要約の次に記載する。 この発明のさらに別の態様によれば、染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置する ヒト遺伝子が提供される。このヒト遺伝子は約5.5kbのエクソン１から１７まで を含み、エクソン２から１１までの制限地図は図８に示したとおりである。 この発明のさらに他の態様によれば、エクソン１から１７までは、図９Ｄに示 すように、エクソン２から１６までの制限地図を有している。 この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子の場合、エクソン５から １６は配列番号２のアミノ酸配列と生物学的、機能的に同等のアミノ酸配列を有 するＮＡＩＰタンパクをコードする。 この発明の別の態様によれば、上記態様のヒト遺伝子は配列番号１のcＤＮＡ 配列に生物学的、機能的に同等のcＤＮＡ配列を含むエクソン５から１６を有す る遺伝子である。 この発明の別の態様によれば、精製ヌクレオチド配列は配列番号１のcＤＮＡ に対応するゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、mＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡまたは相同Ｄ ＮＡを含むヌクレオチド配列である。 この発明の別の態様によれば、ＤＮＡ分子の配列は配列番号２を有するＮＡＩ Ｐタンパクをコードする配列である。 この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号１のＤＮＡ 配列からなる配列である。 この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は実質的に配列番号２のアミノ 酸配列をコードするＤＮＡ配列からなる配列である。 この発明の別の態様によれば、精製ＤＮＡ配列は配列番号１の少なくとも連続 １８塩基を含む配列である。ＤＮＡプローブ、ＰＣＲプライマー、ＤＮＡハイブ リダイゼーション分子などが、少なくとも１８連続塩基からなる精製ＤＮＡ配列 を用いて提供することができる。 この発明の別の態様によれば、上記態様のＤＮＡ配列はクローニングベクター または発現ベクターの構築に使用される。 この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは上記のＤＮＡ配列によって コードされるタンパクである。 この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは配列番号２のアミノ酸配列 と生物学的に同等なアミノ酸配列を含むタンパクである。 この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクは実質的に配列番号２のアミ ノ酸配列からなるタンパクである。 この発明の別の態様によれば、ＮＡＩＰタンパクのフラグメントは配列番号２ の少なくとも１５連続アミノ酸を含むフラグメントである。 この発明の別の態様によれば、上記アミノ酸配列はハイブリドーマの製造に使 用される。 この発明の別の態様によれば、生物標本を分析してＮＡＩＰタンパクをコード する遺伝子の有無を診断する方法が提供される。 この方法は、 i) 第５染色体のＳＭＡ含有領域q13由来の生物標本を単離し、 ii) 生物学的アッセイを行い、 a) 配列番号１のＮＡＩＰコードＤＮＡ;および B) 配列番号２のＮＡＩＰタンパク からなる群から選択された少なくとも一方が生物標本に存在するか否かを判定す る方法である。図面の説明 ＮＡＩＰ遺伝子のエクソンの番号は０から１６まで順次付けられている。これ は、配列番号方式＃１として図面に記載した。ただし、従来のエクソン番号につ いてはエクソン１からエクソン１７までが好ましい。そこで、配列番号方式＃２ として区別した。 図１はＳＭＡ遺伝子領域のＹＡＣ連続アッセイである。ＹＡＣは実線で示され ている。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳＴＳＳを示し、白四角は単 一コピープローブを示す。遺伝学的に定義されたＳＭＡ区間であるＣＭＳ-1-Ｃ ＭＡ-Ｄ5Ｓ557および従来のＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間をＹＡＣ上方に示し た。 図２はＳＭＡ領域の長距離制限地図である。低頻度切断(Rare Cutter)部位は 実線上方に示した。マーカーの最小セットをpYMC4トリプトファンに対応する実 線t下方または左端に示した。ｕはpＹＭＣ4ウラシルまたは右端に対応する。遺 伝的に定義されたＣＭＳ-1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557区間およびＤ5Ｓ629-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ5 57区間は、それぞれ550kbと1.1Mbであると推定される。 図３はCATT-1部位の増幅を示す。対立遺伝子サイズは各レーンの下方に示した 。(Ａ)はＹＡＣの増幅であり、ＧはゲノムＤＮＡを示す。(Ｂ)は第５染色体移動 選別ライブラリ由来のコスミドの増幅である。４つの異なる対立遺伝子をコスミ ド40G1(対立遺伝子15)、58G12(対立遺伝子12)、192F7(対立遺伝子10)および250B 6(対立遺伝子7)によって示した。 図４は我々の連続系列からマッピングされたコスミドの代表例を示す。実線上 方の垂直線はＥcoＲl部位である。白三角は多形性ＳＴＲＳを示し、黒三角はＳ ＴＳＳを示し、黒四角は単一コピープローブを示し、白四角は転写配列を示す。 Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡を示すＳＴＲｓは星印で示した。コスミドlＧ3とl Ｇ9はＹＡＣ 76 Ｃlコスミドライブラリから得られる。 図５はp151.2によって同定されるＳＭＡ領域の配列重複である。ＹＡＣのハイ ブリダイゼーションは、(Ａ)では700bpのフラグメント、(Ｃ)では500bpのフラ グメントを用いた。ＹＡＣは、左から右に、セントロメアからテロメアまでが配 列されている。コスミドのハイブリダイゼーションは、(Ｂ)では700bpのフラグ メント、(Ｄ)では500bpのフラグメントを用いた。(Ｂ)では、12kbのフラグメン トがコスミドに検出されたが、20kbのフラグメントは存在しない。2.5kbのフラ グメントおよび600kbのフラグメントは、それぞれ3Ｂ3と、ＩＥＩに検出された が、これらは末端フラグメントである。(Ｄ)では、３kbのフラグメントしかコス ミドに検出されなかった。24Ｄ6の20kbバンドは(Ａ)では検出されていないが、( Ｃ)では存在することに留意されたい。700bpフラグメントは24Ｄ6に検出される 場合もある。 図６はＩ型ＳＭＡと各種多形性5q13.1標識との間に観察される連鎖不平衡度が 、40Ｇ1で不平衡ピークを示す図である。 図７は9クローンから構成されるＣＡＴＴ領域を含み、約400kbに及ぶＰＡＣ連 続系列を示す。 図８はＳＭＡ遺伝子の構造を示す。エクソンを黒枠で示し、上方に番号を付け た。制限部位が図示されているが、ＢはＢamＨＩ、ＥはＥcoＲＩ、ＮはＮotlで ある。エクソン４およびエクソン５(方式＃１)または方式＃２のエクソン５およ び６は全てのタイプのＳＭＡでしばしば欠失している。 図９は図６、１、７、および８のそれぞれに開示された内容を単ページに配置 した図である。図９(Ａ)は、病状表現型および物理地図を伴った６つの5q13.1標 識について、Ｉ型ＳＭＡ家族に観察される連鎖不平衡度の相関を示す。本明細書 記載の主要な組換えによって定義されるＳＭＡ含有区間が示されている。不均衡 のピークが、組換え体によって規定されたＳＭＡ区間のセントロメア末端に隣接 していることに留意されたい。 図９(Ｂ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＹＡＣ連続系列である。ＹＡＣ およびＰＡＣの連続系列については、ＳＴＳsを黒三角で示し、多形性縦列反復 の多形性を白三角で示し、単コピークローンを黒四角で示した。特に、以下の点 を留意されたい。すなわち、我々の物理地図は、星印を付けた対立遺伝子９を含 むＣＭＳ下位部位を他のＣＭＡ下位部位のテロメア側に配置しており、遺伝的組 換えデータによれば逆転が観察されることから、我々は、5q13.1のこの領域に変 異型が存在することを確信している。 図９(Ｃ)は、5q13.1のＳＭＡ領域をカバーするＰＡＣ連続系列である。 図９(Ｄ)は、図８に詳細に記載されたＮＡＩＰの遺伝子構造である。 図１０は、ＰＡＣ、非ＳＭＡ個体由来の胎児脳cＤＮＡクローンおよびＳＭＡ 患者 由来のＲＴ-ＰＣＲクローンのエクソン内容である。Ｅ158はグルタミン酸残基の 欠失を示している。ＲＴ-ＰＣＲは方式＃２のエクソン１３とエクソン４の間で 行われたが、この領域の外側では未検出の欠失がさらに存在することが考えられ る。 図１１は、ＰＡＣに認められるＮＡＩＰ遺伝子の正常構造および内部欠失／切 断変異の構造である。図１１Ａでは、方式＃２に基づくエクソンを番号付けした 黒枠として記した。ＮはＮotl部位、ＢはＢamＨＩ部位、ＥはＥcoＲＩ部位を示 す。図１１Ｂでは、明細書中で言及されている3kbおよび9.4kbのＥcoＲＩバンド を検出するＥcoＲＶクローンをＥＶと記した。図１４では欠失した4.8kbのＥco ＲＩ/ＢamＨＩバンドも記した。エクソン５およびエクソン６を含む6kbの領域と この欠失から生じる23kbのＢamＨＩを、図１１Ｃおよび１１Ｄに示した。エクソ ン５およびエクソン６の欠失を同定するために使用するプライマーと欠失ＮＡＩ Ｐ遺伝子の切断フラグメントを同定するために使用するプライマーとの位置は、 上記のＮＡＩＰ構造に示されている。 図１２は、ＮＡＩＰ遺伝子のイントロン／エクソンスのスプライス配列である 。 図１３は、ＮＡＩＰ部位のエクソン１３(方式＃２)をプローブとした成人組織 のノーザンブロットである。組織は標識化され、フィルターは50℃、0.2×ＳＳ Ｃで洗浄され、４日間露呈させた。バンドは、肝臓および胎盤に6-7kbの範囲で 観察することかができる。 図１４は、近親婚のフランス系カナダ人のIII型ＳＭＡ家族の家系分析結果お よびサザンブロット結果である。上のパネルは、ＢamＨＩ/ＥcoＲＩで切断した ゲノムＤＮＡを、ＮＡＩＰのエクソン２から９(方式＃２)までを含むcＤＮＡプ ローブで探索した結果、エクソン５および６(方式＃２)を含む4.8kbのフラグメ ントが全患者で損失し、フレーム内欠失が生じていることを示している。その他 全員は、ホモの正常な姉弟を除き、このバンドの用量は半分であった。下のパネ ルは、同じ家族のＢamＨＩ断片を示す。患者では、2つの重なった14.5kbの連続 フラグメントがＢamＨＩ部位を含む6kb配列を欠失しており、その結果23kbのバ ンドが生成されている(図１１参照)。家系のすべての個体の23kbのＢamＨＩバン ドの存在は、母集団全体のばらつきと一致することに留意されたい。同様に、Ｐ ＡＣ238Ｄ12に含まれ、かつ図１１に示される方式＃２のエクソン１から６まで の欠失を示す9.6kbのＢamＨＩバンドが、非ＳＭＡキャリアーを含む個体すべて に確認することができる。 図１５は、エクソン５(方式＃２)を増幅するプライマー1864および1863を用 いてIII型家系21470および24561をＰＣＲ増幅した結果である。この反応は、エ クソン１３(方式＃２)のプライマー1258および1343を用いて多数回行い、結果を 曖昧にするＰＣＲの不良を除外した。増幅不良は、エクソン５(方式＃２)のホモ 接合の不在に一致し、病状表現型と共分離することがわかる。 図１６は、ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織から得られたＲＴ-ＰＣＲ増幅の結 果である。文字ｎは、非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡを指し、aはＳＭＡ疾患組織由 来のＲＮＡを指す。組織源は、各パネルの上に示した。lymはリンパ芽球を指し 、fibは繊維芽細胞を指す。a５を除くすべての試料はＩ型ＳＭＡ患者から得られ 、a５は図１５に示す近親婚のIII型ＳＭＡ家系24561から得られた。 ＲＮＡは、エクソン１３(方式＃２)から逆転写された。パネルＡおよびパネル Ｂに示される一次ＰＣＲ産物には、エクソン１のプライマー1884とエクソン１３ のプライマー1285または1974を使用し、パネルＣに示される一次ＰＣＲ産物には エクソン６のプライマー1919とエクソン１３のプライマーとを使用した。パネル Ａの二次ＰＣＲには、エクソン４のプライマー1886とエクソン１３のプライマー 1974とを使用し、パネルＢの二次ＰＣＲには、エクソン５のプライマー1864とエ クソン１１のプライマー1979とを使用し、パネルＣの二次ＰＣＲには、エクソン ９のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974とを使用した。 生成産物の不良または増幅は、パネルＡの脊髄組織およびリンパ芽球組織の試 料a２、a３、a４、a５、a６およびa７から確認することができる。パネルＢは、 a２およびa３においてサイズが減少したバンドが増幅されたことを示し、a７に おいては挿入断片と一致して大型産物が増幅されたことを示している。パネルＣ は、a２、a３、a９およびa１１においてエクソン１１および１２(方式＃２)の欠 失と一致してバンドサイズが低減することを示している。好ましい態様の詳細な説明 以下、別段の指示がない限り、本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方 式＃２に基づてエクソンを参照する。 明細書を通して、種々の略語を使用して様々な構成要素および技術を特定する 。以下は、このような構成要素および技術の参照として付する語彙リストである 。 ＣＴＲ − 複合縦列反復 ＤＮＡ − デオキシリボ核酸 ＰＣＲ − ポリメラーゼ連鎖反応 ＰＦＧＥ − パルスフィールドゲル電気泳動 ＰＡＣ − Ｐ１人工染色体 ＲＮＡ − リボ核酸 ＲＴ-ＰＣＲ − 逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応 ＳＴＲ − 単純縦列反復 ＳＴＳ − 配列標識部位 ＹＡＣ − 酵母人工染色体 本発明は、神経細胞アポトーシス抑制タンパク(ＮＡＩＰ)をコードする遺伝子 の同定、位置決定および配列特性に関するものである。我々は、この遺伝子の突 然変異が上記Ｉ型、II型およびIII型脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)を引き起こすこと を見出した。この遺伝子の突然変異は正常なＮＡＩＰタンパクの生成欠損を生じ させるが、このＮＡＩＰタンパクはヒト正常過程に生理学的に関与し、神経細胞 を維持し、患者に共通する早期の神経細胞死を阻止していると考えられる。対象 遺伝子は染色体5q13.1のＳＭＡ含有領域に特定される。別段の指示がない限り、 本発明の詳細な説明においてはエクソン番号方式＃２に基づてエクソンを参照す る。この遺伝子は、約5.8kbのエクソン１から１７までを含み、図８に示すよう なエクソン２から１１までの制限地図を有する。エクソン２から１６までの最新 の制限地図を図９Ｄと図１１Ａに示した。図から解るように、この遺伝子はエク ソン１から１７までの配列よりも相当長い。未だに配列が決定されていないエク ソン間には、相当のイントロン情報が存在している。ＳＭＡを診断する観点から すると、エクソン１から１７までの配列が極めて貴重である。正常な配列は、表 ４に示す他、配列番号１として記載した。いかなる遺伝的突然変異、すなわちそ のＤＮＡ配列の変化は、それが遺伝子の全体的な欠失、置換または多形化などに 関わらず、疾患の原因であるか、または原因となり得る。最も共通的な突然変異 は以下のとおりであると考えられる。 i) 遺伝子のエクソン５、６の欠失、または ii) 残りの遺伝子に欠陥がある場合には、第５染色体のこの遺伝子のコピー 不在もしくはコピー数の著しい減少が原因となり得る。 正常配列、または正常配列の突然変異の有無を判定することによってヒトのＳ ＭＡ感受性を診断するにはどのような生物学的アッセイを採用することもできる 。このよう生物学的アッセイは、ＤＮＡプローブを使用するＤＮＡハイブリダイ ゼーション、制限酵素分析、ヒトの生体試料の第５染色体から単離されるような 配列該当部のＰＣＲ増幅、配列当該部のメッセンジャーＲＮＡ検出およびＤＮＡ 配列決定などである。これらの一般的な生物学的アッセイは様々な手続 きで行うことができるが、その場合の好ましい方法は以下の通りである。 ＳＭＡの診断を２つの方法で実施する。第１は、危険性のあるヒトのゲノムに ついて、ＮＡＩＰのエクソン５および６が不在であるかを検定する。これらのエ クソンは、母集団では0.05％の頻度で、Ｉ型ＳＭＡ集団では50％の頻度で不在で あることが分かっている。第２の方法は、被検者のＮＡＩＰ遺伝子のコピー数を 調べるものである。我々は、ＳＭＡ患者ではＮＡＩＰ遺伝子の欠失形態と正常形 態とが共に概ね減少していることを見出している。濃度計を使用して遺伝子のコ ピー数を測定することによって、ＳＭＡの発症リスクを正確に評価する方法を確 立することができる。最も高い相関は、エクソン２から４までとエクソン１３に 観察される。 実際には、以上に概説した２つのステップは以下の方法で実施することができ る。 (i) 被検者から得た等量のＤＮＡ(0.1マイクログラム)に対して２つの同時Ｐ ＣＲを実施する。一方のプライマー対はエクソン５および６に対応するものとし (例えば、配列番号７のプライマー1863と配列番号８のプライマー1864)、他方の プライマー対はエクソン５および６以外の領域に相同なもの(例えば、配列番号 ５のプライマー1343と配列番号４のプライマー1258)とする。後者の反応を実施 することで、ＰＣＲが作用していることを確認することができる。さらに２つの コントロールとして、(i)適切なプライマーを使用して、エクソン５およびエク ソン６を含むことが知られるゲノムＤＮＡにＰＣＲを行い、この特定反応が作用 していることを確認するものと、(ii)鋳型として水を使用し、混入物質の不在を 確認する負のコントロールとがある。すべてのＰＣＲ産物はアガロースゲル内に 移され、電気泳動によって分離され、視覚的に分析される。 (ii) ＳＭＡリスクの濃度計による判定は、蛍光色素で標識したＰＣＲプライ マーを用いて行う。エクソン２から４、エクソン１３、エクソン５、６およびエ クソン１１、１２に対するプライマーを使用して、被験者由来のゲノムＤＮＡに 対するＰＣＲを行う。ＰＣＲ産物はゲル上で電気泳動によって分離され、個々の バンドの輝度は蛍光光度法によって判定される。このような値を標準値と対比さ せ、ＳＭＡリスクを確認する。 ＮＡＩＰの一つの側面は、筋萎縮性側索硬化症やアルツハイマー病等のその他 の神経変性疾患に対するリスクと明らかに相関することである。従って、上記に 説明した試験は、これらの疾患に対するリスクの予知としても役立つ。以下のＢ aculoviral ＩＡＰsの節で詳細に述べるように、ＮＡＩＰタンパクは細胞 アポトーシス抑制タンパクと高い相同性を有している。このため、神経細胞のア ポトーシスを起因する神経変性疾患であれば、ＮＡＩＰ遺伝子のＤＮＡ配列情報 を用いて予知することもできる。このような神経細胞アポトーシスはＮＡＩＰ遺 伝子の突然変異と最も結び付き易く、この変異は、ＳＭＡに関連した突然変異や 神経アポトーシスを抑制するＮＡＩＰタンパクの生物活性に影響する他の遺伝子 の突然変異と類似している。 mＲＮＡの検出については、我々は以下を提案する。 ＲＴ-ＰＣＲは複数の分子生物学的用途に必須であるＲＮＡ転写物を分析する めの迅速な方法である。この方法は従来のノーザンブロット法、ＲＮＡドット／ スロットブロット法、in situハイブリダイゼイション法よりもはるかに感受性 が高く、効率が良い。このような高い感受性によって、少量のＲＮＡ転写物や少 量の細胞から単離したＲＮＡについて試験することができる。さらに、転写物の パネル全体を同時に分析することもできる。 プロトコルの概要: 最初に、ＲＮＡを組織または細胞から単離し、相補的Ｄ ＮＡ(cＤＮＡ)への逆転写のための鋳型として使用する。逆転写(ＲＮＡ依存性の ＤＮＡ合成)を逆転写酵素によって触媒する。次に、cＤＮＡを鋳型として、選択 されたcＤＮＡ領域を増幅するよう設計されたプライマーを用いてＰＣＲを行う 。ＰＣＲ後、生成物をアガロースゲル電気泳動によって分析する。そのcＤＮＡ のヌクレオチド配列情報から推定されるＰＣＲ産物のサイズによって増幅された cＤＮＡを同定する。ＰＣＲ産物は、さらに制限切断、ハイブリダイゼーション 、またはヌクレオチド配列決定によって確認することができる。 ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)によるＲＮＡの酵素的増幅 この方法は、ＰＣＲを用いてＲＮＡを酵素的に増幅するために用いる。 プロトコルの詳細: 最初に、プライマーをＲＮＡにアニーリングする。ＲＮ ＡおよびcＤＮＡプライマーは、poly(Ａ)⁺ＲＮＡ、cＤＮＡおよび水を一緒に添 加することによって共沈させる。酢酸ナトリウムとエタノールとを添加する。こ れを-20℃以上で一晩かけて沈降させる。ペレットをエタノールで洗浄する。次 に、水、Ｔis-ＨＣlおよびＫＣlを添加し、その混合物を90℃に加熱した後、徐 々に67℃まで冷却する。微少遠心分離し、３時間52℃でインキュベートする。こ の最終アニーリング温度は、プライマーの塩基組成に従って調整することができ る。あるいは、プライマーをpoly(Ａ)⁺ＲＮＡ、cＤＮＡおよび水に混合すること によってＲＮＡにアニーリングすることもできる。この混合物を65℃で３分から １５分間加熱する。冷却した混合物に逆転写酵素緩衝液を添加する。 次にcＤＮＡを合成する。逆転写酵素緩衝液とＡＭＶ逆転写酵素とを添加する 。これを混合して１時間42℃でインキュベートする(プライマーとＲＮＡの塩基 組成による)。Ｔris-Ｃl/ＥＤＴＡを添加した後、緩衝フェノールを混合し、撹 拌する。微少遠心し、クロロホルムを水相に添加し、撹拌し、微少遠心する。酢 酸ナトリウムとエタノールを水相に添加する。混合し、-20℃で一晩沈殿させ、 微少遠心し、ペレットを乾燥させ、水に入れて再懸濁する。 次いでcＤＮＡをＰＣＲ増幅する。混合物は調製cＤＮＡ、増幅因子、dＮＴＰ 混合物、増幅緩衝剤および水を含む。通常、増幅プライマーの一つはcＤＮＡプ ライマーと同一のものである。異なるプライマーを使用する場合、cＤＮＡプラ イマーはcＤＮＡ反応から除外されることが望ましい。反応混合物を２分間94℃ に加熱し、微少遠心して凝縮物を回収する。Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼを添加し 、混合し、遠心分離し、ミネラルオイルで皮膜して増幅サイクルを開始する。サ イクル数は、ＲＮＡの量によって様々である。通常は４０サイクルで十分である 。次に、反応産物をアガロースまたは非変性ポリアクリルアミドゲル内でゲル電 気泳動によって分析する。cＤＮＡを増幅ステップに直接導入することもできる 。 当然のことながら、遺伝子、そのcＤＮＡ配列、その他のＤＮＡ配列およびＲ ＮＡ配列について言及する際に、何らかに特定化した配列は生物学的に同等の機 能を有するもののいずれかまたは全てを包含するものである。同様に、記載した タンパク質配列についても、目的が関連している限りは、それらの呼び名は生物 学的に同等の機能を有するもののいずれかまたは全てを包含する。上記の生物学 的アッセイでは、当然のことながら、ＤＮＡ配列またはタンパク配列の全長また は一部を使用することができる。一般に、そのＤＮＡの少なくとも連続１８個塩 基がハイブリダイゼーション用プローブやＰＣＲプライマー等として有用である 。同様に、タンパク質配列の場合にも、少なくとも１５個の連続アミノ酸配列が モノクローナル抗体などのタンパク質受容体を開発する際に有用である。このよ うなモノクロナール抗体は、タンパク質構造の特定の抗原決定因子に特異的なモ ノクロナール抗体を産生するハイブリドーマを作成するような標準的な方法で製 造することができる。 表４について言えば、エクソン5、6、7、8、9、10、11および12がＩＡＰ領域 と高い相同性を示すという観点からすれば、このような相同性は、これらのエク ソンの欠失またはその他の突然変異が疾患に感受性があるキャリアに生じ得るこ とは当然である。例えば、このことは、ヒトにおける減少したコピー数において エクソン５および６の欠失がこの疾患の原因となることによって証明さ れる。このため、遺伝子のこの領域のいかなる配列情報も診断的観点からは重要 であり、この領域に存在するいかなるＤＮＡの１８連続塩基または１５連続アミ ノ酸残基もＳＭＡの疑いがあるヒトの診断の根拠とすることができる。当然、こ の遺伝子のその他の領域における他の種類の欠失、突然変異、多形性なども疾患 の原因であることが考えられ、疾患分析、予後、あるいは治療に関連するその他 の目的に使用することもできる。 制限地図は被検者の遺伝子の特性を同定する際に有用であるが、エクソン１か らエクソン１７までの特異的cＤＮＡ配列を配列番号１に記載した。コード配列 は、エクソン５の396位塩基のＡＴＧコドンから始まり、エクソン１６の4092位 塩基の停止コドンＴＡＡで終了する。エクソン１から４までは5'未翻訳領域に位 置し、エクソン１７は3'未翻訳領域に位置する。いくつかの遺伝性疾患と同様に 、未翻訳領域の突然変異または多形化がこの疾患の原因として当然と考えられる ので、ＩＡＰが相当に類似した領域以外におけるプローブなどの配列部分もＳＭ Ａ診断に有効であると考えられる。配列番号１の配列情報は、適切なクローニン グベクターを構築してその遺伝子のコピーを複製するために使用するこができ、 あるいは組み換え技術によって発現ベクターを構築し、これを宿主にトランスフ ェクトしてＮＡＩＰを多量に製造するために使用することができる。クローニン グベクターまたは発現ベクターの使用目的によって、配列情報のセクション、フ ラグメントまたは全長をそのようなベクターの構築に使用することができる。こ の理解を前提に、ＳＭＡ疾患遺伝子の同定、その特性、対応するタンパク質配列 および診断時のそれらの使用法の詳細を説明する。 染色体5q.13に沿った脊髄性筋萎縮症(ＳＭＡ)遺伝子領域のＹＡＣ連続系列を 構築したが、これはＤ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112区間を含み、全体で４Mbであった。コス ミド系列のＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位は、脊髄性筋萎縮症との有意な連鎖不平衡を 示し、その遺伝子に隣接していることを示した。ただし、ＳＡＭ遺伝子を含む正 確な領域の描写は、この情報だけでは不可能である。９個のクローンからなるＣ ＡＴＴ領域を含み約400kbに及ぶＰＡＣ連続系列が構築された。物理的マッピン グデータと併用した遺伝学的分析の結果、ＣＭＳ対立遺伝子９と40Ｇ1 ＣＡＴＴ 下位部位を含む154kbのＰＡＣクローン125Ｄ9(図７)が高い確率でＳＭＡを含ん でいた。以下のようにさらに分析した結果、ＰＡＣ125Ｄ9は、神経アポトーシス 抑制タンパクをコードする遺伝子を含むことが判明した。 pＹＡＣ(酵母人工染色体プラスミド)によって、400kb以下のＤＮＡ連続鎖を酵 母に直接クローニングすることができる。環状pＹＡＣ(インサートなし)は Ｅ.coli.で複製させることができる。pＹＡＣのin vitro開列、外来性ＤＮＡと の連結、直鎖状分子(各末端にテロメアを含む)の酵母への直接形質転換によって ライブラリが構築され、これは標準的な方法によってスクリーニングすることが できる。 大型のＹＡＣ構築物は自然の染色体と同様に安定している。これらは、ヒトゲ ノムなどの複合ゲノムからライブラリを構成するための格好のベクターである。 さらに、Ｅ.coli.コスミドおよびラムダベクターではクローニング不可能な配列 も、ＹＡＣベクターでは十分にクローニング可能である。 ＹＡＣベクターは、通常は環状プラスミドとして細菌中で増殖する。制限酵素 標的部位は、切断時に２つの腕を生じさせるように配置されており、その各々が 異なる選別マーカーを含み、一方がテロメアで、他方が平滑末端で終結する。さ らに、一方の腕はＡＲＳ要素を含む。この２つの腕は、連結フラグメントから分 離精製され、平滑末端を分離するように断片化された供与ＤＮＡに連結される。 連結反応混合溶液によって酵母細胞が形質転換されるが、この時の選別条件は、 両腕の存在を確認することや、非組み換え体に認められる第３の選別マーカーが インサートによって妨害されることを確認すること等である。 ＹＡＣ連続系列の構築 Ｎational Ｃenters of Ｅxcellence(ＮＣＥ，Ｔoronto)、Ｉmperial Ｃancer Ｒesearch Ｆund(ＩＣＲＦ，Ｌondon)(Ｌain et al.，1991)およびＣentred'Ｅ tude du Ｐolymorphism Ｈumaine(ＣＥＰＨ，Ｐaris)(Ａlertson et al.)で構築 させた３つのライブラリからＹＡＣクローンを単離したが、これらは全てＹＡＣ ベクターpＹＡＣ４に連結したＤＮＡ全体の一部のＥcoＲＩ断片から調製された ものである。ＩＣＲＦ ＹＡＣクローンは、ライブラリフィルターを5q13.1プロ ーブを用いて探査するこによって同定した。ＮＣＥライブラリから得られたＹＡ ＣＤＮＡをＰＣＲ増幅によってスクリーニングし、電気泳動し、サザンブロット に固定し、放射標識したＳＴＳ産物にハイブリダイズし、ポジティブであること を確認した。多数のポジティブがプールしたプレートの第１回目ＰＣＲおよび目 的のクローンを含むと考えられたプレートでの第２回目のＰＣＲ双方から繰り返 し得られたが、その多くは偽のポジティブであった。偽ポジティブクローンはプ ライマー依存性と思われるが、その数はＰＣＲ産物を放射標識し、６％ポリアク リルアミドゲル上で分解させることによって減少した。その後、真のポジティブ クローンのサイズを偽生成物からの干渉を受けずに正確に測定することができた 。 5q13.1ＳＴＳに対してポジティブなＹＡＣを有する酵母菌株を選別プレート上 で培養し、以下の方法で安定性を試験した。すなわち、４コロニーの各々をアガ ロースブロックで培養し調製し、酵母染色体ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気 泳動によって分離し、フィルターに転移し、放射標識した全ヒトゲノムＤＮＡと ハイブリダイズさせることによって各酵母コロニー内に含まれるＹＡＣクローン のサイズと数を決定した。ポジティブクローンは、オリジナルプローブとのハイ ブリダイゼーションまたはＰＣＲ増幅のいずれかによって確認した。ＹＡＣ24Ｄ 6-2だけが１つ以上のＹＡＣを有する複数のコロニーを含んでいた。 ＹＡＣ末端クローンおよびインター-Ａluは、それぞれベクター-ＡluＰＣＲお よびインター-ＡluＰＣＲによって単離した。5q11−13におけるこれらの産物の 位置は、第５染色体の全てを含む体細胞ハイブリッドＨＨＷ105(Ｄona et al.,1 982)と、5q11.2-13.3が欠失した第５染色体を含む誘導体ＨＨＷ1064(Ｇilliam e t al.,1989)のサザンフィルターにハイブリダイズさせて確認した。これらのプ ローブの多くは、5q11−13領域と第５染色体のどこかとに位置することを示すハ イブリダイゼーションプロフィルを示した。ある場合には、各ＹＡＣ末端に特異 的なプライマーは、ベクター-ＡluＰＣＲによって単離されたＹＡＣ末端クロー ンの配列から生成された。各々の新規ＳＴＳの5q11-13への配置は、体細胞ハイ ブリッドＨＨＷ105およびＨＨＷ1064由来のＤＮＡのＰＣＲ増幅によって決定さ れた。若干の場合には、ＨＨＷ105およびＨＨＥ1064から得られたＰＣＲ増幅産 物がポジティブの場合は、プライマー対が第５染色体反復配列を含んでいた。新 規のＳＴＳプライマーの形成によって、5q11-13領域に特異的な産物が増幅した 。末端クローンハイブリダイゼーションおよびＳＴＳ分析をすべてのＹＡＣに実 施し、各ＹＡＣの向きと位置を確認した。 ＳＭＡ区間を含むＹＡＣ連続系列の集合は、２つのマーカー、すなわち、ＳＭ Ａに隣接し、Ｄ5Ｓ435のセントロメア側に存在するマーカーＤ5Ｓ125(Ｍankoo e t al.，1991)と、よりテロメア側に位置するマーカーＤ5Ｓ112(Ｌien et al.，1 991)(図１参照)とから開始する。６つのＹＡＣは、セントロメアマーカーpＪＫ5 3(Ｄ5Ｓ112)によってＩＣＲＦライブラリに同定された。これらのＹＡＣの１つ はＤ06100であるが、末端クローンＳＴＳ分析に基づきさらにセントロメア方向 に延在することが示された。このＹＡＣのセントロメア末端によって、ＮＣＥラ イブラリから２つのＹＡＣすなわち1281と1284を同定した。 Ｄ5Ｓ125またはＤ5Ｓ435マーカーにポジティブなＹＡＣは、ＩＣＲＦライブラリ とＮＣＥライブラリには認められなかったため、ＣＥＰＨライブラリをスクリー ニングすることによって、Ｄ5Ｓ435を含むクローンを単離した。ギャップの中心 に位 置するミクロサテライト多形性であるＣＡＴＴ-１を使用して、３つのＹＡＣす なわち24Ｄ6-2、27Ｈ5、33Ｈ10を検出した。これらのＹＡＣは、ＳＴＳ分析によ って、セントロメア方向のＹＡＣおよびテロメア側のＹＡＣ(1281、1284)に連結 することが示された。ＡluＰＣＲによる中間ＹＡＣ産物を使用して全てのＹＡＣ を探査し、オーバーラップの程度を確立した。ＪＫ348とＤ5Ｓ112との間に位置 するＳＴＳ配列(Ｋleyn et al.,1993)を使用し、オーバーラップの程度と連続系 列におけるＹＡＣの配向を確認した。同時に5q13に沿って各ＳＴＳの順番も確認 した。結果的に全部で１４ＹＡＣを同定し、遺伝マーカーＤ5s435、Ｄ5Ｓ629、 ＣＭＳ-1、Ｄ5Ｆ153、Ｄ5Ｆ149、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｓ557およびＤ5Ｓ112 によって固定した。 長距離制限地図および物理的距離の見積 重要なＳＭＡ領域の制限地図をＤ5Ｓ629に約100kb近位のＳＴＳ Ｙ116Ｕ(Kley n et al.,1993)からＤ5Ｓ557に約500kb遠位のＳＴＳ Ｙ107Ｕまで作成した(図２ 参照)。我々のＹＡＣの欠失または転位についてあらゆる可能性を見い出すため に、ＣＥＰＨライブラリ(Kleeyn et al.,1993)からさらにＹＡＣを単離し、この 領域内にマッピングすることを分析に含めた。ＹＡＣの24Ｄ6、227Ｈ5、33Ｈ10 、155ＳＨ11、76Ｃ1、235Ｂ7、184Ｍ2、428Ｃ5、81Ｂ11(Ｋleyn et al.,1993)を 低頻度切断エンドヌクレアーゼＮotl、ＢssＨＩＩ、Ｓfil、Ｒsrlを用いて部分 的に切断した。パルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）で分離した制限産物 をサザンブロッティングし、ＹＡＣの左腕特異プローブおよび右腕特異プローブ にハイブリダイズさせたところ、各ＹＡＣの両端からの開列部位の位置が明らか にされた。ＹＡＣの配向およびオーバーラップは、ＳＴＳ分析に基づいてすでに 求められているので、オーバーラップしたＹＡＣ中の低頻度切断部位の位置を比 較した。それらの共通する低頻度切断部位にオーバーラップしたＹＡＣを並べる ことによって、オーバーラップの程度をさらに正確に決定することかできた。異 なる起源由来のオーバーラップＹＡＣの長距離制限地図は33Ｈ10および428Ｃ5を 例外としてほとんど一致する。428Ｃ5は欠失を含むことが以前に立証さており( Ｋleyn et al.,1993)、そのＳＴＳ含有物の比較と、わずか300kbのサイズしかな いことから、図２の配置よりもさらにセントロメア側に存在することが示唆され る。ＳＴＳ分析に基づくＹＡＣ33Ｈ10は、内部欠失を含み、ＹＡＣ155Ｈ11はテ ロメア側がキメラであるので、地図のテロメア側の低頻度切断部位は確認するこ とができず、含まれていなかった。この結 果は、セントロメア境界であるＤ5Ｓ435からテロメア境界であるＤ5Ｓ557までの 距離は1.4Mbであり、これは先に報告された400kb(Ｆrancis et al.,1993)とは著 しく異なるが、別の見積結果(Ｗirth et al.,1993)とは一致した。さらに、Ｄ5 Ｓ629-Ｄ5s557区間は1.1Mbであり、遺伝的に定義されたＣＭＳ1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ55 7区間の距離は約550kbであると見積もられた。 第５染色体ライブラリからのコスミド連続アセンブリ ＹＡＣ全体をプローブとして使用するコスミドの単離は、コスミド連続系列を 構築する迅速な方法であると考えられたが、この場合、第５染色体に特異的な反 復配列の存在によって、第５染色体の別の場所に位置するコスミドを単離し易い と思われた。目的のコスミドのウォーキング法は、こうして採用された。 ＣＡＴＴ-１ ＳＴＲは、放射線ハイブリッド分析によって２つの接合標識Ｄ5Ｓ4 35とＤ5Ｓ351のほぼ中間に位置することがわかっているが、これを開始点として 使用し、コスミドクローン系列を構築した。ゲノムＤＮＡに見られる複合増幅パ ターンは、１個体あたり２から８の対立遺伝子を含んでいるが(図３参照)、この 領域のＣＡＴＴ-１配列のコピー数または部位が可変的であることを示すもので あった。３０個のＣＡＴＴ-１にポジティブなコスミドを同定したところ、それ らはＰＣＲ分析時に４個の異なる対立遺伝子の１つを含むことがわかった。コス ミドライブラリはモノ染色体ソース由来であったので、これによってＣＡＴＴ ＳＴＲは少なくとも４つの位置に存在することが確認された。我々はこれらの４ つの部位を下位部位(subloci)と命名した。これらの下位部位は、各々12、19、1 5、20のシトシンアデノシン(ＣＡ)ジヌクレオチドの対立遺伝子を含有すること が確認された第１コスミド番地に基づいてＣＡＴＴ-40Ｇ1、ＣＡＴＴ-192Ｆ7、 ＣＡＴＴ-58Ｇ12、ＣＡＴＴ25ＯＢ60と命名された。両方向ウォーキングを４つ のコスミド下位部位から開始した。ポジティブなハイブリダイゼーションは、58 Ｇ12を一端に有する250Ｂ6と他端に有する192Ｆ7に観察され、cen-192Ｆ7-58Ｇ1 2-250B6-telの順序であった(図４)。ＣＡＴＴ-192Ｆ7対立遺伝子を含む全てのコ スミドは、それらのＣＡＴＴ-１対立遺伝子のサイズおよびそれらの制限酵素プ ロフィルに基づいて、この位置に配置された。図４に示すように、ＣＡＴＴ-192 Ｆ7下位部位は、ＳＴＲ ＣＭＳ-１に対してテロメア側であり、それ自体がＣＡ ＴＴ-40Ｇ1下位部位のテロメア側である。 第５染色体特異反復配列の存在によって第５染色体の別の領域からコスミドを 同定し、連続系列の一貫性を次の各ステップによって確認した。ベクター- Ａlu-ＰＣＲによって生成されたコスミド末端クローンを上記体細胞ハイブリッ ドパネルにハイブリダイズした。第５染色体領域に単独で位置する反復配列がハ イブリッド細胞系ＨＨＷ1064では欠失しいてることが確認され、最終産物によっ て同定されるコスミドはＨＨＷ1064とハイブリダイズしないので、さらに分析し た。オーバーラップは、末端クローンのハイブリダイゼーション、単コピープロ ーブのハイブリダイゼーション、ＳＴＳ含量、制限酵素プロフィルの比較によっ て証明された。ＨＨＷ1064にハイブリダイズする末端クローンによって同定され たコスミドを除外し、同じ方法で確認した別のクローンからの異なるインター- Ａlu産物を用いてウォーキングを継続した。コスミドのサイズは、ＥcoＲＩ制限 フラグメントの添加によって算出され、オーバーラップの存在はＥcoＲＩ制限フ ラグメントによって同様に求められた。 ＹＡＣ76Ｃ１コスミドのコスミド連続系列 コスミド連続系列の伸長は第５染色体に特異的な反復配列の存在によって妨げ られるので、5ＸコスミドライブラリをＹＡＣ 76Ｃ1から作成した。ＹＡＣに沿 って分布するＳＴＳのＣＡＴＴ-1、ＣＭＳ-1、Ｙ122Ｔ(Ｋleyn et at.,1993)、 Ｙ97Ｔ(Ｋleyn et al.，1993）およびＹ98Ｔ(Ｋleyn et al.，1993)を用いてコ スミドを同定し、連続系列を構築した。同様に、以前に開発されたマーカーpＺ Ｙ8、pＬ7、pＧＡ-1、p15.1、p402.1、p2281.8および構築されたコスミド連続系 列由来のβ-グルクロニダーゼ(Ｏshima et al.，1987)(表２、図２)がこのライ ブラリにハイブリダイズしたが、これはコスミドの順序付けに効果的な方法であ った。不規則なハイブリダイゼーションパターンを示し、欠失および／または転 位を含むと考えられるコスミドを除去した。 ＳＴＳ Ｙ98Ｔは、ＳＴＳ Ｙ98Ｔを含む第５染色体ライブラリクローン由来の プロー2281.8によって以前に同定されたコスミドを含む３つのコスミドを識別し た。このコスミドの最終産物は、１０個のコスミドにハイブリダイズした。同時 に、ＣＡＴＴ40Ｇ１下位部位の末端フラグメントは、これら１０コスミドの４つ にハイブリダイズし、ＣＡＴＴ-40Ｇ１およびＣＭＳ-1をよりセントロメア寄り のＳＴＳ Ｙ98Ｔに連結した(図４)。我々は、ＹＡＣおよびＳＴＳ 97Ｔを含むい かなるクローンをも同定することができなかった。フィルターハイブリダイゼー ションおよびＳＴＳマッピング実験の結果、別のＣＡＴＴ40Ｇ１下位部位がさら にセントロメア寄りであることを示した。この下位部位の重複は、我々のＳＭＡ 血族遺伝子型データに一致した(ＭcＬＥan et al.，印刷中)。 この領域を測るのに必要な最小のコスミドセットを用いてＥcorＩ制限地図を 作製した。連続系列の信頼性を確認するため、我々はそれを第５染色体特異的ラ イブラリからの連続構築物に組み込むことを試みた。連続系列の一致は、制限地 図の比較、地図上のプローブおよびＳＴＳsの位置、およびＡlu-ＰＣＲフィンガ プリンティングによって明白であった。この方法の場合、連続系列のサイズは21 0kbであると見積もられた。このため、直接的なウォーキング法によって、既知 のセントロメア／テロメア配置を有する下位部位のＣＡＴＴ-１クラスターを含 む１組のコスミド集合を作成した。 重複／欠失 幾つかの証拠は、我々のコスミド系列中にゲノム配列重複が存在することを示 唆した。我々は、ＣＡＴＴ-40Ｇ1サブクローンの複製が単一の第５染色体由来の コスミドに存在することの証拠を提供する。ＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位として確立 されたこの下位部位に対するセントロメアの位置は、複数のコスミドにおいてＳ ＴＳsのＹ122Ｔ、Ｙ88ＴおよびＣＭＳ-1に隣接していることが見出され、セント ロメアのＹＡＣ428Ｓは、ＣＡＴＴ-40Ｇ1含有コスミドから単離されたプローブ に対してポジティブであった。ＹＡＣ428Ｃ5は、ＰＣＲ増幅の際にはＣＡＴＴ-4 0Ｇ1下位部位を含まなかったが、これはＹＡＣが由来する染色体の無効対立遺伝 子またはＹＡＣの欠失によって説明することができる。我々は、既に、離れたＣ ＡＴＴ-1下位部位で個々の無効対立遺伝子を観察している。ＣＡＴＴ40Ｇ1の別 のよりテロメア寄りの位置を、いずれもテロメア側のＹＡＣ33Ｈ10である24Ｄ62 に結合するプローブpＧＡ-1、pＬ-7およびpＺＹ8のＣＡＴＴ40Ｇ-1へのハイブリ ダイゼーションによって決定した。コスミド40Ｇ1由来のp402.1をコスミドの両 方の位置にハイブリダイズしたところ、重複はＣＡＴＴ40-1下位部位に限定され ず、より広い領域を含む傾向にあることが分かった。サザンブロットによって、 ２つの位置に対するコスミドの異なるプロフィルが明かになったが、Ａlu-ＰＣ Ｒフィンガプリントによって共通のバンドが検出され、重複を裏付けた。 我々のＹＡＣ系列とコスミド系列との相関関係から、ＹＡＣの76Ｃ1、81Ｂ11 、27Ｈ5は、5q13の150kbのＣＡＴＴ領域に及ぶことがわかった。それにも関わら ず、これらのＹＡＣのＣＡＴＴ-1遺伝子型からは１つの対立遺伝子サイズが判明 しただけで、これらのＹＡＣ(４つすべて)が由来する染色体が、それらの残りの ＣＡＴＴ-1下位部位の無効対立遺伝子を含む確率が高くなった。ただし、 我々の実験は、ＳＭＡ家系のＣＡＴＴ連鎖分析によって、遺伝子型を決定した約 300人のうち誰も２つ以下の対立遺伝子を持っていないというようなシナリオは ほとんど有り得ないことを示した。従って我々は、これらのＣＡＴＴ下位部位は 不安定であり、ＹＡＣの構築および／または増殖中に欠失する傾向が強いと考え る。 ＣＡＴＴ-1とＤ5Ｆ153プライマーの配列比較は、一方のプライマーが一致し、 他方のプライマー配列が８ヌクレオチド重複しているので、これらの２つのＳＴ Ｒは類似しており恐らくは同一であることを示した。ただし、セントロメア側の ＹＡＣである428Ｃ5、232Ｆ12、235Ｂ7、184Ｈ2と、テロメア側ののＹＡＣであ る12Ｈ1、155Ｈ11、269Ａ6は、ＣＡＴＴ-1ネガティブであり、Ｄ5Ｆ153増幅産物 を生成したことから、ＣＡＴＴ-1はＤ5Ｆ153の誘導体の可能性がでてきた。これ らのデータは、３つのＤ5Ｆ153部位(図４)を含むコスミド系列のＤ5Ｆ153分析と の比較によって、少なくとも５つのＤ5Ｆ153下位部位の存在を示した。 ＣＡＴＴ-1ＳＴＲとＤ5Ｆ153ＳＴＲの他に、ＣＭＳ-1ＳＴＲとＤ5Ｆ150ＳＴＲ が第５染色体当たりの種々のコピー数で存在した。ＳＴＳ分析によって、ＣＭＳ -1はＹＡＣの423Ｃ5、76Ｃl、81Ｂ11、27Ｈ5に位置決定されたが、それぞれの対 立遺伝子サイズは、5、4、4、3および４であった。ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅は 、１個体あたり４対立遺伝子までであることがわかり、染色体当たり２コピー多 かった。Ｄ5Ｆ150はコスミド系列内の２つの位置に存在したが、１つの位置しか ＹＡＣ系列には検出されなかった。Ｄ5Ｆ151は我々のコスミド系列には検出され なかったにもかかわらず、ＹＡＣ 428Ｃ5のポジティブな増幅に基づきそのコス ミド系列に含まれたＹＡＣ33Ｈ10のセントロメア末端に配置された。Ｄ5Ｆ149の 位置の一つは、我々のコスミドとＹＡＣクローンの両方で検出された。我々のデ ータは、ＣＡＴＴ-1については、無効対立遺伝子の存在および／またはＹＡＣの ＣＭＳ-1、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｆ149配列の不安定性を示唆した。 欠失現象は、第５染色体の特異的コスミドライブラリから得られたコスミド23 4Ａ1を含むＣＡＴＴ-40Ｇ1から単一コピープローブとして単離された800bpのＥc oＲＩフラグメントとのハイブリダイゼーションにおいて観察された。ＹＡＣＤ ＮＡの探査では、我々のＹＡＣのいずれにおいてもこのフラグメントを検出する ことができなかった。数人のゲノムＤＮＡへのハイブリダイゼーションでは、欠 失現象は一切同定されなかったので、この配列はＹＡＣの不安定性に起因するも のと考えられた。このフラグメントの配列決定では、エクソンもコード領域も一 切明かにならなかった。 ＳＭＡ領域の配列重複の別の証拠は、コスミド15Ｆ8(図４)から得られた1.2kb の内部Ａlu-ＰＣＲ産物(p151.2)を用いて確認された。プローブによって、ＹＡ Ｃクローンの76Ｃ1、81Ｂ11、27Ｈ5(20kb、12k、3kb)の３つのＥcoＲＩフラグメ ントが同定されたが、33Ｈ10および24Ｄ6(20kb)と428Ｃ5では１つずつしか確認 されなかった。内部ＥcoＲＩ部位は、このマーカーを500bpと700bpのプローブに 分割した。大きい方のプローブによって、12kbおよび20kbのフラグメントを識別 する一方で、小さい方のプローブによって3kbおよび20kbのフラグメントを識別 した(図５)。我々は、ＹＡＣのこの配列の不安定性は、ライブラリが異なるため に除外し、ハイブリダイゼーションパターンをそれらの物理的位置に反映させた 。12kbおよび3kbのフラグメントはＥcoＲＩ制限地図上に配置されたが、我々は2 0kbのフラグメントを位置づけすることはできなかった。我々のコスミド連続系 列の遠位にある20kbフラグメントはデータから推測することができる。複製はゲ ノムＤＮＡ断片へのハイブリダイゼーションによって確認され、３つ全てのフラ グメントサイズが明らかになった。 ＹＡＣ系列とコスミド系列の特徴 我々は、Ｄ5Ｓ435-Ｄ5Ｓ112領域を組み込み4Mbを含むＳＭＡ疾患遺伝子領域の ＹＡＣ系列を確立した。5q13に沿った系列の向きはＰＦＧＥ分析と組み合わせて ７つの遺伝マーカーおよびＳＴＳｓを分析することによって確認した。長距離制 限地図では、我々の系列に含まれるＹＡＣの主な欠失および転位は明かにならな かったので、この地図を用いて系列のサイズを詳細に見積もった。我々のＹＡＣ 地図は、少数コピー反復配列と複数部位ＳＴＳsによって特徴づけられる1.1Mb領 域に、マーカーＤ5Ｓ629、Ｄ5Ｆ153、Ｄ5Ｆ151、Ｄ5Ｆ150、Ｄ5Ｆ149、ＣＭＳ-1 、ＣＡＴＴ-1およびＤ5Ｓ557を物理的に連結させた。さらに、我々は、新しく遺 伝的に規定されたＣＭＳ1-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557が500kbであると見積もった。Ｄ5Ｓ4 35-Ｄ5Ｓ557領域の物理的距離の評価値は400kb(Francis et al.，1993)から1.4M b(Wirth et al.，1993)までであることが報告されている。このような研究とは 対照的に、我々はＤ5Ｓ435-ＳＭＡ-Ｄ5Ｓ557領域を1.4Mb、ＣＭＳ11-ＳＭＡ-Ｄ5 Ｓ557領域を550kbとする見積では、６個の染色体からなる３つの起源に由来する クローンを採用する。さらに、クローンサイズと低頻度切断部位の位置とを決定 することによって、さらに詳細にＹＡＣのオーバーラップの程度と系列のサイズ を決定することができるようになり、評価が信頼できるものになった。 我々は、第５染色体特異的ライブラリおよびＹＡＣ(76Ｃ1)特異的ライブラリ 由来のコスミドクローンの単−連続系列を、210kbを含むＣＭＳ-1/ＣＡＴＴ-1/ Ｄ5Ｆ153/Ｄ5Ｆ150/Ｄ5Ｆ149領域の制限地図に関連して構築した。第５染色体特 異的ライブラリを使用した場合に、反復配列がコスミド配列の伸長を阻害したの で、重要な領域についてコスミドライブラリＹＡＣ 76Ｃ1を構築しなければなら なかった。連続コスミド系列は、制限酵素フラグメントのオーバーラップによっ て確立されたコスミドのオーバーラッブやＡluフィンガプリンティング、あるい はＳＴＳ、コスミド末端クローンおよび単コピープローブの分析を実証しながら 直接的なウォーキング法によって構築された。 物理的マッピング分析および遺伝的マッピング分析は、重複と反復配列を含む ゲノムＤＮＡの複合領域を明らかにした。この領域から得られた複合ＳＴＲを用 いてゲノムＤＮＡの遺伝子型を決定することで、１個体当たり８個までの多形性 バンドが存在することがわかった。これは、ＳＴＲのＣＡＴＴ-1、ＣＭＳ-1、Ｄ 5Ｆ153、Ｄ5Ｆ150には複数のコピーまたは下位部位が存在することを示している 。我々の物理的マッピングデータは、これらの複数の下位部位の存在を確認した が、Ｄ5Ｆ151およびＤ5Ｆ149の場合は例外であり、１つの位置しか明かにならな かった。４つのＣＡＴＴ-1下位部位は我々のコスミド系列の140kb領域に位置し 、少なくともその一つである下位部位ＣＡＴＴ-40Ｇ1は重複化されている。Ｄ5 Ｆ153とＣＱＴＴ-1は共通の祖先から分岐したと考えられるＳＲＳに関連してい た。我々は、１つのＣＭＳ-1下位部位を我々のコスミド系列に位置づけたが、Ｙ ＡＣ／コスミドライブラリが由来する染色体は無効対立遺伝子を残りの下位部位 に含むか、または欠失が確認される場合が考えられるので、我々のデータからは この200kb領域内の別の染色体上に他の下位部位が存在するか否かについて判定 することができなかった。 ＣＡＴＴ-1、ＤＦ153、Ｄ5Ｆ150およびＤ5Ｆ149ＳＴＲは、母集団の染色体上 に複数コピーが存在していたが、各々に対して単一の対立遺伝子ＰＣＲ産物によ って明かなように、すべてのＹＡＣＳ上に下位部位マーカーとして確認され、こ れらの配列の不安定性と欠失とを示した。これは、第５染色体コスミドライブラ リをベースとした連続系列由来の我々のＹＡＣにおいて800bｐのフラグメントが 不在であることによって裏付けられる。複数の下位部位間に配置される別のユニ ークな配列プローブがＹＡＣに保持されているので、これらの配列の不安定性が 大きな欠失を生じさせるとは思われない。 要するに、我々は、決定的なＳＭＡ領域に対する最初の高解像度物理地図を 作成したのである。ただし、ＳＭＡ遺伝子を含んだ正確な領域の説明は、この情 報だけでは不可能である。 我々は、遺伝的分析と同時に、ＹＡＣ連続系列を３つの異なるＹＡＣライブラ リから得たクローン(Ｒoy et al.,1994)を用いて構築した。この系列からの最小 表示は図９Ｂに示したとおりであり、これは拡張パルスフィールドゲル電気泳動 (ＰＦＧＥ)分析と相関した。一般的なＣＡＴＴ-1 マーカーおよびＳＭＡの連鎖 不平衡に関する初期の提案(Ｂurghes et al.,1994)に従い、伸長したＣＡＴＴ領 域を組み込むコスミド連続系列の構築に着手した。5q13か第５染色体のどこかに 位置する広範で多形性のゲノム反復要素の存在が、連続系列を直線的に構築する ことを妨害した。ただし、系列の一貫性は、制限酵素分析、Ａlu-ＰＣＲフィン ガプリンティング、ＳＴＳ含量決定およびコスミド末端クローンやその他の単コ ピープローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって確保された。この結 果、単一染色体に由来するフローソート第５染色体ゲノムライブラリ(Ｒoy et a l.,1994)に含まれる５つのＣＡＴＴ下位部位を含んだ200kbを組み込んだ系列が 作成された。さらに最近では、このＣＡＴＴ領域を含み、１０クローンから構成 され、約550kbの長さを有するＰ１人工染色体(ＰＡＣ,loannou et al.，1994)連 続系列が構築された(図９Ｃ)。 連鎖不平衡分析 ＳＭＡ領域に位置する５つの複合縦列反復および単純縦列反復を用いる連鎖不 平衡分析を行った。この分析に使用された２つの多形性は、我々のコスミド系列 にマッピングしたＣＡＴＴ-40Ｇ1下位部位およびＣＡＴＴ-192Ｆ7下位部位であ った。２つの独立した下位部位の特異的増幅はＣＡ反復に隣接する領域の配列多 形性で終了するプライマーを構築することによってなされた。ＣＡＴＴ-40Ｇ1下 位部位では図６に示されるように、明確なピークが観察された。 ＰＡＣ連続系列 40Ｇ1 ＣＡＴＴ下位部位は連鎖不平衡を示したので、ＣＡＴＴ領域を含むＰＡ Ｃ連続系列を構築した。このＰＡＣ連続系列は９個のクローンからなり、全長約 400kbであった(図７)。物理的マッピングデータに組み合わせた我々の遺伝的分 析は、ＳＭＡと最大の不平衡を示した40Ｇ1ＣＡＴＴ下位部位マーカーが重複し ており、重要なＳＭＡ領域の極めてセントロメア寄りに局在していることを明ら かにした。結果的に、10kbのセントロメア末端内にＣＭＳ対立遺伝子９を 限定するＳＭＡ領域を含み、テロメア方向に延在して40Ｇ1 ＣＡＴＴ下位部位を 組み込んだ154kbのＰＡＣクローン125Ｄ9をさらに別の試験用に選択した。 ２つのゲノムライブラリは、ＰＡＣ125Ｄ9の全長およびＳsu3ＡＩで切断した 部分的断片(平均インサートサイズ5kb)を用い、制限酵素産物をＢamＨ１で開列 したＢluescriptプラスミドにクローン化することによって構築された。ゲノム 配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクローンがＰＡＣの大部分をカ バーするように(Ｃhen et al.，1993)、5kbの部分的インサートＳau3ＡＩライブ ラリから得られた２００クローンの両端について行った。これは、神経アポトー シス抑制タンパク遺伝子の構造を説明するための手段を提供する。 ＰＡＣ125Ｄ9を30kbのセントロメア側フラグメントと125kbテロメア側フラグ メントにＮotl部位で切除する(これは、アポトーシス抑制領域の開始部位である ＰＡＣ125Ｄ9のエクソン７を二分することが後に示された)。ＮotlＰＡＣフラグ メントはＰＦＧＥによって単離され、胎児脳cＤＮＡライブラリのプローブとし て別々に使用された。Ｎotl部位領域の物理的マッピングおよび配列決定も行い 、迅速にコード配列を検出するためにＣpＧ ilandの存在を検定した。ＰＡＣ125 Ｄ9はまたエクソン トラッピング システムにおける鋳型として使用し、神経ア ポトーシスよ抑制タンパク遺伝子に含まれるエクソンを同定した。 ＧＡ1やＬ7などのコスミド系列から得られたクローンを用いたハイブリダイゼ ーションによって既に同定された転写の存在に加え、多面的な方法を行って、神 経アポトーシス抑制タンパク遺伝子に含まれる６つのcＤＮＡクローンを迅速に 同定した。これらのクローンを可能な場合はオーバーラップ系列に配置した。キ メラ現象は、ＰＡＣ125Ｄ9の部分的なＳau3ＡＩゲノムライブラリ由来のクロー ンから得られた配列を有するcＤＮＡクローンの共直線検出によって何度も除去 した。 神経アポトーシス抑制タンパクのクリーニング ５つのＣＡＴＴ下位部位の１つを含むコスミド250Ｂ6の完全なゲノムcＤＮＡ インサートを用いてヒト胎児脊髄cＤＮＡライブラリをプロービングしたした。 この結果、2.2kbの転写ＧＡ1が検出されたが、この位置は図７に示した。胎児脳 ライブラリを連続コスミドインサート(コスミド４０Ｇ1)の他、このようなコス ミドから単離された単コピーサブクローンを用いてさらにプロービングした。複 数の転写が確認され、中にはＬ7と呼ばれるものも含まれていた。コード領域は Ｌ7につては検出されなかったが、これは恐らくクローン実質部が未処理の異核 ＲＮ Ａを含んでいた事実によると思われる。ただし、我々は、後にＬ7が神経アポト ーシス抑制タンパク遺伝子の一部と考えられる領域を含むことを発見した。同様 に、ＧＡ1転写は、神経アポトーシス抑制タンパクのエクソン１３であることが 最終的に証明された。ＧＡ1は、発現遺伝子であることを示すエクソンを含むこ とがわかったので特に注目した。ＰＡＣクローン125Ｄ9内に含まれるＧＡ1転写 は後にcＤＮＡライブラリを詳しくプロービングすることによって伸長された。 伸長ＧＡ1転写をその他の既知の配列と比較し、そのアミノ酸配列がＯrgyia ＰseudotsugataウイルスおよびＣydia Ｐomonellaウイルスのアポトーシス抑制 ポリペプチドと高い相同性を有することが明らかにされた(表３)。この配列分析 によって、エクソン５および６のアポトーシス抑制タンパクに相同性があること がわかった。 cＤＮＡの残りのギャップを補完して、２つの捕捉エクソンを用いて胎児脳ラ イブラリをプロービングすることによって最終的な３‘の伸長を行った。オーバ ーラップクローンを有するcＤＮＡの物理的地図を作成した。完全cＤＮＡ配列を 表４に示したが、これには１６個のエクソンが含まれている。アミノ酸配列は、 ヌクレオチドトリプレットＡＴＧに対応するメチオニンから開始する。図８は、 ＳＭＡ遺伝子の構造を示す。 表４に示されるＮＡＩＰのcＤＮＡ配列は、当業者らによってこの遺伝子プラ イマー、プローブおよびタンパク産物に対する抗体から発展させることができる 。表４のcＤＮＡ配列を組換ＤＮＡ技術に利用して適当な宿主で発現させ、神経 アポトーシス抑制タンパクを製造することができる。これによって、神経アポト ーシス抑制タンパク材料を提供することができる。ＮＡＩＰの配列およびそれに 含まれるプローブとプライマーを供給すると、たとえば、脊髄性筋萎縮症などの 疾患を検出することもできる。 ＮＡＩＰ構造 ＮＡＩＰ遺伝子は、少なくとも5.5kbからなる１７個のエクソンを含み、ゲノ ムＤＮＡの約80ｋｂに及んでいる。ＮＡＩＰコード領域は3698ヌクレオチドで、 1233アミノ酸からなる遺伝子産物が推定される。ＮＡＩＰは２つの潜在的膜貫通 領域と、ＧＴＰ結合部位に直接隣接する細胞内のアポトーシス抑制ドメインとを 含んでいる。タンパク質ドメインプログラムの調査によって以下の結果が出た。 (i) 残基9-91：認識可能なモチーフが存在しないＮ-末端ドメイン (ii) 残基94-118：疎水性膜spanningドメイン (iii)残基：169-435：アポトーシス抑制タンパクと相同性を示し、次の疎水性 ドメインであるＧＴＰ/ＡＴＰ結合部位の直前に位置するドメイン (iv) 残基486-504：疎水性膜spanningドメイン (v) 残基505-1005：４つのＮ−末端結合グリコシル化部位と１つのリポタン パク質結合ドメインを含む受容体ドメイン 神経アポトーシス抑制タンパク タンパク遺伝子突然変異の分析 cＤＮＡライブラリをスクリーニングするプローブとして完全ＰＡＣ125Ｄ9を 用いてcＤＮＡ20.3プローブを得た。cＤＮＡプローブ20.3を用いたゲノムサザン のプロービングによって、III型の近親婚家族では9kbのＥcoＲＩバンドが欠損し ていることを明らかにした。この情報によって、ＮＡＩＰ遺伝子の欠失をエクソ ン５およびエクソン６に位置づけた。このため、欠失は低頻度Ｎotl制限部位と その直接下流を含むエクソンをカバーする。これらのエクソン内または周囲のプ ライマーを構築し、Ｉ型ＳＭＡ患者３人とIII型ＳＭＡ患者３人にこの領域の増 幅がないことを明かにした。上記の欠失が原因で生成される接合(junction)フラ グメントを増幅するプライマーを調製する目的で、ＰＡＣとエクソン４および５ 内および周囲のコスミドサブクローンからゲノムＤＮＡを単離し、配列を決定し た。１つの接合フラグメントがIII型の患者に検出された。同様の産物が、近親 婚の履歴がない別のフランス系カナダ人２例に観察された。３例のＩ型ＳＭＡお よび３例のIII型ＳＭＡ患者の染色体は、同一のＣＡＴＴ/ＣＭＳハプロタイプを 有し、これが共通の軽度のＳＭＡ突然変異であり、フランス系カナダ人の母集団 には比較的多いことを強く示唆した。このパターンの共分離が証明された。我々 は、ＳＭＡ患者の１１０人の両親の分析を行ったが、同様の産物を発見すること ができなかった。この領域のゲノムＤＮＡの配列を決定したところ、約10kbの欠 失があり、これがフレーム欠失を生じさせていることが確認された。この欠失は 、イントロン領域とエクソン５および６に及んでいた。２世代のＳＭＡ家族にサ ザンブロット分析を行った。最初の８エクソンを含むcＤＮＡプローブを用いて 、末梢血白血球由来ＤＮＡのＥcoＲＩ断片をブロービングした。ＳＭＡ患者は、 エクソン５および６を含む10kbのＥcoＲＩバンドへのハイブリダイゼーションが 存在しなかった。(図９)。 ＮＡＩＰ転写物は、最初に、コスミドライブラリに存在する５つのＣＡＴＴ下 位部 位の一つを含むコスミド250Ｂ6の完全な28kbのゲノムＤＮＡインサートを用いて ヒト胎児脳cＤＮＡライブラリをプロービングすることによって単離した。これ によって2.2kbの転写物を検出し、最終的にＮＡＩＰ遺伝子のエクソン１４であ ることを証明した。さらに、胎児脳ライブラリを連続隣接コスミド系列のインサ ート(コスミド40Ｇ1)と、このようなコスミドから単離された単コピーサブクロ ーンを用いてプロービングすることによて、Ｌ7転写物を含む複数の転写物を同 定し、最終的にＮＡＩＰ部位のエクソン１３を含むことを証明した。Ｌ7に対す るコード領域は検出されなかったが、これは、クローン含有の未処理異核ＲＮＡ がかなりの割合でその真の性質を妨害したことによると考えられる。 この段階では、完全な遺伝的分析および連鎖的不平衡分析とＰＡＣ連続系列の 構築によって、ＰＡＣ125Ｄ9をＳＭＡ部位を含む可能性が高いものとして同定し た。４つのＰＡＣ125Ｄ9ゲノムライブラリは、ＰＡＣインサートの全長およびＳ au3ＡＩ、ＢamＨＩおよびＢamＨＩ/Ｎotlで切断した部分的断片（平均インサー トサイズ５kb)をプラスミドベクターにクローニングすることによって作成した 。High through putゲノム配列決定は、連続的でオーバーラップしたゲノムクロ ーンがＰＡＣ125Ｄ9の大部分をカバーするように(Ｃhen et al.，1993)、5kbの 部分的インサートＳau3ＡＩ切断ライブラリから得られた２００クローンの両端 について行った。これは、神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子の構造を説明す るための手段を提供する。 ＰＡＣ125Ｄ9は、24kbのセントロメア側フラグメントと130kbのテロメア側フ ラグメントにＮotl部位で分割され、アポトーシス抑制相同ドメインの上流に位 置する最初の膜貫通ドメインの開始位置でＮＡＩＰのエクソン６を二分する(図 １１および表４)。Ｎotl ＰＡＣフラグメントはＰＦＧＥによって単離され、胎 児脳cＤＮＡライブラリのプローブとして別々に使用された。Ｎotl部位領域の物 理的マッピングおよび配列決定も行い、迅速にコード配列を検出するためにＣp Ｇilandの存在を検定した。ＰＡＣ125Ｄ9はまたエクソン トラッピングシステ ムにおける鋳型として使用し(Ｃhurch et al.，1994)、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソ ン５、１２、１６、１７を同定した。 これらの多面的な方法によって、ＮＡＩＰ遺伝子(図１０)を網羅するcＤＮＡ クローンを同定した。オーバーラップクローンを同定し、ＰＡＣ125Ｄ9の部分的 Ｓau3Ｉ断片ゲノムライブラリのクローンから得られた配列を有するcＤＮＡ末端 の共直線化を検出することによって、複数回cＤＮＡクローンのキメラ現象を除 去した。この時点で、配列分析結果から、ＮＡＩＰ遺伝子のエクソン７から１３ に コードされたタンパク配列は、バキュロウイルスの２つのアポトーシス抑制タン パク(ＩＡＰs)と類似することが明らかにされた。その後まもなく、cＤＮＡプロ ーブを用いて近親婚のＳＭＡ家族から得たＤＮＡを含むサザンブロットをプロー ビングしたところ、欠失したバンドが明かになった。 どちらのＩＡＰもそのアミノ酸末端に80アミノ酸ＢＩＲ(バクロウイルスＩＡ Ｐ反復)モチーフを含んでおり、約30残基の介在配列の後ろで、33％の一致率で 重複していた(Ｃlem and Ｍiller，1993)。同じ現象はＮＡＩＰにも観察される 。エクソン６、７、８にコードされたアミノ酸185-250は、エクソン１０、１１ 、１２にコードされたアミノ酸300-370と35％相同であった。最も長い相同性は 、53アミノ酸配列領域全体に観察され、29のアミノ酸が一致していた。 さらに、ＩＡＰドメインのＮＨ2末端では、システインとヒスチジンが豊富な 亜鉛フィンガー様モチーフがＣpＩＡＰとＯpＩＡＰの両方のカルボキシ末端に存 在する。これらのモチーフはＤＮＡと相互作用することが知られている(Ｂirnba um et al.，1994)が、ＮＡＩＰ(表４)では認められない。ＮＡＩＰはアポトーシ ス抑制ドメインと連続性ＧＴＰ結合部位を挟む２つの膜貫通領域を含んでいる。 別のタンパク ドメイン プログラムの研究からは、以下のように、上記のタンパ ク ドメイン評価よりも特異的な結果が得られた。 １．残基 1-91：認識可能なモチーフがないＮ-末端ドメイン ２．残基 92-110：ＭＥＭＳＡＴプログラム(Ｊones et al.，1994)によって 膜spanningドメインであることが予知された疎水性ドメイン ３．残基 163-47：バキュウロウイルスのアポトーシス抑制タンパクと相同 性を示し、次の疎水性ドメインＧＴＰ／ＡＴＰ結合部位の直接上流に続くドメイ ン。 ４．残基 479-496：ＭＥＭＳＡＴによって膜spanningドメインであると予知 される疎水性ドメイン。 ５．残基 493-1232：４つのＮ−末端連結グリコシル化部位および１つの原 核脂質付着部位を含む受容体部位。 我々は、少なくとも３つのエクソンは400bpの5'未翻訳領域(5'ＵＴＲ)を含ん でおり、これ以外にも存在するであろうことを理解している。この領域の顕著な 特徴は、エクソン２の前の5'ＵＴＲの90bp領域と、エクソン２とエクソン３を架 橋する領域に完全重複領域が存在することである。さらに、エクソン１７を含む 3'未翻訳領域は550bp区間を含み、そこにはニワトリ内在性膜タンパク質であるo ccludin(Ｆuruse et al.，1993)との相同性が高く、ＧＲＡＩＬプログラムによ って検出される潜在性コード領域が存在する。これがキメラ転写物を表わしてい る可能性がある。occuldin相同配列は４つの異なるcＤＮＡクローンと遺伝子の ２つのアイソフォームに検出されている。推定上の３‘ＵＴＲを有するＮＡＩＰ 遺伝子のコード化エクソンを表すocculdin配列が、実際には異核ＲＮＡであると いう可能性は、3'ＵＴＲが観察されoccludin相同領域の上流に位置するフレーム 内翻訳停止コドンが存在することからすると、ありえないことである。予備的な ＲＴ−ＰＣＲ分析結果は、occludin系が転写されていることを示した。 組織発現 成人組織mＲＮＡを含有するノーザンブロットとエクソン１４プローブとのハ イブリダイゼーションの結果、成人肝臓(約６kbと約７kbのバンド)と胎盤(７kb のバンド、図６)にのみバンドが検出された。成人ＣＮＳでの発現レベルは、ノ ーザン分析法では可視バンドを生成するためには不十分であったが、脊髄、繊維 芽細胞、リンパ芽球ＲＮＡを用いてたＮＡＩＰ転写物の逆転転写酵素ＰＣＲ(Ｒ Ｔ−ＰＣＲ)増幅は、このような組織の転写活性を示唆した。 ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型の検出 ＰＡＣ連続系の解析において、クローン２３８Ｄ１２および３０Ｂ２が、ＮＡ ＩＰのエクソン６に位置するＰＡＣ１２５Ｄ９と高い配列相同性を示したが、こ れらのクローンはＰＡＣ１２５Ｄ９のＮotl部位を含んでいなかった。このこと は、ＮＡＩＰ遺伝子の重複コピーの可能性を示しており、そのため、さらに解析 を進め、ＰＡＣＤＮＡを含むサザンブロットとＮＡＩＰエクソンプローブとのハ イブリダイゼーションを行い、またＰＣＲ ＳＴＳに何が含まれているか評価を 行った結果、ＮＡＩＰ遺伝子座の異常型２種が検出された。すなわち、一つは、 エクソン２〜７が欠失したもの(ＰＡＣ ２３８Ｄ１２)で、他の一種は、エクソ ン６、７および１２〜１７が欠失したもの(ＰＡＣ ３０Ｂ２および２５０Ｉ７) である。サザン解析によってゲノムＤＮＡおよびＰＡＣＤＮＡに同じ大きさのバ ンドが存在することと、ＰＣＲの結果から、この欠失は、in vivoの状態よりも むしろin vitroでのＰＡＣアーチファクトを反映するものであるという可能性は 排除された。従って、ゲノムＤＮＡサザンブロットをＮＡＩＰエクソンプローブ とハイブリダズすると、現れたバンドの数 は、ＮＡＩＰ遺伝子の単一コピーをプローブとした場合に予想されるより多かっ た。例えば、ＢamＨＩ制限切断ゲノムＤＮＡ含有ブロットをＮＡＩＰエクソン３ −１１でプロービングすると、同一サイズの連続する14.5 kb ＢamＨＩフラグメ ントを含むバンドが正常なＮＡＩＰ部位に得られるはずである。(図１１)。とこ ろが、さらに２つのバンドが9.4と23 kb(図１１)に現れた。これは、それぞれＰ ＡＣ238Ｄ12と30Ｂ2/25017で見られる断片である。9.4kb ＢamＨＩ断片はコスミ ドからサブクローン化されたもので、欠失のあるエクソン８−11を含んでいるが 、この欠失は８番目のエクソンの直前にあるエクソン２から７を組み込んでいる （図１１）。23 kbのバンドはＢamＨi部位から6 kbが欠失して、２つの連続する 14.5 kbのＢamＨＩ断片がエクソン２〜５、および８〜１１を含む23 kb ＢamＨ Ｉ断片に置換し、その結果図１１に示したようにエクソン５および６が欠失する 。この欠失の左側は、プライマー1933および1926での増幅では遺伝子産物ができ るのに対し、1933および1923でのＰＣＲでは遺伝子産物が生成されない(データ 示さず)という事実によってマッピングされた。プライマー1927および1933を用 いてＰＣＲを行い、6 kbの欠失に及ぶ４．２kbの接合断片を増幅すると（図１１ ）、サイズおよび配列がゲノムＤＮＡおよびＰＡＣs30Ｂ2/25017において見られ るような増幅産物が得られた。様々なヒトゲノムＤＮＡに見られる９．４および 23kbバンドの用量が異なることから、ＮＡＩＰ遺伝子の２つの部分的欠失型は、 一般母集団に複数かつ多形性で存在することを示している。 非ＳＭＡヒト胎児脳のcＤＮＡライブラリから、エクソン１１および１２（方 式＃１）を欠失したクローンを同定し、そのうちの幾つかはさらにエクソン１５ および１６（方式＃２）も欠失していたことから、複雑さがさらに高まった。こ うしたエクソンの欠失はフレームシフトと非成熟タンパクの切断を生じさせると いう事実はそれらが正常なスプライシングの変形であるよりはむしろ、一般母集 団に存在する切断または欠失型ＮＡＩＰ遺伝子の転写結果である可能性の方が高 いことがわかる（図１１）。以上を総合すると、ＮＡＩＰ遺伝子部位の内部欠失 型および切断型は、幾つかは転写されるものであるが、これらの変異遺伝子の様 々なコピー数を含む領域のプロフィールが我々の分析から明らかになった。 ＮＡＩＰのエクソン プローブを用いて、体細胞変異ハイブリッドＨＨＷ１０ ６４(Gillian et al.，1989)のＤＮＡ含有試料をプロービングすると、ＮＡＩＰ 遺伝子の全ての形態が、この細胞系の第５染色体に含まれた５q１１−１３．３ の３０Ｍｂ欠失領域に限定されることがわかる。以上の知見は、ＮＡＩＰエクソ ン１３を プローブに用いておこなったＦＩＳＨ検出によっても確認されている（未発表デ ータ)。 ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異分析 ＰＣＲで増幅したＮＡＩＰエクソン３〜１０でゲノムサザンブロットをプロー ブすると、III型ＳＭＡ患者近親家系24561の発症者４例には、エクソン５および ６を含む4.8kbのＥcoＲＩ/ＢamＨＩ断片が欠けていることが判明した（図１１お よび１４)。この家系についてＢamＨiで消化したＤＮＡを同様に検出すると、14 .5kb バンドの欠失が認められ、前記のようにエクソン５および６の欠失に対応 した（図１１および１４）。やはり近親関係にあると考えられる他のフランス系 カナダ人家族２組にも、これと類似した結果が認められている。 このエクソン５および６の欠失を確認するため、このエクソンと相同のプライ マーを作成した(図１１の矢印で示すプライマー1893、1864、1863、1910、1877) 。家族24561と別のIII型ＳＭＡ近親家族のＤＮＡをエクソン５特異プライマー（ プライマー1864および1863）を用いて、ＰＣＲで典型的な増幅を行うと同時に、 エクソン１３配列を同時に反応させてＰＣＲが万が一エラーした場合にも対応で きるようにした例を図１５に示す。エクソン５の増幅が存在しないことが、ＳＭ Ａの表現型と共分離していることが見いだせる。 ＮＡＩＰ遺伝子におけるエクソン５および６の欠失がＳＭＡの突然変異に起因 するものかどうかを解析するため、サザン・ブロット解析をおこなった。エクソ ン５および６の6kb欠失の３‘末端直近にマップされる800bpのＥcoＲＶ単一コピ ーローブを使用した（図１１）。このマーカーをＥcoＲＩサザン・ブロットとハ イブリダイズすると、完全なＮＡＩＰ遺伝子部位のエクソン５および６を含む9. 4kbのＥcoＲＩ断片とエクソン５および６が欠失した３kbのＥcoＲＩバンドが検 出された。ここで、われわれのＤＮＡ診断ライブラリで得られた筋緊張性ジスト ロフィー、ＡＤＰＫＯおよび嚢胞性繊維症の家族の９００種以上に及ぶ縁せき関 係にない者のＤＮＡを含むＥcoＲＩのサザン解析試料について分析した。9.4kb のバンドは、全ての被検個体に認められたが、これは、約９００の被検者それぞ れにエクソン５および６が少なくとも一以上存在する事実と一致する。さらに、 被検者全てにこの３kbのバンドが認められたが、これは、一般母集団にエクソン ５〜６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子が何らかの形でほぼ全面的に遍在していること を示している。さらに、３kbのバンドの容量にバラツキがあることから、エクソ ン５−６の欠失したＮＡＩＰ遺伝子のコピーの数は多型性であり、おそらく、 ゲノム当たり４〜５コピーであろうと思われる。 次に、ＰＣＲ分析の範囲を拡大してエクソン５および６プライマーを用いて１ １０のＳＭＡ家族に適用した。Ｉ型ＳＭＡ患者３８例中１７例名(４５％)、およ びII型およびIII型ＳＭＡ患者７２例中１３例(１８％)に、このエクソンのホモ 接合欠失が認められた。染色体がランダムに並んでいると仮定し、エクソン５〜 ６の欠失したホモ接合個体の実測頻度の平方をとると、Ｉ型ＳＭＡの６７％とII 型／III型ＳＭＡの４２％について、エクソン５〜６の欠失した染色体が発現す ると予想される頻度予測値が得られる。次に、増幅がうまくいかなかったＳＭＡ 発症児の親１６８名についてＰＣＲ分析をおこなった結果、被検者３例において エクソン５および６のホモ接合欠失が示唆された。この知見は、今回のアッセイ には十分なＤＮＡによるサザン解析により、２例において確認された。この２名 は、年齢２８歳と３５歳でともにＳＭＡ発症児の親で、電話でのインタビューで 、体は健康で、ＳＭＡの発症はないと答えた。以上から結論として、単離された ＮＡＩＰのエクソン５〜６の欠失は、下記のようにＳＭＡ発症個体におけるより 重度の欠失を表わしているものとも思われるが、臨床学的には無害であることか ら、極めて軽微なＳＭＡか正常な表現型に関係しているものと思われる。以上の 個体について臨床学的評価が現在おこなわれている。 胎児脳のライブラリーとＰＴ−ＰＣＲ ＮＡＩＰ遺伝子産物から検出されたcＤ ＮＡのクローン(図２)から判断すると、ＮＡＩＰ遺伝子の多くの、そしておそら くは全ての切断されコピーは転写されているように思われる。ＳＭＡ患者でその ゲノムにエクソン４および５のコピーを持っていない者の親３名については、表 面上ＳＭＡの影響を受けていないと思われる状態を考えると、ＮＡＩＰのエクソ ン５〜６の欠失型も翻訳されていると考えられる。このモデルによると、エクソ ン５および６が欠けると、フレーム内で欠失が生じ、上流の最も長いＮＡＩＰの 読み取り枠が上流に伸びてヌクレオチド211位のエクソン３開始メチオニンにま で達する。 さらに、欠失したエクソン５および６のＩＡＰモチーフがコードするタンパク 配列は、エクソン１０および１１でコードされたＩＡＰモチーフに約３５％相同 である。このことは、エクソン５〜６が欠失した上記３例の個体において、識別 可能な表現型が存在しないことの理由となるかもしれない。モデルとして一つ考 えられるのは、各染色体上にエクソン５〜６が欠失したＮＡＩＰのコピーが一つ だけあると、ＳＭＡの弱い表現型が生じ、一方、エクソン４−５が欠失したＮＡ ＩＰ遺伝子座のコピーを３ないし４以上もつ個体の場合は、臨床学的に影響を受 けない ということである。ＳＭＡ遺伝子が重複することがこの疾患の基本条件であるの ではないか、という可能性が、ＤiＤonadoらによってこのほど提唱されている( １９９４年)。 ＳＭＡ組織および非ＳＭＡ組織由来のＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる増幅 ＳＭＡ患者と非ＳＭＡ患者のＲＮＡを鋳型とするＲＴ−ＰＣＲ増幅の結果を図 １６に示す。 ここで得た知見では、内部に欠失がみられ、かつ切断されたＮＡＩＰ遺伝子型 は、少なくともその一部は転写されていた。機能的タンパクを産生する正常なＮ ＡＩＰ遺伝子の転写と、生成しないものの転写とを区別するため、できるだけ大 きな転写体をＲＴ−ＰＣＲ増幅することを試みた。エクソン１４の大きさが2.2k bだとすると、これはエクソン２とエクソン１３の５’末端を含んだものである ことがわかった。第１回目のＰＣＲ後の臭化エチジウム染色段階では遺伝子産物 は検出されなかった。従って、先の図１６の説明のように二次の分枝増幅を行っ た。 ＲＴ-ＰＣＲ増幅実験の代表的な例を図１６に示す。すなわち、非ＳＭＡ組織 のＲＮＡを鋳型に使い、エクソン１０または１３からの逆転写産物をＰＣＲ増幅 すと、予想されたサイズの産物が一貫して増幅された。これとは対照的に、ＳＭ Ａ組織のＲＮＡを用いた同種のＲＴ−ＰＣＲ実験の結果、５例ではまったく増幅 が認められなかったが、これは、この５例においては正常な転写が著しく制限さ れたか、あるいは転写が行われなかったことを示す（図１６Ａ９）。ＳＭＡ組織 のＲＮＡは、死後わずか１２時間後に得られた。死後２４時間の正常な組織から 完全なＮＡＩＰ転写を増幅するのは困難でないから、今回の増幅に伴う困難の原 因はＲＮＡの劣化によるものだとは考えられない。また、増幅の困難性はＳＭＡ 組織すべてについても見られるが、これは、ＮＡＩＰが運動ニューロンでのみ転 写され、この運動ニューロンはＳＭＡではその細胞型を消失して居るために、脊 髄組織でのＲＴ-ＰＣＲが成功しなかたったという可能性を否定するものである 。 増幅が観察された事例では、ＲＴ-ＰＣＲ遺伝子産物の配列決定の結果、図１ ６Ａ，１６Ｂ，１６Ｃに示すように次の知見が得られた。 (i) 試料a９のエクソン５の３'末端からのコドン１５３および１９０の欠失 。 (ii) 資料a２のエクソン５プライマー1864およびエクソン１３プライマー1974 により増幅した産物において、７３番目ヌクレオチドにある終止コドンの エクソン７へのフレームシフトを生じさせるエクソン６の欠失。 (iii)試料a７のエクソン４のプライマー１８８６とエクソン１３のプライマー 1974により増幅された遺伝子産物への約５０ヌクレオチドの挿入。 (iv) 試料a３のエクソン５のプライマー1864とエクソン１３のプライマー1974 による増幅産物のエクソン１１および１２の欠失と合わせて、エクソン５のグル タミン酸コドン番号１５８の欠失。 (v) 試料a２、a３、a９、a１１においてエクソン９プライマー1844およびエ クソン１３プライマー1974による増幅産物において、終止コドン１４ヌクレオチ ドのエクソン１３へのフレームシフトを生じさせるエクソン１１および１２の欠 失。 以上を要約すると、エクソン１３からの逆転写産物に対するＰＣＲを行った結 果、１２例の非ＳＭＡ組織からは目的遺伝子産物がうまく増幅されたのに対し、 １２例のＳＭＡ組織では増幅が成功したのは１例に過ぎなかった。後者の場合、 すなわち、試料a１２においては、増幅が行われたのはエクソン１３から１４に 限られ、その転写には、エクソン２〜３あるいはエクソン１４〜１７が含まれて いるどうかは不明である。以上のデータは、ＮＡＩＰがＳＭＡの原因遺伝子であ るという強力な証拠であると考えられる。 ＮＡＩＰ蛋白質の役割 神経アポトーシス抑制タンパク遺伝子が第５染色体のＳＭＡ領域で発見された ことは、ＳＭＡの状態がアポトーシス抑制タンパクドメインにおける欠失の結果 によるものであることを示している。運動ニューロンが長時間生き残るかどうか は、神経アポトーシス抑制タンパクアが生成されるかどうかにかかっている。こ のアポトーシス抑制タンパクドメインの欠失は、このタンパク活性を阻害する。 我々は、ＳＭＡ患者全体の１７パーセント近くに、第５染色体のエクソン５およ び６の欠失が認められたことを実証した。 ５ｑ１３．１の同定領域にはＮＡＩＰ遺伝子の完全なコピーと一部欠失したも のが不定数含まれている。５ｑ１３．１には別に遺伝子座があってその突然変異 がＳＭＡ表現型の発現の原因となることは否定できないが、ＮＡＩＰ遺伝子の突 然変異はＳＭＡの発症には必要かつ十分であると考えられる。ほとんどの常染色 体性劣性遺伝病では、その原因となる突然変異が所与の遺伝子の単一コピーに認 められるのが通常であるが、これとは対照的に、ＳＭＡ染色体は、重度のＳＭＡ 突然変異の場合には、正常なＮＡＩＰ遺伝子のみならずエクソン３および４が欠 失した変異型も不足しているか、あるいは全く存在していないことによ って特徴づけられるということである。こうした染色体の出現に際しては、不均 衡なクロスオーバーが関与し、上記遺伝子座に欠失が生じ、その結果、ＮＡＩＰ 遺伝子産物が欠け、ＳＭＡが発症するように考えられる。 ＳＭＡの診断 所与の個体におけるＳＭＡの遺伝子型を説明することは、５ｑ１３．１領域に おけるＮＡＩＰ遺伝子の異常増幅によって複雑となる。ＮＡＩＰエクソン・プロ ーブでゲノムＤＮＡ含有サザンブロットをプロービングすると、ＮＡＩＰ遺伝子 の内部欠失型および切断型コピーから生じたバンドが見られる。従って、一般母 集団においては、多様な形態のＮＡＩＰ遺伝子座が不定数存在するのが正常であ り、それだけではＳＭＡ突然変異の判定要素とはならず、それ故に、ＮＡＩＰ遺 伝子の突然変異分析は複雑となる。ＮＡＩＰ遺伝子座の変異体を含有したゲノム ＤＮＡが検出されても、ＳＭＡ染色体の証拠とはならず、正常な遺伝子が欠損し ているかどうかを探求しなければならない。しかし、ゲノム中にエクソン３−４ のコピーがないにもかかわらず、臨床上は疾患の形跡がないという珍しい患者を 我々は検出した。これは、我々がＮＡＩＰ遺伝子構造について理解していること と一致する知見である。従って、ＳＭＡ染色体の同定は、完全なＮＡＩＰと、エ クソン３−４だけが欠失したＮＡＩＰ型の両方が不在であることに依存する。そ れが欠けているかどうかを検定する作業は複雑なものとなる。それは、ＮＡＩＰ 遺伝子座でもう一つ、欠失のさらに進んだ形のものそれぞれに正常なＮＡＩＰ断 片が存在するためにである。例えば、ＳＭＡ患者がそのゲノムにＰＡＣ ２３８ Ｄ１２と３０Ｂ２、すなわち各々エクソン１−６およびエクソン５、６と１１− １４が欠失したＮＡＩＰの欠失型（図１０、１１）だけを持っている場合、ＰＣ Ｒとサザン・ブロット解析ではＮＡＩＰのエクソン５−６だけが欠失した型を持 っていることになり、従って、ＳＭＡ染色体は含んでいないように見られる。我 々は、観察した多数のエクソン５−６の欠失したＳＭＡ患者の多く、おそらくは その大部分が、実際にこうした構造の染色体を持ち、欠失のないＮＡＩＰ遺伝子 座もエクソン５−６だけが欠失したＮＡＩＰ型も含んでおらず、何か別の遺伝子 座に重度な切断／欠失の認められる型を組み合わせたものを含有していて、その 結果、欠失のないＮＡＩＰの翻訳ができないのだと考えている。こうした解釈の 裏付けとなるのは、我々が、Ｉ型ＳＭＡ組織のＲＮＡにＲＴ−ＰＣＲを用いて、 正常なＮＡＩＰ転写体を増幅させることができないという事実による。 以上を総合して、ＮＡＩＰ遺伝子の突然変異またはその欠失がＳＭＡの原因と なるという見解を支持する証拠をあげると次のようになる。 (i) ＮＡＩＰは、バキュロウイルスのＩＡＰと相同性があることを考えると 、アポトーシスの抑制因子として作用する可能性が高いこと。この特性はＳＭＡ の病理と完全に呼応するものである。ここで注目に値するのは、従来より、アポ トーシスの調節遺伝子の変異がＳＭＡの原因ではないかと推測されていたことで ある(Ｏppenheim 1991，Sarnat，1992)。 (ii) 組換えの範囲内でのＮＰＩＡ遺伝子座のマッピングは重大なＳＭＡ区間 を規定すること、Ｉ型ＳＭＡと強い連鎖不平衡状態にあることが判明している３ 種の多型マーカー、すなわち、ＣＡＴＴ−４０ＧＩ(Ｍclean et al.，1994)、Ｃ 272(Ｍelki et al.，1994)およびＡＧ−１(ＤiＤonate et al.，1994)は全てＰ ＡＣ 125Ｄ9に位置し、ＮＡＩＰイントロン上に存在する(図９Ｃ)という事実。 (iii)Ｉ型ＳＭＡの表現型と５ｑ１３．１マーカーの間に見られる連鎖不均衡 の性質。我々は、非ＳＭＡ染色体でしばしば重複しているＣＴＴ-４０Ｇ１ ＣＴ Ｒ下位部位(Ｒoy et al.，1994)の欠失が、非ＳＭＡ染色体では４５％(ＭcＬean et al.，1994)であるのに対して、Ｉ型ＳＭＡでは８０％であることを見出して いる。この知見は、ＳＭＡ染色体におけるＮＡＩＰ遺伝子数の欠失とよく一致す る。同様に、Ｍelki et al.，1994は、Ｉ型ＳＭＡにおけるＣ272 ＣＴＲのバン ド数の減少を伴う“ヘテロ接合体不全”を観察し、彼らはこれを、染色体欠失を 反映するものであると提案している。ＤiＤonato et al.,(1994)もまた、非ＳＭ Ａ患者に比べて、Ｉ型ＳＭＡ患者ではＡＧ１ ＣＴＲ下位部位の数の著しい減少 を見出している。Ｉ型ＳＭＡ染色体でのこれらＮＡＩＰ内マーカーの欠失に関す る３つの研究グループの観察結果は、ＮＡＩＰ遺伝子の正常型とエクソン５−６ 欠失型双方の欠如または不在が疾患の原因となるというモデルと良く一致する。 (iv) ＮＡＩＰエクソン５−６の欠失割合は、非ＳＭＡ染色体での検出(２-３ ％)に比べて、ＳＭＡ染色体で検出される割合が著しく高い(Ｉ型ＳＭＡ染色体で 約６７％、II／III型ＳＭＡ染色体で４２％)。既に概観したように、この現象は 、ＳＭＡ染色体において正常なＮＡＩＰ遺伝子とともにエクソン５から６のみが 欠失したＮＡＩＰ変異型の双方が現象または不在であることを反映するものであ り、ＮＡＩＰ遺伝子のより重度な内的欠失型および切断型が表出されていると思 われる。 (v) １２名の非ＳＭＡ患者からのＲＮＡは全てＲＴ-ＰＣＲで増幅できたにも 関わらず、１２名中１１名のＳＭＡ患者からのＲＮＡの転写物は一貫してＲＴ- ＰＣＲ増幅することはできなかった。さらに、Ｉ型ＳＭＡ材料から得ることので き たＰＣＲ産物の配列を決定したところ、様々な突然変異と欠失が明らかになった 。 (vi) ＮＡＩＰ遺伝子の切断型および内的欠失型のコピーが不定数存在するこ とは、常染色体優性多発性嚢胞腎臓病(ＡＤＰＫＤ，Ｅuropean Ｐolycystic Ｋi dney Ｄisease Ｃonsortium，1994)で報告されている状況と類似している。この ケースの場合には、原因遺伝子に対応するプロセスされていない偽遺伝子の位置 が第１６染色体以外の場所にマッピングされることが見出されている。主な相違 点は、ＮＡＩＰの遺伝子座では、その遺伝子の突然変異型が増幅されるという点 である。 この点に関して、５ｑ１３．１のＮＡＩＰ領域は、ステロイド２１−ハイドロ キシラーゼをコードする遺伝子ＣＹＰ２１を含有する第６染色体の領域との類似 性が高い(Ｗedell and Ｌuthman，1993)。ＣＹＰ２１は突然変異すると常染色体 性劣性２１ハイドロキシラーゼ不全を引き起こすが、これは個体中のコピーが０ −３個の時に観察されている。また、この領域にはＣＹＰ２１の不活性の偽遺伝 子コピー(合わせて、ＣＹＰ２１Ｐという)が不定数存在する。ＣＹＰ２１の突然 変異体の大多数は２１ハイドロキシラーゼ不全で観察されているだけでなく、Ｃ ＹＰ21Ｐの幾つかの形態でも検出できることから、この偽遺伝子はＣＹＰ２１で 見られる突然変異の発生源として作用すると考えられる。切断および内的欠失を 有するＮＡＩＰ遺伝子が類似しているのはＣＹＰ21Ｐのみであり、ＣＹＰ21／Ｃ ＹＰ21Ｐについて想定される遺伝子変換の代わりに、機能性タンパクをコードす るＮＡＩＰ遺伝子形態を欠失させるような不均衡なクロスオーバーが染色体に生 じる可能性がある。５ｑ１３．１上における変異ＮＡＩＰ遺伝子の多型性の存在 は、上記のようにしてＳＭＡ染色体が発生する機序だと考えられる。 バキュロウイルスＩＡＰ ＮＡＩＰは、ＣpＩＡＰおよびＯpＩＡＰという昆虫細胞のアポトーシス抑制能 をもつ二種のバキュロウイルスＩＡＰと高い相同性を示す(表４)。昆虫の細胞ア ポトーシスはバキュクロウイルス感染によって生じるが、これについては十分に 実証されており、防衛メカニズムの一種と考えられている。感染した昆虫の細胞 が早期に死亡する結果、ウイルスの複製が弱められる(Ｃlem and Ｍiller，1994 a)。ＣpＩＡＰおよびＯpＩＡＰは、こうしたアポトーシスメカニズムに対するバ キュロウイルス反応を表すものであると考えられる。両タンパクとも互いに関係 なく作用し、宿主昆虫細胞アポトーシスを抑制することによってウイルスの 増殖を増加させる(Ｃlem and Ｍiller，1994a，1994b)。これらのタンパクは相 互にのみ強い類似性を有することが知られているが、最近までcrossphyla タン パクとの配列上の類似性は報告されていなかった。その作用形態は知られてはい ないが、ＤＮＡとある程度相互作用することものと想定されている。 ＮＡＩＰの働きおよび細胞局在性についてはまだ明らかにされていない。しか し、系統発生的にかなりかけ離れたＮＡＩＰ配列とバキュロウイルスＩＡＰ配列 との強い類似性と、先に想定したようなＳＭＡの発生病理における異常なアポト ーシスの役割とを考えあわせると、ＮＡＩＰは運動ニューロンにおいてアポトー シス抑制因子として作用する可能性が高い。ＮＡＩＰを用いて昆虫および哺乳類 の神経細胞にトランスフェクション・アッセイをおこなえばこの点が明らかにな るであろう。 一つの可能性は、ＮＡＩＰのカルボキシル末端が特異なリガンドに結合してＧ ＴＰの結合部位を活性化させ、それがＩＡＰドメインを活性化させるということ である。従って、運動ニューロンが生存できるかどうかは、リガンドが存在する かどうかで決まることになる。濃度が閾値以下に低下すると、ＩＡＰ領域は機能 が停止し、その結果、細胞が死ぬ。これは胚形成過程で観察される運動ニューロ ンが自然選別されるメカニズムと考えられる。リガンドは筋肉細胞あるいはシュ ワン細胞のいずれかから発生すると考えられる。以上から、運動ニューロンの胚 形成は細胞間における一種の競争と見ることができ、ＮＡＩＰの占有率を維持で きるだけの接触をおこなう細胞だけが生き残ることができるのである。 想定した通りにＮＡＩＰがアポトーシスを抑制するとしても、ＮＡＩＰがこれ までに特性化されていない哺乳動物のアポトーシス経路の成分であるのか、ヒト のアポトーシス抑制因子であるＢcl-2(Ｖaux et al.，1988; Ｈockenberry et l a.，1990; Ｇarcia et al.，1992)に関わる経路の上流成分(と考えられるもの) であるのかは不明である。アポトーシス抑制因子の欠落したバキュロウイルス株 を用いて検査した結果、Ｂcl-2はそのような欠落を補完はしないことが明らかと なった(Ｃlem and Ｍiller，1994b)。ＮＡＩＰがバキュロウイルスの機能的相似 体であるとすれば、この観察からわかることは、従来特性化されていない真核細 胞アポトーシスの経路においての何らかの役割が示唆される。可能性として一つ 考えられるのは、ＮＡＩＰは、神経栄養性サイトカイン、繊毛の神経栄養性因子 (ＣＮＴＦ，Ｒaff et al.，1993; Ｍeakin and Ｓhooter，1993)またはこの経路 の下流成分の一種(Ｓtahl et al.，1994)を伴った新規 なアポトーシスメカニズムとの交差を表わすということである。ＣＮＴＦナルマ ウスはＳＭＡと類似した病理学的態様を示し、ニューロンの正常な発達に続いて 最初は徐々にアポトーシス的欠失状態が続く(Ｍasu et al.，1993)。さらに、正 常な状態での神経栄養因子の剥奪は培養ニューロンにアポトーシスを生じさせる が、ＣＮＴＦだけではＢcl-1で救済されるようなアポトーシスを抑制することは できないということは注目すべきである。こうした知見に基づいて、その研究者 等は第２の真核細胞アポトーシス経路の存在を示唆している(Allstopp et al.， 1993)。このような別々の経路の存在は、脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)および ＣＮＴＦ(Ｍitsumoto et al.，1994)で処理後に、Ｗobblerマウスの突然変異体 における運動ニューロンの欠損が顕著に遅延することに見られる相乗効果を裏付 けるものかもしれない。 ＮＡＩＰの脂質付着部位の役割は知られていない。同種の部位は、通常はタン パクのアミノ末端にある原核タンパクのリーダー配列としての役割を果たすこと が知られている。我々は、Ｓwiss-Ｐrotein Ｄatabase(release-２８)の２１８ のヒト配列に共通パターンを検出した。これらの配列は多様な機能的背景に存在 する。例えば、トランスメンブラン領域、シグナル配列、細胞外領域および細胞 質領域などである。一つ考えられるのは、リポタンパク質付着部位は細胞外にあ り、インテグリンと細胞外マトリックスとのアポトーシス抑制性相互作用につい て想定されているような方法でシュワン細胞のプロテオリピッドの成分を結合す るということである(Ｍededith et al，1993; Ｆrish and Ｆrancis，1994)。さ らに、この付着部位は我々がノーザンブロット解析で観察した肝細胞のＮＡＩＰ においてはより積極的な役割を果たしているとも考えられる。また、ＳＭＡ発症 児には血清脂肪酸異常が検出されたことは注目に値する(Ｋelley and Ｓladky， 1986)。 ５ｑ１３．１の同定領域は、ＮＡＩＰ遺伝子の他に、ＮＡＩＰ遺伝子の内部欠 失／切断型のコピーも不定数含んでいる。完全なＮＡＩＰ遺伝子と、特定個人の ゲノムからエクソン５および６が欠失したＮＡＩＰ遺伝子座の両方が欠損または 不在であることがＳＭＡの原因でると我々は考えている。この点について、我々 はＮＡＩＰを同定したことにより、ＳＭＡの正確な分子的診断法を整備すること ができるだけでなく、このような疾病状態に対する伝統的な治療法と遺伝的治療 法とを公式化することがが可能となったのである。さらに、ＮＡＩＰ遺伝子座と ＮＡＩＰと相互作用するタンパクとの相同性を示す遺伝子の同定により、哺乳類 細胞におけるアポトーシスのメカニズムをさらに明らかとするための助けとなる か もしれない。実施例 Ｆamily Ｍaterial ＭacＫenzie et al，(1993)に記載の方法で、所定の診断基準を満足する患者 を対象に臨床的診断をおこなった。記載に従ってＤＮＡを抹消白血球から単離し た(ＭacＫenzie et al.，1993)。 遺伝的分析および連鎖不平衡分析 ミクロサテライト マーカーによる遺伝子型の決定は、ＭacＫenzie et al．( 1993)およびＭcＬean et al．(1994)に従って行った。既に述べたように、次の5 q13.1部位を用いた。Ｄ5Ｓ112(Ｂrzusowitcz et al.，1990)、Ｄ5Ｓ351(Ｈudson et al.，1992)、Ｄ5Ｓ435(Ｓoares et al.，1993）、Ｄ5Ｓ557(Ｆrancis et al .，1993)、Ｄ5Ｓ629およびＤ5Ｓ637(Clermont et al.，1994）、Ｄ5Ｓ684(Ｂrah e et al.，1994)、Ｙ98Ｔ、Ｙ97Ｔ、Ｙ116Ｔ、Ｙ122ＴおよびＣＭＳ(Ｋleyn et al.，1993)、ＣＡＴ(Ｂurghes et al.，1994;ＭcＬean et al.，1994)およびＭ ＡＰＩＢ(Ｌien et al.，1991)。 ミクロサテライトの繰返しで見られる複数対立遺伝子に対応できるパラメタを 用いて連鎖不平衡分析をおこなった。不平衡分析は元来複雑なことを考え、複数 の対立遺伝子に対応可能な計４種のパラメタを用いた。このパラメタとは、Ｈde rick(1987)に規定されているＤij、Ｄij'およびＤ'ならびにｘ²検定である。う ち２種、Dij，Dij'は筋緊張性ジストロフィーに関する以前の研究(Ｐodolsky et al.，1994)において後見的位置情報として最適であるとされている。患者とコ ントロール母集団はＭcＬean et al,(1994)のとおりである。 コスミド、ＹＡＣ、ＰＡＣの系列化 コスミドとＹＡＣ連続系列についてはＲoy et al.,(1994)に概要が述べられて いる。ＰＡＣはloannou et al.,(1994)の記載に従って作製した。以上の方法を 用いて合計175,000個のクローンからなるＰＡＣライブラリを３つ作製し、マイ コロタイター皿に個別クローンとして増殖させた(lannou et al.，結果未公表) 。３つのライブラリ(ＬＬＮＬ ＰＡＣ １、ＲＰＣＩ1、ＲＰＣＩ2と命名)を5q13 .1ＳＴＳ'sでスクリーニングした。ポジティブなＰＡＣを配列して、互いに連続 的にオーバーラップするように配置し、さらにＳＴＳを加えて解析するとともに 、単一 コピーのゲノムＤＮＡとcＤＮＡプローブを用いてＰＡＣ ＤＮＡを含有するサザ ンブロットをプロービングした。 ＤＮＡ操作および分析 ＰＡＣゲノムＤＮＡインサートをＢamＨＩ，ＢamＨＩ/Ｎotl、全および部分的 Ｓau3aＩ(5kbのインサートサイズに合わせて選択)で消化することにより、ＰＡ Ｃ 125Ｄ9インサートを含む４種のゲノム・ライブラリーを作製し、これをＢlue scriptベクターにサブクローニングした。Ｃhen et al．(1994)の方法により、 部分Ｓau３ＡＩ消化ライブラリーから得た５kbのクローン２００個について両末 端の約400bpの配列を決定した。 ＰＡＣのコード配列をＣhurch et al．(1994)に記載されたエクソン増幅法で 単離した。ＰＡＣをＢamＨＩまたはＢamＨＩおよびＢgl IIIで消化させ、サブク ローニングしてpＳＰＬ3を得た。各ＰＡＣのプールしたクローンをＣＯＳ−1細 胞にトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション後、ＲＮＡ全体を 抽出した。エクソンはpＡＭＰ10(Ｇibco，ＢＲＬ)にクローニングし、プライマ ーＳＤ２(ＡＴＧＡＡＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＴＧ ＡＣＡ ＡＧＣ ＴＧＣ）を用い て合成した。 ＡＢＩ ３７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサーによりＤＮＡの配列決定を行った。 λgt(Ｓtratagene)およびλＺＡＰ(Ｃlontech)の市販ヒト胎児脳cＤＮＡライブ ラリーを用いて転写物の候補を単離した。ノーザンブロットは市販品を入手し( Ｃlontech)、標準的な方法で検出を行った。 一般に、文献でＰＣＲ用に使用されるプライマーは６０℃のＴ_mＳに選択され たもので、９４℃、６０秒；６０℃、６０秒；７２℃、９０秒を３０サイクルと いう条件で使用される。ＰＣＲプライマーのマッピングは図面および本文に記載 の通りである。 プライマーの配列は下記の通りである。 ＲＴ−ＰＣＲ ７μｇの完全なＲＮＡを用い、２０μｌの反応溶液でcＤＮＡを合成した。こ のＲＮＡを５分間９５℃で変性し、３７℃で冷却した。５μｌ５×の逆転写緩衝 液、２μｌ0.1Ｍ ＤＴＴ、412.5mＭ dＮＴＰ、８単位 ＲＮＡsin、25ng cＤＮＡ プライマー(1285)および４００単位 ＨＭＬＶ(Ｇibco，ＢＲＬ)を添加後、４２ ℃で１時間逆転写反応を行った。その後、５０μｌＰＣＲの反応では鋳型として １μｌのＤＮＡを用いた。この一次ＰＣＲ１μｌを鋳型に用いて二次ＰＣＲ増幅 を行った。 配列分析 一次ＤＮＡ配列データをＴＥＤプログラムで編集した(Ｇleeson and Ｈillier ,1991)。部分Ｓau３ＡＩ消化ライブラリーの部分的にアミノ酸配列が決定されて いる5kbクローン２００のうちなるべく多数を、ＸＢＡＰ Stadenパッケージによ り配列し、オーバーラップする列にした(Ｄear and Ｓtaden，1991)。また、Ｇ ＣＧ Ｓequence analysis(Ｇenetics Ｃomputer Ｇroup，1991)により配列デー タを組立て、分析した。Ｐrocite proteinデータベース(Ｂairoch and Ｂutcher ，1993)を検索して蛋白質領域の相同性を検出した。ＭＥＭＳＴＡＴプログラム も使ってトランスメンブランドメイン領域の検索もおこなった(Ｊones e tal.， 1994）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ロバート ジー．コーネルク カナダ オンタリオ ケー１ジー ２エル ８ オタワ トウィード アヴェニュー 1901 (72)発明者 マニ エス．マハデバン ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ ウイスコンシン 53719 マデソン エ ーピーティー４ サウス グラモン ロー ド 818 (72)発明者 ミカエル マクリーン カナダ オンタリオ エヌ１ジー ４イー １ ゲルフ ハレスマナー シーアールテ ィ １ (72)発明者 ナタリエ ロイ カナダ オンタリオ ケー２ピー ０ゼッ ト５ オタワ マクレオド ストリート ６ (72)発明者 池田 穣衛 東京都目黒区上目黒５丁目31−１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 独占的な権利または特権が請求される本発明の態様は 以下のとおりに規定される： １． 染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子であって、約5.5kbか らなるエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１１までの制限酵素地図 が図８に示したとおりであるヒト遺伝子。 ２． 染色体5q13のＳＭＡ含有領域に位置するヒト遺伝子であって、約5.5kb か らなるエクソン１から１７までを含み、エクソン２から１６までの制限控訴地図 が図９に示したとおりであるヒト遺伝子。 ３． エクソン５から１６までが、配列番号２のアミノ酸配列と生物学的、機能 的に同等なアミノ酸配列を有するＮＡＩＰタンパクをコードする請求項１または ２のヒト遺伝子。 ４． エクソン５から１６までが、配列番号１のcＤＮＡ配列と生物学的、機能 的に同等なcＤＮＡ配列を有する請求項１または２のヒト遺伝子。 ５． 配列番号１のcＤＮＡ配列に対応するゲノムＤＮＡ、cＤＮＡ、mＲＮＡ、ア ンチセンスＤＮＡまたは相同ＤＮＡを含む精製ヌクレオチド配列。 ６． 配列番号１のＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子。 ７． 配列番号２を有するＮＡＩＰタンパクをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮ Ａ分子。 ８． 実質的に配列番号１のＤＮＡ配列からなる精製ＤＮＡ配列。 ９． 実施的に配列番号２のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列からなる精製ＤＮ Ａ配列。 １０．酸配列番号１の少なくとも１８連続塩基を含む精製ＤＮＡ配列。 １１．請求項１０のＤＮＡ配列を含むＤＮＡプローブ。 １２．請求項１０のＤＮＡ配列を含むＰＣＲプライマー。 １３．請求項１０のＤＮＡ配列を含むＤＮＡハイブリダイゼーション分子。 １４．ＤＮＡ配列が、表４のエクソン１から４および１７から選択される、請求 項１０、１１、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。 １５．ＤＮＡ配列が、表４のエクソン１から１６から選択される請求項１０、１ １、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。 １６．表４のエクソン配列１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、 １２、１３、１４、１５、１６および１７からなるＤＮＡ配列群から選択された 請求項１０、１１、１２または１３の精製ＤＮＡ配列。 １７．ＤＮＡ配列が、エクソン４、５、６および７から選択される請求項１６の 精製ＤＮＡ配列。 １８．ＤＮＡ配列が、エクソン５および６から選択される請求項１６の精製ＤＮ Ａ配列。 １９．クローニングベクターまたは発現ベクターの作成における、請求項１、２ 、３、４、５、６、７、８、９または１０のＤＮＡ配列の使用。 ２０．請求項１、２、３、４、５、６、７、８または９のＤＮＡ配列にコードさ れているＮＡＩＰタンパク。 ２１．請求項１０のＤＮＡ配列の連続４５塩基にコードされているＮＡＩＰタン パクの１５アミノ酸断片。 ２２．配列番号２のアミノ酸配列と生物学的に同等のアミノ酸配列を含むＮＡＩ Ｐタンパク。 ２３．実質的に、配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＡＩＰタンパク。 ２４．配列番号２の少なくとも１５連続アミノ酸を含むＮＡＩＰタンパク断片。 ２５．エクソン５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５およ び１６のいずれか一つにコードされたポリペプチド群から選択されたアミノ酸配 列を含むＮＡＩＰタンパク断片。 ２６．選択されたポリペプチドが、エクソン５、６、７、８、９、１０、１１ま たは１２にコードされたポリペプチドである請求項２５のＮＡＩＰタンパク断片 。 ２７．選択されたポリペプチドが、エクソン５および６にコードされたポリペプ チドである請求項２５のＮＡＩＰタンパク断片。 ２８．ハイブリドーマの作成における、請求項２０、２１、２２、２３、２４、 ２５または２６のアミノ酸配列の使用。 ２９．生物標本を分析してＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の有無を診断す る方法であって、 i) ヒト染色体5q13のＳＭＡ関連領域から生物標本を単離し、 ii) 生物学的測定を行い a) 配列番号１のＮＡＩＰコードＤＮＡ;および b) 配列番号２のＮＡＩＰタンパク からなる群より選択された少なくとも一方が上記生物標本に存在するか否かを決 定する方法。 ３０．ステップii)において、a)群またはb)群の配列の突然変異が測定される請 求項２９のヒトＭＡＳ発症リスク診断方法。 ３１．a)群のエクソン５および６の有無が測定される請求項３０の方法。 ３２．ＮＡＩＰタンパクをコードする遺伝子の第５染色体における正常コピー数 さらに決定する請求項３１の方法。 ３３．生物学的測定が、ＤＮＡハイブリダイゼーション、制限酵素分析、ＰＣＲ 増幅、mＲＮＡ検出およびＤＮＡ配列決定からなる群より選択される測定である 請求項２９、３０、３１または３２の方法。 ３４．生物学的測定が、エクソン５の5'領域およびエクソン６の3'領域から選択 されたＰＣＲプライマーの使用によるエクソン領域５および６のＰＣＲ増幅であ る請求項２９、３０、３１または３２の方法。