JPH10508865A - 抗炎症性活性を有するペプチド - Google Patents
抗炎症性活性を有するペプチドInfo
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Abstract
(57)【要約】
結核菌(Mycobacterium tuberculosis)からの10Kda熱ショックタンパクの少なくとも25%が1〜25フラグメントと相同な配列を有するアミノ酸25個からなるペプチドを開示する。本発明のペプチドは抗炎症性活性を有する。
Description
【発明の詳細な説明】
抗炎症性活性を有するペプチド
本発明は熱ショックタンパクのペプチド誘導体および炎症性病変の治療へのそ
の利用に関する。
熱ショックタンパク(以下”HSP”と表示する)はストレス状態下の細胞、
特にミコバクテリアによって生産される。ミコバクテリア等の原核生物は高濃度
のHSPを発現し、その一部、例えば65kDタンパクは免疫優性抗原であり、
したがってワクチン例えば抗結核菌ワクチンとしての利用が期待される[(Ka
ufmann,S.H.E.ら,Eur.J.Immunol.,17,351
(1987)]。WO89/12455には、このような系統のタンパクまたは
そのフラグメント、特に65kDタンパクの非ウイルス性感染に対するワクチン
としての利用および免疫反応の誘導に関してヒントが示されている。
当該系統に含まれる特定のタンパクは、各種の病変に有用であると記載されて
いる。例えば、WO 90/10449には、65kDのHSPの診断薬としての
利用およびインシュリン非依存性糖尿病治療への利用が開示されている。当該タ
ンパクは、自己免疫性関節炎の発現に関与するミコバクテリア特異性エピトープ
を有することが知られている[Gaston,J.F.ら,Nature,33
1,171(1988)]。
10kDの分子量を有するHSPの配列はBaird,P.N.ら,J.Ge
n.Microb.,135,931−939(1989)によって開示され、
結核菌BGCから得られることが記載されている。一方、Mehra,V.ら,
J.Exp.Med.,175,275−284(1992)は、らい菌(My
cobacterium leprae)から得られた同一分子量の相同性タン
パクを開示している。Barnes,P.F.ら,J.Immun.,148,
1835−1840(1992)は、結核菌から得られた10kDタンパクが高
い免疫反応性抗原であり、抗結核ワクチンとして有用であることを開示している
。Hartman,D.J.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,89,3394−3398(1992)は、哺乳類において前記の文献に記
載されている10kDタンパクと相同なタンパクを同定している。
本発明者らは、結核菌のHSPの1〜25フラグメントと少なくとも25%が
相同な配列を有するアミノ酸25個からなるペプチドが抗炎症性活性を有するこ
とを発見した。
したがって、本発明は、25%またはそれ以上が相同で、以下のアミノ酸配列
(配列識別番号1)を有する25個のアミノ酸からなるペプチドに関する。
NH2−Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Glu A
sp Lys Ile Leu Val Gln Ala Asn Glu Ala Gl
u Thr Thr Thr Ala Ser−OH
ここで、N−末端はアシル化されていてもよい。
特に、アミノ酸配列Iを有する1〜25のペプチドが好ましい。
前記ペプチドは炎症性病変の治療、特にリュウマチ様関節炎の治療に有用であ
る。
本発明に係わるペプチドは、従来の化学的ペプチド合成法によって合成する。
この方法は、本来Merrifield,R.B.によって開発された固相法(
Biochemistry 1964,3,pp.1385;The Pept
ide 1979,2,pp.1−284, E.Gross & J.Mei
enhofer編)である。別の方法として、同様に固相で、フロー法を適用し
、場合によって側鎖を酸に不安定な基で保護したFmoc−アミノ酸を用いて合
成することもできる[Atherton,E.& Sheppard R.C.
,”Solid phase peptide synthesis −a P
ractical approach”,IRL PRESS,Oxford,
1989]。後者の場合、市販の自動的または半自動的合成装置(例えば、Mi
lligenR 9050)を用い、固体保持相としてこの合成法に適した樹脂
(例えば、Novabiochem製樹脂NovaSynRまたはMillig
en KA製樹脂PepSynR)を使用する。通常これらの樹脂はノルロイシ
ン残基(内部標準アミノ酸として)を含み、これに合成を行うペプチドを捕捉す
るためのアンカー剤が結合している。アンカー剤は、例えばp−ヒドロキシメチ
ル−フェノキシ酢酸であってもよい。この場合、市販の樹脂のうち、エステル結
合によって樹脂に結合した最初のアミノ酸の保護誘導体のみを含む樹脂であって
も
よい。一般に、いずれの場合も合成装置製造業者によって提供された標準操作法
および当該分野の専門家にとっては容易に予想できるその改良法にしたがって、
当該装置を用い、ジメチルホルムアミド(DMF)に溶解させた20%ピリジンを用
いた脱保護、DMFを用いた短時間の反復洗浄、アシル化、再度DMFを用いた
反復洗浄からなる一連の操作を自動的に行ってペプチドの合成を行う。ペプチド
を組み立てるための活性化エステルとして単一の保護アミノ酸を用いる。前記エ
ステルは、例えばフェノール系エステルまたは1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾ
ールまたは3−ヒドロキシ−4−オキソ−3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベン
ゾトリアジンエステルまたはそれらの類縁体として、あらかじめ形成させるか、
市販のものを使用するか、単離することなくin situで合成する。実際に
は、適切に保護されたアミノ酸を、選択したフェノール誘導体例えばペンタフル
オロフェノール、または1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール(HOBT)また
は3−ヒドロキシ−4−オキソ−3,4−ジヒドロ−1,2,3−ベンゾトリア
ジン(HODhbt)の存在下で、例えばジシクロアルキル−カルボジイミド、
ジアルキル−カルボジイミドまたはベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−ト
リス−(ジメチルアミノ)−ホスフォニウムヘキサフルオロホスフェート(BO
P)およびそれらの類縁体等の濃縮剤と反応させる。各濃縮工程で、アミノ基に
対して4倍量を使用する。合成段階終了時に、当該分野の専門家にとっては自明
の手順のいずれかを用いて樹脂からペプチドを分離する。例えば、樹脂−ペプチ
ド0.5gを90%トリフルオロ酢酸(TFA)、5%チオアニソール、3%エ
タンジチオール、2%アニソールの混合液約10mlに懸濁させ、窒素を充填し
、軽く撹拌しながら室温に4時間保つ。ついで、アイスバスで冷却した10〜2
0倍量のエチルエーテル中に直接濾過する。濾過または遠心分離により沈澱を集
め、一夜真空乾燥する。ペプチドを適当な緩衝液に溶解させ、凍結乾燥する。別
の方法として、樹脂−ペプチド0.5gを、1Mのトリメチル−シリル−ブロマ
イド(Me3SiBr)、1Mのチオアニソール、0.25Mのエタンジオール
を含むトリフルオロ酢酸液約25mlに懸濁させ、窒素を充填し、軽く撹拌しな
がら全体を0℃に1時間保つ。ついで、樹脂を濾過し、少量の純TFAで洗浄す
る。濾液を濃縮乾固し、残渣をエチルエーテル中で摩砕し、濾過または遠心
分離し、ついで一夜真空乾燥する。ペプチドを適切な緩衝液に溶解させ、凍結乾
燥する。
以下に実施例をあげて、本発明をさらに詳細に説明する。
実施例結核菌からのHSP−10の1〜25フラグメントの合成 配列:H−Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Glu sp Lys Ile Leu Val Gln Ala Asn Glu Ala G lu Thr Thr Thr Ala Ser−OH
固体保持体[Fmoc−Ser(tBu)−PepSyn KA(100);
樹脂置換容量0.09mmol/g]をMilligenR9050合成装置のカ
ラムに充填し、一連の標準的な脱保護およびアシル化に供した。用いた各単一ア
ミノ酸残基はα−アミノ基をFmocで保護したものであり、一方側鎖の保護基
はリジンではtert−ブチルオキシカルボニル(Boc)とし、アスパラギン
酸、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンではtert−ブチル(tBu)と
した。このように保護したアミノ酸は、HODhbtとしてあらかじめ活性化し
たセリンおよびスレオニンを除き、いずれもペンタフルオロフェノールエステル
としてあらかじめ活性化した。約60分間で単一および/または二重カップリン
グサイクルによって、C−末端アミノ酸から各単一残基を順次組み込んだ(モル
濃度で4倍量)。樹脂からのペプチドの最終解裂および側鎖からの保護基の解離
は、前記の手順を用い、ペプチド−樹脂0.5gの規模で行った。凍結乾燥後、
粗ペプチド(分子量:2684;理論収量120mg)100mgが得られ、収
率は83%であった。50mgを半精製逆相カラム(Vydac C4,25x
1cm)に載せ、溶出溶媒A)0.085%TFA水溶液で平衡させ、溶出溶媒
B)アセトニトリル:水(80:20)中0.085TFAを用い、流速3.0
ml/分で0.27%B/分のグラジエント溶出を行った。このようにして13m
gの製品を得、粗ペプチドに対する最終収率は26%であった。ペプチドの相対
純度は、逆相Vydac C4カラム(150x4.6mm)を装着したHPL
Cを用い、溶出溶媒A)水:アセトニトリル(98:2,v/v)中0.045
%および溶出溶媒B)アセトニトリル中0.036%TFAのグラジエント溶出
により測定した。
ペプチドのアミノ酸組成(表1)は、1%(v/v)のフェノールを含む6N
HClを入れた密封小型瓶中で110℃、真空下で22時間加水分解した後、
BECKMAN System Gold 126アミノ酸分析計で測定した。
ペプチド含有量は、88%であった。ペプチドの分子量は、質量スペクトロメー
タ(BIOMASSスペクトロメータ、エレクトロスプレーイオナイザー、クア
ドルポール、精度0.05〜0.01%)で測定した。理論値:2684;分析
値:2684。
本発明に係わるペプチドは、以下に述べる薬理試験(アジュバント関節炎試験
)によって明らかなように各種の起源の異なる炎症性病変の治療に有用である。
熱処理によって不活性化した結核菌(系統C、DTおよびPN;Centra
l Vet. Labs−GB)を滅菌パラフィン油に10mg/mlの濃度で
懸濁させ、0.1mlをCO2麻酔下のWistar系ラット15匹(C.Ri
ver;体重130〜140g)に皮内注射した。ラットを各群5匹の3群に分
け、前記の処置から4、5および6日後に関節炎誘導と同じ手順を用い、第1群
にはPBS 100μlに溶解させたペプチドIを50μg/ラット、第2群に
はPBSのみを投与し、第3群はなにも投与しなかった。以下の臨床学的採点法
を用い、関節炎の発症を追跡した。評点
症状
0 炎症なし
1 軽度の発赤および足底の腫脹
2 腱が判別できないほどの足底の腫脹
3 足関節にまでひろがった腫脹
4 顕著な炎症および足関節の変形
各足底の評点を0〜4までとし、さらにタイに(on the tie)小結
節が認められた場合は別の評点を用い、耳にまで影響が認められた場合にはさら
に別の評点を用いた。したがって、最低0から最高18までの評点を用いた。
結果を表2および3に示す。
したがって、本発明の目的は前記のペプチドを炎症性病変の治療に用いること
である。前記の用途に関連した工業的側面を考慮すると、製剤組成物とすること
も含まれる。期待される医薬品としての用途として、本発明に係わるペプチドは
非経口的投与用の製剤組成物として調剤し、特に皮内、皮下および関節内に注射
できる製剤に調剤して投与する。皮内および皮下注射用製剤に関しては、有効成
分を再蒸留水に溶解させ、必要であればデキストロースまたは塩化ナトリウム等
の等張剤、p−ヒドロキシ−ベンゾエート等の抗菌性物質および緩衝液、例えば
PBS等のリン酸緩衝液を添加してもよい。関節内注射用製剤に関しては、前記
のような等張剤をその他の医薬品添加物とともに添加する必要がある。また有効
成分は、4〜8%のマンニトールまたはラクトースを含む復元可能な凍結乾燥製
品として製剤することもできる。薬量は治療すべき病変の種類および強さ等の各
種のパラメータおよび患者の状況(体重、性別、年齢等)によって異なることは
言うまでもない。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項
【提出日】1996年11月4日
【補正内容】
請求の範囲
1.アミノ酸配列Iを有するペプチド
2.有効成分として請求項1に記載のペプチドと適当な担体を含む医薬用調製物
3.請求項1に記載のペプチドの炎症性病変治療用医薬調製物への利用
4.請求項1に記載のペプチドのリウマチ性関節炎治療用医薬調製物への利用
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U
G),AL,AM,AT,AU,BB,BG,BR,B
Y,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE,ES
,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KG,KP,
KR,KZ,LK,LR,LS,LT,LU,LV,M
D,MG,MK,MN,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,
TT,UA,US,UZ,VN
(72)発明者 フォサッティ、ジャンルカ
イタリア国 イ−20099 セスト エッセ.
ジョヴァンニ ヴィア ジー. カルド
ゥッチ 125
(72)発明者 マスカニ、パオウロ
イタリア国 イ−20099 セスト エッセ.
ジョヴァンニ ヴィア ジー. カルド
ゥッチ 125
(72)発明者 グロモ、ジャーンニ
イタリア国 イ−20099 セスト エッセ.
ジョヴァンニ ヴィア ジー. カルド
ゥッチ 125
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.少なくとも25%が相同で、以下のアミノ酸配列I:NH2−Ala Lys Val Asn Ile Lys Pro Leu Glu Asp Lys Ile Leu Val Gln Ala Asn Glu Ala Glu Thr Thr T hr Ala Ser−OH(I)を有する25個のアミノ酸からなり、必要に応 じてN−末端がアシル化されているペプチド 2.アミノ酸配列Iを有する請求項1に記載のペプチド 3.有効成分として請求項1または2に記載のペプチドと適当な担体を含む医薬 用調製物 4.請求項1または2に記載のペプチドの炎症性病変治療用医薬調製物への利用 5.請求項1または2に記載のペプチドのリウマチ性関節炎治療用医薬調製物へ の利用
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