JPH10508479A

JPH10508479A - 天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生

Info

Publication number: JPH10508479A
Application number: JP8515108A
Authority: JP
Inventors: ゴック，ティアンギアン; バン，ハンス; ウーレン，マティアス; スタール，ステファン; アイクニグレン，ペール
Original assignee: ピエール、ファーブル、メディカマン
Priority date: 1994-11-07
Filing date: 1995-11-07
Publication date: 1998-08-25
Also published as: CA2204511A1; NZ296562A; EP0791059A1; WO1996014409A1; AU704594B2; ZA959417B; FR2726576A1; FR2726576B1; AU4120096A

Abstract

(57)【要約】細胞による上記ペプチドの発現および分泌のための要素と、ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域に少くとも１つの改変を有する点で天然ペプチド配列と異なるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする配列とを含んでなる核酸構築体により形質転換された細胞を培養して、そのペプチドおよび／またはその組換えペプチドを保有した細胞を回収することにより、少くとも１つの疎水性領域を有する天然ペプチドのアナログとして生物学的に活性な組換えペプチドを分泌させるための方法。得られた組換えペプチド、対応ＤＮＡ配列およびそれを含有した細菌も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】天然疎水性ペプチドアナログとしての組換えペプチドの産生本発明は、天然ペプチドのアナログであって、これら天然ペプチドの生物活性を留めている組換えペプチドに関する。これらのペプチドは異なるタイプの細胞により発現させることができ、それらの産生は天然ペプチドの場合と比較して改善されている。ペプチドはアミノ酸の鎖、即ち、オリゴペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質から構成されるあらゆる物質を意味すると理解されている。ペプチドは様々な生物学的性質を有しており、それらを生物学的産物から精製するために用いられる技術に伴う混入の問題を特に避けるために遺伝子操作によりそれらを産生する強い要求があった。しかしながら、組換え経路によるペプチドの産生は発現系および宿主細胞に伴う難しい問題を有する。事実、それらの回収を容易にするためには、細胞外培地、またはグラム陰性細菌の場合にはペリプラズムスペースでそれらを得る上で、細胞膜を通してペプチドが分泌されることが望ましい。膜につないだ配列に融合された形でペプチドを発現させられる系は、膜表面に共有結合された融合産物を得られるように、細胞、特に細菌中に導入させることができる。この理由から、出願人らは、ＲＳＶに対するワクチンを製造することと共に、ポリペプチド配列をコードする遺伝子でヌクレオチドの部位特異的変異誘発により点修飾を行うことができる組換えＤＮＡ方法を開発したが、その方法は特に呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）に対する経口ワクチンを得る上で有用である。呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）は新生児における呼吸病：気管支肺症（細気管支炎）の最も多い原因である。ＷＨＯは毎年５千万件のＲＳＶ感染があって、全世界で１６０，０００人が死亡しているとみている。２つのサブグループのウイルスが存在している（サブグループＡおよびＢ）。ＲＳＶは Paramyxoviridae科 Pneumovirus属に分類され、１０の特異的タンパク質をコードする負極性の非セグメントＲＮＡゲノムを有している。現在、ＲＳＶに対するワクチンは入手できない。不活性化ウイルスワクチンは無効であることが示され、時には乳幼児の感染症を悪化させることさえある。ホルマリン不活性化ＲＳＶで予防接種する１９６０年代の試みは失敗に終わった：ＲＳＶによる再感染から保護する代わりに、ワクチンは幼児で疾患を悪化させる作用を有していた。出願ＷＯ８７／０４１８５は、タンパク質Ｆ（融合タンパク質）またはプロテインＧと称されるエンベロープタンパク質、２２Ｋｄの糖タンパク質、９．５Ｋｄのタンパク質または主要キャプシドタンパク質（タンパク質Ｎ）のような、ワクチン目的向けのＲＳＶ構造タンパク質の使用について提案した。出願ＷＯ８９／０２９３５は、適宜にモノマーまたは脱アセチル化形で修飾された全体ＲＳＶＦタンパク質により有される保護性質について記載している。Ｆタンパク質の一連の断片は、それらの中和性質を確かめる目的でクローニングされた。しかしながら、今まで試験されてきた免疫ワクチンは無効であることがわかったか、または肺の症状（細気管支炎または気管支周囲炎）を誘導した。現時点において、ＲＳＶによる感染症の基本的治療法はない。上気道のＲＳＶ感染症：治療は他のウイルス感染症の場合と同一の対症薬物療法に本質的に基づいている。下気道のＲＳＶ感染症：離乳していない幼児の場合、治療は適当な水分を維持し、分泌物を吸引して、必要であれば酸素を与えることに基づいている。正の効果は、インビトロでＲＳＶに対して活性であるヌクレオチド、リバビリンで観察された。ワクチンの投与を容易にするために、経口で活性であり、良好な免疫を生じて、副作用が減少した製品を利用できるようにすることが望ましい。出願人らは、Escherichia coliおよびStaphylococcus xylosusで機能する、シャトルベクターとも称される新規ベクター系を作った：そのベクターは分泌シグナル配列Ｓと、Staphylococcus aureus タンパク質Ａに由来する膜アンカー領域ＸＭを含んで、１以上の遺伝子が挿入できるクローニング部位をＳとＸＭとの間に有している。ペプチドが膜から容易に通過させるために、分子の疎水性はある場合に改変されねばならない。それにもかかわらず、これらの改変は産物の生物学的、特に免疫学的な性質を変えてはならない。この理由から、本発明は、アミノ酸配列が上記疎水性領域で少くとも１つの改変により天然ペプチドの配列と異なるペプチドをコードし、かつそのペプチドが細胞により発現および分泌されることを確実にする要素を含んだＤＮＡ構築体が細胞中に導入される工程を含み、細胞が培養された後にそのペプチドおよび／またはその組換えペプチドを保有した細胞が回収されることを特徴とする、少くとも１つの疎水性領域を有した天然ペプチドのアナログである生物学的に活性な組換えペプチドを産生するための方法に関する。好ましくは、アミノ酸配列は１つの領域で少くとも改変されていて、そこは天然ペプチドのトランスメンブレン領域とは異なっている。改変は、ペプチドで関心ある生物学的活性にとり必須でなく、保存しておくべき領域で好ましくは行うべきである。この方法では組換え産物を宿主細胞の膜から通過させる構造を改変するために変えられた構造遺伝子に機能性分泌シグナル配列が連結されている組換えＤＮＡ構築体を用いるが、オリジナル構造遺伝子の組換え産物はそれが同様の分泌シグナル配列と連結されたときにこれを行えない；組換え産物の構造的修飾は、発現組換え産物の宿主細胞で位置を変えながら遺伝子操作により行われるべきである。本発明の一面によれば、改変は組換え産物の疎水性を修正することに向けられている。したがって、本発明は、遺伝子の構造的改変によって天然ペプチドの配列の少くとも１つの疎水性アミノ酸が非疎水性アミノ酸に代えられたペプチドに至る、組換えペプチドを産生するための方法に関する。もう１つの態様において、少くとも１つの疎水性アミノ酸は組換えペプチドにおいて天然ペプチドの配列から欠失されている。有利には、疎水性アミノ酸は下記群：トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから選択される。遺伝子の構造的改変は、ヌクレオチドを挿入するか、またはヌクレオチドを欠失させることにより行える。遺伝子の構造的改変が部位特異的変異誘発でヌクレオチドを置換することにより行われた構築体も、本発明に含まれる。遺伝子の構造的改変は、組換え産物が膜つなぎ止め部分への共有結合により細胞の膜表面で露出されるように、その位置を変えることであってもよい。もう１つの態様において、遺伝子の構造的改変では組換え産物が培地中に分泌されるようにその位置を変えることができる。したがって、本発明は、組換えペプチドをコードしてそのペプチドの輸送と細胞外へのその分泌を確実にするＤＮＡ配列と機能的に連結された分泌シグナル配列を含んでいるＤＮＡ構築体にも関する。もう１つの面によれば、本発明はＤＮＡ構築体が上記ペプチドをコードしてそのペプチドを宿主細胞の膜から輸送させて膜につなぎ止めるＤＮＡ配列と機能的に連結されたシグナル配列を含むことを特徴とする方法に関する。本発明は、本方法により得られる組換えペプチドにも関し、それらは天然ペプチドの疎水性領域における少くとも１つの改変により天然ペプチドと異なっていることを特徴とする。それらは宿主細胞の表面につなぎ止めることができる。これらのペプチドはＲＳＶ構造タンパク質のアナログまたはこのようなタンパク質の断片の中から特に選択され、更に詳しくは組換えペプチドは、ＲＳＶのプロテインＧのアナログ、サブグループＡまたはＢ、特にＲＳＶプロテインＧの残基１３０〜２３０であって、少くとも８０％の相同性を示す配列を含んでなる。プロテインＧは、８４〜９０Ｋｄの分子量を有して、メチオニンに乏しいＲＳＶエンベロープ糖タンパク質である。プロテインＧの配列はＲＳＶのＡおよびＢサブグループで異なり、本出願で用いられるとき、“プロテインＧの配列”という用語は、他で指摘されないかぎり、サブグループＡ配列またはサブグループＢ配列の一方および双方であると理解されている。出願人は、天然Ｇタンパク質のアミノ酸１３０〜２３０間に包含された配列が、全ホルモル不活性化ウイルスに基づくワクチンで観察されるかまたは全ＦおよびＧタンパク質で観察される病状を誘導することなく、ＲＳＶサブグループＡおよびＢによる感染に対して有効な保護を誘導する上で特に適していることを証明した。ポリペプチドを発現させるための手段は当業者に知られており、用いられる細菌に応じて適合される。好ましくは、ＤＮＡ配列はシャトルプラスミドのようなプラスミドの形で導入される。ＲＳＶタンパク質はワクシニアウイルス、バキュロウイルスまたはアデノウイルスのような異なる発現系で以前に発現されてきた。しかしながら、潜在的な問題が残留ウイルス粒子の存在に伴う。その態様の１つにおいて、本発明による方法では、ヒトと共生して、非病原性であって、食用である細菌を用いる。特に、その細菌はStaphylococcus属に属し、即ち長年にわたり食品産業で用いられてきた細菌であるStaphylococcus xylos usが生きた状態で経口投与できる。S.xylosusの表面で異種エピトープを発現するための系は、特にN′guyen et al.,Gene,1993,128:89-94に記載されている。好ましくは、異種ポリペプチドは天然プロテインＧの対応エピトープの場合と本質的に同一なコンホメーションで、細菌の膜表面で発現される。細菌の膜表面における組換えタンパク質の提示は、その化学的性質とそのペプチド配列に依存している。ＲＳＶプロテインＧの天然配列が使用でき、配列番号１または配列番号２を含んだペプチドをコードするＤＮＡ配列が導入できる。本発明の一面によれば、プロテインＧのアミノ酸１３０〜２３０間に包含された配列において、１７３および／または１８６位のアミノ酸システインはジスルフィド架橋を形成しないアミノ酸、特にセリンに置き換えられている。このような変異は１７６および１８２位に残留するシステイン残基間でジスルフィド架橋の形成を促し、その架橋は配列の免疫原性にとり重要であって、このような変異は整合性のないジスルフィド架橋の形成を避ける。このような方法を行う上で有用なペプチドは、特に配列番号３または配列番号４の１つを含んだものである。本発明のもう１つの面によれば、ＲＳＶプロテインＧに相当する異種ポリペプチドの配列において、プロテインＧ配列の１６３、１６５、１６８および／または１７０位に相当するフェニルアラニンアミノ酸は極性アミノ酸、特にセリンに置き換えられている。この改変は既に記載された変異と組み合わせることができる。このようなポリペプチドは特に配列番号５を示す。その方法を行うとき、１７６および１８２位においてシステインアミノ酸間でジスルフィド架橋により形成される重要なループの上流に位置する疎水性領域を抑制すれば、組換えタンパク質を細菌膜からもっと容易に通過させて、膜表面で正確にその免疫優性部分を露出させることができる。本発明の更にもう１つの面によれば、アミノ酸１６２〜１７０間に包含された配列はＲＳＶプロテインＧに相当するペプチド配列で欠失されている。更に詳しくは、細菌で発現される異種ペプチドの配列は配列番号６を含むことができる。本発明には、本出願で記載された方法により得られるペプチドまたはタンパク質を発現する細菌も含む。上記細菌は生きたまたは死んだ状態で用いられる。上記特徴のうち１以上を示すポリペプチドまたは細菌は薬剤として使用できる。本発明には医薬組成物も含み、それらは薬学上許容されるアジュバントと混合された本発明によるポリペプチドまたは細菌を含むことを特徴とする。生きたベクターに基づく経口ワクチンは、ＲＳＶに対して最良の保護を誘導する上で最適のコンホメーションを示す改変タンパク質を含んでいるべきである。この理由から、本発明は呼吸器多核体ウイルスに起因する感染症を防止するための経口ワクチンを製造する上で、このような医薬組成物の適用にも関する。最後に、本発明は既に記載されたような天然ペプチドのアナログである組換えペプチドをコードするヌクレオチド配列に関し、これらの配列は１以上の特定宿主細胞で確かにペプチドを発現させる要素を更に含むことができる。これらの要素は細胞を標的にさせて、そこでその構築体がヒトまたは哺乳動物に投与されたときに発現される。これらの配列は、好ましくはベクター中に組み込まれるＤＮＡまたはＲＮＡ構築体である。適切なベクターは特にアデノウイルスタイプのプラスミドまたはウイルスであって、許容される賦形剤と一緒に医薬組成物中に処方することができる。その面の１つによれば、本発明は、呼吸器多核体ウイルスプロテインＧのアミノ酸残基１３０〜２３０間に包含されるペプチド配列により保有されるポリペプチドをコードするか、または上記ペプチド配列と少くとも８０％の相同性を示すポリペプチドをコードして、しかもStaphylococcus属の非病原性細菌の膜の表面でポリペプチドを発現させるための手段も含んでいるヌクレオチド配列に関する。 ‐機能性分泌シグナル配列 ‐天然ペプチドのアナログである組換えペプチドをコードするＤＮＡ配列（組換えペプチド配列は天然ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域で少くとも１つの改変を示す）を含むＤＮＡ配列は、本発明の一部である。本発明による方法は下記工程からなる：ａ．構造遺伝子と機能的に連結されたシグナル配列を包含する組換えＤＮＡ構築体で宿主細胞を形質転換させ（これは組換え産物が宿主細胞の膜を介して輸送できるように修飾されている）、ｂ．組換え産物を発現するために上記宿主細胞を発酵させ、ｃ．構築体で形質転換された細胞により分泌された細胞外タンパク質を回収する。本発明には、既に記載されたようなＤＮＡ配列または構築体を保有した組換え細胞も含む。この宿主細胞には、グラム陽性またはグラム陰性細菌、酵母細胞、または哺乳動物細胞がある。特に適切な細菌はEscherichia coli、Staphylococcus xylosusおよびStaphylo coccus carnosus からなる群より選択される。ＤＮＡ配列は、グラム陽性またはグラム陰性細菌の染色体中に組み込むことができる。この組換えＤＮＡ構築体は、サブグループＢの場合の上流および／または下流に融合されたヒトＲＳＶサブグループＡのプロテインＧアミノ酸１３０〜２３０をコードする遺伝子を含むことができる。１タイプの構築体は、サブグループＡまたはサブグループＢに属するウシＲＳＶのアミノ酸１３０〜２３０のタンパク質をコードする遺伝子を用いて作製することができる。下記例は本発明を説明するためであり、その範囲を何ら制限するものではない。これらの例では、下記図が参考にされる： ‐図１：遺伝子アセンブリーによるプラスミドｐＲＩＴ２８Ｇ２ｄｏｗｎの構築 ‐図２：１）セリン残基により置換された遺伝子Ｇ２の構築２）残基１６２‐１７０が欠失された遺伝子Ｇ２の構築 ‐図３：シャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭの構築 ‐図４：組換え表面タンパク質のフローサイトメトリーによる分析 ‐図５：組換えS.xylosusの膜から抽出されたタンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析 ‐図６：対応シャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭまたはｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭからの分泌ベクターの構築原理図（その記載は例４に示されている）。ベクターを保有したS.xylosusの増殖培地から分泌された産物（その停止コドンは（Ｔ）はＸＭ膜アンカー領域の上に挿入されている） ‐図７：S.xylosusにより分泌された融合タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによる分析 ‐図８：異なるシャトルベクターを保有したS.xylosusにより分泌されたタンパク質のフローサイトメトリーによる分析例例１：Ｉ）合成遺伝子をアセンブリーすることによるＧ２の構築：オリジナル配列と比較して、我々が更に１７３および１８６位の２つのＣｙｓ残基をＳｅｒに変えた、Ｇ２と称されるＲＳウイルスの糖プロテインＧのアミノ酸１３０‐２３０を包含した領域をコードする遺伝子は、固相遺伝子アセンブリー技術により得る（Stahl S.et col.,1993.BioTechniques,14:424-434）。そのオリゴヌクレオチドの配列はE.coliおよびStaphylococcusのような細菌の共通コドンを組み合わせることにより最良なものにさせた。オリゴヌクレオチドは、製造業者の勧めに従い自動ＤＮＡシンセサイザー（Ge ne Assembler Plus,Pharmacia Biotech）でホスホルアミダイト化学により合成した。固相に結合されるオリゴヌクレオチドは、試薬ホスホルアミダイト担持ビオチン（Clontech）により５′末端でビオチニル化させる。他のオリゴヌクレオチドは、Clontechプロトコールに従い試薬アミダイト担持リン酸（Clontech）により５′末端でリン酸化させる。オリゴヌクレオチドをPharmaciaの勧めに従い脱保護および精製する。ビオチニル化オリゴヌクレオチドを逆相液体クロマトグラフィーにより精製する（ＰＥＰＲＰＣカラム；Pharmacia）。遺伝子は２つの部分：遺伝子の５′および３′に２つの制限部位ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを有したアミノ酸１３０‐１７７のＧ２ｕｐ（上流）と、遺伝子の５′および３′に２つの制限部位ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩを有したアミノ酸１７７‐２３０のＧ２ｄｏｗｎ（下流）でアセンブリーする。Ｇ２遺伝子はＰｓｔＩ部位により２つの断片Ｇ２ｕｐおよびＧ２ｄｏｗｎを連結させることにより再構築させる。ａ）Ｇ２ｕｐ遺伝子のアセンブリー（図１）：マイクロチューブで、２つの相補的オリゴヌクレオチド（そのうち１つは５′ ‐ビオチニル化されている：ＴＨ１Ｂ＝５′‐ビオチン‐ＣＣＧＧＡＴＣＣＴＡＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡ‐３′およびＴＨ２＝５′‐ＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＡＣＧＧＴＣＡＴＡＧＧＡＴＣＣＧＧ‐３′）をストレプトアビジン（Dy nal,Oslo,Norway）にカップリングされた磁気ビーズ上でハイブリッド形成させて、固定させる。固定された二本鎖はＢａｍＨＩ制限部位を含んでいて、ビオチニル化鎖と相補的な鎖はその５′末端（ホスホニル化されている）に６〜１５ヌクレオチドの突出部を有していて、それには下記オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成できる。この後者のオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成は、二次構造の形成を避けるために培地の温度を７０℃に上げながら行う。連結はＴ４ＤＮＡリガーゼ（Gibco BRL）を加えることにより行う。遺伝子は、下記オリゴヌクレオチドを加える前に過剰の非結合オリゴヌクレオチドを除去するために固体支持体をすすいでおく注意を各サイクルで払いながら、こうやってうまく構築させる。連結される最後の二本鎖はＰｓｔＩ制限部位を含んでいる。次いで二本鎖はそれを制限酵素ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断することによりその固体支持体から放出させ、その後同酵素で切断されたクローニングおよび配列決定ベクターｐＲＩＴ２８（Hultman et al.,1988,Nucleosides Nucleotide s 7: 629-638）中に連結させる：得られるベクターは大きさが３０６７ｂｐのｐＲＩＴ２８Ｇ２ｕｐである。Ｇ２ｕｐのヌクレオチド配列は、製造業者（Applie d Biosystems）の勧めに従い自動ＡＢＩシークエンサーでＤＮＡ配列決定することにより調べる。ｂ）Ｇ２ｄｏｗｎ遺伝子のアセンブリー（図１）：同様にして、Ｇ２ｄｏｗｎ遺伝子を２つの第一相補的オリゴヌクレオチド〔（そのうち１つは５′‐ビオチニル化されている：ＴＨ１３Ｂ＝（５′‐ビオチン‐ＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＡＧＴＣＧＡＣＣＧＧＴＴＴＧ‐３′）およびＴＨ１２＝（５′‐ＧＣＣＧＡＣＣＡＣＣＡＡＡＣＣＧＧＴＣＧＡＣＴＡＡＧＣＴＴＣＡＣＡ‐３′）など〕により磁気ビーズ上で固相アセンブリーさせる。二本鎖をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄIIIでの連続酵素切断により固体支持体から放出させて、ｐＲＩＴ２８中にクローニングさせる：得られるベクターはｐＲＩＴ２８Ｇ２ｄｏｗｎと称され、大きさが３０９１ｂｐである。Ｇ２ｄｏｗｎのヌクレオチド配列は、製造業者（Applied Biosystems）の勧めに従い自動ＡＢＩシークエンサーでＤＮＡ配列決定することにより調べる。ｃ）Ｇ２遺伝子＝Ｇ２ｕｐ＋Ｇ２ｄｏｗｎの構築：２つの断片Ｇ２ｕｐ＋Ｇ２ｄｏｗｎをＰｓｔＩ制限部位により連結させ、形成された遺伝子を５′ＢａｍＨＩ部位および３′ＨｉｎｄIII部位を用いてｐＲＩＴ２８中にクローニングさせる：得られるベクターはｐＲＩＴ２８Ｇ２と称され、大きさが３２２０ｂｐである。Ｇ２のヌクレオチド配列は、製造業者（Applie d Biosystems）の勧めに従い自動ＡＢＩシークエンサーでＤＮＡ配列決定することにより調べる。Ｇ２断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断して、シャトルベクター：ｐＳＥ′Ｇ２ＢＢＸＭ（７６６６ｂｐ）中にクローニングさせる（図３）。Ｇ２遺伝子をアセンブリーするために要求されるオリゴヌクレオチドのリスト： II ）部位特異的変異誘発によるＧ２ｓｕｂの構築：１６３、１６５、１６８および１７０位の４つのフェニルアラニン残基がセリンに置き換えられた遺伝子断片を、プライマー対としてＲＩＴ２７／ＴＮＧ７３およびＲＩＴ２８／ＴＮＧ７２を用いてベクターｐＲＩＴ２８中に挿入されたＧ２遺伝子から、遺伝子増幅（ＰＣＲ）により作製する。プライマーＴＮＧ７２およびＴＮＧ７３は、４つのフェニルアラニンのうち３つを含んだ１９ヌクレオチドの領域と相補的である：一方、プライマーＴＮＧ７３はＲＩＴ２７と一緒に増幅された上流断片で最初の３つの変異（ＴＴＣからＴＣＣへ）を導入する。他方、プライマーＴＮＧ７２はＲＩＴ２８と一緒に増幅された下流断片中に最後の３つの変異（ＴＴＣからＴＣＣへ）を導入する。５サイクルの温度（９６℃、１５秒間；５０℃、１分間；７２℃、１分間）に次いで、５サイクルの温度（９６℃、１５秒間；６０℃、１５秒間；７２℃、１５秒間）を続ける。２つの増幅断片を１本のチューブで混合し、プライマーのないＰＣＲ緩衝液で希釈し、伸長反応を下記温度（９６℃、１５秒間；５４℃、３０秒間；７２℃、１分間）を用いて５サイクルで行う。伸長産物はＲＩＴ２７およびＲＩＴ２８プライマーを含有したＰＣＲ緩衝液で１／１００希釈し、遺伝子増幅を下記温度（９６℃、１５秒間；５４℃、１５秒間；７２℃、３０秒間）で３０サイクルにわたり行う。次いで断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで切断し、同酵素で切断されたベクターｐＲＩＴ２８中にクローニングして、ｐＲＩＴ２８Ｇ２ｓｕｂを得る。Ｇ２ｓｕｂのヌクレオチド配列は製造業者（Applied Biosystems）の勧めに従いＡＢＩ自動配列決定装置でＤＮＡ配列決定することにより調べる。Ｇ２ｓｕｂ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断して、シャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭ（７６６６ｂｐ）中にクローニングさせる（図３）。III) Ｇ２ｄｅｌの構築：（図２．（２）参照）同様にして、４つのフェニルアラニン残基を含む部分アミノ酸１６２〜アミノ酸１７０が欠失されたＧ２遺伝子断片を、２断片の形でＰＣＲにより作る：一方において上流ではプライマーＲＩＴ２７／ＴＨ４８を用いて、他方下流ではＲＩＴ２８／ＴＨ１１を用いる。プライマーＴＨ１１およびＴＨ４８は１３のヌクレオチドにわたって互いに相補的である。５サイクルの下記温度（９６℃、１５秒間；５２℃、１分間；７２℃、１分間）に次いで、２０サイクルの下記温度（９６℃、１５秒間；６０℃、１５秒間；７２℃、１５秒間）を続ける。２つの増幅断片を１本のチューブで混合し、プライマーのないＰＣＲ緩衝液で希釈し、伸長反応を５サイクルの下記温度（９６℃ 、１５秒間；４２℃、３０秒間；７２℃、１分間）で行う。伸長産物はＲＩＴ２７およびＲＩＴ２８プライマーを含有したＰＣＲ緩衝液で１／１００希釈し、遺伝子増幅を３０サイクルの下記温度（９６℃、１５秒間；６０℃、１５秒間；７２℃、３０秒間）で行う。次いで断片を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIで切断し、同酵素で切断されたベクターｐＲＩＴ２８中にクローニングして、ｐＲＩＴ２８Ｇ２ｄｅｌを得る。Ｇ２ｄｅｌのヌクレオチド配列は製造業者（Applied Biosystems）の勧めに従い自動ＡＢＩ配列決定装置でＤＮＡ配列決定することにより調べる。Ｇ２ｄｅｌ断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIで切断して、シャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭ（７６３９ｂｐ）中にクローニングさせる（図３）。IV ）シャトルベクターの構築：オリゴヌクレオチドリンカー（５′‐ＡＧＣＴＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＡＧ‐３′、相補鎖と一緒）をプラスミドｐＳＺＺｍｐ１８ＸＭ（Hansson et al.,1992,J.Bacteriol.174: 4239-4245）のＨｉｎｄIII部位中に挿入して、それにより得られるベクターｐＳＺＺｍｐ１８（ＸｈｏＩ）ＸＭのＨｉｎｄIII部位の下流に２つの追加制限部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを作る。StaphylococcusプロテインＧの血清アルブミン結合領域からの、ＢＢと称される１９８アミノ酸をコードする遺伝子断片（Nygren et al.,1988,J.Mol.Reconig .,1: 69-74）は、プラスミドｐＳＰＧ１（Guss et al.,1986,EMBO j.,5:1567-15 75）からなる鋳型で、プライマー（１＝５′‐ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＧＡＴＧＣＴＣＴＡＧＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＧ‐３′および２＝５′‐ＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＴＣＡＴＣ‐３′）を用いて、ＰＣＲにより作製する。その断片をＨｉｎｄIIIおよびＸｈｏＩで切断し、ベクターｐＳＺＺｍｐ１８（ＸｈｏＩ）ＸＭのｍｐ１８マルチクローニング部位の下流にクローニングする；得られたベクターｐＳＺＺｍｐ１８（ＸｈｏＩ）ＢＢＸＭはＮｏｔＩおよびＨｉｎｄIIIで切断する。ＺＺを含む断片は、ベクターｐＥ′ｍｐ１８（Sophia Hober 、未公表）から同様の制限酵素で切断されたもう１つの断片に代える。得られたシャトルベクターはｐＳＥ′ｍｐ１８ＢＢＸＭと称される（図３）。例２：組換えS.xylosus株からの膜タンパク質の抽出および分析：クロラムフェニコール（２０μg/ml）を含有した培地２５０ｍｌ（ＴＳＢ７．５ｇ、酵母抽出物１２．５ｇ）を、Gotz et al.,1981,J.Bacteriol.,145: 74-81 のプロトコールに従いシャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ＢＢＸＭ、ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭまたはｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭの１つで形質転換されたS.xylo susの一夜予備培養物５ｍｌと一緒に、１ｌエルレンマイヤーフラスコ中に接種する。フラスコを振盪しながら３２℃の温度で６時間にわたりインキュベートする。培地を４℃の温度で１２分間にわたり５０００ｒｐｍで遠心する。細菌ペレットをＴＳＴ４０ｍｌに再懸濁し、リソスタフィン（１ mg/ml）を含有した溶液２００μｌとその後にリゾチーム（５０ mg/ml）２００μｌを加える。混合液を穏やかに振盪しながら３７℃の温度で１時間インキュベートする。次いで溶液は、パワーが７に調整されたプローブを備えたVibra細胞装置を用いて、２分間にわたり超音波処理する。混合液を４℃の温度で２０分間にわたり１３，５００ｒｐｍで遠心する。タンパク質をアフィニティ精製する：上澄をＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）‐Sepharoseアフィニティカラムに通す。カラムがすすがれた後、タンパク質をｐＨ２．７の酸緩衝液で溶出させ、凍結乾燥する。タンパク質は前染色標準分子量マーカー（Gibco ＢＲＬ）を用いて２つの同一な１２％ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分離させる。１つのゲルはクマシーブルーで染色する。第二は（現行免疫プロトコールに従いＧ１（ａａ１７４‐１８７）ペプチドで免疫されたウサギの血清から得られた）抗Ｇ１特異的抗体で免疫ブロットするための Problot^TM（Applied Biosystem）膜に移す。図５参照例３：S.xylosus の表面における組換えタンパク質のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ^TM）による分析：組換えS.xylosus細菌の培養物を前記のように作製する。ストック溶液を作るために、その細菌は光学密度（６００ｎｍ）で規定される単位の最終濃度で０．１％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジドを含有したＰＢＳの溶液に再懸濁する。ストック溶液３０μｌを微量滴定プレートの各円錐形ウェル中に分けて、４℃で１０分間にわたり５５０ｇで遠心する。細菌ペレットは２００倍希釈抗Ｇ２ポリクローナルウサギ血清（力価１／１，２８０，０００）含有ＰＢＳ溶液１５０μｌの容量中に再懸濁して、混合液を３０分間インキュベートする。細菌細胞をＰＢＳで２回すすいで、３０分間にわたり１００倍希釈ＦＩＴＣ抗ウサギ(Sigma)含有ＰＢＳ溶液１５０μｌ中でインキュベートする。細胞がＰＢＳ緩衝液で２回すすがれた後、それらを１％（ｗ／ｖ）ＰＢＳ‐パラホルムアルデヒド緩衝液１ｍｌ含有Falconチューブ中に再懸濁する。こうして作られたサンプルをＦＡＣＳｃａｎ^TM（Becton Dickinson）装置で分析する。各細胞懸濁液の蛍光分布はLYSIS II^TMソフトウェアを用いて分析し、蛍光ヒストグラムで表す。図４参照例４：分泌／挿入から分泌へのモジュレーション：異なるシャトルベクターを用いて、図６に示されたような膜つなぎ止めコード領域ＸＭの上流に終結コドンを挿入することができる。ＢＢとＸＭとの間にあるユニークＸｈｏＩ制限部位を用いて、３つの終結コドン（Ｔｅｒ）をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを双方向に挿入させ、ＡａｔII制限部位を導入する：こうして、ベクターｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭおよびｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭをＸｈｏＩで切断し、既に５′リン酸化された二本鎖オリゴヌクレオチドに連結させる。得られたベクターは各々ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢ〔Ｔｅｒ〕ＸＭ（７６９３ｂｐ）およびｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢ〔Ｔｅｒ〕ＸＭ（７６６６ｂｐ）である。プロテインＧ２ｓｕｂＢＢおよびＧ２ｄｅｌＢＢは、これら２つのベクターで各々形質転換されたE.coliおよびS.xylosus細胞を培養して、その後アフィニティカラム（ＨＳＡ‐セファロース）で精製することにより得られる。図７では、Ａ）ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルの場合において、S.xylosusから分泌されたタンパク質の還元条件下における分離を示し（１および２は予想サイズ：３５．２３Ｋｄａおよび３４．２８ＫｄａのプロテインＧ２ｓｕｂＢＢおよびＧ２ｄｅｌＢＢを各々表す）、Ｂ）においてタンパク質の免疫ブロットは、ＲＳＶのＧ（ａａ１７４‐１８７）領域またはＧ１に特異的な抗体が２つの分泌タンパク質を容易に認識することを証明している。タンパク質分解はほとんど観察されなかった。加えて、ＦＡＣＳｃａｎ分析はウサギ抗ＢＢポリクローナル抗体を用いて異なるS.xylosus株で行った。図８では、シャトルベクターｐＳＥ′ｍｐ１８ＢＢＸＭ、ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭおよびｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭを保有した S.xylosusについてのスペクトルが蛍光強度の軸で右方向に、即ち細菌表面における異種抗原の存在方向に転移していることを示している。逆に、シャトルベクターｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＴｅｒＸＭおよびｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＴｅｒＸＭを保有したS.xylosusについてのスペクトルは転移されず、異種抗原が細菌表面に不在であり、それらが培地に見出され、培地から精製されたことを示している。図面の説明図５：Ａ）クマシーブルー染色：異なる構築体を保有した細菌の膜から抽出されてアルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル： ‐ウェルＨＷ：分子サイズマーカー（Ｋｄａ） ‐ウェル１：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ＢＢＸＭ〕 ‐ウェル２：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭ〕 ‐ウェル３：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭ〕Ｂ）異なる構築体を保有した細菌の膜から抽出されてアルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質の、ウサギ抗Ｇ１ポリクローナル抗体で得られた免疫ブロット： ‐ウェルＨＷ：前染色分子サイズマーカー（Ｋｄａ） ‐ウェル１：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ＢＢＸＭ〕 ‐ウェル２：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢＸＭ〕 ‐ウェル３：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢＸＭ〕図７：Ａ）クマシーブルー染色：異なる構築体を保有した細菌から分泌されてアルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲル： ‐ウェル１：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢ〕（３４．２８Ｋｄａ） ‐ウェル２：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢ〕（３５．２３Ｋｄａ） ‐ウェルＨＷ：分子サイズマーカー（Ｋｄａ）Ｂ）異なる構築体を保有した細菌から分泌されてアルブミンアフィニティカラムで精製された融合タンパク質の、ウサギ抗Ｇ１（ＲＳＶ）ポリクローナル抗体で得られた免疫ブロット： ‐ウェル１：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｄｅｌＢＢ〕（３４．２８Ｋｄａ） ‐ウェル２：S.xylosus 〔ｐＳＥ′Ｇ２ｓｕｂＢＢ〕（３５．２３Ｋｄａ） ‐ウェルＨＷ：前染色分子サイズマーカー（Ｋｄａ）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/265 39/265 48/00 ＡＣＤ 48/00 ＡＣＤＣ０７Ｋ 14/135 Ｃ０７Ｋ 14/135 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｐ 21/00 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:44） (72)発明者スタール，ステファンスウェーデン国ストックホルム、トルファグスベーゲン、８ (72)発明者ニグレン，ペールアイクスウェーデン国スカルプナック、ピロトガタン、22

Claims

【特許請求の範囲】１．少くとも１つの疎水性領域を有する天然ペプチドのアナログである生物学的に活性な組換えペプチドを分泌するための方法であって、 ‐細胞による上記ペプチドの発現および分泌を確実にする要素 ‐そのアミノ酸配列がペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域において少くとも１つの改変により天然ペプチド配列と異なるペプチドをコードする配列を含む核酸構築体で形質転換された細胞を培養し、そしてそのペプチドおよび／またはその組換えペプチドを有する細胞を回収することを特徴とする方法。２．天然ペプチド配列の少くとも１つの疎水性アミノ酸が非疎水性アミノ酸で置き換えられた、請求項１に記載の方法。３．少くとも１つの疎水性アミノ酸が天然ペプチド配列から欠失された、請求項１または２に記載の方法。４．疎水性アミノ酸が下記群：トリプトファン、フェニルアラニン、プロリン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシンおよびメチオニンから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。５．ＤＮＡ構築体が、組換えペプチドをコードし、かつそのペプチドの輸送と細胞外へのその分泌を確実にするＤＮＡ配列と機能的に連結された分泌シグナル配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。６．ＤＮＡ構築体が、ペプチドをコードし、かつそのペプチドを宿主細胞膜から輸送し膜につなぎ止めるＤＮＡ配列と機能的に連結されたシグナル配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。７．天然ペプチドの疎水性領域において少くとも１つの改変により天然ペプチドと異なっていることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載された方法により得ることができる組換えペプチド。８．宿主細胞の表面につなぎ止められている、請求項７に記載の組換えペプチド。９．ＲＳＶ構造タンパク質のアナログまたはこのタンパク質の断片である、請求項７または８に記載の組換えペプチド。１０．ＲＳＶのプロテインＧのアナログ、サブグループＡまたはＢ、である配列を含んでなる、請求項７〜９のいずれか一項に記載の組換えペプチド。１１．ＲＳＶプロテインＧの残基１３０〜２３０間に包含された配列のアナログである配列を含んでなる、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の組換えペプチド。１２．配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のうちの１つである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の組換えペプチド。１３．請求項７〜１２のいずれか一項に記載されたペプチドをコードするヌクレオチド配列。１４．１以上の特定宿主細胞におけるペプチドの発現を確実にする要素を更に含む、請求項１３に記載のヌクレオチド配列。１５．ＤＮＡ配列である、請求項１３または１４に記載のヌクレオチド配列。１６．ＲＮＡ配列である、請求項１３または１４に記載のヌクレオチド配列。１７．請求項１３〜１６のいずれか一項に記載されたヌクレオチド配列を含む特徴とする発現ベクター。１８．請求項１７に記載された発現ベクターを有することを特徴とする、ペプチドのin situ 産生を行うために哺乳動物に投与される医薬組成物。１９． ‐機能性分泌シグナル配列 ‐天然ペプチドのアナログである組換えペプチドをコードするＤＮＡ配列（組換えペプチド配列は天然ペプチドの非トランスメンブレン疎水性領域で少くとも１つの改変を有する）を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載された方法で用いられるＤＮＡ配列。２０．請求項１５、１６または１９に記載されたＤＮＡ配列を有することを特徴とする組換え細胞。２１．グラム陰性細菌である、請求項２０に記載の細胞。２２．グラム陽性細菌である、請求項２０に記載の細胞。２３．酵母細胞である、請求項２０に記載の細胞。２４．哺乳動物細胞である、請求項２０に記載の細胞。２５． Escherichia coli、Staphylococcus xylosus、Staphylococcus carnosus から選択される、請求項２２または２３に記載の細菌。２６．組換えＤＮＡ配列が宿主の染色体中に組み込まれていることを特徴とする、請求項２１に記載のグラム陰性細菌。２７．宿主の染色体中に組み込まれた組換えＤＮＡ配列を有することを特徴とする、請求項２２に記載のグラム陽性細菌。２８．請求項２０〜２７のいずれか一項に記載された細胞を有することを特徴とする医薬組成物。