JPH10505237A

JPH10505237A - カノラ及びダイズのパルミトイル−ａｃｐチオエステラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、並びにダイズ及びカノラ植物の油の脂肪酸量の調節におけるこれらの使用

Info

Publication number: JPH10505237A
Application number: JP8508820A
Authority: JP
Inventors: ウイリアム・デイーンヒツツ，
Original assignee: イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-25
Publication date: 1998-05-26
Also published as: USRE37317E1; EP2311959B1; HUT76842A; ZA957321B; AU3410295A; EP2311959A3; ES2533860T3; MX9701238A; CA2198222C; BR9509502A; WO1996006936A1; DK0778896T3; AU706866B2; EP2311959A2; IL115107A0; EP0778896A1; US5955650A; CA2198222A1; PL319103A1; EP0778896B1

Abstract

(57)【要約】Ｃ１６特異的ＡＣＰチオエステラーゼをコードするヌクレオチド配列を単離した。本発明のヌクレオチド配列を、大腸菌及び植物組織において発現する。これらの配列を、内在する植物チオエステラーゼのアンチセンス阻害に、並びに、植物油中の飽和脂肪酸量を減少するためのアシル補酵素Ａプールの調節に用いた。

Description

【発明の詳細な説明】カノラ及びダイズのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列、並びにダイズ及びカノラ植物の油の脂肪酸量の調節におけるこれらの使用発明の分野本発明は、植物の脂質組成を変えるために、アシルーアシルキャリヤータンパク質チオエステラーゼ酵素をコードしている核酸フラグメントを、調製及び使用することに関する。変化したレベルの飽和脂肪酸を有するトランスジェニック植物を作製するために、そのような核酸フラグメント及び適当な調節配列を含むキメラ遺伝子を用いることができる。発明の背景植物脂質は、様々な産業及び食物に使用され、並びに、植物膜機能及び気候適応の中心となっている。これらの脂質は非常に多数の化学構造を示し、これらの構造はその脂質の生理学的及び産業上の性質を決定する。これらの構造の多くは、その脂質の飽和度を変える代謝過程から直接的または間接的に生じる。植物脂質は、トリアシルグリセロールの形態において、食用油として主に用いられる。食用油の特異的性能及び健康特性は、主にその脂肪酸組成により決定される。販売されている植物種から取り出された大部分の植物油は、主として、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、及びリノレン酸（１８：３）から成る。パルミチン酸及びステアリン酸は、それぞれ、１６及び１８炭素鎖長の飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸は、それぞれ、１、２、及び３個の二重結合を含んでいる、１８炭素鎖長の不飽和脂肪酸である。オレイン酸は、モノ不飽和脂肪酸と呼ばれ、一方リノール酸及びリノレン酸は、ポリ不飽和脂肪酸と呼ばれる。一般的に使用される食用植物油中の飽和及び不飽和脂肪酸の相対的な量を、以下に要約する（表１）。多くの最近の研究努力により、飽和及び不飽和脂肪酸が、冠状動脈性心疾患の危険率の減少において果たす役割が調べられてきている。過去においては、飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸と対照的に、モノ不飽和脂肪酸は、血清コレステロール及び冠状動脈性心疾患の危険率に影響がないと信じられていた。いくつかの最近のヒト臨床研究は、モノ不飽和脂肪の割合が高く、飽和脂肪の割合が低い食事により、「悪玉」（低密度リポタンパク質）コレステロールを減少し、一方「善玉」（高密度リポタンパク質）コレステロールを保つことができることを示唆する（Ｍａｔｔｓｏｎ等、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｐｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ（１９８５）２６：１９４−２０２）。ダイズ油は、他の植物油の源に比べて飽和脂肪酸の割合が高く、ダイズ種子の全脂肪酸量に対して低い割合のオレイン酸を含む。これらの特徴は、米国心臓協会（ＡｍｅｒｉｃａｎＨｅａｒｔＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）により定義された重要な健康要求にかなわない。全飽和脂肪酸及びポリ不飽和脂肪酸の割合が低く、モノ不飽和脂肪酸の割合が高いダイズ油は、米国住民に著しい健康上の恩恵を与え、並びに、油加工業者に対して経済的恩恵を与えるであろう。植物中の油の生合成については、かなりよく研究されてきている［ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ、第８巻、（１）：１−４３、（１９８９）のＨａｒｗｏｏｄを参照］。パルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸の生合成は、色素体中で、「ＡＣＰトラック」の３つの重要な酵素、すなわちパルミトイル−ＡＣＰエロンガーゼ、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼ、及びアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの相互作用により生じる。これらの酵素型のうち、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、アシル鎖をそのキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）から、従ってその代謝経路から取り除くために機能する。オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼは、高い率でオレオイル−ＡＣＰチオエステルの加水分解を触媒し、それよりかなり低い率でパルミトイル−ＡＣＰ及びステアロイル−ＡＣＰの加水分解を触媒する。この多様な活性は、酵素間の基質競合を引き起こし、同じ基質に対するこのアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びパルミトイル−ＡＣＰエロンガーゼの競合、並びに同じ基質に対するアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ及びステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの競合が、植物油のトリアシルグリセリド中に見いだされるパルミチン酸及びステアリン酸の生成の一部をもたらす。いったんＡＣＰトラックから除かれると、脂肪酸は細胞質に運び出され、そこでアシル−補酵素Ａを合成するために用いられる。これらのアシル−ＣｏＡは、油生合成中にアシル部分をトリアシルグリセリドに結合する少なくとも３つの異なるグリセロールアシル化酵素（グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、１−アシル−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ、及びジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ）に対するアシル供与体である。これらのアシルトランスフェラーゼは、トリグリセリドの１及び３位に飽和脂肪酸を、並びに２位にモノ不飽和脂肪酸を結合する、絶対的ではないが強い選択性を示す。従って、アシルプールの脂肪酸組成を変えると、量作用により、油の脂肪酸組成において対応する変化を引き起こす。上記の解説に基づくと、植物油中のパルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸のレベルを変える一つの方法は、油の生合成に用いられる細胞質のアシル− ＣｏＡプール中のこれらの脂肪酸のレベルを変えることである。以前の仕事（国際公開第９２１１３７３号）において、出願人は、ダイズのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするクローン化したｃＤＮＡを用いて、この酵素を調節できることを示した。オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのｃＤＮＡを、ダイズ植物細胞を形質転換するためのキメラ遺伝子を作るために用い、これらのキメラ遺伝子は、植物種子においてアシル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害をもたらした。出願人は、今回、Ｃ１６基質に活性を有し、またアシル補酵素Ａプールの調節のために有用である、全く新しい植物チオエステラーゼを発見した。出願人は、油生産種における脂肪酸組成を遺伝子形質転換により改変するために有用である、ダイズ及びカノラのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする核酸フラグメントを単離した。従って、機能的な酵素をコードする、本発明の核酸フラグメントまたはこれらの一部を、それらのｍＲＮＡの転写を導く適当な調節配列と共に生細胞中に導入すると、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの生産または過剰生産をもたらし、並びに、トリアシルグリセロールを含む細胞脂質中の飽和脂肪酸レベルの増加をもたらす。本発明の核酸フラグメントまたはこれらの一部を、それらのアンチセンスＲＮＡの転写を導く適当な調節配列と共に植物中に導入すると、導入された核酸フラグメントとかなり相同な、内在するパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現の阻害をもたらし、並びに、トリアシルグリセロールを含む細胞脂質中の飽和脂肪酸レベルの減少をもたらす。本発明の核酸フラグメントまたはこれらの一部を、それらのｍＲＮＡの転写を導く適当な調節配列と共に植物中に導入すると、導入された核酸フラグメントとかなり相同な、内在するパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現の共抑制（ｃｏｓｕｐｐｒｅｓｉｏｎ）による阻害をもたらすことができ、並びにトリアシルグリセロールを含む細胞脂質中の不飽和脂肪酸のレベルの減少をもたらすことができる。発明の要約食用植物油中の飽和及び不飽和脂肪酸のレベルを制御する方法を発見した。ダイズ種子のパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの前駆体または酵素のいずれかに対するｃＤＮＡを用いてキメラ遺伝子を作製し、そしてこれらのキメラ遺伝子を、減少したレベルの飽和脂肪酸を有する種子油を生産するようにダイズ植物を形質転換するために用いることができる。同様に、カノラ種子のパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの前駆体または酵素のいずれかに対するｃＤＮＡを、キメラ遺伝子を作製するために用いることができ、次に、これらの遺伝子を、減少したレベルの飽和脂肪酸を有する種子油を生産するようにカノラ植物を形質転換するために用いることができる。特に、本発明の一つの特徴は、配列表の配列番号１に示された配列中の１ないし１６８８のヌクレオチド、またはこれとかなり相同な全ての核酸フラグメントに相当する、ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸フラグメントである。加えて、もう一つの特徴は、配列表の配列番号２の１ないし１４８８のヌクレオチド、配列表の配列番号３１の１ないし１６７４のヌクレオチド、またはこれらとかなり相同な全ての核酸フラグメントに相当する、カノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸フラグメントに関する。好ましくは、ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ前駆体、成熟ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素、カノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ前駆体、及び成熟カノラ種子パルミトイル −ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードする、これらの核酸フラグメントである。本発明のもう一つの特徴は、ダイズ植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子に関し、このキメラ遺伝子は、種子中でダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害を生じるように適当な調節配列に連結された、あるいは、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質の過剰発現、または共抑制が起こるとパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質の過少発現のいずれかをもたらす、ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のセンス発現を生じるように適当に連結された、配列番号１のダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードしている核酸フラグメントを含んでなる。好ましくは、ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ前駆体または成熟ダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードしている核酸フラグメントを含む、これらのキメラ遺伝子である。さらに、本発明の他の態様は、上昇したまたは減少したレベルの飽和脂肪酸を含んでいる種子油を生産する方法に関し、この方法は，（ａ）上記のキメラ遺伝子でダイズ植物細胞を形質転換し、（ｂ）該形質転換した植物細胞から生殖的に成熟した植物体を育て、（ｃ）該生殖的に成熟した植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、（ｄ）減少したレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該油を得るために、該子孫種子をつぶすことを含んでなる。そのような植物細胞を形質転換する好ましい方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴｉ及びＲｉプラスミドの使用、エレクトロポレーション、及び高速弾道砲弾（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙｂａｌｌｉｓｔｉｃｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を含む。本発明の他の特徴は、カノラ種子細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子に関し、このキメラ遺伝子は、種子中でカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害を生じるように適当な調節配列に連結された、あるいは、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質の過剰発現、または共抑制が起こるとパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼタンパク質の過少発現のいずれかをもたらす、カノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子のセンス発現を生じるように適当に連結された、配列番号２または配列番号３１のカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードしている核酸フラグメントを含んでなる。好ましくは、カノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ前駆体または成熟カノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードしている核酸フラグメントを含む、これらのキメラ遺伝子である。配列表の配列番号１及び２は、それぞれ、ダイズ種子パルミトイルーＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ及びカノラ種子パルミトイルーＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す。発明の詳細な記述本開示の文脈上、多数の用語が用いられる。脂肪酸は、炭素原子の数及び二重結合の位置により特定され、すなわち、コロンの前及び後ろの数はそれぞれ鎖長及び二重結合の数を示す。この脂肪酸の名称に続く数は、二重結合のシス立体配置のための接辞「ｃ」と共に、脂肪酸のカルボキシル末端からの二重結合の位置を示す。例えば、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１、９ｃ）、ペトロセリン酸（１８：１、６ｃ）、リノール酸（１８：２、９ｃ、１２ｃ）、γ−リノレン酸（１８：３、６ｃ、９ｃ、１２ｃ）、及びα−リノレン酸（１８：３、９ｃ、１２ｃ、１５ｃ）。別に記載しないかぎり、１８：１、１８：２、及び１８：３は、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸を示す。本明細書に用いられる「パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ」という用語は、その優先的な反応として、パルミトイル−アシルキャリヤータンパク質のパントテン配合族中の炭素−硫黄チオエステル結合の加水分解開裂を触媒する酵素をいう。他の脂肪酸−アシルキャリヤータンパク質チオエステルの加水分解もまた、この酵素が触媒できる。「核酸」という用語は、糖、リン酸、及びプリンまたはピリミジンのいずれかを含んでいるモノマー（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖であることのできる巨大分子をいう。「核酸フラグメント」は、与えられた核酸分子の断片である。高等植物において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝物質であり、一方リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡ中の情報をタンパク質へ伝達することに関与する。「ゲノム」は、生物の各細胞に含まれた遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列」という用語は、一本鎖または二本鎖であることのできる、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの配列をいい、場合によっては、ＤＮＡまたはＲＮＡポリマーの中に含むことのできる、合成の、非天然の、または改変したヌクレオチド塩基を含んでいる。「オリゴマー」という用語は、通常、１００塩基の長さまでの、短いヌクレオチド配列をいう。本明細書に用いられる「相同な」という用語は、２つの核酸分子のヌクレオチド配列間または２つのタンパク質分子のアミノ酸配列間の相関性をいう。そのような相同性の評価は、当該技術分野において熟練した者によりよく理解されるような、ストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションのいずれか（Ｈａｍｅｓ及びＨｉｇｇｉｎｓ、Ｅｄｓ．（１９８５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬＰｒｅｓｓ、ＯＸｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、あるいは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ等の方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３−４５３）によるような、２つの核酸またはタンパク質間の配列の類似性を比較することにより与えられる。本明細書に用いられる「実質的に相同な」は、コーディング領域に相当する遺伝子及び偽遺伝子のような請求された配列のコーディング領域と、ヌクレオチドレベルで９０％以上の全般的な同一性を有するヌクレオチド配列をいう。本明細書に記述された核酸フラグメントは、例えば、（ａ）コードされるアミノ酸に変化をもたらさない塩基の変化に関する変異、または（ｂ）アミノ酸を変えるが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能的な性質には影響しない塩基の変化に関する変異、（ｃ）核酸フラグメントの欠失、再配列、増幅、ランダムなもしくは制御された突然変異誘発に由来する変異、及び（ｄ）時々の核酸シークエンシングの間違いでさえ、のような、しかしこれらに限定されない、人工及び天然の両方の可能な変異を含んでなる分子を含む。［遺伝子」は、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントをいい、そのコーディング領域の前（５’ノンコーディング）及び後ろ（３’ノンコーディング）の調節配列を含む。「天然の」遺伝子は、天然に見いだされるそれ自身の調節配列と共に単離された遺伝子をいう。「キメラ遺伝子」は、天然には見いだされない、異種の調節配列とコーディング配列を含んでなる遺伝子をいう。「内在する」遺伝子は、ゲノムの本来の位置に通常見いだされる天然の遺伝子をいい、この遺伝子は単離されていない。「外来」遺伝子は、宿主生物の中に通常見いだされないが、遺伝子導入により導入される遺伝子をいう。「偽遺伝子」は、機能的な酵素をコードしないゲノムのヌクレオチド配列をいう。「コーディング配列」は、特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列をいい、ノンコーディング配列を除外する。コーディング配列は、「連続するコーディング配列」をすなわちイントロンを欠いて構成でき、あるいは、適当なスプライス連結部により境界づけられる一つまたはそれより多くのイントロンを含むことができる。「イントロン」は、一次転写産物には転写されるが、タンパク質に翻訳されることのできる成熟ｍＲＮＡを作るための細胞内でのＲＮＡの切断及び再連結を通して除去されるヌクレオチド配列である。「開始コドン」及び「終始コドン」は、それぞれ、タンパク質合成（ｍＲＮＡの翻訳）の開始及び読み終わりを特定する、コーディング配列内の３個の隣接するヌクレオチドの単位をいう。「オープン読み枠」は、アミノ酸配列をコードする、開始コドン及び終始コドン間の、イントロンにより遮られていないコーディング配列をいう。「ＲＮＡ転写産物」は、ＲＮＡポリメラーゼが触媒する、ＤＮＡ配列の転写から生じた産物をいう。ＲＮＡ転写産物が、ＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである時、それを一次転写産物といい、あるいは、ＲＮＡ転写物は、その一次転写物の転写後プロセッシングから生じたＲＮＡ配列であることができ、これを成熟ＲＮＡという。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンのない、細胞によりタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」は、ｍＲＮＡに相補的で、ｍＲＮＡに由来する二本鎖ＤＮＡをいう。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写産物またはｍＲＮＡの全てまたは一部に相補的で、その一次転写産物またはｍＲＮＡのプロセッシング、移動、及び／または翻訳を妨げることにより、標的遺伝子の発現を阻止するＲＮＡ転写産物をいう。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写産物のいかなる部分、すなわち、５’ノンコーディング配列、３’ノンコーディング配列、イントロン、またはコーディング配列、とでもよい。加えて、本明細書に用いられるアンチセンスＲＮＡは、アンチセンスＲＮＡの遺伝子発現を妨げる効力を増すリボザイム配列の領域を含むことができる。「リボザイム」は、触媒ＲＮＡをいい、配列特異的なエンドリボヌクレアーゼを含む。本明細書に用いられる「適当な調節配列」は、本発明の核酸フラグメントの上流（５’）、内部、及び／または下流（３’）に位置し、本発明の核酸フラグメントの発現を制御する、天然またはキメラの遺伝子内のヌクレオチド配列をいう。本明細書に用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメントから生じる、センス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定な蓄積をいい、細胞のタンパク質装置と連係して、変化したレベルのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼを生じる。遺伝子の発現または過剰発現は、遺伝子の転写、及びパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの前駆体及び成熟タンパク質へのｍＲＮＡの翻訳を含む。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を妨げることのできる、アンチセンスＲＮＡ転写産物の生産をいう。「過剰発現」は、通常または非形質転換生物における生産レベルを越える、トランスジェニック生物内での遺伝子産物の生産をいう。「共抑制」は、内在する遺伝子にかなりの相同性を有する外来遺伝子の発現をいい、外来遺伝子及び内在する遺伝子の両方の発現の抑制をもたらす。「変化したレベル」は、通常または非形質転換生物の量または割合と異なる、トランスジェニック生物内での遺伝子産物の生産をいう。「プロモーター」は、遺伝子内の、通常コーディング配列の上流（５’）のＤＮＡ配列をいい、ＲＮＡポリメラーゼ及び正しい転写に必要な他の因子に対する認識部位を提供することにより、コーディング配列の発現を制御する。人工のＤＮＡ構築物において、プロモーターはまた、アンチセンスＲＮＡを転写するために用いることもできる。プロモーターはまた、生理学的または発生の条件に反応して転写開始の有効性を制御する、タンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むこともできる。プロモーターはまた、エンハンサー要素を含むこともできる。「エンハンサー」は、プロモーター活性を高めることのできるＤＮＡ配列である。エンハンサーは、プロモーターの本来の要素、あるいは、プロモーターのレベル及び／または組織特異性を高めるために挿入した異種要素であってもよい。「構成的プロモーター」は、全ての組織で常時遺伝子発現を導くプロモーターをいう。本明細書に引用される、「組織特異的」または「発生特異的」プロモーターは、それぞれ、葉または種子のような特定の組織において、あるいは、初期または後期胚形成のような組織の特定の発生段階で、ほとんど独占的に遺伝子発現を導くプロモーターである。「３’ノンコーディング配列」は、ポリアデニレーションシグナル、及びｍＲＮＡのプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる他のあらゆる調節シグナルを含む、遺伝子のＤＮＡ配列部分をいう。ポリアデニレーションシグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸部分の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。本明細書の「形質転換」は、宿主生物のゲノムへの外来遺伝子の導入及びその遺伝学的に安定な継承をいう。「制限酵素切断片長多型」は、遺伝子の変異型の中または辺りでの変化したヌクレオチド配列による、異なった大きさの制限酵素断片長をいう。「稔性の」は、有性的に増殖することのできる植物をいう。「植物」は、真核生物及び原核生物の両方の光合成生物をいい、一方、「高等植物」は、真核生物の植物をいう。本明細書の「油生産種」は、特定の器官、主に種子においてトリアシルグリセロールを生産及び貯蔵する植物種をいう。そのような種としては、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、ナタネ及びカノラ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを含む）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓｃｏｍｍｕｎｉｓ）、及びピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ）を含む。この群はまた、タバコ、早い周期のブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、及びアラビドプシスサリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）のような適当な発現ベクターを開発するのに有用な非農耕学種、及び特異的な脂肪酸の源となり得る野生種を含む。「配列依存的方法」は、それらの使用のためにヌクレオチド配列を必要とする技術をいう。配列依存的方法の例としては、核酸及びオリゴマーのハイブリダイゼーション法、並びに、ポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）の様々な使用において例示されるような、ＤＮＡ及びＲＮＡの増幅法を含むが、これらに限定されるものではない。「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼチェインリアクション」は、核酸分子の直線的または対数的増幅をもたらす方法をいう。ＰＣＲは、一般的に、例えば、ヌクレオチド三リン酸、適当な配列を有する二つのプライマー、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、及びタンパク質から成る複製成分を必要とする。これらの試薬及び核酸の増幅にそれらを用いるための方法を記述している詳細は、米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７年、Ｍｕｌｌｉｓ等）及び米国特許第４，６８３，１９５号（１９８６年、Ｍｕｌｌｉｓ等）において提供される。本発明は、ダイズ及びカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする２つの核酸フラグメントを記述する。これらの酵素は、それぞれのアシル−ＡＣＰ中のＡＣＰからパルミチン酸、ステアリン酸、及びオレイン酸を加水分解開裂するのを触媒する。機能的な酵素をコードする、本発明のこれらの核酸フラグメントまたはそれらの一部の一つまたは両方を、適当な調節配列と共に生細胞内に導入すると、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの生産または過剰生産をもたらし、油を含む細胞脂質中のパルミチン酸、及びより低い程度でステアリン酸のレベルを増加することができる。本発明の核酸フラグメントまたは複数のフラグメントを、本発明のｃＤＮＡを転写する適当な調節配列と共に、本発明のｃＤＮＡとかなり相同な内在する種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼを有する植物に導入すると、内在するパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を共抑制することによる阻害をもたらすことができ、結果として、種子油中のパルミチン酸、及びより低い程度でステアリン酸の量を減少することができる。本発明の核酸フラグメントまたは複数のフラグメントを、種子パルミトイル− ＡＣＰチオエステラーゼのｍＲＮＡまたはその前駆体に相補的なアンチセンスＲＮＡを転写する適当な調節配列と共に、ダイズまたはカノラに導入すると、内在するパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現の阻害をもたらすことができ、結果として、種子油中のパルミチン酸、及びより低い程度でステアリン酸の量を減少することができる。本発明の核酸フラグメントはまた、ダイズ及びカノラの遺伝学的研究及び品種改良プログラムにおける制限酵素断片長多型マーカーとして用いることができる。ダイズ及びカノラパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするｃＤＮＡの同定及び単離ダイズ及びカノラの両方において、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするｃＤＮＡを同定するためには、まず第一に、これらの植物ゲノムからｃＤＮＡをスクリーニングするのに適したプローブを構築することが必要であった。ウンベルラリア（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ）Ｃ１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼとかなり相同性を有することが知られているアラビドプシスのｃＤＮＡの一部を、ＰＣＲプライマー（配列番号３及び４）をデザインするために用いた。アラビドプシスからポリソームＲＮＡを単離、精製し、ＲＮＡ−ＰＣＲ（ＧｅｎｅＡｍｐ^R ＲＮＡ−ＰＣＲキット（商標）ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、部品番号Ｎ８０８−００１７）のための鋳型として用いた。この方法を用いて、５６０ｂｐのフラグメントを生じ、これをダイズ及びカノラｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いるために放射性標識した。真核生物のゲノムからｃＤＮＡライブラリーを作製する方法は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版、（１９８９）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照）。好ましい方法においては、全ＲＮＡを単離し（Ｋａｍａｌａｙ等、Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：９３５−９４６）、ポリアデノシンが付加されたｍＲＮＡを標準的な方法により精製する。ｍＲＮＡを、ラムダファージのような適当なファージに組み入れ、大腸菌のような適当な宿主を形質転換するために用いる。陽性にハイブリダイズするプラークを得るために、形質転換されたクローンを放射性標識したＰＣＲ由来のプローブを用いてスクリーニングする。このようにして、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードしている可能性のあるＤＮＡフラグメントを、ダイズ及びカノラの両方から選択した。ダイズから単離したＤＮＡフラグメントを配列番号１として同定し、カノラから単離したＤＮＡフラグメントを配列番号２及び配列番号３１として同定する。ダイズ及びカノラアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするＤＮＡの大腸菌内での発現単離されたダイズ及びカノラＤＮＡフラグメントの機能を確かめるためには、タンパク質の精製及び酵素活性の分析のために組換え宿主内でこれらのフラグメントを発現させることが必要であった。本発明は、遺伝子操作および組換えタンパク質の発現に適したベクター及び宿主細胞を提供する。適当な宿主は、様々なグラム陰性及びグラム陽性のバクテリアを含むことができ、一般的に大腸菌が好ましい。バクテリア由来のベクターの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＳＰ６４、ｐＵＲ２７８、及びｐＯＲＦ１のようなプラスミドベクターを含む。適当なウイルスベクターの例は、ファージ、ワクチニア、及び様々なウイルス由来のものである。ファージベクターの例は、λ⁺、λＥＭＢＬ３、λ２００１、λｇｔ１０、λｇｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４ａ、Ｃｈａｒｏｎ４０、及びλＺＡＰ／Ｒを含む。ｐＸＢ３及びｐＳＣ１１は、ワクチニアベクターの典型である（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ等、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３４０１−９（１９８５）及びＭａｃｋｅｔｔ等、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４９：８５７８６４（１９８４））。本発明において好ましいものは、（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ及びＪ．Ｗ．Ｄｕｂｅｎｄｏｒｆｆにより、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻に記述された）ｐＥＴ−３ｄのようなバクテリア由来のベクター及び宿主大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＥ）である。いったん適当なベクターを構築すると、それらを、適当なバクテリア宿主を形質転換するために用いる。所望するＤＮＡフラグメントを大腸菌に導入することは、例えばカルシウムにより透過性を増した細胞を用いた形質転換、エレクトロポレーション、または組換えファージウイルスを用いたトランスフェクションによるような、既知の方法により行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、上記）。ダイズ及びカノラＤＮＡフラグメント（各々、配列番号１及び２）の発現のために、まず最初に、成熟タンパク質をコードしている領域を単離するために、これらのフラグメントを適当な制限酵素で切断した。これに続いて、これらの制限フラグメントを適当なリンカー配列に連結し、適当なベクターの適当なプロモーターの下流に挿入した。適当なプロモーターは、誘導的または構成的のいずれでもよく、好ましくはバクテリア由来である。適当なプロモーターの例は、Ｔ７及びｌａｃである。チオエステラーゼアッセイチオエステラーゼ活性を測定するための方法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｓｍｉｔｈ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２１２、１５５、（１９８３）及びＳｐｅｎｃｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３、５９２２（１９７８）を参照）。本発明の目的のためには、ＡＣＰ及び大腸菌から単離されたＡＣＰシンテターゼを用いて放射性標識した基質（［¹⁴Ｃ］アシルーＡＣＰ）を合成することに関して、Ｍｃｋｅｏｎ及びＳｔｕｍｐｆの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：１２１４１−１２１４７］を修正したものを用いた。［¹⁴Ｃ］パルミチン酸、［¹⁴Ｃ］ステアリン酸、［¹⁴Ｃ］オレイン酸、［¹⁴Ｃ］ラウリン酸、及び［¹⁴Ｃ］デカン酸の溶液を、ＡＣＰシンテターゼの存在下で精製したＡＣＰに加え、得られた放射性標識されたアシルＡＣＰを標準的な方法により精製した。配列番号１及び配列番号２によりコードされ、発現されるタンパク質の活性は、加水分解された［¹⁴Ｃ］基質の量を基にして測定した。アンチセンスＲＮＡを用いた植物標的遺伝子の阻害アンチセンスＲＮＡは、植物標的遺伝子を組織特異的に阻害するために用いられてきている（ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌ等、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：９５８−９７６を参照）。アンチセンス阻害は、全ｃＤＮＡ配列（Ｓｈｅｅｈｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８８）８５：８８０５−８８０９）並びに部分的ｃＤＮＡ配列（Ｃａｎｎｏｎ等、ＰｌａｎｔＭｏｌｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１５：３９−４７）を用いて示されている。また、３’ノンコーディング配列（Ｃｈ’ｎｇ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：１０００６−１００１０）及び１．８７ｋｂのｃＤＮＡのわずか４１塩基対だけを含んでいる、５’コーディング配列のフラグメント（Ｃａｎｎｏｎ等、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）１５：３９−４７）が、アンチセンス阻害において重要な役割を果たすことができるという証拠もある。ダイズパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの全ｃＤＮＡを、ダイズβ−コングリシニンプロモーターに対してアンチセンスの向きにクローン化し、このキメラ遺伝子をダイズ体細胞胚に形質転換した。実施例２において示されるように、これらの胚は、ダイズ接合体胚のための優れたモデル系として使える。形質転換された体細胞胚は、パルミチン酸及び十分ではないがステアリン酸の生合成を阻害することを示した。同様に、ブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）パルミトイル−ＡＣＰの全ｃＤＮＡをナタネのナピンプロモーターに対してアンチセンスの向きにクローン化し、このキメラ遺伝子をブラシカ・ナパスに形質転換した。共抑制による植物標的遺伝子の阻害共抑制の現象もまた、組織特異的に植物標的遺伝子を阻害するために用いられてきている。全ｃＤＮＡ配列（Ｎａｐｏｌｉ等、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９９０）２：２７９−２８９、ｖａｎｄｅｒＫｒｏｌ等、ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９９０）２：２９１−２９９）並びに部分的ｃＤＮＡ配列（１７７０ｂｐのｃＤＮＡの７３０ｂｐ）（Ｓｍｉｔｈ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９０）２２４：４７７−４８１）を用いた、内在する遺伝子の共抑制が知られている。パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードしている本発明の核酸フラグメントまたはそれらの一部を、適当な調節配列と共に、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのレベルを減少するために用いることができ、これにより、導入された核酸フラグメントとかなり相同な内在する遺伝子を含有するトランスジェニック植物において、脂肪酸組成を変えることができる。これに必要な実験方法は、全てのまたは一部のｃＤＮＡのいずれかを用いることができる点を除いて、パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ核酸フラグメントのアンチセンス発現のための上記の方法と同様である。内在する遺伝子を、その遺伝子の導入されたコピーのノンコーディング領域によってもまた、阻害することができる（例えば、Ｂｒｕｓｓｌａｎ、Ｊ．Ａ．等、（１９９３）ＰｌａｎｔＣｅｌｌ５：６６７−６７７、Ｍａｔｚｋｅ、Ｍ．Ａ．等、ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１６：８２１− ８３０）。宿主、プロモーター、及びエンハンサーの選択本発明の核酸フラグメントを発現するための異種宿主の好ましい種類は、真核生物の宿主、特に、高等植物の細胞である。高等植物の中で特に好ましいものは、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ、Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓを含む）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓａｎｎｕｓ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａｍａｙｓ）、ココア（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａｃａｃａｏ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）、アブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）、ココヤシ（Ｃｏｃｏｓｎｕｃｉｆｅｒａ）、アマ（Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、及びピーナッツ（Ａｒａｃｈｉｓｈｙｐｏｇａｅａ）のような、油生産種である。植物内での発現は、そのような植物の中で機能する調節配列を用いる。植物内での外来遺伝子の発現は、十分に確立されている（ＤｅＢｌａｅｒｅ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９８７）１５３：２７７−２９１）。本発明のフラグメントを発現させるために選択されるプロモーターは、所望する宿主組織の中で脂肪酸デサチュラーゼに翻訳され得るｍＲＮＡのレベルを、それぞれ増加または減少することにより本発明を達成するのに十分な転写活性があれば、その種類は重要ではない。好ましいプロモーターは、（ａ）カリフラワーモザイクウイルスにおいて１９Ｓ及び３５Ｓ転写産物を導くプロモーターのような、強力な構成的植物プロモーター（Ｏｄｅｌｌ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：８１０ −８１２、Ｈｕｌｌ等、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８７）８６：４８２−４９３）、（ｂ）組織または発生特異的プロモーター、及び（Ｃ）外来遺伝子を発現させるためにバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いたもののような、植物中で設計された他の転写プロモーター系を含む。組織特異的なプロモーターの例は、（もし発現が、光合成組織において所望されるなら）リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットの光誘導性プロモーター、トウモロコシのゼインタンパク質プロモーター（Ｍａｔｚｋｅ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８４）３：１５２５−１５３２）、及び葉緑素のａ／ｂ結合タンパク質プロモーター（Ｌａｍｐａ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３１６：７５０−７５２）である。特に好ましいプロモーターは、種子特異的な発現をさせるものである。種子は植物油の主要な源であり、また、種子特異的な発現は、非種子組織におけるいかなる可能な悪影響も回避するので、このことは特に有用となり得る。種子特異的プロモーターの例は、多くの植物において全種子タンパク質の９０％までに相当することのできる、種子貯蔵タンパク質のプロモーターを含むが、これに限定されるものではない。種子貯蔵タンパク質は、厳密に制御されており、ほとんど種子だけに、非常に組織特異的で発生時期特異的に発現されている（Ｈｉｇｇｉｎｓ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９８４）３５：１９１−２２１、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等、Ｃｅｌｌ（１９８９）５６：１４９−１６０）。さらに、異なる種子貯蔵タンパク質を、種子発生の異なる時期に発現させることができる。種子特異的遺伝子の発現は、非常に詳細に研究されてきている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ等、Ｃｅｌｌ（１９８９）５６：１４９−１６０及びＨｉｇｇｉｎｓ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９８４）３５：１９１−２２１による総説を参照）。現在は、トランスジェニック双子葉植物における種子貯蔵タンパク質の種子特異的発現の多数の例がある。これらは、双子葉植物からの、マメｂ−ファゼオリン（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：３３２０−３３２４、Ｈｏｆｆｍａｎ等、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１１：７１７−７２９）、マメレクチン（Ｖｏｅｌｋｅｒ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８７）６：３５７１−３５７７）、ダイズレクチン（Ｏｋａｍｕｒｏ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８２４０−８２４４）、ダイズクニッツ（Ｋｕｎｉｔｚ）トリプシンインヒビター（Ｐｅｒｅｚ−Ｇｒａｕ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：０９５−１１０９）、ダイズβ−コングリシニン（Ｂｅａｃｈｙ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：３０４７−３０５３）、エンドウマメビシリン（Ｈｉｇｇｉｎｓ等、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１１：６８３−６９５）、エンドウマメコンビシリン（Ｎｅｗｂｉｇｉｎ等、Ｐｌａｎｔａ（１９９０）１８０：４６１−４７０）、エンドウマメレグミン（Ｓｈｉｒｓａｔ等、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９８９）２１５：３２６−３３１）、ナタネナピン（Ｒａｄｋｅ等、Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８８）７５：６８５− ６９４）の遺伝子、並びに、単子葉植物からの、トウモロコシ１５ｋＤゼイン（Ｈｏｆｆｍａｎ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８７）６：３２１３−３２２１）、トウモロコシ１８ｋＤオレオシン（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８８：６１８１−６１８５）、オオムギｂ−ホルデイン（Ｍａｒｒｉｓ等、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１０：３５９−３６６）、及びコムギグルテニン（Ｃｏｌｏｔ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８７）６：３５５９−３５６４）のような遺伝子を含む。さらに、キメラ遺伝子構築物において異種のコーディング配列に作動できるように連結された、種子特異的遺伝子のプロモーターはまた、トランスジェニック植物内でそれらの時間的及び空間的発現型を維持する。そのような例は、アラビドプシス及びブラシカ・ナパス種子中で、エンケファリンペプチドを発現させるためのアラビドプシス・サリアナ２Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子のプロモーター（Ｖａｎｄｅｋｅｒｃｋｏｖｅ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８９）７：９２９−９３２）、ルシフェラーゼを発現させるためのマメレクチン及びマメｂ−ファゼオリンプロモーター（Ｒｉｇｇｓ等、ＰｌａｎｔＳｃｉ．（１９８９）６３：４７−５７）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを発現させるためのコムギグルテニンプロモーター（Ｃｏｌｏｔ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８７）６：３５５９−３５６４）の使用を含む。本発明の核酸フラグメントの発現において特に用いられるのは、クニッツトリプシンインヒビター（Ｊｏｆｕｋｕ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：１０７９−１０９３）、グリシニン（Ｎｉｅｌｓｏｎ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：３１３−３２８）、及びβ−コングリシニン（Ｈａｒａｄａ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：４１５−４２５）のプロモーターのような、いくつかのダイズ種子貯蔵タンパク質遺伝子からの異種プロモーターである。ダイズβ−コングリシニン貯蔵タンパク質のα−及びβ−サブユニット遺伝子のプロモーターは、トランスジェニック植物における種子発生の中期ないし後期で、子葉においてｍＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡを発現するのに特に有用である（Ｂｅａｃｈｙ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：３０４７−３０５３）。なぜなら、トランスジェニック種子におけるこれらの発現にほとんど位置効果がないからであり、２つのプロモーターは、異なる時間的制御を示す。α−サブユニット遺伝子のプロモーターは、β−サブユニット遺伝子のプロモーターの２、３日前に発現される。このことは、油生合成が種子貯蔵タンパク質合成の約１週間前に始まる、形質転換しているナタネには重要である（Ｍｕｒｐｈｙ等、Ｊ．ＰｌａｎｔＰｈｕｓｉｏｌ．（１９８９）１３５：６３−６９）。また、特に用いられるのは、初期胚形成及び油生合成中に発現される遺伝子のプロモーターである。本発明の核酸フラグメントを発現しているパルミトイル− ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の天然のプロモーターを含む天然の調節配列は、当該分野において熟練した者により、単離した後に用いることができる。ブラシカ・ナパスイソクエン酸リアーゼ及びリンゴ酸シンターゼ（Ｃｏｍａｉ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：２９３−３００）、ベニバナ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Λｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２５７８−２５８２）及びカスター（Ｓｈａｎｋｌｉｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：２５１０−２５１４）からのδー９デサチュラーゼ、アラビドプシス（Ｐｏｓｔ−Ｂｅｉｔｔｅｎｍｉｌｌｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８９）１７：１７７７）、ブラシカ・ナパス（Ｓａｆｆｏｒｄ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）１７４：２８７−２９５）、及びブラシカ・カンペストリス（Ｂ．ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（Ｒｏｓｅ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．（１９８７）１５：７１９７）からのアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）、オオムギからのβ−ケトアシルーＡＣＰシンテターゼ（Ｓｉｇｇａａｒｄ−Ａｎｄｅｒｓｅｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：４１１４−４１１８）、並びに、ジー・メイズ（Ｚｅａｍａｙｓ）（Ｌｅｅ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１）８８：６１８１−６１８５）、ダイズ（ジーンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号：Ｘ６０７７３）、及びブラシカ・ナパス（Ｌｅｅ等、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）９６：１３９５−１３９７）からのオレオシンのプロモーターのような、種子油生合成に関与する他の遺伝子からの異種プロモーターが用いられる。もし、これらの対応する遺伝子の配列が開示されていなかったり、またはそれらのプロモーター領域が同定されていなかったら、当該技術部分野において熟練した者は、その対応する遺伝子及びプロモーターを含んでいるそのフラグメントを単離するために、公知の配列を用いることができる。比較的多量にあるエノイルーＡＣＰレダクターゼ及びアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼの部分的タンパク質配列もまた、公知であり（Ｓｌａｂａｓ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８７）８７７：２７１−２８０、Ｃｏｔｔｉｎｇｈａｍ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９８８）９５４：２０１−２０７）、当該技術分野において熟練した者は、対応する種子遺伝子をそれらのプロモーターと共に単離するために、これらの配列を用いることができる。本発明の核酸フラグメントの適切なレベルの発現を達成するためには、異なるプロモーターを用いた異なるキメラ遺伝子を使用する必要があるかもしれない。そのようなキメラ遺伝子は、１つの発現ベクター内に一緒に、または１つより多くのベクターを用いて逐次的に、宿主植物に導入することができる。エンハンサーまたはエンハンサー様要素を、本発明の天然またはキメラのいずれかの核酸フラグメントのプロモーター領域に導入すると、本発明を達成するための発現の増加をもたらすことが予想される。これは、３５Ｓプロモーターに見いだされるようなウイルスのエンハンサー（Ｏｄｅｌｌ等、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８８）１０：２６３−２７２）、オピン遺伝子からのエンハンサー（Ｆｒｏｍｍ等、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ（１９８９）１：９７７−９８４）、または、本発明の核酸フラグメントに作動できるように連結されたプロモーターに配置すると増加した転写をもたらす、あらゆる他の種類からのエンハンサーを含む。特に重要なものは、構成性プロモーターに対して４０倍の種子特異的増大を与えることのできる、βーコングリシニンのα−サブユニット遺伝子から単離されたＤＮＡ配列要素である（Ｃｈｅｎ等、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８９）１０：１１２−１２２）。当該技術分野において熟練した者は、容易にこの要素を単離し、トランスジェニック植物中でプロモーターと共に種子特異的な増大した発現を得るために、ありゆる遺伝子のプロモーター領域内にその要素を挿入することができる。β−コングリシニン遺伝子と異なる時期に発現される、あらゆる種子特異的遺伝子にそのような要素を挿入すると、種子発生中のより長い期間、トランスジェニック植物において発現をもたらす。ポリアデニレーションシグナル及び本発明の核酸フラグメントの適切な発現のために必要とされ得る他の調節配列を提供することのできる３’ノンコーディング領域を、本発明を達成するために用いることができる。これは、天然の脂肪酸デサチュラーゼ、３５Ｓまたは１９Ｓカリフラワーモザイクウイルス転写産物からのようなウイルス遺伝子、オピン合成遺伝子、リブロース１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ、または葉緑素ａ／ｂ結合タンパク質の３’末端を含む。当該技術分野には、異なる３’ノンコーディング領域の有用性を教示する多数の例がある。形質転換法本発明の高等植物の細胞を形質転換する様々な方法を、当該技術分野において熟練した者は利用することができる（ＥＰＯＰｕｂ．０２９５９５９Ａ２及び０３１８３４１Ａ１を参照）。そのような方法は、アグロバクテリウム種（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐｐ．）のＴｉ及びＲｉプラスミドを利用した形質転換用ベクターを基にしたものを含む。これらのベクターのバイナリー型を用いるのが特に好ましい。Ｔｉ由来のベクターは、単子葉及び双子葉植物を含む種々多様な高等植物を形質転換する（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ等、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８７）８：２０９−２１６、Ｐｏｔｒｙｋｕｓ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１９９：１８３）。外来ＤＮＡ構築物の直接取り込み（ＥＰＯＰｕｂ．０２９５９５９Ａ２を参照）、エレクトロポレーションの技術（Ｆｒｏｍｍ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９：７９１）、または核酸構築物で被覆された金属粒子の高速弾道砲撃（Ｋｌｉｎｅ等、Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０）のような他の形質転換法を、当該技術分野において熟練した者は利用できる。いったん形質転換すると、当該技術分野において熟練した者は、それらの細胞を再生することができる。特に関連するものは、ナタネ（ＤｅＢｌｏｃｋ等、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．（１９８９）９１：６９４−７０１）、ヒマワリ（Ｅｖｅｒｅｔｔ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７）５：１２０１）、及びダイズ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９）８６：７５００−７５０４）のような商業的に重要な作物に外来遺伝子を形質転換するために最近記述された方法である。本発明は、以下の実施例においてさらに説明され、その中で、別に記載しないかぎり、全ての割合及びパーセンテージは重量によるものであり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示す一方で、実例としてのみ与えられるものである。上記の解説及びこれらの実施例から、当該技術分野において熟練した者は、本発明の本質的な特徴を見いだし、その意図及び目的に反することなく、様々な使用及び条件に適応するために、本発明の様々な改良及び修正をすることができる。実施例材料及び方法実験操作において用いられる様々な溶液は、「ＳＳＣ」、「ＳＳＰＥ」、「Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液」等のような、それらの一般名により示す。これらの溶液の組成、並びに核酸の標準的な操作、形質転換、及び大腸菌の生育のためのいかなる方法も、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等の参考図書（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）により見い出すことができる。生育培地植物胚培養組織の生育のための培地を、以下に示す。植物胚培養培地培地ＳＢ５５及びＳＢＰ６ストック溶液（ｇ／Ｌ）ＭＳ硫酸塩１００ｘストックＭｇＳＯ₄ ７Ｈ₂Ｏ３７．０ＭｎＳＯ₄ Ｈ₂Ｏ１．６９ＺｎＳＯ₄ ７Ｈ₂Ｏ０．８６ＣｕＳＯ₄ ５Ｈ₂Ｏ０．００２５ＭＳハロゲン化物１００ｘストックＣａＣｌ₂ ２Ｈ₂Ｏ４４．０ＫＩ０．０８３ＣｏＣｌ₂ ６Ｈ₂Ｏ０．００１２５ＫＨ₂ＰＯ₄ １７．０Ｈ₃ＢＯ₃ ０．６２Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ２Ｈ₂Ｏ０．０２５ＭＳＦｅＥＤＴＡ１００ｘストックＮａ₂ＥＤＴＡ３．７２４ＦｅＳＯ₄ ７Ｈ₂Ｏ２．７８４Ｂ５ビタミンストック１０ｇｍ−イノシトール１００ｍｇニコチン酸１００ｍｇピリドキシンＨＣｌ１ｇチアミンＳＢ５５（リットル当たり）１０ｍＬ各ＭＳストック１ｍＬＢ５ビタミンストック０．８ｇＮＨ₄ＮＯ₃ ３．０３３ｇＫＮＯ₃ １ｍＬ２，４−Ｄ（１０ｍｇ／ｍｌストック）６０ｇショ糖０．６６７ｇアスパラギンｐＨ５．７ＳＢＰ６−には、０．５ｍＬ２，４−Ｄを代用する。ＳＢ１０３（リットル当たり）ＭＳ塩６％マルトース７５０ｍｇＭｇＣｌ₂ ０．２％ゲルライトｐＨ５．７ＳＢ７１−１（リットル当たり）Ｂ５塩１ｍＬＢ５ビタミンストック３％ショ糖７５０ｍｇＭｇＣｌ₂ ０．２％ゲルライトｐＨ５．７実施例４に記述された、ブラシカ・ナパス細胞の形質転換及びアグロバクテリウムの生育のための培地は、以下の通りである。最小Ａバクテリア生育培地１０．５グラムリン酸カリウム、二塩基４．５グラムリン酸カリウム、一塩基１．０グラム硫酸アンモニウム０．５グラムクエン酸ナトリウム、二水和物を蒸留水に溶解する。蒸留水で９７９ｍＬにする。オートクレーブする。２０ｍＬのフィルター滅菌した１０％ショ糖を加える。１ｍＬのフィルター滅菌した１ＭＭｇＳＯ₄を加える。ブラシカカルス培地ＢＣ−２８リットル当たり、ムラシゲ・スクーグ最小有機培地（ＭＳ塩、１００ｍｇ／Ｌｉ−イノシトール、０．４ｍｇ／Ｌチアミン；ＧＩＢＣＯ＃５１０−３１１８）３０グラムショ糖１８グラムマンニトール１．０ｍｇ／Ｌ２，４−Ｄ０．３ｍｇ／Ｌカイネチン０．６％アガロースｐＨ５．８ブラシカ再生培地ＢＳ−４８ムラシゲ・スクーグ最小有機培地ガンボルグＢ５ビタミン（ＳＩＧＭＡ＃１０１９）１０グラムグルコース２５０ｍｇキシロース６００ｍｇＭＥＳ０．４％アガロースｐＨ５．７２．０ｍｇ／Ｌゼアチン０．１ｍｇ／ＬＩＡＡをフィルター滅菌し、オートクレーブ後に加える。ブラシカシュート伸長培地ＭＳＶ−１Ａムラシゲ・スクーグ最小有機培地ガンボルグＢ５ビタミン１０グラムショ糖０．６％アガロースｐＨ５．８チオエステラーゼアッセイチオエステラーゼ活性の存在をアッセイするために、［¹⁴Ｃ］放射性標識されたアシルＡＣＰ基質を調整した。この基質の調整は、ＡＣＰ及び大腸菌からのＡＣＰシンテターゼの単離、並びに［¹⁴Ｃ］脂肪酸のＡＣＰタンパク質との酵素反応を必要とした。大腸菌からのアシルキャリヤータンパク質（ＡＣＰ）の精製（最小培地で生育した大腸菌Ｂの１／２対数増殖期のもの０．５ｋｇで、ＧｒａｉｎＰｒｏｃｅｓｉｎｇＣｏｒｐ、ＭｕｓｃａｔｉｎｅＩＡから入手した）凍結した大腸菌細胞ペーストに、５０ｍＬの１Ｍトリス、１Ｍグリシン、及び０．２５ＭＥＤＴＡ溶液を加えた。１０ｍＬの１ＭＭｇＣｌ₂を加え、この懸濁液を５０℃の水浴中で融解した。懸濁液が３７℃に近づくと、３７℃浴に移し、２−メルカプトエタノールが１０ｍＭになるようにし、２０ｍｇのＤＮＡｓｅ及び５０ｍｇのリゾチームを加えた。この懸濁液を２時間撹拌し、次に、ＷａｒｉｎｇＢｌｅｎｄｏｒ中で３回の２０秒破砕により剪断した。この容量を１Ｌに調整し、この混合液を２４，０００ｘｇで３０分間遠心分離した。得られた上清を、９０，０００ｘｇで２時間遠心分離した。得られた高速ペレットをアシル−ＡＣＰシンターゼの抽出（以下参照）のために保存し、上清を、酢酸の添加によりｐＨ６．１に調整した。次に、この抽出物の撹拌溶液に０℃で冷２−プロパノールをゆっくりと加えることにより、５０％２−プロパノールになるようにした。２時間沈殿させ、次に、得られた沈殿物を１６，０００ｘｇでの遠心分離により除去した。得られた上清をＫＯＨでｐＨ６．８に調整し、１０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．８で平衡化したＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）の４．４ｘ１２ｃｍカラムに２ｍＬ／分で添加した。このカラムを１０ｍＭＭＥＳ、ｐＨ６．８で洗浄し、同バッファー中０から１．７Ｍの１ＬのＬｉＣｌの濃度勾配で溶出した。２０ｍＬのフラクションを集め、２フラクションごとの１０μ Ｌをネイティブポリアクリルアミド（２０％アクリルアミド）ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のレーンにのせることにより、溶出されたＡＣＰの位置を決定した。約０．７ＭＬｉＣｌで溶出されるフラクションに殆ど純粋なＡＣＰが含まれており、これらを合わせ、水に対して一晩透析し、次いで凍結乾燥した。アシル−ＡＣＰシンターゼの精製上記の高速遠心分離から得られた膜ペレットを、３８０ｍＬの５０ｍＭトリス −Ｃｌ、ｐＨ８．０及び０．５ＭＮａＣｌ中でホモジナイズし、次に、８０，０００ｘｇで９０分間遠心分離した。得られた上清を捨て、ペレットを１２ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度になるように、５０ｍＭトリス−Ｃｌ，ｐＨ８．０に再懸濁した。この膜懸濁液を２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００及び１０ｍＭＭｇＣｌ₂ になるようにし、０℃で２０分間撹拌後、８０，０００ｘｇで９０分間遠心分離した。得られた上清中のタンパク質を、５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０中２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００で５ｍｇ／ｍＬに希釈し、次に、固体ＡＴＰ（二ナトリウム塩）を同モル量のＮａＨＣＯ₃と共に加えることにより、５ｍＭＡＴＰになるようにした。この溶液を、内部温度が５３℃になるまで、５５度浴中で暖め、次に５３℃及び５５℃の間で５分間保持した。５分後にこの溶液を氷上で急冷し、１５，０００ｘｇで１５分間遠心分離した。熱処理工程から得られた上清を、５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０及び２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で平衡化した７ｍＬのブルーセファロース（ＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂのカラムに直接添加した。このカラムを５容量のローディングバッファー、次いで、５容量の同バッファー中０．６ＭのＮａＣｌで洗浄し、同バッファー中０．５ＭのＫＳＣＮで活性を溶出した。活性フラクションを下記のようにアシル−ＡＣＰの合成に対してアッセイし、これらを合わせ、そして、５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００に平衡化した、３ｍＬの静置容量のヒドロキシアパタイトに結合させた。このヒドロキシアパタイトを遠心分離により集め、２０ｍＬの５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で２回洗浄した。０．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７．５、２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の５ｍＬ洗浄２回により、活性を溶出した。この第一回目の洗浄は、活性の６６％を含んでおり、これを３０ｋＤ膜濾過濃縮機（Ａｍｉｃｏｎ）で１．５ｍＬに濃縮した。放射性標識したアシル−ＡＣＰの合成メタノール中に調製した、［¹⁴Ｃ］パルミチン酸、［¹⁴Ｃ］ステアリン酸、［¹⁴ Ｃ］オレイン酸、［¹⁴Ｃ］ラウリル酸、及び［¹⁴Ｃ］デカン酸（各１２０ｎｍｏｌｅｓ）の溶液をガラス反応瓶中で乾燥した。上記のＡＣＰ調製物（１．１５ｍＬ、３２ｎｍｏｌｅｓ）を、０．１ＭＭｇＣｌ₂と０．１ｍＬの０．１ＭＡＴＰ、０．０５ｍＬの８０ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＬの８ＭＬｉＣｌ、及び０．５Ｍトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０中１３％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００２ｍＬと共に加えた。この反応液を完全に混合し、０．３ｍＬのアシル−ＡＣＰシンターゼ調製物を加え、この反応液を３７℃でインキュベートした。０．５時間ごとに１０μｌ量を採り、小濾紙ディスク上で乾燥した。このディスクをクロロホルム：メタノール：酢酸（８：２：１、ｖ：ｖ：ｖ）でよく洗浄し、ディスク上に保持された放射能を［¹⁴Ｃ］−アシル−ＡＣＰの量とした。２時間で約８８％のＡＣＰが消費された。この反応混合液を、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０で１対４に希釈し、同バッファーに平衡化した１ｍＬのＤＥＡＥ−セファセルカラムに添加した。このカラムを、５ｍＬの２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０中８０％の２−プロパノール５ｍＬで続いて洗浄し、２０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０中０．５ＭのＬｉＣｌで溶出した。このカラム溶出物を、オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂの３ｍＬカラムに直接通し、このカラムを１０ｍＬの２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８で洗浄し、次いで、２ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．８中３５％の２−プロパノールで溶出した。この溶出物を凍結乾燥し、２４ μＭの濃度で再溶解した。実施例１ダイズ及びカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡの単離中鎖脂肪族アシル−ＡＣＰチオエステラーゼに相同な配列を有するアラビドプシスｃＤＮＡのＤＮＡプローブのＰＣＲ合成（アラビドプシス・サリアナの計画的ｃＤＮＡシークエンシングは、ウンベルラリア・カリフォルニカ（Ｕｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）のＣ１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼに相同性を有する遺伝子を見いだした（Ｆｒａｎｃｏｉｓｅ等、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１、５９９、（１９９３））。）ジーンバンク登録Ｚ１７６７８から得られた、アラビドプシス・サリアナの転写されたゲノムのシークエンシングプロジェクトにおいてシークエンスされたアラビドプシスｃＤＮＡの配列の一部（クローンＹＡＰ１４０Ｔ７）、及びその配列を用いて得られ、Ｄｒ．ＪｏｈｎＯｈｒｏｌｇｇｅ（ミシガン州立大学）から送られたアラビドプシスサリアナｃＤＮＡクローンからの追加配列を、配列番号３（５’伸長プライマー）及び配列番号４（３’伸長プライマー）に示す２つのＰＣＲプライマーを作るために用いた。全ＲＮＡをアラビドプシス植物のｇｒｅｅｎｓｅｌｉｑｕｅｓから抽出し、ポリソームＲＮＡをＫａｍａｌａｙ等の方法（Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：９３５−９４６）に従って単離した。ポリアデニル酸の付加したｍＲＮＡフラクションを、オリゴ−ｄＴセルロースのアフィニティークロマトグラフィーにより得た（Ａｖｉｖ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７２）６９：１４０８−１４１１）。１３ｎｇのポリアデニル酸の付加したｍＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ^R ＲＮＡ−ＰＣＲキット（商標）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ、部品番号Ｎ８０８−００１７）を用いた、オリゴ−ｄＴからの増幅のための鋳型として用いた。ＰＣＲは、５２℃のアニーリング温度で３５サイクル行った。約５６０塩基対のＤＮＡフラグメントが生じ、これをアガロースゲル精製により単離した。単離されたフラグメントを、［³²Ｐ］ｄＣＴＰでのランダムプライマーラベリングのための鋳型として用いた。アラビドプシスチオエステラーゼ様フラグメントに相同なブラシカ・ナパス種子ｃＤＮＡのクローニング放射性標識したプローブを、ブラシカ・ナパス種子ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために用いた。ライブラリーを構築するために、ブラシカ・ナパスの種子を授粉後２０−２１日目に採取し、液体窒素中に置き、ポリソームＲＮＡをＫａｍａｌａｙ等の方法（Ｃｅｌｌ（１９８０）１９：９３５−９４６）に従って単離した。ポリアデニル酸の付加したｍＲＮＡフラクションを、オリゴ −ｄＴセルロースのアフィニティークロマトグラフィーにより得た（Ａｖｉｖ等、上記）。このｍＲＮＡの４ μｇを、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ＿合成キット（１９９１Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ、品目＃２００４００）に記述されたプロトコルを用いて、ラムダファージ（Ｕｎｉ−ＺＡＰ＿ＸＲベクター）中に種子ｃＤＮＡライブラリーを構築するために用いた。低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．６、６ｘＳＳＣ、５ｘＤｅｎｈａｒｄ’ｓ、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ変性子ウシ胸腺ＤＮＡ及び５０℃）を用い、ハイブリダイゼーション後の洗浄を、２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間を２回、次いで０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温で１５分間を２回、そして次に０．２ｘＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃で１５分間を２回行うことを除いて、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋ等、上記、に記述されたようにして、陽性にハイブリダイズするプラークを得るために、上記の放射性標識したＰＣＲ由来のプローブを用いて、約２４０，０００クーンをスクリーニングした。強いハイブリダイゼーションを示す、９個の陽性プラークを選び、他のプレートに培養し、スクリーニング手順を繰り返した。この２次スクリーニングから、４個の純粋なファージプラークを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手したインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）切出しプロトコルに従って、ヘルパーファージを用いることにより、ｃＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドクローンを得た。Ｍａｇｉｃ^R Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びその製造業者の説明書を用いて、二本鎖ＤＮＡを調製し、得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動により、大きさの分析をした。ｐ５ａと命名した、４つのクローンのうちの１つは、約１．５ｋｂのインサートを含んでおり、このインサートをダイデオキシ法により両鎖からシークエンスした。ｐ５ａのｃＤＮＡインサートの１４８３塩基の配列を、配列番号１に示す。ｐ２ａと命名した、２番目のクローンもまた、シークエンスをし、配列番号３１に示す１６７３塩基対のｃＤＮＡを含むことを見いだした。２つのｃＤＮＡインサートの配列は全体で８５％同一で、全体で９２％同一であるが推定される成熟ペプチド（色素体輸送配列を除去後のペプチド）の領域内では９４％同一であるペプチドをコードする。成熟ペプチドをコードする２つのｃＤＮＡのｃＤＮＡ領域は、９０．４％同一である。これら２つのｃＤＮＡは、おそらく同じ活性の２つのアイソザイムをコードする。これら２つの配列の輸送ペプチドの長さ、各ｃＤＮＡの長さ、及び以下に示すダイズの配列に対する整列に基づくと、クローンｐ５ａのｃＤＮＡは、実際のメッセージをわずかに欠いたものであり、一方クローンｐ２ａは、全長のメッセージに相当することがわかる。クローンｐ２ａから単離されたｃＤＮＡをシークエンスし、その配列を配列番号３１に示す。アラビドプシスのチオエステラーゼ様フラグメントに相同なダイズ種子ｃＤＮＡのクローニングｃＤＮＡライブラリーを以下のように作製した。ダイズ胚（各約５０ｍｇの新鮮重量）を莢から取り、液体窒素中で凍結した。この凍結した胚を、液体窒素の存在下で微小粉末にすりつぶし、次にＰｏｌｙｔｒｏｎホモジナイゼーションにより抽出し、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ等の方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７９）１８：５２９４−５２９９）により、全ＲＮＡを濃縮するために分別した。Ｇｏｏｄｍａｎ等（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７９）６８：７５−９０）により記述されるように、全ＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースカラムに通し、塩でポリＡ⁺ＲＮＡを溶出することにより、核酸フラクションをポリＡ⁺ＲＮＡに対して濃縮した。ｃＤＮＡ合成システム（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）及びその製造業者の説明書を用いて、精製したポリＡ⁺ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。得られた二本鎖のＤＮＡをＥｃｏＲＩＤＮＡメチラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によりメチル化し、その両端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）で平滑化し、そしてＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＵｐｓａｌｌａＳｗｅｄｅｎ）を用いて、リン酸化したＥｃｏＲＩリンカーに平滑末端ライゲーションをした。この二本鎖ＤＮＡをＥｃｏＲＩ酵素で消化し、ゲル濾過カラム（セファロースＣＬ−４Ｂ）に通すことにより過剰のリンカーから分離し、そして製造業者の説明書に従ってラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、１１０９Ｎ．ＴｏｒｒｅｙＰｉｎｅＲｄ．、ＬａＪｏｌｌａＣＡ．）に連結した。製造業者の説明書に従って、Ｇｉｇａｐａｃｋパッケージングエキストラクト（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、連結したＤＮＡをファージにパッケージングした。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの説明書のとおりに、得られたｃＤＮＡライブラリーを増幅し、−８０℃で保存した。ラムダＺＡＰクローニングキットマニュアル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の説明書に従って、大腸菌ＢＢ４細胞を感染させるためにｃＤＮＡファージライブラリーを用い、６枚の直径１５０ｎｍのペトリプレート上に合計約３６０，０００のプラーク形成単位を培養した。これらのプレートの写しをニトロセルロースフィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）上に作製した。これらのフィルターを、６ｘＳＳＰＥ、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、０．５％ＳＤＳ、５％デキストラン硫酸及び０．１ｍｇ／ｍＬ変性サケ***ＤＮＡ（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．）から成る２５ｍＬのハイブリダイゼーションバッファー中、５０℃で２時間プレハイブリダイゼーションした。上記のアラビドプシスのＰＣＲ産物に基づく放射性標識したプローブを加え、５０℃で１８時間ハイブリダイズさせた。これらのフィルターを全く上記のように洗浄した。これらのフィルターのオートラジオグラフィーは、９個の強くハイブリダイズしているプラークがあることを示した。これらの９個のプラークを前記のような２次スクリーニングに供した。この２次スクリーニングから、３個の純粋なファージプラークを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手したインビボ切出しプロトコルに従って、ヘルパーファージを用いることにより、ｃＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドクローンを得た。Ｍａｇｉｃ^R Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びその製造業者の説明書を用いて、二本鎖ＤＮＡを調製し、得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動により、大きさの分析をした。ｐ２３３ｂと命名した、４つのクローンのうちの１つは、約１．２ｋｂのインサートを含んでおり、このインサートの片方の鎖をダイデオキシ法により部分的にシークエンスした。シークエンスしたｐ２３３ｂの３１１塩基は、ＰＣＲプローブの基となったアラビドプシスのチオエステラーゼ様配列と比較して、８１．２％同一の配列を示した。最初のスクリーニングから単離された他の２個のクローンは、最初のインサートがｐ２３３ａと同様な大きさであるｃＤＮＡコンカテマーであることがわかった。ｐ２３３ａの５’末端の配列のカノラ配列及びアラビドプシス配列の両方との比較は、ｐ２３３ａが推定されるチオエステラーゼの５’末端を欠いたものであることを示した。ｐ２３３ｂのｃＤＮＡインサートをＥｃｏＲＩでの消化により取り出し、このインサートをアガロースゲル電気泳動により精製した。この精製したインサートを上記のランダムプライマーラベリングのための鋳型として用いた。ダイズ種子ｃＤＮＡライブラリーの約１５０，０００プラーク形成単位を、上記のように３枚のプレート上に培養し、写しのニトロセルロースを高いストリンジェンシー（６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で１８時間のハイブチダイゼーション、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６０℃で各１０分間２回の洗浄）でスクリーニングした。得られた１８個の陽性プラークのうち、ｐＴＥ１１と命名し、１．５ｋｂのインサートを含んでいる１個を、ダイデオキシ法によるシークエンシングのために選択した。ｐＴＥ１１のダイズｃＤＮＡインサートの中の１６８８塩基の配列を配列番号２に示す。実施例２アラビドプシスからの推定チオエステラーゼに相同な、ダイズ及びカノラｃＤＮＡによりコードされる、触媒活性のあるタンパク質の大腸菌での発現プロタンパク質をコードすると考えられる、ダイズ及びカノラのチオエステラーゼと推定されるｃＤＮＡの一部を発現させるためのプラスミドベクターを、（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、Ａ．Ｈ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｊ．Ｄｕｎｎ及びＪ．Ｗ．Ｄｕｂｅｎｄｏｆｆ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８５巻に記述されている）ベクターｐＥＴ−３ｄ及び宿主細胞株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＥ）を用いて作製した。カノラのクローンｐ５ａを、１２３５塩基対のフラグメントを取り出すために、ＰｖｕＩＩ及びＨｉｎＤＩＩＩで消化し、このフラグメントをＤＮＡポリメラーゼＩで平滑化した後、アガロースゲル電気泳動により単離した。一緒にアニーリングすると、以下のリンカー配列を形成する、２つのオリゴヌクレオチドを合成した。このリンカーを、１２３５塩基対のフラグメントに連結し、次にそれをＮｃｏＩ消化し子ウシ腸ホスファターゼ処理したｐＥＴ−３ｄに連結した。このライゲーション混合液を、ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙＥ）コンピテントセルを形質転換するために用い、２０個のアンピシリン耐性のコロニーを５ｍＬの液体培養に接種するために用いた。これらの培養菌からプラスミドＤＮＡを調製し、インサートの存在及びインサートのＴ７プロモーターに対する向きを確認するために、ＰｖｕＩＩ、ＮｃｏＩ、及びＥｃｏＲＩで消化した。インサートを有するプラスミドが１つだけ得られ、そのプロモーターに対するコーディング領域の向きは逆であった。このプラスミドＤＮＡをＮｃｏＩで消化し、そのインサートを単離し、そして上記のようにＮｃｏＩ消化しホスファターゼ処理したｐＥＴ−３ｄに再連結した。このライゲーション混合液を、ＸＬ−１コンピテントセルを形質転換するために用いた。１０個の単離されたコロニーを、５ｍＬの液体培養に接種するために用い、プラスミドＤＮＡを単離した。これらのＥｃｏＲＩ消化フラグメントのパターンにより、３個のクローンが正方向にあることを確認した。クローニング部位にまたがる領域をシークエンスし、リンカーＤＮＡ配列によりコードされる開始メチオニンが、カノラｃＤＮＡによりコードされるタンパク質とフレームが合うように配置され、配列番号６に示す推定アミノ酸配列を与えることを見いだした。ダイズｃＤＮＡを含んでいるプラスミドｐＴＥ１１をＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩで平滑化し、得られた１２０８塩基対のフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。このフラグメントに上記のリンカーを連結し、その産物を、上のカノラｃＤＮＡフラグメントに対して記述したように、ｐＥＴ−３ｂベクターに連結した。このライゲーション混合液を、ＸＬ−１コンピテントセルを形質転換するために用い、得られたコロニーのうちの１０個を５ｍＬの液体培養に接種するために用いた。これらの培養菌から単離されたプラスミドＤＮＡを、ｃＤＮＡインサートの存在を確認するためにＮｃｏＩで消化し、Ｔ７プロモーターに対するインサートの向きを確認するためにＨｐａＩ及びＳｐｈＩで消化した。正しい向きのインサートを有する１つのクローンが得られ、これをＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＥ）コンピテントセルを形質転換するために用いた。発現されるタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号７に示す。ｐＥＴ：カノラ及びダイズｃＤＮＡ発現ベクターを保有するＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＬｙｓＥ）株の単一コロニーを、５０ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含む５ｍＬの２ｘＹＴ培地に接種するために用いた。これらの培養菌を３７℃で一晩培養し、新しく調製したアンピシリンを含む培地で６００ｎｍで０．１ＯＤに希釈し、６００ｎｍで１．５ＯＤまで３７℃で再培養した。１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧを加えることにより、両培養菌を誘導した。誘導後３時間で、遠心分離により細胞を集めた。この細胞ペレットとほぼ等量の溶菌バッファー（５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１５ｍＭＮａＣｌ、０．５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、及び１５％グリセロール）を加え、これらの細胞をボルテックス混合により再懸濁した。超音波処理の直前に、少量の２ｍｍガラスビーズ、及び最終濃度が０．２ｍＭになるように２−プロパノール中０．２ＭのＰＭＳＦを加えた。この細胞溶菌液をきれいにするためにマイクロフュージ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）で遠心分離し、カノラｃＤＮＡを発現している細胞株の上清を、１．８ｍｇ／ｍＬの溶菌タンパク質濃度になるように、５０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）（ｐＨ８．２、１ｍｇ／ｍＬＢＳＡ、及び１ｍＭＤＴＴ）で１対２０に希釈した。同様に、ダイズｃＤＮＡを発現している細胞株を、２．４ｍｇ／ｍＬの溶菌タンパク質濃度になるように、１対５に希釈した。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼアッセイチオエステラーゼアッセイのための試薬及び基質を、材料及び方法の項において記述したように調製する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｍｃｋｅｏｎ及びＳｔｕｍｐｆにより記述された（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８２）２５７：１２１４１−１２１４７）ようにアッセイした。放射性標識したアシル− ＡＣＰの各々を、ｐＨ９．５のＣＡＰＳ−ＮａＯＨバッファー（５０ｍＭ）中１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンから成る反応バッファーで、０．１８μＭから２．０６μＭの範囲の濃度及び４０μＬの容量に調整した。ダイズ種子またはカノラ種子のいずれかからの推定アシル−ＡＣＰチオエステラーゼの植物ｃＤＮＡを発現している大腸菌からの溶菌液で反応を開始し、そのフラクションの活性により、１２秒から１分まで変わる時間の間インキュベートした。２−プロパノール中５％の酢酸溶液１００μｌを加えることにより反応を停止し、水飽和したヘキサン各１ｍｌで２回抽出した。これらを合わせた抽出物に、５ｍＬのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅＢｉｏＨＰ（Ｆｉｓｈｅｒ）シンチレーション液を加え、遊離した脂肪酸中の放射能をシンチレーション計数により測定した。チオエステラーゼを発現しているプラスミドで形質転換しなかった培養菌からの大腸菌抽出物に行ったチオエステラーゼアッセイは、１μＭの基質濃度で行われた時、パルミトイル−ＡＣＰ、ステアロイル−ＡＣＰ、及びオレオイル−ＡＣＰアッセイにおいて、約０．０２５ｎｍｏｌｅ／分／ｍｇタンパク質の比活性であった。この大腸菌のバックグラウンドは、植物チオエステラーゼを発現している株において見いだされる活性より、７０から１５０倍低いので、以下のデータにおいては無視する。ダイズ酵素に対しては４つの基質濃度で、カノラ酵素に対しては最大活性を与える濃度でアッセイを行った。各基質濃度で、利用できる基質の２５％未満が消費されるようにアッセイを行い、表２に挙げる基質濃度は、反応時間中の平均濃度である。表２のデータは、ダイズ及びカノラの酵素の両方が、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼであることを示す。いずれの酵素も、最初にそれらが相同であると同定された酵素（アラビドプシス・サリアナの計画的ｃＤＮＡシークエンシングは、ウンベルラリア・カルフォルニカのＣ１２：０−ＡＣＰチオエステラーゼに相同性を有する遺伝子を明らかにする。ＦｒａｎｃｏｉｓｅＧｒｅｌｌｅｔ、ＲｉｃｈａｒｄＣｏｏｋｅ、ＭｏｎｉｑｕｅＲａｙｎａｌ、ＭｉｃｈｅｌｅＬａｕｄｉｅ及びＭｉｃｈｅｌＤｅｌｓｅｎｙ、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９３３１：５９９−６０２）の基質であるラウロイル− ＡＣＰまたはデカノイル−ＡＣＰに対しては有意な活性をもたない一方で、両酵素ともより長いアシル鎖−ＡＣＰに対して活性がある。両酵素とも、ステアロイル−ＡＣＰまたはオレオイル−ＡＣＰのいずれかより、パルミトイル−ＡＣＰに対して、２及び３倍の間の選択性を有する。このことは、オレオイル−ＡＣＰに対して強い基質選択性を示す、これらの種からの既知のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（国際公開第９２１１３７３号）と対照的である。従って、これらの酵素は、長鎖飽和アシル−ＡＣＰに対して基質選択性を有する、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼと同じ組織内に存在する、２番目の種類のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼに相当する。実施例３ダイズにおけるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現の制御発生中のダイズ種子におけるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を減少するための、グリシン・マックス形質転換用ベクターの構築ダイズβ−コングリシニンプロモーター（Ｂｅａｃｈｙ等、ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：３０４７−３０５３）の制御の下に、アンチセンスのグリシン・マックス（Ｇ．ｍａｘ）パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのｃＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドを構築した。これらのプロモーターの制御の下で、ダイズのδ−１２デサチュラーゼのアンチセンスｃＤＮＡを発現しているベクターの構築は、国際公開第９４１１５１６号に記述されているプラスミドｐＣＷ１０９及びｐＭＬ１８を用いることにより、容易となった。ｐＣＷ１０９をＮｃｏＩ及びＸｂａＩで消化し、続いてその一本鎖ＤＮＡ末端をマングビーンエキソヌクレアーゼで除くことにより、ｐＣＷ１０９のβ−コングリシニンプロモーター及びファゼオリン３’末端の間のクローニング領域に、単一のＮｏｔＩ部位を導入した。この直鎖状プラスミドにＮｏｔＩリンカー（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号ＮＥＢ１１２５）を連結し、プラスミドｐＡＷ３５を作製した。ｐＭＬ１８をＮｏｔＩで消化し、その一本鎖末端をｄＮＴＰｓ及びＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化し、続いてこの直鎖状プラスミドを再連結することにより、ｐＭＬ１８内の単一のＮｏｔＩ部位を消失させた。この改変したｐＭＬ１８を、次に、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理した。ｐＡＷ３５内のβ−コングリシニン：ＮｏｔＩ：ファゼオリン発現カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより取り出し、この１．７９ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。この単離したフラグメントを、上記の改変し直鎖状にしたｐＭＬ１８構築物に連結した。β−コングリシニン転写単位の向きが、選択可能なマーカー転写単位と同じであることを示している、１．０８ｋｂのフラグメントを取り出すためのＮｏｔＩ及びＸｂａＩでの消化により、所望する方向性を有するクローンを同定した。得られたプラスミドをｐＢＳ１９と命名した。ＮｏｔＩ制限酵素部位及びＮｏｔＩ消化のための十分な添加塩基を与えるための付加塩基と共に、配列番号１の塩基１ないし１６に相当するＰＣＲ増幅プライマー、ＳＯＹＴＥ３（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＡＣＡＣＡＡＴＡＧＣＣＣＴＴＣＴ−３’）（配列番号５）、並びに、ＮｏｔＩ制限酵素部位及びＮｏｔＩ消化のための十分な添加塩基を与えるための付加塩基と共に、配列番号１の塩基１６４０ないし１６５７の逆向きの相補鎖に相当するＰＣＲ増幅プライマー、ＳＯＹＴＥ４（５’−ＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＡＴＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＣ−３’）（配列番号１２）を合成した。これらのプライマー、鋳型としてｐＴＥ１１、及び標準的なＰＣＲ増幅方法（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｌｅｒＣｅｔｕｓ、ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲキット）を用いて、ｐ２３３ｂの１．６ｋｂフラグメントを増幅し、アガロースゲル電気泳動により単離した。このフラグメントをＮｏｔＩで３７℃で一晩消化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、続いてクロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行った。プラスミドｐＢＳ１９をＮｏｔＩで消化し、子ウシ腸ホスファターゼで処理し、そしてこの直鎖状プラスミドをアガロースゲル電気泳動により精製した。上記のＮｏｔＩ消化し、ＰＣＲ増幅したｐＴＥ１１のフラグメントを、直鎖状にしたｐＢＳ１９に連結し、このライゲーション混合液をＸ１−１コンピテントセルを形質転換するために用いた。ダイズパルミトイルーＡＣＰｃＤＮＡがβ−コングリシニンプロモーターに対してアンチセンスの方向に向いているクローンを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより同定した。アンチセンスの向きは、１．６及び１．９ｋｂのフラグメントを取り出し、一方センスの向きは、１．１５及び２．３ｋｂのフラグメントを取り出す。アンチセンスのダイズパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼプラスミドをｐＴＣ３と命名し、センスの向きのプラスミドをｐＴＣ４と命名した。ダイズ体細胞胚培養組織の形質転換ダイズ胚形成懸濁培養を、混合の蛍光及び白熱照明で、１６：８時間の日／夜スケジュールで、回転振とう培養機（１５０ｒｐｍ）上、２８℃で、３５ｍＬの液体培地（ＳＢ５５又はＳＢＰ６、材料及び方法）中で続けた。約３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地に移植することにより、４週ごとに培養組織を継代培養した。ダイズ胚形成懸濁培養組織を、粒子銃砲撃（パーティクルガンボンバードメント）の方法（Ｋｌｉｎｅ等、（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０を参照）により、ｐＴＣ３で形質転換した。ＤｕＰｏｎｔＢｉｏｌｉｓｔｉｃＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム改良装置）をこれらの形質転換のために用いた。５０ｍＬの６０ｍｇ／ｍＬ１ｎｍ金粒子懸濁液に対して、（順に）５ μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬのスペルミジン（０．１Ｍ）、及び５０μＬのＣａＣｌ₂（２．５Ｍ）を加えた。この粒子調製物を３分間撹拌し、マイクロフュージで１０秒間回転し、その上清を除いた。このＤＮＡが被覆した粒子を次に、４００μＬの７０％エタノールで一度洗浄し、４０μＬの無水エタノール中に懸濁した。このＤＮＡ／粒子懸濁液を各１秒間ずつ３回、超音波処理をした。このＤＮＡが被覆した金粒子の５μＬを次に、各マクロキャリヤーディスク上にのせた。４週目の懸濁培養組織の約３００−４００ｍｇを空の６０ｘ１５ｍｍペトリ皿に置き、残余の液体を組織からピペットで除いた。各形質転換実験に対して、約５−１０プレートの組織を通常砲撃する。膜破壊圧力を１０００ｐｓｉに合わせ、輪胴を２８インチ水銀の真空度までにした。組織を保持スクリーンから約３．５インチ離して置き、３回砲撃した。砲撃後、この組織を液体に戻し、上記のように培養した。砲撃後１１日目に、液体培地を５０ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含む、新しく調製したＳＢ５５と交換した。この選択培地は毎週新しくした。砲撃後７週間目に、緑色の形質転換された組織が、形質転換されなかった壊死状態の胚形成塊から生長しているのが観測された。単離された緑色組織を取り除き、これを、新しい、クローンとして増殖した、形質転換された胚形成懸濁培養組織を作るために、個々のフラスコに移植した。従って、各々の新しい系統は、別個の形質転換結果として扱った。これらの懸濁液は、次に、継代培養を通して未成熟な発生段階に塊化した胚の懸濁液として維持するか、または、個々の体細胞胚の成熟及び発芽により全植物体に再生することができる。形質転換された胚形成塊を液体培養から取り、ホルモンまたは抗生物質を含まない固体寒天培地（ＳＢ１０３、材料及び方法）上に置床した。胚は、分析の前に、混合の蛍光及び白熱照明で、１６：８時間の日／夜スケジュールで、２６℃ で４週間培養した。アンチセンスパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ構築物を保有するトランスジェニックグリシン・マックス胚の分析上記のダイズβ−コングリシニンプロモーターの制御の下、アンチセンスの向きにダイズパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡを含んでいるベクターｐＴＣ３は、７つの成熟胚系統を生じた。形質転換に用いた胚系統の培養組織は、脂肪酸分析のコントロール系統として使用するために、形質転換または選択をせずに成熟胚まで培養を続けた。脂肪酸の分析を、メタノール中２．５％のＨ₂ ＳＯ₄をメチル化試薬として用い、単一の成熟胚を組織源をして用いた胚脂質のメタノリシスもたらすためにサンプルを８０度℃で１．５時間加熱したことを除いて、本質的にＢｒｏｗｓｅ等（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８６）１５２：１４１−１４５）により記述されたような、脂肪アシルメチルエステルのガスクロマトグラフィーにより行った。各形質転換株からの９ないし１０個の胚及び非形質転換コントロールからの５個の胚を分析し、その結果を表３に示す。７つの形質転換系統のうち６つの平均パルミチン酸量は、コントロール胚系統のものより著しく少ない。これらの６系統の各々において、平均ステアリン酸量もまた、コントロールの平均より少ない。もしパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼが、トリアシルグリセリドに取り込まれるパルミチン酸の全てまたは一部の遊離を行うことができ、並びに、もしアンチセス構築物が、生産されるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの量を減少させたなら、この結果は予想される。これらの系統のステアリン酸量は、減少したパルミチン酸に対応して増加するよりむしろ減少するので、以下のことを推論できる。すなわち、パルミトイル− ＡＣＰをステアロイル−ＡＣＰに伸長する能力が、増加した流れをステアリン酸へと変えるのに十分でなければならず、また、ステアロイル−ＡＣＰをオレオイル−ＡＣＰに飽和度を低下させる能力も、増加した流れをオレイン酸へと変えるのに十分でなければならない。これらの２つのことは、形質転換胚中で生産される全飽和脂肪酸の著しい減少をもたらす。また、ＡＣＰ合成トラックから除かれなかった炭素の大部分は、リノレン酸フラクションに見いだされるので、オレイン酸の飽和度を低下させる能力が、供給される基質を上回って存在することも推測できる。このことは、系統３５７／１／３及び３５７／５／１の比較において最も明確に見られる。系統３５７／１／３は形質転換されたが、脂肪酸表現型においてほとんどまたは全く変化を示さず、一方、系統３５７／５／１は、変化した脂肪酸表現型を生じる点において、全ての試験された胚の間で全く同一である。系統３５７／５／１における脂質の平均パルミチン酸量は、系統３５７／１／３のものより３．２倍少なく、３５７／１／３の平均ステアリン酸量は、系統３５７／５／１のものより１．８倍少ない。合わせた飽和脂肪酸量の減少は、全脂肪酸の１２．２％であり、この１２．２％のうちほとんど全て（１１．７％）は、増加したオレイン酸及びリノレン酸として見なすことができる。従って、総合的な結果は、６５％少ない飽和脂肪酸を有し、そして増加したモノ不飽和及びポリ不飽和脂肪酸を有する、ダイズ胚系統である。このデータから、発生中のダイズ種子において発現されるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ量の減少は、減少した飽和脂肪酸量を有するダイズ油の生産をもたらすと結論する。表３に示す形質転換系統内の胚間で観察されるアンチセンス効果量における変動は、この形質転換系の特徴であり、以下に、より十分に説明する。未成熟胚から取ったデータと、これらの体細胞胚から再生した植物体において生じた接合体胚からの種子との関係は、以下に論じる。ダイズ体細胞胚における遺伝子発現のアンチセンスまたは共抑制阻害から生じる脂肪酸表現型は、これらの胚から再生される植物体の種子の脂肪酸表現型を予示する。成熟したダイズ体細胞胚は、接合体胚の良いモデルである。液体培養の球状胚状態の間、ダイズ体細胞胚は、成熟するダイズ接合体胚に特徴的な非常に少量のトリアシルグリセロールまたは貯蔵タンパク質を含む。この発生段階で、全極性脂質（リン脂質及び糖脂質）に対する全トリアシルグリセリドの割合は、体細胞胚培養を開始した発生段階でのダイズ接合体胚に特徴的であるように、約１：４である。球状期でも同様に、顕著な種子タンパク質、β−コングリシニンのαサブユニット、クニッツトリプシンインヒビター３、及び種子レクチンのｍＲＮＡは、本質的に存在しない。成熟する体細胞胚状態へ分化させるホルモンフリーの培地に移すと、トリアシルグリセロールは、最も多い脂質種になる。同様に、β −コングリシニンのαサブユニット、クニッツトリプシンインヒビター３及び種子レクチンのｍＲＮＡは、全ｍＲＮＡ集団における非常に多量のメッセージとなる。このことに基づくと、ダイズ体細胞胚系は、インビボにおける成熟しているダイズ接合体胚に非常に類似したようにふるまい、それ故、脂肪酸生合成経路の中の遺伝子の発現を改変することの表現型への影響を分析するための、優れた迅速なモデル系である。最も重要なことには、このモデル系はまた、形質転換胚から生じた植物体からの種子の脂肪酸組成を予示する。このことは、２つの異なる型の実験及び類似した共抑制実験における、２つの異なるアンチセンス構築物で示される。種子特異的プロモーター（β−コングリシニンプロモーター）の制御の下で、アンチセンスの向きのダイズミクロソームδ−１５デサチュラーゼ（実験１、国際公開第９３１１２４５号）またはダイズミクロソームδ−１２デサチュラーゼ（実験２）から成るキメラ遺伝子で形質転換した液体培養球状胚は、成熟胚を生じた。ベクターのみ（コントロール）及びアンチセンスキネラ遺伝子を含んでいるベクターで形質転換した系統からの成熟体細胞胚、並びにこれらから再生した植物体の種子の脂肪酸量を測定した。実験１においては、各系統からの１組の胚を脂肪酸量の分析をし、その同じ系統からのもう一組の胚を植物体に再生した。実験２においては、同じアンチセンス構築物を含む、異なる系統を体細胞胚における脂肪酸分析及び植物体への再生に用いた。実験１においては、形質転換胚系統でコントロールと比較して１８：３量の減少が見られる全ての場合において、この系統から生じた植物体の分離種子でもまた、コントロール種子と比較して１８：３量の減少が見られた（表４）。実験２においては、形質転換胚系統の約５５％が、コントロール系統と比較して増加した１８：１量を示した（表５）。同じアンチセンス構築物を含む、異なった体細胞胚系統から再生した植物体のダイズ種子は、体細胞胚と同様の頻度（５３％）の高オレイン酸形質転換体を有した（表５）。時々、胚系統はキメラであり得る。すなわち、１つの系統の１０−７０％の胚は、導入遺伝子を含んでいないかもしれない。導入遺伝子を含む残りの胚は、全ての場合においてクローンであることが見いだされている。そのような場合、たとえその系統から分析された大部分の胚が、トランスジェニック表現型を有してしても、野生型及びトランスジェニック表現型の両方を有する植物体が、単一のトランスジェニック系統から再生され得る。この例を表６に示す。この中で、単一の胚系統から再生した５植物体のうち３つが高オレイン酸表現型を有し、２つが野生型であった。大部分の場合、単一のトランスジェニック系統から再生した植物体の全ては導入遺伝子を含んでいる種子を有した。同様な実験において、δ−１２デサチュラーゼ配列及びδ−１５デサチュラーゼ配列のコーディング領域（５’末端で始まる）の７５％を、上記のダイズ形質転換のための単一の構築物内で、各々、β−コングリシニンプロモーターの後ろに置いた。上記の実験２のように、別々の胚組を、胚期及び成熟植物への再生での分析のために用いた。各７形質転換系統からの５つの胚における平均の１８：１及び１８：３量を表７に示す。７系統のうち２つは、δ１２−デサチュラーゼによる１８：１の１８：２への転換がこの酵素の発現の減少のために制限される胚に予期されるように、明らかに増加したレベルの１８：１を有する。これらの同じ系統において、減少したδ−１５デサチュラーゼ活性を示す、１８：３量のわずかな減少がある。２０の成熟ダイズ植物体が、上記のδ１２／δ１５デサチュラーゼを合わせた共抑制構築物で形質転換した体細胞胚から再生した。各植物体から５個の単一種子を分析し、２０系統のうち２つがδ１２及びδ１５デサチュラーゼの両方の活性が減少したことを示唆する全脂肪酸分析を示した。形質転換した植物体からの第一代種子は、遺伝学的に導入遺伝子に対して分離しているはずなので、これらの２系統からの単一種子を、その脂肪酸表現型を与える導入遺伝子の遺伝子座数を概算するために分析した。系統５５７−２−８−１の９９個の種子を分析し、５５７−２−８−２の１３７個の種子を分析した。両系統からの脂肪酸分析の種類は、その表現型を与える２つのトランスジェニック遺伝子座と一致した。高分離体種であると判断される種子の平均脂肪酸分析を、これらの系統の両方に対して表８に示す。アンチセンス構築物でのように、体細胞胚において見られる脂肪酸分析は、体細胞胚と同じ構築物で形質転換した成熟植物の種子から得られる脂肪酸分析における変化の型及び大きさを予示する。従って、トランスジェニック成熟体細胞胚系統において見られる変化した脂肪酸表現型は、その系統から生じる植物体の種子の変化した脂肪酸組成を予示すると結論する。センス方向のパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ構築物を含んでいるトランスジェニックグリシン・マックス胚の分析上記のダイズβ−コングリシニンプロモーターの制御の下で、センス方向にダイズパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡを含んでいるベクターｐＴＣ４は、ダイズ体細胞胚系において６つの成熟胚系統を生じた。これらの系統の各々から６から１０個の胚を、上記の各脂肪酸の相対量に対して分析した。その結果を表９に示す。標的組織に内在するｍＲＮＡの発現を増すとしばしばそうであるように、得られる酵素の過剰発現、及び共抑制によるその酵素の過少発現の両方が、この実験において見られた。系統３６１／１／１及び３６１／２／１が、コントロール系統（表９に示した）に非常に類似した脂肪酸分析結果を有する一方、系統３６１／１／２の大部分の胚は、コントロールまたは変化した脂肪酸分析結果を示さない形質転換系統より約３倍低いパルミチン酸レベルを有する。それに反して、系統３６１／５／２の全ての胚のパルミチン酸量は増加し、平均パルミチン酸量は２６．２％またはコントロール胚平均の１．８倍である。系統３６１／２／２は、共抑制表現型（低パルミチン酸）を示す８個の胚及び過剰発現表現型（高パルミチン酸量）を示す１個の胚を含む。この実験において、ダイズパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの変化した発現が、両方の方向において見られ、これらの得られた表現型は、この酵素の基質特異性から予想されるものである。発現が増加するように調整すると、相対的パルミチン酸量は増加し、減少するように調整すると、相対的パルミチン酸量は減少する。実施例４発生中のカノラ種子中でパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現を減少するための、ブラシカ・ナパス形質転換用ベクターのカノラ構築物におけるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現の制御伸長したポリＡテールを、プラスミドｐ５ｂに含まれるカノラパルミトイル− ＡＣＰチオエステラーゼ配列から以下のようにして取り除いた。プラスミドｐ５ｂをＥｃｏＲＩ及びＳｓｐＩで消化し、このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターから取り出された１．５ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。一本鎖末端をＫｌｅｎｏｗフラグメント及びｄＮＴＰｓで平滑化した。カノラナピンプロモーター発現カセットを以下のようにして構築した。欧州特許第２５５３７８号に公開されたナピンラムダクローンＣＧＮ１−２のヌクレオチド配列に基づいて、８個のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。これらのオリゴヌクレオチド配列は、であった。カノラ変種「Ｈｙｏｌａ４０１」（ＺｅｎｅｃａＳｅｅｄｓ）からのゲノムＤＮＡを、ナピンプロモーター及びナピンターミネーター領域のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。プロモーターを最初にプライマーＢＲ４２及びＢＲ４３を用いて増幅し、プライマーＢＲ４５及びＢＲ４６を用いて再増幅した。この１．０ｋｂのプロモーターＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ０１を得た。ナピンターミネーター領域をプライマーＢＲ４８及びＢＲ５０を用いて増幅し、プライマーＢＲ４７及びＢＲ４９を用いて再増幅した。この１．２ｋｂのターミネーターＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ０６を得た。ｐＩＭＣ０６を鋳型として用いて、ターミネーター領域をプライマーＢＲ５７５’− ＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＧＡＴ −３’ ２１、及びプライマーＢＲ５８５’−ＧＡＧＣＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＴＴＣＣＡＡＡＣ−３’ ２２、を用いたＰＣＲにより再増幅した。このＰＣＲ産物をＳａｃＩ／ＮｃｏＩで消化し、ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ消化したｐＩＭＣ０１に連結することにより、ナピンプロモーター及びターミネーターの両方を含んでいるプラスミドｐＩＭＣ１０１を作製した。プラスミドｐＩＭＣ１０１は、完全なナピン５’及び３’非翻訳配列及び翻訳開始ＡＴＧに導入されたＮｃｏＩ部位を含んでいる２．２ｋｂのナピン発現カセットを有する。プライマーＢＲ６１５’ −ＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＴＧＡＡＴＴＣＴＣＡ−３’ ２３及びプライマーＢＲ６２５’−ＧＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＣＣＧＡＧＧＣＴＣ−３’ ２４、を、ナピンプロモーターの３’末端から〜２７０ｂｐのフラグメントをＰＣＲ増幅するために用いた。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＩＭＣ１０１に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ４０１を得た。プラスミドｐＩＭＣ４０１は、ナピン５’非翻訳配列を欠く２．２ｋｂのナピン発現カセットを含み、転写開始地点にＮｏｔＩ部位を含む。これらのオリゴヌクレオチド配列は、配列番号８の２９ないし５２の塩基（ＢＲ４２）及び１１４６ないし１１６９の塩基の相補鎖（ＢＲ４３）に相当する、ＢＲ４２及びＢＲ４３。配列番号８の４６ないし６６の塩基（ＢＲ４６）及び１０２８ないし１０４７の塩基の相補鎖（ＢＲ４５）に相当する、ＢＲ４５及びＢＲ４６。さらに、ＢＲ４６は、その５’末端にＳａｌＩ部位（５’−ＧＴＣＧＡＣ−３’）及び数個の付加塩基（５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’）に相当する塩基を有し、ＢＲ４５は、プライマーの５’末端にＢｇｌＩＩ部位（５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’）及び２個の付加塩基（５’−ＣＴ−３’）に相当する塩基を有した。配列番号１０の８１ないし１０２の塩基（ＢＲ４７）及び２２ないし４５の塩基（ＢＲ４８）に相当する、ＢＲ４７及びＢＲ４８。さらに、ＢＲ４７は、プライマーの５’末端に２個の付加配列（５’−ＣＴ−３’）、続いてＢｇｌＩＩ部位（５’−ＡＧＡＴＣＴ−３’）に相当する塩基、続いて数個の付加塩基（５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’）を有した。配列番号１０の１２５６ないし１２７５の塩基の相補鎖（ＢＲ４９）及び１２７４ないし１２９７の塩基の相補鎖（ＢＲ５０）に相当する、ＢＲ４９及びＢＲ５０。さらに、ＢＲ４９は、その５’末端にＳａｌＩ部位（５’−ＧＴＣＧＡＣ− ３’）及び数個の付加塩基（５’−ＴＣＡＧＧＣＣＴ−３’）に相当する塩基を有した。配列番号１０の１２５８ないし１２７５の塩基の相補鎖（ＢＲ５７）及び８１ないし９３の塩基に相当する、ＢＲ５７及びＢＲ５８。さらに、ＢＲ５７の５’末端には、数個の余分な塩基（５’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）、続いてＳａｃＩ部位（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）に相当する塩基、続いてさらに多くの付加塩基（５’−ＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧ−３’）（配列番号２５）を有した。ＢＲ５８の５ ’末端には、付加塩基（５’−ＧＡＧＣＴＣ−３’）、続いてＮｃｏＩ部位（５ ’−ＣＣＡＴＧＧ−３’）に相当する塩基、続いて付加塩基（５’−ＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣ−３’）（配列番号２６）を有した。配列番号８の７４５ないし７６４の塩基（ＢＲ６１）及び９９３ないし１０１３の塩基（ＢＲ６２）に相当する、ＢＲ６１及びＢＲ６２。さらに、ＢＲ６２の５ ’末端には、付加塩基（５’−ＧＡＣＡ−３’）、続いてＢｇｌＩＩ部位（５’ −ＡＧＡＴＣＴ−３’）に相当する塩基、続いて数個の付加塩基（５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）を有した。であった。カノラ変種「Ｈｙｏｌａ４０１」（ＺｅｎｅｃａＳｅｅｄｓ）からのゲノムＤＮＡを、ナピンプロモーター及びナピンターミネーター領域のＰＣＲ増幅のための鋳型として用いた。プロモーターは、最初にプライマーＢＲ４２及びＢＲ４３を用いて増幅し、プライマーＢＲ４５及びＢＲ４６を用いて再増幅した。この１．０ｋｂのプロモーターＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ⁺（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ０１を得た。ナピンターミネーター領域を、プライマーＢＲ４８及びＢＲ５０を用いて増幅し、プライマーＢＲ４７及びＢＲ４９を用いて再増幅した。この１．２ｋｂのターミネーターＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＳａｌＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ０６を得た。ｐｌＭＣ０６を鋳型として用いて、ターミネーター領域を、プライマーＢＲ５７及びプライマーＢＲ５８を用いたＰＣＲにより再増幅した。このＰＣＲ産物をＳａｃＩ／ＮｃｏＩで消化し、ＳａｃＩ／ＮｃｏＩ消化したｐＩＭＣ０１に連結することにより、ナピンプロモーター及びターミネーターの両方を含んでいるプラスミドｐＩＭＣ１０１を作製した。プラスミドｐＩＭＣ１０１は、完全なナピン５’及び３’非翻訳配列及び翻訳開始ＡＴＧに導入されたＮｃｏＩ部位を含んでいる２．２ｋｂのナピン発現カセットを有する。プライマーＢＲ６１及びプライマーＢＲ６２を、ナピンプロモーターの３’末端から〜２７０ｂｐのフラグメントをＰＣＲ増幅するために用いた。得られたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＩＭＣ１０１に連結することにより、プラスミドｐＩＭＣ４０１を得た。プラスミドｐＩＭＣ４０１は、ナピン５’非翻訳配列を欠いている２．２ｋｂのナピン発現カセットを含み、転写開始地点にＮｏｔＩ部位を含む。プラスミドｐＩＭＣ４０１をＮｏｔＩで消化し、その一本鎖末端をｄＮＴＰｓ及びＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑化した。この直鎖状プラスミドを子ウシ腸ホスファターゼで処理した。このホスファターゼ処理した、直鎖状プラスミドを、上記のカノラパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの平滑化した１．５ｋｂのフラグメントに連結した。このライゲーション混合液で大腸菌コンピテントセルを形質転換し、この植物ｃＤＮＡ配列が、ナピンプロモーターに対して、センスの向きにあるクローン（ｐＩＭＣ２９）及びアンチセンスの向きにあるクローン（ｐＩＭＣ３０）を単離した。ナピンプロモーター制御の下でアンチセンスのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ構築物を、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いて植物に形質転換するためのベクターを、バイナリーＴｉプラスミドベクター系（Ｂｅｖａｎ、（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：８７１１−８７２０）を構築することにより作製した。この系のための１つの出発ベクター（ｐＺＳ１９９）は、（１）形質転換した植物細胞の選択マーカーとして、キメラ遺伝子、ノパリンシンターゼ／ネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（Ｂｒｅｖａｎ等、（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ３０４：１８４−１８６）、（２）ＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの左端及び右端のボーダー配列（Ｂｒｅｖａｎ等、（１９８４）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１２：８７１１−８７２０）、（３）ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、及びＳａｌＩに対する単一の制限酵素部位を有する、大腸菌のｌａｃＺ α−相補性セグメント（Ｖｉｅｒｉａ及びＭｅｓｓｉｎｇ（１９８２）Ｇｅｎｅ１９：２５９−２６７）、（４）シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）プラスミドｐＶＳ１からのバクテリアの複製起点（Ｉｔｏｈ等、（１９８４）Ｐｌａｓｍｉｄ１１：２０６− ２２０）、及び（５）形質転換したアグロバクテリウム・チュメファシエンスの選択マーカーとして、Ｔｎ５からのバクテリアネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子（Ｂｅｒｇ等、（１９７５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｎｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７２：３６２８−３６３２）を含むベクターを基にする。植物選択マーカーの中のノパリンシンターゼプロモーターを、標準的な制限酵素消化及びライゲーション法により、３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ等、（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０−８１３）に置き換えた。この３５Ｓプロモーターは、下記のブラシカ・ナパスの効率よい形質転換に必要である。ナピン：パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡ：ナピン３’配列を切り出すためにｐＩＭＣ２９及びｐＩＭＣ３０をＳａｌＩで消化し、これらの３．８ｋｂのフラグメントをアガロースゲル精製することにより、センス及アンチセンスのパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現カセットを含んでいるバイナリーベクターを構築した。プラスミドｐＺＳ１９９もまたＳａｌＩで消化し、この直鎖状ベクターに、ｐＩＭＣ２９及びｐＩＭＣ３０から単離された３．８ｋｂのフラグメントを連結した。形質転換及びクローンの単離により、センス構築物（ｐＩＭＣ１２９）及びアンチセンス構築物（ｐＩＭＣ１３０）を含んでいるバイナリーベクターを得た。アグロバクテリウムを介したブラシカ・ナパスの形質転換バイナリーベクターｐＩＭＣ１２９及びｐＩＭＣ１３０を、凍結／融解法（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ等、（１９７８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：１８１−１８７）により、アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４（Ｈｏｃｋｅｍａ等、（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ３０３：１７９−１８０）に導入した。ブラシカ・ナパス栽培変種「Ｗｅｓｔａｒ」を、適当なバイナリーベクターを保有するｄｉｓａｒｍｅｄアグロバクテリウム・チュメファシエンス株ＬＢＡ４４０４と実生切片を共存培養することにより形質転換した。ブラシカ・ナパス種子は、１０％Ｃｈｌｏｒｏｘ、０．１％ＳＤＳ中で３０分間撹拌することにより滅菌し、次に滅菌蒸留水で完全にすすいだ。これらの種子を３０ｍＭＣａＣｌ₂及び１．５％寒天を含んでいる滅菌培地上に発芽させ、２４℃で暗所で６日間成長させた。植物形質転換のためのアグロバクテリウムの液体培養菌は、１００ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んでいる最小Ａ培地中２８℃で一晩生育させた。このバクテリア細胞を、遠心分離によりペレットとし、１００μＭアセトシリンゴンを含んでいる液体ムラシゲ・スクーグ最小有機培地に１０⁸細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。ブラシカ・ナパス実生胚軸を５ｍｍ断片に切断し、すぐにバクテリア懸濁液中に置いた。３０分後、胚軸切片をバクテリア懸濁液から取り除き、１００μＭアセトシリンゴンを含んでいるＢＣ−２８カルス培地に置床した。この植物組織及びアグロバクテリアを薄暗い照明中、２４℃で３日間共存培養した。アグロバクテリアを殺生するための２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び形質転換した植物細胞の生育を選択するための２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んでいるＢＣ−２８カルス培地上に胚軸切片を移植することにより、共存培養を終了した。実生切片を連続照明の下、２４℃で３週間この培地上で培養した。３週間後、２００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び２５ｍｇ／Ｌカナマイシンを含んでいるＢＳ−４８再生培地に切片を移植した。カルス培地に対して記述した同じ培養条件の下、植物組織を、新しく調整した選択再生培地上で２週間ごとに継代培養した。形質転換したと思われるカルスは、再生培地上で迅速に成長し、カルスが約２ｍｍの直径に達すると、これらを胚軸切片から取り除き、カナマイシンを欠いた同じ培地上に置床した。ＢＳ−４８再生培地に移植した後数週間以内にシュートが出始める。シュートが識別できる茎を形成するやいなや、これらをカルスから切除し、ＭＳＶ−１Ａ伸長培地に移植し、２４℃で１６：８時間の光周期に移した。いったんシュートが数節間伸長すると、寒天面の上で切除し、その切除末端をＲｏｏｔｏｎｅに浸漬する。処理したシュートを湿ったＭｅｔｒｏ−Ｍｉｘ３５０水植え用培地に直接植える。これらの鉢をビニル袋で覆い、この袋は植物が明らかに成長した時−約１０日後−に取り除く。植物を、１６：８時間の光周期の下、２３℃の日中温度及び１７℃の夜間温度で育てる。最初の開花茎が伸長し始めると、異系交配を防ぐために網状の花粉封じ込め袋で覆う。毎日数回これらの植物を揺することにより、自家受粉を促進し、鉢へ移した後約９０日までに種子が成熟する。種子脂質中の７つの主要脂肪酸の各々の相対量を、以下のように分析した。各植物体の２５鉢のサンプルからランダムに採取した２０個の種子を０．５ｍＬの２−プロパノール中ですりつぶした。得られた抽出物の２５μＬをガラス管に移し、窒素気流の下で溶媒を蒸発させた。乾燥した残渣を、メタノール中１％のナトリウムメトキシド０．５ｍｌの中で６０℃で１時間、メタノリシスに供した。生じた脂肪酸メチルエステルを１ｍＬのヘキサン中に抽出し、このヘキサン層からメタノールを洗浄するために０．５ｍＬの水をこの溶媒混合液に加えた。ヘキサン層の一部を、上の実施例３に記述したガスー液体クロマトグラフィーによる分析のためにサンプル瓶に移した。７つの脂肪酸を分析したが、５つの主要脂肪酸の全脂肪酸に対する相対量のみを、以下の表１０、１１、及び１２に示す。分析した形質転換植物体のいずれも、カノラ種子において予想される脂肪酸分析結果と著しく異なるものはなかった。植物体番号１２９−８０５、１２９−８８９及び１２９−７３は、飽和脂肪酸量がわずかに増加し、これらは少量の過剰発現をしている系統を表すかもしれない。形質転換結果は、導入された遺伝子に対してヘテロ接合体である植物体を生じるので、これらの植物体からの種子は、その導入遺伝子のコピー数に関して分離する。予想されるように、もし脂肪酸表現型が導入遺伝子のコピー数に関して累積的であるなら、形質転換後第二世代まで、完全な影響を全種子集団において見ることができない。飽和脂肪酸量が適度に増加した植物体の次世代において、さらなる分析を行う。共抑制している形質転換体から期待される、低パルミチン酸表現型の有力な証拠はない。しかしながら、ダイズと対照的に、カノラにおける共抑制は、まれな形質転換結果である。脂肪酸生合成経路における他の遺伝子での我々の経験では、２００もの多くの形質転換系統が、強い共抑制表現型を見るために必要であった。分析した２８の形質転換体の平均パルミチン酸量は、０．３９の平均の標準偏差で４．３である。全種子分析においてこの平均から大きくそれる系統がないのに対して、系統１３０−１２６は、この平均より２標準偏差を上回って少ない。このことは上記の分離種子群において見られる弱いアンチセンス表現型を示すことができるので、この植物体からの１２の単一種子を、同じ生育室において生育し、類似した日に植えた非形質転換Ｗｅｓｔａｒ植物体からの１２の単一種子と共に、相対脂肪酸量を分析した。これらの分析の結果を表１２に示す。形質転換体１３０−１２６からの１２の種子の平均相対的パルミチン酸量は、３．４２％で、その平均の標準偏差は０．３５９であり、一方１２のコントロール種子の平均パルミチン酸量は、０．２０の平均の標準偏差で４．０８である。観察されたパルミチン酸量のより低い平均、より大きい標準偏差、及びより広い範囲は全て、カノラパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス導入遺伝子に対してホモ接合体である種子が、わずかに少ないパルミチン酸を生産する分離集団を、示すものである。観察された表現型を、次世代の多数の植物体からの全種子を分析することにより、確認する。上記のセンス構築物に対して記載したように、最大限に変化した脂肪酸表現型の発生は、カノラにおいてはまれな形質転換結果である。従って、形質転換体１３０−１２６における低パルミチン酸の分離種子の表現型は、カノラ種子におけるパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス過少発現が、飽和脂肪酸の生産を減少できることを示すが、この方法により達成することのできる最小パルミチン酸量を示すものではない。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年９月３日【補正内容】この２次スクリーニングから、４個の純粋なファージプラークを単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手したインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）切出しプロトコルに従って、ヘルパーファージを用いることにより、ｃＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドクローンを得た。Ｍａｇｉｃ^R Ｍｉｎｉｐｒｅｐ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びその製造業者の説明書を用いて、二本鎖ＤＮＡを調製し、得られたプラスミドをアガロースゲル電気泳動により、大きさの分析をした。ｐ５ａと命名した、４つのクローンのうちの１つは、約１．５ｋｂのインサートを含んでおり、このインサートをダイデオキシ法により両鎖からシークエンスした。ｐ５ａのｃＤＮＡインサートの１４８３塩基の配列を、配列番号２に示す。ｐ２ａと命名した、２番目のクローンもまた、シークエンスをし、配列番号３１に示す１６７３塩基対のｃＤＮＡを含むことを見いだした。２つのｃＤＮＡインサートの配列は全体で８５％同一で、全体で９２％同一であるが推定される成熟ペプチド（色素体輸送配列を除去後のペプチド）の領域内では９４％同一であるペプチドをコードする。成熟ペプチドをコードする２つのｃＤＮＡのｃＤＮＡ領域は、９０．４％同一である。これら２つのｃＤＮＡは、おそらく同じ活性の２つのアイソザイムをコードする。これら２つの配列の輸送ペプチドの長さ、各ｃＤＮＡの長さ、及び以下に示すダイズの配列に対する整列に基づくと、クローンｐ５ａのｃＤＮＡは、実際のメッセージをわずかに欠いたものであり、一方クローンｐ２ａは、全長のメッセージに相当することがわかる。クローンｐ２ａから単離されたｃＤＮＡをシークエンスし、その配列を配列番号３１に示す。アラビドプシスのチオエステラーゼ様フラグメントに相同なダイズ種子ｃＤＮＡのクローニングｃＤＮＡライブラリーを以下のように作製した。ダイズ胚（各約５０ｍｇの新鮮重量）を莢から取り、液体窒素中で凍結した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/16 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 7/40 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．Ｃ１６アシル−ＡＣＰに対する基質特異性を有し、パルミトイル−、ステアロイル−、及びオレオイル−ＡＣＰチオエステルの加水分解を触媒し、そして配列番号１の５０６ないし１４７７のヌクレオチドまたは配列番号２の２７３ないし１２２６のヌクレオチドまたは配列番号３１の４８１ないし１４３８のヌクレオチドに対応する成熟機能性タンパク質をコードするＤＮＡ配列に少なくとも７５％の相同性を示す、植物アシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。２．配列番号１の１ないし１６８８のヌクレオチドに相当するダイズ種子アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。３．配列番号２の１ないし１４８３のヌクレオチドに相当するカノラ種子アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。４．配列番号３１の１ないし１６７４のヌクレオチドに相当するカノラ種子アシル−ＡＣＰチオエステラーゼｃＤＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸フラグメント。５．該ヌクレオチド配列が、配列番号１の５０６ないし１４７７のヌクレオチドに対応する触媒活性のあるダイズ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードする、請求の範囲２に記載の単離された核酸フラグメント。６．該ヌクレオチド配列が、配列番号２の２７３ないし１２２６のヌクレオチドに対応する触媒活性のあるカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードする、請求の範囲３に記載の単離された核酸フラグメント。７．該ヌクレオチド配列が、配列番号３１の４８１ないし１４３８のヌクレオチドに対応する触媒活性のあるカノラ種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼ酵素をコードする、請求の範囲５に記載の単離された核酸フラグメント。８．適当な調節配列にアンチセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲１に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害を生じ、該阻害が標準より低いレベルの飽和脂肪酸をもたらす、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。９．適当な調節配列にセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲１に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの上昇または共抑制を生じ、該阻害が標準より低いレベルの飽和脂肪酸をもたらす、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。１０．適当な調節配列にアンチセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲２に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害を生じる、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。１１．適当な調節配列にセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲２に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの上昇または共抑制を生じる、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。１２．適当な調節配列にアンチセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲３または４に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル− ＡＣＰチオエステラーゼのアンチセンス阻害を生じる、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。１３．適当な調節配列にセンスの向きに作動できるように連結した請求の範囲３または４に記載の核酸フラグメントを含んでなり、種子パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼの上昇または共抑制を生じる、油生産種の植物細胞を形質転換することのできるキメラ遺伝子。１４．該油生産種の植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲８に記載のキメラ遺伝子。１５．該油生産種の植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲９に記載のキメラ遺伝子。１６．請求の範囲８に記載のキメラ遺伝子で形質転換した植物細胞。１７．請求の範囲９に記載のキメラ遺伝子で形質転換した植物細胞。１８．植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲１６に記載された植物細胞。１９．植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲１７に記載された植物細胞。２０．（ａ）植物細胞を、請求の範囲８に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した植物細胞から、稔性の植物体を生育し、（ｃ）該稔性の植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該植物種子油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる植物種子油を生産する方法。２１．（ａ）油生産種の植物細胞を、請求の範囲９に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した油生産種の植物細胞から、稔性の生殖的に成熟した植物体を生育し、（ｃ）該稔性の植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸または標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる植物種子からの油を生産する方法。２２．（ａ）ダイズ植物細胞を、請求の範囲１０に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した植物細胞から、稔性のダイズ植物体を生育し、（ｃ）該稔性のダイズ植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該ダイズ植物種子油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいるダイズ植物種子油を生産する方法。２３．（ａ）油生産種のダイズ植物細胞を、請求の範囲１１に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した油生産種のダイズ植物細胞から、稔性の生殖的に成熟したダイズ植物体を生育し、（ｃ）該稔性のダイズ植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸または標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいるダイズ植物種子からの油を生産する方法。２４．（ａ）ナタネ植物細胞を、請求の範囲１２に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した植物細胞から、稔性のナタネ植物体を生育し、（ｃ）該稔性のナタネ植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該ナタネ植物種子油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいるナタネ植物種子油を生産する方法。２５．（ａ）油生産種のナタネ植物細胞を、請求の範囲１３に記載のキメラ遺伝子で形質転換し、（ｂ）該形質転換した油生産種のナタネ植物細胞から、稔性の生殖的に成熟したナタネ植物体を生育し、（ｃ）該稔性のナタネ植物体からの子孫種子を、所望するレベルのパルミチン酸及びステアリン酸に対してスクリーニングし、そして（ｄ）標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいる該油を得るために、該子孫種子をつぶす、ことを含んでなる、標準より高いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸または標準より低いレベルのパルミチン酸及びステアリン酸を含んでいるナタネ植物種子からの油を生産する方法。２６．該油生産種の植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲２０に記載の方法。２７．該油生産種の植物細胞が、ダイズ、ナタネ、ヒマワリ、ワタ、ココア、ナンキンマメ、ベニバナ、及びトウモロコシからなる群から選択される、請求の範囲２１に記載の方法。２８．該形質転換の工程が、アグロバクテリウムの感染、エレクトロポレーション、及び高速弾道砲撃からなる群から選択される方法により達成される、請求の範囲２０に記載の方法。２９．該形質転換の工程が、アグロバクテリウムの感染、エレクトロポレーション、及び高速弾道砲撃からなる群から選択される方法により達成される、請求の範囲２１に記載の方法。３０．該チオエステラーゼが、配列番号１の２４２ないし１４９２のヌクレオチドまたは配列番号２の２７３ないし１２２６のヌクレオチドまたは配列番号３１の４８１ないし１４３８のヌクレオチドに対応する成熟機能性チオエステラーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に少なくとも８１％の相同性を示す、請求の範囲１に記載の単離された核酸フラグメント。３１．配列番号２９のアミノ酸配列のダイズアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードしている単離された核酸フラグメント。３２．配列番号３０のアミノ酸配列のナタネアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードしている単離された核酸フラグメント。３３．配列番号３２のアミノ酸配列のナタネアシル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードしている単離された核酸フラグメント。