JPH10504804A

JPH10504804A - リポ多糖の中和用組成物

Info

Publication number: JPH10504804A
Application number: JP8502590A
Authority: JP
Inventors: サミュエルディーライト; マークエムワーフェル; ピーターエリックハイルマン
Original assignee: ザロックフェラーユニヴァーシティ
Priority date: 1994-06-14
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 1998-05-12
Also published as: WO1995034289A1; US5928624A; US5932536A; AU2870095A; AU687219B2; EP0760652A1; MX9606506A; CA2192661A1

Abstract

(57)【要約】本発明はリポ多糖の中和用組成物及び中和方法、並びにそれに基くグラム陰性セプシスの治療に関する。それ故、本発明はリン脂質と脂質交換タンパク質、例えば、リン脂質転移タンパク質またはLBS 結合タンパク質とを含む均一粒子の組成物に関する。脂質交換タンパク質は粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする。本明細書に例示される特別な実施態様において、脂質粒子はアポリポタンパク質A-I(apoA-I)、リン脂質、及びコレステロールまたはその脂質二層結合誘導体を含む高密度リポタンパク質粒子である。特別な例において、リン脂質はホスファチジルコリン(PC)である。特別な例において、ホスファチジルコリン：コレステロール：アポリポタンパク質A-I の比は約80:4:1である。患者からの試料中のLPS 交換タンパク質活性のレベルは内毒素症、グラム陰性セプシス、または敗血症性ショックを有する患者の診断、監視、または予診のインジケータを与える。

Description

【発明の詳細な説明】リポ多糖の中和用組成物本発明に至る研究は米国公衆衛生サービス助成金No.AI-30556 により一部支持された。政府は本発明に或る権利を有し得る。関連出願本件出願は1994年11月10日に出願された共同未決特許出願第08/337,611号の一部継続出願であり、これは順に1994年６月14日に出願された共同未決特許出願第 08/259,957号の一部継続出願であり、これが本明細書に参考としてそのまま含まれ、本件出願は35U.S.C.§120に従ってその出願日の利益を主張する。発明の分野本発明はリポ多糖の中和用組成物及び中和方法、並びにこれらに基くグラム陰性セプシス（敗血症）の治療に関する。発明の背景セプシスは毒素により頻繁に誘発される症状であり、その導入または蓄積は感染症またはトラウマにより最も普通に引き起こされる。セプシスまたは敗血症性ショックの初期の症候として、典型的には悪寒、過多の発汗、不規則な弛張性発熱、虚脱等、続いて持続性発熱、ショックをもたらす緊張低下、好中球減少症、白血球減少症、播種性血管内凝固、成人呼吸困難症候群及び多発性臓器不全が挙げられる。一般に急性期敗血症性ショックと称されるこれらの最後の症候は殆ど不可避的に死亡をもたらす。セプシス誘発毒素は病原性のバクテリア、ウイルス、植物及び毒物と関連して見られた。良く記載されたバクテリア毒素の中に、グラム陰性バクテリアの内毒素またはリポ多糖(LPS)がある。これらの分子は全てのグラム陰性バクテリアの外膜中に偏在する糖脂質である。LPS 分子の殆どの化学構造は複雑かつ多様であるが、共通の特徴はLPS の脂質Ａ領域である(Rietschelら，1984，Handbook of Endotoxins，R.A.Proctor 及びE.Th.Rietschel編集，Elsevier，Amsterdam 1:18 7-214)。生物系における脂質Ａの認識はセプシスの病変の全てではないとしてもその多くを開始する。脂質Ａ構造はグラム陰性生物の全ての型中に高度に保存されるので、共通の病変がグラム陰性セプシスを特性決定する。現在の概念は、LPS に対する宿主（ヒトを含む）の一次応答が単球／マクロファージ系列の細胞によるLPS の認識、続いてサイトカインとして知られている一般のグループを含む種々の細胞生産物の迅速な加工を伴うという主張を支持する。セプシス、特にLPS に対する応答に関与すると考えられるその他の細胞型は多形核白血球及び内皮細胞である。これらの細胞型の夫々がまた潜在的な炎症性物質の同化によりLPS に対して応答することができる。 LPS は、特に症候が成人呼吸困難症候群(ARDS)を含む時に、グラム陰性セプシス中のヒトの死亡の主たる原因であると考えられる(van Deventeret ら，1988， Lancet，1:605; Zieglerら，1987，J.Infect.Dis．136:19-28)。例えば、一種の特別なサイトカインである腫瘍壊死因子α／カケクチン(TNF)は敗血症性ショックの主たる媒介物質であると報告されていた(Beutlerら，1987，N.Eng.J.Med.31 6:379)。実験動物及びヒトへのバクテリアからのLPS内毒素の静脈内注射はTNFの迅速な一過性の放出を生じる(Beutlerら，1985，J.Immunol．135:3972; Math-is onら，1988，J.Clin.Invest．81:1925)。TNF が敗血症性ショックの重要な媒介物質であるという証拠は、抗TNF 抗体による動物の前処理が致死率を低下するという実験に主として由来する(Beutlerら，1985，Science 229:869; Mathisonら，上記文献)。これらの論文は、LPS またはその他の因子により生じるTNF の分泌の中断がセプシスのしばしば致死性の症候を軽減することを示唆する。血液へのLPS の導入後に、それはリポ多糖結合タンパク質(LBP)と称されるタンパク質に結合し得る。LBP は健康な動物及びヒトの血清中に約５μg/ml未満の濃度で存在する60 kD の糖タンパク質である。急性期中に、LBP は肝細胞により合成され、血清中で30〜50μg/mlの濃度に達する。LBP は急性期のヒト及びウサギの血清から精製し得る(Tobias ら，1986，J.Exp.Med．164:777-793)。LBP はL PS の脂質Ａ領域を認識し、粗大かつ平滑の両方の形態のLPS と複合体を形成する(Tobias ら，1989，J.Biol.Chem．264:10867-10871)。LBP は殺菌剤透過性増大因子(BPI)として知られているLPS 結合タンパク質とのＮ末端配列相同性を有する(Tobias ら，1988，J.Biol.Chem．263:13479-13481)。BPI はPMN の特定の顆粒中に貯蔵され(Weissら，1987，Blood 69:652-659)、LPS を結合し、透過性バリヤーを分断することによりグラム陰性バクテリアを死滅させる(Weissら，19 84，J.Immunol．132:3109-3115)。 BPI とは対照的に、LBP はグラム陰性細胞に直接に細胞毒性ではない(Tobias ら，1988，J.Biol.Chem．263:13479-13481)。その代わり、LPS に結合するLBP はLPS とマクロファージの相互作用を著しく増強することがわかり、オプソニンとしてのその役割を示す(Wright ら，1989，J.Exp.Med．170:1231-1241)。例えば、抗LBP 抗体によるLBP の抑制は内毒素介在性セプシスを治療するのに治療上有益として示唆されていた（国際特許出願番号PCT/US90/04250、1990年７月30日に出願）。過去２、３年にわたる研究は、血漿タンパク質が低濃度のバクテリアのリポ多糖に対する細胞の応答を媒介するのに重要な役割を果たすことを示した。幾つかの脂質転移タンパク質が配列類似性並びに同様の機能を有するヒト血漿中で同定された。コレステロールエステル転移タンパク質(CETP)はリポタンパク質粒子間のコレステロールエステル、トリグリセリド、及びリン脂質の転移を促進する(A lbers ら，1984，Arteriosclerosis 4:49-58)。リン脂質転移タンパク質(PLTP) はリポタンパク質の間のリン脂質の交換及び転移を媒介する(Tollefsonら，1988 ，J.Lipid.Res.29:1593-1602)。LBP(Shumannら，1990，Science 249:1429)及びセプチン(Wright ら，1992，J.Exp.Med．176:719)はLPS と相互作用し、CD14へのLPS の結合を促進する(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269)。単球、マクロファージ及び好中球の表面に見られるタンパク質であるCD14（Goyert＆Ferrer o，1987，Leukocyte Typing III，McMichaelら編集，Springer Verlag:ニューヨーク，613頁）はその後これらの細胞の応答を開始する。また、CD14は血漿中に可溶性タンパク質として見られ、可溶性CD14とのLPS の複合体が内皮細胞 (Frey ら，1992，J.Exp.Med．176:1665)、上皮細胞(Puginら，1993，Proc.Natl. Acad.Sci．USA 90:2744)、そしておそらく膜CD14を発現しないその他の細胞型の応答に関与する。また、LBP は高密度リポタンパク質(HDL)粒子またはリン脂質へのリポ多糖(LPS)の転移を媒介して、LPS の機能性中和をもたらすことができる(Wurfel ら，1994，J.Exp.Med．180:1025-1035)。これらの研究はLPS に対する応答を強化する血漿の能力を強調した。要するに、血漿は細胞活性化、そして最終的には敗血症性ショックを開始するLPS の能力を増強する因子を含む。対照的に、幾つかの更に昔の研究は内毒素を不活化する血漿の能力に集中していた(Rall ら，1957，Am.J.Physiol．188:559; Skarnesら，1958，J.Exp.Med.10 8:685; Ulevitch ら，1978，J.Clin.Invest．62:1313)。血漿と一緒のLPS のインキュベーションは実験動物で発熱及び死亡を生じるLPS の能力を阻止し(Sk-ar nes ら，上記文献; Ulevitchら，上記文献)、またリムルスアメーバ様細胞分解産物(LAL)アッセイで陽性シグナルを生じるLPS の能力を阻止することが示されていた(Johnsonら，1977，Am.J.Pathology 88:559; Emancipatorら，1992，Infe ct.Immunol．60(2):596)。LPSのこの“解毒”または中和はLPS の共有修飾によらずに起こると考えられる。何となれば、血漿により解毒されたLPS は有機溶媒により抽出でき、充分な活性を示すからである(Rudbach＆Johnson，1964，Natur e 202:811)。幾つかの研究所の研究は、血漿リポタンパク質、特に高密度リポタンパク質(H DL)がLPS を結合し、中和すること(Skarnesら，1968，J.Bacteriology 95:2031) ; Ulevitchら，1979,J.Clin.Invest.64:1516; Munford ら，1981，Inf-ect.Immu nol．34(3):835; Flegelら，1993，Infect.Immunol．61(12):5140)、またこれらの粒子が血漿中でLPS 中和活性を構成し得ることを示していた。 LPS 中和因子は単球、マクロファージ、及び多形核白血球へのLPS の結合を抑制し、マクロファージへのLPS 被覆赤血球結合を破壊し、また多形核白血球及び単球のセプチン依存性刺激を破壊する因子と既に同定された（1994年１月27日に出願された共同未決米国特許出願第08/188,644号(これは1991年12月30日に出願され、現在放棄された米国特許出願第07/814,775号の継続出願であり、これは19 90年２月１日に出願され、現在放棄された米国特許出願第07/473,609号の一部継続出願である)を参照のこと、また1993年７月８日に公表されたWrightの国際特許公開WO 93/13201 を参照のこと(これらの夫々が参考として本明細書にそのまま含まれる))。この因子が称される“セプチナーゼ”の活性はα₂-マクログロブリンにより抑制することができた。この因子がセプチンを不活化すると考えられる一つのメカニズムはタンパク質分解によるものであった。その他の実験データは、その因子がセプチンを破壊しないでLPS を不活化することを示唆した。どのようなメカニズムが基礎となろうとも、セプチナーゼはLPS を永久に不活化した。セプシスを治療するための幾つかのアプローチが試みられてきたが、これらを具体的に２、３挙げると、LPS への抗体の使用、腫瘍壊死因子への抗体の使用、可溶性TNF 受容体の使用、可溶性インターロイキン-1（IL-1）受容体の使用が挙げられる。夫々のアプローチは若干の効力を有するが、総合的な結果は期待に反した。こうして、セプシス及び敗血症性ショックの症候を予防または軽減するためにグラム陰性内毒素（即ち、LPS）を中和するのに有効な医薬薬剤及び治療方法に対する要望が当業界にある。本明細書中の文献の引用は、このような文献が本発明の従来技術として利用できるという許可と考えられるべきではない。発明の要約本発明は、その最も広い観点において、リン脂質と脂質交換タンパク質とを含む均一粒子の組み合わせに関する。脂質交換タンパク質は粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする。好ましい観点において、脂質交換タンパク質はリン脂質転移タンパク質(PLTP; Day ら，1994，J.Biol.Chem．269:9388 を参照のこと)、またはそのフラグメント、類似体、もしくは誘導体である。別の実施態様において、脂質交換タンパク質はリポ多糖結合タンパク質(LBP)、またはそのフラグメント、類似体、もしくは誘導体である。本発明の脂質交換タンパク質のフラグメント、類似体、または誘導体は機能上活性であり、即ち、リポタンパク質粒子へのリポ多糖の交換を促進することができる。本発明によれば、脂質交換タンパク質、特にPLTPまたはLB P はリポタンパク質粒子、例えば、HDL 粒子にリポ多糖を交換するように触媒的に機能し得る。特別な実施態様において、リン脂質は約８〜約18個の炭素原子のアシル鎖を有し、またはリン脂質は一つ以上のシス二重結合を含むアシル鎖を有する。更に特別な実施態様において、リン脂質は約14個より大きく約18個までの炭素原子のアシル鎖及び一つ以上のシス二重結合を有する。下記の実施例において、リン脂質のアシル鎖は14個の炭素原子を有し、かつ一つのシス二重結合を含む。特別な実施態様において、リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、セレブロシド、ガングリオシド、及びこれらの混合物からなる群から選ばれ得る。リン脂質はホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、及びこれらの混合物からなる群から選ばれることが好ましい。一つの特別な実施態様において、その組成物は両親媒性αらせんペプチド含有分子を実質的に欠いていもよい。別の特別な実施態様において、その組成物は両親媒性αらせんペプチド含有分子を含んでいてもよい。特に、両親媒性αらせんペプチド含有分子はアポリポタンパク質またはその両親媒性αらせん部分であってもよい。例えば、限定のためではないが、アポリポタンパク質またはそのフラグメントはアポリポタンパク質 A-I、apo-A-II、apo-A-IV、apo-B、apo-C-II、及びapo-E からなる群から選ばれてもよい。特別な実施態様において、αらせんペプチド含有分子はアポリポタンパク質A-I である。また、その組成物はコレステロールまたはその脂質二層結合誘導体を含むことができる。こうして、特別な観点において、本発明はリポタンパク質粒子と脂質交換タンパク質とを含む組成物に関する。特別な実施態様において、リポタンパク質粒子は高密度リポタンパク質(HDL)粒子であるが、低密度リポタンパク質(LDL)粒子及び超低密度リポタンパク質(VLDL)粒子が使用されてもよい。リポタンパク質粒子の約1/20より多くが脂質交換タンパク質を含むことが好ましい。更に好ましい観点において、リポタンパク質粒子の約1/2より多くが脂質交換タンパク質を含む。更に好ましい観点において、リポタンパク質粒子の約9/10より多くが脂質交換タンパク質を含む。リポタンパク質粒子成分及び脂質交換タンパク質は治療を要すると考えられる患者に見られる天然分子であることが好ましい。本発明の好ましい観点において、組成物は可溶性CD14を更に含む。可溶性CD14 はLBP により媒介される脂質交換の速度を、例えば、約30倍に著しく加速する。それ故、本発明は、治療抗体に対する宿主免疫と関連する問題を避けることができる点でセプシス及び敗血症性ショックの抗体に基く治療に対し大きな利点を与える。本発明の別の利点は、哺乳類患者に通常見られる粒子の濃縮または均一組成物である本発明の組成物の導入が重大な副作用を媒介しないと予想されることである。本発明の更に別の利点は、それがセプシスの治療のその他の様式、例えば、腫瘍壊死因子またはインターロイキン-1のアンタゴニスト、例えば、その抗体もしくはその可溶性受容体の使用、攻撃的抗生物質療法、または内毒素を直接抑制するその他の薬剤、例えば、内毒素の抗体の使用と適合性であることである。それ故、本発明は内毒素血症、セプシス、または敗血症性ショックのその他の治療とともに本発明の組成物の同時または連続の投与を提供する。本明細書に例示された特別な実施態様において、リポタンパク質粒子はアポリポタンパク質A-I（apo A-I）、リン脂質、及びコレステロールまたはその脂質二層結合誘導体を含む高密度リポタンパク質粒子である。特別な例において、リン脂質はホスファチジルコリン(PC)である。特別な例において、ホスファチジルコリン：コレステロール：アポリポタンパク質A-I の比は約80:4:1である。別の特別な実施態様において、特別な高密度リポタンパク質中に存在する場合のリポタンパク質（またはその両親媒性αらせん部分）対脂質交換タンパク質、特にLPS 結合タンパク質の重量比は約10〜約1000（または全タンパク質ではなくフラグメントが使用される場合にはその均等な比）の範囲である。その比が約 100 であることが更に好ましい。別の観点において、リポタンパク質、特に高密度リポタンパク質の濃度は約１μg/ml〜約１mg/ml の範囲である。特別な実施態様において、高密度リポタンパク質の濃度は約100 μg/mlである。組成物が両親媒性αらせんペプチド含有分子を欠いている場合、脂質交換タンパク質は、あたかも両親媒性ポリペプチドが存在したかのようにリン脂質に匹敵する配合量で存在してもよい。好ましい観点において、リポタンパク質粒子、特に高密度リポタンパク質粒子は均一である。脂質交換タンパク質に対する一次構造類似性を有するタンパク質を含むリポタンパク質粒子は小胞またはミセルからリポタンパク質、特にHDL へのLPS の転移を促進し得ることが発見された。こうして、本発明はLPS、即ち、内毒素の存在と関連する疾患または障害の治療に重要な意味を有する。それ故、本発明は脂質交換タンパク質を含むリポタンパク質粒子、即ち、本発明の組成物と、医薬上許される担体または賦形剤とを含む内毒素血症の治療用医薬組成物を更に提供する。更に特別な実施態様において、本発明の医薬組成物はアポリポタンパク質A-I（apo A-I）、リン脂質、及びコレステロールまたはその脂質二層結合誘導体を含む高密度リポタンパク質粒子と、リン脂質転移タンパク質またはリポ多糖結合タンパク質とを含む。更に別の観点において、医薬組成物は可溶性CD14を含む。本発明はリポ多糖を中和するのに有効な量の本発明の医薬組成物をこのような治療を要すると考えられる患者に投与することを特徴とするグラム陰性セプシスの治療方法を更に提供する。好ましい観点において、脂質交換タンパク質がLBP である場合、その方法は可溶性CD14を投与することを更に含む。また、本発明はグラム陰性感染症、内毒素介在性セプシス、または敗血症性ショックの診断、予診、または監視の方法を提供する。その方法は高密度リポタンパク質粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする脂質交換タンパク質を含むリポタンパク質粒子のレベルを測定し、そのレベルを初期の患者中のレベルと比較することを含み、この場合、レベルの増加はセプシスの陽性結果の大きな可能性を示す。一実施態様において、この測定はLPS を中和する患者からの血漿の能力の機能性測定である。別の実施態様において、その測定はイムノアッセイ技術、または特異性結合パートナーを使用するその均等物により行い得る。特別な実施態様において、リポタンパク質はリポタンパク質A-I を含む高密度リポタンパク質であり、また脂質交換タンパク質はリポ多糖結合タンパク質である。こうして、その方法は、例えば、サンドイッチイムノアッセイにより、リポ多糖結合タンパク質をまた含むアポリポタンパク質A-I を含むリポタンパク質粒子の割合を検出することを伴い得る。本発明の主目的はLPS の活性を中和するための組成物を提供することである。本発明の別の目的は脂質粒子中のLPS の隔離、及びLPS 活性の中和を促進する脂質含有粒子と脂質交換タンパク質とを含む組成物を提供することである。本発明の更に別の目的はin vitroまたはin vivo でLPS または内毒素を中和するための組成物を提供することである。本発明の更に別の目的はグラム陰性セプシス、即ち、グラム陰性バクテリアによる全身性感染症を患っていると考えられる患者に導入するための医薬組成物を提供することである。それ故、本発明の別の目的は内毒素介在性敗血症性ショックを治療するための医薬組成物を提供することである。本発明の別の目的はセプシスまたは敗血症性ショックのエピソードの結果に関する診断または予診のインジケータを提供することである。本発明の更に別の目的は添付図面及び発明の詳細な説明を見れば明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１．NHP はPMN を刺激するLPS の能力を最初に強化し、次いで中和する。E. coli K12 LPS(１ng/ml)を37℃で示された間隔でNHP(10％)とともにインキュベートした（●、○）。この期間の終了時に、緩衝液（●）またはrLBP（１pg/ml）（○）及び蛍光標識PMN を添加した。37℃で10分後に、フィブリノーゲンへのPMNの結合を物質及び方法に記載されたようにして測定した。血漿とともに120 分間のインキュベーション後に添加された新しいLPS(１ng/ml)（◆）は細胞付着を回復した。rLBP（１μg/ml）はPMN の添加の直前にLPS(１ng/ml)と混合される時に応答を可能にするのに充分であった（■）。“対照”はLPS 単独（▽）またはNHP 単独（◆）で処理されたPMN を表す。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図２．NHP はマクロファージへのELPSの結合を可能にし、次いで抑制する。EL PSをNHP(２％)とともに示された期間にわたってインキュベートし（■）、EDTAG VB^2-中で洗浄し、マクロファージの単層に添加し、赤血球の結合を物質及び方法に記載されたようにして評価した。データが100 のマクロファージ当たりに結合された赤血球の数である付着インデックスとして表され、３回繰り返された代表的な実験の三つのウェルに関する平均値±s.d.である。NHP とともに５分間インキュベートし、洗浄し、37℃で更に35分間インキュベートしたELPSはマクロファージへの結合の減少を示さなかった（○）。この実験において、LBP またはNHP の不在下のELPSは５の付着インデックスを生じた。図３．R-HDL へのLPS の結合はrLBPの濃度に依存する。³H-LPS（100ng/ml）を 37℃で１時間にわたってR-HDL(100 μg/ml)の存在下（●）または不在下（○）で次第に増加する濃度のrLBPとともにインキュベートした。d=1.12g/mlにおける超遠心分離後に、夫々の管の上半分及び下半分を分離し、³H-LPSの量をシンチレーションカウンティングにより評価した。データは夫々の管中で回収された合計の％として夫々の管の上半分(d〈1.12g/ml)中で測定されたCPM として示される。結果は２回の同一の研究及び一定投与量のLBP を使用する３回の同様の研究を表す。図４．R-HDL 及びrLBPによるLPS の中和の時間依存性。E.coli K12 LPS(1ng/m l)をrLBP（0.5mg/ml）の存在下（●）または不在下（○）で示された時間にわたってR-HDL(100 μg/mlのapoA-I）とともにインキュベートした。残っている生物活性LPS の量を、全ての試料のLBP 濃度を0.5 μg/mlに調節することにより評価し、フィブリノーゲンへのPMN の付着を測定した。付着の刺激が緩衝液単独（▽ ）、LPS 単独（▲）、またはR-HDL と一緒のLPS(■)では見られなかった。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図５．LBP はR-HDL による高濃度のLPS の中和を可能にする。次第に増加する濃度のE.coli K12 LPSを37℃で２時間にわたってrLBP（１μg/ml）の存在下（■ 、▲）または不在下（△）で緩衝液（■）またはR-HDL(100 μg/mlのapoA-I)(▲ 、△)とともにインキュベートした。残っている生物活性LPS の量を、全ての試料中の最終rLBP濃度を１μg/mlに調節し、PMN を添加し、フィブリノーゲンへの結合を測定することにより評価した。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図６．R-HDL によるLPS の中和はrLBPの濃度に依存する。次第に増加する濃度のrLBPを両方とも100 μg/mlの濃度のapoA-IでapoA-I（■）、またはR-HDL(▲) とともに37℃で２時間にわたってK12 LPS(10ng/ml)とともにインキュベートした。残っている生物活性LPS を、rLBP濃度を全ての管中で１mg/ml だけ上昇させ、 PMN を添加し、フィブリノーゲンへの結合を測定することにより評価した。付着の刺激がLPS 単独（▼）では見られなかった。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図７．Lp(A-I)粒子はLNF 活性を示す。次第に増加する濃度のR595 LPSを37℃ で２時間にわたって緩衝液(AHPBS)単独（■、△）、10％のNHP（●）、10％のap oA-I枯渇血漿（○）、または10％の精製Lp(A-I)粒子（▼）（NHP の開始容積に基準化された希釈液）とともにインキュベートした。このインキュベーションの終了時に、緩衝液（■）またはrLBP（△、●、○、▼）を0.5 μg/mlまで添加し、PMN を添加し、フィブリノーゲン被覆表面への付着を評価した。LPS 単独はPM N の刺激を生じなかった（■）。LNF 活性はここではLBP 刺激付着（△）と刺激能力の損失（矢印）の差異により表される。夫々の点は三つの組から選ばれた実験の３ウェルの平均を表す。図８．LBP/セプチン活性はLp(A-I)粒子で同時純化される(copurify)。 (A)示された濃度のR595 LPSを37℃で10分間にわたって緩衝液(AHPBS)単独（■）、10％のNHP(●)、10％のapoA-I枯渇血漿（○）、10％の精製Lp(A-I)粒子（▼）または10％の前免疫対照(sham)枯渇血漿（◆）の存在下でインキュベートした。フィブリノーゲンへのPMN の付着を刺激するこれらの混合物の能力を測定した。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均を表す。(B)ELPS を示された試料の1:80希釈液の存在下で37℃で10分間にわたってインキュベートした。処理されたELPSを洗浄し、マクロファージの単層に添加し、結合を物質及び方法に記載されたようにして評価した。夫々のバーは３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図９．Lp(A-I)粒子はLBP/セプチン活性及びLNF 活性の両方を含む。R595 LPS( 10ng/ml)を前免疫IgG カラムからの10％の溶離液（△、▲）または10％の精製Lp (A-I)粒子（○、●）の存在下で37℃で示された時間にわたってインキュベートした。このインキュベーションの終了時に、緩衝液(APBS)（△、▲）またはrLBP (0.5 μg/ml)(▲、●)を添加し、その混合物を更に10分間インキュベートし、次いでPMN を添加し、フィブリノーゲン被覆ウェルへのPMN の結合を測定した。LP S 単独（■）は細胞を刺激しなかった。夫々の点は３回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図10．抗LBP はapoA-Iを捕獲する。TerasakiプレートをLBP の抗体（ハッチ付きのバー）、apoA-I（中実のバー）またはCD14（開いたバー）で被覆し、続いて 30分間にわたってrLBP（0.1 μg/ml）、apoA-I（0.1 μg/ml）または部分精製されたリポタンパク質（５μg/ml）を添加した。捕獲されたapoA-Iをウサギ抗apoA -I(パネルA)で検出し、捕獲されたLBP をウサギ抗rLBP(パネルＢ)で検出した。バックグラウンドシグナル（LBP またはリポタンパク質が添加されなかった）を固定化抗体及び二次抗体の夫々の組み合わせについて測定し、示されたデータから引かれた。夫々のバーは３回繰り返された代表的な実験の平均±s.d.を表す。図11．LBP はR-HDL にsCD14-LPS 複合体を中和させる。500 μg/mlのrsCD14を 37℃で５時間にわたって10μg/mlのLPS(S.ミネソタR60 からのラフLPS)とともにインキュベートすることによりsCD14-LPS 複合体を生成した。1000倍に希釈されたCD14-LPS複合体(500ng/mlのsCD14 及び10ng/ml のLPS)を37℃で１時間にわたって示された濃度のR-HDL(○)またはR-HDL 及びrLBP(1μg/ml)(●)とともにプレインキュベートした。次いでフィブリノーゲン被覆表面へのPMNの付着を誘発するそれらの能力を評価した(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269)。図12．sCD14 はR-HDL 及びLBP によるLPS の中和を加速する。LPS(E.coli K12 、１ng/ml 及びLBP(0.5 μg/ml)をAPBS（CA++、MG⁺⁺及び１％のHSA を含むPSB)中で希釈し、示された間隔で37℃でR-HDL(100 μg/mlのapoA-I)とともに（●、▲ ）もしくはそれを使用しないで（○、△）、rsCD14（0.5 μg/ml）とともに（△ 、▲）もしくはそれを使用しないで（○、●）インキュベートした。２時間のインキュベーション後に残っている生物活性LPS を、PMN を添加し、フィブリノーゲン被覆表面への細胞の結合を記載されたようにして(Hailmanら，上記文献)評価することにより検出した。夫々の点は３ウェルの平均±s.d.を表す。図13．ホスファチジルコリン／コレステロール小胞はLBP 依存性様式でLPS を中和する。LPS(E.coli K12、１ng/ml)をR-HDL(■)(100 μg/mlのapoA-I)、またはapoA-Iを除いてR-HDL について記載されたようにして調製されたホスファチジルコリン(PC)／コレステロール小胞(○)(R-HDL 中に存在するものに均等の脂質の濃度)の存在下で37℃で２時間にわたって次第に増加する投与量のrLBPとともにインキュベートした。２時間のインキュベーション後に残っている生物活性LP Sの量を評価するために、LBP 濃度を夫々の管中で１μg/mlまで上昇させ、PMN を添加し、フィブリノーゲン被覆表面への細胞の結合を記載されたようにして(H a-ilman ら，上記文献）評価した。２時間にわたってR-HDL またはリポソームの不在下でrLBP（10μg/ml）とともにインキュベートされたLPS(♯)は強い細胞刺激を示した。点は３ウェルの平均±s.d.を表す。図14．LBP はPCリポソームによるsCD14-LPS 複合体の中和を媒介する。図11のように調製されたsCD14-LPS 複合体を1:1000に希釈し、37℃で２時間にわたって rLBP（１μg/ml）の存在下または不在下で示された濃度の卵PCリポソームとともにプレインキュベートした。次いで試料をPMN に添加し、フィブリノーゲン被覆表面への付着を評価した(Hailmanら，上記文献）。プレインキュベーション工程中の成分の濃度はその図及び先に示されたのよりも25％高かった。リポソームは PCを乾燥させ、PBS 中で再度懸濁させ、浴型装置中で５分間音波処理することによりつくられた。図15．rLBPはsCD14 からの³H-LPSの解離を加速する。sCD14-³H-LPS複合体は25 0μg/mlのsCD14 を37℃で16時間にわたって４μg/mlの³H-LPSとともにプレインキュベートすることにより生成された。次いでsCD14-³H-LPS複合体を1:5に希釈し、 PBS 中で１時間または10時間にわたってrLBP(１μg/ml）の存在下（Ｂ、レーン9 -16）または不在下(Ａ、レーン1-8)で単独で、または未標識LPS(100 μg/ml；レーン３、４、11、12)、ホスファチジルコリン(PC)(100μg/ml；レーン５、６、1 3、14)、またはポリマイシンＢスルフェート（10μg/ml；レーン７、８、15、16 ）とともにインキュベートした。これらの希釈は³H-LPSに対し100 倍重量過剰の未標識LPS 及びPCを与える。次いで試料を天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、³H-LPSを蛍光光度法により検出した。LBP の不在下では、³H-sCD14複合体はPCリポソームの存在下で10時間にわたって安定である（レーン６）。しかしながら、LBP の添加は１時間以内のsCD14 からPCへの³H-LPSの完全な転移を可能にする（レーン13）。図16．³H-ホスファチジルイノシトール(PI)は天然PAGE中でsCD14 とともに同時移動する。³H-LPS（レーン1-2)または³H-PI(レーン3-6)を１mMのEDTAを含むPB S 中で37℃で２時間にわたって単独で、またはsCD14(100 μg/ml、２μM)とともにインキュベートし、天然ポリアクリルアミドゲル中で実験し、蛍光光度法により検出した。レーン１、rsCD14＋³H-LPS(２μM)。レーン２、³H-LPS(２μM)。レーン３、rsCD14＋³H-PI(２μM)。レーン４、rsCD14＋³H-PI(18μM)。レーン５、³ H-PI(18μM)。レーン６、³H-PI(２μM)。図17．PCの脂肪アシル鎖の鎖長及び不飽和がrsCD14-LPSの中和に影響する。rs CD14-LPS複合体(図11中のように、最終濃度500ng/mlのrsCD14及び10ng/ml のLPS )を37℃で２時間にわたって単独で、rLBP（１μg/ml）とともに、またはrLBP及び合成PC(100 μM)とともにプレインキュベートし、次いでフィブリノーゲン被覆表面へのPMN の付着を誘発するそれらの能力について評価した。使用したPC製剤は１位及び２位に図に示された炭素の数（C4、C6、等）を有する飽和脂肪アシル鎖を有する。C18 シス9PC は両方の脂肪アシル鎖の９位に二重結合を有する。図18．急性期血漿はLPS の加速された中和を示す。LPS(E.coli K12、１ng/ml) を健康なドナーから溜められた正常なヒト血漿(NHP、10％)(○)または敗血症性ショックの患者からの急性期ヒト血漿(APHP、10％)(●)とともに37℃で示された間隔でインキュベートした。次いでPMN を添加し、フィブリノーゲン被覆表面への付着を記載されたようにして評価した。値は３ウェルの平均を表す。図19．異なる脂質によるLPS の中和。LPS(S.ミネソタRa、10ng/ml)及びrLBP（１μg/ml）をＹ軸に示された脂質(10μM)とともに37℃で２時間にわたってインキュベートした。残っている生物活性LPS を、蛍光標識好中球を添加し、37℃で 10分間インキュベートし、次いでフィブリノーゲン被覆表面への好中球の結合を評価することにより評価した。値は緩衝液対照中で観察された付着の％としての付着の刺激％（これは夫々の場合に観察された付着を表す）として表される。夫々の欄は２回繰り返された代表的な実験の３ウェルの平均±s.d.を表す。図20．PLTPはR-HDL によるLPS の迅速な中和を可能にする。LPS を0.5 ％のヒト血清アルブミンを含むPBS 中で37℃で示された時間にわたって単独で（□）またはR-HDL(■;再生されたHDL 粒子、100 μg/ml)、PLTP（R-HDL と一緒ではない場合△、R-HDL と一緒の場合▲；PLTPトランスフェクトされた細胞からの濃縮培地、初期の濃度に希釈）、及び対照培地（R-HDLと一緒ではない場合◇、R-HDLと一緒の場合◆、mockトランスフェクトされた細胞からの濃縮培地、初期の濃度に希釈、図中に“mock”とマークした）の種々の組み合わせとともにインキュベートした。次いでLBP を１μg/mlの最終濃度（R-HDL と一緒ではない場合○、R-HD L と一緒の場合●）まで試料に添加し、続いて蛍光標識PMN を3.3x10⁶/mlの最終濃度まで添加した。試料を37℃で10分間インキュベートし、フィブリノーゲン被覆プレートへのPMN の付着を測定した。誤差バーは３回の反復測定の標準偏差を表す。図21．PLTPはR-HDL への³H-LPSの結合を加速する。³H-LPS（１μg/ml）をPBS 中で37℃で２時間にわたってR-HDL(100 μg/ml)、LBP(１μg/ml)、CD14（５μg/ ml）、PLTP（PLTPトランスフェクトされた細胞からの5.6X濃縮された培地）または対照培地（mockトランスフェクトされた細胞からの4X濃縮された培地）の種々の組み合わせとともにインキュベートした。次いで混合物を8-166 ％の天然ポリアクリルアミドゲル中で電気泳動にかけ、³H-LPSを蛍光光度法により検出した。レーン１、³H-LPS単独。レーン２、³H-LPS＋R-HDL。レーン３、3H-LPS＋LBP。レーン４、³H-LPS＋LBP＋R-HDL。レーン５、³H-LPS＋PLTP。レーン６、³H-LPS＋PL TP＋R-HDL。レーン７、³H-LPS＋対照培地。レーン８、³H-LPS＋対照培地＋R-HDL 。レーン９、³H-LPS＋LBP＋CD14。レーン10、³H-LPS＋LBP＋CD14＋ R-HDL。レーン11、³H-LPS＋PLTP＋CD14。レーン12、³H-LPS＋PLTP＋CD14＋R-HDL レーン13、³H-LPS＋対照培地＋CD14。レーン14、³H-LPS＋対照培地＋CD14＋R-HD L 図22．rPLTP はR-HDL への³H-LPSの結合を媒介する。³H-LPS（１μg/ml）を37 ℃で２時間にわたってPBS 中で単独（レーン１）で、R-HDL(100 μg/ml)(レーン２)、対照培地(2X)（レーン３）、対照培地及びR-HDL(レーン４)、rPLTP 培地(2 X)（レーン５）、rPLTP 培地及びR-HDL(レーン６)、LBP 及びsCD14(レーン７)またはLBP、sCD14 及びR-HDL(レーン８)とともにインキュベートした。試料を天然 PAGEにかけ、³H-LPSを蛍光光度法により視覚化した。R-HDL を電気泳動にかけ、比較のために銀染色により視覚化した（レーン９）。図23．rPLTP はR-HDLによるLPS の中和を媒介する。LPS(10ng/ml)をR-HDL(100 (g/ml)（γ）、R-HDL 及びrPLTP 培地(2X)（■）、R-HDL 及び対照培地(2X)（● ）、rPLTP 培地（□）、または対照培地（○）の存在下で示された間隔でインキュベートした。生物活性LPS を、PMN を添加し、フィブリノーゲンへのそれらの結合を測定することにより評価した。夫々の点は３回の反復測定の平均±S.D.を表す。図24．rPLTP 培地はR-HDL によるLPS の中和を媒介する。LPS（10ng/ml）を37 ℃で示された間隔で単独（○）で、R-HDL(100 μg/ml)(●)、rPLTP 培地(2X)（ □）、またはrPLTP 培地及びR-HDL（■）とともにインキュベートした。生物活性LPS を、夫々の試料の一部を全血に添加し、IL-6の産生を測定することにより測定した。夫々の点はELISA により測定されたIL-6産生の３回の反復測定の平均 ±S.D.を表す。図25．rPLTP 培地はR-HDL を修飾することによりLPS の中和を媒介しない。LP S（10ng/ml）を37℃で示された時間にわたってrPLTP 培地(2X)の存在下（▲、■ 、●）または不在下（▼）でR-HDL(100 μg/ml)とともにインキュベートした。幾つかの場合（■、●）には、R-HDL をLPS の添加の前に37℃で１時間にわたってrPLTP 培地とともにプレインキュベートし、一つの場合（●）には、抗PLTPを LPS と同時に添加した。生物活性LPS を、図24のようにしてIL-6産生を全血中で測定することにより評価した。図26．抗PLTPポリクローナル抗体はR-HDL 及びrPLTP 培地によるLPS の中和を抑制する。LPS（10ng/ml）を37℃で２時間にわたって次第に増加する濃度の抗 PLTP抗体（■）または対照抗体（□）の存在下でR-HDL(100 μg/ml)及びrPLTP 培地(2X)とともにインキュベートした。生物活性LPS を、図24のようにしてIL-6 産生を全血中で測定することにより評価した。図27A.正常なヒト血漿はR-HDL によるLPS の中和を媒介する。LPS（10ng/ml）を37℃で次第に増加する時間にわたって単独（□）で、R-HDL(100 μg/ml)(■) 、NHP(3 ％)(▽)、またはNHP 及びR-HDL(▲)とともにインキュベートした。生物活性LPS を、図24のようにしてIL-6産生を全血中で測定することにより評価した。図27B.抗PLTPポリクローナル抗体はR-HDL 及びNHP によるLPS の中和を抑制しない。LPS（10ng/ml）を37℃で２時間にわたって次第に増加する濃度の抗PLTP抗体（■）または対照抗体（□）の存在下でR-HDL(100 μg/ml)及びNHP(3 ％)とともにインキュベートした。生物活性LPS を、図24のようにしてIL-6産生を全血中で測定することにより評価した。図28．rPLTP 培地はLPS によるPMN の刺激を媒介しない。PMN を37℃で10分間にわたって緩衝液単独（開いたバー）中で、または示された濃度のLBP、rPLTP 培地もしくは対照培地とともにLPS(10ng/ml)(満たされたバー)とともにインキュベートした。PMN を洗浄し、フィブリノーゲンへの付着を測定した。夫々の点は３回の反復測定の平均±S.D.を表す。図29．rPLTP 培地はLPS-sCD14 複合体の中和を媒介しない。LPS-sCD14 複合体を実験操作に記載されたようにして調製し、10ng/ml のLPS 及び１μg/mlのsCD1 4の最終濃度で示された時間にわたって単独（γ）で、LBP(１μg/ml)(○)、R-HD L(100μg/ml)(■)、LBP 及びR-HDL(●)、またはrPLTP 培地及びR-HDL(◆)とともにインキュベートした。生物活性LPS を、図24のようにしてIL-6産生を全血中で測定することにより評価した。図30．精製PLTPはsCD14 ではなくR-HDL への³H-LPSの転移を媒介する。³H-LPS （２μg/ml）を37℃で２時間にわたってLBP(１μg/ml)(レーン4-6)または精製PL TP(レーン7-9)の存在下でsCD14(10 μg/ml)（レーンｂ）またはR-HDL(100μg/ml )(レーンｃ)とともにインキュベートした。試料を天然PAGEにかけ、³H-LPS を蛍光光度法により視覚化した。発明の詳細な説明上記のように、本発明はin vitroまたはin vivo のリポ多糖活性を中和するための脂質交換タンパク質を含むリポタンパク質粒子を含む組成物に関する。本発明は当業者の範囲内の通常の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術に一部関係する。このような技術は文献に充分に説明されている。例えば、Sa mbrook，Fritsch ＆Maniatis，分子クローニング：実験マニュアル，第２編(198 9)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，ニューヨーク( 本明細書中、“Sambrookら，1989”と称する); ＤＮＡクローニング：実用的アプローチ，Ｉ巻及びII巻(D.N.Glover ら，1985);オリゴヌクレオチド合成(M．J. Gait編集,1984);核酸ハイブリダイゼーション［B.D.Hames ＆S.J.Higgins編集(1 985)］；転写及び翻訳［B.D.Hames ＆S.J.Higgins 編集(1984)］；動物細胞培養［R.I.Freshney編集(1986)］；固定された細胞及び酵素［IRL Press，(1986)］；B.Perbal，分子クローニングに関する実用的なガイド(1984)を参照のこと。それ故、本明細書で使用される場合、下記の用語は以下に示された定義を有するべきである。 “A”（ここで、“A”は単一分子、例えば、タンパク質、リン脂質、コレステロール、またはこのような成分の特定の均一な組成物である）を含む組成物は、組成物の少なくとも約75重量％が“A”である場合に“B”(ここで、“B”は一種以上の汚染タンパク質、リン脂質分子、等を含む)を実質的に含まない。“A”は組成物中のＡ＋Ｂ種の少なくとも約90重量％を構成することが好ましく、少なくとも約99重量％を構成することが最も好ましい。また、汚染を実質的に含まない組成物は関係する活性または特性を有する特定成分の夫々の単一分子量種のみを含むことが好ましい。本明細書に使用される“均一な”という用語は、夫々の粒子が個々の成分のほぼ同じ割合からつくられている粒子の特定組成物を表す。こうして、リン脂質及び脂質交換タンパク質を含む粒子の均一組成物中で、夫々の粒子はほぼ同じ割合のリン脂質またはリン脂質及び脂質交換タンパク質を有する。このような粒子は通常タンパク質及びリン脂質を含む種々の量の成分を有する天然産粒子とは区別される。また、本明細書に使用される“均一な”という用語は、実質的に同じ組成を有する粒子の一つより多い集団が存在する特定混合物を表す。例えば、本発明の“均一粒子の組成物”はホスファチジルコリン／ホスファチジルイノシトール／脂質交換タンパク質の粒子及びホスファチジルコリン／コレステロール／脂質交換タンパク質の粒子を含んでいてもよい。このような組成物は、厳密には均一ではないが、それにもかかわらず良く特定される。本発明の組成物に関して使用される“粒子”という用語は、リン脂質、脂質交換タンパク質、及び存在し得るその他の成分を含む脂質二層小胞または混合ミセルを表す。臨界濃度で、リン脂質がエネルギー的に有利であるこのような粒子を自然に形成することが当業界で良く理解されている。何となれば、リン脂質の極性頭基は水溶液中に延び、非極性アシル鎖は混合ミセルまたは小胞二層の内部に位置するからである。“混合ミセル”という用語は本明細書に特定されるように一種以上のリン脂質及び脂質交換タンパク質を含むミセルを表す。 “医薬上許される”という用語は、生理学上寛容され、かつ典型的にはヒトに投与された時にアレルギー反応または同様の望ましくない反応、例えば、胃の不調、目眩等を生じない分子物体または組成物を表す。本明細書に使用される“医薬上許される”という用語は連邦または州政府の規制当局により認可され、または米国薬局方もしくは動物、更に特別にはヒトにおける使用についてその他の一般に認められている薬局方にリストされていることを意味することが好ましい。 “担体”という用語は化合物が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを表す。このような医薬担体は無菌液体、例えば、水及び油であってもよく、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源の油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油等が挙げられる。水溶液または食塩水溶液並びに水性のデキストロース溶液及びグリセロール溶液が、特に注射液について担体として使用されることが好ましい。好適な医薬担体がE.W.Martinにより“レミントンの医薬科学”に記載されている。 “治療有効量”という用語は、宿主の活性、機能及び応答の臨床上重大な欠損を少なくとも約15％、好ましくは少なくとも50％、更に好ましくは少なくとも90 ％軽減し、最も好ましくはそれを阻止するのに充分な量を意味するのに本明細書に使用される。また、治療有効量は宿主の臨床上重大な症状の改善を生じるのに充分である。種々の略号が本明細書に使用され、HAP、0.5U/ml のアプロチニン、0.05％のヒト血清アルブミン、３mMのＤ−グルコースを含むダルベッコPBS; PD、Ca²⁺及びMg²⁺を欠いているダルベッコPBS; PD EDTA、１mMのEDTAを含むCa²⁺及びMg²⁺を欠いているダルベッコPBS; NHP、正常なヒト血漿; ELPS、LPS 被覆ヒツジ赤血球 ;LBP、ヒトリポ多糖結合タンパク質（少ない場合の“ｒ”はそのタンパク質が組換えにより生成されることを示す）；PLTP、リン脂質転移タンパク質; HDL、高密度リポタンパク質; R-HDL、再生された高密度リポタンパク質; PC、ホスファチジルコリンが挙げられる。本発明は、ヒト好中球に関して白血球インテグリンのCD14依存性活性化を測定する迅速アッセイを使用して天然HDL 及び再生HDL(R-HDL)によるLPS の機能性中和の研究の結果に一部基いている。これらの研究は、リン脂質及び遊離コレステロールと組み合わされた精製アポリポタンパク質A-1 から調製された再生HDL 粒子(R-HDL)がLPS の生物活性を中和するのに充分ではないが、LPS をCD14に転移し、LPS に対する細胞の応答を増進することが知られているタンパク質である組換えLPS 結合タンパク質(LBP)の添加がR-HDL によるLPS の速い結合及び中和を可能にすることを実証した。同様に、rPLTP はrLBPで観察された程度より大きい程度にR-HDL によるLPS 中和の速度を増進した。こうして、本発明は、PLTP及び LBP がLPS をリポタンパク質粒子に転移することができることが明らかであるという予期しない観察に一部基いている。また、可溶性CD14の存在はR-HDL へのLP S のLBP 介在性転移を大きく加速することがわかった。可溶性CD14はLPS のPLTP 介在性転移に関して効果を有しない。更に、本発明は、R-HDL とは対照的に、抗apoA-Iカラムによる選択アフィニティー免疫吸着(SAIS)により血漿から単離されたリポタンパク質を含むアポリポタンパク質A-I(LpA-I)が外在性LBP を添加しないでLPS を中和したという観察に基いている。本明細書に開示された証拠の幾つかの系列は、LBP が血漿中のLpA-I の成分であることを実証した。抗apoA-Iカラム中の血漿の通過はELISA により検出できるLBP の99％より多くを除去し、一方、LBP の31％がカラムの溶離により回収された。同様に、LPS による好中球の活性化を可能にする血漿の能力(LBP/ セプチン活性)が同プロセスにより枯渇され、回収された。更に、固定された抗L BP モノクローナル抗体はapoA-Iを共沈した。ここに記載された結果は、LPS をC D14に転移するその能力に加えて、HDL 粒子と会合したLBP がまたLPS をリポタンパク質に転移し得ることを示唆する。LBP はリポタンパク質と物理的に会合性であることが明らかであり、この会合が血漿中で安定であるので、このような複合体はLPS の中和に重要な役割を果たすように配置される。更に、本発明は、LBP が可溶性CD14(sCD14)からR-HDL へのLPS の転移を触媒作用し、sCD14がLBP 及びR-HDL によるLPS の中和を加速し、アポリポタンパク質ではなくリン脂質がLPS のLBP 依存性結合及び中和に必要とされ、sCD14 がリン脂質を結合し、リン脂質と会合したLBP によるLPS の中和がアシル鎖長に依存し、異なる脂質と会合したLBP が異なる程度にLPS を中和し、かつ急性期血漿が LPS の中和の増進を示すという本明細書に開示された観察に基いている。リポタンパク質組成物上記のように、本発明の組成物は、リン脂質またはリポタンパク質粒子へのLP S の転移を媒介することができる脂質交換タンパク質を含む。本明細書に使用される“脂質（またはリン脂質）交換タンパク質”及び“脂質（またはリン脂質）転移タンパク質”という用語は同じ意味を表し、小胞またはミセルからリポタンパク質粒子へのLPS の転移を媒介するタンパク質を表す。それ故、以下のこのようなタンパク質はLPS に作用することができない脂質交換（または転移）タンパク質からそれらを区別するために“LPS 交換タンパク質”と特別に称される。特別な観点において、本発明のLPS 交換タンパク質は、或るタンパク質がリポタンパク質粒子へのLPS の一種より多い分子の転移を媒介することができる点で触媒的に作用する。このようなタンパク質が天然源から、または組換え技術により得られる。特別な理論により束縛されることを意図しないが、このようなタンパク質は、それがLPS について会合される粒子からリン脂質を交換することにより操作し得る。下記の実施例に示されるように、LPS はLPS ミセルまたは小胞中に見られ、またはそれはCD14（可溶性または膜関連）と会合し得る。下記の特別な実施例において、ホスファチジルイノシトールはリン脂質-LPS交換タンパク質粒子への可溶性CD14と会合したLPS の交換に有利であることが観察された。本発明の大きな利点は、それがCD14と会合したLPS の交換を与えることである。この交換反応は、LPS がその受容体と会合した後にLPS の活性を中和することを与えるだけでなく、小胞またはミセル中に見られる“遊離”LPS を中和することを与える。好ましい実施態様において、LPS 交換タンパク質はリン脂質転移タンパク質(P LTP; Dayら，1994，J.Biol.Chem．269:9388)、または機能上活性であるそのフラグメント、類似体、または誘導体である。別の特別な実施態様において、LPS 交換タンパク質はLBP または脂質転移タンパク質（Wirtz，1991，Annu.Rev.Bio-ch em．60:73 を参照のこと）、または機能上活性であるそのフラグメント、類似体、または誘導体である。LPS 交換またはLPS 転移タンパク質、またはそのフラグメント、類似体もしくは誘導体は組換えにより生成し得る（例えば、Hailman ら，1994，J.Exp.Med．179:269; Day ら，上記文献）。“機能上活性”という用語は、リポタンパク質粒子へのLPS の転移を媒介する能力を特別に表す。 LPS 交換タンパク質誘導体は、コードする核酸配列を機能上均等な分子を与える置換、付加または欠失により変更することによりつくられる。天然LPS 交換タンパク質に対し機能活性を増進または増大した誘導体がつくられることが好ましい。本発明のLPS 交換タンパク質誘導体として、一次アミノ酸配列として、機能上均等なアミノ酸残基がその配列内の残基に代えて置換されて保存アミノ酸置換をもたらす変更配列を含むLPS 交換タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含むものが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、その配列内の一つ以上のアミノ酸残基が、機能上の均等物として作用する同様の極性の別のアミノ酸により置換されて、サイレント変化をもたらし得る。その配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスのその他の員から選択されてもよい。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性の中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電される（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電される（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。本発明のLPS 交換タンパク質誘導体及び類似体をコードする遺伝子は当業界で知られている種々の方法により生産し得る。それらの生産をもたらす操作は遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで行い得る。例えば、クローン化LPS 交換タンパク質遺伝子配列が当業界で知られている多数の戦略（Sambrookら．1989，上記文献）のいずれかにより修飾し得る。その配列は適当な部位で一種以上の制限エンドヌクレアーゼで開裂され、続いて所望により酵素修飾され、単離され、in v itro でつながれる。LPS 交換タンパク質の誘導体または類似体をコードする遺伝子の生産に際して、修飾された遺伝子は、所望の活性がコードされる遺伝子領域中に、翻訳終止シグナルにより中断されないで、LPS 交換タンパク質遺伝子と同じ翻訳読み取り枠内に残ることを確実にするように注意が払われるべきである。更に、LPS 交換タンパク質をコードする核酸配列はin vitroまたはin vivo で突然変異されて、翻訳配列、開始配列、及び／または終止配列を生じ、かつ／または分解し、またはコード領域中に変化を生じ、かつ／または新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成し、または既存のものを分解して、更にin vitro修飾を促進し得る。このような突然変異は突然変異されたLPS 交換タンパク質遺伝子産物の機能活性を増進することが好ましい。当業界で知られている突然変異誘発に関するあらゆる技術が使用でき、in vitro部位誘導突然変異誘発(Hutchinson,C. ら，1978，J.Biol.Chem．253:6551; Zoller 及びSmith，1984，DNA 3:479-488; Oliphantら，1986，Gene 44:177; Hutchinson ら，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U .S.A．83:710)、TAB(商標)リンカー（ファーマシア）の使用、等が挙げられるが、これらに限定されない。PCR 技術が部位誘導突然変異誘発に好ましい（Hig-uc hi，1989，“ＤＮＡを操作するためのPCR の使用”,PCR Technology; DNA 増幅に関する原理及び応用，H.Erlich編集，Stockton Press，６章，61-70 頁を参照のこと）。種々のリン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、スフィンゴミエリン、セレブロシド、及びガングリオシド（これらに限定されない）がリン脂質粒子を調製するのに使用し得る。リン脂質の或る特性はLPS を中和するLPS 交換タンパク質、例えば、PLTPまたはLBP の能力を増進する。例えば、約８〜約18個の炭素原子のリン脂質アシル鎖長はLBP により媒介される脂質交換に好ましいことがわかった。また、例えば、長さが14個よりも多い更に長いアシル鎖について、１個以上の不飽和結合、即ち、シス−二重結合の存在はLPS を中和するLBP の能力を増進することがわかった。それ故、本発明は、好ましくは１個、更に好ましくは１個より多いシス−二重結合を有する、長さが18個より多い炭素原子のアシル鎖の使用を意図している。一種のリン脂質または一種より多いリン脂質の混合物が本発明の組成物を調製するのに使用し得る。一種以上のリン脂質の選択は交換反応を最適にして、LPS を中和する高い能力を有する組成物をもたらすことが好ましい。これに関して、上記のように、ホスファチジルイノシトール(PI)はLBP 介在性交換に良好な基質であることが明らかであることがわかった。こうして、好ましい実施態様において、リン脂質粒子はPIを含む。その粒子はPI及びPCを含むことが更に好ましい。PCの存在はその粒子を安定化する。脂質-LPS交換タンパク質粒子組成物を安定化するためのその他の薬剤として、トリグリセリド；コレステロール、または脂質二層と会合するその誘導体及び類似体、例えば、コレステロールエステル；並びに両親媒性α−らせんペプチド含有分子が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に使用される“両親媒性α−らせんペプチド含有分子”という用語は両親媒性α−らせん構造を有するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、またはこれらの接合体（例えば、互いにカップリングされたもの、短いポリマーにカップリングされたもの、等）を表す。これらの分子の例、及び脂質粒子と相互作用し、安定化するそれらの能力が当業界で公知である（例えば、Cantor及びSchim- mel，Biophysical Chemistry Part I:生物巨大分子の配座，W.H.Freeman ＆Com- pany: サンフランシスコ，1980，246-248 頁; Darnell ら，分子細胞生物学，Sc ientific American Books:ニューヨーク，1986，578-584 頁を参照のこと；これらの文献の夫々が本明細書に特別に含まれる）。また、このようなタンパク質のα−らせん部分またはドメインは脂質と会合するのに充分であることが知られている。このような両親媒性α−らせんペプチド含有分子はアポリポタンパク質であることが好ましく、これらは脂質と相互作用するように特別に設計されている。それ故、このような分子の例として、apo A-I、apo A-II、apo B、apo C-I 、apo C-II、apo C-III、及びapo E が挙げられるが、これらに限定されない。リポタンパク質粒子という用語は高密度リポタンパク質(HDL)粒子、低密度リポタンパク質(LDL)粒子、及び超低密度リポタンパク質(VLDL)粒子を表す。このような粒子はリポタンパク質、例えば、アポリポタンパク質(apo)A-I及び／またはapo A-II（HDL の成分);リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン; 及びコレステロール（または細胞膜に結合するその誘導体もしくは類似体）のその中の存在を特徴とする。apo A-I は約245 アミノ酸タンパク質を含む。apo A-IIは単一ジスルフィド結合により結合された二つの約77アミノ酸タンパク質のホモダイマーである。本発明の組成物のin vitro使用特別な実施態様において、LPS 交換タンパク質を含む本発明のリン脂質-LPS 交換タンパク質組成物は溶液中の内毒素のレベルを減少または排除するのにin v itro で使用し得る。内毒素のレベルの減少はin vitro細胞培養及び醗酵に極めて重要である。細胞培地中の内毒素の存在は特別な抗原に応答して白血球またはリンパ球の活性化を測定するように設計された実験をだめにすることがあり、またはこのような細胞の特別な系列またはクローンを増殖しようとする努力をだいなしにすることがある。それ故、免疫学者及び細胞培養技術は内毒素を避け、または破壊するのに長時間、及び費用を要する。頻繁に、これらの努力は培地または血清（例えば、ウシ胎児血清）の試料中の内毒素のレベルを測定し、内毒素汚染を示すロットを捨てることを含む。その他の戦略は特異性抗体吸着による内毒素の排除を含み、これは部分的に有効であるにすぎない。こうして、本発明は細胞培養液またはその成分中の内毒素のレベルを排除または減少することを有利に与える。それ故、本発明は本発明の組成物をLPS 活性を中和するのに有効な濃度で細胞培地に添加することを提供する。このような濃度は、例えば、インジケータとしてLPS 活性のアッセイを使用する滴定技術を使用して容易に決定し得る。本明細書に例示された、LPS 活性の一つのアッセイはフィブリノーゲン被覆表面へのPM S の付着を評価することを含む(van Kessel ら，1994，J.Immunol.Meth.)。LPS の存在に関するその他のアッセイ、例えば、TNF またはその他のリンホカインの発現がまた組成物のin vitro投与量を滴定するのに使用し得る。同様に、グラム陽性バクテリア、最も普通にはE.coliにより生産された組換えタンパク質中の内毒素の存在はこれらの製剤をヒト及びその他の哺乳類における治療用に不適にする。それ故、本発明はこれらの起源からの内毒素汚染物質を中和し、こうして組換え生産タンパク質をヒト及び動物用に安全にすることを提供する。本発明の更なる利点は、LPS 含有リン脂質粒子またはリポタンパク質粒子が簡単なサイズ排除クロマトグラフィーにより組換え発現されたタンパク質から容易に除去されることである。何となれば、このような粒子とタンパク質の間には大きなサイズの相違があるからである。更に、リポタンパク質粒子はかなり不活性であり、また培養中または患者に投与される組成物中に使用される場合に実質的な副作用を媒介しないと予想される。治療方法本発明は内毒素介在性セプシスの症候、特にTNF の血液レベルの一時的な増加と関連する症候の一種以上、例えば、発熱、緊張低下、好中球減少症、白血球減少症、血小板減少症、ショック及び多発性臓器不全を治療し、かつ／または予防する方法を意図している。このような治療を要する患者として、グラム陰性バクテリア感染症から生じる内毒素症のおそれがあり、またそれを患っていると考えられる患者が挙げられる。特に本発明から恩恵を受けることができる患者は、E. coli、サルモネラ、等による感染症を患っている患者である。特にセプシスのおそれがある患者として、火傷、銃弾傷、薬品毒または乱用のための腎不全または肝不全を患っている患者、免疫悪化した個体、例えば、AIDS患者、等が挙げられる。本発明の組成物は医薬上許される担体と混合して調製されることが好ましい。本明細書に使用される“内毒素症”という用語は、内毒素（LPS 粒子または分子）が特定の応答を誘発できるレベルで患者中に存在する症状を表す。一般に、内毒素症はグラム陰性バクテリア感染症と関連する。 “グラム陰性”バクテリア感染症という用語はグラム陰性バクテリア、例えば、E.coli及びサルモネラ（これらに限定されない）による局所または全身の感染症を表す。 “内毒素介在性セプシス”という用語は内毒素の増大されたレベル、またはグラム陰性感染症と関連するセプシスを表す。“セプシス”という用語は発明の背景に定義されている。本発明の組成物、特に本発明の医薬組成物、またはこのような組成物の投与は内毒素症、セプシス、または敗血症性ショックを患っていると考えられる動物患者、特に哺乳類患者を保護または治療するのに使用し得る。こうして、本発明の組成物は鳥類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、及びペット、哺乳類、好ましくはヒトに使用し得るが、本発明の組成物はその他の哺乳類種における使用について意図されており、これらとして、家畜動物（イヌ及びネコ）、牧場動物（ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ブタ、等）、げっ歯類、及び非家畜動物が挙げられるが、これらに限定されない。セプシスが内毒素またはグラム陰性バクテリア感染症のためであることを確かめることは常に実施可能または実用的であるとは限らないので、本発明の組成物の投与は内毒素症、内毒素介在性セプシス、またはグラム陰性感染症を患っていると疑われている患者の治療に指示される。本発明の組成物、即ち、リポタンパク質粒子はそれら自体で高度に活性ではないことが特に有利である。こうして、このような組成物は、たとえグラム陰性感染症が確かめられないとしても予防投与のために安全であると考えられる。こうして、本発明によれば、組成物は特にセプシスを発生するおそれがある患者において内毒素症を避けるのに予防上有利に使用し得る。予防または治療のための本発明の組成物の実際の投与量は多くの因子、例えば、感染の潜在性または段階、セプシスの重度、患者の総合の健康、患者の年齢、患者のサイズ及び体重、等に依存する。これらのパラメーターの評価に基いて治療有効投与量を決めるのは通常の医師の技量内にある。本発明の特別な利点は、リポタンパク質-LPS 交換タンパク質組成物が患者の自然成分を反映し、こうして中和またはアレルギー免疫応答を生じる可能性を減少し得ることである。診断方法上記のように、本発明はグラム陰性セプシスまたは内毒素介在性セプシスを患っていると考えられる患者の診断、監視、または予診の方法を提供する。一般に、診断、監視、または予診の方法は患者からの生物学的試料中のリポタンパク質と会合したLPS 交換タンパク質のレベルを検出または測定し、こうして測定されたレベルを初期に患者中で測定されたレベル、または正常に見られるレベルと比較することを伴い、特別な例において、そのレベルの適度の増加は内毒素症を示し、また大きい増加は急性期を示す。検出または測定はLPS 活性を中和する患者からの生物学的液体、例えば、血漿または血清の能力を測定することを含み得る。LPS 活性は、先に説明された方法、例えば、PMN の付着、TNF またはIL-Iの発現の誘発、等を含む当業界で知られているあらゆる方法を使用して評価し得る。下記の特別な実施例において、LPS 活性を中和する血漿の大きく増大された能力は敗血症性ショックの急性期と関連する。それ故、本発明は敗血症性ショックの急性期を診断するためのアッセイを特別に提供する。別の実施態様において、LPS を中和する血漿の能力の適度の増加は内毒素症と関連した。特に、正常なボランティアにLPS を注射し、LPS による注射の６時間後にボランティアから採取された血漿はLPS への暴露の前に採取された血漿と比較してLPS 中和活性を増大した。また、本発明の検出はイムノアッセイにより分析し得る。例えば、リポタンパク質もしくはLPS 交換タンパク質、またはその両方の成分と反応性の抗体が調製され、必要により例えば酵素、蛍光化合物及び／または放射性元素で標識され、次いで内毒素介在性セプシスを患っていると考えられる哺乳類からの生物学的試料に導入し得る。標識物質が結合を起こらせる条件下で試料中に存在し得る抗原と反応する機会を有した後に、得られる混合物が結合の立証のために知られている技術（これらは結合された標識の性質により変化し得る）により試験し得る。これらの一般的な操作及びそれらの応用は全て当業者に良く知られており、本明細書に例示として示されるが、本発明の範囲内で利用し得る操作を限定するものではない。“競合”操作と同様のイムノアッセイ操作が米国特許第3,654,090 号及び同第3,850,752 号明細書に記載されている。“サンドイッチ”操作と同様のイムノアッセイが米国特許第RE31,006号及び同第4,016,043 号明細書に記載されている。本発明によれば、LPS 交換タンパク質及びリポタンパク質粒子を認識する抗体が商用源またはその他の源から入手でき、または調製し得る。このような抗体として、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fa b フラグメント、及びFab 発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。それ故、本明細書に使用される“抗体”という用語は、広義に、例えば、上記のような免疫グロブリンまたはその抗原結合フラグメントに関する。当業界で知られている種々の操作がポリクローナル抗体の産生に使用し得る。抗体の産生について、種々の宿主動物（ウサギ、マウス、ラット、等が挙げられるが、これらに限定されない）が抗原による注射により免疫し得る。一実施態様において、LPS 交換タンパク質またはリポタンパク質粒子の成分が免疫原性キャリヤー、例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)に接合し得る。種々のアジュバントが宿主種に応じて免疫応答を増大するのに使用されてもよく、これらのアジュバントとして、フロイント（完全及び不完全）、無機ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、表面活性物質、例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及び潜在的に有益なヒトアジュバント、例えば、BCG(カルメット・ゲラン牛型)及びコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)が挙げられるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体の調製について、培養中の連続細胞系により抗体分子の産生を与えるあらゆる技術が使用し得る。これらとして、Kohler及びMilstein(197 5, Nature 256:495-497)により最初に開発されたハイブリドーマ技術、並びにトリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor ら，1983，Immunology To- day 4:72)、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのEBV-ハイブリドーマ技術(Cole ら，1985，モノクローナル抗体及び癌療法，Alan R.Liss,Inc.,77-96 頁)が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の追加の実施態様において、モノクローナル抗体は最近の技術(PCT/US90/02545)を使用して無胚動物中で産生し得る。本発明によれば、ヒト抗体が使用されてもよく、ヒトハイブリドーマ (Cote ら，1983．Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．80:2026-2030)を使用することにより、またはヒトＢ細胞をin vitroでEBV ウイルスで形質転換することにより得られる(Cole ら，1985，モノクローナル抗体及び癌療法，Alan R.Liss,Inc.,77- 96頁)。本発明によれば、一本鎖抗体の産生について記載された技術（米国特許第4,94 6,778号）が抗体を産生するのに採用し得る。本発明の追加の実施態様はFab発現ライブラリーの構築について記載された技術（Huseら，1989，Science 246:1275 -1281）を利用して所望の特異性を有するモノクローナルFab フラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にする。抗体分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の技術により生成し得る。例えば、このようなフラグメントとして、抗体分子のペプシン消化により産生し得るF(ab')₂フラグメント、F(ab')₂フラグメントのジスルフィドブリッジを還元することにより生成し得るFab'フラグメント、及び抗体分子をパパイン及び還元剤で処理することにより生成し得るFab フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。抗体の産生において、所望の抗体のスクリーニングは当業界で知られている技術、例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)、“サンドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈殿反応、免疫拡散アッセイ、in situ イムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素または放射性同位元素標識を使用する）、ウェスタンブロット、沈殿反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体固定アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、及び免疫電気泳動アッセイ、等により行い得る。一実施態様において、抗体結合が一次抗体で標識を検出することにより検出される。別の実施態様において、一次抗体が一次抗体への二次抗体または試薬の結合を検出することにより検出される。別の実施態様において、二次抗体が標識される。多くの手段がイムノアッセイにおいて結合を検出するために当業界で知られており、本発明の範囲内である。上記抗体が、例えば、ウェスタンブロッティング、PTP の画像形成、適当な生理学的試料中のそのレベルの測定、等について、LPS 交換担体またはリポタンパク質粒子のレベルを検出し、測定することに関して当業界で知られている方法に使用し得る。一般に、抗体は検出可能に標識されるであろう。これらの研究に最も普通に使用される標識は放射性元素、酵素、紫外線に暴露された時に蛍光を発する薬品、等である。好適な放射性元素は³H、¹⁴C、³²P、³⁵S、³⁶Cl、⁵¹Cr、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、⁹⁰Y 、¹²⁵I、¹³¹I、及び¹⁸⁶Re からなる群から選ばれてもよい。放射性標識、例えば、上記の放射性同位元素の一つが使用される場合、既知の現在利用できるカウンティング操作が標識の量、ひいては結合された物質の量を検出または定量するのに利用し得る。標識が酵素である場合、検出は当業界で知られている現在利用されている比色技術、分光光度技術、蛍光光度技術、温度測定技術、電流滴定技術または気体定量技術のいずれかにより行い得る。酵素は、橋かけ分子、例えば、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等との反応により炭水化物に接合されてもよい。これらの操作に使用し得る多くの酵素が知られており、利用し得る。好ましい酵素はペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ヘキソキナーゼ＋GDPase、RNAse、グルコースオキシダーゼ＋アルカリ性ホスファターゼ、NAD オキシドリダクターゼ＋ルシフェラーゼ、ホスホフラクトキナーゼ＋ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ＋ホスホエノールピルベートデカルボキシラーゼ、及びアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第3,654,090号、同第3,850,7 52 号、及び同第4,016,043 号が別の標識物質及び標識方法のそれらの開示について例として参考にされる。幾つかの蛍光物質が知られており、標識として利用し得る。これらとして、例えば、フルオレセイン、ローダミン及びオーラミンが挙げられる。本発明はリポタンパク質と会合したLPS 交換タンパク質の存在の程度の定量分析のために試験キットの形態で調製し得るアッセイ系を含む。その系または試験キットは試料中のLPS 交換タンパク質及びリポタンパク質の存在及び量を検出するための手段を含むであろう。必要により、試験キットはまた指示、酵素基質、及びその他の試薬を含んでいてもよい。特別な実施態様において、本発明のキットは標準物質として既知の量の本発明の組成物を含んでいてもよい。上記の試験技術によれば、このようなキットの一つのクラスはLPS 交換タンパク質及びリポタンパク質の成分への抗体の結合を検出するための手段を含み、また選択される方法に応じて指示を含んでもよい。また、キットは補助的な試薬、例えば、緩衝剤、安定剤、等を含んでいてもよい。試験キットの別のこのようなクラスはLPS を中和する血漿の能力を測定するのに必要な試薬を含むであろう。例えば、このような試験キットは既知の量のLPS 、及び試料中のLPS のレベルを測定するための手段、例えば、PMN 付着アッセイ用試薬、またはTNF もしくはIL-1を検出するための抗体、等を含んでいてもよい。このような試験キットは標準物質を与えるために既知の量の方法の組成物を含むことが好ましいであろう。本明細書に使用される“診断”という用語は疾患または障害の原因に関する医療上の結論を表し、これは症候及び妥当なインジケータの全体に基いている。本発明によれば、例えば、LPS を中和する血漿の能力により測定されるような、リポタンパク質と会合したLBP のレベルの変化が内毒素介在性セプシスと関連しているかもしれない。こうして、上記のように、また下記の実施例において、本発明は内毒素症、セプシス及び敗血症性ショックの診断を提供する。 “監視”という用語は、治療が本発明の組成物の投与またはグラム陰性セプシスのその他の治療を伴おうとも、治療を受ける患者の症状を評価することを表す。本発明は、リポタンパク質、特にHDL 粒子と会合したLBP のレベルの変化が内毒素介在性セプシスまたは敗血症性ショックの治療と関連し得ることを意図している。 “予診”という用語は疾患または障害の結果または進行を予測することを表す。本発明によれば、予診はセプシスまたは敗血症性ショックの結果、例えば、グラム陰性感染症または内毒素介在性セプシスを患っていると考えられる患者が回復する可能性の予診である。特に、予診は高密度リポタンパク質粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とするLPS 交換タンパク質を含むリポタンパク質粒子のレベルを測定し、工程(a)で測定されたレベルを初期の患者中のレベルと比較することを伴ってもよく、この場合、レベルの増加はセプシスの陽性結果の大きな可能性を示す。特別な実施態様において、LBP を含むHDL 粒子のレベルの測定は、またリポ多糖結合タンパク質を含むアポリポタンパク質A-I を含むリポタンパク質粒子の割合を検出することを含む。例えば、捕獲試薬としての抗apo A-I 抗体及び検出試薬としての抗LBP 抗体を使用するサンドイッチイムノアッセイが行い得る。また、抗LBP 抗体が捕獲試薬として使用でき、また抗apo A-I 抗体が検出試薬として使用し得る。下記の特別な実施例において、LBP の存在は抗apo A-I カラムから溶離されたLp(A-I)粒子のELISA により検出される。下記の別の特別な実施例において、HDL とのLBP の会合は固相吸着されたモノクローナル抗LBP 抗体17G4を使用するサンドイッチELISA により検出され、Lp(A-I)の存在がポリクローナル抗apo A-I により検出される。本発明は、その開発及び正当性の実証において従われた構築及び操作の詳細を示す下記の例示記載に鑑みて良く理解されるであろう。実施例１：LBP-リポタンパク質複合体がLPS を中和する。本実施例は、LBP を含む再生HDL 粒子、並びにLBP を含む血漿から単離された LpA-I 粒子がLPS を中和することを実証する。物質及び方法試薬．サルモネラ・ミネソタ株R595(Re)からのLPS 及びE.coli K12株LCD25(K12) からの³H標識LPS をList Biological Laboratories（キャンベル、CA）から購入した。ヒト血清アルブミンをArmour Pharmaceutical Company(カンカキー，IL.) から購入した。組換えヒトリポ多糖結合タンパク質(rLBP)を記載されたようにして発現し、精製した(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269)。ポリクローナル抗rLBPをウサギ中で生じ、プロテインＧセファロースによるクロマトグラフィーにより精製した。17G4はLBP に対し誘導されたマウスモノクローナル抗体(IgG2a )である。それを腹水からプロテインＧセファロースによるクロマトグラフィーにより精製した。精製された卵ホスファチジルコリン、コレステロール及び葉酸ナトリウムをSigma Chemical Co．(セントルイス，MO)から購入した。正常なヒト血漿(NHP)を5U/ml のナトリウムヘパリンで凝固阻止された健康なドナーの血液から調製し、４℃で貯蔵した。 NHP からのアポリポタンパク質A-I の枯渇．既に記載されたような選択アフィニティー免疫吸着(SAIS)(McVicarら，1984，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 81:1356; Kunitakeら，1990，Arteriosclerosis 10:25)を使用して、NHP からアポリポタンパク質A-I(apoA-I)を枯渇した。ヤギ抗ヒトapoA-I IgGにカップリングされたセファロースのカラムに通されたNHP はELISA によりapoA-Iが95％より大きく枯渇されたことを示した。0.2Mの酢酸、150 mMのNaCl(pH3.0)による溶離によるカラムからのapoA-Iの回収は90％より大きかった。apoA-I含有リポタンパク質(Lp( A-I))の得られる製剤を前記のようにして特性決定した(McVicarら，上記文献）。対照として、NHP を前免疫IgG カラムに通し、フロースルーからのapoA-Iの検出可能な損失及び酸溶離液中のapoA-Iの回収を示さなかった。イムノアフィニティーカラムを調製するのに使用したヤギ抗ヒトapoA-I抗体はELISA(図10を参照のこと)またはウェスタンブロット（データは示されない）によりLBP を認識しないことが示された。再生HDL 粒子の調製．R-HDL を既に記載されたような葉酸ナトリウム透析方法 (Matz ら，1982，J.Biol.Chem．257(8):4535)により調製した。簡単に言えば、連続の超遠心分離及び既に記載されたようなサイズ排除クロマトグラフィー(We- isweiler，1987，Clin.Chim.Acta 169:249)により精製されたapoA-Iを80:4:1:80 の比(PC:コレステロール:apoA-I:葉酸塩)の比で卵ホスファチジルコリン(PC)、コレステロール及び葉酸塩と混合し、葉酸塩を0.01％のアジ化ナトリウムを含む PD EDTA(Ca²⁺及びMg²⁺を欠いており、１mMのEDTAを含むダルベッコPBS)に対し徹底的な透析で除去した。PC及びコレステロールを省いた別の混合物(apoA-I単独) を平行して調製した。約200 kd MW の脂質含有粒子へのapoA-Iタンパク質のとり込みを、ファーマシアスペロース６カラム(60cm x 1.8cm)を使用するゲル濾過により、またファーマシア・ファスト系で運転された8-25％のゲルを使用する非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により確認した。最終的な製剤を４℃で0.01 ％のアジドを含むPDEDTA中で貯蔵した。LPS の生物活性のアッセイに使用する直前に、apoA-I製剤をセントリコン10(Amicon，バーバリィ，MA.)中の限外濾過によりAPBS(0.5 ％のヒト血清アルブミンを含むPBS)に交換した。 LBP の定量のためのELISA．72ウェルのテラサキ・プレート(Robbins Scient-i fic Corp.，サニーベール，CA.)を抗LBP mAb 17G4（５μg/ml）で被覆し、次いで10％の無脂肪ミルクを含むPD（Ca²⁺またはMg²+を欠いているダルベッコPBS)でブロックした。次いでプレートをトゥイーン20（0.05％）を含むPDで洗浄し、0. 1％の無脂肪ミルクを含むPD中で希釈された試料を室温で１時間にわたってプレートに添加した。次いでプレートを洗浄し、ウサギ抗ヒトrLBP（0.1 ％の無脂肪ミルクを含むPD中５μg/ml）を室温で１時間にわたって添加した。プレートを再度洗浄し、アルカリ性ホスファターゼ接合ヤギ抗ウサギIgG（Bio-Rad，リッチモンドCA.)(0.1％の無脂肪ミルクを含むPD中1:1500)をウェルに添加した。室温で更に35分間インキュベートした後、プレートを洗浄し、蛍光性(fluorogenic)基質アットホス(JBL scientific,サンルイスオビスポ，CA)及びサイトフルオー230 0(Millipore Corp.)蛍光プレートリーダーを使用して結合されたアルカリ性ホスファターゼを測定した。夫々のプレートは0.1 ％のミルクを含むPD中で希釈された既知濃度のrLBPの標準曲線を含んでいた。 apoA-IとのLBP の相互作用を観察するために、テラサキウェルを21℃で２時間にわたって５μg/mlのmAb 17G4、ヒトapoA-I、型IIに対し誘導されたmAb（Calb- iochem)、またはCD14に対し誘導された対照mAb 26ic(Toddら，1982，Hybridoma1 :329)で被覆した。プレートを記載されたようにして0.5 ％のゼラチンでブロックし(Marcel ら，1990，J.Clin.Invest．85:10)、rLBP、精製apoA-I、または部分精製リポタンパク質の希釈液を21℃で30分間にわたって添加した。次いでプレートを洗浄し、ヤギ抗apoA-I（10μg/ml）またはウサギ抗LBP（10μg/ml）とともにインキュベートした。結合された二次抗体を上記のようにしてアルカリ性ホスファターゼ接合抗ヤギ(Bio-Rad)または抗ウサギIgG で検出した。ハイパック^TMアルデヒド(Chromatochem，ミゾウラ，MO)を装填したカラムにNH P を通すことにより、部分精製リポタンパク質を得た。この操作はNHP からLBS/ セプチン活性を定量的に除去した。カラムを0.5Mの酢酸アンモニウム、pH3.0で溶離し、溶離液を直ちにG-25セファデックスカラムに適用して緩衝剤をPDEDTAに交換した。この溶離液は血漿の初期のLBS/セプチン活性の90％を含んでいたが、血漿のタンパク質の１％未満を含んでいた。 LPS によるPMN の刺激．LPS の生物活性を評価するために、フィブリノーゲン被覆表面へのヒトPMN の付着を測定した(van Kessel ら，1994，J.Immunol.Met- hodsを参照のこと)。このアッセイにおいて、PMN 付着の刺激は細胞表面CD14へのLPS の結合に依存し、この結合を促進するのにLBP またはセプチン(LBP/ セプチン活性）を必要とする。フィブリノーゲンへの刺激されたPMN の付着は白血球インテグリンCD11b/CD18(CR3，Mac1)により媒介される。簡単に言えば、LPS 及びLBP またはセプチンの源を含む混合物を示された濃度までAPBSまたはAHPBS（4U/mlのナトリウムヘパリンを含むAPBS）中で希釈し、50 μl の最終容積を得た。記載されたように(Hailmanら，上記文献)5-(及び6-)カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステルで蛍光標識された新たに単離されたPMN（HAP(0.5U/ml のアポチニン、0.05％のヒト血清アルブミン、３mMのＤ−グルコースを含むダルベッコPBS)中2 x 10⁷の細胞/ml）10μ l を添加し、37℃で10分間インキュベートして細胞を刺激した。次いでPMN をHA P 中で洗浄し、フィブリノーゲンで被覆された72ウェルのテラサキプレートに添加した。37℃で15分後に、プレートへのPMN の付着を定量した。夫々のウェル中の蛍光を、ウェル当たりの細胞数を定量する方法としてサイトフルオー2300を使用して測定した。次いでプレートを洗浄し、プレートを再度読み取った。結合を洗浄工程後にウェルに残っている細胞の％（付着％）として表す。PMN の刺激は LPS 及びLBP/セプチンの両方を必要とするので（図１）、過剰のLBP の存在下で行われたアッセイはLPS の利用可能な濃度を測定する。同様の様式において、過剰のLPS の存在下で行われたアッセイはLBP/セプチンの利用可能な濃度を測定する。最大応答におけるドナー間の変化（20-75％の付着）により別々の実験の結果を平均化することはできないが、それにもかかわらず応答のパターンは再現性があった。 LPS の中和．LPS を37℃で０〜２時間にわたってAHPBS 中で希釈されたリポタンパク質またはNHP とともにインキュベートした。管中に残っている利用可能な LPS の量を、LBP 濃度を0.5-1.0 μg/mlに調節し、PMN を添加し、上記のようにして付着を測定することにより評価した。マクロファージへのLPS 被覆赤血球の結合．培養されたヒトマクロファージの CD14による、血漿でオプソニン化作用されたLPS 被覆ヒツジ赤血球(ELPS)の結合を記載されたようにして行った(Wright ら，1989，J.Exp.Med．170:1231)。簡単に言えば、音波処理されたLPS(R595)10mgを37℃で１時間にわたって10⁸のヒツジ赤血球とともにインキュベートすることによりELPSを調製した。ELPSを徹底的に洗浄し、EDTA-GVB²-(150 mMのNaCl、0.1 ％のゼラチン、１mMのEDTAを含む５mM のベロナール緩衝液、pH7.5)中で1 x 10⁸の細胞/ml の濃度まで再度懸濁させた。マクロファージへのELPSの結合を促進するNHP の能力を測定するために、等容積のELPS及びPDEDTA中のNHP の1:50希釈液を37℃で前記時間にわたってインキュベートした。得られるオプソニン化作用されたELPSを洗浄し、EDTA-GVB^2-中で再度懸濁させ、5 x 10⁵の赤血球をテラサキウェル中のマクロファージの単層に添加した。室温で15分間インキュベートした後、未結合ELPSをプレートを室温で10 分間倒立させ、単層を軽く洗浄することにより除去した。ELPSの結合を位相コントラスト顕微鏡により評価し、100 マクロファージ当たりに結合された赤血球の数である付着インデックスとして表した。 R-HDL への³H標識LPS の結合．R-HDL へのLPS の結合を測定するために、³H-L PS（10ng/ml、比活性1000dpm/10ng）、R-HDL(100 μg/ml)及びrLBP(0-10mg/ml) をAPBS１ml中で希釈し、37℃で１時間にわたってインキュベートした。次いでその溶液を０℃に冷却し、飽和臭化カリウム溶液で1.12g/mlの密度にし、５mlのクイック−シール^TM管(Beckman Instruments，パロアルト，CA)に入れ、10℃の温度で９時間にわたって60,000rpm でVti 65.2ローター(Beckman)中で回転させた。夫々の管の内容物を等しい上部フラクション及び下部フラクションに分離し、夫々のフラクション１ml中の放射能の量をレディセーフ^TM(Beckman)１ml中でシンチレーションカウンティングにより評価した。予備研究は、同様の条件下で、³ Hホスファチジルコリン標識R-HDL の90％より多くが管の上半分に見られることを実証した。また、ウェスタンブロットにより検出されたapoA-Iタンパク質はこれらの条件下で管の上部に移動した。結果 PMN を刺激するLPS の能力はNHP 中のインキュベーション後に迅速に増進され、次いで徐々に中和される。LPS(1ng/ml)を図１に示された間隔で37℃でNHP(10 ％)とともにインキュベートした。得られた混合物の細胞を刺激する能力を、10 分間にわたってPMN を添加し、固定されたフィブリノーゲンへの細胞の付着を測定することにより定量した。LPS 単独はフィブリノーゲンへのPMN の付着を刺激しなかったが、NHP と共にLPS のインキュベーションを行うと、付着を刺激する LPS の能力は非常に迅速に得られた（図１）。LPS 及びNHP をPMN と一緒の10分間のインキュベーションの直前に合わせた時（０分のインキュベーション）でさえも刺激は明らかであり、10分間のインキュベーションにより最大であった。この迅速にする効果はLPS 及び／または血漿中のセプチンに起因しているかもしれず、それ故、インキュベーションの初期に見られるこの活性がLBP/セプチン活性と称される。 NHP と共により長くインキュベーションを行うと、LPS のPMN を刺激する能力は徐々に失活した。120 分後には、その混合物の刺激能力の80％より多くが失活した。経時の活性の損失はLBP/セプチンの損失または分解ではなく、利用可能な LPS の損失のためであった。何となれば、インキュベーションの終了時のLPS の添加が応答を回復し、一方、rLBPの添加が応答を回復しなかったからである（図１）。こうして、NHP 中のインキュベーション後の細胞を刺激するLPS の能力の損失はLPS の中和により生じる。それ故、この中和の原因の一つ以上の因子がLP S 中和因子、またはLNF と称される。120 分より長い時間にわたるNHP 中のLPS のインキュベーションは活性のごくわずかの追加の損失を生じたので、120 分を LNF 活性を実証するためのインキュベーションの標準時間として選択した。細胞によるLPS の認識を一時的に可能にする血漿の能力を、マクロファージの CD14へのLPS 被覆赤血球(ELPS)の結合を測定する研究で確かめた。ELPSを所定の間隔で２％のNHP とともにインキュベートし、洗浄し、マクロファージへの結合を評価した（図２）。血漿と一緒のELPSのインキュベーション（５分間）はマクロファージへの強い結合を可能にしたが、更なるインキュベーションはこの結合能力の完全な損失を生じた。結合のこの損失はELPS表面に付着されたLBP/セプチンの不安定性のためではなかった。何となれば、NHP とともに５分間インキュベートされ、未結合タンパク質を除去するために洗浄され、37℃で更に35分間インキュベートされたELPSは、マクロファージを結合する能力を保持したからである。更に、NHP と一緒の長いインキュベーション後に観察された結合の低下はLBP/ セプチン活性の損失により引き起こされなかった。何となれば、ELPSと一緒のインキュベーション後に回復したNHP はマクロファージへの新しいELPSの結合を促進する能力を保持し、また処理されたELPSへの新しいNHP またはLBP の添加がマクロファージへの結合を回復しなかったからである（データは示されない）。最後に、結合の低下は赤血球からのLPS の損失により引き起こされたことはありそうもない。何となれば、³H標識LPS で形成されたELPSは５分の時点と40分の時点の間でLPS の９％未満の遅い損失のみを示したからである（データは示されない）。これらの結果は、血漿が最初に細胞によるLPS の認識を可能にし、次いでLP S の中和を生じる活性を含むことを確かめる。 R-HDL はLPS を結合または中和しない。幾つかの研究所が、血液または血漿に添加されたLPS がHDL の如きリポタンパク質に結合して低下された生物活性を有する複合体をもたらすことを実証していた(Skarnesら，上記文献; Ulevitchら，上記文献; Munford ら，上記文献; Flegelら，上記文献）。それ故、LPS の中和におけるHDL 粒子の役割を評価した。全てのHDL 粒子はapoA-Iを含むが、これらの粒子はまた化学量論量以下の量の少なくとも17種のその他のタンパク質を含む (Marcel ら，1990，J.Clin.Invest．85:10; Jordan-Starck ら,1992，Curr.Op.L ipidology 3: 75; Novotny ら，1989，J.Biol.Chem．264(31):18832; Staffor- ini ら，1987，J.Biol.Chem．262(9):4215; Cheungら，1986，J.Lipid Res．27( 11):1135; Kunitake ら，1992;Proc.Natl.Acad.Sci．USA 89:6993)。均一な製剤を得るために、HDL 粒子を精製アポリポタンパク質A-I(apoA-I)、ホスファチジルコリン及びコレステロールから再生した。リポタンパク質へのLPS の結合を、³H-LPSを37℃で１時間にわたってR-HDL とともにインキュベーションし、続いて1.12g/mlの密度で超遠心分離を行って比較的高い密度の³H-LPSからR-HDL(d〈1.12g/ml)を分離することにより測定した（図３）。R-HDL の添加はd〈1.12g/mlで見られる³H-LPSの量の増加を生じず、これはR-HDL への結合が起こらなかったことを示す。同様の研究において、LPS（1ng /ml）を２時間までの時間にわたって10％のNHP に見られる量に近似する量(100 μg/ml)のR-HDL とともにインキュベートしたが、生物活性の中和が観察されなかった（図４）。こうして、R-HDL それ自体はLPS を結合または中和することができない。 rLBPはR-HDL にLPS を迅速に結合させ、中和させる。先の研究は、LBP がLPS 転移タンパク質として作用し、CD14へのLPS の結合を触媒作用することを示しており(Hailmanら，上記文献)、これが細胞応答のLPS 活性化を促進する。この研究は、LBP がLPS をR-HDL に転移し、LPS の中和を生じ得るかもしれないというありそうもない可能性を調べた。実際に、本発明者らは、LBP がR-HDL で分別する³H-LPSの量の投与量依存の増加を可能にすることを観察した（図３）。R-HDL との³H-LPSの会合は１μg/mlのLBP 濃度で最高であることが明らかであった。これらの条件下で、³H-LPSの約30％がLBP の添加により上部のHDL 含有フラクションにシフトされた。平行の研究は、LBP がまたR-HDL にLPS の生物活性を中和させることを示した（図４）。R-HDL 及びLBP によるLPS の中和は迅速かつ完全であり、50％より大きい中和が40分で起こり、88％より大きい中和が120 分までに起こった。本発明者らは、幾つかの濃度のLPS を使用してR-HDL によるLPS の中和におけるLBP の要件を確かめた（図５）。１mg/ml のrLBPの添加はR-HDL に30ng/ml より多いLP S を強く中和させたが、LBP の不在下のR-HDL はいずれの投与量でもLPS の中和を生じなかった。LPS の投与量を100ng/mlに調節した場合、LBP は生物活性の約30％の中和を生じた（図５）。このフラクションは同様の条件下でR-HDL に転移された³H-LPSの30％に良く相当する（図３）。化学量論量以下の量のrLBPはR-HDL によるLPS の中和を可能にするのに充分であった。R-HDL による10ng/ml のLPS の最高の半分の中和が0.01μg/mlのrLBPで見られた（図６）。これらの条件下で、LBP(Mr60,000)(Shumannら，1990，Sci-e nce 249:1429)の夫々の分子はR-HDL の存在下でLPS(Mr4,000)(Kitchensら，1992 ，J.Exp.Med．176:485)の少なくとも７分子を中和した。更に、この結果はLBP がR-HDL によるLPS の中和を可能にすることを確かめ、またLBP がこの役割において触媒的に機能することを示唆する。R-HDL とは対照的に、apoA-I単独はLPS を中和せず、高濃度のLBP の添加でさえもが中和を可能にしなかった。この結果は、LBP またはapoA-IのいずれもがLPS 中和活性を有しないことを示し、またR- HDL によるLPS 中和における脂質の必要な役割を示唆する。 apoA-I含有リポタンパク質(Lp(A-I))粒子は血漿中のLNF 活性の一部のみを与える。血漿中のLNF 活性へのapoA-I含有リポタンパク質(Lp(A-I))粒子の寄与を評価するために、アフィニティー免疫吸着(SAIS)を使用して全血漿からLp(A-I) 粒子を除去し、精製Lp(A-I)粒子を回収した。抗apoA-Iによるクロマトグラフィーは血漿からapoA-Iの95％より多くを除去したが、少量のLNF 活性のみを除去した（図７）。除去されたLNF 活性の量は製剤間で変化したが、NHP からのapoA-I の除去は中和されたLPS の量の66％より大きい低下を生じなかった。この観察は、Lp(A-I)粒子がLPS の中和に関与したリポタンパク質粒子のみではないことを示唆する。この知見はLPS の中和におけるVLDLの役割を実証する研究(Harris ら，1990，J.Clin.Invest．86:696)と一致する。また、精製Lp(A-I)粒子をLNF 活性について試験した。Lp(A-I)粒子は非常に強いLNF 活性を示し、10ng/ml のR595 LPSを殆ど完全に中和した（図７）。LNF 活性は対照の前免疫カラムから溶離されなかった（データは示されない）。Lp(A-I )粒子によるLPS の充分な中和は、R-HDL のように、天然HDL 粒子がまたLPS を中和できることを示す。しかしながら、精製Lp(A-I)粒子によるLPS の中和は外部添加されたLBP に関する依存性を示さなかった。この知見は、天然Lp(A-I)粒子がLBP と同じ機能を有する脂質転移タンパク質を有することを示唆した。おそらく、脂質トランスフェラーゼLBP それ自体がこれらの粒子中に存在した。 LBP/セプチン活性はLp(A-I)粒子で同時純化される。Lp(A-I)粒子を、10分間のインキュベーション後にLPS に対するPMN の応答を可能にするそれらの能力を測定することによりLBP/セプチンについて評価した。強いLBP/セプチン活性がLPS 単独に対しPMN 付着の大きな増加により示されるようにLp(A-I)粒子中で観察された（図8A）。対照的に、apoA-Iの枯渇された血漿は、約1000倍多いLPS がLp(A -I)の存在下で見られた付着のレベルを観察するのに必要とされるようなLBP/セプチン活性の著しい低下を示した。Lp(A-I)によるLBP/セプチン活性の同時純化を、マクロファージへのELPSの結合を可能にするフラクションの能力を測定することにより確かめた（図8B）。NHP はこのアッセイにおいて強いLBP/セプチン活性を示し、マクロファージへのELPSの激しい結合を可能にした。対照的に、抗ap oA-Iカラム中の通過によりLp(A-I)の枯渇された血漿はこの活性を欠いており、E LPSの結合を促進しなかった。このアッセイにおいて観察されたLBP/セプチン活性の62％より多くが抗apoA-Iカラムからの溶離液中で回復された（精製Lp(A-I) 粒子）。約35％のNHP からの活性の非特異的損失が前免疫IgG カラム中の通過後に見られたが、活性がこのカラムからの溶離液中で回復されず、これはLBP/セプチン活性がLp(A-I)粒子で特異的に同時純化されることを確かめた。これらの結果は、Lp(A-I)粒子がLNF 活性を有するだけでなく、LBP/セプチン活性を有し、また血漿中のLBP/セプチン活性のほぼ全てがLp(A-I)粒子にあることを示す。 apoA-I含有粒子とのLNF 及びLBP/セプチン活性の両方の関連は、LPS 及び精製 Lp(A-I)粒子によるPMN 刺激の速度論を追跡することにより確かめられた。LPS を種々の時間にわたって精製Lp(A-I)粒子または対照の前免疫カラムからの溶離液とともにインキュベートした（図９）。PMN を刺激するLPS の能力はLp(A-I) 粒子により迅速に可能にされ、こうしてLBP/セプチン活性を示した。更なるインキュベーション後に、その混合物はPMN を刺激する能力を失った。活性のこの損失はLPS の中和のためであった。何となれば、インキュベーションの終了時のrL BPの添加は活性を回復できなかったからである。対照の前免疫カラムからの溶離液はLBP/セプチン活性またはLNF 活性を示さず、これはこれらの活性がLp(A-I) 粒子と特異的に関連することを実証した。また、これらの研究は、全血漿中で観察されたLPS 介在性応答の連続の可能性及び中和（図１）が精製Lp(A-I)粒子により反復発生され得ることを示す。 LBP はLp(A-I)粒子により物理的に会合される。上記の機能データはLBP がLp( A-I)粒子中に存在し得ることを示唆したので、これらの粒子と会合したLBP をEL ISAにより測定した（表１）。NHP は2.8 μg/mlのLBP を含むことがわかった。L p(A-I)粒子の枯渇はLBP を検出できないレベルに減少した（99％より大きい枯渇）。カラムから溶離されたLp(A-I)粒子は0.88μg/mlのLBP を含み、一方LBP は対照の前免疫カラムからの溶離液中で検出できなかった。こうして、ELISAにより検出されたLBP は抗apoA-Iカラムにより保持され、これはLBP がLp(A-I)粒子により物理的に会合されることを示唆する。３種の別々の個体からのNHP をヤギ抗ヒトapoA-I IgGまたはヤギ前免疫IgG とカップリングされたカラムによるイムノアフィニティー吸着にかけた。フラクションを血漿の出発容積に均等化し、LBP レベルの濃度を物質及び方法に記載されたようにしてELISA により測定した。示された値はLBP 濃度（μg/ml）である。夫々の値は３つの反復実験ウェルの平均である。ELISA の検出の限界は0.025 μ g/mlである。改良ELISA を使用して、反復実験（抗LBP によるapoA-Iの捕獲）を行った（図 10）。リポタンパク質粒子の溶液を抗LBP mAb 17G4で被覆されたプレート中でインキュベートした。この工程はLBP 及び関連アポリポタンパク質の両方の捕獲をもたらす。次いで、捕獲されたLBP と会合したapoA-Iをポリクローナル抗apo A- I を使用して検出した。NHP は高濃度のapoA-I(約１mg/ml)を含むので、血漿からのこのタンパク質の非特異的結合はバックグラウンドの上のシグナルの検出を妨害した。この複雑さを避けるために、ハイパック^TMアルデヒドのカラムによるクロマトグラフィーにより単離された部分精製リポタンパク質粒子を使用して分析を行った。この操作は血漿からのLBP/セプチン活性の定量的回収をもたらすが、タンパク質濃度が100 倍低下する。抗LBP mAb 17G4はLBP を捕獲しただけではなく、この溶液からのapoA-Iを捕獲した(図10A)。この観察はapoA-I含有リポタンパク質とのLBP の物理的会合を確かめる。同一条件下で、表面結合モノクローナル抗apoA-Iは少量のLBP を捕獲した(図10B)。これは、固定された抗apoA-I mA bが飽和され、こうしてapoA-Iの捕獲が不完全であるという事実のためであるかもしれない。低濃度の部分精製リポタンパク質を用いる実験は抗apoA-IによるLB P の79％までの捕獲を示した（データは示されない）。平行の研究は先に使用した抗体の効力及び特異性を確かめた。表面結合抗LBP mAb 17G4はウサギ抗LBP 抗体で検出されるように精製rLBPを捕獲した（図10）。 17G4が不適当なモノクローナルと交換された場合にrLBPは捕獲されず、これはこのmAb の特異性を確かめ、またウサギ抗LBP は別のモノクローナル抗体により捕獲されたapoA-Iを検出せず、これはこのポリクローナル抗体の特異性を確かめた。同様の様式において、表面結合抗apoA-Iはヤギ抗apoA-I二次抗体で検出されるように精製apoA-Iを捕獲した。モノクローナル抗apoA-Iが不適当なモノクローナルと交換された場合にapoA-Iは捕獲されなかった。重要なことに、ポリクローナル抗apoA-Iは17G4により捕獲されたLBP を検出せず、これはそれがLBP を認識しないことを示す(図10A)。このポリクローナル抗apoA-I抗体を上記のLp(A-I)粒子のアフィニティー単離に使用したので、先に観察されたapoA-IによるLBP の同時単離はLBP とのヤギ抗apoA-Iの交差反応性により生じた人工物ではありそうもない。検討細胞へのLPS 含有試料の10分間の暴露のみを必要とするLPS の生物活性に関するアッセイを開発したので、NHP 中のLPS 中和の速度論を研究した。このアッセイはLPS のin vitro中和の研究に使用されたその他のアッセイ（例えば、単球によるサイトカインの産生）（これらは試料と一緒に細胞の少なくとも４時間のインキュベーションを必要とし、それ故、ここに記載されたLPS の利用可能性の迅速な変化にはわかりにくい）とは対照的である。このアッセイを使用して、血漿が最初にLPS に細胞を刺激させ、活性が10分以内にピークに達することがわかった。続いて、細胞を刺激するLPS の能力は次の２時間で徐々に低下した。この減少は血漿中のLBP/セプチン活性の損失のためではなく、細胞表面CD14へのLBP 介在性転移に最早利用できない形態のLPS の隔離のためであった。こうして、血漿はLPS の生物学的効果を連続的に可能にし、次いで中和する因子を含む。血漿中のLPS を結合し、中和するHDL の良く実証された能力(Skarnesら，上記文献; Ulevitchら，上記文献; Munford ら，上記文献; Flegel，上記文献)及び静脈内のR-HDL が内毒素ショックの動物モデルにおいて死亡に対し保護することを示す研究(Hubsch ら，1993,Circ.Shock 40:14); Levine ら，1993，Proc.Natl .Acad.Sci．USA 90:12040)にもかかわらず、本結果は、高度に精製された成分（ apoA-I、PC、及びコレステロール）から再生されたR-HDL 粒子単独は精製LPS を結合または中和できないことを示す。LPS がR-HDL と自然に相互作用することができないことはLPS 及びリン脂質の生物学的性質と一致する。これらの膜形成両親媒体(amphiphiles)は二層間を非常に徐々に拡散し、リン脂質の認められる移動が二層間の移動を触媒作用するリン脂質交換タンパク質の如きタンパク質の存在下でのみ観察される(Wirtz，1991，Annu.Rev.Biochem．60:73)。R-HDL へのrL BPの添加はR-HDL によるLPS の迅速な強力な投与量依存性の結合及び中和を可能にした。その他の脂質交換タンパク質（即ち、脂質転移タンパク質）と同様に、 LBP はLPS 小胞またはミセルからHDL へのその拡散を促進することによりLPS の中和を可能にすることが明らかである。 rLBPは中和されるLPS の投与量に対し化学量論量以下の投与量でLPS の有効な中和を可能にした。LBP の夫々の分子は図６に示された条件下でLPS の少なくとも７分子の中和を生じた。この結果は、LBS が触媒作用してLPS をR-HDL に転移することを意味する。こうして、LBP は少なくとも二つの行き先、即ち、最近記載されたようなCD14(Hailmanら，上記文献)と今のHDLにLPS を触媒的に転移することが明らかである。本明細書に開示された結果は、LBP がapoA-Iと会合して血漿中を循環することを示す。ELISA により検出されたLBP の99％以上及びLBP/セプチン活性の実際に全てが抗apoA-Iカラム中の通過により血漿から除去され、またLBP/セプチン活性及びLBP タンパク質の両方が抗apoA-Iカラムからの溶離液中で回収された。反復研究は、LBP の固定されたモノクローナル抗体がLBP だけでなくapoA-Iを捕獲することを示した（図10）。こうしてLBP はapoA-I含有リポタンパク質と会合する 17種以上のアポリポタンパク質のグループを結合する(Marcel ら，1990，J.Clin .Invest.85:10; Jordan-Starkら，1992，Curr.Op.Lipidology 3:75; Novotnyら，1989，J.Biol.Chem．264(31):18832; Stafforiniら，1987，J.Biol.Chem．262 (9):4215; Cheungら，1986，J.Lipid Res．27(11):1135; Kunitakeら，1992; Pr oc.Natl.Acad.Sci．USA 89:6993)。血漿中のLBP(約５mg/ml)(Calvanoら，1994， Arch.Surg.129:220)及びapoA-I(約１mg/ml)の相対的多数のために、HDL 粒子の1 /100 未満がLBP を有することがありそうである。apoA-I含有リポタンパク質は組成の点で極めて不均一であり、こうしてこれらの研究はLBP と会合したLp(A-I )粒子中のその他の成分を同定しない。更に、これらの研究は、LPS の中和がリポタンパク質及びリポタンパク質への LPS の移動を触媒作用する酵素の両方を必要とすることを示す。apoA-I含有リポタンパク質はこれらの成分の両方を有し、従ってLPS の強い中和剤である（図７）。しかしながら、血漿からのapoA-Iの除去はLPS 中和活性の部分的損失のみを生じた（図７）。apoA-I枯渇血漿は多量のリポタンパク質(LDL、VLDL)を含むので、転移酵素のみが中和が観察されるのに必要とされる。図６は0.01mg/ml 程度に少量のLBP が過剰のリポタンパク質の存在下でLPS の有意な中和を触媒作用し得ることを示す。それ故、apoA-I枯渇血漿中に残っている少量のLBP がLPS の中和を可能にするのに充分であることが可能である。また、追加の脂質転移または交換活性が血漿中に存在することが可能である。血漿中のリポタンパク質がLPS の中和に必要な全てのコファクターを有するという知見は先の研究とは異なる。超遠心分離により単離されたリポタンパク質を用いる研究は、LPS の中和が非リポタンパク質フラクション中に見られる因子を必要とすることを実証した(Ulevitch ら，上記文献; Munford ら，上記文献)。この相違はおそらくリポタンパク質を調製するのに使用した方法に起因する。ここで使用された選択アフィニティー免疫吸着(SAIS)操作は超遠心分離よりもはるかに穏やかな操作であり、HDL とのタンパク質の会合を保存することが知られている。例えば、HDL とのトランスフェリンの会合(Kunitake ら，上記文献)は超遠心分離単離により中断されるが、SAISにより保存される。それ故、SAISにより単離されたリポタンパク質はLPS を中和するのにLBP の如き外在性コファクターを必要としない。何となれば、LBP はLp(A-I)粒子に結合されたまま残るからである。 LBP はコレステロールエステル転移タンパク質(CETP)(Shumannら，上記文献) 及びリン脂質転移タンパク質(PLTP)(Dayら，1994，J.Biol.Chem．269:9388)と強い配列相同性を示す（夫々、23％及び24％の同一性）。CETPはHDL と会合され、コレステロールエステル及びトリグリセリドをリポタンパク質間に転移する(He- slerら，1988，J.Biol.Chem．263:5020)。また、PLTPはHDL と会合され、リン脂質をHDL に転移する(Tollefsonら，1988，J.Lipid Res．29:1593)。こうして、L BP は配列相同性、HDL との会合、及びリポタンパク質間に脂質種を転移する能力により特性決定されるタンパク質の発生ファミリーの一部であることが明らかである。追加の相同性タンパク質である、バクテリア透過性増大因子(BPI)(Shu- mannら，上記文献)はリポタンパク質にあるのではいが、PMN の原発性顆粒の膜にある(Weersink ら，1993，J.Immunol．150(1):253)。脂質転移活性はBPI について未だに実証されていなかった。 LPS の中和におけるLBP の主たる役割は、LBP が抗原投与後に〈5μg/mlから〉60μg/mlまで生じる急性期反応体であり(Calvanoら，上記文献)、急性期の患者からの血漿がLPS に応答して単球によるサイトカイン産生を可能にする低下された能力を示す(Tollefsonら，上記文献)という観察から推定されたのかもしれない。 apoA-I含有リポタンパク質はLPS の生物活性を可能にし、中和することの両方に必要な全ての成分を有する。実際に、これらの精製粒子は全血漿（図１）で観察されたLPS 介在性応答の連続の可能性及び中和（図９）を反復発生した。こうして、HDL はLPS トラフィッキング(trafficking)中の交差点にある。CD14へのL PS の転移は生物活性複合体をもたらすとともに、リポタンパク質による保持がL PS を中和する。それ故、LBP 及びリポタンパク質、特にHDL と会合したその他の機能上同様の脂質交換／転移タンパク質の投与は、内毒素症及びセプシスを患っている個体にかなり恩恵を与えるものと予想される。実施例２：LBP はsCD14 からR-HDL へのLPS の転移を触媒作用する先の研究は、LBP がミセルからCD14へのLPS の転移（スキーム１、反応１）及びミセルからHDL へのLPS の転移（反応２、上記実施例１）を触媒作用することを示した。この実施例は、LBP がまたCD14からHDL へのLPS の移動（反応３）を触媒作用するか否かを試験する。sCD14 とのLPS の複合体を、LPS を37℃で５時間にわたって化学量論過剰量のsCD14 とともにインキュベートすることにより生成した。ほぼ全てのLPS がこれらの条件下でsCD14 に結合され、得られる複合体はPMN のインテグリン介在性付着を強く刺激した（図11）。非常に高濃度のR-HD Lと一緒の５時間にわたるLPS-sCD14 複合体のインキュベーションはPMN を刺激するそれらの能力を低下し、これはLPS がsCD14 からR-HDL に徐々に分配することを示唆した。しかしながら、LBP の添加は100 倍少ない量のR-HDL にこの時間でLPS-CD14複合体を完全に中和させた（図11）。この観察は、LBP がsCD14 から R-HDL へのLPS の移動を触媒作用し得ることを示唆する。こうして、LBP はスキーム１に示された三つの別々の反応を触媒作用する。実施例３：sCD14 はLBP 及びR-HDL によるLPS の中和を加速する LBP はR-HDL によるLPS の時間依存性中和（スキーム１、反応１、及び図12）を触媒作用し、その結果はR-HDL へのLPS の結合のためであることが明らかである。0.5 μg/mlのsCD14 の添加はこのプロセスの著しい加速を生じた（黒三角、図12）。こうして、LBP はLPS ミセルからR-HDL へのLPS の直接転移の速度よりも速い速度でLPS を最初にCD14に、次にR-HDL に転移するかもしれず、即ち、スキームＩの反応１及び３は反応２より速く進行する。この知見は、LBP が三つの全ての反応においてLPS を可溶性LPS-LBP 複合体としてシャトルしそうもないことを示唆する。CD14は、それが可溶性LPS-LBP 複合体からLPS を受け取る場合に、可溶性LPS-LBP 複合体の濃度を上昇できなかった。可溶性CD14は正常な血清中で高レベルで見られ、これらのレベルは感染により増加する。こうして、外在性 CD14は殆どの個体に添加される必要はない。実施例４：アポリポタンパク質ではなく、リン脂質がLPS のLBP 依存性結合及び中和に必要とされる実施例１の結果は、LBP 及びR-HDL の混合物がLPS を中和するが、精製ApoA-I 及びLBP は中和できないことを示した。リン脂質単独がLPS を中和できることを測定するために、ホスファチジルコリン(PC)及びコレステロールの混合物をR-HD Lにとり込むのではなく、リポソームとして懸濁させた（図13）。これらのリポソームの添加はLBP 依存様式でLPS の完全な中和を生じた。PC−コレステロールリポソームはR-HDL 中の匹敵する量のリン脂質よりもLPS を中和するのに有効ではなかった（図13）。これは、リポソーム中のPCの多くがLPS を中和するのに利用できないという事実に由来するかもしれない。それはリポソームの内部小葉またはマルチラメラリポソームの内膜に存在し得る。対照的に、HDL 粒子中の全てのPCは培地に露出される。また、リポソームは、再度LBP 依存様式でLPS-sCD14 複合体中のLPS の中和を生じた（図14）。これらの結果は、LBP がLPS をミセルまたはsCD14 からリポソームに転移し得ることを示唆する。この仮説を以下のようにして確かめた。³H-L PS-sCD14 複合体の天然PAGEはsCD14 と会合した放射能のほぼ全てを示した（図1 5a、レーン１）。未標識PCリポソームの添加は10時間のインキュベーションでCD 14からの³H-LPSの損失を殆ど生じなかった（図5a、レーン６）。しかしながらLB P の添加は１時間でsCD14 からリポソームへの³H-LPSのほぼ完全な転移を可能にした（図15b、レーン13）。この観察は、LBP がCD14からリポソームへのLPS の移動を触媒作用し得ることを確かめる。また、図15は、LBP が未標識LPS ミセルとのCD14に結合されたLPS の平衡を触媒作用することを示す（図15b、レーン11及び12）。こうして、CD14へのLPS の結合は易可逆性である。遊離LPS は約400KDaのタンパク質により共有された位置までアクリルアミドゲル中を良く移動することに注目されたい。こうして、LPS は小胞としてではなく、比較的小さい凝集物またはミセル中に存在する。対照的に、PCリポソームはゲルに入らず（示されていない）、それ故、これらのリポソームへの³H-LPSの移動はゲルからの放射能の損失により伴われる（図15B、レーン13及び14）。また、PC以外のリン脂質がLPS-CD14複合体を中和する。例えば、LBP は³H-LPS をLPS-CD14複合体からPIリポソームに容易に転移する。更に、LPS-CD14複合体の中和はPCよりもほぼ100 倍少ないPIを必要とし（データは示されない）、これは PIがLBP に良好な基質であることを示唆する。実施例５：sCD14 はリン脂質を結合する CD14はLPS だけでなく、その他のリン脂質を結合し得る。sCD14 を２時間にわたって³H-PI とともにインキュベートし、次いで天然ゲルに適用した（図16）。殆どのPIはゲルに入ることができず、これはPIリポソームの大きいサイズを反映した。しかしながら、一部の³H-PIがゲルに流入し、これはPIミセルの存在を示唆した（図16、レーン５）。等モル量のsCD14 の添加はsCD14 と一致してPIの殆どを移動させた（レーン３）。PIの量を増やすと、sCD14 と会合した放射性標識の量を増加し（レーン４）、これはPIの会合が１よりも大きい化学量論量を有することを示唆した。二つの追加の観察は、PI、及びその他のリン脂質がCD14を結合することを確かめる。最初に、sCD14 への³H-LPSの結合を次第に増加する投与量のリポソームの存在下で測定した。PI、PC、ホスファチジルセリン(PS)及び未標識LPS は夫々sCD14 への³H-LPSの結合を阻止し（示されない）、これは脂質が CD14への結合についてLPS と競合し得ることを示唆した。抑制に関する特異性は、スフィンゴミエリン(SM)がCD14からLPSを置換できなかったという知見により示唆される。第二に、sCD14 へのLPS の結合は受容体の電気泳動移動度の明瞭なシフトを生じることが先に示された（図16）。リポソームの添加はLPS が移動度のこのシフトを生じることから阻止し、これはそれらがCD14を結合することについてLPS と競合し得ることを再度示唆した。重要なことに、リン脂質はリン脂質の型により変化するsCD14 の電気泳動移動度の若干であるが再現性のシフトを生じた（示されない）。これらのデータは、sCD14 がLPS だけでなく、その他のリン脂質を結合し、その結合が天然PAGE中で安定であることを示す。 CD14への³H-PI の転移が短いインキュベーション時間(30分)後に観察され、LB P はPI結合の著しい加速を生じることがわかった（示されない）。この結果はsC D14 へのPIの結合を更に確かめる。 PI及びその他のリン脂質はsCD14 を結合するが、得られる複合体は細胞を刺激しないことが明らかである。sCD14 及び多種のリン脂質のいずれかに暴露された PMN の付着性の変化が観察されなかった（示されない）。この知見は、CD14に結合することについてLPS と競合するリン脂質の能力がLPS-CD14複合体によるPMN の刺激を阻止するその能力を測定することにより分析し得ることを示す。実施例６：リン脂質によるLPS の中和はアシル鎖組成に依存する特定のアシル鎖組成を有するPCを使用してリポソームをつくり、LPS/sCD14 複合体のLBP 触媒中和を測定した（図17）。飽和C16 鎖、C18 鎖またはC20 鎖を有するPCは中和活性を殆ど有しなかったが、C14、C10、C8への鎖長の減少、または更に長い鎖長を有するPC中の不飽和の導入は、かなり良好な中和活性をもたらした。対照実験は、これらのリン脂質のいずれもが毒性効果をもたず、いずれもが TNF により刺激されたPMN の付着を低下しないことを示した。これらの結果は、 HDL のリン脂質組成がLPS を中和するその能力に重要な影響を有し得ることを示唆する。また、これらの結果は、交換反応に良好な基質であるリン脂質を含む均一リン脂質粒子が天然産リポタンパク質粒子よりもLPS を中和するのに極めて有効であり得ることを示す。それ故、このような均一粒子は有意な治療潜在性を有する。実施例７：急性期血漿はLPS の増進された中和を示す急性期応答はLBP 濃度及びHDL 補給の両方の変化により伴われる。これらの変化の効果を測定するために、健康なドナーから溜められた血漿またはグラム陰性敗血症性ショックの患者の血漿を使用して、LPS の中和を測定した。中和は敗血症性ショック血漿では速く、しかも更に完全であった（図18）。中和の同様ではあるが、それ程著しくない増進がLPS による６時間の注射の前後にボランテァから採取された血漿の比較において観察された。これらのデータは、LPS 中和能力の増大がLPS の刺激効果に対抗する感染に対する応答に相当することを示唆する。増進された中和の基礎となるメカニズムはリポタンパク質粒子へのLPS の転移を伴うものと考えられる。こうして、患者からの血漿の中和潜在性の測定はLPS 交換タンパク質活性のレベルを間接的に示し得る。更に、この測定は患者中の内毒素症、セプシス、または敗血症性ショックの存在または段階の指標を与えることができる。実施例８：異なる脂質によるLPS の中和 LPS のLBP 介在性中和を促進する種々の脂質（これらは鎖長及び頭基組成を異にする）の能力を評価した（図19）。結果は、卵ホスファチジルコリン(PC)、C6 PC（アシル鎖中に６個の炭素原子を有するPC）、C14PC、及びC16PC がLPS を中和するのにそれ程有効ではないが、C10PC、ホスファチジルイノシトール(PI)、C 8セラミド及びカルジオリシンがこの目的に更に有効であることを示す。実施例９：リン脂質転移タンパク質は再生高密度リポタンパク質粒子へのLPS の転移を媒介する PLTPはリン脂質をリポタンパク質粒子の間に転移することが知られている血漿タンパク質である。本実施例は、PLTPがまたLPS をHDL 粒子に転移するという観察に関する。 PLTPを一過性のトランスフェクション後にCHO 細胞中で発現し、無血清培養上澄みを回収した(Dayら，1994，J.Biol.Chem．269:9388)。mockトランスフェクトされた細胞からの培養上澄みが対照として利用できた。図20は、PLTPの添加が再生HDL 粒子(R-HDL)によるLPS 中和の速度を強く増進したことを示す。中和はLBP で観察された中和よりも大きい。追加の研究は、LPS の中和がR-HDL 粒子へのLPS のPLTP介在性転移により引き起こされることを示した。放射能標識LPS はブロードバンドとして非変性ゲルで移動し、一方、R-HDL はApoA-Iの２分子、３分子、または４分子を有する粒子を反映する種の特有のラダーとして移動する。PLTPを含まない培地の添加はLPS と R-HDL の混合物中の放射能標識LPS の移動に影響しない（図21、レーン２と８を比較のこと）。しかしながら、PLTPを含む培地の添加はLPS にR-HDL のバンドとともに正確に移動させる（図21、レーン８と６を比較のこと）。これらの観察は、PLTPがLPS をHDL 粒子に転移することを示す。重要な観察は、PLTPがLPS をCD14に転移しないことである。投与量の範囲におけるPLTPの添加はLPS に対するCD14含有細胞の応答を可能にせず（示されていない）、これはLPS がPLTPにより細胞表面CD14に移動されないことを示唆した。更に、sCD14 は非変性ゲルで速い移動を示し、LBP の添加は、本発明者らの先の観察と一致して、sCD14 への放射能標識LPS の速い移動を生じた（図21、レーン９）。対照的に、PLTPの添加は対照インキュベーションで観察された移動を上回る sCD14へのLPS の移動を生じなかった（図21、レーン11と13を比較のこと）。これらの観察は、LBP と違って、PLTPによるHDL 粒子へのLPS の転移は直接であり、しかも中間体としてsCD14 を使用しないことを示す。 LPS による細胞の望ましくない刺激（敗血症性ショックをもたらす）は中間体としてCD14-LPS複合体を必要とするので、上記の結果は、PLTPがLPS に対する細胞応答を促進しないことを示し、その結果が実証された。むしろ、リポタンパク質へのLPS の移動を生じることにより、PLTPはLPS を中和し、LPS に対する細胞応答を少なくする。この実施例に報告された観察は、セプシスがPLTPの血清濃度を上昇するPLTPの投与量による、またはLPS スポンジとして機能し得るPLTPを含む再生リポタンパク質粒子の組成物による動物またはヒトの治療により軽減し得ることを確かめる。物質及び方法試薬．サルモネラ・ミネソタ株R60(Ra)からのLPS 及びE.coli LCD25(K12)からの³H標識LPS(³H-LPS)(Munford ら，1992，J.Immunol.Methods 148:115)をListBi ological Laboratories（キャンベル、CA）から購入した。ヒト血清アルブミンをArmour Pharmaceutical Company(カンカキー，IL.)から購入した。組換えヒト LBP 及び組換えヒトsCD14 を記載されたようにして発現し、精製した(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269-277)。 rPLTP の生産．通常の方法を使用してヒト組換えPLTPを調製した。簡単に言えば、ヒトPLTP cDNA を哺乳類発現ベクターpZem228cc(Dayら，1995，J.Biol.Chem 269:9388-9391)へのｃＤＮＡの連結によりヒト膿静脈内皮(HUVE)細胞から構築されたｃＤＮＡライブラリーからクローン化した。完全PLTP cDNA を含むクローンを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション(Waechter ら，1982，Proc.Nat l.Acad.Sci．USA 79:1106-1110)を使用してベイビーハムスター腎臓(BHK-570)細胞にトランスフェクトした。選択マーカーNeo(G418)を使用して、低濃度の細胞における初期トランスフェクションの塗布及びクローニングシリンダーの使用により安定なコロニーを選択した。血漿由来PLTPの精製．記載されたようにして(Tu 及びNishida，1993，J.Biol. Chem 268:23098-23105)、デキストランスルフェート/CaCl₂沈殿並びにフェニル −セファロース、CM- セルロース、DEAE- セルロース、ヘパリン−セファロース、及びヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーの組み合わせを使用して、PL TPをヒト血漿から均一に精製した。抗PLTP及び対照免疫グロブリンの調製．rPLTP 約275mg を等しい容積のフロイントアジュバントとともに注射することによりポリクローナル抗体をウサギ中で産生した。動物を３週間後に１回免疫し、３〜４週間隔で心臓穿刺により採血した。抗rPLTP IgG 及び対照IgG を、McKiney 及びParkinson(1987，Immunologi-c al Meth．96:271-78)の操作に従って調製した。再生HDL 粒子の調製．R-HDL を既に記載されたような葉酸ナトリウム透析方法 (Matz 及びJonas，1982，J.Biol.Chem．257:4535)により調製した。簡単に言えば、精製されたアポリポタンパク質A-I(apoA-I)を80:4:1:80 のモル比(PC:コレステロール:apoA-I:葉酸塩)で卵ホスファチジルコリン(PC)、コレステロール及び葉酸塩と混合し、葉酸塩を0.01％のアジ化ナトリウムを含むPDEDTA(Ca²⁺及びM g²⁺を欠いており、１mMのEDTAを含むダルベッコPBS)に対し徹底的な透析で除去した。最終的な製剤を４℃で0.01％のアジドを含むPDEDTA中で貯蔵した。R-HDL 粒子に関する全ての濃度値はapoA-Iの均等な濃度(mg/ml)として表される。 LPS-sCD14 複合体の形成．夫々の図に記載された濃度より500 倍高い濃度のLP S 及びsCD14 を0.5 ％のHSA を含むPBS 中で37℃で５〜18時間にわたって一緒にインキュベートした。使用したこれらの高い濃度は先に記載されたように(Ha-il man ら，1994，J.Exp.Med．179:269-277)sCD14 へのLPS の結合を最大にするように設計された。 LPS によるPMN の刺激．LPS の生物活性を評価するために、フィブリノーゲン被覆表面へのヒトPMN の付着を記載されたようにして測定した(Hailmanら，1994 ,J.Exp.Med．179:269-277; Wurfelら，J．Exp.Med．180:1025-1035)。このアッセイにおいて、LPS によるPMN 付着の刺激はLBP または血漿の存在に依存する。フィブリノーゲンへの刺激されたPMN の付着は白血球インテグリンCD11b/CD18(C R 3，Mac1)により媒介される(van Kessel ら，1994，J.Immunol.Methods 172:25-3 1)。簡単に言えば、LPS を含む混合物を示された濃度までAPBS(Ca²⁺及びMg²⁺、0 .5 ％のヒト血清アルブミンを含むダルベッコPBS)中で希釈し、50μl の最終容積を得た。記載されたように(van Kessel ら，1994，J.Immunol.Methods 172:25 -31)して5-（及び6-）カルボキシフルオレセインジアセテート、スクシンイミジルエステルで蛍光標識された新たに単離されたPMN(0.5U/mlのアポチニン、0.05 ％のヒト血清アルブミン、３mMのＤ−グルコースを含むダルベッコPBS)HAP 中2 x 10⁷の細胞/ml)10μl を添加し、37℃で10分間インキュベートして細胞を刺激した。次いでPMN をHAP 中で洗浄し、フィブリノーゲンで前被覆された72ウェルのテラサキプレートに添加した。37℃で15分後に、プレートへのPMN の付着を定量した。夫々のウェル中の蛍光を、ウェル当たりの細胞の合計数を定量する方法としてサイトフルオー2300(Millipore Corp.)を使用して測定した。次いでプレートを洗浄し、蛍光を再度測定した。結合を洗浄工程後にウェルに残っている細胞の％（付着％）として表す。最大応答におけるドナー間の変化（25-75 ％の付着）により別々の実験の結果を平均化することはできないが、応答のパターンは高度に再現性であった。全血中のインターロイキン-6（IL-6）産生の刺激--ヘパリン処理した血液を健康なヒトボランティアから静脈穿刺により得た。LPS をR-HDL 及びその他の試薬（以下を参照のこと）でプレインキュベートし、次いでミクロ遠心分離管中で1( 1〜99(1の血液の容積に添加した。試料を５％のCO₂環境中で37℃で４時間にわたってインキュベートし、次いで1500 x gで３分間遠心分離した。血漿を回収し、 ELISA によりIL-6について分析するまで、-20 ℃で貯蔵した。 IL-6 ELISA．市販のヒトIL-6 ELISAキット(BioSource International，カマリロ，CA)の改良を使用してIL-6レベルを測定した。抗IL-6モノクローナル抗体をP BS 中で40μg/mlに希釈した。５μl／ウェルをテラサキプレート(Robbin Sc-ien tific，サニーベール，CA)に添加し、プレートを４℃で一夜放置した。プレートを洗浄緩衝液(BioSource)で浸すことにより洗浄し、室温で１時間にわたってゼラチン(PBS中0.1 ％、10μl／ウェル)でブロックし、再度洗浄した。ビオチン接合体（ビオチン標識二次抗IL-6抗体）５μlを夫々のウェルに添加し、続いて希釈緩衝液(BioSource)中10X に希釈された血漿試料５μl を添加した。37 ℃で２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄緩衝液で２回洗浄し、ストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ溶液(Bio-Rad，ハーキュレス，CA)10 μ lを添加した。室温で１時間インキュベートした後、蛍光性アルカリ性基質アットホス(JBL scientific,サンルイスオビスポ，CA)を添加し、サイトフルオー230 0蛍光プレートリーダー(Millipore)を使用して蛍光を測定した。 LPS 及びLPS-sCD14 複合体の中和．LPS の中和を、フィブリノーゲンへのPMN の付着を刺激し、または全血中のIL-6産生を刺激するその能力の損失として測定した。PMN 付着を刺激する能力の中和を既に記載されたようにして評価した(Wu- rfelら，1994，J.Exp.Med．180:1025-1035)。簡単に言えば、LPS、R-HDL 及び可変量のLBP をAPBS中で50μl の最終容積まで希釈した。37℃で示された時間にわたってインキュベートした後、管に残っている利用可能なLPS の量を、50％のヒト血漿中に再度懸濁されたPMN を添加し、上記のようにして付着を測定することにより評価した。 IL-6産生を刺激する能力の中和を同様の方法で行った。LPS を次第に増加する時間にわたって37℃でAPBS10μl 中でR-HDL 及びLBP またはPLTPトランスフェクト細胞もしくは対照細胞からの培地とともにインキュベートした。残っている生物活性LPS を、その混合物１μl を血液99μl に添加し、上記のようにしてIL-6 産生について評価することにより測定した。同じ方法を使用してLPS-sCD14 複合体の中和を測定し、この複合体は上記のようにLPS とsCD14 のプレインキュベーションにより生成された。LPS-sCD14 複合体に応答して全血中で産生されたIL-6 の量は、sCD14 を添加しないで同じ投与量のLPS で産生された量と非常に近似していた。電気泳動．³H-LPSを１分間音波処理し、R-HDL 及び図脚注に示されたその他のタンパク質とともに種々の時間にわたって37℃でインキュベートした。電気泳動の直前に、PBS 中に0.005 ％のブロモフェノールブルー及び20％のグリセロールを含む1/2 の容積の負荷(loading)緩衝液を夫々の試料に添加した。試料を、192 mMのグリシン、24mMのトリス(Tris)、pH8.3 を含む実験緩衝液中で100-150Vで２〜３時間にわたって連続緩衝液(pH8.6)、非変性トリス−グリシン８−16ポリアクリルアミドステップ−勾配ゲル(Novex、サンジエゴ，CA)中に流入した。電気泳動後に、ゲルをエンハンス(ENHANCE)(Dupont，ボストン，MA)中に45分間にわたって浸軟し、ddH₂O 中で15分間にわたって３回洗浄し、乾燥させ、４日にわたって富士RXフィルムに露出した。結果 PLTPはR-HDL への³H-LPSの転移を媒介する。非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（天然PAGE）は可溶性CD14(sCD14)及びR-HDL 粒子との³H-LPSの会合を示した(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269-277)。この技術を利用して、PLTP がR-HDL への³H-LPSの転移を媒介できるか否かを調べた。³H-LPSをヒトPLTPについてｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞からの培地(rPLTP培地）または未トランスフェクト細胞からの培地（対照培地）の存在下でR-HDL とともにインキュベートし、次いで天然PAGEにかけた。既に示されたように(Wurfel ら，1995，J. Exp.Med．181:1743-54)、³H-LPSはこれらの条件下でR-HDL と自然に会合しなかった（図22、レーン１）。しかしながら、³H-LPSを電気泳動の前にrPLTP 培地及びR-HDL とともにインキュベートした場合、³H-LPSの移動のパターンは銀染色で見られたR-HDL のパターンと似ており（図22、レーン６及び９）、これはR-HDL との³H-LPSの会合を示した。また、R-HDL、LBP 及びsCD14 と一緒の³H-LPSのインキュベーションは、本発明者らが先に示したようにR-HDL へのLPS の転移をもたらした（図22、レーン８）。³H-LPSは対照培地及びR-HDL と一緒またはrPLTP もしくは対照培地単独と一緒のインキュベーション後にこの特有のパターンを示さなかった（図22、夫々、レーン４、５、３）。これらの結果は、rPLTP が³H-L PSをR-HDL に転移することができることを示唆する。 rPLTP はR-HDL によるLPS の中和を媒介する。多くの研究は、リポタンパク質またはリン脂質小胞中のLPS のとり込みがLPS の生物学的効力の中和をもたらすことを示していた(Dijkstra ら，1987，J.Immunol．138:2663-2670; Flegelら， 1993，Infect.Immun．61:5140)。加えて、LBP はR-HDL 粒子へのLPS の移動を加速し、それによりLPS の中和を促進することができる(Wurfel ら，1994，J.Exp. Med．180:1025-1035)。³H-LPSをR-HDL 粒子に転移するrPLTP の能力は、rPLTP 培地がまたR-HDL によるLPS の中和を促進すべきであることを示唆する。この活性を実証するために、LPS を次第に増加する時間にわたってrPLTP 培地または対照培地の存在下でR-HDL とともにインキュベーションし、次いでLPS の中和をフィブリノーゲン被覆表面への好中球の付着を刺激するその能力の時間依存性損失として測定した。R-HDL 単独またはR-HDL 及び対照培地と一緒のLPS のプレインキュベーションは好中球の付着応答について刺激能力の有意な損失を生じなかった（図23）。しかしながら、rPLTP 培地単独と一緒ではなく、rPLTP 培地及びR- HDL と一緒のLPS のプレインキュベーションは、１時間のインキュベーション後に活性の殆ど完全な損失でもって、刺激の時間依存性損失を生じた。こうして、 rPLTP はR-HDL 粒子へのLPS の転移を促進し、LPS の中和をもたらすことができる。 rPLT PはLPSに応答して全血中のサイトカイン産生を測定することによりR-HDL によるLPS の中和を媒介することが確かめられた。単球細胞はLPS に応答して種々のサイトカイン（腫瘍壊死因子、インターロイキン(IL)-1、IL-6、及びIL-8を含む）を産生し、これらのサイトカインはin vivo のLPS の病態生理学的効果の多くを媒介するものと考えられる（Beutler ら，1985，Science 229:869-871; D inarello ら，1991，J.Inf.Dis．163:1177-1184; Fletcherら，1990 J.Immunol. 145:4185; Huber ら，1991，Science 254:99）。全血中のIL-6産生を測定し、LP S がIL-6産生の投与量依存性刺激を生じることを測定した（示されない）。血液への添加の前のR-HDL 単独またはrPLTP 培地単独と一緒のLPS のプレインキュベーションはIL-6産生の非常にわずかな変化を生じた（図24）。しかしながら、R- HDL 及びrPLTP 培地と一緒のLPS のプレインキュベーションはIL-6産生の刺激の時間依存性損失を生じた（図24）。この結果と、LPS に応答するIL-6産生の投与量−応答曲線（示されない）との比較は、LPS の約90％がこれらの条件下で１時間以内に中和され、その活性の少なくとも97％が２時間後に中和されることを示唆した。対照培地及びR-HDL と一緒のLPS のインキュベーションはLPS の中和を生じることができなかった（示されない）。これらの結果は、rPLTP がR-HDL によるLPS の中和を媒介することを確かめる。 PLTPはLPS と相互作用してR-HDL によるLPS の中和を媒介する必要がある。 PLTPはHDL 変換(Tu 及びNishida，1993，J.Biol.Chem 268:23098-23105; Jauhi- ainen ら，1993，J.Biol.Chem268:4032-4036)、またはHDL 粒子のサイズ分布の変化を生じ得ることが最近示された。HDL 粒子を修飾するPLTPのこの能力は、PL TPがLPS と直接に相互作用することによるのではなく、リポタンパク質粒子を修飾することによりR-HDL へのLPS の転移を加速するかもしれないという可能性を高めた。この可能性を解明するために、LPS を添加する前にrPLTP 培地をR-HDL とともにプレインキュベートし、次いでLPS の中和の速度を調べた。PLTPがR-HD Lを修飾することにより作用する場合、LPS、rPLTP 培地及びR-HDL を同時に添加した時の先の実験と比較して、LPS の更に速い中和がこれらの条件下で予想されるであろう。R-HDL と一緒のrPLTP 培地のプレインキュベーションは、３種の試薬全部を同時に添加した時よりもかなり速い中和をもたらさなかった（図25）。この結果は、rPLTP がR-HDL を修飾することをもたらさない方法で、むしろLPS と直接に相互作用してそれをR-HD Lに転移することによりR-HDL によるLPS の中和を媒介することを示唆する。この結果を確かめるために、PLTPに対して生じたポリクローナル抗体(抗PLTP IgG)を使用した。この抗体は全血漿またrPLTP によるリン脂質の転移を阻止し（示されていない）、これはそれがPLTPを認識し、その機能を阻止することを確かめる。対照IgG ではなく、抗PLTP IgGはrPLTP 培地及びR-HDL によるLPS の中和を抑制することが測定され（下記を参照のこと）、これはrPLTP がこれらの実験においてR-HDL によるLPS の中和を媒介することを確かめた。次いで抗PLTP IgG を使用して、PLTPがその中和を媒介するためにはLPS と相互作用する必要があることを確かめた。R-HDL を１時間にわたってrPLTP 培地とともにインキュベートし、次いで抗PLTP IgG及びLPS を添加し、その後のLPS の中和を測定した。PL TPがR-HDL に作用することによりLPS の中和を媒介した場合、抗PLTP IgGはrPLT P 培地がR-HDL とともにインキュベートされた後に添加された時にrPLTP 培地及びR-HDL によるLPS の中和を抑制するとは予想されないであろう。しかしながら、抗PLTP IgGはこれらの条件下でLPS の中和を抑制することができることがわかり（図25）、これはPLTPがLPS と直接に相互作用し、それをR-HDL に転移することを強く示唆した。抗PLTP IgGは血漿によるLPS の中和を抑制しない。PLTPが血漿中でLPS の中和の原因であるか否かを測定するために、抗PLTP IgGをR-HDL を含む血漿により、または血漿単独によりLPS の中和を抑制するその能力について試験した。上記のように、抗PLTP IgGは全血漿のリン脂質転移活性の殆どを抑制する。それはまた R-HDL によるLPS のPLTP介在性中和を抑制することを示すために、LPS を次第に増加する濃度の抗PLTP IgGまたは対照IgG の存在下で２時間にわたってR-HDL 及びrPLTP 培地とともにインキュベートした（図26）。IgG の不在下で、LPS はこれらの条件下で完全に中和される（図24）。抗PLTP IgGはこの中和の投与量依存性の完全な抑制を生じ（次第に増加する抗体濃度によるIL-6産生の増加に相当する）、一方、対照IgG は中和に効果を有しなかった（図26）。次に抗PLTP IgGをR-HDL 及び血漿によるLPS の中和に関するその効果について試験した。３％の血漿またはR-HDL 単独と一緒のLPS のインキュベーションはLP S の中和を生じなかったが、３％の血漿及びR-HDL と一緒のインキュベーションは、２時間後にLPS 活性の少なくとも90％の損失でもって、LPS の時間依存性中和を生じた(図27A)。こうして、血漿はR-HDL によるLPS の中和を可能にする脂質転移活性の源として利用できる。抗PLTP IgGまたは対照IgG の添加は血漿及び R-HDL と一緒のLPS の２時間のインキュベーション中にLPS の中和に関して効果を有しなかった(図27B)。使用した血漿の量に対し同じ濃度では、抗PLTPは血漿のリン脂質転移活性を殆ど完全に抑制することができた。一緒にされると、これらの結果は、血漿中のPLTPがR-HDL によるLPS の中和を媒介する血漿の能力に有意に寄与しないことを示唆する。加えて、血漿単独（高濃度の血漿及び低濃度の LPS を使用する）によるLPS の中和を抑制する抗PLTP IgGの効果を調べた。再度、抗PLTP IgGの効果を示すことは可能ではなく（示されていない）、これはPLTP が内在性リポタンパク質によるLPS の中和に重要な役割を果たさないことを示唆した。 PLTPはCD14へのLPS の転移を媒介しない。CD14は単球、マクロファージ及び好中球の表面にグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合タンパク質として、またGPI アンカーを欠いている血液中の可溶性タンパク質として見られる55 kDa の糖タンパク質である。これらの形態のCD14の両方がLPS を結合でき、また LPS に対する細胞の応答を媒介することができ(Wright ら，1990，Science 249: 1431; Wrightら，1991，J.Exp.Med．173:1281; Leeら，1992，J.Exp.Med．175:1 697; Freyら,1992，J.Exp.Med．176:1665)、またCD14を欠いているマウスはLPS に低応答性であり(Haziot ら，1974，Endotoxin Res.Abstracts 1:73)、LPS に対する動物の応答におけるCD14の重要性を実証する。LBP はLPS に対するCD14を有する細胞の応答を媒介し(Schumann ら，1990，Science 249:1430)、本発明者らは、LBP が触媒作用して可溶性CD14(sCD14)へのLPS の結合を加速することができることを最近示した(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269-277)。LBP はL PS をリポタンパク質またはCD14に転移することができるので、実験を行ってPLT PがまたLPS をCD14に転移することができることを試験した。天然PAGEを使用して、³H-LPSをsCD14 に転移するPLTPの能力を調べた。sCD14 単独と一緒の³H-LPSのインキュベーションはCD14の移動位置で不鮮明なバンドを生じ、少量の³H-LPS-sCD14複合体（示されていない）の形成を示した。このインキュベーションをLBP の存在下で行った場合、LBP の殆どがsCD14 と同時移動し、LBP によるsCD14 への³H-LPSの完全転移を示唆した（示されていない）。sCD1 4 と一緒の³H-LPSのインキュベーションを次第の増加する濃度のrPLTP 培地の存在下で行った場合、形成された³H-LPS-sCD14複合体の量は増加しなかった。同じ濃度のrPLTP 培地は³H-LPSをR-HDL に転移することができ、これはPLTPがLPS を CD14に転移することができないことを示唆した。 LPS に対する好中球の付着応答を測定して、PLTPがLPS をCD14に転移することができないことを確かめた。好中球はLPS 単独に応答してフィブリノーゲン被覆プレートに付着しないが、LBP と一緒のLPS に応答して付着することが先に示されていた(Hailmanら，1994，J.Exp.Med．179:269-277; Wurfelら，1994，J.Exp. Med．180:1025-1035)。この応答は細胞表面CD14に依存する。何となれば、それはCD14のモノクローナル抗体で抑制し得るからである(Hailmanら，1994，J.Exp. Med．179:269-277)。LPS を細胞表面CD14に転移するPLTPの能力を、好中球を一定投与量のLPS 及び次第に増加する量のLBP またはrPLTP 培地とともにインキュベートすることにより確かめた（図28）。低濃度(10ng/ml)のLBP の添加は好中球の付着を可能にし、一方、rPLTP 培地または対照培地の添加は付着応答を増進しなかった。同様の濃度のrPLTP 培地はR-HDL によるLPS の中和を媒介することができた（図23及び24）。この結果、及び先の実験の結果は、PLTPがLPS をCD14 に転移することができないことを示す。 PLTPはR-HDL によるLPS-sCD14 複合体の中和を媒介しない。“遊離”(ミセル) LPS をR-HDL に転移することに加えて、LBP はまたLPS をLPS-sCD14 複合体から R-HDL に転移することができる(Wurfel ら，1995，J.Exp.Med．181:1743-54)。P LTPがLPS をCD14に転移することができないことは、それがCD14と相互作用する能力を欠いており、R-HD LによるLPS-sCD14 複合体の中和を媒介しないものと予想されることを示唆する。この可能性を試験するために、LPS-sCD14 複合体をLB P またはrPLTP 培地の存在下で次第に増加する時間にわたってR-HDL とともにインキュベートした。100ng/ml程度に少量のLBP がR-HDL によるLPS-sCD14 複合体の有効な中和を可能にでき、一方、rPLTP 培地の添加はこのような効果を有していなかった（図29）。同じ濃度のrPLTP 培地はR-HDL によるLPS の中和を可能にでき（図24）、これはsCD14 に結合されたLPS がrPLTP との相互作用から保護されることを示唆した。上記の結果は、PLTPがCD14と相互作用することができず、またLPS をCD14に、またはCD14から転移する能力がLBP に特有であることを強く示唆する。血漿から精製されたPLTPは³H-LPSをR-HDL に転移するが、sCD14 に転移しない。PLTPの精製はその活性の迅速な損失をもたらすので、先に示された実験を全て rPLTP 培地を用いて行った。何となれば、LPS 転移活性は非常に経時安定性であったからである。上記の結果を確かめるために、ヒト血漿から精製されたPLTPを使用し、³H-LPSをR-HDL 及びsCD14 に転移するその能力を試験した。上記の結果と一致して、精製されたPLTPはR-HDL への³H-LPSの転移を可能にしたが、sCD14 への転移を可能にしなかった（図30）。検討先の研究において、LBP はCD14へのLPS の移動を触媒作用することができ(Ha- ilman ら，1994，J.Exp.Med．179:269-277)、LPS、またはリポソームに対する応答を可能にし(Wurfel ら，1994，J.Exp.Med．180:1025-1035; Wurfelら，1995, J.Exp.Med．181:1743-54)、LPS の生物活性を中和することが示された。ここでは、PLTPがLPS をR-HDL に転移することができるが、CD14に転移しないことが示される。こうして、PLTPはLPS と相互作用し、その中和を促進することができるが、LPS に対する細胞の応答を増進しない。LPS と相互作用する能力がLBP について、また殺菌剤透過性増大タンパク質(BPI)、殺菌活性を有する好中球顆粒タンパク質及びLPSを中和する能力について先に示された(Elsbach及びWeiss,1992,炎症：基本的原理及び臨床上の相関関係 Gaillinら編集，603-636頁，Raven Pre ss,ニューヨーク)。PLTPはヒトLBP(24％の同一性)及びBPI(26％の同一性)に対し配列類似性を有し(Dayら，1994，J.Biol.Chem 269:9388-9391)、３種のタンパク質の全てがヒト染色体20にマッピングされた(Dayら，1994，J.Biol.Chem 269:93 88-939; Grayら，1993，Genomics 15:188-190)。また、PLTPはCETPに対し配列類似性を有するが(Dayら，1994，J.Biol.Chem 269:9388-9391; Drayna ら，1987， Nature 327:632-634)、ヒトCETPは染色体16にマッピングされる(Luis ら，1987 ，Genomics 1:232-235)。CETPがまたLPS の転移タンパク質として作用し得るか否かは研究されていなかったが、それはリン脂質をリポタンパク質粒子間に転移することが示され、こうしてそれはPLTPのようにLPS をリポタンパク質に転移し得る。本実施例に示されたPLTPによる結果はLBP の作用のメカニズムについて意味を有する。LPS をCD14またはリポタンパク質に転移するLBP の能力は、LBP がLPS を分離するようにのみ作用して、モノマーLPS を放出し、次いでこれが利用できる結合部位に結合することを示唆した。PLTPがLPS をリポタンパク質粒子のみに転移することができることは、LBP がLPS の転移中にCD14と特異的に相互作用することを意味する。LBP がLPS を単に分離しないという別の示唆は、LPS をLPS- sCD14 複合体からR-HDL に転移するその能力である(Wurfel ら，1995，J.Exp.Me d.181:1743-54)。夫々のCD14分子はLPS の１分子または２分子のみを結合するので、この反応におけるLBP の作用は単にLPS のモノマーをLPS のミセルまたはその他の凝集物から放出することではない。PLTPがLPS をLPS-sCD14 複合体からR- HDL に転移することができないこと（図29）は、LBP が転移反応中にCD14と特異的に相互作用し、PLTPがCD14と相互作用する能力を欠くというアイデアを更に支持する。脂質分子をリポタンパク質または膜ではなく別のタンパク質に転移する脂質転移タンパク質の能力はLBP に特有であることが明らかであるが、その他の脂質結合タンパク質がまた脂質転移タンパク質を使用し得ることが可能である。 LBP がCD14とのその特異的な相互作用に必要な特異なアミノ酸配列を有し得ることは、LBP のアミノ末端フラグメントがLPS を結合するが、LPS をCD14に転移することができないことが明らかであるという知見(Theofanら,1994，J.Immunol .152:3623-3629; Hanら，1994，J.Biol.Chem 269:8172-8175)により支持される。しかしながら、LBP のアミノ末端フラグメントはLPS をR-HDL に転移することができることは示されていなかった。このフラグメントはCD14またはR-HDL への LPSの転移に必要とされる配列を欠いているかもしれない。即ち、LPS の結合はL PS の転移に充分ではないかもしれない。一方、LBP のアミノ末端フラグメントがLPS をR-HDL に転移できた場合、それはCD14との相互作用に必要とされるLBP のカルボキシ末端部分中に特定の配列があるという反論を強くするであろう。本発明はその精神または必須の特徴から逸脱しないでその他の形態で具体化されてもよく、または別の方法で実施されてもよい。それ故、本開示は全ての面で例示と考えられるべきであり、限定と考えられるべきではなく、本発明の範囲は請求の範囲により示され、均等物の意味及び範囲内にある全ての変化がその中に含まれるものと意図される。種々の文献がこの明細書中に引用され、これらの夫々が参考として本明細書にそのまま含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/92 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/22 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＭＸ，ＵＳ (72)発明者ワーフェルマークエムアメリカ合衆国ニューヨーク州 10021 ニューヨークイーストセヴンティースストリート 420 アパートメント 14エイチ (72)発明者ハイルマンピーターエリックアメリカ合衆国ニューヨーク州 10028 ニューヨークイーストエイティフォースストリート 325 アパートメント４エイ

Claims

【特許請求の範囲】１．リン脂質と、粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする脂質交換タンパク質とを含む均一粒子の組成物。２．リン脂質が約８個〜約18個の炭素原子のアシル鎖を有する請求の範囲第１項に記載の組成物。３．リン脂質が14個の炭素原子のアシル鎖を有する請求の範囲第２項に記載の組成物。４．リン脂質が一つ以上のシス二重結合を含むアシル鎖を有する請求の範囲第１項に記載の組成物。５．リン脂質が14個より多く約18個までの炭素原子のアシル鎖を有する請求の範囲第４項に記載の組成物。６．リン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、セレブロシド、ガングリオシド、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の組成物。７．リン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲第１項に記載の組成物。８．両親媒性α−らせんペプチド含有分子を実質的に欠いている請求の範囲第１項に記載の組成物。９．両親媒性α−らせんペプチド含有分子を更に含む請求の範囲第１項に記載の組成物。 10．両親媒性α−らせんペプチド含有分子がアポリポタンパク質またはその両親媒性α−らせん部分である請求の範囲第９項に記載の組成物。 11．アポリポタンパク質またはそのフラグメントがアポリポタンパク質A-I、apo -A-II、apo-A-IV、apo-B、apo-C-II、及びapo-Eからなる群から選ばれる請求の範囲第10項に記載の組成物。 12．両親媒性α−らせんペプチド含有分子がアポリポタンパク質A-Iである請求の範囲第９項に記載の組成物。 13．コレステロールまたはその脂質二層結合誘導体を更に含む請求の範囲第１項に記載の組成物。 14．脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質である請求の範囲第１項に記載の組成物。 15．脂質交換タンパク質がリン脂質転移タンパク質である請求の範囲第１項に記載の組成物。 16．脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質のフラグメントである請求の範囲第１項に記載の組成物。 17．脂質交換タンパク質がリン脂質転移タンパク質のフラグメントである請求の範囲第１項に記載の組成物。 18．脂質交換タンパク質が触媒的に機能してリポ多糖を高密度リポタンパク質粒子に交換する請求の範囲第１項に記載の組成物。 19．可溶性CD14を更に含む請求の範囲第１項に記載の組成物。 20．リポタンパク質粒子と、リポタンパク質粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする脂質交換タンパク質とを含む組成物であって、約 1/20より多くのリポタンパク質粒子が脂質交換タンパク質を含む組成物。 21．リポタンパク質のリン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、セレブロシド、ガングリオシド、及びこれらの混合物からなる群から選ばれる請求の範囲第20項に記載の組成物。 22．リン脂質が約12個〜約18個の炭素原子のアシル鎖を有する請求の範囲第21項に記載の組成物。 23．リン脂質が一つ以上のシス二重結合を含むアシル鎖を有する請求の範囲第21 項に記載の組成物。 24．脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質である請求の範囲第20項に記載の組成物。 25．脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質のフラグメントである請求の範囲第20項に記載の組成物。 26．脂質交換タンパク質がリン脂質転移タンパク質である請求の範囲第20項に記載の組成物。 27．脂質交換タンパク質がリン脂質転移タンパク質のフラグメントである請求の範囲第20項に記載の組成物。 28．高密度リポタンパク質粒子とリポ多糖結合タンパク質とを含む組成物であって、約1/20より多くの高密度リポタンパク質粒子がリポ多糖結合タンパク質を含む組成物。 29．高密度リポタンパク質粒子のリン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、セレブロシド、及びガングリオシドからなる群から選ばれたリン脂質からなる請求の範囲第28項に記載の組成物。 30．リン脂質が約12個〜約18個の炭素原子のアシル鎖を有する請求の範囲第28項に記載の組成物。 31．リン脂質が一つ以上のシス二重結合を含むアシル鎖を有する請求の範囲第28 項に記載の組成物。 32．高密度リポタンパク質対LPS 結合タンパク質の重量比が約10〜約1000の範囲である請求の範囲第28項に記載の組成物。 33．高密度リポタンパク質の濃度が約１μg/ml〜約１mg/ml の範囲である請求の範囲第28項に記載の組成物。 34．高密度リポタンパク質粒子とリン脂質転移タンパク質とを含む組成物であって、約1/20より多くの高密度リポタンパク質粒子がリン脂質転移タンパク質を含む組成物。 35．高密度リポタンパク質粒子のリン脂質がホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジホスファチジルグリセロール、セレブロシド、及びガングリオシドからなる群から選ばれたリン脂質からなる請求の範囲第34項に記載の組成物。 36．高密度リポタンパク質対リン脂質転移タンパク質の重量比が約10〜約1000の範囲である請求の範囲第34項に記載の組成物。 37．高密度リポタンパク質の濃度が約１μg/ml〜約１mg/mlの範囲である請求の範囲第34項に記載の組成物。 38．請求の範囲第１項、第20項、第28項、または第34項に記載の組成物と、医薬上許される担体または賦形剤とを含む内毒素症の治療用医薬組成物。 39．グラム陰性セプシスの治療を要すると考えられる患者にリポ多糖を中和するのに有効な量の請求の範囲第38項に記載の医薬組成物を投与することを特徴とするグラム陰性セプシスの治療方法。 40．a)高密度リポタンパク質粒子へのリポ多糖の交換を促進することができることを特徴とする脂質交換タンパク質を含むリポタンパク質粒子のレベルを測定し、 b)工程(a)で測定されたレベルを初期の患者中のレベルと比較することを含み、レベルの増加がセプシスの陽性結果の大きな可能性を示すことを特徴とするグラム陰性セプシスまたは内毒素介在性セプシスを患っていると考えられる患者の監視または予診方法。 41．リポタンパク質が高密度リポタンパク質である請求の範囲第40項に記載の方法。 42．脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質である請求の範囲第40項に記載の方法。 43．リポタンパク質がリポタンパク質A-I を含む高密度リポタンパク質であり、かつ脂質交換タンパク質がリポ多糖結合タンパク質である請求の範囲第40項に記載の方法。 44．測定がリポ多糖結合タンパク質をまた含むアポリポタンパク質A-I を含むリポタンパク質粒子の割合を検出することを含む請求の範囲第43項に記載の方法。 45．測定がリポ多糖活性を中和する患者からの血漿または血清の能力を検出することを含む請求の範囲第40項に記載の方法。