JPH10504186A

JPH10504186A - プロテインｃに対するカルシウム結合組換え抗体

Info

Publication number: JPH10504186A
Application number: JP8502358A
Authority: JP
Inventors: アリレザレザイー，; チャールズティー．エズモン，
Original assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Current assignee: Oklahoma Medical Research Foundation
Priority date: 1994-06-10
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 1998-04-28
Also published as: ATE410514T1; DE69535855D1; EP0804580A1; EP0804580B1; AU2822995A; WO1995034652A1; AU710106B2; CA2192467A1; CA2192467C

Abstract

(57)【要約】プロテインＣの活性化領域内の特定の12ペプチド配列（EDQVDPRLIDGK）に特異的に結合するCa²⁺依存性組換え抗体を構築した。本抗体は、活性化プロテインＣに結合せず、そしてプロテインＣの精製および腫瘍の処置において、トロンビン-トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化を阻害するために用い得る。

Description

【発明の詳細な説明】プロテインＣに対するカルシウム結合組換え抗体発明の背景本発明は、一般に、血漿タンパク質、特にプロテインＣに対する抗体、およびそれらの使用方法の分野にある。プロテインＣは、セリンプロテアーゼに対するビタミンＫ依存性血漿タンパク質チモーゲンである。活性化の際に、これは強力な抗凝固因子になる。活性型プロテインＣは、プロ凝固補因子の第VIIIa因子および第Va因子の特異的タンパク質分解を介して作用する。この活性は、別のビタミンＫ依存性タンパク質であるプロテインＳ、カルシウム、およびリン脂質（おそらく細胞性）表面の存在を必要とする。Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Pract ice 、第２版、Colman，R.W.ら、263頁（J.B.Lippincott，Philadelphia，PA 198 7）に記載されるように、プロテインＣは、２鎖型で循環している。この２鎖型は、大きな方の重鎖が小さな方の軽鎖に単一のジスルフィド結合により結合している。少ない割合のタンパク質は、単鎖型でも循環している。この場合、分子中のLys-Argジペプチドが、軽鎖を重鎖に直接結合している。プロテインＣは活性化されて、活性型プロテインＣ(APC)になる。トロンビンは、重鎖中のArg¹²-Leu¹³結合の特異的開裂により、プロテインＣを活性化し得る。インビボでは、生理的濃度のカルシウムの存在下で、この活性化速度は、トロンビンが内皮細胞補因子であるトロンボモジュリンに結合すると劇的に増大される。Matschinerら、Current Advances in Vitamin K Research、135〜140頁、 John W．Suttie編（Elsevier Science Publishing Co.，Inc．1988）は、凝固におけるビタミンＫ依存性タンパク質の役割をさらに概説している。プロテインＣは、インビボにおいて主要な重要性を有することが示されている。プロテインＣまたはその補因子のプロテインＳを欠損する患者は、顕著な血栓傾向を示す。プロテインＣを全く欠損して生まれた新生児は、広範な（massive ）播種性血管内凝固(DIC)および壊死性症候群（necrotic syndrome）（これは治療しなければ、生後最初の数週間内で死に至る）を示す。活性型プロテインＣはまた、エンドトキシンショックの凝固障害的および致死的作用に対して動物を保護することが示されている（Taylorら、J ．Clin．Invest. 79，918-925(1987)に記載）。 Kisiel、J ．Clin．Invest. 64，761-769(1979)により最初に報告されたように、プロテインＣは元来、典型的なタンパク質精製技術を用いて半純粋型で血漿から単離された。このタンパク質精製技術には、クエン酸バリウム吸着および溶出、硫酸アンモニウム分画、DEAE-セファデックスクロマトグラフィー、デキストラン硫酸アガロースクロマトグラフィー、および分取ポリアクリルアミドゲル電気泳動が包含される。この手順は、Stearnsら、J ．Biol．Chem. 263(2)，826-83 2(1988)に記載されるプロテインＣに対する特有の抗体（HPC-4と称される）の発見により、大きく改善され、そして容易にされた。Esmonら、Joint IABS/CSL Sy mposium on Standardization in Blood Fractionation including Coagulation Factors、Melbourne、Australia 1986（Develop ．Biol Standard.，67，51-57（ S．Karger，Basel，1987に報告される）により詳述されるように、プロテインＣは、QAEセファデックスでの希釈ヘパリン処理血漿のバッチ吸着、緩衝化0.15Ｍ NaClでの洗浄および0.5M NaClでの溶出、再カルシウム沈着およびHPC-4を用いるバッチ吸着、次いでCa²⁺含有緩衝液での洗浄およびEDTA含有緩衝液を用いるプロテインＣの溶出により、ヒト血漿から単離され得る。HPC-4は、ヒトプロテインＣに対するカルシウム依存性モノクローナル抗体である。この抗体により認識されるエピトープは同定され、そしてトロンビン開裂部位に及ぶプロテインＣのチモーゲン中のアミノ酸の配列（stretch）に相当する。活性型プロテインＣは、H PC-4により認識されない。HPC-4は、Esmonらの米国特許第5,202,253号に開示およびクレームされている。ヒトプロテインＣに対するいくつかの抗体が、例えば、Laurellら、FEBS Lett s. 191(1)，75-81(1985)；Wakabayashiら、J ．Biol．Chem. 261，11097-11105(1 986)；Sugoら、Thromb ．Hemost．Abstrs.，Brussells，229(1987)；およびOhlin ら、J ．Biol．Chem. 262，13798-13804(1988)により報告されている。これらのいくつか（例えば、Laurellらにより報告された抗体の１つ）はカルシウム依存性である。しかし、発行された報告において決定され得る限り、この依存性は、プロテインＣの軽鎖へのカルシウム結合の必要に起因し、そしてこれらの抗体は、軽鎖上のエピトープを認識する。他の抗体は、重鎖上のトロンビン開裂部位周辺の領域を認識するが、これらは、カルシウム依存性ではない。OhlinらのH PC-4抗体は、Ca²⁺依存性であるが、活性化領域に対しておらず、従って、Stearn sらおよびEsmonらの米国特許第5,202,253号に記載の抗体とは異なる。プロテインＣのCa²⁺安定化領域に結合する他の全ての抗体は、プロテインＣおよびプロテインＣの活性型の両方を認識する。その活性型が共存していないタンパク質が望ましい状況が生じ得る。これは、特に、プロテインＣ活性化を阻害するための抗体の治療用途に関する場合である。天然の抗凝固因子経路、特にプロテインＣ経路の封鎖は、腫瘍毛細管を微小血管血栓形成に標的して腫瘍の出血性壊死に導く、腫瘍の天然のプロ凝固特性を用いる。このことはEsmonらの米国特許第5,147,638号に記載されている。HPC-4は、単独あるいは生物学的応答調節剤、化学療法、または放射線治療と併用して、固形腫瘍の治療のためにこの方法において用いられる好ましい抗体である。腫瘍は、腫瘍ベッド(tumor bed)中の血管中に血餅を形成する素因を与えるタンパク質を含む。腫瘍はまた、腫瘍血管の血栓形成を妨害する他のタンパク質および細胞要素を含む。腫瘍壊死は、プロ凝固因子機構と抗凝固因子機構との間の止血平衡を変化させ、腫瘍微小血管系の血栓形成を促進することから生じる。腫瘍の止血平衡は、プロテインＣのその活性型（活性型プロテインＣ）への転換を遮断することにより変化され得る。次いで、腫瘍ベッド中に存在するプロ凝固因子機構は抵抗なしに機能し、そして腫瘍血管の血栓形成を生じる。HPC-4抗体のためのエピトープは、プロテインＣにおける活性化部位に及び、結果としてプロテインＣ活性化を遮断する。実験ツールとして、この抗体が、イヌ、ブタ、および少なくとも２つの霊長類（ヒヒおよびマーモセット）血漿由来のプロテインＣと交差反応することに注意することが重要である。この抗体は、ウシまたはマウスのプロテインＣとは交差反応しない。阻害効果は、抗体が結合しない活性型プロテインＣの投与により、直ちに逆転され得る。従って、この抗体は、インビボでプロテインＣ経路を選択的に阻害し、かつ血栓合併症が腫瘍以外の部位で起こる場合、プロセスを逆転させる手段を提供する。プロテインＣ遮断剤は、好ましくは、サイトカインと組み合わせて投与される。このサイトカインは、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞媒介性細胞傷害性を刺激し、マクロファージを活性化し、単核細胞におけるFcレセプター発現および抗体依存性細胞性細胞傷害性を刺激し、HLAクラスII抗原発現を増強し、かつ／またはプロ凝固因子活性を刺激する。このようなサイトカインとしては、腫瘍壊死因子(T NF)、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、γインターフェロン(γ-IFN)、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GMCSF)が挙げられる。あるいは、エンドトキシン、またはグラム陰性菌（例えばE．coli）由来の精製リポ多糖(liposaccharide；LPS)のような因子は、サイトカイン（例えば、TNF）の産生を惹起するために用いられ得る。 HPC-4は、そのすばらしい特性に関わらず、マウス抗体である。非免疫原性であるまたは免疫原性が低いヒト化型の抗体を提供することが好都合である。HPC- 4のヒト化型を構築するために、この抗体の超可変領域の配列を知ることが必須である。次いで、分子生物学において開発された従来の変異誘発法を用いて、関連のないヒト抗体の超可変領域の配列をHPC-4超可変領域の配列と置換することが可能である。このようなアプローチは、他の抗体のヒト化において首尾良く用いられている。さらに、超可変領域の配列を知ることにより、HPC-4抗体の超可変領域に相当する短いペプチドを合成することが可能であり得る。このペプチドは、HPC-4を模倣し、プロテインＣ上の同じ領域に結合し、そしてトロンビン− トロンボモジュリン複合体によるプロテインＣの活性化を妨害する。このようなペプチドは、クロッティングの促進が所望される疾患状態に非常に有効である。従って、本発明の目的は、HPC-4のようなプロテインＣの活性化領域に結合する組換えCa²⁺依存性抗体を提供することである。本発明のさらなる目的は、HPC-4のような抗体の超可変領域をコードするDNA配列を提供することである。本発明のなおさらなる目的は、治療目的のために、このCa²⁺依存性抗体を使用するための方法および手段を提供することである。本発明のさらに別の目的は、診断目的のために、このCa²⁺依存性抗体（単数または複数）、ペプチド誘導体およびその結合体を提供することである。発明の要旨 HPC-4抗体の超可変領域のアミノ酸配列および核酸配列が決定され、そして「ヒト化抗体」の構築において用いられる。HPC-4−プロテインＣ結合の模倣において有用な超可変領域由来ペプチドもまた、開示される。これらの材料は、プロテインＣの単離において、腫瘍患者の治療において、および凝固のインヒビターとして、ならびに診断アッセイにおいて有用である。発明の詳細な説明 Ca²⁺依存性モノクローナル抗体の可変Ｈ(VH)鎖および可変Ｌ(VL)鎖がクローン化され、配列決定された。この抗体は、カルシウムと組み合わせて、非ウシ起源のプロテインＣ（ヒト、ブタ、ヒヒ、およびイヌのプロテインＣを包含する）の活性化領域における特定の12ペプチドの配列EDQVDPRLIDGK（配列番号１）に特異的に結合する。抗体は、活性型プロテインＣ(「APC」)に結合せず、トロンビン −トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化を阻害するために用いられ得る。以下に記載のように、HPC-4抗体のFab（抗原結合フラグメント）配列を細菌ペリプラズム発現ベクター中で構築し、そして組換え抗体を、細菌細胞培養上清から、固定化基質に結合させた上記ペプチド配列を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより大規模で単離した。抗体は、プロテインＣの単離および特徴付けにおいて、診断薬として、およびプロテインＣの活性化を防止する治療薬として、多数の特定用途を有する。インビボにおいて、ヒト化組換え抗体は、腫瘍成長を阻害することが実証された。さらに、この抗体は、高レベルの第VIII因子インヒビター、血友病、血小板欠損（血小板減少症）、およびクロッティングを増大することが望ましい他のクロッティング不全を有する患者におけるクロッティングを促進することにおいて有効である。抗体の構造および特異性Ｘ線結晶学研究は、抗体分子の構造を提供し、そして抗原−抗体認識の性質を示した。抗体は、大きなタンパク質（免疫グロブリンＧの場合、約150,000ダルトン）であり、これは４つのポリペプチド鎖（２つの同じＨ鎖および２つの同じＬ鎖）からなる。抗原結合部位は、Ｈ鎖およびＬ鎖のおおよそ最初の110のアミノ酸からなり、そしてこれは可変領域と称される。抗体は、10⁴〜10¹⁴M^-1の範囲の会合定数で分子を結合する。小さな分子（代表的には100〜2500ダルトン）は、代表的には抗体分子の裂け目（cleft）に結合されるが、大きな分子（例えば、10 KDa〜500 KDa）については、結合部位は、600〜800 Åをおおい得る拡張したした表面であり得る。そのリガンドに対する抗体の特異性は、基質に対する酵素の特異性を超越し得る。代表的には、以下により詳細に考察されるように、他の抗体ドメインまたは融合タンパク質に架橋またはカップリングされ得るその配列が由来する抗体（この場合はHPC-4）のＨ鎖およびＬ鎖の超可変領域からなる組換え抗体が構築される。抗体は、親和性または特異性を変化するために分子生物学において一般に用いられるコード配列の部位特異的変異誘発により改変され得、そしてインビボでの有用性を改善するためにヒト化され得る。 HPC-4 抗体 1988年11月２日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、Rockville，MD に寄託され、ATCC番号HB 9892を割り当てられたモノクローナル抗体、HPC4の特性（これはHPC4を比類なく有用にする）は、以下のとおりである：この抗体は、活性型プロテインＣ（APC）ではなくプロテインＣをカルシウム存在下でのみ結合する。従って、この抗体が親和性支持体に固定化される場合、プロテインＣは，非常に温和な条件下で血漿由来供給源または組織培養発現系のいずれかから単離され得る。これは、産物の生物学活性および固体支持樹脂の安定性を維持することにおいて重要である。活性プロテインＣは、いかなる条件下でも結合されないので、得られる産物はAPCを全く含まない。この抗体は、プロテインＣ上の活性化部位に結合し、それ故、インビボにおける抗凝固因子タンパク質APCの形成をブロックするために用いられ得る。この抗体は、APCを結合も阻害もしないので、インビボ阻害効果は、APCの投与により逆転され得る。 HPC-4DNA のクローニングおよび配列決定方法 HPC-4 cDNAライブラリーの構築： 75ml T-フラスコ中で増殖させた約1×10⁹ HPC-4ハイブリドーマ細胞由来のRNAを調製し、mRNA（ポリA＋RNA）を、製造業者（Stratagene，CA）の指示に従ってオリゴ（dT）-セルロースにおいて単離した。確立された手順に従って、約10μgのポリA＋RNAを用いて第１鎖のcDNA、および次いで第２鎖のcDNAを合成した。標準的な分子生物学的技術を用いて、EcoRIリンカーを、２本鎖cDNA（ds cDNA）に連結し、そしてこのds cDNAを、EcoRIで消化したλファージ（λgt10）ベクターDN Aに連結した。HPC-4cDNAおよびλgt10ファージベクターのライゲーション混合物を、インビトロでパッケージし、そしてE.coliのC600hflA株に形質転換し、そして高密度でアガープレートにプレーティングした。次いでバクテリオファージプラークを、Gene Screen Plus^TMフィルター（New England Nuclear）にトランスファーし、そして無関係の免疫ブロブリンＨ鎖（Tasuku Honjoら、Cell 18:559- 568，1979）およびＬ鎖遺伝子（Edward Maxら、J.Biol.Chem. 256:5116-5120,19 81）の定常領域由来の³²P標識cDNAフラグメントでプローブした。Ｈ鎖プレートおよびＬ鎖プレート由来のいくつかのポジティブクローンを同定した。ファージDNAを調製し、そして挿入物をEcoRI制限酵素により切断した。Ｈ鎖またはＬ鎖プローブにより同定されたクローンは、それぞれ約1600bpまたは80 0bpの挿入物を与えた。Ｈ鎖およびＬ鎖のcDNAフラグメントを、pUC19プラスミドのEcoRI部位にサブクローン化し、そしてユニバーサルpUC正方向および逆方向配列決定用プライマーにより配列決定した。 PCRによるクローニング：HPC-4モノクローナル抗体のＨ鎖の可変領域（VH）およびＬ鎖の可変領域（VL）を、同様にPCR法によりクローン化した。第１鎖cDNA 合成の後、ポリ（dG）テールを、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）で第１鎖の３'末端に付加した。次いでVH領域のクローニングのために、産物を、Ｈ鎖定常領域の3'末端由来のアンチセンスプライマー5'-AAGCG GCCGCTGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGCC-3'（配列番号２）およびポリ（dC）テールからなる他のオリゴヌクレオチドプライマー AAGCGGCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC C-3'（配列番号３）で増幅した。同様に、VL領域のクローニングのために、ポリ（dG）テールを有する第１鎖DNAを、Ｌ鎖定常領域の3'末端由来のアンチセンスプライマー5'-AAGCGGCCGCGAAGATGGATACAGTTGGTGCAGCATCAGC-3'（配列番号４）およびポリ（dC）テールを含有する他のオリゴヌクレオチド（配列番号３）で増幅した。それぞれ約400bpであるPCR増幅産物を、pUC19プラスミドのSmaI部位に別々にサブクローン化し、そしてユニバーサル正方向および逆方向配列決定用プライマーにより配列決定した。両方のクローニング方法（PCRまたはλgt10ライブラリー）による、Ｈ鎖およびＬ鎖可変領域の配列が同一であることを見出した。細菌におけるHPC-4 Fabの発現：HPC-4のFab（抗原結合フラグメント）配列を、以下で手短に概説するように発現のためにPCR法によりＨ鎖およびＬ鎖のcDNA から増幅した：抗体のFab領域は、VLおよび定常Ｌ鎖（CL）とともに保有されるV Hおよび定常Ｈ鎖ドメイン１(CH1)からなる。細菌においてHPC-4 Fabを発現するために、４つのPCRプライマーを合成した：Ｈ鎖正方向プライマーは、5'-AGGTTA CTCTGCTCGAGTCTGGCCCTGG-3'（配列番号５）であった。これは、構築目的のためにXhoI制限酵素部位を有するように設計された。２つの終止コドンおよびその終止コドンの下流にSpeI部位を有する、Ｈ鎖逆方向プライマー（CH1領域の3'末端に相補的）5'-AGGCCTACTAGTTTACTAACAATCCCTGGGCACAAT-3'（配列番号６）を合成した。同様に、SacI制限酵素部位を含有するＬ鎖正方向プライマー5'-TGTCCAGAG GAGAGCTCATTCTCACCCAGTCTCCGGC-3'（配列番号７）ならびに２つの終止コドンおよび構築目的のためのXbaI部位を含有する逆方向プライマー5'-TCCTTCTAGATTACT AACACTCTCCCCTGTTGAA-3'（配列番号８）を合成した。Ｈ鎖およびＬ鎖HPC-4 cDNA を、これらのプライマーにより増幅し、そして得られたDNAフラグメントを、製造業者（Stratagene，CA）の指示に従い、それぞれImmuno ZAP H^TMおよびImmuno ZAPL^TMベクターにサブクローン化した。 HPC-4 Fabを、細菌（E.ColiのXL1-B株）のペリプラズム空間に発現させ、そしてAffigel^TMに連結したヒトプロテインＣ活性化ペプチド領域由来のHPC-4 Fab自身の12残基のエピトープ（Glu-Asp-Gln-Val-Asp-Pro-Arg-Leu-Ila-Asp-Gly-Lys 、配列番号１）で精製した。HPC-4 Fabを、５mM EDTAを含有するTBS（20mM Tris H Cl，pH7.5，0.1M NaCl）で溶出した。このことは、そのエピトープへのHPC-4のF abフラグメントの結合が、完全長の天然のHPC-4抗体のように、Ca²⁺依存性であることを示す。精製されたFabのSDS-PAGEは、精製されたFabが本質的に純粋であり、そして予想されたように48 KDaの見かけの分子量で移動することを示した。これら全ては、組換えHPC-4 Fabが、腹水から精製された野生型HPC-4モノクローナル抗体の全ての特性を含むことを示す。Immuno ZAP^TM発現系に用いられるクローニングストラテジーは、Ｈ鎖において、天然のスレオニン（３位のアミノ酸）をリジンに、そして５位のリジンをロイシンに変化させることを注意されるべきである。Ｌ鎖において、天然のHPC-4は、成熟ペプチドの１位および２位にグルタミンおよびイソロイシンを含有し、そしてこのクローニングストラテジーは、これらをそれぞれグルタミン酸およびロイシンに変化させる。細菌における発現の間のＨ鎖およびＬ鎖のN末端におけるこれらの微小な変化（これは、エピトープが結合する領域の外側に位置する）は、内因性蛍光分光法（intrinsic fluore scence spectroscopy）により決定された、12アミノ酸残基ペプチドエピトープへのその類似したCa²⁺依存性親和性結合により立証されたように、HPC-4 Fabの特性に影響しない。これらの技術を用いて、以下の核酸およびアミノ酸配列を得た：１． HPC-4 Ｈ鎖可変領域（VHγ）をコードする核酸配列（配列番号９）：シグナルペプチドは、ヌクレオチド１〜57によりコードされる。成熟ペプチド（発現される形態）は、ヌクレオチド58〜417によりコードされる。２．シグナル配列を含有するHPC-4 Ｈ鎖可変領域アミノ酸配列（配列番号10）は、以下の通りである：成熟ペプチドは、アミノ酸番号20（これはＱである）から始まる。アミノ酸に対する標準的な１文字表記が用いられる。３． HPC-4 Ｌ鎖可変領域（VLκ）をコードするヌクレオチド配列（配列番号11 ）は、以下の通りである：シグナルペプチドは、ヌクレオチド１〜66によりコードされる。成熟ペプチドは，ヌクレオチド67〜387によりコードされる（CAAATTA....から始まる）。４． HPC-4 Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列(κ鎖)(配列番号12)は、以下の通りである。成熟ペプチドは、アミノ酸23（これはＱである）から始まる。当業者は、種々のDNA配列が、上記のポリペプチド抗体フラグメントをコードすることを理解する。これは、遺伝コードの縮重の存在に起因する。遺伝コードの縮重は異なるコドン（３塩基のセット）が、同一のアミノ酸残基をコードし得ることを意味する。これらは当業者に公知である。上記の配列以外の異なる更なる置換を有するが、なお同一の結合特性を有するタンパク質（例えば、このタンパク質は、保存的なアミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸の類似したサイズおよび電荷を有する他のアミノ酸での置換）を有する）をコードするDNA配列を合成することも可能である。組換え抗体の構築上記の配列を用いて、公知の方法論を使用し、組換え抗体が構築され得る。キメラ遺伝子を構築するための方法は、例えば、Kobilka,B.K.ら、「キメラα₂-、 β₂-アドレナリンレセプター：エフェクターカップリングおよびリガンド結合の特異性に関与するドメインの詳細な描写」Science 240:1310-1316、1988；Verho eyen,M.、C.Milstein、G.Winter、「ヒト抗体再成型：抗リゾチーム活性のグラフト」Science、239:1534-1536、1988；Riechmann,L.、M.Clark、H.Waldmann、G .Winter、「治療用ヒト抗体再成型」Nature、332:323-327、1988により記載されている。標準的な分子生物学的技術を用いて、Summers,M.D.およびG.E.Smith、「バキュロウイルスベクターおよび昆虫細胞培養手順のための方法のマニュアル」、Texas Agricultural Experimental Station(1987)に記載の手順に従い、目的のモノクローナル抗体の遺伝子を含む標的DNAが、バキュロウイルス発現ベクターのような適切な発現ベクター中に構築され得る。組換え遺伝子の発現は、上記文献中に記載される方法により達成され得、その教示は本明細書中に援用する。あるいは、組換え抗体は、上記のような細菌ペリプラズム発現ベクターにおいて産生され得る。ELISAアッセイにより、所望の産物のスクリーニングが達成され得る。このアッセイにおいて、放出されるタンパク質は、標的免疫グロブリンが金属依存的様式で特異的であった抗原を認識するその能力について試験される。抗体のヒト化抗体の「ヒト化」、または非ヒト抗体のより低い免疫原性のフラグメントの作製のための方法は周知である。ヒト化抗体は、抗原認識部位または相補性決定超可変領域(CDR)のみが非ヒト起源であり、可変ドメインの骨格領域(FR)を含む全ての他の領域はヒト遺伝子産物である抗体である。これらの「ヒト化」抗体は、ヒトレシピエントに導入された場合、より低い免疫原性ではあるが抗原結合特異性は依然として保持する。選択されたマウスモノクローナル抗体のヒト化を達成するために、Daughertyら、Nucl ．Acids Res.、19:2471-2476(1991)(本明細書中で参考として援用される)に記載されるCDRグラフト法が使用され得る。簡単に説明すると、動物可変遺伝子の公知の配列中のCDRの位置に基づき、動物のCDRが動物の骨格領域(FR)から区別される(Kabat,H.A.ら、Sequences of Proteins of Im munological Interest、第４版、U.S．Dept. Health and Human Services、Beth esda、MD、1987)。一旦動物CDRとFRが同定されると、動物CDRは、合成オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法の使用を包含する標準的な分子生物学的技術により、関連のないヒトのＨ鎖およびＬ鎖の可変領域骨格の配列にグラフトされる。あるいは、DNA合成機(Applied Biosystems Division of Perki n-Elmer Cetus、CA)により、CDRをコードする全てのコドンが動物抗体の所望のC DRで置換されている公知のヒト可変Ｈ鎖遺伝子およびヒト可変Ｌ鎖遺伝子の全配列が実験室で合成される。動物抗体由来のグラフトされたCDRを有するヒトＨ鎖およびＬ鎖可変領域をコードする得られた合成DNA配列は発現ベクターにサブクローン化され、そして組換え融合抗体がバキュロウイルスまたは上記のような細菌の周辺腔で調製される。組換え抗体は、同様に哺乳動物発現系において産生され得る。このように産生されたモノクローナル抗体により与えられる免疫原性刺激はまた、Pharmacia製「Recombinant Phage Antibody System」(RPAS)(Pharmacia LKB Biotechnology、Sweden)の使用により低減され得る。RPASは、抗体の完全な抗原結合ドメインを取り込んだ１本鎖Fvフラグメント(ScFv)を作製する。RPASにおいて、可変Ｈ鎖遺伝子および可変Ｌ鎖遺伝子は、ハイブリドーマmRNAから別々に増幅され、そして発現ベクター中にクローン化される。Ｈ鎖ドメインおよびＬ鎖ドメインは、可動(flexible)ペプチドをコードする短いリンカーDNAと連結した後、同一のポリペプチド鎖上で同時発現される。このアセンブリにより、抗体の完全な抗原結合ドメインを取り込んだ１本鎖Fvフラグメント(ScFv)が作製される。インタクトなモノクローナル抗体と比較して、組換えScFvは、相当に少ない数の抗原エピトープを含み、それにより、ヒトに注入された場合、はるかに弱い免疫原性刺激を与える。 HPC-4 抗体の精製腹水由来のHPC-4および組換えHPC-4の両方は、Ｈ鎖の残基６と残基17の間、具体的にはE D Q V D P R L I D G K(配列番号１)に含まれるプロテインＣ分子の規定された領域に結合する。このペプチドは、固体支持体樹脂上に直接固定され得、そして腹水液から抗体を、または細胞培養上清から組換え体として高濃度で単離するために用いられ得る。このアプローチにより、高い希釈度の溶液からでさえ、高収率の、極めて純度の高い形態の抗体の単離が可能となる。所望であれば、カルシウムイオンの除去、または精製されたモノクローナル抗体の機能に影響しない1.5Ｍグアニジンのいずれかにより抗体を固体支持体ペプチドから取り出し得る。取締当局によりグアニジンはウイルス失活剤として認識されているので、これは重要であり得る。この薬剤を用いる溶出または処理の後、抗体は、モノクローナル抗体を産生するために用いられたマウス由来の腹水中または(組換え抗体の産生のために組織培養が用いられた場合)培養上清のいずれかに存在し得る生存ウイルスを全く含まない。従って、プロテインＣ産物を調製するため使用される抗体からタンパク質Ｃ産物中にウイルスは取り込まれない。好適な実施態様において、ペプチドを、約1.0mg/mlの最終濃度となるようにAf fi-Gel^TM15にカップリングする。エピトープペプチドのカップリングは、製造業者(Bio-Rad、Richmond、CA)により記載されるように0.1Ｍ NaCl、0.1Ｍ MOPS、p H7.5中で４℃で実施される。Affi-Gel^TMを、有機溶媒を除去するために、使用する直前に氷冷水で洗浄する。エピトープペプチドを、0.1Ｍ NaCl、0.1Ｍ MOPS、 pH7.5中、１mg/mlと２mg/mlとの間の濃度に調製し、そしてゲルに対するペプチドの最終比率が１mg/mlを示すように、十分なAffi-Gel^TM15と混合する。ペプチドをゲルにカップリングするために、ペプチドとゲルとを暖かなロッカー(gentl e rocker)上で一晩(約12時間と18時間との間)混合する。カップリング反応が完了した後、樹脂をガラスカラムに注ぎ、そして0.1Ｍ NaCl、0.01Ｍ MOPS、pH7.5 で洗浄する。100mlの樹脂は、少なくとも1.5グラムのHPC-4が結合する能力を有する。ヒトプロテインＣを同じ方法により、Affi-Gel^TMにカップリングし得る。上記の緩衝液１mlあたり３〜５mgのプロテインＣを、ゲルに対するヒトプロテインＣの最終比率が３〜５mgタンパク質/１mｌゲルとなるように十分なAffi-Gel^TMと混合する。腹水の脱塩硫酸アンモニウム画分をエピトープアフィニティーカラムに充填し、そしてカラムを少なくとも４カラム容量の0.4Ｍ NaCl、0.02Ｍ Tris HCl、１m M CaCl₂、pH7.5で洗浄する。次いで、以下の方法の内の１つにより、カラムから HPC-4または組換え抗体を溶出する：(1)２Ｍ NaCl、0.02Ｍ Tris HCl、２mM EDT A；(2)２Ｍ NaCl、1.5ＭグアニジンHCl、0.02M Tris HCl、２mM EDTA。後者の利点は、200mlの腹水が100mlの樹脂カラムに付加される場合、タンパク質がはるかに鋭いピークとして25mg/mlを超える濃度で溶出することである。これらの条件下での溶出後、抗体は、エピトープに結合する能力の95％以上を保持する。次いで、抗体は、さらなる適用のために、適切な緩衝液中に透析されるか、あるいは脱塩される。抗体の混入物はSDSゲル電気泳動によっては検出されない。カラムがその結合能力を超えて過剰に充填される場合、一度通過させた材料を再度カラムに付加することによりさらなる抗体が得られ得る。 HPC-4 抗体のインビトロ適用組換え抗体は、HPC-4と同様の方法で、精製および治療目的に利用し得る。以下で論議されるように、「HPC-4」は、寄託されたマウスモノクローナル抗体およびその組換え形態の両者を含む。プロテインＣの精製アフィニティクロマトグラフィーによるプロテインＣの精製のために、抗体の固定化基質(Affi-Gel^TM樹脂など)へのカップリングは、製造業者(Bio-Rad、Rich mond、CA)に記載されるように、0.1M NaCl、0.1M M0PS、pH7.5中、４℃で実施する。Affi-Gel^TMは、使用直前に、氷冷水で洗浄し有機溶媒を除去する。HPC-4を、0.1M NaCl、0.1M MOPS、pH7.5中、3〜5 mg/mlの濃度で調製し、そしてゲルに対するHPC-4の最終比を5mg/mlとするに十分なAffi-Gel^TM10と混合する。抗体とゲルを緩かなロッカー上で一晩(12〜18時間)混合しカップリング反応を行わせる。通常、90％以上の抗体が結合する。カップリング反応が終了した後、樹脂をガラスカラムに注ぎ、そして0.1M NaCl、0.01M MOPS，pH7.5で洗浄する。この樹脂は、これらの条件下で、少なくとも１年間は安定である。100mlの樹脂は、少なくも20ミリグラムのプロテインＣを結合する能力を有する。上記のように、このペプチドを、アフィニティクロマトグラフィーによるHPC- 4の単離および精製に利用し得る。同様に、このペプチドは、抗体がクロマトグラフィー基質に結合するプロセスの間に、結合部位を一時的に「保護」するために使用され得、結合抗体の最大量が、単離されるタンパク質への結合に利用される得ことを確実にする。クロマトグラフィー基質と反応し得るペプチドの反応基 (アミノ末端、リジン側鎖)は、HPC-4による認識には必要ではなく、当業者に公知の標準的方法を用い、ペプチドの無水酢酸との反応により最初にブロックされる。HPC-4を樹脂にカップリングした後、抗体の抗原結合部位に結合したペプチドを、1.5MのグアニジンHCl、2mM EDTA、0.02M Tris HCl、pH7.5で樹脂を洗浄することにより取り出す。抗体およびペプチドは、それぞれ、プロテインＣおよび抗体を精製および単離する使用のために、種々の基質(アガロース、アクリルアミドおよび他のタイプの従来のクロマトグラフィー樹脂、フィルターなどを含む)に結合され得る。これらの材料は、タンパク質をそれらに結合するための方法のように、当業者に公知である。この材料の選択は、大部分、精製の規模または分析される試料、ならびに最終製品が薬学的使用のためである場合、生体適合性および政府当局の認可に依存する。診断用途診断薬としての使用のために抗体を標識する方法および手段は、当業者に公知であり、放射活性、蛍光、発色、または酵素分子での標識を含む。次いで、抗体を診断アッセイに用いて活性化プロテインＣまたは総プロテインＣよりむしろプロテインＣ量を測定する。なぜなら、プロテインＣに対する他の抗体と異なり、この抗体は、活性化プロテインＣには結合しないからである。抗体を用いる融合タンパク質の単離 HPC-4抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーにより容易に単離される融合タンパク質は、1994年３月29日に発行された米国特許第5,298,599号に記載されるように、12アミノ酸のHPC-4エピトープをコードするDNA配列、次いで単離されるべきタンパク質をコードする遺伝子をベクター中に挿入することにより調製される。好適な実施態様では、特定のプロテアーゼ切断部位を、エピトープとタンパク質コード配列との間のベクター中に挿入し、得られる融合タンパク質は容易に切断されてエピトープペプチドと所望のタンパク質を生じる。最も好適な実施態様では、融合タンパク質は、エピトープと単離されるべきタンパク質との間にプロテアーゼ切断部位を含む。適切な部位は、Xa因子により切断される配列：Ile Glu Gly Arg(IEGR)、エンテロキナーゼにより切断される配列：Asp Asp Asp Asp Lys(DDDDK)、およびトロンビンにより切断される配列：Phe/Gly Pro Ar g(F/GPR)を含む。HPC-4を用いて精製した後、融合タンパク質を適切な酵素で処理し、所望のタンパク質から結合ペプチドを切断する。組換えHPC-4の治療用途哺乳動物における凝固および抗凝固系は、血液をその適切な流動状態に維持する微妙なチェックおよびバランス系を提供する。この系の任意の１つの要素の変化は、恒常性を維持する哺乳動物の能力に甚大な衝撃を有し得る。プロテインＣ系は、血液凝固を阻害し、そしてフィブリン溶解を刺激する抗凝固調節系である。この系は、凝固プロセスでフィブリノーゲンをフィブリンに転換する酵素であるトロンビンにより活性化される。遊離のまたは過剰のトロンビンは、内皮細胞上のタンパク質トロンボモデュリンと結合する。トロンビン-トロンボモデュリン複合体は、トロンビンの血餅形成を触媒する能力をなくし、そしてトロンビンを強力なプロテインＣアクチベーターに転換する。活性化プロテインＣは、順に、プロテインＳと膜表面と共同して作用し、限定タンパク質分解により第Va因子および第VIIIa因子を不活化する。不活化された第Va因子は、酵素第Xa因子または基質プロトロンビンと効果的に相互作用する能力を失う。プロテインＣに対する抗体の添加、プロテインＳに対する抗体の添加、または C4b結合タンパク質(C4bBP)(プロテインＳに結合しそれによってコファクターとしてプロテインＳを不活化する)の添加は、適切な形態で、凝固を促進することが好ましい個体において凝固促進のために使用し得る。第VIII因子インヒビターを有する患者は、このグループの患者の代表である。第Va因子が不活化されることを防止することにより、第VIII因子が相対的に不足していても凝固は進行する。プロテインＣ抗凝固系のこれらインヒビターを投与する効果は、経路をブロックするために用いられる薬剤に依存して、活性化プロテインＣまたはプロテインＳの過剰量の投与により逆転され得る。適正量は、血液中に存在するタンパク質の相対モル量に関連する計算に基づく。超凝固可能状態を生じるこのアプローチの実行可能性は、HPC-4のヒヒへの投与により証明されている(Taylorら、J ．Cli n．Invest .，79、918-925(1987))。HPC-4が存在したとき、動物は、低レベルのバクテリアの注入の結果として、全体のフィブリノーゲン消費により特徴付けられる大きな凝固応答を生じた。それらは、抗体の非存在下ではこの応答を生じなかった。C4bBPレベルを約１mg/ml血漿まで増加したとき事実上同じ結果が得られる。これらの応答は動物にとっては有害であるが、それらはいずれの方法も凝固系を増強することを例示する。これは正常な恒常性が損なわれている状況では有益である。この方法はまた、凝固因子が欠損している他の状態、例えば、ヘパリンまたは放射線療法、肝臓疾患および出血性卒中により誘導されるような血小板減少症の処置において、急性的にも急性発症後の再出血を最小限にするためにも適応され得る。 HPC-4はまた、1992年９月５日に発行された米国特許第5,147,638号に記載されるように、固形腫瘍ベッドにおける微小血管凝固を誘導するために用いられる得る。動物腫瘍モデルでは、これは、腫瘍の増殖を大いに妨害することが見い出されている。この抗体および/または(腫瘍壊死因子または放射線照射のような)現在使用されている他の処置とともにプロテインＣ抗凝固経路の機能をブロックし得る他の上記で示された他の薬剤の組み合わせはまた、固形腫瘍の処置に用いられ得る。薬学的組成物抗体の投与のための薬学的に受容可能なキャリアは、生理学的pHの通常の滅菌した生理食塩水を含む。好ましい投与方法では、薬剤は被験体に注入される(最も好ましくは、静脈注射)。好適な用量は、約30〜150μg抗体/ml患者血漿であり、内因性のプロテインＣの90％以上をブロックするに十分である。上記で引用された文献および特許の教示は、当業者に公知の方法および試薬の代表として本明細書に特に援用される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 17/00 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＥＤ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．カルシウムとの組み合わせで、EDQVDPRLIDGK（配列番号１）により規定されるプロテインＣの重鎖の活性化ペプチド領域のエピトープに免疫反応性である組換えCa2⁺依存性モノクローナル抗体であって、ここで、該抗体がトロンビン-トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化を阻害する、抗体。２．以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体：３．ヒトアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。４．以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって、一部がコードされる、請求項１に記載の抗体：５．患者への投与のために、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載の抗体。６．前記抗体との組み合わせで有効な用量で腫瘍内の微小血管系を凝固するが、該抗体の非存在下では微小血管系を凝固しない、サイトカインまたはサイトカイン発現のインデューサーをさらに含む、請求項５に記載の抗体。７．前記抗体に結合した検出可能な標識を有する、請求項１に記載の抗体。８．固定化された前記抗体が、生物学的液体からのプロテインＣの精製に適切である、基質に対して固定化された、請求項１に記載の抗体。９．プロテインＣ抗凝固因子の阻害によって障害を処置する方法であって、その処置を必要とする患者に、カルシウムとの組み合わせで、EDQVDPRLIDGK（配列番号１）により規定されるプロテインＣの重鎖の活性化ペプチド領域のエピトープに免疫反応性である有効量の組換えCa2⁺依存性モノクローナル抗体を投与する工程を包含し、ここで、該抗体がトロンビン-トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化を阻害する、方法。１０．前記抗体が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法：１１．前記抗体がヒトアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。１２．前記抗体が、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって、一部がコードされる、請求項９に記載の方法：１３．前記抗体とともに、腫瘍の微小血管系を凝固するに有効な量のサイトカインまたは他の化学療法剤を投与する工程をさらに包含する、請求項９に記載の方法。１４．カルシウムとの組み合わせで、EDQVDPRLIDGK（配列番号１）により規定されるプロテインＣの重鎖の活性化ペプチド領域のエピトープに免疫反応性である組換えCa2⁺依存性モノクローナル抗体を作製する方法であって、ここで、該抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、該抗体がトロンビン -トロンボモジュリンによるプロテインＣの活性化を阻害する、方法。１５．前記抗体が以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の方法：１６．前記抗体が、以下からなる群より選択されるヌクレオチド配列によって、一部がコードされる、請求項１４に記載の方法：１７．前記抗体内に、動物の配列の代わりにヒトの配列を挿入する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。１８．前記抗体に検出可能な標識を結合する工程をさらに包含する、請求項１４に記載の方法。１９．基質に前記抗体を固定化する工程をさらに包含し、ここで、該固定化抗体が生物学的液体からのプロテインＣの精製に適切である、請求項１４に記載の方法。