JPH10503773A - ５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、治療用および診断用核酸に有用であるヌクレアーゼ耐性５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドを提供する。新規修飾オリゴヌクレオチドは、天然に生じるホスホジエステル結合の５’−位にある酸素原子（５’−架橋酸素）および少なくとも１つの非架橋酸素原子の両者が独立に単一の硫黄原子で置換されている少なくとも１つの５’−ジチオエート結合を有する。本発明は、５’−ジチオ修飾および５’−チオ修飾オリゴヌクレオチド並びに新規単量体ヌクレオシドおよびその合成方法に有用なヌクレオチド中間体を作るための重合体支持方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチド 発明の分野 本発明は、治療学の分野に、さらに特には核酸治療学の分野に関する。 背 景 医薬開発における伝統的なアプローチでは、病状または他の不健康な状態に関 与するタンパク質に直接相互作用することができる治療剤の用途に焦点があてら れてきた。この伝統の医薬としては、例えば（体内に望ましく存在するタンパク 質ベースのホルモンの機能を刺激する）合成ホルモン、（外来タンパク質、特に 微生物のものを攻撃する）抗生物質および（体内で通常の機能を発揮するために 特定のタンパク質に必要とされるビルディングブロックを提供する）ビタミン、 さらに多くの他のものが挙げられる。さらに最近、オリゴヌクレオチドの形態の 治療剤は、遺伝子レベルで、全てのタンパク質の合成を制御する青写真または機 構を変えることにより、タンパク質機能を間接的に発生させるか、制御するか、 またはさもなければ衝撃を与えるように設計されている。各遺伝子は特定のタン パク質の 多数のコピーを作るのに必要な情報を含むので、個々のこれらの核酸治療剤は標 的タンパク質との直接的相互作用に頼る伝統的な巨大分子薬となるより、その間 接的相互作用を通して多くのタンパク質分子に影響を及ぼしうる。 核酸治療化合物は、多くの異なる方法で作用することができるが、２つのカテ ゴリーの内のいずれか１つに入るのが最も一般的である。第１のカテゴリーとし ては、ある種の方法で所望の遺伝的作用をまねるまたは高めるオリゴヌクレオチ ドが挙げられる。この型の核酸治療化合物に刺激される活性は、一般的に「遺伝 子治療」と呼ばれる。第２のカテゴリーの核酸治療化合物としては、核酸治療化 合物が望ましくないタンパク質の生成を阻害する抑制性オリゴヌクレオチドが挙 げられる。一般的にこのサブクラスに割り当てられる化合物は真正な「アンチセ ンス」法で常に作用するわけではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 抑制性核酸治療化合物のサブクラスを形成する。この２つのカテゴリーの治療用 オリゴヌクレオチドに加えて、核酸治療化合物が、伝統的治療薬とほどんど同じ 方法で標的タンパク質に直接的に相互作用する可能性があることも注目すべきで ある。 真正なアンチセンス相互作用は、結果として単独で、または他の試薬（例えば 、ＲＮＡｓｅのような酵素）と組み合わせて形成されるその複合体が遺伝子情報 をタンパク質に翻訳するテンプレートとしてもはや機能しえないような配列特異 的方法で、選択された核酸標的（例えば、ウイルス性ＲＮＡまたは他の望ましく ない遺伝子メッセージ）と相補的なオリゴヌクレオチド（したがって、「アンチ センス」）のハイブリダイゼーションに関与する。他の抑制性オリゴヌクレオチ ドは、標的配列と必ずしも相補的でない配列を有するが、アンチセンスオリゴヌ クレオチドのように、望ましくない遺伝子材料の発現（例えば複製および／また は翻訳）を干渉する可能性を有する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、外来 遺伝子（例えば、ＨＩＶのようなウイルス性遺伝子）の発現、または内在性遺伝 子（例えば、突然変異した癌遺伝子として異常に発現される通常の遺伝子）の異 常発現に干渉するように設計されてもよい。これらの望ましくない遺伝子メッセ ージは、ウイルス性感染および癌腫を含めた多くの病状に関与する。抑制性オリ ゴヌクレオチドは、伝統的な医薬の方法でのように疾患の進行の後期段階で生じ たタンパク質を攻撃するより、むしろ早期複製および発現段階で病 状を治療的に停止する可能性を増大させる。 遺伝子治療で使用されるオリゴヌクレオチドは、患者においてはないか、さも なければ弱められている所望の効果を示すオリゴヌクレオチドまたは合成遺伝子 を提供するように設計される。体の構造または機能のいずれかに寄与する特定の タンパク質を作るのは、ヒトの体に正常に存在する各遺伝子による。この遺伝子 が不完全であるか、または不在の場合、タンパク質合成は不完全であるかまたは 生起せず、そして奇形または遺伝子疾患を生じる。核酸治療化合物を患者の細胞 の遺伝子材料に組み込むのは、レトロウイルスのような伝搬体を通して遂行され て、その結果必要とされるタンパク質を生成することができる。 核酸治療化合物が、遺伝子治療、アンチセンス治療、または遺伝子または他の レベルでタンパク質に影響を及ぼすことが望まれる他の任意の状況に用いられる かどうかを問わず、これらの合成オリゴヌクレオチドの設計は、達成できる成功 の水準に対する鍵である。特に、これらのオリゴヌクレオチドは、ヒトまたは動 物の体に内在する種々のヌクレアーゼの存在下で生き延びるようにオリゴヌクレ オチドにヌクレアーゼ耐性を与える方法で通常に修飾されなければならない。未 修飾の治療用オリ ゴヌクレオチドを分解できるヒトの体に存在する同じ外在性ヌクレアーゼがヒト 血清にも存在し、これらのサンプル中の未修飾のオリゴヌクレオチドプローブも 分解できるので、同じものが、血清サンプルの分析に使用されるオリゴヌクレオ チドプローブに有効である。 特に、未修飾（または「野生型」）オリゴヌクレオチドは、完成したオリゴヌ クレオチド中で個々のヌクレオシド単位を互いに連結するヌクレオチド間結合の ３’−および５’−位の両方でのヌクレアーゼ分解に影響を受けやすい。従って 、治療用オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を与える試みは、このヌクレオ チド間結合の修飾に向けられ、そしてその結果首尾よく天然に生じるホスホジエ ステル結合で「非架橋」酸素原子の修飾について最初に達成された。(例えば、 硫黄原子で置換された１つの非架橋酸素を有するホスホルチオエート修飾オリゴ ヌクレオチド（米国特許第３８４６４０２号）および双方とも硫黄原子で置換さ れた非架橋酸素を有するホスホルジチオエート修飾オリゴヌクレオチド（米国特 許第５２１８１０３号）)。しかし、ホスホルチオエート修飾オリゴヌクレオチ ドは、特に、ヌクレオチド間結合の開裂を伴う５’−ホスフェートを遊離す るヌクレアーゼにより、ある例では修飾ヌクレオチド間結合の３’位でヌクレア ーゼ分解に対する影響の受けやすさを残すことが観察されてきた。これは、おそ らくホスホジエステル結合中の「非架橋」酸素原子の内のただ１つが修飾された からである。 治療用または診断用オリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性を付与する他の試 みは、天然に生じるホスホジエステル結合で「架橋」酸素原子の修飾をすること に向けられ、その結果ある種限定されながらも、成功してきた。例えば、単一の ３’−メチレン置換（すなわち、３’−架橋酸素がメチレン（−ＣＨ₂−）基で 置換される）を含有するオリゴヌクレオチドの合成が報告されてきた。ハイネマ ンらのニュークレイック アシッズ レス．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ ｅｓ．）１９、４２７−４３３（１９９１）。しかし、ヌクレオチド間結合を発 生すると報告された溶液ベースのホスホルトリエステル法が必要とされるヌクレ オシド中間体の合成は、時間と手間がかかり、それによりオリゴヌクレオチドの 複雑な３’−メチレン修飾の合成を困難かつ冗長にする。その結果として、３’ −メチレン結合を含むオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ安定性が、 ごく最近報告されたにすぎない。（同時継続米国特許出願連続番号０８／２２１ ４２５を参照。） 架橋ホスホルアミデイト結合（すなわち、５’−酸素または３’−酸素が、ア ミノ（−ＮＨ−）基に置き換えられる）を含有する修飾オリゴヌクレオチドが合 成された。グリアズノフらのニュークレイック アシッズ レス．（Ｎｕｃｌｅ ｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２０、３４０３−３４０９（１９９２）およびマ グらのテトラヘドロン レット（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．）、３３ 、７３２３−７３２６（１９９２）。同様に、３’−チオ架橋結合（硫黄原子で 置換された３’−架橋酸素）を含有する修飾オリゴヌクレオチドが合成された。 コッスチックらのニュークレイック アシッズ レス．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ．）１８、８２９−８３４（１９９０）；ベイルらのバイオケミ ストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍiｓｔｒｙ）、３１、３０１２−３０１８（１９９２ ）。アミノまたは硫黄部分による３’−酸素の修飾は、ヌクレアーゼ分解に対し てある程度の耐性を授けることが分かったが、おそらく「架橋」酸素のただ１つ への単一の修飾では顕著なヌクレアーゼ耐性を授けるのに不十分である（すなわ ち、上述のホス ホルチオエート修飾に類似する）ので、ホスホルアミデイトおよび３’−チオ架 橋修飾オリゴヌクレオチドが、修飾ヌクレオチド間結合の分解への影響の受けや すさを残すことが観察された。 単一の５’−チオ架橋置換（硫黄原子で置換された５’−架橋酸素）を含む修 飾オリゴヌクレオチドの合成も報告されている。マグらのニュークレイック ア シッズ レス．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１９、１４３７−１ ４４１（１９９１）。しかし、所望の修飾ヌクレオチド間結合の形成を完了する ことが要求される脱保護反応は５’−チオール部分からトリチル保護基を開裂す るのに銀または水銀塩を使用するので、この方法は単一の５’−チオ架橋結合を １つ以上有する修飾オリゴヌクレオチドの合成に適合しない。これらの塩は、オ リゴヌクレオチド内に先に形成されたＰ−Ｓ結合全てを必然的に開裂もする。多 重５’−チオ架橋修飾を含む修飾オリゴヌクレオチドを作る他の公知の液相法は 、ホスホジエステル技術に基づき、オリゴヌクレオチドの自動化された重合体サ ポート合成には適合しない。さらに、「架橋」酸素のただ１つが修飾されるので 、５’−チオ架橋修飾だけでは、核酸治療用に使用 するオリゴヌクレオチドに十分なヌクレアーゼ耐性を付与することは望めない。 核酸治療用化合物としてまたは診断用プローブとして使用するのに適切な長さ の別のジチオ修飾オリゴヌクレオチドを得ること、さらに修飾オリゴヌクレオチ ドにヌクレアーゼ耐性を付与することができるチオ架橋修飾結合の型を得ること が望ましい。 したがって、本発明の目的は、少なくとも１つのヌクレオチド間結合の５’− 位に硫黄置換を有するジチオ修飾オリゴヌクレオチドを提供することである。 本発明の他の目的は、１つまたはそれ以上のヌクレオチド間結合の５’−架橋 硫黄置換を有するオリゴヌクレオチドを合成するための重合体サポート法を提供 することである。 本発明のさらに他の目的は、５’−チオ架橋修飾を有するオリゴヌクレオチド を合成するために使用する新規ヌクレオシド中間体を提供することである。 発明の要約 本発明は、ヌクレオチド間(internucleotide)結合の５’−位で架橋酸素原子 が硫黄原子に置き換えられ、そして天然に生 じるホスホジエステル結合の少なくとも１つの非架橋酸素原子も、硫黄原子で置 き換えられた、少なくとも１つのヌクレオチド間結合を有するヌクレアーゼ耐性 オリゴヌクレオチドを提供する。５’−ジチオエートおよび５’−チオエート修 飾オリゴヌクレオチドを作製する方法および中間体も提供される。本発明の修飾 オリゴヌクレオチドは、核酸治療、プローブ診断の分野、またはヌクレアーゼ耐 性オリゴヌクレオチドが望まれるかまたは有益である全ての他の用途に使用され うる。 図面の簡単な説明 図１は、５’−チオホスホルアミダイトシントンを重合体サポートヌクレオチ ドの３’−末端に結合させることを通して５’−ジチオ修飾結合の合成を示す。 図２は、通常でない５’→３’への方向で重合体サポートホスホルアミダイト 化学を通して本発明の５’−ジチオ修飾ヌクレオチド間結合を発生するのに使用 される５’−チオホスホルアミダイトシントンの合成を示す。 図３は、本発明の５’−ジチオエート結合を作るＨ−チオホスホネート法に使 用される２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）ヌクレオシド中間体の合 成の図式である。 図４は、保護２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシト リチル）ヌクレオシドを固相支持体に付着させることを達成する他の方法を示す 。 図５は、温和な酸条件下、塩化アリールスルフェニルの存在下で５’−チオー ル部分（ジメトキシトリチルチオチミジン）から４，４’−ジメトキシトリチル 保護基を除去し、不斉２，４−ジニトロスルフェニルジスルフィド（ジニトロベ ンゼンスルフェニルチオチミジン）を発生させることを示す。そして、生じる不 斉２，４−ジニトロスルフェニルジスルフィドをさらに２つの異なる型のＨ−メ チルホスホネートシントンとカップリングさせて、５’−チオ架橋または５’− ジチオエート修飾２量体を発生させることも示す。 図６は、ヌクレオシド３’−メチルハイドロジェンホスホネート中間体を使用 して、３’−５’の方向でジチオ修飾ヌクレオチド間結合を重合体支持（サポー ト）合成することを示す（Ｈ−チオホスホネート法）。 図７は、１７個全ての５’−ジチオ修飾ヌクレオチド間結合を有する十分に修 飾された重合体チミン１８−マーオリゴヌク レオチドの³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを示す。 図８は、５つの５’−ジチオ修飾ヌクレオチド間結合を３’−末端に有する部 分的に修飾された１１−マーオリゴヌクレオチドの³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを示 す。 図９は、血清の存在下で修飾および未修飾のオリゴヌクレオチドの相対的分解 比を示すグラフである。 図１０は、蛇毒ホスホジエステラーゼの存在下で修飾および未修飾のオリゴヌ クレオチドの相対的分解比を示すグラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、核酸治療および診断に有用なヌクレアーゼ耐性５’−ジチオ修飾オ リゴヌクレオチドを提供する。これらの新規オリゴヌクレオチドは、５’−位で の酸素原子（５’−架橋酸素）および天然のホスホジエステル結合の少なくとも １つの非架橋酸素原子の両方が、独立に単一の硫黄原子で置き換えられた、少な くとも１つの５’−ジチオエート結合を含有する。そして本発明は５’−ジチオ 修飾および５’−チオ修飾オリゴヌクレオチドを作製する方法にも関係する。重 合体支持合成によりこれらの修飾オリゴヌクレオチドを作る際に有用な新規単量 体ヌ クレオシドおよびヌクレオチド中間体も、本発明の範囲内に入るよう意図される 。 ホスホジエステル結合における対応の酸素原子を５’−架橋硫黄原子および少 なくとも１つの非架橋硫黄原子の両方で置換することは、生じる修飾５’−ジチ オエート結合をキラルにし、その結果この特定の結合の異性体の混合物になるの で全く価値がない。しかし、ホスホジエステル結合の両方の非架橋酸素原子が硫 黄原子で置き換えられると、本発明の５’−ジチオエート結合は自然に生じたホ スホジエステルヌクレオチド間結合と同じアキラル特性を残す。５’−ジチオ修 飾結合の特定の形態のキラリティに係わらず、本発明の５’−ジチオエート結合 は、修飾オリゴヌクレオチドに、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡに対する顕著な水準 の結合アフィニティおよび配列特異性を残させる保存的修飾である。これは重要 な特色であるが、それはこれらの特徴が本発明の５’−ジチオエートオリゴヌク レオチドの種々の意図された用途にしばしば利用されるからである。 例えば、核酸治療用および診断用プローブアッセイについての伝統的なアンチ センスアプローチの場合に、修飾オリゴヌク レオチドはその注目の治療または診断標的とハイブリダイズすることが必要であ る。（例えば、伝統的なアンチセンス治療の場合に疾患の状態に関与したウイル スのｍＲＮＡまたは遺伝子に修飾オリゴヌクレオチドをハイブリダイスすること 。）したがって、修飾オリゴヌクレオチドがそれに対応する標的とハイブリダイ ズするときに形成された二重ラセンの安定性は、（５’−ジチオエート修飾によ り付与されるヌクレアーゼ安定性に加えて）重要である。 本発明の理解のために、ここで使用される場合、以下の語句は、下記に明示さ れる定義を示す。 「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも２つのヌクレオシド単位よりなる重合 体であることを示し、ここで個々のヌクレオシド単位の各々は、単一の燐部分を 通して少なくとも１つの他のヌクレオシド単位に共有結合している。自然に生じ るオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド単位間の共有結合は、ホスホジエス テル結合である。それにもかかわらず、ここで使用されるとおり「オリゴヌクレ オチド」という用語は、以下の（１）ヌクレオシド単位間でのホスホジエステル 結合、（２）個々の ヌクレオシド単位自身、および／または（３）ヌクレオシド単位の部分であるリ ボース、または糖の内の任意の１つまたはそれ以上について（天然に生じるオリ ゴヌクレオチドに対比して）修飾されるオリゴヌクレオチドを含む。 特に断りがない限り、「塩基」または「核酸塩基」の語は、アデニン、グアニ ン、シトシン、チミンおよびウラシルのようなプリンまたはピリミジン、並びに ５−メチルシトシンおよび５−プロピニルピリミジンのようなこれらの塩基の修 飾型を示す。 「ヌクレオシド」の語は、５−炭糖の１’−位に共有結合した塩基からなる個 々の単量体ヌクレオシド単位を示す。５−炭素糖は、デオキシリボース、リボー スまたはアラビノースのような一般に天然に生じる糖であり、２’−フルオロ− ２’−デオキシリボースや、糖の環で酸素原子を炭素基で置換している炭素環糖 （すなわち、６−炭素類似体）でさえ含むが、これに限定されるものではない、 ５−炭素糖やそれらの修飾形態でありうる。典型的に、塩基は、アデニン、グア ニンおよび他のプリンのＮ９、又はシトシン、チミン、ウラシルおよび他のピリ ミジンのＮ１のように常套の位置で糖部分に結合する。 「ヌクレオチド」は、糖の３’−または５’−位のいずれかでヌクレオシドの 糖部分に共有結合した燐部分を更に有する単量体ヌクレオシド単位を示す。 「修飾ヌクレオチド間結合」は、自然に生じるオリゴヌクレオチド中で個々の ヌクレオシド単位を結び付けるホスホジエステル結合の修飾を示す。 「修飾オリゴヌクレオチド」の語句は、特に少なくとも１つの修飾ヌクレオチ ド間結合を有するオリゴヌクレオチドを示す。 「部分的に修飾されたオリゴヌクレオチド」の語句は、少なくとも１つであっ て、全部よりは少ないヌクレオチド間結合が修飾されている修飾オリゴヌクレオ チドを意味する。 「完全に修飾されたオリゴヌクレオチド」の語句は、全てのヌクレオチド間結 合が修飾されている修飾オリゴヌクレオチドを意味する。 「５’−チオエート」ヌクレオチド間結合または「５’−チオエート修飾」結 合の語句は、５’−位の酸素原子が硫黄原子で置換されているヌクレオチド間結 合を意味する。 「５’−ジチオエート」ヌクレオチド間結合または「５’−ジチオ修飾」結合 の語句は、ホスホジエステルヌクレオチド結合の５’−位の酸素原子および少な くとも１つの非架橋酸素原子が各々独立に単一の硫黄原子で置換されているヌク レオチド間結合を意味する。したがって、ここで定義される場合、「５’−チオ エート結合」は、５’−トリチオエート結合、すなわちホスホジエステル結合中 の両方の非架橋酸素原子が硫黄原子で置換されている場合を含む。 「５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチド」または５’−ジチオエートオリゴヌ クレオチド」の語句は、少なくとも１つの５’−ジチオエート結合を有するオリ ゴヌクレオチドを示す。 「標的配列」は、オリゴヌクレオチドまたは修飾オリゴヌクレオチドがハイブ リダイズするように設計されているヌクレオチド配列を示す。抑制性オリゴヌク レオチドの場合、「標的配列」は、ウイルスのタンパク質、癌関連タンパク質ま たは疾患状態に関与したその他のタンパク質をコードする自然に生じるメッセン ジャーＲＮＡであってよいが、これに限定されるものではない。 特に、本発明の５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドは、以下に示されるとお り少なくとも１つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合を有する。 この構造で、Ｃ₁およびＣ₂は、それぞれ、本発明の５’−ジチオ修飾ヌクレオ チド間結合を通して、オリゴヌクレオチド中で一緒に連結されるヌクレオシド単 位の３’−位および５’−位を表す。 この５’−ジチオエート修飾ヌクレオチド間結合を、以下の構造に関してさら に十分に記述し、これは、さらに詳細にはこの特定の結合を囲む個々のヌクレオ シド単位を示す。 このオリゴヌクレオチド構造について、Ｂは、プリンまたはピリミジン塩基、 特にアデニン、グアニン、シトシンまたは（ＤＮＡの場合には）チミン、あるい は（ＲＮＡの場合には）ウラシルである。Ｚは、Ｂがオリゴヌクレオチドの末端 塩基である場合には水素（−Ｈ−）原子、あるいはオリゴヌクレオチドの次のヌ クレオチド間結合では燐原子のいずれかである。Ｒ⁴は、一般的に（ＤＮＡの場 合には）水素（−Ｈ−）原子であるか、または（ＲＮＡの場合、あるいは骨格に アラビノー ス単位を有するオリゴヌクレオチドの場合）ヒドロキシル（−ＯＨ−）部分であ るが、他の５−炭素糖がオリゴヌクレオチドの骨格に使用される場合にフッ素（ −Ｆ−）のような他の原子または部分であってもよい。Ｙは一般に酸素原子（− Ｏ−）であるが、（１）出発物質として使用されるヌクレオシドが３’−修飾を 有すかいなか、および（２）オリゴヌクレオチド合成に使用される方法によって 、他の原子または二価の置換基（例えば、硫黄（−Ｓ−）、メチレン（−ＣＨ₂ −）、または置換メチン（−ＣＨＲ−））のような部分であってもよい。 一般に、Ｘは、酸素（ただ１つの非架橋酸素原子の代わりに硫黄置換を有する 本発明のさらに典型的な５’−ジチオエート結合の場合）であるか、または硫黄 原子（ここに定義されるとおり、５’−ジチオエート結合の５’−トリチオエー ト形態の場合）である。Ｘは、必要であれば、完成したオリゴヌクレオチドの合 成に使用される中間体の中で燐原子で行われる置換により、アルキル基（例えば 、メチルまたは置換アルキル鎖）であってもよい。Ｍは、一般的にナトリウム、 カリウムまたはトリエチルアンモニウムのような陽イオンである。しかし、以下 に記載するとおり、修飾結合した後、保護基を取り除く場合、 Ｍは、アルキル（メチル）または（２−シアノエチルのような）置換アルキル基 であってもよい。 本発明は、さらに上述の５’−ジチオ修飾結合を含有するオリゴヌクレオチド を作る迅速で効果的な重合体支持法を提供する。これらの方法は、５’−チオエ ート結合の合成に使用することもでき、伝統的な重合体支持技術によって作られ る非修飾オリゴヌクレオチドに匹敵する長さの修飾オリゴヌクレオチドを作るの に適合できる。このことは、重要であるが、それはおよそ１０〜１２塩基または それより長いオリゴヌクレオチドは一般に大腸菌のようなサンプルゲノムに対す る配列特異的プローブとして使用するために必要とされるからである。より長い オリゴヌクレオチド生成物の溶融温度（Ｔｍ）は、この点でまたはこの点より上 で同じ値に集中するので、およそ６０ヌクレオチド塩基の上限が等温プロセスの ため確立される。一方、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的温度で有 効であり、そして一般には約１５〜２５ヌクレオチド長である。一般に、この範 囲内のより長いアンチセンスオリゴヌクレオチドが望ましいが、それは、それら が大きなゲノムで偶然に生じる可能性がより低いからである。例えば、１７−マ ーのオリゴヌクレオ チドは、哺乳類ゲノムに特徴的（ユニーク）であるにちがいない。一方、アンチ センスオリゴヌクレオチドが長すぎれば（すなわち、２５ヌクレオチドより実質 的に長い）、他の非標的配列と非特異的にハイブリダイズし得る。この型の非特 異的ハイブリダイゼーションは不可避であるが、それは患者の生理学的体温がス トリンジェンシーを増大するように調整されることができないからである。 本発明の５’−ジチオエートオリゴヌクレオチドは、本発明の教示に従い、業 界で通常に熟練した者に明白になる多数の方法の内の任意の１つで合成できる。 一般に、２つの望ましい合成法があり、そしてその両方は、所望の修飾オリゴヌ クレオチド生成物の途中で新規単量体ヌクレオシド単位を使用する。これらの方 法は、常套でない（５’→３’）合成（第１法、すなわち、ホスホルアミダイト 法の場合）または常套の（３’→５’）方向の合成（第２法、すなわち、新規ヌ クレオシド３’−アルキルハイドロジェンホスホネートまたはヌクレオシド３’ −アルキルチオホスホネート中間体を使用するＨ−ホスホネート法の場合）を用 いてもよい。 本発明の５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドを作る第１の 望ましい方法は、伝統的なホスホルアミダイト技術を活用するが、しかしほとん ど一般的に使用されていない５’→３’方向の合成を進行させる。自動化ホスホ ルアミダイト法に使用される５’−チオホスホルアミダイトシントンを以下に示 す。 ＮＲ₂＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノまたはピロリジノ ＤＭＴｒ＝４，４’−ジメトキシトリチル このチオホスホルアミダイトシントンは、図１に示されるとおり、この単量体 単位を成長する重合体支持オリゴヌクレオチド鎖に結合させることにより、５’ −架橋硫黄原子を所望のオリゴヌクレオチド生成物に組み込む。結合反応は、常 套のヌクレオチドシントンを、非修飾結合が望ましい、成長するオリゴヌクレオ チド鎖に結合するために市販の５’−ホスホルアミダイトを単に使用することに より、（５’−ジチオ修飾結合と非修飾ホスホジエステル結合の両方を含む）部 分的に修飾された ５’−ジチオエートオリゴヌクレオチド、さらに、完全に５’−ジチオ修飾され たオリゴヌクレオチドを発生するのに使用できる。 通常、オリゴヌクレオチドの重合体支持合成は、出発点として固体支持体に付 着されたヌクレオシドを通して開始される。最も一般的には、第１のヌクレオシ ドはヌクレオシドの３’−酸素に付着し、そしてその合成は３’−ホスホルアミ ダイトを使用して３’−５’方向で起こる。しかし、本発明のチオホスホルアミ ダイト法によれば、ほとんど一般的に使用されていない５’−３’方向で合成が 進行する。それにもかかわらず、市販の５’−結合固体支持体は、最初の結合反 応に使用できる。上記のとおり、５’−チオホスホルアミダイトシントンは、所 望のオリゴヌクレオチド最終生成物の重合体支持合成の間に、容易に入手可能な ５’−ホスホルアミダイトシントンに所望されるとおりに入れ替えることができ る。 図２で概略される合成スキームによって、本発明のホスホルアミダイト法に使 用される５’−チオホスホルアミダイトシントンの合成が完了されるのが好まし い。このスキームは、単量体２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル） ヌクレオ シド中間体がまず第１に得られることを必要とする。この単量体ヌクレオシド中 間体は、２つの方法の内の１つにしたがって作られることが好ましい。 単一段階を使用するので、第１の方法がより好ましい。この方法で、商業的に 入手可能なヌクレオシドは、当業者に公知の方法にしたがって、位置選択性ミツ ノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ）カップリング反応でチオ酢酸と反応され、それによ って、１級アルコールであるヌクレオシドの５’−ヒドロキシル基は、カップリ ング反応に関係しない２級３’−ヒドロキシル基の存在下でチオール酢酸と選択 的に反応する。（ミツノブのオルグ．シンセシス（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ）、１−２８（１９８１）、カワイらのキャン．ジェイ．ケム．（Ｃａｎ．Ｊ． Ｃｈｅｍ．）、７０、１５７３−１５８０（１９９２）参照。） チオール酢酸との２’−デオキシヌクレオシドの反応は、トリフェニルホスフ ィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレートの存在下で起こり、予め２級 ３’−ヒドロキシル官能性を保護する必要なく、０℃で、すばらしい収量の２’ ，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−ヌクレオシドを穏やか に生成し、それはもちろん合成段階の数を増加する。 代わりに、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）ヌクレオシドは 、２段階手段にしたがって行われてもよく、その結果、２’−デオキシヌクレオ シドの５’−ヒドロキシル基が、最初にトシレートに変換され、次いでチオール 酢酸カリウムとの反応により中間体トシレートが実質的に置き換えられる。（レ イストらのジェイ．オルグ．ケム．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、２９、５５４ −５５８（１９６４）参照。） ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）ヌクレオシド中間体（上述 の２つの方法のいずれかから得られる）の３’−アルコールは、その後塩化４， ４’−ジメトキシトリチルで保護され、その後塩基を用いた注意深い処理により アセチル基を取り除き、そして生じた２’，５’−ジデオキシ−５’−メルカプ トヌクレオシドをホスフィチル化(phosphitylated)して、５’−チオホスホルア ミダイトシントンを得る。 常套のヨウ素酸化段階を硫黄酸化反応で置換するサイクルの簡便な修飾は、本 発明の５’−ジチオエート結合に第２の（すなわち、非架橋）硫黄原子を生じる 。 固相合成の間、多様な酸化プロトコールを組み合わせてホス フィチル化段階で異なるホスフィンを使用することにより、同じ２，５’−ジデ オキシ−５’−Ｓ−ヌクレオシドからトリホスホルアミダイト法を用いて、ヌク レオチド間結合の他の位置に置換を含む５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドを 合成することができる。 本発明の５’−ジチオエート修飾オリゴヌクレオチドを作るための第２の好ま しい方法は、いっそう一般的に使用される３’→５’方向で行われるが、所望の Ｐ−Ｓヌクレオチド間結合を形成するために、常套の重合体支持オリゴヌクレオ チド合成でカップリング反応の極性を逆転する。常套のホスホルアミダイトまた はＨ−ホスホネートオリゴヌクレオチド合成技術にしたがって、適切なヌクレオ チドシントンおよび重合体支持オリゴヌクレオチド鎖の末端塩基の間のカップリ ング反応で、ヒドロキシル基は、求核試薬として働き、燐中間体は求電子試薬と して働く。特に、（１）ホスホルアミダイト技術の場合にテトラゾール触媒反応 、または（２）常套のＨ−ホスホネート化学の場合に縮合反応のいずれかで、ヒ ドロキシル基は求核試薬として働き、一方燐中間体は求電子試薬として働く。 最も一般的に、常套のホスホルアミダイト化学が用いられ、 それによりカップリング反応での求核性ヒドロキシル基は、３’−重合体支持ヌ クレオチド塩基の５’−ヒドロキシル基であり、そして単量体シントンは、３’ −ホスホルアミダイトヌクレオシドである。あまり一般的に使用されないＨ−ホ スホネート化学で、求核性のヒドロキシル基はそれでも３’−重合体支持ヌクレ オチド塩基の５’−ヒドロキシルであるが、単量体シントンは、ヌクレオシド３ ’−Ｈ−ホスホネート塩である。後者の場合に、３’−Ｈ−ホスホネート塩は、 ５’−ヒドロキシル求核試薬と反応できる前に、縮合剤（例えば、ピバロイルク ロライド、ピリジン）の使用により活性化される必要がある。 もちろん、ヌクレオチド間結合を合成する他の公知方法はあるが、これらの他 の方法は、オリゴヌクレオチドの自動化固相合成で一般的には使用されない。そ れにもかかわらず、これらの他の方法は、所望の反応で求電子試薬としてヌクレ オチド間結合の燐原子を同様に使用する。例えば、オリゴヌクレオチド合成攻略 法でのアルキルヌクレオシド３’−ハイドロジェンホスホネートの以前の用途は 、燐原子での塩素化によるこれらの中間体の活性化を包含し、それにより燐原子 は、ヌクレオチドシントンの求核性５’−ヒドロキシル基との反応で、なお求電 子試薬として働く。 これらの公知方法に対して、本発明にしたがって新規塩基触媒反応を使用して 、成長するオリゴヌクレオチド鎖の重合体支持の末端ヌクレオシド単位とこの合 成方法に使用される３’−メチルハイドロジェンチオホスホネートヌクレオシド シントンとの間のカップリング反応を行なう。新規ヌクレオシド３’−メチルチ オホスホネートシントンは以下に示される。 本発明の新規塩基触媒反応にしたがって、塩基は３’−メチルチオホスホネー トシントンからの水素原子の引抜きに影響を与え、そしてそれは燐原子を求核試 薬として働かせる。ここで、シントンの求核性（活性化）燐原子は、この反応で 求電子試薬として働く３’−重合体支持ヌクレオチド塩基の５’−Ｓ−スルフィ ドまたは５’−ジスルフィドと反応する。ここに記述さ れる塩基触媒カップリング反応は、不斉ジスルフィドとホスファイトとのすでに 公知のミカエリス−アルブゾフ反応に比べ、溶液では驚くべきほど速い。（ベイ ルらのテトラヘドロンレターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、 ３３、３０１７−３０２０（１９９２） （反応を完了させるのに室温で１６時 間必要とされる）。） 本発明の第２の好ましい（Ｈ−チオホスホネート）合成方法で、カップリング 反応に使用される単量体サブ単位またはシントンは、ヌクレオシド３’−アルキ ルハイドロジェンホスホネート（本発明の新規チオ−（−Ｓ−）または５’−チ オ架橋結合についての酸素（−Ｏ−）基）である。塩基触媒下で、これらの単量 体アルキルハイドロジェンホスホネートシントンは、合成されるべきオリゴヌク レオチド鎖の重合体支持末端ヌクレオシド単位の反応性不斉ジスルフィドと反応 する。 本発明の新規ヌクレオシド３’−メチルハイドロジェンホスホネートシントン は、水（Ｈ₂Ｏ）／テトラゾールまたは硫化水素（Ｈ₂Ｓ）／テトラゾール試薬を 市販のメチル（−Ｍｅ−）ホスホルアミダイトと反応させ、重合体支持合成の間 に、成長するオリゴヌクレオチド鎖にカップリングするための単量体シ ントンを生成することにより容易に作られる。単独の５’−チオ架橋ヌクレオチ ド間結合の場合に、テトラゾールの存在下で水でヌクレオシド３’−メチルホス ホルアミダイトを加水分解すると、対応の３’−メチルホスホネートを生じる。 （類似の手段の説明として、ガレグらのケミカ スクリプタ（Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ）、２６、５９−６２（１９８６）、およびグリアゾノフらのニ ュークレイック アシッズ レス．（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．） 、２０、３４０３−３４０９（１９９２）を参照。）同様に、５’−ジチオエー ト修飾結合について、テトラゾールの存在下でのヌクレオシド３’−メチルホス ホルアミダイトのヒドロスルフェノリシスは、以下に示すとおり対応の３’−メ チルチオホスホネートを与える。 先に記述したチオホスホルアミダイト法にしたがって合成す る場合に、Ｈ−チオホスホネート法による修飾オリゴヌクレオチドの重合体支持 合成は、出発点として固体支持体に付着したヌクレオシドを通して開始される。 硫黄がヌクレオシドの５’−位で酸素を置換する場合では、Ｈ−チオホスホネー ト法は、常套でない塩基触媒化学にしたがって進行するので、市販の３’−結合 固体支持体は適切でなく、そして第１のヌクレオシド単位（すなわち、２’，５ ’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヌクレオシド）は 、ヌクレオチド間結合が形成される前に適切な固体支持体に付着させなければな らない。 ２’，５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヌクレ オシドを得るための合成スキームは、図３に図示されている。最初に、塩化４， ４’−ジメトキシトリチルを、チオール酢酸と反応させて、４，４’−ジメトキ シトリチルチオールアセテートを発生させ、それはその後、塩基（ナトリウムメ トキシド）で処理して、４，４’−ジメトキシトリチルナトリウムチオレート塩 を生成する。その後、生じたナトリウムチオレートを、当業界で公知の方法にし たがって製造された２’−デオキシヌクレオシドの５’−Ｏ−（トシレート） と反応させる。（例えば、レイストらのジェイ．オルグ．ケム．（Ｊ．Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．）、２９、５５４−５５８（１９６４）参照。）この反応も図２に示 されるとおり、本発明のＨ−チオホスホネート法のために必要とされる２’，５ ’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヌクレオシド中間 体を生じる。 固体支持体への５’−保護チオールヌクレオシドの付着は、確立された合成法 にしたがって未保護３’−位の誘導化を通して完了することができる。好ましい 固体支持体は制御された多孔性ガラスであるが、他の固体支持体が当業界で公知 であることが認められ、そして本発明の方法による合成に適している。固体支持 体への第１のヌクレオシドの付着は、常套のスクシニルまたはサルコシニルリン カーを使用して達成されうるが、これらの試薬を使用する反応に限定されるもの ではない。具体例として、無水コハク酸での３’−ヒドロキシルの誘導化、次い でジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）−ｐ−ニトロフェノールでの活性 化、そしてその後図４に示されるとおり、活性化樹脂と３’−ヒドロキシルとの 反応と同様にアミノ誘導ＣＰＧとの反応が行われる。代わりに、２’，５’−ジ デオキ シ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヌクレオシドの３’−ホスホ ルアミダイトがさらに図４に示されるとおり使用される条件で、３’−固着ヌク レオシドを含む市販のＣＰＧ支持体を使用できる。その後、生じた適切に誘導体 化された固体支持体が使用されて、常套のＤＮＡ／ＲＮＡ合成機およびここで記 載されるヌクレオシド３’−メチルハイドロジェンチオホスホネートシントンを 使用して５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドの３’→５’固相合成を開始させ る。 本発明のＨ−チオホスホネート法による５’−ジチオエート結合の重合体支持 オリゴヌクレオチド合成について、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（４， ４’−ジメトキシトリチル）ヌクレオシド官能基の対応する反応性ジスルフィド への変換は、新規で重要な段階である。さらに、固相合成法によってこれらの反 応性ジスルフィドをその場で（ｉｎ ｓｉｔｕ）発生する方法を以下に記載する 。 背景説明のため、チオールから得られるＳ−ｔ−ブチルチオエーテル保護基を 除去するための許容される方法が、塩化ｏ−ニトロフェニルスルフェニルでの処 理により、中間体不斉ジスルフィドを形成し、そしてその後水素化ホウ素ナトリ ウムで還 元して、遊離チオール部分を得ることができることは全く価値がないことを最初 に述べる。（グリーンズ プロテクティブ グループス イン オーガニック ケミストリー（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉ ｎ Ｏｇｒａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第２版、２８９ 、ウイレイ（１９ ９１）参照。）Ｓ−トリフェニルメチルチオエーテル（トリチル保護基としても 知られる）の場合、この保護基の除去のため銀または水銀のような金属の存在下 で酸を使用することが必要とされるが、それは酸だけでは、完全には硫黄−炭素 結合を解離しないからである。しかし、金属が成長するオリゴヌクレオチド鎖で 先に形成された任意のＰ−Ｓ結合を開裂するので、これらの金属の使用は、逐次 ５’−ジチオエート結合の固相合成に適さない。４，４’−ジメトキシトリチル 保護基はトリチル基より酸に対して不安定であるので、チオールをより不安定で ある４，４’−ジメトキシトリチル官能基で保護することが好ましく、そのため 塩化アリールスルフェニルの存在と組み合わせた穏やかな酸処理により、中間体 の不斉ジスルフィドの形成を首尾よく促進できる。 したがって、酸処理が２，４−ジニトロベンゼンスルフェニ ルクロリドの存在下で行われて、不斉２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルジ スルフィドを発生するとの条件で、本発明にしたがって、５’−チオール部分か ら４，４’−ジメトキシトリチル基の除去は、穏やかな酸条件下で行い得る。不 斉ジスルフィドを形成するのは、酸溶液に他のチオールまたはジスルフィド、例 えばｐ−ニトロチオフェノールまたは２，４−ジチオビス（５−ニトロピリジン ）を添加することによっても達成できる。 いかなるジチオールまたはジスルフィド試薬の添加なしに、４，４’−ジメト キシトリチル基の部分的除去が穏やかな酸条件下で達成されうること、および得 られる推定された対称ジスルフィドが連続カップリング反応でＨ−ホスホネート シントンと反応できることに注目するのは重要である。しかし、Ｈ−チオホスホ ネートまたはＨ−ホスホネートシントンと対称ジスルフィドとの反応は、この反 応から副生物としてヌクレオシド５’−チオールを形成するために、修飾ヌクレ オチド間結合の収量減少を起こす。その結果として、対称ジスルフィドを形成す るのは、好ましくも望ましくもない。 液相合成として、例えば２’，５’−ジデオキシ−５’−ジ メトキシトリチルチオチミジンを対応するジニトロベンゼンスルフェニルチオチ ミジンに迅速に変換するのは、後に続くクロマトグラフィ精製による生じた不斉 ジスルフィドの分離とともに単一段階で達成できる。ジニトロベンゼンスルフェ ニルチオチミジン二量体の液相合成は図５に示される。２つの異なるＨ−ホスホ ネートシントンとのジニトロベンゼンスルフェニルチオチミジン中間体の反応は 、図５に示されるとおり、ピリジン／ベンゼン溶媒で行うと、修飾二量体のオリ ゴヌクレオチドの生成を起こす。さらに詳細には、単一の５’−チオ修飾ヌクレ オチド間結合の場合に、ピリジン／ベンゼン中でＤＢＵ（１，８−ジアザビシク ロ［５．４．０］ウンデク−７−エン）を触媒として使用すると、溶液中に５’ −チオ修飾二量体の純粋（ｃｌｅａｎ）な形成を起こす。しかし、本発明のさら に複雑な５’−ジチオエート結合が所望される場合、より反応性の高いＨ−チオ ホスホネートシントンを使用することが必要であり、そしてその結果として、ト リエチルアミンが、所望の二量体オリゴヌクレオチドに純粋にそして迅速に変換 させるための塩基として使用されるのが好ましい。 本発明のＨ−チオホスホネート法にしたがった５’−チオエ ートおよび５’−ジチオエート結合の新規固相合成の条件は、一般に２つの段階 を包含する。（図６参照）。開始点として固体支持体に付着した２’，５’−ジ デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヌクレオシドで開始す ると、第１の段階は、組み合わせた脱ブロック（ｄｅｂｌｏｃｋ）／活性化段階 であり、塩化ジニトロベンゼンスルフェニル、ｐ−ニトロチオフェノール、また は２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）のいずれかを含有する２．５％ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の溶液を使用することにより達成される。遊離チオー ルのスルフェニル化（塩化スルフェニルの場合に）により、または交差酸化（ｐ −ニトロチオフェノールまたは２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）の 場合に）により、この反応は、ジメトキシトリチル保護基を除去し、マスクされ ていないチオールをジスルフィドに変換する。塩化２，４−ジニトロベンゼンス ルフェニルで３級炭素チオエーテル保護基を処理することで主要な中間体、すな わち不斉ジスルフィドを与えるので、Ｓ−ｔ−ブチルエーテル、または同様の保 護基もこの第１の段階で首尾よく使用できると考えられる。 いずれの場合にも、脱ブロック／活性化反応を完了まで制御 するため、すなわち、（１）交差酸化（第２の活性化剤がヨウ素／ｐ−ニトロチ オフェノール試薬である場合）、または（２）スルフェニル化（第２の活性化剤 が塩化アリールスルフェニル／トリエチルアミン溶液である場合）のいずれかに より所望の不斉ジスルフィドを形成させるために、固体支持体に活性化剤を２番 目に供給することが要求される。これらの試薬を添加して、任意の残留の望まれ ない支持体結合の対称ジスルフィドまたはチオール部分から所望の不斉ジスルフ ィドの形成を完了する。 この固相合成スキームでの次の段階は、固体支持体固着のジスルフィドを単量 体ヌクレオシド３’−メチルハイドロジェンチオホスホネートまたは３’−メチ ルハイドロジェンチオホスノネートシントンとカップリングすることを包含する 。これらのシントンをトリエチルアミンまたはＤＢＵ溶液と同時に添加して、そ れぞれ５’−ジチオエートまたは５’−チオエート結合を発生する。 この方法が、逐次５’−チオエート（５’−チオ架橋）結合、ならびに５’− ジチオエート結合を合成するのに使用できることに注目するのは重要である。こ の場合、適切な３’−メチル ハイドロジェンホスホネートシントン（第１の結合に対してはＨ−ホスホネート または後者の場合にＨ−チオホスホネートのいずれか）を選択する。図６は、上 述の３’−メチルハイドロジェンホスホネート中間体の使用を通して、これらの ヌクレオチド間結合の重合体支持合成を示す。この合成は、固体支持体およびリ ンカーに適合する。一般的に使用されるサクシニルリンカーがこの強塩基の使用 により開裂されうることが知られているので、サルコシンリンカーはＤＢＵを使 用する場合に必要とされうる。ここに記載した反応の条件下で、ＤＢＵは支持体 から成長するオリゴヌクレオチド鎖を有意に開裂する原因ではなかった。５’− ジチオエート結合の合成について、使用されるトリエチルアミンは常套のリンカ ーおよび支持体に適合できる。 本発明のＨ−チオホスホネート法を使用して、多数の異なる修飾結合が合成さ れうる。例えば、この化学は、ＤＮＡの存在する固相合成に適合できるので、修 飾（例えば、５’−ジチオ）および未修飾（５’−オキシ）結合の両方が、同じ オリゴヌクレオチド配列に導入されうる。５’−ジチオエート結合に隣接する５ ’−オキシ結合を導入することが望まれる場合、２’− デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−メチルハイド ロジェンチオホスホネートは、入ってくるＨ−チオホスホネートヌクレオシド単 量体として使用される。塩基触媒されたカップリング反応を完了の際に、その後 化学を、常套のホスホルアマダイト法を使用し、それが所望の未修飾（「野生型 」またはホスホジエステル）結合のために最も一般的に使用されるのと同じ方向 、すなわち３’→５’でのホスホルアミダイトカップリングに切り替えてもよい 。ホスホルアミダイト試薬の場合、塩基に対して安定なメチルホスホルアミダイ トは、常套の２−シアノエチルホスホルアミダイト代わりに、特にホスホジエス テルヌクレオチド間結合が成長するオリゴヌクレオチド鎖における５’−ジチオ エート結合の形成に優先する場合に使用されるべきである。 本発明のＨ−チオホスホネート法を使用して、ヌクレオチド間結合の他の「架 橋」または「非架橋」位置における置換を含む５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオ チドを合成できる。この場合、修飾ヌクレオシド３’−ハイドロジェンチオホス ホネートシントンを合成することは、非修飾ヌクレオシド３’−ホスホルアミダ イトを使用して開始する。 本発明を理解する助けとするために以下の例が提供され、その真正な範囲は添 付の請求項に記載される。修飾が、本発明の概念から逸脱することなく、記載さ れる手段で行われうることが理解される。 ジェネラル エレクトリック オメガＲ ３００ＮＢ分光機（カリフォルニア 、フレモントのブルーカー インストルメンツに現在支援されるカリフォルニア 、フレモントのジェネラル エレクトリック社）で、プロトン（¹Ｈ）、リン（^{3 2} Ｐ）および炭素（¹³Ｃ）核磁気共鳴スペクトルを３００ＭＨｚ、１２１ＭＨｚ および７５ＭＨｚで各々測定した。化学シフトは、各々プロトンおよび炭素につ いての内部対照としてテトラメチルシランまたは重水化溶媒中の残留クロロホル ムの７．２４ｐｐｍあるいは７７．０ｐｐｍ共鳴を使用して記録される。リンの 化学シフトがリン酸（０ｐｐｍ）の内部対照に関連して記録される。ＮＭＲサン プル標品分析に関して、以下の重水化溶媒を使用した。それは、ｄ−クロロホル ム（ＣＤＣｌ₃）、重水（Ｄ₂Ｏ）、そして必要であればｄ３−メタノール（ＣＤ₃ ＯＤ）およびｄ６−ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ₆）である。 全ての反応は、乾性アルゴンの環境下で乾燥機で乾燥させたグラスウエアー上 で行われた。特にことわりがない限り、市販品から最も品質のよい無水溶媒およ び試薬が得られた。使用の前に以下の試薬を精製した。それは、塩化メチレン（ ＣＨ₂Ｃｌ₂）、ピリジン、トリエチルアミンおよびアセトニトリルは水素化カル シウム（ＣａＨ₂）から蒸留された。ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ メチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は活性化４＝モレ キュラーシーブ上で乾燥させた。メタノールは、マグネシウムターニング／ヨウ 素から蒸留した。テトラヒドロフランは、ナトリウム／ベンゾフェノンケチルか ら蒸留した。使用直前に塩基性アルミナ（ウエルム、アクティビティーＩ）を通 過させて、ｄ−クロロホルム（ＣＤＣｌ₃）を乾燥させた。０℃で、無水エーテ ル中で市販の２−シアノエトキシジクロロホスフィンを１−トリメチルシリルピ ロリドン（２当量）と反応させることにより、ビスピロリジノ２−シアノエトキ シホスフィンを製造した。濾過し、真空中で揮発物を除去した後、ビスピロリジ ノ２−シアノエトキシホスフィン（³¹Ｐ ＮＭＲにより純粋）を使用まで−７８ ℃で貯蔵した。 ＰＦ２５４インディケーター（メルク、番号５５５４）を含む０．２８ｍｍ層 のシリカゲル６０で被覆されたアルミニウムシートを使用することで、分析的薄 相クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を行った。メルク２３０〜４００メッシュのシリ カゲル６０（メルク番号９３８５−９）を使用して、スチルの方法［スチルらの ジェイ．オルグ．ケム．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、３４、２９２３（１９７ ８）］によりフラッシュクロマトグラフィを行った。 実施例１ ５’−デオキシ−Ｓ−（アセチル）−５’−デオキシチミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−Ｓ−（アセチル）−５’−デオキシチミジン の合成を例示する。 新たに蒸留されたピリジン（１００ｍＬで２回）および無水トルエン（５０ｍ Ｌで２回）で共蒸発することで、５．８ｇのチミジン（２３．９ミリモル）を共 沸蒸留的に乾燥させ、さらに真空で一夜乾燥させた。７５ｍＬの新たに蒸留され たテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中にトリフェニルホスフィン（８．１７８ｇ、 ３１ミリモル）を含む溶液を４０分かけて攪 拌しながらアルゴン下で０℃に冷却した。ジイソプロピルアゾジカルボキシレー ト（６．２ｍＬ、３１．５ミリモル）をその冷却溶液に添加した。得られたトリ フェニルホスフィン−ジイソプロピルアゾジカルボキシレート複合体の白色懸濁 液を０℃で４５分間攪拌した。５５ｍＬの無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ ＤＭＦ）および１０ｍＬのＴＨＦ中にチミジン（５．８ｇ、２３．９ミリモル） を含む溶液をその攪拌懸濁液に添加し、さらにチオール酢酸（２．２ｍＬ、３１ ミリモル）を加えて、白色懸濁液を生じ、これは光沢のある黄色溶液に変化した 。この溶液を、氷浴で２ １／２時間攪拌し、その後全ての溶媒を真空中で除去 し、そしてＣＨ₂Ｃｌ₂中の０〜６％のＭｅＯＨの勾配を用いたシリカゲルフラッ シュクロマトグラフィにより、生じた深紅の残渣を精製した。産生物を含む画分 を濃縮し、乾燥させて３．５５ｇ（１１．７９ミリモル、収率４９％）の白色固 体を得た。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ−コージー により、産生物は特徴づけられた。 実施例２ ５’−デオキシ−Ｓ−（アセチル）３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）５’−デオキシチミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−Ｓ−（アセチル）３’−Ｏ−（４，４’−ジ メトキシトリチル）５’−デオキシチミジンの合成を例示する。 無水ピリジン（１００ｍＬで２回）で共蒸発し、そしてその後８０ｍＬのピリ ジンに再溶解させて、実施例１から得られた５’−デオキシ−５’−Ｓ−（アセ チル）５’−デオキシチミジン（３．５５ｇ、１１．７９ミリモル）を乾燥させ た。得られた５’−デオキシ−５’−（チオールアセチル）チミジン／ピリジン 溶液を、塩化４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒＣｌ）（５．２ｇ、１５ ．３ミリモル）および５０ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と反 応させた。反応は、標準シリカゲル薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）により行わ れた。反応時間の１６時間後、さらに２．０ｇのＤＭＴｒＣｌを添加した（５． ９ミリモル）。周囲温度でアルゴン下で３日間攪拌した後、真空中でピリジンを 除去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（３００ｍＬ）に溶解し、１５０ｍＬの飽和ＮａＨＣ Ｏ₃水溶 液で抽出した。有機相を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）で乾燥させ、濾過し て濃縮した。ＣＨ₂Ｃｌ₂中の０〜４％のＭｅＯＨの勾配を用いたシリカゲルフラ ッシュクロマトグラフィにより、粗チオールアセテート産物を精製して、７．０ ｇの純粋産物である光沢のある黄色発泡物を得た（収率９８％）。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ−コージー により、産生物は特徴づけられた。 実施例３ ５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）５’−チオール チミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）５’−チオールチミジンの合成を例示する。 実施例２から得られるチオールアセテート（１．５９ｇ、２．６４ミリモル） を十分に脱気したＥｔＯＨ３００ｍＬに溶解させた。アルゴンをそれに通して通 気しながら、氷浴中で、１時間この溶液を０℃に冷却した。その後８．６ｍＬの １０Ｎ ＮａＯＨ（水性、８６ミリモル）を添加した。０℃で、３時間反応物を 攪拌し、ＴＬＣにより観察した。生成物をエルマン試薬（０．１Ｍ、ｐＨ８トリ ス緩衝液中５％溶液）で、視覚化 した。その後、反応混合物を５００ｍＬのＣＨＣｌ₃および２００ｍＬの飽和Ｎ ａＨＣＯ₃水溶液に注いだ。有機相を無水硫酸ナトリウム（Ｎａ₂ＳＯ₄）上で乾 燥させ、濾過して濃縮した。ＣＨＣｌ₃中の０〜６％のＭｅＯＨの勾配を用いた シリカゲルフラッシュクロマトグラフィにより、生成物を精製して、真空中で一 夜乾燥させた後１．４ｇ（収率９４％）の白色発泡物を得た。チオールがジスル フィドに酸化するのを避けるために、化合物は製造から２４時間以内に使用した 。 所望のチオール化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ− コージーにより、産生物は特徴づけられた。このチオールは、分析用シリカゲル ＴＬＣで実施例２から得られるチオールアセテート化合物、および以下の実施例 ４および５に記載されたジイソプロピルアミノホスホルアミダイドとも一緒に移 行する。しかし、所望のチオール化合物は、エルマン試薬と一緒に塗布すること によりＴＬＣで容易に検出されうる。 実施例４ ５’−デオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）ピロリジノホスホルアミダ イト］−５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジ ンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）ピロリジ ノホスホルアミダイト］−５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシ トリチル）チミジンの合成を例示する。 新たに蒸留された塩化メチレンで共蒸発することで、実施例３から得られた１ ．５４ｇ（２．７５ミリモル）の５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメ トキシトリチル）５’−チオールチミジンを共沸蒸留的に乾燥させた。アルゴン 下で、室温で攪拌しながら、３６ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂中にメルカプトチミジンを含 む溶液（２グラニュールの乾燥４Åシーブを含む）を、１．０１ｇ（４．１９ミ リモル）のビスピロリジノ−２−シアノエトキシホスフィン、および無水アセト ニトリル中にテトラゾール（昇華グレード、ウイスコンシン、ミルウォーキーの アルドリッチ ケミカル カンパニー）を含む０．５Ｍ（７．５ミリモル）溶液 １５ｍＬで処理した。アルゴン下で正確に５分間この反応混合物を攪拌し、その 後直ぐに５％のトリエチルアミンを含有する３００ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に注いだ。 飽和ＮａＨＣＯ₃水溶液、１０％Ｎａ₂ＣＯ₃水溶液および飽和ＮａＣｌ水溶液の １００ｍＬ部で得られた溶液を素早く抽出 した。有機相を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過して油状物に濃縮した。この 油状物を１０ｍＬのＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解させ、迅速に攪拌している脱気ヘプタン（ １．３Ｌ、３％トリエチルアミンを含有する）にゆっくりと、滴加して沈殿させ た。濾過し真空中で乾燥させて、白色固体沈殿物を収集し、１．４７９ｇ（２． ０２ミリモル、収率７３％）の生成物を得た。長期保存のために、乾燥固体を −２０℃でデシケーター保存した。 所望のホスホルアミダイト化合物の同一性を確認するために、³¹Ｐ ＮＭＲ、¹ Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ−コージーにより、産生物は特徴づけられた。 実施例５ ５’−デオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル アミノホスホルアミダイト］−５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメト キシトリチル）チミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）−Ｎ，Ｎ −ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト］−５’−デオキシ−３’−Ｏ−（ ４，４’−ジメトキシトリチ ル）チミジンの合成を例示する。 新たに蒸留されたＣＨ₂Ｃｌ₂で共蒸発することで、実施例３から得られた１． ６４ｇ（２．９３ミリモル）の５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメト キシトリチル）５’−チオールチミジンを共沸蒸留的に乾燥させた。アルゴン下 で１３ｍＬの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂に得られた白色発泡物を溶かした。その後、その溶 液に２．８３ｍＬ（１６．２４モル）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンを 添加し、さらに１．２ｍＬ（５．３６ミリモル）のクロロ−（２−シアノエトキ シ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィンを加えた。アルゴン下で、周囲 温度で２時間反応液を攪拌した。その後、１．０ｍＬのエタノールを添加して、 その後５％トリエチルアミンを含有する酢酸エチル３００ｍＬで反応混合物を希 釈した。飽和水性ＮａＨＣＯ₃および飽和水性ＮａＣｌの１００ｍＬ部で溶液を 抽出した。有機相をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。ＣＨ₂Ｃｌ₂− ヘキサン−酢酸エチル−トリエチルアミン５：５：４：１（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ）で 溶出させながら、シリカゲルフラッシュクロマトグラフィにより、残渣を精製し た。適切な画分を濃縮し、そして乾燥させて透明油状物を得た （２．０ｇ、８９％）。１０ｍＬの無水トルエンに油状物を溶解させ、そして激 しく攪拌している３％トリエチルアミンを含有する３７０ｍＬの脱気ヘプタンに ゆっくりと、滴加して沈殿させた。濾過し真空デシケーター中で乾燥させて、白 色固体沈殿物を収集し、１．４９ｇ（１．９６ミリモル、６６％）の生成物を得 た。長期保存のために、生成物を室温でデシケーター保存した。 所望のホスホルアミダイト化合物の同一性を確認するために、³¹Ｐ ＮＭＲ、¹ Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ−コージーにより、産生物は特徴づけられた。 実施例６ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベンゾイルシチジンの 合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベン ゾイルシチジンの合成を例示する。 チミジンについて実施例１に記載された手段にしたがい、シチジンに対して類 似の反応スキームを、６．０ｇの５’−デオキシ−Ｎ−ベンゾイル−２’，５’ −ジデオキシシチジン（１８．０５ミリモル）で開始した。５．０４ｇ（１２． ９ミ リモル、収率７１％）の２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ −ベンゾイル−２’，５’−ジデオキシシチジンを得た。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄ−コージー により、産生物は特徴づけられた。 実施例７ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−イソブチリルグアノシ ンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−イソ ブチリルグアノシンの合成を例示する。 実施例１に記載された手段にしたがい、類似の反応スキームは、出発物質とし て使用された６．３２ｇ（１７．９８ミリモル）の２’，５’−ジデオキシ−Ｎ −イソブチリルグアノシンで開始され、５．１ｇ（１２．４２ミリモル、収率６ ９％）の２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−イソブチリル グアノシンを得た。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよびコージーにより 、産生物は特徴づけられた。 実施例８ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ −（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベン ゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンの合成を例示す る。 実施例２に記載された手段にしたがい、５．０３ｇ（１２．９ミリモル）の２ ’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベンゾイルシチジン（実 施例６から得た）を出発物質として使用して、８．３０３ｇ（１２ミリモル、９ ３％）の２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−ベンゾイル− ３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンを得た。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲにより、産生物は特徴 づけられた。 実施例９ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−３’−Ｏ−（４，４’−ジ メトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルグアノシンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−３’−Ｏ −（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルグアノシンの合成を例 示する。 実施例２に記載された手段にしたがい、２．７９ｇ（６．８ミリモル）の２’ ，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ 実施例７から得た）を使用して、３．４９ｇ（４．９ミリモル、収率７２％）の ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチル）−３’−Ｏ−（４，４’−ジ メトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルグアノシンを得た。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲにより、産生物は特徴 づけられた。 実施例１０ ２’，５’−デオキシ−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト リチル）−５’−チオールシチジンの合成 この実施例は、２’，５’−デオキシ−Ｎ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４ ’−ジメトキシトリチル）−５’−チオールシチジンの合成を例示する。 実施例３に記載された手段にしたがい、２．４３ｇ（３．５１ミリモル）の２ ’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチ ル）−Ｎ−イソベンゾイル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチ ジン（実施例８から得た）を出発材料として使用して、２．２ｇ（３．３８ミリ モル、収率９６％）の２’，５’−ジデオキシ−Ｎ−ベンゾイル−２’，５’− デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５’−チオールシチ ジンを得た。 チオがジスルフィドに酸化するのを避けるために、化合物は製造から２４時間 以内に使用した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄコージーに より、産生物は特徴づけられた。 実施例１１ ２’，５’−ジデオキシ−３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イ ソブチリル−５’−チオールグアノシンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシト リチル）−Ｎ−イソブチリル−５’−チオールグアノシンの合成を例示する。 実施例３に記載された手段にしたがい、１．４４ｇ（２．０２ミリモル）の２ ’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（アセチ ル）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリルグアノ シン（実施例９から得た）を使用して、１．３ｇ（収率９５％）の２’，５’− ジデオキシ−３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル− ５’−チオールグアノシンを得た。 チオールがジスルフィドに酸化するのを避けるために、化合物は製造から２４ 時間以内に使用した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび２Ｄコージーに より、産生物は特徴づけられた。 実施例１２ ２’，５’−ジデオキシ−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ−（２−シアノエチル）ピ ロリジノホスホルアミダイト−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シ チジンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−３’−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ− （２−シアノエチル）ピロリジノホスホルアミダイト−Ｏ−（４，４’−ジメト キシトリチル）シチジンの合成を例示する。 反応が８分間行われること以外は実施例４に記載された手段 にしたがい、２．３ｇ（３．５ミリモル）の２’，５’−デオキシ−Ｎ−ベンゾ イル−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５’−チオールシチジン （実施例１０から得た）を使用して、２．５２ｇ（８８％）の２’，５’−ジデ オキシ−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ−（２−シアノエチル）ピロリジノホスホル アミダイト−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンを生成した 。 長期保存のために、得られた固体を−２０℃でデシケーター保存した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲ、³¹Ｐ ＮＭＲおよび ２Ｄコージーにより、産生物は特徴づけられた。 実施例１３ ２，５’−ジデオキシ−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）Ｎ ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト］−２，５’−ジデオキシ−３ ’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンの合成 この実施例は、２，５’−ジデオキシ−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ−［（２− シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ ホスホルアミダイト］−２，５’−ジデオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメト キシトリチル）シチジンの合成を例示する。 実施例５に記載された手段にしたがい、９３９ｍｇ（１．４４５ミリモル）の ２’，５’−デオキシ−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イ ソブチリル−５’−チオールシチジン（実施例１０から得た）を使用して、６０ ０ｍｇ（収率４９％）の２，５’−ジデオキシ−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｓ−［ （２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト］−３ ’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジンを生成した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲに より、産生物は特徴づけられた。 実施例１４ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）ピロリジノホスホ ルアミダイト］−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）Ｎ−イソブチリ ルグアノシンの合成 この実施例は、２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル） ピロリジノホスホルアミダイト］−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）Ｎ−イソブチリルグアノ シンの合成を例示する。 反応が１０分間行われる以外は実施例４に記載された手段にしたがい、１．０ １ｇ（１．５ミリモル）の２’，５’−ジデオキシ−３−Ｏ−（４，４’−ジメ トキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−５’−チオールグアノシン（実施例１１ から得た）を使用して、１．６５ｇ（１．９６ミリモル、収率９６％）の２’， ５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）ピロリジノホスホルアミ ダイト］−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）Ｎ−イソブチリルグア ノシンを生成した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲ により、産生物は特徴づけられた。 実施例１５ ２，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロ ピルアミノホスホルアミダイト］−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）グアノシンの合成 この実施例は、２，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［（２−シアノエチル）Ｎ ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト］−３’−Ｏ−（４，４’−ジ メトキシトリチル）グアノシンの合成を例示する。 実施例５に記載された手段にしたがい、１．８１ｇ（２．７ミリモル）の２’ ，５’−ジデオキシ−３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブ チリル−５’−チオールグアノシン（実施例１１から得た）を使用して、７６０ ｍｇ（０．８７ミリモル、収率３２％）の２，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−［ （２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホルアミダイト］−３ ’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）グアノシンを生成した。 所望の化合物の同一性を確認するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲ により、産生物は特徴づけられた。 実施例１６ チオホスホルアミダイト法によるジチオ修飾オリゴヌクレオチドの合成 この実施例は、ここに記述される第１の好ましい（チオホスホルアミダイト） 方法にしたがって、部分的に修飾されたオリゴヌクレオチド（未修飾（ホスホジ エステル）および修飾（５’−ジチオエート）結合の両方を含む）の重合体支持 合成を記述する。 市販の５’−ヌクレオシド−ＣＰＧ（バージニア、スターリ ングのグレン リサーチから）を用いて５’−３’方向で１マイクロモルスケー ルで、アプライド バイオシステムズ（カリフォルニア、フォスターシティーの ＡＢＩ）モデル３９４合成機で合成を行った。以下の置換および付加が試薬ポー トに行われた。ポート１−４で５’−ホスホルアミダイト（グレン リサーチか ら）、ポート５−８で５’−チオホスホルアミダイト（例えば、チミジンの５’ −チオホスホルアミダイト、例えば、ポート８で実施例４または５から得られる ）、ポート１０は、６％トリエチルアミンを含む１：１（ｖ／ｖ）二硫化炭素（ ＣＳ₂）−ピリジン中に元素硫黄（Ｓ₈）を含む新たに製造された５％溶液（ｗ／ ｖ）を示す。ポート２０は、二硫化炭素（ＣＳ₂）を含有した。そして、ポート １５は、通常の０．１Ｍヨウ素酸化溶液に取って代わるテトラヒドロフラン（Ｔ ＨＦ）／ピリジン／水（グレンリサーチ）中の０．０２Ｍヨウ素を有する。標準 ＡＢＩ環（サイクル）、１μｍ ＣＥを修飾して、１回の超過トリクロロ酢酸（ ＴＣＡ）添加を行い、それに続きＣＨ₂Ｃｌ₂洗浄を行い、さらに各修飾結合につ いて二重の逐次カップリング（各回２５０秒待機）、またはホスホジエステルに ついて１回の２５０秒カップリングを行った。修飾結合のため、硫黄酸化は、キ ャッピング段階に先行する。試薬ライン の詰まりを防ぐために硫黄酸化の前後に、二硫化炭素洗浄を行った。 部分的に修飾されたオリゴヌクレオチド（ホスホジエステルおよび５’−ジチ オエート結合の両方を含む）について、混合化学サイクルが記載され、前者の（ 未修飾）結合に５’−ホスホルアミダイト（ポート１−４、カップリング時間に 対応、Ｉ₂酸化）を使用し、そして後者の（修飾）結合に５’−チオホスホルア ミダイト（ポート５−８、二重カップリング、Ｓ₈酸化）を使用した。固相合成 の終わりに、最後の塩基のジメトキシトリチル保護基をオリゴヌクレオチドに残 した（ＤＭＴ−オン）。 ヨウ素はＰ−Ｓヌクレオチド間結合を開裂することが当業界で知られているが 、固相合成状態下で、ＴＨＦ／ピリジン／水試薬中の０．０１ＭのＩ₂は、顕著 な量の結合の開裂を誘導せず、したがって、修飾および未修飾（ホスホジエステ ル）結合の両方を含む部分的に修飾されたオリゴヌクレオチドで逐次５’−ジチ オエート結合を合成させた。 サイクルの最適化が必要であった。最良の収量のためには、ピロリジノチオホ スホルアミダイトの０．１５Ｍ溶液が使用さ れた。ジイソプロピルアミノチオホスホルアミダイトはより反応性の高いピロリ ジノチオホスホルアミダイトに比例して収率を減少させる。０．５〜１．０ Ｏ ．Ｄ．のＤＭＴ−オン粗オリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析により収率を決定し た。 オリゴヌクレオチドはＤＭＴ−オンで合成された。オリゴヌクレオチドは固体 支持体から切り離され、そして重合体支持オリゴヌクレオチドを濃縮水性アンモ ニアで１５時間５５℃で処理することにより塩基およびホスフェート保護基を取 り除いた。上清を分取し、そして溶媒を真空中での濃縮により除去した。残渣は 、１ｍＬの０．２Ｍトリス（ｐＨ８）を添加することにより塩基性を維持させた 。化合物は、自動サンプリング装置、ポンプおよび勾配制御装置を具備したウォ ーターズ（マサチューセッツ、マーボルフのウォーターズファーマシューティカ ルディビジョン）４０００ダイオード配列ＨＰＬＣで０．１Ｍ酢酸トリエチルア ンモニウム中０〜４０％勾配のアセトニトリル（ＴＥＡＡ、１分当たり１％、５ μまたは１０μのカラムで別々に０．７５ｍＬまたは１ｍＬ／分の流速）を用い て、ハミルトンＰＲＰ−１上の逆相ＨＰＬＣ（粒子サイズ５μまたは１０μ、７ ｍｍ×１５０ｍｍのカラム）により製造された。 精製ＭＤＴ−含有オリゴヌクレオチドを含む画分を貯蔵し、真空中で乾燥させ た。乾燥オリゴヌクレオチドを０．５ｍＬの８０％水性酢酸で処理（周囲温度で １時間、ＤＴＭ−オンオリゴのＡ２６０ Ｏ．Ｄ．当たり２０μＬの８０％ＨＯ Ａｃ）し、ついで酢酸を真空中で除去することで脱トリチル化が完了した。その 後、残渣を１．０ｍＬのＨ₂Ｏに溶解させ、酢酸エチルで抽出して、４，４’− ジメトキシトリチルアルコ Ｍ重炭酸トリエチルアンモニウムまたはＴＥＡＢで溶出しながら）し、蒸留水か ら再度乾燥させた後純粋オリゴヌクレオチドを得た。２６０ｎｍでの吸光度を測 定することで、オリゴヌクレオチドを定量した。ヌクレオシド塩基成分の公表さ れた２６０ｎｍでの吸光係数を使用してオリゴヌクレオチドの吸光係数を計算し た。 ＮＭＲ分析のために０．５ｍＬの重水（Ｄ₂Ｏ）に乾燥オリゴヌクレオチドを 溶解させた。合成された所望の結合の存在を認定するために³¹Ｐ ＮＭＲにより 特徴づけを行った。５’−ジチオエート結合はδ７２．７−７３．２ｐｐｍで共 鳴を示し、一方未修飾ホスホジエステル結合は、外部リン酸（Ｈ₃ＰＯ₄） 標準に比例して０ｐｐｍの共鳴を示した。 上述の一般法で記載されたとおり、完全に修飾されたＴ−１８オリゴヌクレオ チド（全ての５’−ジチオエート結合を含むチミジン多量体）を合成し、精製し て、７０ナノモルの精製オリゴヌクレオチドを生じた（１マイクロモルの出発Ｃ ＰＧからおよそ７％の収率）。０．５ｍＬ Ｄ₂Ｏ中のオリゴヌクレオチドの³¹ Ｐ ＮＭＲは、図７に示されるとおり、外部Ｈ₃ＰＯ₄水準に比例して７２．７− ７３．２ｐｐｍでただ１つの幅広のピークを示した。ポリアクリルアミドゲル電 気泳動（１５％ＰＡＧＥ）は、ＵＶ投影で可視化されると１つのバンドを示した 。 部分的に修飾されたオリゴヌクレオチド（ホスホジエステルおよび５’−ジチ オエート結合の両方を含む）を、上で検討された手段にしたがって合成した。内 部放射性標識について合成された特定例の１１マー修飾オリゴヌクレオチドは、 下の実施例１８に記載されたヌクレアーゼ安定性アッセイを必要とし、１マイク ロモルの出発材料から以下の量のオリゴヌクレオチド（精製後）を得た。 ＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴ^*Ｔ ２６６ナノモル ＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ ２３０ナノモル ＴＣ ＣＴＧ Ｃ^*Ｔ^*Ｔ ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ ２６０ナノモル （＊は５’−ジチオエート結合を表す。） 最後のオリゴヌクレオチドの³¹Ｐ ＮＭＲは図８に示される。 実施例１７ ヌクレアーゼ耐性アッセイのためのオリゴヌクレオチドの製造分析 以下の一連のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ耐性を試験する目的のため に製造された。 ＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴ^*Ｔ ＴＣ ＣＴＧ ＣＴＴ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ ＴＣ ＣＴＧ Ｃ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ^*Ｔ （＊は５’−ジチオエート結合を表す。） γ³²Ｐ−アデノシントリホスフェートを用い、ニューイングランド バイオラ ボ（マサチューセッツ、ビバリー）から得られたＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ を使用する記載された手法にしたがって、これらの４つのオリゴヌクレオチドを 酵素的に ホスホリルエステル化した。（マクサムらのプロク．ナショナル．アカデ．サイ ．ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ．）、７４、５６０−５６４（１９７７））。オリゴヌクレオチドをポリアクリ ルアミドゲル電気泳動にかけた。記載した手段にしたがって、ホスホイメ ダイナミックス）で、ポリアクリルアミドゲルをスキャンした。ジョンストンら のエレクトロホレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）ＩＩ、３５５−３６ ０（１９９０）。 修飾オリゴヌクレオチドの安定性を評価するために、キナーゼ処理されたオリ ゴヌクレオチドを以下の合成オリゴヌクレオチドと別々にライゲーションした。 ＴＴＴ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＴ ニューイングランド バイオラボから得られたＴ４ ＤＮＡリガーゼを使用し た公表された手法にしたがってライゲーション反応を行った（マクサムらのプロ ク．ナショナルアカデ．サイ．ユーエスエイ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａ ｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）、７４、５６０−５６４（１９７７）。）ライ ゲーション反応で使用されたテンプレートは、以下の通り であった： ＧＣＡ ＧＧＡ ＡＡＧ ＡＣＣ 公表された手法にしたがって、以下に示されたライゲーション産物は、１５％ 変性ポリアクリルアミドゲルから単離した。（ヤンスラらのバイオケミストリー （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１６、１７７２−１７７６（１９７７）。） ＃は、³²Ｐ標識を表す。 ＊は、５’−ジチオエート結合を表す。 ライゲーション過程の間、放射性ホスフェート原子はライゲーション産物中に 内在化する。これは、ヌクレアーゼ源に内在するホスファターゼ活性による標識 の損失を消去する。 実施例１８ ５’−ジチオ修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性 この実施例では、種々の部分的に修飾された本発明のオリゴヌクレオチドのヌ クレアーゼ耐性を比較する。 実施例１７に記載された、オリゴヌクレオチドの３’−末端にゼロ（「野生型 」）、１つ、３つおよび５つの５’−ジチオエート修飾を含む内部³²Ｐ標識オリ ゴヌクレオチドを使用して、部分的に修飾された５’−ジチオエートオリゴヌク レオチドのヌクレアーゼ耐性を決定した。以下に記述されるとおり、（１）ヒト 血清に内在のヌクレアーゼ、および（２）蛇毒ホスホジエステラーゼの両方から ヌクレアーゼ分解に対する耐性について、内部で標識されたオリゴヌクレオチド を分析した。 Ａ．内在性血清ヌクレアーゼに対する耐性 標準放血技術により、レッドトップ凝血管（ニューヨーク、オレンジバーグの ベクトン−ディッカーソン）に１０ｍＬの全血を取った。室温で３０分間、その 血液を凝血させ、その後サンプルを１０００ｒｐｍで、１０分間遠心した。サン プルから血清を除き、０．５ｍＬアリコートを製造した。血清アリコートを−７ ０℃で貯蔵し、使用直前に解凍した。 実施例１７に記載された４つのゲル精製の内在的に標識されたオリゴヌクレオ チド（１９０００ｃｐｍ／ｐｍ保存溶液）を４ｐｍ／μＬの濃度にした希釈した 。各オリゴヌクレオチドの１２．５μＬ（５０ｐｍ）を３７．５μＬのヒト血清 と一緒に ３７℃でインキュベートした。最終オリゴヌクレオチド濃度は７５％（ｖ／ｖ） 血清中で１μＭであった。５μＬの鉱油を加えて、インキュベート中の蒸発を避 けた。定期的インターバルで、各インキュベーションから得た５μＬアリコート を、１０μＬホルムアミド、および８０％ホルムアミド中の０．１％ブロモフェ ノールブルー／０．１％キシレンシラノール２μｌと混合した。分析の準備がで きるまで、−２０℃で、サンプルを貯蔵した。サンプルを２分間煮沸し、２分間 氷の上に放置し、そして変性２０％ ポリアクリルアミドゲルに載せた。電気泳 して全長オリゴヌクレオチドの量を定量した。得られたデータは図９に示される 。ヒト血清安定性アッセイについての時間点は、０、１時間、４時間、８時間お よび２４時間であった。 図９は、対応する０時間対照レーンに対する全長バンドの積分により、残りの 全長オリゴヌクレオチドの含有率としてグラフ化された血清の存在下でのオリゴ ヌクレオチドの安定性を示す。図９中のデータは、５’−ジチオ修飾オリゴヌク レオチドが未修飾「野生型」オリゴヌクレオチドより顕著に血清での分解に耐性 であることを例示する。３’−末端での１つの３’− ジチオエート修飾結合でさえ、ヒト血清に１時間曝露する際にヌクレアーゼ分解 に対するある種の保護を示した。同じ１時間の定期的インターバルで未修飾オリ ゴヌクレオチドは９０％以上減成（１０％未満の全長オリゴヌクレオチド残留） し、一方、３’−末端で最小限３つの修飾結合を有する５’−ジチオエートオリ ゴヌクレオチドは４時間で約５０％減成した。（図９参照。） Ｂ．蛇毒ホスホジエステラーゼに対する耐性 実施例１７に記述された４つの内部に標識されたオリゴヌクレオチドを、別々 に０．２Ｍ炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）緩衝液中１ｐｍ／ μＬの濃度に希釈した。２μＬの酵素を１２３μＬの０．２Ｍ炭酸ナトリウム／ 重炭酸ナトリウム（ｐＨ９．５）緩衝液と混合することにより、蛇毒ホスホジエ ステラーゼ（ベーリンガーマンハイム）を希釈した。５μＬ（５ピコモル）の各 オリゴヌクレオチド溶液を、５μＬの蛇毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤＥ） 溶液と３７℃でインキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度は、１μＭ であった。各時間点について、反応がされ、そして定期的インターバル（０、３ ０分、６０分、９０分または１２０分）の終 わりに、各インキュベーション混合物を、ホルムアミド溶液中の１０μＬの染料 と混合し、そして２０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析する準備が できるまで、−２０℃で貯蔵した。ゲルをスキャンし、画像化し、そしてホスホ イメジャ 図１０は、対応する０時間対照レーンに対する全長バンドの積分により、残留 全長オリゴヌクレオチドの含有率としてグラフ化された蛇毒ホスホジエステラー ゼの存在下でのオリゴヌクレオチドの安定性を示す。野生型オリゴヌクレオチド が３０分で９０％分解されるのに使用されたＳＶＰＨＥ濃度で、わずかに１つの 単一ジチオエート結合により蛇毒ホスホジエステラーゼに対する存在するヌクレ アーゼに対する実質的耐性を与えることが分かった。（図１０参照。） Ｃ．５’−ジチオエートオリゴヌクレオチドの化合的開裂 実施例１７に記載された０、１つ、３つまたは５つの５’−ジチオエート修飾 を含む内的に標識されたオリゴヌクレオチド（４ｐｍ／μＬ保存溶液）を、３０ 分間、５０μＭ硝酸銀で処理し、さらに５０μＭ ＤＴＴで処理し、そしてその 後ＰＡＧ 可視化した。修飾を含むオリゴヌクレオチドに開裂が観察され、逆に、「野生型 」対照には開裂はなかった。このことは、本発明の５’−ジチオ修飾結合が、ホ スホジエステルまたは野生型結合の存在下で本発明の５’−ジチオエート修飾の 銀（または水銀）イオンによる化学的開裂のために、ＤＮＡの特定の操作に使用 できることを示す。 実施例１９ ４，４’−ジメトキシトリチルチオールアセテートの合成 この実施例は、４，４’−ジメトキシトリチルチオールアセテートの合成を例 示する。 ２５ｇ（７３．８ミリモル）の塩化４，４’−ジメトキシトリチルを、５００ ｍＬの無水塩化メチレンに溶かした。その後１５．８ｍＬ（２２１ミリモル）の チオール酢酸を、塩化４，４’−ジメトキシトリチルに添加した。反応物を、周 囲温度で３０分間攪拌し、その後３０．８ｍＬ（２２１ミリモル）のトリエチル アミンのゆっくりとした添加により過剰の酸を中和した。５００ｍＬの５％水性 ＮａＨＣＯ₃、５００ｍＬの水、および３００ｍＬの飽和水性ＮａＣｌで２回反 応混合物を洗浄した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して、濃縮し た。塩化メチレン／ヘキサンから、得られた暗褐色油状物を結晶化させた。濾過 および真空中での乾燥により明るい茶色の結晶が収集されて２６．４ｇ（収率９ ４％）の生成物を得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲ により生成物は特徴づけられた。 実施例２０ ５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）チミジンの合成を例示する。 アルゴン下で、１．１８ｇ（５１．５ミリモル）のナトリウムに２０ｍＬの新 たに蒸留したメタノールを添加した。全てのナトリウムを反応させた後、過剰の メタノールの除去して、ナトリウムメトキシドを白色固体として得た。そのナト リウムメトキシドを５０ｍＬのジメチルジメチルスルホキシドに溶かし、アルゴ ンで１時間通気することにより脱気した。この溶液をカニューレを介して、２５ ０ｍＬの脱気ジメチルスルホキシド中に先の実施例から得られた４，４’−ジメ トキシトリチルチオールアセテート１５．５６ｇ（４１ミリモル）に添加した。 アルゴン下で３０分間通気しながら反応物を攪拌し、その後１３．５８ｇ（３４ ．４ミリモル）の５’−Ｏ−トシルチミジン（レイストのジェイ．オルグ．ケム ．（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）、２９、５５４−５５８（１９６４）により記載 されたとおりに製造した）を迅速に添加した。アルゴン下で、一夜反応物を攪拌 し、その後３００ｍＬの塩化メチレンで希釈し、その後３００ｍＬの５％ＮａＨ ＣＯ₃溶液で２回、水３００ｍＬで１回、そして３００ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液 で１回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過して、濃縮した。 クロロホルム中で０〜５％エタノールの勾配を用いたシリカゲルフラッシュクロ マトグラフィにより粗生成物を精製して１８ｇの純粋生成物（収率９４％）を光 沢のある黄色発泡体として得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲに より生成物は特徴づけられた。 実施例２１ ５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メチルホスホ ルアミダイト］−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミ ノ）メチルホスホルアミダイト］−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）チミジンの合成を例示する。 無水ピリジン（３×１００ｍＬ）およびトルエン（２×１００ｍＬ）と共沸さ せることにより、実施例２０から得られた１０ｇ（１７．８ミリモル）の５’− デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを共沸的に乾 燥させた。その後、１００ｍＬの無水ＣＨ₂Ｃｌ₂、９．９２ｍＬ（７１．２ミリ モル）のトリエチルアミンおよび４．１６ｍＬ（２１．４ミリモル）のクロロ− （Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィンを乾燥固体に加えた。反 応物を３０分間、周囲温度に置いた。³¹Ｐ ＮＭＲによりアリコートを分析して 、（１５０ｐｐｍの化学シフトを示す）生成物に変換したことを認定した。反応 物を塩化メチレンで希釈し、１００ｍＬの５％ＮａＨＣＯ₃溶液で２回、１００ ｍＬの飽和ＮａＣｌ溶液で１回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濃縮し た。４：４：１：１のヘキサン：塩化メチレン：酢酸エチル：トリエチルアミン を用いたシリカゲルフラッシュクロマ トグラフィにより粗生成物を精製して１０．９ｇ（収率８５％）の純粋生成物を 得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲに より生成物は特徴づけられた。 実施例２２ ５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（メ チルハイドロジェンチオホスホネート）チミジンの合成 この実施例は、５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル ）−３’−（メチルハイドロジェンチオホスホネート）チジジンの合成を例示す る。 実施例２１から得られた１．０ｇ（１．３８ミリモル）の５’−デオキシ−３ ’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メチルホスホルアミダイト］５’ −Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを、アルゴン下で、７５ｍＬ の新たに蒸留した塩化メチレンに溶かした。乾燥硫化水素ガス（Ｈ₂Ｓ、粉末状 無水酸化カルシウムおよび硫酸カルシウムを含有するトラップを通してガス蒸気 を通過させることにより乾燥させた）を反応物に１時間通気した。その後、無水 アセトニトリル中に テトラゾールを含む０．５Ｍ溶液１３．８ｍＬを添加し、そして硫化水素通気を １０分間再び続けた。その後、１時間反応物を攪拌し、³¹Ｐ ＮＭＲによりアリ コートを分析しながらＴＬＣにかけた（生成物は７２ｐｐｍの化学シフトを示す 。）。実験室内にＨ₂Ｓを放出するのを防ぐために、反応のための排出ラインを 硫酸カルシウムを充填した乾燥管に取り付け、続いて漂白溶液にかけ、そして水 酸化ナトリウム溶液トラップを濃縮した。１時間後、２０分間アルゴンで反応物 を浄化して、過剰のＨ₂Ｓを除去し、塩化メチレンで希釈し、その後７５ｍＬの ５％ＮａＨＣＯ₃溶液で２回抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濃縮した 。最初、クロロホルム中の０〜１％エタノールの勾配を用いたシリカゲルフラッ シュクロマトグラフィにより粗生成物を精製した。クロマトグラフ化された生成 物を乾燥させ、５ｍＬトルエンに溶かし、その後迅速に攪拌させているペンタン ８００ｍＬにゆっくりと添加することにより沈殿させた。濾過により固体を収集 して、０．５６ｇ（６１％）の純粋生成物を得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲに より生成物は特徴づけられた。 実施例２３ ５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（メチルハイドロジェン チオホスホネート）チミジンの合成 この実施例は、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（メチ ルハイドロジェンチオホスホネート）チミジンの合成を例示する。 先の実施例に記載されたものに類似する手段により、５ｇ（６．９３ミリモル ）の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジ イソプロピルアミノ）メチルホスホルアミダイト］チミジン（グレン リサーチ ）を使用して、２．４８９ｇ（５６％）の生成物を得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび³¹Ｐ ＮＭＲに より生成物は特徴づけられた。 実施例２４ Ｈ−チオホスホネート法にしたがったジチオ修飾オリゴヌクレオチドの合成 アプライド バイオシステムズ（カリフォルニア、フォスターシティ）モデル ３９４合成機で、ここで先に記載されたＨ−チオホスホネート法を用いて、未修 飾（ホスホジエステル）お よび修飾（５’−ジチオエート）結合の両方を含む部分的に修飾されたオリゴヌ クレオチドの固相合成を行った。換気フードで手動で選択段階を行った。特に断 りがない限り、全ての試薬は、アプライドバイオシステムズ、グレンリサーチ（ バージニア、スターリング）またはアルドリッチ ケミカル カンパニー（ウイ スコンシン、ミルウォーキー）から購入した。固相合成のための全ての溶液は、 使用前にアルゴンで十分に脱気した。 第１の段階として、５’−デオキシ−５’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリ チル）チミジンを含むヌクレオシドをＣＰＧ樹脂に付着させた。ヌクレオシドの ３’−ヒドロキシルのカップリングは、当業界で知られた方法を介してたやすく 完了できた。その次の実験として、実施例２１から得られた５’−デオキシ−３ ’−Ｏ−［（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスホルアミダイト］５ ’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンをＴ−ＣＰＧ樹脂にホスフ ァイトカップリングを介して付着させた。ホスファイトカップリングに、標準ア プライド バイオシステムズ プログラム１μｍ ＣＥおよび標準ホスホルアミ ダイト試薬を使用した。 以下のプロトコールを使用して、固相Ｈ−チオホスホネート 法をしながら５’−ジチオエート結合を導入した。 （Ａ）合成機プログラムは、（順次）以下の段階： （１）０．２Ｍ 塩化２，４−ジニトロスルフェニルを含む塩化メチレン溶液中 の２．５％トリクロロ酢酸（ポート１５）を用いる脱ブロック／活性化段階、続 いて（２）塩化メチレン洗浄、その後（３）ポート１１および１２から各々ＣＨ₂ Ｃｌ₂溶液の０．２Ｍの塩化２，４−ジニトロスルフェニルおよびＣＨ₂Ｃｌ₂溶 液中の０．５Ｍトリエチルアミンの同時伝搬を伴う第２の活性化段階（それがキ ャッピングプロトコールであるように記載された）、（４）ＣＨ₂Ｃｌ₂洗浄、（ ５）ＣＨ₂Ｃｌ₂中の０．５Ｍトリエチルアミンの溶液（ポート９）の同時伝搬を 伴う、ＣＨ₂Ｃｌ₂中の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（ Ｈ−チオメトキシホスホネート）チミジンシントン（実施例２３から得られた） の０．２Ｍ溶液でカップリングすること、そして最終的に（６）さらに洗浄する ことを含む、記載されたＨＰｈｏｓ２１であった。 （Ｂ）合成機プログラムＨＰｈｏｓ２３を使用して、順次以下の段階：（１） １．０Ｍのｐ−ニトロチオフェノールを含む２．５％ＴＣＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂を用い る脱ブロック／活性化段 階、（２）ＣＨ₂Ｃｌ₂洗浄、（３）５分間放置を伴なう、１．０Ｍ ｐ−ニトロ チオフェノールを含有するＣＨ₂Ｃｌ₂中の飽和ヨウ素溶液を搬送する第２の活性 化段階（手動伝搬）、（４）ＣＨ₂Ｃｌ₂洗浄、（５）合成機のポート９から得ら れたＣＨ₂Ｃｌ₂中のトリエチルアミンの０．５Ｍ溶液の同時伝搬を伴なう、アミ ダイトポートから伝搬されたＣＨ₂Ｃｌ₂中の５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｈ−チオホスホ ネートシントン（実施例２２から得られた）の０．２Ｍ溶液でカップリングした 。 （Ｃ）同じ合成機プログラム（ＨＰｈｏｓ２３）を使用して、第１の脱ブロッ ク／活性化溶液が、０．２Ｍの２，２’−ジチオビス（５’−ニトロピリジン） を含有するＣＨ₂Ｃｌ₂中の２．５％ＴＣＡからなる以外は、（Ａ）と同様の段階 を行った。 ここに記述されたプロトコールに従って、１つの修飾結合を含む以下の三量体 を合成した。 Ｔ^*ＴＴ （＊は５’−ジチオエート結合を表す。） チオフェノール／トリエチルアミン／ジオキサン（チオレート）溶液でＤＭＴ −オフ三量体を含有する樹脂を最初に処理し、メチル保護基を除去し、続いてジ エチルエーテルおよびメタノ ールで支持体を洗浄した。その後、通気乾燥固体支持体オリゴヌクレオチドを、 濃縮アンモニア溶液で１時間、室温で処理し、樹脂からオリゴを開裂した。アン モニアを真空中で除去し、０．２Ｍトリス（ｐＨ８）緩衝液１．０ｍＬを添加す ることにより粗オリゴヌクレオチドを塩基性に維持した。 ０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム中の０〜４０％アセトニトリルの勾配を 用いた１０μハミルトンＰＲＰ−１（７ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムでの逆相ＨＰ ＬＣにより、粗ＤＭＴ−オフオリゴヌクレオチドを精製した。精製オリゴヌクレ オチドの³¹Ｐ ＮＭＲは、５’−ジチオエートヌクレオチド間結合を反映して７ ２−７３ｐｐｍで、およびホスホジエステル結合についての０ｐｐｍ、積分比１ ：１で共鳴を与え、これにより所望のオリゴヌクレオチド化合物の同一性を確認 した。 実施例２５ ２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（２，４−ジニトロフェニルスルフェニル ）チミジンの合成 実施例２０から得られた２．０ｇ（３．５７ミリモル）の５’−デオキシ−５ ’−Ｓ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを、４００ｍＬの塩化メチ レンに溶かした。その後、得 られた溶液に、２ｇ（１２．２４ミリモル）のトリクロロ酢酸および３．３５ｇ （１４．２７ミリモル）の塩化２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルを添加し 、そして反応混合物を０．５時間、周囲温度で攪拌した。その後、反応混合物を 塩化メチレンで希釈し、５％ＮａＨＣＯ₃溶液で２回、水および飽和ＮａＣｌ溶 液で１回抽出し、その後硫酸ナトリウム上で乾燥させて、濃縮した。乾燥有機相 をシリカゲルに加え、その後懸濁物を減圧下で注意深く乾固させた。吸着された 生成物を含むシリカゲルを、遊離の流体粉末としてクロロホルムで予め平衡にし たシリカゲルカラムの頂部に負荷した。クロロホルム中の０〜６％エタノールの 勾配でカラムを溶出させて、０．９１ｇ（５６％）の純粋生成物を得た。 所望の化合物の同一性を認定するために、¹Ｈ ＮＭＲおよび¹³Ｃ ＮＭＲに より生成物は特徴づけられた。 実施例２６ ジチオ修飾二量体の溶液合成 この実施例は、溶液中でのＴ^*Ｔ二量体（＊は５’−ジチオエート結合を表す ）の合成を例示する。 実施例２５から得られた１９．７ｍｇ（４３マイクロモル） の２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ−（２，４−ジニトロフェニルスルフェニ ル）チミジンを含む溶液を、およそ０．８ｍＬの重水化ベンゼン（ベンゼン−ｄ ６）中に実施例２３から得られた２５ｍｇ（３９マイクロモル）の５’−Ｏ−（ ４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−（メチルハイドロジェンチオホスホネ ート）チミジンの溶液に添加した。得られた溶液をＮＭＲ管に載せた。その後、 １０．９μＬ（７８マイクロモル）のトリエチルアミンを添加した。１分後の³¹ Ｐ ＮＭＲスペクトルは、Ｈ−チオホスホネートを保護Ｔ^*Ｔ二量体（メチル保 護基を有する２’−ジチオエート結合）に完全に変換することを示した。出発の Ｈ−チオホスホネートの³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルは、７２．４ｐｐｍおよび７２ ．１ｐｐｍで共鳴（２つのジアステレオマー）をなす。保護二量体の³¹Ｐ ＮＭ Ｒは、９６．８および９５．８ｐｐｍで共鳴する。２つの５’−ジチオエートジ アステレオマーがあるので、２つのピークが観察された。 ５分後、反応物を２ｍＬの酢酸エチルで希釈し、１ｍＬの５％ＮａＨＣＯ₃で ２回そして飽和塩化ナトリウムで１回抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾 燥させ、濾過し、濃縮した。 乾燥二量体を、重水化Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ｄ７−ＤＭＦ）に溶かし 、そして³¹Ｐ ＮＭＲにより生成物を特徴づけた（ｄ７−ＤＭＦ中で９７．４、 ９６．８ｐｐｍで共鳴）。 保護二量体のｄ７−ＤＭＦ溶液を、チオレート溶液で処理して、脱保護Ｔ^*Ｔ 二量体を得た。³¹Ｐ ＮＭＲにより生成物を特徴づけた（ｄ７−ＤＭＦ中で６９ ．０、６８．９ｐｐｍで共鳴）。 別々の脱ブロッキング反応で、乾燥保護二量体を、１ｍＬのチオフェノール： トリエチルアミン：ジオキサン溶液（２：２：１）で処理した。反応は、およそ ２時間で脱保護Ｔ^*Ｔ二量体を生じた（チオレート溶液中の化学シフト７２．９ 、７２．５）。³¹Ｐ ＮＭＲは、重水素ロックなしに行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 少なくとも１つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合を有する少なく とも１０塩基の修飾オリゴヌクレオチド。 ２． 長さで１０〜６０塩基の間である請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチ ド。 ３． 少なくとも３つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合を有する請求項 ２に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ４． 前記３つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合が前記修飾オリゴヌク レオチドの３’−末端にある請求項３に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ５． 前記ヌクレオチド間結合の全てが５’−ジチオエートヌクレオチド間結合 である請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ６． 長さで１２〜６０塩基の間である請求項５に記載の修飾オリゴヌクレオチ ド。 ７． 前記５’−ジチオエートヌクレオチド間結合中の非架橋酸素原子のただ１ つが硫黄原子で置換されている請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 ８． 長さで１０〜６０塩基の間である請求項７に記載の修飾オリゴヌクレオチ ド。 ９． 少なくとも３つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合を有する請求項 ８に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 １０． 前記３つの５’−ジチオエートヌクレオチド間結合が前記修飾オリゴヌ クレオチドの３’−末端にある請求項９に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 １１． 前記ヌクレオチド間結合の全てが５’−ジチオエートヌクレオチド間結 合である請求項１０に記載の修飾オリゴヌクレオチド。 １２． ２’，５’−ジデオキシ−５’−チオール−３’−Ｏ−保護ヌクレオシ ドをホスフィチル化剤と反応させることよりなる５’−チオホスホルアミダイト ヌクレオシドシントンの製造方法。 １３． （ａ）酸触媒ホスホルアミダイト条件下で５’−重合体支持ヌクレオシ ドの３’−ヒドロキシルを２’，５’−ジデオキシ−５’−チオール−３’−Ｏ −保護５’−チオホスホルアミダイトと結合させて、チオホスファイト中間体を 生成し、 （ｂ）該チオホスファイト中間体を硫化して、保護５’−ジ チオエート結合を発生させ、及び （ｃ）該保護５’−ジチオエート結合を脱保護して、５’−ジチオエート修飾 結合を得る段階よりなる５’−ジチオ修飾結合を合成する方法。 １４． 段階（ａ）〜（ｂ）を所望の回数反復して、相当する数の逐次保護５’ −ジチオエート結合を発生させてから、最終の脱保護段階（ｃ）を行うことによ り多重逐次５’−ジチオ修飾結合を合成する請求項１６に記載の方法。 １５．式： （式中、Ｘは酸素または硫黄である。） で表される３’−メチルハイドロジェンチオホスホネートシントン。 １６． テトラゾールの存在下で、硫化水素および水からなる群から選択される 化合物とメチルホスホルアミダイトを反応させることを含む３’−Ｈ−ホスホネ ートシントンを合成する方法。 １７． ３’−Ｈ−ホスホネートシントンが３’−Ｈ−チオホスホネートシント ンであり、そして前記化合物が硫化水素である請求項１６に記載の方法。 １８． チオレート塩を２’−デオキシヌクレシドの５’−Ｏ−トシレートと反 応させることにより５’−デオキシ−５’−保護チオール中間体を合成する方法 。 １９． 前記チオレート塩が４，４’−ジメトキシトリチルチオレートである請 求項１８に記載の方法。 ２０． （ａ）ヌクレオシドの５’−位に不斉ジスルフィドを作り、 （ｂ）ヌクレオシドの該不斉ジスルフィドを３’−Ｈ−ホスホネートシントン と反応させる段階を含む、前記ヌクレオチド間結合の５’−位に硫黄置換を有す る修飾ヌクレオチド間結合を合成する方法。 ２１． 前記ヌクレオシドが前記ヌクレオシドの３’−位を通 して重合体支持体に結合される請求項２０に記載の方法。 ２２． 塩化アリールスルフェニルの存在下で前記重合体支持ヌクレオシドを酸 と反応させることにより前記不斉ジスルフィドが作られる請求項２０に記載の方 法。 ２３． 前記ヌクレオシドが２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ（４，４−ジメ トキシトリチル）ヌクレオシドである請求項２２に記載の方法。 ２４． 前記３’−Ｈ−ホスホネートシントンが３’−メチルハイドロジェンチ オホスホネートシントンである請求項２０に記載の方法。 ２５． 前記３’−Ｈ−ホスホネートシントンが３’−メチルハイドロジェンチ オホスホネートシントンである請求項２３に記載の方法。 ２６． 前記ヌクレオシドが２’，５’−ジデオキシ−５’−Ｓ（４，４’−ジ メトキシトリチル）ヌクレオシドであり、そして前記３’−Ｈ−ホスホネートシ ントンが３’−メチルハイドロジェンチオホスホネートシントンである請求項２ ０に記載の方法。