JPH10503524A - ペプチド核酸コンジュゲート - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 それに結合したコンジュゲートを含む新規な種類のペプチド核酸が記載される。ペプチド核酸は、一般に、適当なリンカーを介してペプチド主鎖に結合した天然に生ずるＤＮＡ塩基等のリガンドを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 ペプチド核酸コンジュゲート関連する出願のクロスリファレンス 本出願は、１９９４年１０月６日出願の米国特許出願０８／３１９，４１１の 一部継続出願であり、これは１９９３年８月２７日出願の米国特許出願０８／１ ０８，５９１の一部継続出願であり、これは１９９１年５月２４日出願のデンマ ーク特許出願９８６／９１、１９９１年５月２４日出願の９８７／９１および１ ９９２年４月１５日出願の５１０／９２に基づく優先権を主張して１９９２年５ 月２２日に出願した国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９の国内段階である。 さらに、本出願は、１９９３年７月２日出願の米国特許出願０８／０８８，６５ ８、１９９３年７月２日出願の米国特許出願０８／０８８，６６１および１９９ ４年７月１５日出願の米国特許出願０８／２７５，９５１の一部継続出願である 。 上述の特許出願の開示のすべてを本明細書の一部としてここに引用する。発明の分野 本発明は、ポリヌクレオチドではないが、対応するＤＮＡより強力に相補的な ＤＮＡおよびＲＮＡ鎖に結合する化合物に関する。特に、本発明は、共有結合し たコンジュゲートを含むように機能化されたペプチド核酸（ＰＮＡ）に関する。発明の背景 オリゴヌクレオチドおよびその類似体は、分子生物学において、ある種の方法 において、プローブ、プライマー、リンカー、アダプターおよび遺伝子フラグメ ント等として開発され用いられてきた。これらの方法において用いられるオリゴ ヌクレオチドへの修飾には、非放射性同位体、例えば、フルオレセイン、ビオチ ン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、または他のレポーター分子での 標識が含まれる。ヌクレアーゼに対する安定性を増加させるために、リボースホ スフェート主鎖に他の修飾が行われてきた。これらの修飾には、メチルホスホネ ート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート連結、および２’−Ｏ−メチ ルリボース糖ユニットの使用が含まれる。別の修飾には、取り込みおよび細胞内 分布を調節するための修飾が含まれる。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド は現在のところ抗ウイルス剤としての使用を含む種々の疾患状態のためのヒトの 臨床試験においてアンチセンス剤として用いられている。これらのオリゴヌクレ オチドは診断および治療において首尾よく使用されているが、改良されたオリゴ ヌクレオチド類似体に対する要望がなお存在する。 オリゴヌクレオチドはいくつかの方法で天然のＤＮＡおよびＲＮＡと相互作用 することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは一本鎖核酸とともにデュープ レックスを形成し、または二本鎖ＤＮＡに結合してトリプレックス構造を形成す る。しかし、二本鎖ＤＮＡとトリプレックス構造を形成するためには、オリゴヌ クレオチドのシトシン塩基がプロトン化されていなければならない。したがって 、トリプレックス形成はｐＨ依存性である。Ｐ．Ｏ．Ｐ．Ｔｓ’ｏおよび同僚は 、ＤＮＡトリプレックス形成において、シトシンの永続的にプロトン化された類 似体としてシュードイソシトシンを用いた（Ｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，４０３２−４０３３；Ｏｎｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７，３２２５−３２３０を参照 されたい）。ＴｒａｐａｎｅおよびＴｓ’ｏはまた、一本鎖核酸標的とのトリプ レックス形成のためのシュードイソシトシンの使用を示唆している（Ｔｒａｐａ ｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．，１９９ １，８，２２９；Ｔｒａｐａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，１９ ９２，６１，２４３７；Ｔｒａｐａｎｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃａｎｃｕｎ，Ｍｅｘｉｃｏ，Ｊａｎｕａｒｙ １９ ９３を参照されたい）。ＷＯ９３／０５１８０は、トリプレックス形成における プロトン化されたシトシンを８−オキソアデニンで置換することを開示する。 ペプチド核酸は、ある点ではオリゴヌクレオチドと類似する化合物であるが、 これらの構造は非常に異なる。ペプチド核酸においては、オリゴヌクレオチドの デオキシリボース主鎖は、ペプチドを有する主鎖で置き換えられている。それぞ れのサブユニットには、天然に生ずるまたは天然に生じない塩基が結合している 。そのような主鎖の１つは、アミド結合を介して連結したＮ−（２−アミノエチ ル）グリシンの繰り返しユニットから構築される。 ＰＮＡはＤＮＡおよびＲＮＡの両方に結合して、ＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ ／ＲＮＡデュープレックスを形成する。得られるＰＮＡ／ＤＮＡまたはＰＮＡ／ ＲＮＡデュープレックスは、それらがより高い溶融温度（Ｔｍ）を有することに より証明されるように、対応するＤＮＡ／ＤＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡデュープ レックスよりも高い親和性で結合する。この高い熱安定性は、ＰＮＡの主鎖が中 性であり、ＤＮＡまたはＲＮＡデュープレックスに存在する電荷斥力と遭遇しな いことに起因するのであろう。また、ＰＮＡの中性の主鎖により、ＰＮＡ／ＤＮ Ａ（ＲＮＡ）デュープレックスのＴｍは事実上塩濃度に非依存性である。すなわ ち、ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスは、イオン強度に高度に依存性であるＤＮ Ａ／ＤＮＡデュープレックス相互作用に比べてさらなる利点を提供する。ホモピ リミジンＰＮＡは相補的なＤＮＡまたはＲＮＡに結合して、熱安定性の高い（Ｐ ＮＡ）₂／ＤＮＡ（ＲＮＡ）トリプレックスを形成することが示されている（例 えば、Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４ ９７；Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９２ ，１１４，１８９５；Ｅｇｈｏｌｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏ ｃ．，１９９２，１１４，９６７７を参照されたい）。 増加した親和性に加えて、ＰＮＡはまた増加した特異性をもってＤＮＡに結合 することが示されている。ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレックスのミスマッチが溶解 するとき、ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスと比較して８から２０℃のＴｍの降 下が見られる。このような大きなＴｍの降下は、ミスマッチが存在する対応する ＤＮＡ／ＤＮＡデュープレックスについては見られない（Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６５，ｐ．５６６を参照されたい） 。 ＰＮＡ鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖への結合は、２つの配向のいずれかで起こり うる。この配向は、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖が、ＰＮＡのカルボキシル末端がＤＮ ＡまたはＲＮＡの５’末端に向けられておりかつＰＮＡのアミノ末端がＤＮＡま たはＲＮＡの３’末端に向けられるように、５’から３’配向で相補的なＰＮＡ 鎖に結合するとき、アンチパラレルと称される。パラレル配向においては、ＰＮ Ａのカルボキシル末端およびアミノ末端は、ＤＮＡまたはＲＮＡの５’−３’方 向に関して反対向きである。 ＰＮＡは一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの両方に結合する。ＰＮＡの２つの 鎖がｄｓＤＮＡに結合しうることが観察されている。ＰＮＡ／ＤＮＡデュープレ ックスはアンチパラレルコンフィギュレーションにおいて安定であるが、以前は （ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックスについてはパラレル配向が好ましいと考え られていた。 ２つの一本鎖ピリミジンＰＮＡの二本鎖ＤＮＡへの結合は、オリゴヌクレオチ ドのトリプレックス形成について観察されるような通常の三重らせん形成ではな く、鎖置換を介して生ずることが示されている。ＰＮＡ鎖が二本鎖ＤＮＡに浸入 するとき、ＤＮＡの一方の鎖が置き換えられ、ＰＮＡ₂／ＤＮＡ複合体領域側で ループを形成する。ＤＮＡの他方の鎖は（ＰＮＡ）₂／ＤＮＡトリプレックス構 造の一部である。一本鎖ループ領域（Ｄループとして知られる）は、一本鎖ＤＮ Ａを切断しうる酵素による切断に感受性である。 オリゴヌクレオチドと比較してＰＮＡのさらなる利点は、そのポリアミド主鎖 がヌクレアーゼまたはプロテアーゼのいずれによっても認識されず、したがって 酵素による分解に耐性であることである。 これらの性質のため、ＰＮＡは、いくつかの異なる分野において有用であるこ とが知られている。ＰＮＡはオリゴヌクレオチドより強い結合および高い特異性 を有しているため、クローニング、ブロッティング方法、および蛍光インサイチ オハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等の応用においてプローブとして用いら れている。ホモピリミジンＰＮＡは、ホモプリン標的における鎖置換に用いられ ている。Ｄ−ループと重複するかまたはそれに隣接する制限部位は、制限酵素に より切断されないであろう。さらに、局所的なトリプレックスは遺伝子の転写を 阻害する。ＰＮＡがＤＮＡフラグメント中の特定の制限部位に結合することによ り、これらの部位における切断が阻害されうる。この利点はクローニングおよび サブクローニング方法において有用である。標識したＰＮＡはまた、蛍光標識を 有するＰＮＡ分子を鎖侵入を用いてデュープレックスＤＮＡ中の相補的な配列に ハイブリダイズさせることにより、ＤＮＡ分子を直接マッピングするために用い ることができる。 ＰＮＡはさらに、ＰＣＲに基づくアッセイ（ＰＣＲクランピング）において点 突然変異を検出するためにも用いられている。ＰＣＲクランピングにおいては、 ＰＣＲに基づくアッセイ、例えば、検証中のＤＮＡのセグメント中の通常の野生 型遺伝子座と変異体遺伝子座との間の区別において、点突然変異を検出するため にＰＮＡを用いる。典型的には、野生型配列に相補的なＰＮＡオリゴマーを合成 し、２つのＤＮＡプライマーを含みその１つは変異体配列に相補的であるＰＣＲ 反応混合物に加える。野生型ＰＮＡオリゴマーおよびＤＮＡプライマーは、標的 に対するハイブリダイゼーションについて競合する。標的が変異体遺伝子座であ れば、ＤＮＡプライマーのハイブリダイゼーションおよび続く増幅のみが生ずる であろう。この方法を用いて、変異体の存在および正確な同一性を判定すること ができる。 診断、研究試薬および潜在的な治療に用いるための、相補的なＤＮＡおよびＲ ＮＡ鎖に結合するオリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の応用に 関する多くの研究が行われている。多くの用途のためには、オリゴヌクレオチド およびオリゴヌクレオチド類似体は細胞膜を横切って輸送されるか、または細胞 により取り込まれて活性を発現しなければならない。 ＰＣＴ／ＥＰ／０１２１９は、対応するＤＮＡより強く相補的なＤＮＡおよび ＲＮＡに結合する新規ペプチド核酸（ＰＮＡ）化合物を記載する。これらの化合 物に、これらの活性もしくはこれらの膜もしくは細胞輸送を調節するかさもなく ば影響を与える基を付加することが望ましい。そのような輸送を増加させる１つ の方法は、ペンダント親油性基の付加によるものである。”Ａｍｉｎｅ−Ｄｅｒ ｉｖａｔｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ ｓｉｄｅｓ”と題する米国特許出願１１７，３６３（１９９３年９月３日出願） は、いくつかのアルキルアミノ官能基およびそのようなペンダント基のオリゴヌ クレオシドへの付加におけるその使用を記載する。 さらに、”Ｎｏｖｅｌ Ａｍｉｎｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａ ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ”と題する米国特許出願０７ ／９４３，５１６（１９９２年９月１１日出願）および対応する公開されたＰＣ Ｔ出願ＷＯ９４／０６８１５は、とりわけ細胞取り込みを増強させ、親油性を増 加させ、より高い細胞保持性を引き起こし、細胞内での化合物の分布を増加させ る目的のための、他の新規アミン含有化合物およびこれらのオリゴヌクレオチド 内への取り込みを記載する。 ”Ｔｈｉｏｌ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ”と題する米国特許出願０８／１１６，８０ １（１９９３年９月３日出願）は、それを介してペンダント基を結合させるチオ アルキル官能基を含むように誘導化したヌクレオシドおよびオリゴヌクレオシド を記載する。 当該技術分野においては、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡに結合して、二本鎖Ｄ ＮＡを模倣してそれらの結合、細胞取り込みまたは他の活性を増強するためにペ ンダント基を有するように誘導化しうる、二本鎖のらせん構造を形成する、安定 な化合物が必要とされている。発明の目的 本発明の目的は、それに付加された少なくとも１つのコンジュゲートを有する ＰＮＡを提供することである。 本発明の別の目的は、アルキルアミノ化学官能基を含むＰＮＡを提供すること である。 本発明の別の目的は、アルキルチオ化学官能基を含むＰＮＡを提供することで ある。 本発明の別の目的は、改良された細胞膜を横切る輸送特性を有するＰＮＡを提 供することである。 本発明の別の目的は、インターカレーター、核酸開裂剤、細胞表面リン脂質、 および／または診断薬を含むペプチド核酸を提供することである。 これらのおよび他の目的は、以下の説明および添付の特許請求の範囲から明ら かとなるであろう。発明の概要 本発明は、ＰＮＡ主鎖および、直接または連結部分を介してＰＮＡに結合した コンジュゲートを含むＰＮＡコンジュゲートを提供する。ＰＮＡ主鎖はアミノ末 端、カルボキシル末端および複数のアミノ基を有する。核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂ ａｓｅ）は内部に位置するアミノ基を介して主鎖につなげられる。 コンジュゲートは連結部分を介して、主鎖、テザーまたは核塩基の少なくとも １つに結合している。好ましくは、コンジュゲートは主鎖に結合している。 コンジュゲートは、レポーター酵素、レポーター分子、ステロイド、炭水化物 、テルベン、ペプチド、蛋白質、芳香族性親油性分子、非芳香族性親油性分子、 リン脂質、インターカレーター、細胞レセプター結合分子、架橋剤、水溶性ビタ ミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂複合体、金属キレーター、ポルフィ リン、アルキレーターまたは高分子アミン、高分子グリコールおよびポリエーテ ルから選択される高分子化合物でありうる。好ましくは、コンジュゲートは連結 部分を介してペプチド核酸主鎖、テザーまたは核塩基に結合している。 また、次の式： ［式中、 ｍは１から約５０の整数であり； ＬおよびＬｍは、独立して、Ｒ¹²（Ｒ¹³）_aであり；ここで Ｒ¹²は、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に生ずる核塩基、 天然に生じない核塩基、芳香族性部分、ＤＮＡインターカレーター、核塩基結合 基、複素環部分、レポーターリガンド、またはコンジュゲートであり； ただし、Ｒ¹²の少なくとも１つは天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、 ＤＮＡインターカレーター、または核塩基結合基であり； Ｒ¹³はコンジュゲートであり；そして ａは０または１であり； ＣおよびＣｍは、独立して、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり；ここで Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立して、水素、天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖、（Ｃ₂ −Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁ −Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、コンジュゲート、ＮＲ³Ｒ⁴、 ＳＲ⁵、またはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環系または複素環系を形成し；こ こで Ｒ⁵は水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ−、アルコキ シ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり；そして Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒ ドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アル キル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオまたはアミノであり； ＤおよびＤｍは、独立して、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり；ここで ｙ＋ｚの合計は２より大きいが１０以下であり； Ｇｍは、独立して、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−Ｎ Ｒ³ＳＯ−または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり； Ａ−ＡｍおよびＢ−Ｂｍのそれぞれの対は、 （ａ）ＡまたはＡｍは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の基であり、 かつＢまたはＢｍはＮまたはＲ³Ｎ⁺である；または （ｂ）ＡまたはＡｍは式(ＩＩｄ)の基であり、かつＢまたはＢｍはＣＨである； であるように選択され； 式中、 Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０以 下であり； ｒおよびｓのそれぞれは０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０以 下であり； Ｒ¹およびＲ²は、独立して、水素、(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ−置換(Ｃ₁ −Ｃ₄)アルキル、アルコキシ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、アルキルチオ−置換 （Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、ハロ ゲンまたはコンジュゲートであり； Ｉは、−ＮＲ⁸Ｒ⁹または−ＮＲ¹⁰Ｃ（Ｏ）Ｒ¹¹であり；ここで Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポ ーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水 化物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸 、ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、溶解性ポ リマー、非溶解性ポリマーまたはコンジュゲートであり； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂Ｒ⁸、−ＣＯ₂Ｒ⁹、−ＣＯＮＲ⁸Ｒ⁹、−ＳＯ₃Ｈ、−Ｓ Ｏ₂ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹または−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化された誘導体であり ；そして 式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およ びＲ¹³の少なくとも１つはコンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、レポ ーター酵素、レポーター分子、ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋 白質、芳香族性親油性分子、非芳香族性親油性分子、リン脂質、インターカレー ター、細胞レセプター結合分子、架橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、Ｒ ＮＡ開裂複合体、金属キレーター、ポルフィリン、アルキレーター、または高分 子アミン、高分子グリコールおよびポリエーテルから選択される高分子化合物で あり；該コンジュゲートは任意に連結部分を含んでいてもよい］のＰＮＡコンジ ュゲートも提供される。コンジュゲートは、好ましくは連結部分を介してＰＮＡ に結合している。 好ましい態様においては、基Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹ 、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²またはＲ¹³の少なくとも１つはコンジュゲートである。他の 好ましい態様においては、基Ａ−Ａｍの少なくとも１つは基Ｒ¹、Ｒ²またはＲ³ の少なくとも１つを含む。 基Ｂ−Ｂｍまたは基Ｇ−Ｇｍの少なくとも１つは、好ましくは少なくとも１つ の基Ｒ³を含み、前記基Ｑまたは１の少なくとも１つは、好ましくは基Ｒ⁸、Ｒ⁹ 、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹の少なくとも１つを含む。前記基Ｄ−ＤｍまたはＣ−Ｃｍの少 なくとも１つは、好ましくはＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の少なくとも１つを 含む。 好ましい態様においては、ｍは１から約２００、好ましくは１から約５０、よ り好ましくは１から約２０である。 また、次のいずれかの式の化合物も提供される： ［式中、 Ｌ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは上で定義したとおりであり； Ｅは、独立して、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ＯＨまたはその活性化 されたもしくは保護された誘導体であり； Ｆは、独立して、ＮＨＲ³またはＮＰｇＲ³であり、ここでＰｇはアミノ保護基で あり；そして Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ¹²およびＲ¹³の少なくとも１つは上で 定義したコンジュゲートであり、該コンジュゲートは好ましくは連結部分を介し て結合している。 好ましい態様においては、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の少なくとも１つは コンジュゲートである。他の好ましい態様においては、基Ｒ³の少なくとも１つ はコンジュゲートである。好ましくは、Ｒ¹²がコンジュゲートであるかまたはＲ¹³ がコンジュゲートである。いくつかの好ましい態様においては、基Ａまたは基 Ｂの少なくとも１つがコンジュゲートを含むか、または前記基Ｃまたは前記基Ｄ の少なくとも１つがコンジュゲートを含む。 また、複数のＰＮＡモノマーを含むペプチド核酸コンジュゲートが提供される 。ここで、少なくとも１つのＰＮＡモノマーは式： または式： または式： 式中、 Ｌは上で定義したとおりであり； Ｋは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり、Ｊは（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり、ここでＲ⁶、Ｒ⁷、ｙおよ びｚは上で定義したとおりであり；ｌは１から５の整数であり；そして Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ¹²およびＲ¹³の少なくとも１つは上で 定義したコンジュゲートである。好ましくは、基Ｋ、基ＪまたはＲ³の少なくと も１つは、好ましくは連結部分を介して結合していろコンジュゲートを含む］。図面の簡単な説明 当業者には、添付の図面を参照することにより、本発明の多くの目的および利 点がよりよく理解されるであろう。 図１は、ＰＮＡ主鎖の１位における２−アミノエチル部分の機能化の例を表す 反応スキームである。 図２は、ＰＮＡ主鎖の２位における２−アミノエチル部分の機能化の例を表す 反応スキームである。 図３は、本発明のモノマーシントンの化学的変更の経路の例を表す。 図４は、本発明の実施において有用な別の経路の例を表す反応スキームである 。 図５は、ＰＮＡ主鎖のＬ−セリン部分のＯＨ基の機能化の例を表す反応スキー ムである。 図６は、実施例１１１Ａに関する電気泳動ゲルの再生であり、ＰＮＡ ＮＴＡ Ｆｅ²⁺が有効なオリゴヌクレオチド開裂剤であることを示す。 図７は、実施例１１１Ｂに関する電気泳動ゲルの再生であり、ＰＮＡ ＮＴＡ Ｆｅ²⁺がＰＮＡ−ＤＮＡトリプレックス鎖置換により標的に結合することを示す 。発明の詳細な説明 本発明は、少なくとも１つのコンジュゲート基を有する新規ペプチド核酸に関 する。それぞれのＰＮＡモノマーまたはポリマーは、ＰＮＡの線状部分である主 鎖を有する。主鎖は通常は、アミノ（Ｎ）末端またはその誘導体からカルボキシ ル（Ｃ）末端またはその誘導体へと定義される。ある好ましい態様においては、 主鎖はＮ末端、Ｃ末端、ＰＮＡ中のモノマーユニットの数より１つ少ない数のア ミド結合、およびＰＮＡ中のモノマーの数と等しい数の内部置換アミン基を有す る。 ＰＮＡ主鎖のＮ末端または内部アミド窒素は、置換基を有していてもよいいく つかのメチレン基により最も近い置換アミノ基から分離されている。好ましい態 様においては、そのようなメチレン基が２つ存在する。置換アミノ基はテザーに 結合しており、該テザーはリガンドに結合している。リガンドは典型的には核塩 基である。 置換アミノ基は、置換基を有していてもよい１つまたはそれ以上のメチレン基 により、ＰＮＡ主鎖のＣ末端カルボキシル基または内部ペプチジルカルボニル基 から分離されている。好ましい態様においては、そのようなメチレン基が１つ存 在する。すなわち、これらの好ましい態様においては、ｎ個のモノマー性ユニッ トのＰＮＡ主鎖は次の構造を有する： Ｈ−［ＨＮ−（ＣＨ₂）₂−Ｎ（テザー−核塩基）−（ＣＨ₂）−ＣＯ］_n−ＯＨ 式中、メチレン基は水素のかわりに任意に置換基を有していてもよい。 本発明のモノマーおよびオリゴマーは、オリゴマー中のＮ末端、Ｃ末端、主鎖 メチレン（主鎖中のすべてのメチレンを含む）、内部置換アミン、テザー、リガ ンドまたはモノマー間のアミド結合に付加した少なくとも１つのコンジュゲート を含む。 本明細書において用いる場合、用語「核塩基」は、天然に生ずる複素環塩基、 例えばアデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル、および天然に生 じない核塩基類似体、相同体および修飾した核塩基、例えば除去可能な保護基を 有するものを含む。いくつかの代表的な核塩基リガンドおよび例示的合成リガン ドは、ＷＯ９２／２０７０２の図２に示されている。 認識されるように、本発明にしたがって種々のＰＮＡコンジュゲートを製造す ることができる。代表的なコンジュゲートは、ホモポリマー性ＰＮＡ鎖またはヘ テロポリマー性ＰＮＡ鎖（例えば、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡのキメ ラ）から形成することができる。キメラ鎖のそれぞれのＰＮＡ鎖またはＰＮＡ部 分は、好ましくは、天然に見いだされる位置、すなわち、アデニンまたはグアニ ンについては９位、およびチミンまたはシトシンについては１位において結合基 を介して主鎖に連結した複数のリガンドＬ（典型的には核塩基）を含む。あるい は、リガンドは、天然に生じない核塩基（核塩基類似体）、別の塩基結合部分、 芳香族性部分、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、ヒドロキシまたは水素であってもよ い。Ｌはまた、任意の連結基を介して付加しているコンジュゲートでさらに置換 されていてもよい。ある好ましい態様においては、Ｌはコンジュゲートである。 モノマーシントンにおいては、ＷＯ９２／２０７０２の図４に示されるように、 Ｌは保護基でブロックされていてもよい。 本明細書において用いる場合、用語「コンジュゲートは」、レポーター酵素、 レポーター分子、ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋白質、芳香族 性親油性分子、非芳香族性親油性分子、リン脂質、インターカレーター、細胞レ セプター結合分子、架橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ開裂複合 体、金属キレーター、ポルフィリン、アルキレーター、および高分子アミン、高 分子グリコールおよびポリエーテル等の高分子化合物を含む。本発明のＰＮＡは 、 直接または任意の連結部分を介して付加している少なくとも１つのコンジュゲー トを含む。このように誘導化した場合、ＰＮＡは、例えば、診断または治療薬と して、他の特性を試験構造中の相補的な核酸に与え、または診断または治療薬を 細胞膜を通して輸送することに有用である。このような診断または治療薬は、オ リゴマー性化合物が、天然に生ずるまたは天然に生じない核塩基を目的とするＲ ＮＡまたはＤＮＡの領域に相補的でありそれと特異的にハイブリダイズするであ ろう配列で有するモノマー性ユニットを含む、本発明のオリゴマー性化合物から 形成される。すなわち、本発明のオリゴマー性化合物は、任意の連結部分を介し てオリゴマー性化合物に付加されたコンジュゲートを含むように「機能化され」 ている。同定の目的のためには、そのような機能化されたオリゴマー性化合物は 、置換基含有（例えば、ステロイド含有）オリゴマー性化合物として特徴づける ことができる。そのようなオリゴマー性化合物は、その活性を調節するためにそ れに付加された少なくとも１つのコンジュゲートを有するであろう。 本発明のオリゴマー性化合物は、種々の他の標的分子に結合させるのに有用で あろう。本発明の標的分子は、種々の生物学的に重要な分子のいずれかを含むこ とができる。標的分子には、核酸、炭水化物、糖蛋白質または他の蛋白質が含ま れうるが、これらに限定されない。 本発明のＰＮＡオリゴマーおよびモノマーシントンは、コンジュゲートがそれ に共有結合するように構築される。本発明の１つの観点においては、コンジュゲ ートはＰＮＡに付加された分子種であり、所望のＰＮＡの活性、輸送、取り込み または寿命を、調節、最適化または変更するかさもなくばこれらに影響を与える 。 本発明の目的のためには、用語「修飾する」とは、それへの付加、それからの 除去、その切断または他の方法により、その結果が修飾されたものと本質的に異 なるように、特性を変化させることを意味する。用語「調節する」とは、特性の 大きさを変化（すなわち増加または減少）させることを意味する。 ＰＮＡモノマーはコンジュゲートを含むように機能化および誘導化することが でき、得られるコンジュゲートされたモノマーは、ＰＮＡオリゴマー中に取り込 ませることができる。あるいは、１つまたはそれ以上のコンジュゲートを、予め 定められた位置において機能化されているオリゴマー性ＰＮＡ中に取り込ませる ことができる。当業者は、コンジュゲートの付加のために広範な化学物質を本発 明に適用しうることを理解するであろう。 テザーＡは広範な種類の基、例えば−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ（Ｏ）−、−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ（Ｓ ）−、−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ（Ｓｅ）−、−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ³）−、−ＣＲ¹Ｒ² Ｃ（ＣＨ₂）−および−ＣＲ¹Ｒ²Ｃ［Ｃ（ＣＨ₃）₂］−（式中、Ｒ¹、Ｒ²および Ｒ³は上で定義したとおりである）でありうる。好ましくは、Ａはメチレンカル ボニル（−ＣＨ₂ＣＯ−）、アミド（−ＣＯＮＲ³−）、または、ＢがＲ³Ｎ⁺であ るときＢと一緒になってウレイド（−Ｎ⁺Ｒ³ＣＯＮＲ³−）である。Ａはまたよ り長い鎖部分、例えばプロパノイル、ブタノイルまたはペンタノイル、またはＯ がＸの他の部分により置き換えられているか鎖がＲ¹Ｒ²で置換されているかまた はＹ（ここでＹは複素原子である）を含む、対応する誘導体でありうる。さらに 、Ａは（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキレン鎖またはＲ¹Ｒ²で置換されているかもしくはＹ（ ここでＹは複素原子である）を含む（Ｃ₂−Ｃ₆）アルキレン鎖でありうる。ある 態様においては、Ａは単結合である。 １つの好ましい態様においては、Ｂは窒素原子であり、このことにより、アキ ラル主鎖の可能性を提示する。ＢはまたＣＨまたはＲ³Ｎ⁺（ここでＲ³は上で定 義したとおりである）でありうる。 好ましい態様においては、Ｃは−ＣＲ⁶Ｒ⁷−または２炭素ユニット、すなわち −ＣＨＲ⁶ＣＨＲ⁷−または−ＣＲ⁶Ｒ⁷ＣＨ₂−（ここでＲ⁶およびＲ⁷は上で定義 したとおりである）である。Ｒ⁶およびＲ⁷はまた、ヘテロアリール基、例えば、 ピロリル、フリル、チエニル、イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニル、インド リルであることができ、または一緒になって脂環系、例えば、１，２−シクロブ タンジイル、１，２−シクロペンタンジイルまたは１，２−シクロヘキサンジイ ルを完成することができる。Ｃはまた、例えばＲ⁶および／またはＲ⁷において、 コンジュゲートの付加点として用いることもできる。ある好ましい態様において は、Ｇは−ＣＯＮＲ³である。 モノマー性の態様においては、ＦはＮＨＲ³またはＮＰｇＲ³（ここでＰｇはア ミノ保護基である）であることができ、ＥはＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ₂ＯＨま たはそれらの活性化された誘導体であることができる。ポリマー性の態様におい ては、基ＥおよびＦを活性化して化学的に組み合わせて基Ｇを形成し、したがっ て、これは−ＣＳＮＲ³−、−ＳＯＮＲ³−、または−ＳＯ₂ＮＲ³−でありうる。 活性化は、例えば酸無水物または活性エステル誘導体を用いて実施することがで き、ここでＥで表される基中のヒドロキシは成長しつつある主鎖を発生させるた めに適した脱離基で置き換えられている。 場合によっては、コンジュゲートをいずれかの末端（Ｑ、Ｉ）に付加して、得 られるＰＮＡの結合特性を調節することが有用であろう。代表的なコンジュゲー トには、ｄｓＤＮＡ結合を改良し細胞取り込みを増加させるＤＮＡインターカレ ーターおよび静電気的相互作用によりＰＮＡの結合を強化するリシンまたはポリ リシン等の塩基性基が含まれる。他の成分は非末端位置に存在することができる 。オリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオシドは、末端位置Ｑまたは １に共有結合させて、ＰＮＡ部分およびオリゴヌクレオチドおよび／またはオリ ゴヌクレオシド部分を含むキメラを形成することができる。ヌクレオシドおよび ／またはヌクレオチド（一リン酸、二リン酸、または三リン酸）を末端位置に付 加することもできる。 図１は、ＰＮＡ主鎖の１位における２−アミノエチル部分の機能化の例を表す 反応スキームである。市販の（Ｏ−ベンジル）Ｂｏｃ−セリンから出発し、ジア ゾメタンおよびＭｅＯＨを用いて酸をメチルエステルとして保護し、完全に保護 された化合物３０Ａを得る。化合物３０Ａをエステルにおいて還元して遊離ヒド ロキシルを有する化合物３０Ｂを得て、これを標準的なミツノブ化学を用いて保 護されたアミン化合物３０Ｃに転換する。化合物３０Ｃをブロモ酢酸メチルと反 応させて、モノマー性主鎖ユニットを形成し、これをさらにクロロカルボニル機 能化核塩基または他のリガンドと反応させて、側鎖がＯ−ベンジルとして保護さ れた機能化モノマーを形成する。フタルイミド基を除去し、遊離アミンをＢＯＣ 基で保護し、モノマーをＭＢＨＡリシン樹脂に結合させて、固体支持体に結合し た最初のモノマーを得る。次に、支持体結合モノマーをＴＦＡを用いて脱保護し 、第２の機能化されたモノマーまたは機能化されていないモノマーと反応させて ダイマーを得る。所望のＰＮＡが組み立てられるまで、このプロセスを反復様式 で繰り返す。 図２は、ＰＮＡ主鎖の２位の２−アミノエチル部分の機能化の例を表す反応ス キームである。化合物３０Ｃをヒドラジンおよびエタノールで脱保護して化合物 ３４Ａを得て、これをさらにブロモ酢酸メチルと反応させて機能化された主鎖化 合物３４Ｂを得る。化合物３４Ｂを塩化アセチル活性化核塩基または他のリガン ドと反応させて、側鎖がベンジルエーテルとして保護された機能化モノマーを形 成する。塩化１−チミニルアセチルをアセチルクロロカルボニル機能化核塩基と して用いると化合物３４が得られる。次に図１に示されるように化合物３４を適 切な樹脂に結合させる。次に支持体結合モノマーをでＴＦＡで脱保護し、別のモ ノマーと反応させて所望のＰＮＡ鎖を得る。 図３は、ＰＮＡモノマー側鎖の変換を表す。ヒドラジンおよびＢｏｃ₂Ｏ／Ｎ ａＯＨを用いて化合物３０をフタルイミド保護アミンからＢｏｃ保護アミンに転 換し、ベンジル保護ヒドロキシルを水素分解により脱保護して化合物３５を得る 。これはヒドロキシル基に典型的な活性化および置換反応に供することができる 。すなわち、本発明のＰＮＡオリゴマーおよびモノマーシントンは、ＤＮＡおよ びＲＮＡ２’−および３’−ヒドロキシルの誘導化に有用な多くの化学種で機能 化することができる。 すなわち、本発明のＰＮＡモノマーに付加された連結部分を種々のプロセスに より修飾し、これを広範な種類のコンジュゲートまたはそれ自体連結部分で機能 化されたコンジュゲートとの連結に供することができる。 化合物３５はまた、酸化してカルボニル（アルデヒド）化合物３７Ａとしても よい。化合物３７Ａはシッフ塩基連結に供することができ、これを例えば、ホウ 水素化ナトリウムを用いて還元的アミノ化により安定化することができる。化合 物３７Ａはまた、活性カルボニル基のエノレート縮合、有機金属反応、安定化ウ ィティッヒ反応、および当業者に明らかな他の反応によりさらに機能化すること ができる。 図４は機能化された主鎖の別の経路を表す。市販のＢＯＣ−セリンをトリフェ ニルホスフィン／ＤＥＡＤと、次にＴＦＡ／ＴｓＯＨと反応させて、化合物４６ Ａを生成する。化合物４６Ａをガブリエル試薬と反応させて、化合物４６Ｂを得 る。アミン官能基をフタルイミドとして保護し、エタノールでエステル化して化 合物４６Ｃを得る。ＴＦＡにより脱保護して化合物４６Ｄを得て、これを、図１ に示されるように、モノマーの２−アミノエチル部分の２位で機能化されたＰＮ Ａモノマーの製造に用いることができる。ヒドラジンで脱保護して化合物４６Ｅ を得て、これを、図２に示されるように、モノマーの２−アミノエチル部分の１ 位で機能化されたＰＮＡモノマーの製造に用いることができる。 ヒドラジンまたはＴＦＡのいずれかによる化合物４６Ｃの選択的脱保護により 、モノマーの２−アミノエチル部分の１位または２位で機能化されたモノマーを 合成しうることがわかるであろう。 主鎖の別の位置における機能化は図５に示されている。３−(Ｂｏｃ−アミノ) −１，３−プロパンジオールを過ヨウ素酸酸化によりＮ−Ｂｏｃ−アミノアセト アルデヒド化合物３９Ａに転換する。方法Ａの方法にしたがって、化合物３９Ａ を氷酢酸およびトリアセトキシホウ水素化ナトリウムで処理すると、中間体化合 物３９Ｂが得られるであろう。化合物３９Ｂは、化合物３０Ｄおよび３４Ｂと同 様の方法により、第２アミノ基に付加された種々の異なる官能基を有することが できる。化合物３９Ｂをさらに１ＮＮａＯＨ中で１−カルボキシメチルチミニル （化合物３）と反応させて化合物３９を得る。化合物３９のベンジル保護セリン ヒドロキシルを実施例４２の方法にしたがって脱保護し、実施例４３の方法によ り酸化してホルミル基とする。ホルミル化合物をさらに機能化して、実施例４４ の方法によりアミノエチル化合物を得る。化合物４４を多くの異なる方法により 処理して、本発明の他の化合物を得ることができる。 本発明の１つの観点においては、化合物４４を保護基で処理し、ＰＮＡオリゴ マー中に取り込ませ、脱保護し、さらに任意の連結部分を有していてもよいコン ジュゲートで機能化する。本発明の別の観点においては、化合物４４をテザーで 機能化し、次にＰＮＡオリゴマー中に取り込ませる。オリゴマー化の後、保護基 を除去し、テザーを任意の連結部分を有していてもよいコンジュゲートと反応さ せる。本発明のさらに別の観点においては、オリゴマー化の前に、任意の連結部 分を有していてもよいコンジュゲートを化合物４４に結合する。当業者は、上述 の方法および技術の多くの変更を本発明に適用しうることを理解するであろう。 本発明のＰＮＡについては、１つまたはそれ以上の機能化されたモノマーを鎖 に取り込ませることが有利であることがわかるであろう。モノマーは、独立して 、上述のようにモノマーの２−アミノエチル部分の１位または２位で機能化して もよく、または別の位置、例えば上述のようにＯ−リシンにおいて機能化しても よい。 本明細書で用いる場合、ＰＮＡオリゴマーとの用語は、連結したＰＮＡモノマ ーを意味する。オリゴマーを作り上げるモノマーはまたシントンとも称される。 好ましい連結は連続するＰＮＡモノマー間のアミド結合である。コンジュゲート は、上述したようなＰＮＡ主鎖またはリガンドＬまたはテザーＡへの化学結合に より所定のＰＮＡに付加することができる。本明細書で用いる場合、用語「ＰＮ Ａ主鎖」は、ＰＮＡの線状高分子鎖を意味することを意図する。 主鎖を形成するアミノ酸は、同一であっても異なっていてもよい。２−アミノ エチルグリシンに基づくものは、本発明の目的に特によく適合する。他の主鎖は 、２−アミノエチルセリンベンジルエーテルである。好ましいものは、コンジュ ゲート、または他の連結部分との結合を行うことができる連結部分を含むように 機能化された主鎖であり、この連結部分をコンジュゲートに付加する。 すなわち、その中に含まれる連結部分を有する本発明にしたがうモノマーシン トンを形成し、所望のコンジュゲート基をＰＮＡオリゴマーを組み立てる前また は後に連結部分に結合させることができる。すべてのモノマーシントンが機能化 されている必要がないことがわかるであろう。しかし、有利であれば、所定のＰ ＮＡオリゴマー中のすべてのモノマーがそのように機能化されていてもよい。 コンジュゲートは、２つの官能基の反応からの化学結合の形成により、連結部 分、ＰＮＡモノマー、またはＰＮＡオリゴマーに付加される。化学結合の形成の ための代表的な官能基には、ヒドロキシ、ホルミル、カルボキシまたは他の活性 炭素種、アミノ、置換アミノ、チオ、スルホキソ、スルホノ、亜硫酸もしくは硫 酸エステル、またはコンジュゲート基との化学結合を行いうる他の種が含まれる が、これらに限定されない。官能基はまた、保護されたまたは「マスクされた」 ものを含む。保護基はそれ自体、アミン基およびチオール基等の官能基に選択的 に結合できかつそれから除去することができる化学官能基として知られている。 これらの基は、化学化合物中に存在して、化合物がさらされる化学反応条件に対 してそのような官能基を不活性とする。例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕｔ ｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈ ｅｓｉｓ，２ｄ ｅｄ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９１を参照されたい。 場合によっては、連結部分を介してコンジュゲート基をＰＮＡオリゴマーまた はモノマーシントンに連結させることが有利である。本発明の実施において有用 な代表的な連結部分は、”Ｔｈｉｏｌ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｏ ｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ”と題する米国特許出 願０８／１１６，８０１（１９９３年９月３日出願）および、”Ａｍｉｎｅ−Ｄ ｅｒｌｖａｔｉｚｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ ｅｏｓｉｄｅｓ”と題する米国特許出願１１７，３６３（１９９３年９月３日出 願）（この開示を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。 すなわち、本発明のモノマーシントン（および、したがって究極的にはＰＮＡ オリゴマー）は、コンジュゲート基の連結のためのいくつかの官能基の任意の１ つ、またはコンジュゲート基に付加されたリンカー（すなわち、カルボキシ、ホ ルミル、チオ、ヒドロキシ、アミノ、および同様のもの）を含むように構築する ことができる。当業者は、本発明のＰＮＡモノマーおよびオリゴマーを広範な種 類の連結官能基にコンジュゲートさせることができることを理解するであろう。 例えば、遊離アミノ基を含有するコンジュゲートをＰＮＡモノマーシントンまた はＰＮＡオリゴマーに付加するためには、カルボキシル基を含有するようにモノ マーを機能化し、標準的な化学を用いてアミド結合を生成させることができる。 同様に、場合によっては、実施例８５に記載されるように、還元的アミノ化によ りホルミル部分で機能化されたＰＮＡモノマー性ユニットを介してアミノ基を付 加することが有利であろう。一般に、モノマーシントン上の特定の官能基は、コ ンジュゲート基または連結分子上の利用可能な官能基により選択されるであろう 。当業者は、標準的な原理を適用することにより官能基の最適な対合を決定する ことができるであろう。 本発明の１つの観点は、上述のように、ＰＮＡ主鎖、テザーまたはリガンド位 置に少なくとも１つのチオール含有連結部分を有するＰＮＡに関する。コンジュ ゲートをＰＮＡ主鎖、リガンドまたはテザー位置に付加するために有用な代表的 なチオール連結部分は、−ＮＨ−（ＣＨ₂）₆−Ｓ−Ｈおよび−ＣＨ₂−Ｏ−（Ｃ Ｈ₂）₆−Ｓ−Ｈ（ここで、Ｈは任意に保護基で置き換えられていてもよい）であ る。これらの連結部分の多数の変更が可能であることが容易にわかるであろう。 多くのチオール保護基が当該技術分野において知られており、これには、トリフ ェニルメチル（トリチル；Ｔｒ）およびＳ−ｔ−ブチル、Ｓ−ｐ−ニトロベンジ ル、およびＳ−ｐ−メトキシ−ベンジル（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｗｕ ｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔ ｈｅｓｉｓ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。 本発明にしたがう好ましいリンカー基には、１から約１２個の炭素原子を有す るものから独立して選択されるアルキル部分、または酸素、イオウおよび窒素等 の適切な複素原子が間に置かれてポリエーテル、ポリチオエーテルまたはポリア ルキルアミンを形成しているアルキル基が含まれる。用語「アルキル」とは、直 鎖および分枝鎖の炭化水素を含むことを意図するものである。そのようなリンカ ー中では、これらの炭化水素の好ましい長さは１から約７個の炭素原子である。 他のリンカーには、ヘテロ二官能性およびホモ二官能性リンカーが含まれる。 本発明の目的のためには、用語「レポーター分子」および「レポーター酵素」 は、ゲル、液体、全細胞系、破壊細胞系および同様のものにおいて、分光光度、 放射活性、比色アッセイ、蛍光、および特異的結合等の物理学的性質を用いて同 定することを可能とする物理学的または化学的性質を有する分子または酵素を含 む。レポーター分子として特に有用なものは、ビオチン、ローダミン、クマリン およびフルオレセイン染料等の染料分子である。レポーター酵素として特に有用 なものは、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼである。 ステロイドは、ペルヒドロ−１，２−シクロペンタノフェナントレン環系を含 有する化学化合物を含む。ステロイド分子として特に有用なものは、コール酸、 デオキシコール酸およびデヒドロコール酸等の胆汁酸；コルチゾン、ジゴキシゲ ニン、テストステロンおよびコレステロール等のステロイドであり、コルチゾン 環の３位で二重結合により結合したトリメチルアミノメチルヒドラジド基を有す るコルチゾン等のカチオン性ステロイドであってもよい。 蛋白質およびペプチドは、アミノ酸のポリマーであるというそれらの有用な意 味において用いられる。通常は、ペプチドは、蛋白質と比較してユニット分子あ たりにより少ない数のアミノ酸を含有するポリマーである。ペプチドおよび蛋白 質として特に有用なものは、配列特異的ペプチドおよびホスホジエステラーゼ、 ペルオキシダーゼ、ホスファターゼおよびヌクレアーゼ蛋白質等の蛋白質である 。そのようなペプチドおよび蛋白質には、ＳＶ４０ペプチド、ＲＮａｓｅＡ、Ｒ ＮａｓｅＨおよびスタフィロコッカスヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定 されない。 親油性分子には、天然に生ずるおよび合成の芳香族性および非芳香族性部分、 例えば、脂肪酸、エステル、アルコールおよび他の脂質分子、アダマンタンおよ びバクミンスターフラーレン等のケージ構造、およびベンゼン、ペリレン、フェ ナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセンおよびナフタセン等 の芳香族性炭化水素が含まれる。親油性分子として特に有用なものには、脂環炭 化水素、飽和および不飽和脂肪酸、ワックス、テルペンおよびアダマンタンおよ びバクミンスターフラーレン等のポリ脂環炭化水素が含まれる。テルペノイドと して特に有用なものには、ビタミンＡ、レチノイン酸、レチナールおよびデヒド ロレチノールである。 本発明にしたがうアルキレーターは、標的の分子構造に求電子基を結合させる ことができる部分である。代表的なアルキレーターは、Ｍｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８９，１１１，８５１７により開示され ている。 インターカレーターは、正常なワトソン−クリック塩基対に影響を与えること なく隣接する塩基対の間に挿入しうるポリ環状芳香族性部分である。代表的なイ ンターカレーターは、ピレン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジ ン、アントラキノン、アクリジンであり、これらのおよび他の例は、Ｍａｎｏｈ ａｒａｎ、Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，ｅｄｓ．，ＣＲＣ Ｐ ｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３によりさらに開示されている。ピレ ンには、ピレンおよび標準的なプロトコールを用いてコンジュゲートしうる他の ピレン系カルボン酸が含まれる。本発明のインターカレーターはまた、ハイブリ ッドインターカレーターを含む。ハイブリッドインターカレーターの１つの例は 、ホトヌクレアーゼ／インターカレーターである６−［［［９−［［６−（４− ニトロベンズアミド）ヘキシル］アミノ］アクリジン−４−イル］カルボニル］ アミノ］ヘキサノイル−ペンタフルオロフェニルエステルである。この化合物は ２つの重要な性質を有する：インターカレーターであるアクリジン部分およびホ トヌクレアーゼであるｐ−ニトロベンズアミノ基。 本発明にしたがう細胞レセプター結合分子は、その特異的レセプターが細胞内 に存在するビタミンおよび炭水化物部分である。代表的な細胞レセプター結合分 子は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６（１９９２年１０月２３日出 願、この内容を本明細書の一部としてここに引用する）に開示されている。 架橋剤は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの鎖内または鎖間共有結合を行いうる 部分である。代表的な架橋剤は国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９３／０２０５９（１ ９９３年５月５日出願、この内容を本明細書の一部としてここに引用する）に開 示されている。ペプチド核酸は、この出願および国際特許出願ＷＯ９２／２０７ ０２（１９９２年１１月２６日公開）に開示されている。 本発明の架橋剤は光架橋剤を含む。光架橋剤の１つの群は、アリールアジド、 例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベンゾエート（ＨＳＡＢ） およびＮ−スクシンイミジル−６（−４’−アジド−２’−ニトロフェニル−ア ミノ）ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡＨ）である。ＰＮＡにコンジュゲートされた アリールアジドは、照射により核酸および蛋白質と架橋するであろう。これらは また担体蛋白質（例えばＫＬＨまたはＢＳＡ）と架橋して、オリゴヌクレオチド に対する抗体を生じさせることができる。 本発明にしたがうビタミンは、一般に水溶性または脂溶性として分類される。 水溶性ビタミンには、チアミン、リボフラビン、ニコチン酸またはナイアシン、 ビタミンＢ₆ピリドキサール群、パントテン酸、ビオチン、葉酸、Ｂ₁₂コバミド 補酵素、イノシトール、コリンおよびアスコルビン酸が含まれる。脂溶性ビタミ ンには、ビタミンＡファミリー、ビタミンＤ、ビタミンＥトコフェロールファミ リーおよびビタミンＫ（およびフィトール）が含まれる。レチノイン酸およびレ チノールを含むビタミンＡファミリーは、特定の蛋白質、例えば、サイトゾルレ チノール結合蛋白質タイプＩＩ(ＣＲＢＰ−ＩＩ)、レチノール−結合蛋白質(Ｒ ＢＰ)、および細胞性レチノール結合蛋白質（ＣＲＢＰ）とのそれらの相互作用 を介して標的組織に吸着され輸送される。ヒト身体の種々の部分において見いだ されているこれらの蛋白質は、約１５ｋＤの分子量を有する。これらは、ビタミ ンＡファミリーの化合物、特に、レチノイン酸およびレチノールと特異的相互作 用を有する。 ビタミンＡファミリーの化合物は、種々のファミリーメンバーに見いだされる 酸またはアルコール官能基を介して本発明のＰＮＡオリゴマーに付加することが できる。例えば、レチノイン酸の酸部分のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステ ルをＰＮＡまたはＰＮＡに付加されたリンカーのアミン官能基にコンジュゲート させることにより、ビタミンＡをアミド結合によりＰＮＡに結合させることがで きる。 α−トコフェロール（ビタミンＥ）および他のトコフェロール（ベータからゼ ータ）をＰＮＡにコンジュゲートさせて、それらの親油性特性により取り込みを 増強させることができる。また、親油性ビタミンであるビタミンＤおよびそのエ ルゴステロール前駆体を、まずヒドロキシル基を活性化して例えばヘミスクシネ ートエステルとすることにより、それらのヒドロキシル基を介してＰＮＡに付加 することができる。次に、ＰＮＡからのアミノリンカーに、または本明細書に記 載される他の適切な官能基を介してＰＮＡ主鎖にコンジュゲートさせることがで きる。ビタミン上のヒドロキシル基を介してＰＮＡまたはＰＮＡアミノリンカー にコンジュゲートすることができる他のビタミンには、チアミン、リボフラビン 、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサール、デオキシピリドキシンが含 まれる。脂溶性ビタミンＫおよび関連するキノン含有化合物は、キノン環上のカ ルボニル基を介してコンジュゲートすることができる。ビタミンＫのフィトール 部分もまた、ＰＮＡの細胞への結合を増強するのに役立つであろう。 ピリドキサール（ビタミンＢ₆）は、特異的Ｂ₆結合蛋白質である。これらの蛋 白質のピリドキサール輸送における役割は、Ｚｈａｎｇ ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍ ｉｃｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８，１ ０４０７により研究されている。ＺｈａｎｇおよびＭｃＣｏｒｍｉｃｋはまた、 いくつかの合成アミンがピリドキサールの４’位にコンジュゲートされている一 連のＮ−（４’−ピリドキシル）アミンが、Ｂ₆輸送体により行われるプロセス により細胞内に入ることが可能であることを示した。彼らはまた、これらの合成 アミンが細胞内で放出されることを示した。他のピリドキサールのファミリーの メンバーには、ピリドキシン、ピリドキサミン、ピリドキサールリン酸、および ピリドキシン酸が含まれる。ピリドキシン酸、ナイアシン、パントテン酸、ビオ チン、葉酸およびアルコルビン酸は、レチノイン酸について上述したように、Ｐ ＮＡまたはＰＮＡ上に存在するアミノリンカーと反応性であるＮ−ヒドロキシス クシンイミドエステルを用いてＰＮＡにコンジュゲートさせることができる。 ＰＮＡの性質を変更させる他の基には、ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂複合体が含まれる 。ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂剤には、ｏ−フェナントロリン／金属複合体およびＲｕ（ ビピリジン）₃ ²⁺複合体が含まれる。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺複合体は、核酸と相互作 用して、核酸を光化学的に開裂する。金属キレーターには、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ 、ニトリロトリアセテート（ＮＴＡ）、およびｏ−フェナントロリンが含まれる 。ポルフィリンには、ポルフィン、その置換形、および金属複合体が含まれる。 本明細書中で用いられる場合、ポリアミンまたは高分子アミン種は、複数の窒 素原子を有する種を表す。ポリアミンには、第１アミン、ヒドラジン、セミカル バジン、チオセミカルバジンおよび類似の窒素性種が含まれる。そのような種は 、ポリアミン含有ポリマー等の対称種であってもよく、またはそれらは、ポリア ミンのアミン官能基が異なる成分により分離されている非対称のものであっても よい。炭素原子に加えて、他の原子種、例えば窒素およびイオウがポリアミン種 中に取り込まれていてもよい。本発明のある好ましい態様においては、ポリアミ ンの少なくとも１つの窒素原子は遊離電子対を有する。 ポリアミンとして好ましいものは、約３から約２０ユニットの範囲の長さの種 である。より好ましくは、少なくとも１つの窒素原子を有する種は、一般式Ｈ₂ Ｎ（（ＣＨ₂）_nＮＨ］_m−（式中、ｎは２−８の整数であり、ｍは１−１０の整 数である）を有する。これらの種は、線状または環状でありうる。環状アミンに は、クラウンアミンおよび混合クラウンアミン／クラウンエーテルが含まれる。 ポリアミンの形成に適切な他の適切な窒素含有化合物には、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖ア ルキルアミン、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖置換アルキルアミン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルア ミンＣ₂−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキルアミン、Ｃ₃ −Ｃ₅₀環状置換アルキルアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直 鎖置換アルケニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルアミン、Ｃ₃−ＣＳＯ分枝 鎖置換アルケニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルケニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換 アルケニルアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルキニルアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキ ニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキニ ルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀）環状アルキニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルキニルア ミン、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルヒドラジン、Ｃ₁−Ｃ₅₀直鎖置換アルキルヒドラジ ン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルヒドラジン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキルヒドラ ジン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルカン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルカン， Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルヒドラジン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルケニルヒドラジン 、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルヒドラジン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルケニルヒド ラジン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルケン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルケン 、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルキニルヒドラジン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニルヒドラジ ン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルヒドラジン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキニルヒ ドラジン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルキン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルキ ン，Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルヒドロキシアミン、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖置換アルキルヒド ロキシアミン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルヒドロキシアミン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖置 換アルキルヒドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状オキシアルキルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀ 環状置換オキシアルキルアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルヒドロキシアミン、 Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルケニルヒドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルヒ ドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルケニルヒドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀ 環状オキシアルケニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換オキシアルケニルアミン、Ｃ₂ −Ｃ₂₀直鎖アルキニルヒドロキシアミン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニルヒドロ キシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルヒドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置 換アルキニルヒドロキシアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀ 環状オキシアルキニルアミン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換オキシアルキニルアミン、 Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルセミカルバジド、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖置換アルキルセミカルバ ジド、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキル セミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキルセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ア ルキルセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直 鎖置換アルケニルセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルセミカルバジド 、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルケニルセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルケニルセ ミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルケニルセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖ア ルキニルセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニルセミカルバジド、Ｃ₃− Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキニルセミカ ルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキニルセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルキ ニルセミカルバジド、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルチオセミカルバジド、Ｃ₁−Ｃ₂₀直 鎖置換アルキルチオセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルチオセミカルバ ジド、Ｃ₂−Ｃ₅₀鎖置換アルキルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキルチ オセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルキルチオセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀ 直鎖アルケニルチオセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルケニルチオセミカ ルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置 換アルケニルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状、アルケニルチオセミカルバ ジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルケニルチオセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルキ ニルチオセミカルバジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニルチオセミカルバジド、 Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキニ ルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキニルチオセミカルバジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀ 環状置換アルキニルチオセミカルバジド、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルヒドラゾン 、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖置換アルキルヒドラゾン、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルヒドラゾン 、Ｃ₂−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキルヒドラゾン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルカン、 Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルカン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルヒドラゾン、Ｃ₂ −Ｃ₂₀直鎖置換アルケニルヒドラゾン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルヒドラゾン 、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルケニルヒドラゾン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルケン 、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルケン、 Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルキニルヒドラゾン、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニルヒドラゾン 、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルヒドラゾン、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキニルヒド ラゾン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状ヒドラゾアルキン、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換ヒドラゾアルキン ，Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖アルキルヒドラジド、Ｃ₁−Ｃ₂₀直鎖置換アルキルヒドラジド、 Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルキルヒドラジド 、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルキルヒドラジド、 Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルケニルヒドラジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルケニルヒドラジド 、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルケニルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アルケニルヒド ラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルケニルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状置換アルケニルヒ ドラジド，Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖アルキニルヒドラジド、Ｃ₂−Ｃ₂₀直鎖置換アルキニル ヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖アルキニルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀分枝鎖置換アル キニルヒドラジド、Ｃ₃−Ｃ₅₀環状アルキニルヒドラジドおよびＣ₃−Ｃ₅₀環状置 換アルキニルヒドラジドが含まれる。 本発明の好ましい態様にしたがえば、ポリアミンは線状または環状の非芳香族 性ポリアミンである。有用な種類の環状非芳香族性ポリアミンは、Ｓｔｕｄｅｒ ，ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ １９８６，６９，２０８１お よびＳｍｉｔｈ−Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈ ｅｍ．１９９１，２，４１５により開示されるクラウンアミンである。本発明の さらに好ましい態様においては、ポリアミンは非アミド窒素原子を含む線状また は環状の非芳香族性である。非アミドとは、カルボニル基（すなわちＣ＝Ｏまた はＣ＝Ｓ）に隣接していない窒素である。 代表的なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）含有基は、Ｏｕｃｈｉ，ｅｔ ａ ｌ．，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ １９９２，９， ９３，Ｒａｖａｓｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６ ，４３２９；Ｄｅｌｇａｒｄｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅ ｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅ ｍｓ １９９２，９，２４９に開示されている。ポリエチレングリコールおよび ポリエーテルには、線状および環状化合物の両方が含まれる。環状ポリエーテル はクラウンエーテルを含む。 本明細書において用いる場合、アルキルとの用語には、Ｃ₁−Ｃ₁₂の直鎖およ び分枝鎖のアルキル、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘ キシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、イソプ ロピル、２−ブチル、イソブチル、２−メチルブチル、イソペンチル、２−メチ ルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシルおよび２−プロピルペン チルが含まれるが、これらに限定されない。アルケニル基には、上述のアルキル 基に由来する不飽和成分が含まれ、ビニル、アリルおよびクロチルが含まれるが 、これらに限定されない。アルキニル基には、上述のアルキル基に由来する少な くとも１つの三重結合を有する不飽和成分が含まれ、エチニルおよびプロパルギ ルが含まれるが、これらに限定されない。アリール基には、フェニル、トリル、 ベンジル、ナフチル、アントラシル、フェナントリル、ピレニルおよびキシリル が含まれるが、これらに限定されない。ハロゲンには、フッ素、塩素、ヨウ素お よび臭素が含まれる。適切な複素環基には、イミダゾール、テトラゾール、トリ アゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジンおよびモルホリンが含まれるが 、これらに限定されない。アミンには、上述のアルキル、アルケニルおよびアリ ール基のすべてのアミンが含まれ、第１および第２アミンおよびフタルイミド等 の「マスクされたアミン」が含まれる。アルカノイル化合物アルキル部分を含み 、カルボニル基を介して連結しているものであり、すなわち、構造：アルキル− Ｃ（Ｏ）−を有する基である。アラルキル基はアリール部分およびアルキル部分 の両方を有し、そのアルキル部分を介して結合する。ベンジル基はアラルキル基 の１例である。アルカリール基もまたアリール部分およびアルキル部分を有する が、そのアリール部分を介して結合する。アルコキシ基は、酸素原子を介して結 合したアルキル、アルケニルまたはアルキニル基である。 ヘテロアリール基は、芳香族性複素環、例えばピロリル、フリル、チエニル、 イミダゾリル、ピリジル、ピリミジニルおよびインドリルである。 テルペンは、イソプレンのオリゴマーとして当該技術分野において知られてお り、特にジペンテン、ピネンおよびミルセンである。テルペン分子の定義に含ま れるものは、テルペン誘導体、例えばカンファーおよびメントールである。 本明細書において用いる場合、リン脂質との用語は、加水分解によりリン酸、 アルコールおよび１つまたはそれ以上の脂肪酸を生ずる化合物を含む。リン脂質 の代表的な例には、レシチン、セファリンおよびスフィンゴミエリンが含まれる 。 アミンはまた、ポリアルキルアミノ化合物およびアミノアルキルアミン、例え ばアミノプロピルアミン、およびさらに別のヘテロシクロ−アルキルアミン、例 えばイミダゾール−１、２または４−イル−プロピルアミンを含むことを意味す る。 上述のならびに以下に記載する他の成分のための置換基には、他のアルキル、 ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、チオアルコキシ、ハロア ルコキシおよびアリール基、ならびにハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、アジド 、カルボキシ、シアノ、ニトロ、メルカプト、スルフィド、スルホン、スルホキ シド、ケト、カルボキシ、ニトレート、ニトライト、ニトロソ、ニトリル、トリ フルオロメチル、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、ＮＨ−アルキル、アミノ、シリ ル、アミド、エステル、エーテル、カーボネート、カルバメート、尿素、イミダ ゾール、インターカレーター、コンジュゲート、ポリアミン、ポリアミド、ポリ エチレングリコール、ポリエーテル、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性を増強 する基、およびオリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を増強する基が含まれる が、これらに限定されない。他の適切な置換基には、ローダミン、クマリン、ア クリドン、ピレン、スチルベン、オキサゾローピリドカルバゾール、アントラキ ノン、フェナントリジン、フェナジン、アジドベンゼン、ソラーレン、ポルフィ リンおよびコレステロールが含まれる。１つの特に好ましい基はＣＦ₃である。 典型的なインターカレーターおよびコンジュゲートには、コレステロール、リン 脂質、ビオチン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラ キノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および染料が含 まれる。ハロゲンには、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が含まれる。 本発明にしたがう化合物を製造する１つの方法は、少なくとも１つの遊離ヒド ロキシル基を有するＰＮＡオリゴマーまたはモノマー性ユニットを、塩基性条件 下で、式Ｌｖ−（ＣＨ₂）_n−Ｓ＝ＰＧ（式中、Ｌｖは脱離基であり、ＰＧは保護 基であり、ｎは１から約２０である）を有する化合物と反応させる。酸素アニオ ンの求核攻撃を介する脱離基の置換により、所望のチオール誘導体が得られる。 適切な脱離基には、ハロゲン、アルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、 アリールスルホニル、置換アリールスルホニル、ヘテロシクロスルホニル、トリ クロロアセチミデートおよびペンタフルオロフェノールが含まれるが、これらに 限定されない。より好ましい基には、クロロ、フルオロ、ブロモ、ヨード、ｐ− （２，４−ジニトロアニリノ）ベンゼンスルホニル、ベンゼンスルホニル、メチ ルスルホニル（メシレート）、ｐ−メチルベンゼンスルホニル（トシレート）、 ｐ−ブロモベンゼンスルホニル、トリフルオロメチルスルホニル(トリフレート) 、トリクロロアセチミデート、アシルオキシ、２，２，２−トリフルオロエタン スルホニル、イミダゾールスルホニルおよび２，４，６−トリクロロフェニルが 含まれ、ブロモが好ましい。 チオール含有官能基がＰＮＡ主鎖のヒドロキシル位置に付加されている態様に おいては、ＰＮＡオリゴマーまたはモノマー性ユニットの塩基部分中のアミン官 能基は、好ましくは、非酸性条件下で、ベンゾイルおよびイソブチリル基等の、 当該技術分野において知られている保護基で保護する。あるいは、チオール試薬 Ｌｖ−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−ＰＧとの反応の前に塩基を保護してもよい。適切に保護 されたＰＮＡモノマー性ユニットは、本明細書の実施例２６に開示される技術に したがって組み立てて、ＰＮＡオリゴマーとすることができる。 本発明にしたがう化合物はまた、５−ハロゲン置換ピリミジン含有ＰＮＡモノ マーシントンまたは２−もしくは８−ハロゲン置換プリンＰＮＡモノマーシント ンを、式ＨＣ≡Ｃ−ＣＨ₂−Ｑａ−ＰＧ（式中、ＱａはＯ、Ｓ、またはＮＨであ る）を有するアセチレン性試薬と、ピリミジンまたはプリン塩基をアセチレン性 試薬とカップリングさせて、ピリミジンの５位またはプリンの２位もしくは８位 に式−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ₂−Ｑａ−ＰＧを有する置換基を有するＰＮＡモノマーシン トンを形成しうる条件下で反応させることにより製造することができる。多くの 適切な保護基が当該技術分野において知られており、これには、アミン保護基、 例えばトリフルオロ酢酸、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、カルボベン ジルオキシ（ＣＢＺ）、クロロＣｂｚ、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ） 、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、イソニコチニルオキシカルボ ニル（ｉ−Ｎｏｃ）基；ヒドロキシル保護基、例えばｔ−ブチルジフェニルシリ ル、 ｔ−ブチルジメチルシリルおよびジメトキシトリチル基；およびチオール保護基 、例えばＳ−トリチル、Ｓ−ｐ−メトキシベンジルチオエーテル、Ｓ−ｐ−ニト ロベンジルチオエーテルおよびＳ−ｔ−ブチルチオエーテルが含まれるが、これ らに限定されない。(例えば、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ,ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２、３２８６；Ａｔｈｅｒｔｏｎ ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎ ｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９ ８３；Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１−３８を参照されたい)。カップリングは、好まし くはパラジウム、ニッケル、白金およびイリジウムから選択される金属の媒介に より、一般に、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ ｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９８７，１５，４８５７にしたがう条件下で行 う。カップリングを行った後、保護基を除去し、得られる遊離ヒドロキシ、チオ またはアミノ化合物を、式Ｒ₄−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−Ｒ₁（式中、Ｒ₄はＲ₅ＯＯＣ− 、ＨＳ、または−ＮＣＳであり、Ｒ₅はＨ、クロロ、１−１２個の炭素原子を有 するアルキルである）を有する適切なチオール誘導体または活性エステルと縮合 させる。 本発明にしたがう化合物はまた、金属置換ピリミジン含有ＰＮＡモノマーシン トンまたはプリン含有ＰＮＡモノマーシントンを、式Ｈ₂Ｃ＝Ｃ−Ｃ（Ｏ）ＯＲ₆ （Ｒ₆は１−１２個の炭素原子を有するアルキルである）を有するアクリレート と、ピリミジンまたはプリン塩基をアクリレートとカップリングさせるのに有効 な条件下で反応させて、ピリミジンの５位またはプリンの２位もしくは８位にお いて式−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）ＯＨを有する置換基を有するＰＮＡモノマーシン トンを形成することにより製造することができる。カップリングは、一般に、Ｄ ｒｅｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９８５，８２，９６８にしたがう条件下で実施する。カップリングを行った後 、酸を式Ｈ₂Ｎ−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−ＰＧを有するアミノチオール誘導体と縮合さ せる。 本発明にしたがう化合物はまた、５−ピリミジン位置または２−、６−もしく は８−プリン位置において、脱離基Ｌｖ（上で定義したとおりである）を有する ＰＮＡモノマーシントンを、例えば、式ＨＱａ−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−ＰＧ（式中、 ＱａおよびＰＧは上で定義したとおりである）を有するチオール誘導体と、脱離 基が置き換えられる条件下で反応させることにより製造することができる。その ような置換は、好ましくは室温で、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメ チルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の溶媒中で実施する。 本発明にしたがうＰＮＡオリゴマーは、ＰＮＡオリゴマーを組み立て、これに チオール官能基を付加することにより製造することができる。例えば、遊離ヒド ロキシル基を有するＰＮＡオリゴマーを本明細書の実施例２６および３１−３７ の技術にしたがって組み立て、次に式Ｌｖ−（ＣＨ₂）_n−Ｓ−ＰＧを有する試薬 と反応させることができる。しかし、認識されるように、ＰＮＡオリゴマー中の チオール官能基の配置に関しては、上述したようにそのような官能基を選択され たＰＮＡモノマーシントン上に導入し、次に選択されたＰＮＡモノマーシントン および他のＰＮＡモノマーシントンを用いて所望のＰＮＡオリゴマーを構築する ことにより、より高い選択性を達成することができる。 組み立てた後、−Ｓ−ＰＧで終止する１つまたはそれ以上の連結部分を有する ＰＮＡを、保護基ＰＧを除去する条件下でルイス酸で処理する。代表的な酸には 、銀カチオンおよび水銀カチオンが含まれる。脱保護した後、ＰＮＡを、チオー ル系カップリング試薬の存在下で、チオール含有ステロイド分子、レポーター分 子、親油性分子、レポーター酵素、ペプチド、蛋白質または他のチオール含有コ ンジュゲートと接触させることができる。有用なカップリング試薬には、２，２ ’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）および他のピリジルジスルフィドまたエ ルマン試薬が含まれる。 あるいは、−Ｓ−Ｈで終止する１つまたはそれ以上の連結部分を有するＰＮＡ を、式（マレイミド）−コンジュゲートまたはＬｖ−ＣＨ₂Ｃ（Ｏ）−Ｒ₂（式中 、Ｌｖは上で定義した脱離基であり、Ｒ₂もまた上で定義したとおりである）を 有する求電子部分と接触させることができる。認識されるように、ＰＮＡ上のイ オウ原子は、１，４−付加を介して前者の求電子部分と、求核置換を介して後者 と反応する。好ましい求電子部分には、リン脂質マレイミド、ｏ−フェナントロ リン−５−ヨードアセトアミド、フルオレセインマレイミド、およびピレンマレ イ ミドが含まれるが、多くの他の求電子部分を用いることができる。 すなわち、本発明の１つの観点においては、実施例２６に記載されるような標 準的な方法および技術を用いて所望のＰＮＡ配列を組み立てる。マスクされたま たは保護された連結部分を含有する少なくとも１つのＰＮＡモノマーが配列の予 め定められた位置に含まれる。次に、コンジュゲートを、直接またはコンジュゲ ートに付加された連結部分を介して連結部分に化学的に結合させる。 本発明に適用しうる他の代表的なチオール基は、システイン、グルタチオン、 ペニシルアミン、２−ピリジルメルカプチル、Ｂｒ−ＣＨ₂−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ₂ −ＣＨ₂−ＳＴｒ、ＳＨ−Ｃ−（ＣＨ₃）₂ＣＨ₂−ＮＨ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＮＨ−Ｃ Ｈ₂−Ｃ−（ＣＨ₃）₂ＳＨ、ＨＯＯＣ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₃ＯＯＣＳ、 ＣＨ₃−ＣＯ−Ｓ−Ｃ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂−Ｃ−ＮＨ−（ＣＨ₂）₂−ＣＯＯＨ）で ある（例えば、Ｄｉｚｉｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅ ｍ．１９９１，２，３５３；Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏ ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１９９０，１，４００を参照されたい）。 多くのアミン保護基が当該技術分野において知られており、これには、フタル イミド（Ｐｈｔｈ）、トリフルオロ酢酸、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ ）、カルボベンジルオキシ（ＣＢＺ）、クロロＣＢＺ、ｔ−ブチルオキシカルボ ニル（Ｂｏｃ）、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、およびイソニ コチニルオキシカルボニル(ｉ−Ｎｏｃ)基が含まれるが、これらに限定されない （例えば、Ｖｅｂｅｒ ａｎｄ Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏ ｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７７，４２，３２８６；Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ． ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅ ｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３；Ｖｏｌ． ９，ｐｐ．１−３８を参照されたい）。 本発明にしたがうコンジュゲート含有ＰＮＡオリゴマーは、ＰＮＡモノマー性 シントンを機能化し、組み立てて所望のオリゴマーとするか、またはコンジュゲ ート基を含有しないＰＮＡモノマー性シントンを組み立て、次に所望のコンジュ ゲート（１つまたは複数）をこれに結合させることにより製造することができる 。例えば、少なくとも１つの遊離ヒドロキシル基を有するＰＮＡモノマーシント ン を、塩基性条件下で、式Ｌｖ（ＣＨ₂）_n−ＮＨ−ＰＧＡ（式中、Ｌｖは上で定義 した脱離基であり、ＰＧＡはアミン保護基である）を有する化合物と反応させる ことができる。酸素アニオンによる求核攻撃を介する脱離基の置換により、所望 のアミン誘導体が生成する。本発明にしたがう適切な脱離基には、ハロゲン、ア ルキルスルホニル、置換アルキルスルホニル、アリールスルホニル、置換アリー ルスルホニル、ヘテロシクロスルホニルまたはトリクロロアセチミデートが含ま れるが、これらに限定されない。より好ましい群には、クロロ、フルオロ、ブロ モ、ヨード、ｐ−（２，４−ジニトロアニリノ）ベンゼンスルホニル、ベンゼン スルホニル、メチルスルホニル（メシレート）、ｐ−メチルベンゼンスルホニル （トシレート）、ｐ−ブロモベンゼンスルホニル、トリフルオロメチルスルホニ ル（トリフレート）、トリクロロアセチミデート、アシルオキシ、２，２，２− トリフルオロエタンスルホニル、イミダゾールスルホニルおよび２，４，６−ト リクロロフェニルが含まれるが、ブロモが好ましい。 本発明にしたがうＰＮＡオリゴマーはまた、ＰＮＡオリゴマーおよびそれに結 合したアルキルアミノ官能基を組み立てることにより製造することができる。例 えば、遊離ヒドロキシル基を有するＰＮＡオリゴマーを既知の技術にしたがって 組み立て（実施例２６および３１−３７を参照されたい）、次に、式Ｌｖ−（Ｃ Ｈ₂）_n−ＮＨ−ＰＧＡを有する試薬と反応させる。しかし、認識されるように、 ＰＮＡオリゴマー中のアルキルアミノ官能基の配置に関しては、そのような官能 基を上述のように選択されたＰＮＡモノマー性シントン上に導入し、次に選択さ れたＰＮＡモノマー性シントンおよび他のＰＮＡモノマー性シントンの両方を用 いて所望のＰＮＡオリゴマーを構築することにより、より高い選択性を達成する ことができる。 組み立てた後、保護されたアミン基で終止する連結部分を有する１つまたはそ れ以上の基を有するＰＮＡを、保護基を除去するのに有効な試薬で処理する。脱 保護した後、ＰＮＡを求電子部分、例えば、スクシンイミジルエステルおよび他 の活性化されたカルボン酸（例えば、Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−スクシンイミドおよびＣ （＝Ｏ）−Ｏ−ペンタフルオロフェニル）、イソチオシアネート、塩化スルホニ ル、ハロアセトアミド、リン脂質カルボン酸活性エステル、ｏ−フェナントロリ ン−５−ヨードアセトアミド、フルオレセインイソチオシアネート、１−ピレン 酪酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびペプチド核酸のカルボン酸 誘導体等と接触させる。好ましい求電子部分には、コレステリル−３−ヘミスク シネート−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ピレン−１−酪酸−Ｎ−ヒ ドロキシスクシンイミドエステルおよびポリエチレングリコール−プロピオン酸 −Ｎ−ヒドロキシスクシミドエステルが含まれる。 本発明の他の観点においては、診断または治療薬中のＰＮＡの少なくとも１つ のモノマー性ユニットにコンジュゲートを付加して、治療または診断薬の細胞膜 を横切る輸送を助ける。そのような診断または治療薬は、天然に生ずるまたは天 然に生じない塩基を有し、それに結合した任意の連結部分を含んでいてもよい少 なくとも１つのコンジュゲートを含み、目的とするＲＮＡまたはＤＮＡの領域に 相補的でありそれと特異的にハイブリダイズするであろう配列にある複数の連結 したＰＮＡモノマー性ユニットから形成される。すなわち、連結したＰＮＡモノ マー性ユニットの１つまたはそれ以上は、ＰＮＡモノマー性ユニットに連結した コンジュゲートを含むように「機能化され」ている。この結合は、任意の連結部 分を含んでいてもよい。少なくとも１つの機能化されたＰＮＡモノマーユニット をその配列中に有する連結されたＰＮＡモノマーユニットは、増強された活性お よび細胞膜を横切る輸送を示すことが予測される。 種々の連結基を用いて、コンジュゲートをＰＮＡオリゴマーまたはモノマーシ ントンに接続させることができる。ある種の連結基、例えばΩ−アミノアルコキ シ成分およびΩ−アミノアルキルアミノ成分は、ステロイド分子またはレポータ ー分子をＰＮＡヒドロキシル基に連結させるのに特に有用である。多くの連結基 が市販されており、これには、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌ ）から入手可能なヘテロ二官能性およびホモ二官能性連結部分が含まれる。ヘテ ロ二官能性およびホモ二官能性連結部分は、Ω−アミノアルコキシおよびΩ−ア ミノアルキルアミノ部分と組み合わせて、ペプチドおよび蛋白質をＰＮＡオリゴ マーに接続させる伸長されたリンカーを形成するのに特に有用である。本発明の ＰＮＡモノマーシントンには、そのＮ−６プリンアミノ基においてリンカーで機 能化されたアデニン含有ＰＮＡシントン、その環外Ｎ−２プリンアミノ基ににお い てリンカーで機能化されたグアニン含有ＰＮＡモノマーシントン、およびそのＮ −４ピリミジンアミノ基または５ピリミジン位置のいずれかにおいてリンカーで 機能化されたシトシン含有ＰＮＡモノマーシントンが含まれることが意図される 。このタイプの結合は、実施例４７において、ＰＮＡ５−ｍｅｒ中のコンジュゲ ートビオチンの、シトシンのＮ−４位への付加により例示される。 本発明のＰＮＡオリゴマーを、コンジュゲート（例えば、コール酸）の活性エ ステル誘導体と反応させることができる。活性エステル誘導体には、Ｎ−ヒドロ キシスクシンイミドエステル、テトラフルオロフェノールエステル、ペンタフル オロフェノールエステルおよびペンタクロロフェノールエステルが含まれる。コ ール酸については、アミノ基と活性エステルとの反応により、コール酸が連結基 を介してＮ−末端位置に結合したＰＮＡオリゴマーが生成する。コール酸は、コ ール酸をそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転換し、次に目的とする ＰＮＡとさらに反応させることにより、ＰＮＡオリゴマーのカルボキシ末端に付 加してもよい。上述の両方の方法を適用することにより、コール酸をＰＮＡオリ ゴマーの両方の末端に結合させることができる。当業者には明らかなように、上 述の方法は本発明の多数のコンジュゲートに適用することができる。 本発明のさらなる態様においては、１つまたはそれ以上の選択された非末端モ ノマー性ユニットにおいてアミノリンカーを有するＰＮＡオリゴマーは、実施例 ２６および６５の方法にしたがって製造する。次に、コール酸等のコンジュゲー トを、活性エステルまたはそのイソチオシアネートを用いて付加する。この方法 は、多数のコンジュゲートを１つのＰＮＡオリゴマー配列中に導入することを可 能にする。実際、オリゴマー中のそれぞれのＰＮＡモノマーをそのように置換す ることができる。 レポーター酵素、ペプチド、および蛋白質等のコンジュゲートのＰＮＡへの付 加は、酵素、ペプチドまたは蛋白質を、いくつかの方法のいずれかによりＰＮＡ 上の上述のアミノ連結基と反応させろことにより行う。例えば、ペプチドまたは 蛋白質を、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ（すなわち、１−エチル−３（３−ジメチル アミノプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）で処理 することにより、ペプチドまたは蛋白質を機能化されたＰＮＡモノマーに結合す ることができる。これは、レポーター酵素、ペプチド、または蛋白質のカルボキ シル末端をＰＮＡのアミノ末端またはＰＮＡに結合したアミン含有リンカーに結 合させることを可能とするであろう。さらに、ＰＮＡオリゴマー性コンジュゲー トは、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳを用いて、レポーター酵素、ペプチドまたは蛋白 質中のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基のカルボキシル基をＰＮＡのアミ ノ末端に結合させることにより製造することができる。 好ましくは、レポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質で機能化されたＰＮＡは 、レポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質を、ヘテロ二官能性リンカー、例えば ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル（Ｍ ＢＳ）またはスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン −１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）で機能化されたＰＮＡオリゴマーで処理す ることにより製造することができる。すなわち、レポーター酵素、ペプチドまた は蛋白質上のチオール官能基をＰＮＡのアミノ官能基に結合させる。ＰＮＡ結合 リンカーのアミノ基をＭＢＳまたはＳＭＣＣマレイミドリンカーと反応させるこ とにより、ＰＮＡオリゴマー−マレイミドコンジュゲートを形成する。次に、得 られるコンジュゲートを、遊離スルフヒドリル基を有するペプチドまたは蛋白質 と反応させる。 第２の好ましい方法においては、レポーター酵素、ペプチドまたは蛋白質で機 能化された連結ＰＮＡオリゴマーは、ペプチドまたは蛋白質をホモ二官能性リン カー、例えばジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）を用いてＰＮＡで処理し て、ペプチドまたは蛋白質上のアミノ官能基をＰＮＡ上のリンカーのアミノ基に 結合させることにより製造することができる。このメカニズムにより、ＰＮＡに 結合したリンカーのアミノ基とジスクシンイミジルスベレートリンカーとの反応 により、スクシンイミジル官能基をＰＮＡオリゴマーに付加することができる。 ジスクシンイミジルスベレートリンカーは、配列上のアミンリンカーとカップリ ングし、リンカーのサイズを拡大する。次に、拡大されたリンカーをアミン基、 例えば、リシンのアミンまたはレポーター酵素、ペプチドおよび蛋白質上の他の 利用可能なＮ−末端アミンと反応させる。 本発明のＰＮＡオリゴマーは、ダイマーから２００−ｍｅｒの範囲の大きさで ありうる。本発明の好ましい態様においては、ＰＮＡオリゴマーはダイマーから ５０−ｍｅｒの範囲の大きさである。より好ましい態様においては、ＰＮＡオリ ゴマーはダイマーから約２０−ｍｅｒの範囲の大きさである。 別の態様においては、１３から１４−ｍｅｒのＰＮＡを標準的な方法および技 術にしたがって用いて、特定のｍＲＮＡの発現のために存在するメッセージをコ ードするＤＮＡの領域を同定する。 本発明にはより長いＰＮＡ分子も含まれるが、１から約２０個のモノマー性ユ ニットを有するＰＮＡが多くの診断的応用に有用であることは容易にわかるであ ろう。 本発明の化合物はまた、生物による蛋白質の産生の調節のための研究試薬とし ても有用であろう。調節は、生物を本発明の化合物と接触させることにより行う ことができる。好ましくは、化合物は目的の蛋白質をコードするＲＮＡまたはＤ ＮＡとハイブリダイズすることができる。 本発明の化合物はさらに診断試薬としても有用である。診断の応用には、試料 中における特定のＤＮＡまたはＲＮＡの存在または不在を検出することが含まれ る。目的の試料を本発明の化合物と接触させ、ここで該化合物は目的のＲＮＡと 特異的にハイブリダイズすることができる。診断試薬の目的のＤＮＡまたはＲＮ Ａとのハイブリダイゼーション、あるいはそのようなハイブリダイゼーションが 生じないことを検出する方法には、蛍光、放射性標識またはキャピラリーゲル電 気泳動による検出が含まれるが、これらに限定されない。本発明のＰＮＡを、適 当なコンジュゲートをこれに付加することにより標識する。目的の試料を、それ に付加された少なくとも１つのコンジュゲートを有するＰＮＡと接触させる。目 的の核酸の存在または不在の判定は、試料へのハイブリダイゼーションの存在ま たは不在を検出することにより行うことができる。 本発明のさらに別の観点においては、ＰＮＡをペプチドまたは蛋白質にコンジ ュゲートさせ、ここでペプチドはシグナリング活性を有し、蛋白質は、例えば、 酵素、転写因子または抗体である。また、ＰＮＡを水溶性または水不溶性ポリマ ーに結合させることもできる。 本発明の別の観点においては、ＰＮＡをオリゴヌクレオチドまたは炭水化物に コンジュゲートさせる。所望の場合には、固体支持体に結合させた成分（例えば 、ペプチド鎖、レポーター、インターカレーターまたは他のタイプのリガンド含 有基）の上でＰＮＡオリゴマーを合成することができる。 本発明のさらに別の観点においては、ＰＮＡを標的ＲＮＡおよびｓｓＤＮＡに 対して用いて、核酸の同定および精製のためのハイブリダイゼーションプローブ を生成することができる。さらに、ＰＮＡを修飾して、ｄｓＤＮＡとの鎖置換三 重らせんを形成することができる。すなわち、これらの試薬は、研究および診断 において、特定の核酸を検出し単離するために用いることができる。 オリゴヌクレオチドがｄｓＤＮＡとトリプレックスを形成する三重らせん形成 は、ｄｓＤＮＡの配列特異的認識の当該技術分野において知られる唯一の手段で あると考えられている。しかし、三重らせん形成はホモプリン−ホモピリミジン 配列の認識に非常に限定されている。本発明のＰＮＡを用いる鎖置換によるトリ プレックス形成は、４つの天然塩基を用いる任意の配列の認識を可能にする点に おいて、オリゴヌクレオチド−ｄｓＤＮＡ三重らせん認識より優れている。 本発明のＰＮＡは、研究および診断試薬として、遺伝子の検出に有用である。 ＰＮＡは、標的遺伝子の制御領域（プロモーター）に相補的な約１２から約１８ のサブユニットを含む核塩基配列を有するように設計される。目的とする試料(例 えば、細胞、組織、または他のもの)は、標準的な方法および技術により調製し 、特異的な配列および少なくとも１つのサブユニットに結合した少なくとも１つ のコンジュゲートを有する本発明のＰＮＡ（適切な担体中）で、インビボで処理 する。ＰＮＡはプロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼがそれにアクセスす ることを遮断するであろう。結局、ｍＲＮＡは産生されず、したがって遺伝子産 物（蛋白質）も産生されない。標的がウイルスの生存遺伝子中にある場合、生存 可能なウイルス粒子は生成しないであろう。あるいは、標的がプロモーターの下 流にある場合、ＲＮＡポリメラーゼはこの位置で終止し、したがって、非機能性 のトランケートされたｍＲＮＡ／蛋白質が生成する。 塩基相補的なハイブリダイゼーションによるｓｓＤＮＡの配列特異的認識を、 標的特異的遺伝子およびウイルスに利用することができる。この場合、標的配列 は、薬剤の標的への結合がリボソームの作用、したがって、ｍＲＮＡの蛋白質へ の翻訳を隠すようにｍＲＮＡ中に含まれる。本発明のペブチド核酸は、相補的な ｓｓＤＮＡに対して著しく高い親和性を有する点において、従来の試薬より優れ ている。さらに、ＰＮＡは荷電主鎖を有しないため、リシンまたは他の類似の荷 電部分がＰＮＡ活性を妨害することなく存在しうる。さらに、ＰＮＡは水溶性で あり（これは細胞取り込みを容易にする）、非生物学的アミノ酸のアミドを含み （これは、それらを生物安定性にし、プロテアーゼ等による酵素的分解に耐性に する）、かつｍＲＮＡとトリプレックスを形成することができる。 鎖置換を伴うＰＮＡ化合物の二本鎖ＤＮＡへの結合は、”Ｈｉｇｈｅｒ Ｏｒ ｄｅｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ”と題する米国特許出願０８／０８８，６５８（ １９９３年７月２日出願）に示されている。鎖反転を伴うＰＮＡおよびビスＰＮ Ａの二本鎖ＤＮＡへの結合は、”Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉ ｃ Ａｃｉｄｓ”と題する米国特許出願０８／２７５，９５１（１９９４年７月 １５日出願）に示されている。これらの中の例示的説明は、ＰＮＡ化合物がワト ソン−クリック結合を介してその相補鎖に結合し、他方の鎖を実質上一本鎖コン フォメーションで押し出すことを示す。 ＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のキメラ構造を、正常なＰＮＡ鎖の代わり にまたはそれに加えて用いて、デュープレックス形成、トリプレックス形成、核 酸結合または蛋白質結合を実施してもよい。そのようなキメラ構造のＲＮＡまた はＤＮＡ核酸部分には、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチ オエート、アルキルホスホネート、水素ホスホネート、ホスホトリエステル、ホ スホルアミダイトおよび他の同様のリン結合を介して連結された核酸が含まれる が、これらに限定されない。これらはさらに、他の置換、例えばリボース糖の２ ’位における置換を含むことができるが、これに限定されない。特に好ましいも のは、２’−フルオロ（これらはキメラの核酸部分の他の核酸に対する親和性を 増加させるため）、および２’−Ｏ−アルキル、特に２’−Ｏ−プロビル、２’ −Ｏ−アリール等（これらは核酸鎖にヌクレアーゼ耐性を付与するため）である 。 本発明の化合物は他の標的分子に結合するのにも有用であろう。本発明の標的 分子は種々の生物学的に意義のある任意の分子を含みうる。そのような他の標的 分子は、炭水化物、糖蛋白質または他の蛋白質でありうる。本発明のある好まし い態様においては、標的分子は蛋白質、例えばイムノグロブリン、レセプター、 レセプター結合リガンド、抗原または酵素であり、より詳細には、ホスホリパー ゼ、腫瘍壊死因子、エンドトキシン、インターロイキン、プラスミノーゲン活性 化因子、蛋白質キナーゼ、細胞接着分子、リポキシゲナーゼ、ヒドロラーゼ、お よびトランスアシラーゼでありうる。本発明の別の態様においては、標的分子は 、ヒト免疫不全ウイルス、カンジダ、ヘルペスウイルス、パピローマウイルス、 サイトメガロウイルス、ライノウイルス、肝炎ウイルスまたはインフルエンザウ イルスの重要な領域でありうる。本発明のさらに別の態様においては、標的分子 はオンコジンの領域でありうる。さらに別の態様においては、標的分子はｒａｓ ４７−ｍｅｒステループＲＮＡ、ヒト免疫不全ウイルスのＴＡＲ要素、ヒト免疫 不全ウイルス（ＨＩＶ）のｒｅｖ応答要素（ＲＲＥ）またはｇａｇ−ｐｏｌステ ムループである。さらに別の標的は細胞活性を誘導することができる。例えば、 標的はインターフェロンを誘導することができる。 転写因子または他の標的分子への結合においては、転写因子または他の標的分 子は精製されている必要はない。これは、例えば、全細胞中に、体液中に、粗細 胞溶解物中に、血清中に、または他の体液もしくは細胞の抽出物中に存在しうる 。もちろん、精製された転写因子または精製された形態の他の標的分子もまた、 本発明のいくつかの観点において有用である。 本発明のさらに別の態様においては、合成的に製造した転写因子または他の標 的分子が有用でありうる。これらの合成的に製造した分子は、それに付加された コンジュゲートを有する少なくとも１つのモノマー性ユニットを有することが必 要であるのみである。転写因子または他の標的分子はまた、例えばビオチン化ま たは放射性標識により修飾することができる。例えば、合成的に製造した転写因 子は、合成の間に１つまたはそれ以上のビオチン分子を取り込むことができるか 、または合成後に修飾することができる。 本明細書において用いる場合、転写因子との用語は、遺伝子の発現を制御する ＤＮＡまたはＲＮＡ結合蛋白質を表す。ＨＩＶ ｔａｔおよびｃ−ｒｅｌは遺伝 子の発現を制御する転写因子の例である。またこの用語により意図されるものは 、 ＤＮＡおよびＲＮＡ結合蛋白質であり、これらは厳密には転写因子であるとは考 えられていないが、細胞増殖に関与していることが知られている。これらの転写 因子には、ｃ−ｍｙｃ、ｆｏｓ、およびｊｕｎが含まれる。転写因子は一般に細 胞含有量が非常に少ないため、本発明の方法は転写因子を標的分子として用いる のに特に適切である。 ＰＮＡ含有デュープレックス構造の用途は、ＨＩＶ ＴＡＲ要素の種々の配列 に対応し、ステム−ループ構造としてまたはデュープレックス構造を形成する２ つのＰＮＡとしてデュープレックス構造を形成する可能性を有するＰＮＡ配列を 構築することにより例示することができる。競合アッセイにおいて、ｔａｔ転写 因子に結合するＰＮＡ構造は、インキュベーション混合物中に存在する競合ＴＡ Ｒ配列の結合を阻害する。ＴＡＲ ＲＮＡ配列はビオチン化されているため、非 結合分子およびＰＮＡ配列と複合体を形成したｔａｔ蛋白質を洗い流した後には 、ＴＡＲとの結合が可能な蛋白質のみがマイクロタイタープレート上に残るであ ろう。ＴＡＲ ＰＮＡ構造とビオチン化ＴＡＲ構造との間の競合の濃度依存性は 、ｔａｔと有効に競合することができ、したがってＨＩＶ調節剤として有用な配 列を特定するのに役立つであろう。 当業者には、以下の実施例を参照することにより、本発明の他の目的、利点、 および新規な特徴が明らかとなるであろう。これらの実施例は本発明を制限する ことを意図するものではない。 実施例１ 第三級ブチル−４−ニトロフェニルカーボネート（１） 炭酸ナトリウム（２９．１４ｇ；０．２７５モル）および４−ニトロフェノー ル（１２．７５ｇ；９１．６ミリモル）をジオキサン（２５０ｍｌ）と混合した 。Ｂｏｃ無水物（２０．０ｇ；９１．６ミリモル）をジオキサン（５０ｍｌ）と ともに該混合物に導入した。この混合物を１時間還流させ、０℃に冷却し、濾過 して1/3に濃縮した後、０℃の水（３５０ｍｌ）中に注入した。1/2時間撹拌後、 濾過して生成物を集め、水洗後適当な乾燥剤で真空乾燥した。収量２１．３ｇ（ ９７％）。融点７３．０−７４．５℃（ｌｉｔｔ．７８．５−７９．５℃）。Ｃ₁₁ Ｈ₁₃ＮＯ₅の元素分析．実測値（計算値）Ｃ：５５．２０（５５．２３） Ｈ ：５．６１（５．４８） Ｎ：５．８２（５．８５）。 実施例２ （Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシン（２） Ｈｅｉｍｅｒらの方法（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ.,１９８４、２３、２０３−２ １１）を改良して標記化合物を調製した。Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン（ ３．００ｇ；２５．４ミリモル）を水（５０ｍｌ）に溶解し、ジオキサン（５０ ｍｌ）を加えて、２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを１１．２に調節した。第三級ブ チル−４−ニトロフェニルカーボネート（１， ７．２９ｇ；３０．５ミリモル ）をジオキサン（４０ｍｌ）に溶解して２時間にわたり１滴ずつ加え、その間２ Ｎ水酸化ナトリウムによりｐＨを１１．２に保った。さらに３時間定期的にｐＨ を調節した後、該溶液を一夜間放置した。その溶液を０℃に冷却し、０．５モル 塩酸を用いてｐＨを慎重に３．５に調節した。この水溶液をクロロホルム（３× ２００ｍｌ）で洗い、２Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨを９．５に調節して、該溶液 を真空（１４ｍｍＨｇ）中で蒸発乾固した。その残留物をＤＭＦ（２５＋２×１ ０ｍｌ）で抽出し、抽出物を濾過して過剰の塩を除いた。これにより、標記化合 物の溶液が約６０％の収量で得られ、ｔｌｃ（ニンヒドリンにより視覚化、Ｒ_f ＝０．３）によれば９５％を上回る純度であった。この溶液をさらに精製せずに 後記のＢｏｃ−ａｅｇ（ａｅｇ＝アミノエチルグリシン）誘導体の調製に使用し た。 実施例３ Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（３） この方法は文献の合成法とは異なるが、さらに容易で、高収量が得られ、また 生成物中に未反応のチミンを残さない。チミン（４０．０ｇ；０．３１７モル） および炭酸カリウム（８７．７ｇ；０．６３４ミリモル）のＤＭＦ(９００ｍｌ) 懸濁液にメチルブロモアセテート（３０．００ｍｌ；０．３１７ミリモル）を加 えた。この混合物を窒素雰囲気中で一夜間激しく撹拌した。この混合物を濾過し て、真空中で蒸発乾固した。固体残留物を水(３００ｍｌ)と４Ｎ塩酸（１２ｍｌ ）とで処理し、０℃で１５分撹拌し、濾過して水（２×７５ｍｌ）で洗った。こ の沈殿物を水（１２０ｍｌ）および２Ｎ水酸化ナトリウム（６０ｍｌ）で処理し て、１０分間煮沸した。この混合物を０℃に冷却し、濾過して、４Ｎ塩酸（７０ ｍｌ）を加えて純粋な標記化合物を沈殿させた。適当な乾燥剤による真空乾燥後 の収量：３７．１ｇ（６４％）。¹Ｈ−ＮＭＲ：（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆） ：１１．３３ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）；７．４９（ｄ，Ｊ＝０．９２Ｈｚ，１ Ｈ，ＡｒＨ）；４．３８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂）；１．７６（ｄ，Ｊ＝０．９２Ｈ ｚ，Ｔ−ＣＨ ₃）。 実施例４ Ｎ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニルエステル（４） Ｎ−１−カルボキシメチルチミン（３，１０．０ｇ；５４．３ミリモル）およ びペンタフルオロフェノール（１０．０ｇ；５４．３ミリモル）をＤＭＦ（１０ ０ｍｌ）に溶解し、氷水中で５℃に冷却した。次にＤＤＣ（１３．４５ｇ；６５ ．２ミリモル）を加えた。温度が５℃を下回るようになったとき、氷浴を取り去 り、混合物を外界温度で３時間撹拌した。沈澱したＤＣＵを濾過して除き、ＤＭ Ｆ（２×１０ｍｌ）で２回洗った。この濾液を合わせてエーテル（１４００ｍｌ ）中に注入し、０℃に冷却した。石油エーテル（１４００ｍｌ）を加えて、混合 物を一夜間放置した。濾過して標記化合物を単離させ、石油エーテルで十分に洗 った。収量：１４．８ｇ（７８％）。この生成物は次の反応を行わせるのに十分 なほど純粋であったが、分析用試料は２−プロパノールで再結晶させて得た。融 点２００．５−２０６℃。Ｃ₁₃Ｈ₇Ｆ₅Ｎ₂Ｏ₄の元素分析。実測値（計算値）Ｃ： ４ ４.７９（４４．５９）；Ｈ：２．１４(２．１０)；Ｎ：８．１３（８．００） 。ＦＡＢ−ＭＳ：４４３（Ｍ＋１＋グリセロール）。３５１（Ｍ＋１）。¹Ｈ− ＮＭＲ：（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１１．５２ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ，ＮＨ ）；７．６４（ｓ，１Ｈ，ＡｒＨ）；４．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂）；１．７６ （ｓ，３Ｈ，ＣＨ ₃）。 実施例５ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グ リシン（５） 実施例２から得たＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（７．０８ｍｌ；５０．８ミ リモル）に続いてＮ−１−カルボキシメチルチミンペンタフルオロフェニルエス テル（４，４．４５ｇ；１２．７ミリモル）を加えた。得られた溶液を１時間撹 拌した。この溶液を０℃に冷却してカチオン交換物質（「Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ −８」，４０ｇ）で２０分間処理した。濾過してカチオン交換物質を除き、ジク ロロメタン（２×１５ｍｌ）で洗い、さらにジクロロメタン（１５０ｍｌ）を加 えた。この得られた溶液を塩化ナトリウム飽和溶液で洗い、硫酸マグネシウムで 乾燥し、次いで先ず水アスピレーター、次に油ポンプで真空にして蒸発乾固した 。残留物を水（５０ｍｌ）とともに振とうして、蒸発乾固した。この方法を一回 繰返した。次に残留物をメタノール（７５ｍｌ）に溶解して、エーテル（６００ ｍｌ）および石油エーテル（１．４Ｌ）の中に注入した。一夜間撹拌後、濾過し て白色固形物を単離して石油エーテルで洗った。適当な乾燥剤で真空乾燥して３ ．５０ｇ（７１．７％）を得た。融点１４２−１４７℃。Ｃ₁₆Ｈ₂₄Ｎ₄Ｏ₇の元素 分析。実測値（計算値）Ｃ：４９．５９（５０．００） Ｈ：６．３４（６．２ ９） Ｎ：１４．５８（１４．５８）。¹Ｈ−ＮＭＲ：（２５０ＭＨｚ；ＤＭＳ Ｏ−ｄ₆）：第二級アミド結合の周りの回転が束縛されるためにいくつかのシグ ナルは２：１の比の二重線となった（表には主要な方をｍｊ．主要でない方をｍ ｉ．で示す）。１２．７３ｐｐｍ(ｂ，１Ｈ，−ＣＯ₂Ｈ)；１１．２７ｐｐｍ（s ，ｍｊ.,イミド）；１１．２５ｐｐｍ(ｓ，ｍｉ.,イミド)；７．３０ｐｐｍ（ｓ ，ｍｊ.,ＡｒＨ）；７．２６ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ.,ＡｒＨ）；６．９２ｐｐｍ（分 解しないｔ，ｍｊ.,ＢｏｃＮＨ）；６．７３ｐｐｍ（分解しないｔ，ｍｉ.,Ｂｏ ｃＮ Ｈ）；４．６４ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,Ｔ−ＣＨ₂−ＣＯ−）；４．４７ｐｐｍ（ｓ ，ｍｉ.,Ｔ−ＣＨ₂−ＣＯ−）；４．１９ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯ₂ Ｈ）；３．９７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．４１−２． ８９ｐｐｍ（分解しないｍ，−ＣＨ₂ＣＨ₂−および水）；１．７５ｐｐｍ（ｓ， ３Ｈ，Ｔ−ＣＨ₃）；１．３８ｐｐｍ（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）。¹³Ｃ−ＮＭＲ： １７０．６８ｐｐｍ（ＣＯ）；１７０．３４（ＣＯ）；１６７．４７（ＣＯ）； １６７．０８（ＣＯ）；１６４．２９（ＣＯ）；１５０．９（Ｃ５”）；１４１ ．９２（Ｃ６”）；１０８．０４（Ｃ２’）；７７.９５および７７.６８（Ｔｈ ｙ−ＣＨ ₂ＣＯ）；４８．９６，４７．４５および４６．７０（−ＣＨ ₂ＣＨ ₂− およびＮＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３７．９８（Ｔｈｙ−ＣＨ ₃）；２８．０７（ｔ−Ｂ ｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：４０７（Ｍ＋Ｎａ⁺）；３８５（Ｍ＋Ｈ⁺）。 実施例６ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グ リシンペンタフルオロフェニルエステル（６， Ｂｏｃ−Ｔａｅｇ−ＯＰｆｐ） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］ グリシン（５）（２．００ｇ；５．２０ミリモル）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し て塩化メチレン（１５ｍｌ）を加えた。ペンタフルオロフェノール（１．０５ｇ ；５．７２ミリモル）を加えて、溶液を氷浴中で０℃に冷却した。次にＤＤＣ（ １．２９ｇ；６．２４ミリモル）を加えて、２分後に氷浴を取り除いた。外界温 度で３時間撹拌後、沈澱したＤＣＵを濾過して除き、塩化メチレンで洗った。濾 液を合わせ、炭酸水素ナトリウム水溶液で２回および塩化ナトリウム飽和溶液で １回洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、真空中で蒸発乾固した。この固体残留 物をジオキサン（１５０ｍｌ）に溶解して、０℃の水（２００ｍｌ）中に注入し た。濾過して標記化合物を単離し、水洗し、適当な乾燥剤で真空乾燥した。収量 ：２．２０ｇ（７７％）。分析用試料は２−プロパノールで再結晶させて得た。 融点１７４−１７５．５℃。Ｃ₂₂Ｈ₂₃Ｎ₄Ｏ₇Ｆ₅の元素分析、実測値（計算値） ：Ｃ：４８．２２（４８．０１）；Ｈ：４．６４（４．２１）；Ｎ：９．６７（ １０．１８）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：第二級アミド結合の 周りの回転が束縛されるためにいくつかのシグナルは６：１の比の二重線となっ た （表には主要な方をｍｊ．，主要でない方をｍｉ．で示した）。７．０１ｐｐｍ （ｓ，ｍｉ.,ＡｒＨ）；６．９９ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,ＡｒＨ）；５．２７ｐｐｍ （分解しないｔ，ＢｏｃＮＨ）；４．６７ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,Ｔ−ＣＨ₂−ＣＯ −）；４．６０ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ.,Ｔ−ＣＨ₂−ＣＯ）；４．４５ｐｐｍ（ｓ， ｍｊ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯ₂Ｐｆｐ）；４．４２ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ ＣＯ₂Ｐｆｐ）；３．６４ｐｐｍ（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ₂ＣＨ ₂−）；３． ８７ｐｐｍ（”ｑ”，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ ₂ＣＨ₂−）；１．４４（ｓ，９Ｈ， ｔ−Ｂｕ）。ＦＡＢ−ＭＳ：５５１（１０；Ｍ＋１）；４９５（１０；Ｍ＋１− ｔＢｕ）；４５１（８０；−Ｂｏｃ）。 実施例７ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｃｂｚ）グリシン（７） アミノエチルグリシン（５２．８６ｇ；０．４４７ミリモル）を水（９００ｍ ｌ）に溶解して、ジオキサン（９００ｍｌ）を加えた。２Ｎ ＮａＯＨでそのｐ Ｈを１１．２に調節した。ｐＨを１１．２に保ちながら、第三級ブチル−ｐ−ニ トロフェニルカーボネート（１２８．４ｇ；０．５３７ミリモル）をジオキサン （７２０ｍｌ）に溶解して２時間にわたり１滴ずつ加えた。ｐＨを少なくともさ らに３時間１１．２に保った後、一夜間撹拌したままにした。この黄色の溶液を ０℃に冷却して、２Ｎ ＮＣｌでｐＨを３．５に調節した。この混合物をクロロ ホルム（４×１００ｍｌ）で洗い、その水相のｐＨを、０℃において２ＮのＮａ ＯＨで９．５に再調節した。２Ｎ ＮａＯＨでそのｐＨを９．５に保ちながら３ ０分間にわたりＣｂｚクロリド（７３．５ｍｌ；０．５１５モル）を加えた。さ らに４時間にわたりしばしばｐＨを調節して、その溶液を一夜間撹拌したままに した。次の日にその溶液をエーテル(３×６００ｍｌ）で洗った後０℃において ２Ｎ ＨＣｌで溶液のｐＨを１．５に調節した。酢酸エチル（５×１０００ｍｌ ）で抽出して標記化合物を単離させた。この酢酸エチル溶液を硫酸マグネシウム で乾燥し、真空中で蒸発乾固した。これにより１３８ｇが得られ、これをエーテ ル（３００ｍｌ）に溶解し、石油エーテル（１８００ｍｌ）を加えて沈澱させた 。収量１２４．７ｇ（７９％）。融点６４．５−８５℃。Ｃ₁₇Ｈ₂₄Ｎ₂Ｏ₆の元素 分析。実測値（計算値）Ｃ：５８．４０（５７．９４）；Ｈ：７．０２（６．８ ６）；Ｎ：７．９４（７．９５）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）： ７．３３＆７．３２（５Ｈ，Ｐｈ）；５．１５＆５．１２（２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂） ；４．０３＆４．０１（２Ｈ，．ＮＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．４６（ｂ，２Ｈ，Ｂｏ ｃＮＨＣＨ₂ＣＨ ₂）；３２．８（ｂ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ ₂ＣＨ₂）；１．４３ ＆１．４０（９Ｈ，ｔＢｕ）。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍ）２０．７１分（８０．２ ％）および２１．５７分（１９．８％）。ＵＶスペクトル（２００ｎｍ−３００ ｎｍ）は同一で、小さい方のピークはＢｉｓ−Ｚ−ＡＥＧより成ることを示す。 実施例８ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステル（８） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（Ｃｂｚ）グリシン（７， ６ ０．６ｇ；０．１７０モル）およびＮ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（６ ．００ｇ）を無水エタノール（５００ｍｌ）に溶解して０℃に冷却してからＤＣ Ｃ（４２．２ｇ；０．２０４モル）を加えた。５分後に氷浴を取り去り、さらに ２時間撹拌を続けた。沈澱したＤＣＵ（乾物３２．５ｇ）を濾過して除き、エー テル（３×１００ｍｌ）で洗った。濾液を合わせて、硫酸水素カリウム希薄溶液 （２×４００ｍｌ）、炭酸水素ナトリウム希薄溶液（２×４００ｍｌ）および塩 化ナトリウム飽和溶液（１×４００ｍｌ）でつぎつぎに洗った。この有機相を濾 過した後硫酸マグネシウムで乾燥して、真空中で蒸発乾固して、若干のＤＣＵを 含む油状物質６６．１ｇを得た。 この油を無水エタノール（６００ｍｌ）に溶解して、炭素に担持させた１０％ パラジウム（６．６ｇ）を加えた。受器に２Ｎ水酸化ナトリウムを満たして該溶 液を大気圧下で水素化した。４時間後には、理論的な４．２Ｌの中３．３Ｌが消 費された。反応混合物をセライトに通して濾過し、真空中で蒸発乾固して油状物 質３９．５ｇ（９４％）を得た。この油状物質の一部１３ｇをシリカゲル（６０ ０ｇ ＳｉＯ₂）充填クロマトグラフィーで精製した。石油エーテル２０％の塩 化メチレン溶液３００ｍｌで溶離させた後、標記化合物をメタノール５％の塩化 メチレン溶液１７００ｍｌで溶離させた。満足すべき純度を有する画分から溶剤 を真空除去すると収量が８．４９ｇであった。また別に、粗製物１０ｇをＫｕｇ ｅｌ Ｒｏｈｒ蒸留法で精製した。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ₃ＯＤ）； ４．７７（ｂ，ｓ，ＮＨ）；４．１８（ｑ，２Ｈ，ＭｅＣＨ ₂−）；３．３８（ ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ ₂ＣＯ₂Ｅｔ）；３．１６（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ ₂ＣＨ₂） ；２．６８（ｔ，２Ｈ，ＢｏｃＮＨＣＨ₂ＣＨ ₂）；１．４３（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ ）および１．２６（ｔ，３Ｈ，ＣＨ₃）。¹³Ｃ−ＮＭＲ １７１．４（ＣＯＥｔ ）；１５６．６（ＣＯ）；７８．３（（ＣＨ₃）₃ Ｃ）；５９．９（ＣＨ₂）；４ ．９０（ＣＨ₂）；４．８１（ＣＨ₂）；３９．０（ＣＨ₂）；２６．９（ＣＨ₂） および１２．６（ＣＨ₃）。 実施例９ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンメチルエステル（９） 実施例８の方法を用い、ただしエタノールの代りにメタノールを使用した。最 終生成物はフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製した。 実施例１０ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グ リシンエチルエステル（１０） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステル（８， １３ ．５ｇ；５４．８ミリモル）、ＤｈｂｔＯＨ（９．８４ｇ；６０．３ミリモル） およびＮ−１−カルボキシメチルチミン（４， １１．１ｇ；６０．３ミリモル ）をＤＭＦ（２１０ｍｌ）に溶解した。次に塩化メチレン（２１０ｍｌ）を加え た。この溶液をエタノール／氷浴中で０℃に冷却してＤＣＣ（１３．６ｇ；６５ ．８ミリモル）を加えた。１時間後氷浴を取り去り外界温度でさらに２時間撹拌 を続けた。沈澱したＤＣＵを濾過して取り除き、塩化メチレン（２×７５ｍｌ） で２回洗った。合わせた濾液にさらに塩化メチレン（６５０ｍｌ）を加えた。こ の溶液を炭酸水素ナトリウム希薄溶液（３×５００ｍｌ）、硫酸水素カリウム希 薄溶液（２×５００ｍｌ）および塩化ナトリウム飽和溶液（１×５００ｍｌ）で つぎつぎに洗った。この有機相から若干の沈澱物を濾過して除去した。その有機 相を硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固した。この油状物質を塩化メ チレン（１５０ｍｌ）に溶解し、濾過し、０℃において石油エーテル（３５０ｍ ｌ）を加えて標記化合物を沈澱させた。この塩化メチレン／石油エーテル法を一 回繰返した。これによって１６．０ｇ（７１％）の標記化合物を得、ＨＰＬＣに よれ ばその純度は９９％を上回った。 実施例１１ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グ リシン（６ａ） 実施例１０で得た物質をＴＨＦ（１９４ｍｌ，０．２モル溶液を得る）中に懸 濁させて１モルの水酸化リチウム水溶液（１１６ｍｌ）を加えた。この混合物を 外界温度で４５分間撹拌した後濾過して残留ＤＣＵを除いた。この溶液に水（４ ０ｍｌ）を加えてさらに塩化メチレン（３００ｍｌ）で洗った。さらに水（３０ ｍｌ）を加え、このアルカリ溶液をもう一度塩化メチレン（１５０ｍｌ）で洗っ た。この水溶液を０℃に冷却し、１Ｎ ＨＣｌ（約１１０ｍｌ）を１滴ずつ加え てｐＨを２に調節した。標記化合物を酢酸エチル（９×２００ｍｌ）で抽出し、 抽出物を合わせて硫酸マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固した。残留物を 一旦メタノールから蒸発させ、一夜間乾燥後無色のガラス状固体を得た。収量９ ．５７ｇ（６４％）。ＨＰＬＣ ＞９８％Ｒ_T＝１４．８分。Ｃ₁₆Ｈ₂₄Ｎ₄Ｏ₇／ ０．２５ Ｈ₂Ｏの元素分析。実測値（計算値）Ｃ：４９．２９（４９．４２） ；Ｈ：６．５２（６．３５）；Ｎ：１４．１１（１４．４１）。第二級アミドの 周りの回転が束縛されるためにいくつかのシグナルは２：１の比の二重線となっ た（表では主要な方をｍｊ．，主要でない方をｍｉ．と示す）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ ２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１２．７５（ｂ．ｓ.,１Ｈ，ＣＯ₂Ｈ）；１１ ．２８（ｓ，“１Ｈ”，ｍｊ.,イミドＮＨ）；１１．２６（ｓ，“１Ｈ”，ｍｉ .,イミドＮＨ）；７．３０（ｓ，“１Ｈ”，ｍｊ.,Ｔ Ｈ−６）；７．２６（ｓ ，“１Ｈ”，ｍｉ.,Ｔ Ｈ−６）；６．９２（ｂ．ｔ.,“１Ｈ”，ｍｊ.,Ｂｏｃ ＮＨ）；６．７３(ｂ，ｔ.,“１Ｈ”ｍｉ.,ＢｏｃＮＨ)；４．６４(ｓ，“２Ｈ ”，ｍｊ.,ＣＨ ₂ＣＯＮ)；４．４６（ｓ，“２Ｈ”，ｍｊ.,ＣＨ ₂ＣＯＮ）；４ ．１９（ｓ，“２Ｈ”，ｍｉ.,ＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．９７（ｓ，“２Ｈ”，ｍｊ .,ＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．６３−３．０１（分解しないｍ，水を含む，ＣＨ ₂ＣＨ ₂ ）；１．７５（ｓ，３Ｈ，ＣＨ ₃）および１．３８（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ）。 実施例１２ Ｎ−４−Ｃｂｚシトシン（１２） オーブン乾燥設備内の窒素雰囲気中で０℃においてシトシン（８， ２０．０ ｇ；０．１８モル）の無水ピリジン（１０００ｍｌ）懸濁液に、Ｃｂｚクロリド （５２ｍｌ；０．３６モル）を約１時間にわたり１滴ずつ添加した。次にこの溶 液を一夜間撹拌し、その後このピリジン懸濁液を真空中で蒸発乾固した。水（２ ００ｍｌ）および４Ｎ塩酸を加えてｐＨ１に到達させた。得られた白色沈澱を濾 別し、水洗し、空気吸引で半乾燥させた。まだ湿っている沈澱物を無水エタノー ル（５００ｍｌ）とともに１０分間煮沸し、０℃に冷却し、濾過し、エーテルで 十分に洗って、真空乾燥した。収量２４．７ｇ（５４％）。融点＞２５０℃。Ｃ₁₂ Ｈ₁₁Ｎ₃Ｏ₃の元素分析。実測値（計算値）；Ｃ：５８．５９（５８．７７）； Ｈ：４．５５（４．５２）；Ｎ：１７．１７（１７．１３）。生成物を溶解させ ることができなかったのでＮＭＲスペクトルの記録は得られなかった。 実施例１３ Ｎ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（１３） 機械撹拌機および窒素遮蔽を備えた三つ口丸底フラスコにメチルブロモアセテ ート（７．８２ｍｌ；８２．６ミリモル）ならびにＮ−４−Ｃｂｚシトシン（１ ２， ２１．０ｇ；８２．６ミリモル）および炭酸カリウム（１１．４ｇ；８２ ．６ミリモル）の無水ＤＭＦ（９００ｍｌ）懸濁液を充填した。この混合物を一 夜間激しく撹拌し、濾過して、真空中で蒸発乾固した。水（３００ｍｌ）および ４Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加え、混合物を０℃で１５分撹拌し、濾過して、水洗（ ２×７５ｍｌ）した。単離した沈澱物を水（１２０ｍｌ）、２Ｎ水酸化ナトリウ ム（６０ｍｌ）で処理し、３０分間撹拌し、濾過し、０℃に冷却して、４Ｎ塩酸 （３５ｍｌ）を加えた。濾過して標記化合物を単離させ、水で十分に洗い、メタ ノール（１０００ｍｌ）で再結晶させ、さらにエーテルで十分に洗った。これに よって７．７０ｇ（３１％）の純粋な化合物を得た。再結晶時の母液を２００ｍ ｌの容積に縮減して、０℃に冷却した。これによって、さらに２．３０ｇの標記 化合物が得られ、このものはｔｌｃによれば純粋であったか赤味がかった色を呈 した。融点２６６−２７４℃。Ｃ₁₄Ｈ₁₃Ｎ₃Ｏ₅の元素分析。実測値（計算値）； Ｃ：５５．４１（５５．４５）；Ｈ：４．２３（４．３２）；Ｎ：１４．０４（ １３．８６）。¹Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆）：８．０２ｐｐｍ （ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３９（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７． ０１(ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５)；５．１９(ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂− )；４．５２（ｓ，２Ｈ）。 実施例１４ Ｎ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシンペンタフルオロフェニルエ ステル（１４） Ｎ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（１３， ４．００ｇ； １３．２ミリモル）およびペンタフルオロフェノール（２．６７ｇ；１４．５ミ リモル）をＤＭＦ（７０ｍｌ）と混合して、氷水で０℃に冷却し、ＤＣＣ（３． ２７ｇ；１５．８ミリモル）を加えた。３分後に氷浴を取り除き、混合物を室温 で３時間撹拌した。沈澱したＤＣＵを濾過により除き、ＤＭＦで洗って濾液を真 空中（０．２ｍｍＨｇ）で蒸発乾固した。固体残留物を塩化メチレン（２５０ｍ ｌ）で処理し、１５分間激しく撹拌し、濾過し、炭酸水素ナトリウム希薄溶液で ２回および塩化ナトリウム飽和溶液で１回洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、 真空中で蒸発乾固した。この固体残留物を２−プロパノール（１５０ｍｌ）で再 結晶させ、さらに結晶をエーテルで十分洗った。収量３．４０ｇ（５５％）。融 点２４１−２４５℃。Ｃ₂₀Ｈ₁₂Ｎ₃Ｆ₅Ｏ₅の元素分析。実測値（計算値）；Ｃ： ５１．５６（５１．１８）；Ｈ：２．７７（２．５８）；Ｎ：９．２４（８．９ ５）。¹Ｈ−ＮＭＲ（９０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）：７．６６ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７． ６３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３７（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．３１（ｄ，Ｊ＝ ７．６３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．２１（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂−）；４．９ ７（ｓ，２Ｈ，ＮＣＨ ₂−）。ＦＡＢ−ＭＳ：４７０（Ｍ＋１）。 実施例１５ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−４−Ｃｂｚ−１−シトシ ニル）アセチル］グリシン（１５） 実施例２に述べたように調製した（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシン ２のＤＭＦ溶液にトリエチルアミン（７．００ｍｌ；５０．８ミリモル）および Ｎ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシンペンタフルオロフェニルエ ステル（１４， ２．７０ｇ；５．７５ミリモル）を加えた。この溶液を室温で １時間撹拌後、塩化メチレン（１５０ｍｌ）、塩化ナトリウム飽和溶液（２５０ ｍｌ）および４Ｎ塩酸をｐＨが１になるように加えた。この有機層を分離して塩 化ナトリウム飽和溶液で２回洗い、硫酸マグネシウムで乾燥して、最初に水アス ピレーター、次に油ポンブで真空にして蒸発乾固した。この油状残留物を水（２ ５ｍｌ）で処理して、再び真空中で蒸発乾固した。さらにこの方法を繰返した。 次に油状残留物（２．８０ｇ）を塩化メチレン（１０００ｍｌ）に溶解して、石 油エーテル（２５０ｍｌ）を加えて、混合物を一夜間撹拌した。標記化合物を濾 過により単離させ、石油エーテルで洗った。ＴＬＣ（システム１）はかなりの量 のペンタフルオロフェノールを示したが、その除去は試みなかった。収量：１． ７２ｇ（５９％）。融点１５６℃（分解）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ Ｃｌ₃）：第二級アミド結合の周りの回転が束縛されるためにいくつかのシグナ ルは２：１の比率の二重線になった（表では主要な方をｍｊ．主要でない方をｍ ｉ．で示す）。７．８８ｐｐｍ（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−６）；７．３９（ｍ，５Ｈ， Ｐｈ）；７．００（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−５）；６．９２（ｂ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ） ；６．７４（ｂ，１Ｈ，ＺＮＨ）；５．１９（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ ₃）；４． ８１ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,Ｃｙｔ−ＣＨ₂−ＣＯ−）；４．６２ｐｐｍ（ｓ，ｍｉ. ,Ｃｙｔ−ＣＨ₂−ＣＯ−）；４．２３（ｓ，ｍｉ．ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３ ．９８ｐｐｍ（ｓ，ｍｊ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．４２−３．０２（分解 しないｍ，−ＣＨ₂ＣＨ₂−および水）；１．３７（ｓ，９Ｈ，ｔＢｕ）。ＦＡＢ −ＭＳ：５０４（Ｍ＋１）；４４８（Ｍ＋１−ｔＢｕ）。 実施例１６ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−４−Ｃｂｚ−１−シトシ ニル）アセチル］グリシンペンタフルオロフェニルエステル（１６） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−４−Ｃｂｚ−１−シト シニル）アセチル］グリシン（１５， １．５０ｇ；２．９８ミリモル）および ペンタフルオロフェノール（５４８ｍｇ；２．９８ミリモル）をＤＭＦ（１０ｍ ｌ）に溶解した。塩化メチレン（１０ｍｌ）を加えて、反応混合物を氷浴中で０ ℃に冷却して、ＤＣＣ（６７６ｍｇ；３．２８ミリモル）を加えた。３分後氷浴 を取り去り、混合物を外界温度で３時間撹拌した。沈澱物を濾過して単離し、塩 化メチレンで１回洗った。この沈澱物を沸騰しているジオキサン（１５０ｍｌ） に溶解し、溶液を１５℃に冷却し、それによりＤＣＵを沈澱させた。濾過してＤ ＣＵを除き、得られた濾液を０℃の水（２５０ｍｌ）中に注入した。標記化合物 を濾過により単離し、水洗して、適当な乾燥剤で真空乾燥した。収量１．３０ｇ （６５％）。Ｃ₂₉Ｈ₂₈Ｎ₅Ｏ₈Ｆ₅の元素分析。実測値（計算値）；Ｃ：５２．６ ３（５２．０２）；Ｈ：４．４１（４．２２）；Ｎ：１０．５５(１０．４６)。¹ Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：エステルの加水分解によるもの である可能性の高い前記酸の固有のスペクトルを示した。ＦＡＢ−ＭＳ：６７０ （Ｍ＋１）；６１４（Ｍ＋１−ｔＢｕ）。 実施例１７ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−４−Ｃｂｚ−１−シトシ ニル）アセチル］グリシン（１７） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステル（８， ５． ００ｇ；２０．３ミリモル）、ＤｈｂｔＯＨ（３．６４ｇ；２２．３ミリモル） およびＮ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（１３， ６．７７ ｇ；２２．３ミリモル）をＤＭＦ（１００ｍｌ）中に懸濁させた。次に塩化メチ レン（１００ｍｌ）を加えた。この溶液を０℃に冷却してＤＣＣ（５．０３ｇ； ２４．４ミリモル）を加えた。２時間後氷浴を取り去り、外界温度でさらに１時 間撹拌を続けた。反応混合物を真空中で蒸発乾固した。残留物をエーテル（１０ ０ｍｌ）中に懸濁させて、３０分激しく撹拌した。濾過して固体物質を単離し、 エーテル洗浄操作を２回繰返した。次に炭酸水素ナトリウム希薄溶液（約４％溶 液、１００ｍｌ）を加えてこの物質を１５分間激しく撹拌し、濾過して、水洗し た。次いでこの方法を一回繰返し、これを乾燥後１７．０ｇの黄色味を帯びた固 体物質が残った。次にこの固体をジオキサン（２００ｍｌ）と沸とうさせた後、 熱い間に濾過した。冷却後（２００ｍｌ）を加えた。沈澱した物質を濾過により 単離し、水洗して乾燥した。ＨＰＬＣ（２６０ｎｍで観察）によればこの物質は 純度が９９％を上回り、さらにＤＣＵを含んだ。このエステルを次にＴＨＦ（１ ００ｍｌ）中に懸濁させ、０℃に冷却して、１Ｎ ＬｉＯＨ（６１ｍｌ）を加え た。１５分撹拌後、混合物を濾過して、濾液を塩化メチレン（２×１５０ｍｌ） で洗った。このアルカリ溶液を次に０℃に冷却し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨを２．０ に調節した。濾過により標記化合物を単離し、一回水洗して、乾燥後１１．３ｇ の白色粉末が残った。この物質を塩化メチレン（３００ｍｌ）中に懸濁させて、 石油エーテル（３００ｍｌ）を加えた。濾過および洗浄を行い乾燥後に７．１ｇ （６９％）が得られた。ＨＰＬＣによりＲ_T＝１９．５分に純度９９％で検出、 またＲ_T＝１２．６分におそらくＺ脱保護モノマーと思われる少量の不純物（約 ２％）を検出した。Ｃ₂₃Ｈ₂₉Ｎ₅Ｏ₈の元素分析。実測値（計算値）Ｃ：５４．１ ６（５４．８７）；Ｈ：５．７６（５．８１）およびＮ：１３．６５（１３．９ １）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１０．７８（ｂ．ｓ，１ Ｈ，ＣＯ₂ Ｈ）；７．８８（２つが重なりあった二重線，１Ｈ，Ｃｙｔ Ｈ−６ ）；７．４１−７．３２（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０１（２つが重なりあった二 重線，１Ｈ，Ｃｙｔ Ｈ−６）；６．９４＆６．７８（分解しない三重線，１Ｈ ，ＢｏｃＮＨ）；５．１９（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂）；４．８１＆４．６２（ｓ ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＣＯＮ）；４．１７＆３．９８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＣＯ₂）。 実施例１８ ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１８） アデニン（１０．０ｇ，７４ミリモル）および炭酸カリウム（１０．２９ｇ， ７４．０ミリモル）をＤＭＦ中に懸濁させてエチルブロモアセテート（８．２４ ｍｌ，７４ミリモル）を加えた。この懸濁液を室温下で窒素雰囲気中で２．５時 間撹拌してから濾過した。固体残留物をＤＭＦ（１０ｍｌ）で３回洗った。濾液 を合わせて真空中で蒸発乾固した。この黄橙色の固体物質を水（２００ｍｌ）中 に注入し、４Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを６にした。０℃で１０分撹拌後、固形物 を濾別し、水洗し、９６％エタノール（１５０ｍｌ）で再結晶させた。標記化合 物を濾過により単離して、エーテルで十分に洗った。収量３．４ｇ（２０％）。 融点２１５．５−２２０℃。Ｃ₉Ｈ₁₁Ｎ₅Ｏ₂の元素分析。実測値（計算値）：Ｃ ：４８．８６（４８．６５）；Ｈ：５．０１（４．９１）；Ｎ：３１．６６（３ １．４２）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：（ｓ，２Ｈ，Ｈ− ２＆Ｈ−８），７．２５（ｄ．ｓ．，２Ｈ，ＮＨ₂），５．０６（ｓ，２Ｈ，Ｎ ＣＨ₂），４．１７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，ＯＣＨ₂）および１．２１ （ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１３Ｈｚ，ＮＣＨ₂）。¹³Ｃ−ＮＭＲ．１５２．７０，１ ４１，３０，６１．４１，４３．９７および１４．０７。ＦＡＢ−ＭＳ．２２２ （ＭＨ＋）。ＩＲ：振動数ｃｍ^-1単位（強度）。３８５５（５４．３），３２７ ４（１０．４），３２４６（１４．０），３１１７（５．３），２９８９（２２ ．３），２９４０（３３．９），２８７６（４３．４），２７５３（４９．０） ，２３４６（５６．１），２１０６（５７．１），１８９９（５５．７），１７ ６２（１４．２），１７４２（１４．２），１７４２（１．０），１６７１（１ ．８），１６４４（１０．９），１６０６（０．６），１５８２（７．１），１ ５２２（４３．８），１４７７（７．２），１４４５（３５．８）および（１４ ２２（８．６）。アルキル化の位置は、９６％エタノールで再結晶させて得た結 晶についてのＸ線結晶学により確認した。 別に、次のような方法で９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル１８を 調製することができる。窒素送入管、機械撹拌機および滴下漏斗を備えた２Ｌの 三つ口フラスコ内のアデニン（５０．０ｇ，０．３７モル）のＤＭＦ（１１００ ｍｌ）懸濁液に、ヘキサンで洗った１６．４ｇ（０．４０７モル）の水素化ナト リウムの鉱油溶液を添加した。この混合物を２時間激しく撹拌してから、３時間 にわたりエチルブロモアセテート（７５ｍｌ，０．６７モル）を１滴ずつ加えた 。この混合物をさらに１時間撹拌した後、ｔｌｃはアデニンが完全に転化したこ とを示した。この混合物を１ｍｍＨｇで蒸発乾固し、その油状残留物に水（５０ ０ｍｌ）を加えて標記化合物を結晶化させた。その固体を６０％エタノール（６ ００ｍｌ）で再結晶させた。乾燥後の収量５３．７ｇ（６５．６％）。ＨＰＬＣ （２１５ｎｍ）純度９９．５％を上回る。 実施例１９ Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１９） ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１８， ３．４０ｇ，１５． ４ミリモル）を穏やかに加熱して無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、２０℃に冷 却して、１５分間にわたり、氷冷しつつあるＮ−エチル−Ｃｂｚ−イミダゾール テトラフルオロボレート（６２ミリモル）の塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液に加 えた。若干の沈澱が認められた。氷浴を取り去り、その溶液を一夜間撹拌した。 その反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和溶液（１００ｍｌ）で処理した。１０ 分間撹拌後、相を分離させ、その有機相を１容量の水、硫酸水素カリウム希薄溶 液（２回）および塩化ナトリウム飽和溶液でつぎつぎに洗った。その溶液を硫酸 マグネシウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固して、１１ｇの油状物質を得た。その 物質を塩化メチレン（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して、石油エーテル（５ ０ｍｌ）で沈澱させた。この方法を一回繰り返して３．４５ｇ（６３％）の標記 化合物を得た。融点１３２−３５℃。Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄の元素分析。実測値（計算 値）：Ｃ：５６．９５（５７．４６）；Ｈ：４．７１（４．８２）；Ｎ：１９． ３５（１９．７１）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＣＤＣｌ₃）：８．７７（ｓ ，１Ｈ，Ｈ−２またはＨ−８）；７．９９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２またはＨ−８）； ７．４５−７．２６（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．３１（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ ₂）； ４．９６（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ ₂）；４．２７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ ，ＣＨ ₂ＣＨ₃）および１．３０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ₂ＣＨ ₃）。¹³ Ｃ−ＮＭＲ：１５３．０９；１４３．１１；１２８．６６；６７．８４；６２ ．５１；４４．２４および１４．０９。ＦＡＢ−ＭＳ：３５６（ＭＨ＋）および ３１２（ＭＨ＋−ＣＯ₂）。ＩＲ：振動数ｃｍ^-1単位（強度）。３４２３（５２ ．１）；３１８２（５２．８）；３１１５（５２．１）；３０３１（４７．９） ；２９８１（３８．６）；１７４７（１．１）；１６１７（４．８）；１５．８ ７（８．４）；１５５２（２５．２）；１５１１（４５．２）；１４９２（３７ ．９）；１４６５（１４．０）および１４１３（３７．３）。 実施例２０ Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニン（２０） Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（１９，３． ２０ｇ；９．０１ミリモル）をメタノール（５０ｍｌ）と混合して０℃に冷却し た。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を加えると該物質は急速に溶解し た。０℃に３０分保持後、そのアルカリ溶液を塩化メチレン（２×５０ｍｌ）で 洗った。その水溶液を０℃において４Ｎ ＨＣｌでｐＨを１．０にすることによ り標記化合物を沈澱させた。濾過、水洗および乾燥後の収量は３．０８ｇ（１０ ４％）であった。生成物は塩を含み、元素分析はそれを反映した。Ｃ₁₅Ｈ₁₃Ｎ₅ Ｏ₄ の元素分析。実測値（計算値）：Ｃ：４６．３２（５５．０５）；Ｈ：４．２ ４（４．００）；Ｎ：１８．１０（２１．４０）およびＣ／Ｎ：２．５７（２． ５６）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆）：８．７０（ｓ，２Ｈ， Ｈ−２およびＨ−８）；７．５０−７．３５（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．２７（ｓ ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ ₂）；および５．１５（ｓ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ ₂）。¹³Ｃ−ＮＭ Ｒ。１６８．７７，１５２．５４，１５１．３６，１４８．７５，１４５．１３ ，１２８．５１，１２８．１７，１２７．９８，６６．７６および４４．６７。 ＩＲ（ＫＢｒ）３４８４（１８．３）；３１０９（１５．９）；３０８７（１５ ．０）；２９６６（１７．１）；２９２７（１９．９）；２３８３（５３．８） ；１９６０（６２．７）；１７３９（２．５）；１６８８（５．２）；１６５５ （０．９）；１５９４（１１．７）；１５６０（１２．３）；１５３０（２６． ３）；１４９９（３０．５）；１４７５（１０．４）；１４５５（１４．０）； １４２９（２４．５）および１４１１（２３．６）。ＦＡＢ−ＭＳ：３２８（Ｍ Ｈ＋）および２８４（ＭＨ＋−ＣＯ₂）。システム１のＨＰＬＣ（２１５ｎｍ， ２６０ｎｍ）により１５．１８分に検出、少量の不純物はすべてで２％未満。 実施例２１ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−アデニ ニル）アセチル］グリシンエチルエステル（２１） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステル（８， ２． ００ｇ；８．１２ミリモル）、ＤｈｂｔＯＨ（１．４６ｇ；８．９３ミリモル） およびＮ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニン（２０， ２．９２ｇ； ８．９３ミリモル）をＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解した。次に塩化メチレン（１５ ｍｌ）を加えた。その溶液をエタノール／氷浴中で０℃に冷却した。ＤＤＣ（２ ．０１ｇ；９．７４ミリモル）を加えた。２．５時間後氷浴を取り去り、さらに １．５時間室温で撹拌を続けた。沈澱したＤＣＵを濾過により除き、ＤＭＦ（１ ５ｍｌ）で１回および塩化メチレン（２×１５ｍｌ）で２回洗った。合わせた濾 液にさらに塩化メチレン（１００ｍｌ）を加えた。その溶液を炭酸水素ナトリウ ム希薄溶液（２×１００ｍｌ）、硫酸水素カリウム希薄溶液（２×１００ｍｌ） および塩化ナトリウム飽和溶液（１×１００ｍｌ）でつぎつぎに洗った。この有 機相 を真空中で蒸発乾固して黄色味がかった油状物質３．２８ｇ（７３％）を得た。 粗製物のＨＰＬＣは純度がわずか６０％で、いくつかの不純物を含んでおり、不 純物には、メインピークよりも極性の強いもの、弱いものの両方を含んだ。この 油状物を無水エタノール（５０ｍｌ）に溶解して、活性炭を加えた。５分間撹拌 後溶液を濾過した。濾液を水（３０ｍｌ）と混合して一夜間撹拌したままにして おいた。次の日に濾過して白色沈澱物を除き、水洗し、乾燥して、ＨＰＬＣによ り９８％を上回る純度の物質１．１６ｇ（２６％）を得た。この母液に水を加え ると純度が約９５％の０．５３ｇをさらに得た。Ｃ₂₆Ｈ₃₃Ｎ₇Ｏ₇・Ｈ₂Ｏの元素 分析。実測値（計算値）Ｃ：５５．０１（５４．４４）；Ｈ：６．８５（６．１ ５）およびＮ：１６．４７（１７．０９）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤ Ｃｌ₃）：８．７４（ｓ，１Ｈ，Ａｄｅ Ｈ−２）；８．１８（ｂ．ｓ，１Ｈ， ＺＮＨ）；８．１０＆８．０４（ｓ，１Ｈ，Ｈ−８）；７．４６−７．３４（ｍ ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．６３（分解しないｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．３０（ｓ ，２Ｈ，ＰｈＣＨ₂）；５．１６＆５．００（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＣＯＮ）；４．２ ９＆４．０６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ ₂ＣＯ₂Ｈ）；４．２０（ｑ，２Ｈ，ＯＣＨ ₂ＣＨ₃ ）；３．６７−３．２９（ｍ，４Ｈ，ＣＨ ₂ＣＨ ₂）；１．４２（ｓ，９Ｈ，^tＢ ｕ）および１．２７（ｔ，３Ｈ，ＯＣＨ₂ＣＨ ₃）。該スペクトルは微量のエタノ ールおよびＤＣＵを示す。 実施例２２ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−アデニ ニル）アセチル］グリシン（２２） Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−アデ ニニル）アセチル］グリシンエチルエステル（２１， １．４８ｇ；２．６６ミ リモル）をＴＨＦ（１３ｍｌ）中に懸濁させ、混合物を０℃に冷却した。水酸化 リチウム（８ｍｌ；１Ｎ）を加えた。撹拌１５分後、反応混合物を濾過し、過剰 の水（２５ｍｌ）を加えて、その溶液を塩化メチレン（２×２５ｍｌ）で洗った 。この水溶液のｐＨを１Ｎ ＨＣｌでｐＨ２．０に調節した。この沈澱物を濾過 により単離し、水洗して乾燥し、０．８２ｇ（５８％）を得た。この生成物を塩 化メチレン／石油エーテルで２回再沈澱させ、乾燥後０．７７ｇ（５５％）得た 。 融点１１９℃（分解）。Ｃ₂₄Ｈ₂₉Ｎ₇Ｏ₇・Ｈ₂Ｏの元素分析。実測値（計算値） Ｃ：５３．３２（５２．８４）；Ｈ：５．７１（５．７３）；Ｎ：１７．６８（ １７．９７）。ＦＡＢ−ＭＳ。５２８．５（ＭＨ＋）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０Ｍ Ｈｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：１２．７５（真のｂ，１Ｈ，ＣＯ₂Ｈ）；１０．６５（ ｂ．ｓ，１Ｈ，ＺＮＨ）；８．５９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１４Ｈｚ，Ａｄｅ Ｈ −２）；８．３１（ｓ，１Ｈ，Ａｄｅ Ｈ−８）；７．４９−７．３１（ｍ，５ Ｈ，Ｐｈ）；７．０３＆６．７５（分解しないｔ，１Ｈ，ＢｏｃＮＨ）；５．３ ３＆５．１６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＯＮ）；５．２２（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂）； ４．３４−３．９９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ₂ＣＯ₂Ｈ）；３．５４−３．０３（ｍ’ｓ ，水を含む，ＣＨ ₂ＣＨ ₂）および１．３９＆１．３７（ｓ，９Ｈ，^tＢｕ）。¹³ Ｃ−ＮＭＲ。１７０．４；１６６．６；１５２．３；１５１．５；１４９．５； １４５．２；１２８．５；１２８．０；１２７．９；６６．３２；４７．６３； ４７．０３；４３．８７および２８．２４。 実施例２３ ２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン（２３） ２−アミノ−６−クロロプリン（５．０２ｇ；２９．６ミリモル）および炭酸 カリウム（１２．９１ｇ；９３．５ミリモル）のＤＭＦ（５０ｍｌ）懸濁液にブ ロモ酢酸（４．７０ｇ；２２．８ミリモル）を加えた。この混合物を窒素雰囲気 中で２０時間激しく撹拌した。水（１５０ｍｌ）を加え、その溶液をセライトに 通して濾過して黄色透明液を得た。この溶液を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性化した。 沈澱物を濾過して、適当な乾燥剤で真空乾燥した。収量（３．０２ｇ；４４．８ ％）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：ｄ＝４．８８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；６． ９５（ｓ，２Ｈ）；８．１０（ｓ，１Ｈ）。 実施例２４ ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（２４） ナトリウム（２．０ｇ；８７．０ミリモル）をベンジルアルコール（２０ｍｌ ）に溶解して、１３０℃に２時間加熱した。０℃に冷却後、２−アミノ−６−ク ロロ−９−カルボキシメチルプリン（２３， ４．０５ｇ；１８．０ミリモル） のＤＭＦ（８５ｍｌ）溶液を徐々に加えて、得られた懸濁液を２０℃で一夜 間撹拌した。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ，１００ｍｌ）を加えて、透明な溶液 を酢酸エチル（３×１００ｍｌ）で洗った。次に水相を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性 化した。沈澱物を酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶解して、水相を酢酸エチル（２ ×１００ｍｌ）で抽出した。合わせた有機相を塩化ナトリウム飽和溶液（２×７ ５ｍｌ）で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、真空中で蒸発乾固した。この残 留物をエタノール（３００ｍｌ）で再結晶させた。適当な乾燥剤による真空乾燥 後の収量：２．７６ｇ（５２％）。融点１５９−６５℃。元素分析。（計算値； 実測値）Ｃ（５６．１８；５５．９７），Ｈ（４．３８，４．３２），Ｎ（２３ ．４，２３．１０）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：４．８２ｐｐｍ（ｓ，２ Ｈ，）；５．５１（ｓ，２Ｈ）；６．４５（ｓ，２Ｈ）；７．４５（ｍ，５Ｈ） ；７．８２（ｓ，１Ｈ）。 実施例２５ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（２−アミノ−６−ベンジルオ キシプリン−９−イル）アセチル］グリシン［ＢｏｃＧａｅｇモノマー］（２５ ） ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（２４，０． ５０ｇ；１．６７ミリモル）、Ｎ−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンメチルエステ ル（０．６５ｇ；２．８０ミリモル）、ジイソプロピルエチルアミン（０．５４ ｇ；４．１９ミリモル）およびブロモトリスピロリジノホスホニウムヘキサフル オロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ（登録商標））（０．７９８ｇ；１．７１ミリ モル）をＤＭＦ（２ｍｌ）中で４時間撹拌した。この透明溶液を炭酸水素ナトリ ウムの氷***液（１Ｎ；４０ｍｌ）中に注入して、酢酸エチル（３×４０ｍｌ） で抽出した。この有機層を、硫酸水素カリウム溶液（１Ｎ；２×４０ｍｌ）、炭 酸水素ナトリウム溶液（１Ｎ；１×４０ｍｌ）および塩化ナトリウム飽和溶液（ ６０ｍｌ）で洗った。無水硫酸ナトリウムおよび真空蒸発で乾燥後、固体残留物 を酢酸エチル／ヘキサン（２０ｍｌ（２：１））で再結晶させて、６３％の収量 でメチルエステルを得た（ＭＳ−ＦＡＢ５１４（Ｍ＋１））。このエステルを濃 縮水酸化ナトリウム（１ｍｌ）を含有するエタノール／水（３０ｍｌ（１：２） ）に溶解して加水分解を行った。２時間撹拌後、溶液を濾過して、４Ｎ塩酸 を加えてｐＨ３に酸性化した。濾過により標記化合物を得た。収量：３７０ｍｇ （加水分解に対して７２％）。ＨＰＬＣによる純度は９９％を上回った。第二級 アミドの周りの回転が束縛されるためにいくつかのシグナルは２：１の比の二重 線になった（表では主要なものをｍｊ.,主要でないものをｍｉ．で示す）。¹Ｈ −ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ₆）：ｄ＝１．４ｐｐｍ．（ｓ，９Ｈ） ；３．２（ｍ，２Ｈ）；３．６（ｍ，２Ｈ）；４．１（ｓ，ｍｊ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ ＣＯＯＨ）；４．４（ｓ，ｍｉ.,ＣＯＮＲＣＨ ₂ＣＯＯＨ）；５．０（ｓ，ｍｉ .,Ｇｕａ−ＣＨ ₂ＣＯ−）；５．２（ｓ，ｍｊ.,Ｇｕａ−ＣＨ ₂ＣＯ）；５．６（ ｓ，２Ｈ）；６．５（ｓ，２Ｈ）；６．９（ｍ，ｍｉ.,ＢｏｃＮＨ）；７．１（ ｍ，ｍｊ.,ＢｏｃＮＨ）；７．５（ｍ，３Ｈ）；７．８（ｓ，１Ｈ）；１２．８ （ｓ，１Ｈ）。¹³ Ｃ−ＮＭＲ．１７０．９５；１７０．５２；１６７．２９；１６６．８５；１ ６０．０３；１５９．７８；１５５．８４；１５４．８７；１４０．６３；１３ ６．７６；１２８．４９；１２８．１０；１１３．０４；７８．１９；７７．８ ６；６６．９５；４９．２２；４７．７０；４６．９４；４５．９６；４３．６ ２；４３．３１および２８．２５。 実施例２６ 固相法によるＰＮＡオリゴマーの合成。一般的方法。 官能性樹脂を、典型的には０．１−１．０ミリモルの官能性を与えるように計 り取る（樹脂に結合させる官能性は、種々の源、たとえばＰｅｐｔｉｄｅｓ Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙから市販されている）。この重量 の樹脂を１：１（容量／容量）ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液中に 懸濁させ(３０ｍＬ／１ｇの樹脂)、必要ならばある時間の間膨潤させる。次に濾 過して溶剤を除き、樹脂をトリフルオロ酢酸中に再懸濁させて(１ｍＬ／１ｇの 樹脂)、３分間振とうする。濾過してトリフルオロ酢酸を除き、この工程を２回 繰り返す。この樹脂を１：１（容量／容量）ジクロロメタン：ジメチルホルムア ミド溶液で３回洗う。得られた樹脂をピリジン溶液に再懸濁させ（５ｍＬ／１０ ０ｍｇの樹脂）、真空濾過してピリジンを除去する。この工程を２回繰返す。こ の樹脂を１：１（容量／容量）ピリジン：ジメチルホルムアミドに懸濁させ、こ の 懸濁液に所望のＰＮＡモノマー（２−１０モル相当）、ＴＢＴＵ（１．９−９． ９モル相当）、およびジイソプロピルエチルアミン（５−２０モル相当）を、Ｐ ＮＡモノマーの最終濃度が０．２モルになるように加える。この懸濁液を１５− ６０分振とうし、消費されたカップリング溶液を濾過により除く。樹脂をピリジ ンで３回洗い、ＤＭＦ中の５当量のＲａｐｏｐｏｒｔ試薬を用いて５分間で未反 応アミンをキャップする。次に樹脂をピリジンで３回洗い、続いて１：１（容量 ／容量）ジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液で３回洗う（５ｍＬ／１０ ０ｍｇの樹脂）。この時点で樹脂は次のカップリング反応の準備が整い、所望の ＰＮＡが樹脂に結合するまでこの手順を繰返す。 この一般方法によって調製されるアミノエチルグリシン（ａｅｇ−）ＰＮＡおよ びａｅｇ−ＰＮＡ誘導体の特定例 実施例２７ ＰＮＡのキャッピング ＰＮＡは実施例２６に記載される方法に従い、最終のカップリング工程でＰＮ Ａモノマーの代りに所望のカルボン酸系キャッピング試薬を用いることにより、 Ｎ末端の非ＰＮＡ部分によりキャッピングすることができる。 この一般方法により調製されるａｅｇ−ＰＮＡおよびａｅｇ−ＰＮＡ誘導体の特 定例 実施例２８ 一般的開裂反応 完結したＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体は次のように樹脂から開裂して単離するこ とができる。該樹脂をトリフルオロ酢酸で２回洗った後、１：１：２：６の比率 のチオアニソール、ｍクレゾール、トリフルオロメタンスルホン酸およびトリフ ルオロ酢酸の混合物中に室温で１時間懸濁させる（２００μｌ／１μモル）。次 にエーテル中に開裂溶液を流し込み（１ｍｌ／μモル）前記のプロセスを繰返す 。次いで濾過または遠心分離によって沈澱物を集める。 実施例２９ 一般的精製法 単離したＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体は、Ｗａｔｅｒｓ μＢｏｎｄａｐａｋ Ｐｈｅｎｙｌ−Ｃ１８カラム（１９ｍｍ×１５０ｍｍ）を用い、アセトニトリル ：０．０５０モルＮＨ₄ＯＡＣ（９：１）、ｐＨ６、０．０５０モルＮＨ₄ＯＡＣ 溶液に０．１％ヘキサフルオロプロパノールを加えたｐＨ６の溶液より成るグラ ジェント液で溶離させる分取逆相ＨＰＬＣによって精製する。この溶離剤は精製 する特定のＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体に合うように修正することができる。 実施例３０ Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチル］ −Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシン（３０） Ａ．（Ｏ−ベンジル）Ｂｏｃセリンメチルエステル（３０Ａ） （Ｏ−ベンジル）Ｂｏｃセリン２．００ｇ（６．８ミリモル）を５０ｍｌのエ ー テルに溶解した。この溶液に、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌ ｅｔｉｎ ｎｕｍｂｅｒ ＡＬ−１８０による方法を用いて５ｇのＤｉａｚａｌ ｄから新たに調製したジアゾメタンを含有するエーテル溶液を加えた。この溶液 を３０分撹拌後、溶液が透明になるまで氷酢酸を１滴ずつ加えた。得られた溶液 を真空中で濃縮して、透明油状物として２．００ｇ（９５％）を得た。¹Ｈ：（ ＣＤＣｌ₃）：７．３（ｄ，５Ｈ），５．５（ｂｓ，１Ｈ），４．５（ｓ，２Ｈ ），３．８（ｍ，２Ｈ），３．７（ｓ，３Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）。 Ｂ．１−Ｏ−ベンジル−２−Ｎ−Ｂｏｃ−２，３−プロパンジオール（３０Ｂ ） 化合物３０Ａを５０ｍｌのメタノールに溶解して０℃に冷却した。これに３０ ０ｍｇの水素化ホウ素リチウムを、添加の間にガス発生の止むのを待って少量ず つ添加した。該水素化物をすべて添加し終ると、反応物を１時間還流させた。次 に０℃に冷却し、さらに重炭酸ナトリウム飽和溶液を１滴ずつ加えることによっ て抑制させた。この溶液を５０ｍｌずつのクロロホルムで２回抽出した。有機抽 出物を合わせて、再度重炭酸ナトリウム飽和溶液、次に塩化ナトリウム飽和溶液 で洗った。このクロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮して油状物 を得た。この油状物をシリカゲルを用いるクロマトグラフィーにかけ、７％メタ ノールメタン溶液で溶離させ、透明な油として１．３０ｇを単離させた。¹Ｈ： （ＣＤＣｌ₃）：７．３（ｓ，５Ｈ），５．２（ｂｓ，１Ｈ），４．５（ｓ，２ Ｈ），３．９−３．５（ｍｍ，５Ｈ），１．４（ｓ，９Ｈ）。 Ｃ．Ｔ−Ｏ−ベンジル−２−Ｎ−Ｂｏｃ−３−フタロイル−２，３−ジアミノ プロパノール（３０Ｃ） 化合物３０Ｂを１００ｍｌの新たに蒸留したＴＨＦに溶解した。この溶液に次 の試薬を加えた：トリフェニルホスフィン（１．２６ｇ，４．８２ミリモル）、 ジエチルアゾジカルボキシレート（０．８３９ｇ，４．８２ミリモル）およびフ タルイミド（０．７１０ｇ，４．８２ミリモル）。そして反応物を室温で一夜間 撹拌した。撹拌後溶液を濃縮して黄色固体を得、さらに３０％酢酸エチルのヘキ サン溶液を用いてシリカゲルによるクロマトグラフィーを行った。生成物は白色 固体として単離され、収量は１．６０ｇ（９７％）であった。¹Ｈ：（ＣＤＣｌ₃ ）；７．９（ｍ，２Ｈ），７．７（ｍ，２Ｈ），７．３（ｓ，５Ｈ），５．１ （ｄ，１Ｈ），４．５（ｓ，２Ｈ），４．０−３．５（ｍｍ，５Ｈ），１．３（ ｓ，９Ｈ）。 Ｄ．Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエ チル］グリシンメチルエステル（３０Ｄ） 化合物３０Ｃ（１．００ｇ，２．９ミリモル）を２０ｍｌのジクロロメタンに 溶解して０℃に冷却する。これに２０ｍｌのＴＦＡを加えて反応物を室温に温め る。完了後に、反応物を真空中で濃縮し、次いでジクロロメタンに再溶解し、１ Ｎ ＮａＯＨおよび食塩水で洗い、この有機溶液を乾燥し、濃縮して遊離アミン を得る。次にこのアミンを２当量のトリエチルアミンとともに無水ＴＨＦに溶解 して、０℃に冷却する。メチルブロモアセテート（０．５００ｇ，３．２ミリモ ル）を加えて、反応が完了するまで反応物を室温で撹拌する。標準の水性の処理 法およびクロマトグラフィーによって標記化合物を得る。 Ｅ．Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエ チル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシン（３０） 実施例３０Ｄの官能性主鎖モノマーをＴＨＦに溶解して３当量のトリエチルア ミンで処理する。これに、１当量の１−クロロカルボニルメチルチミンをＴＨＦ 溶液として３０分間にわたり１滴ずつ加える。得られた溶液を一夜間または反応 完了まで撹拌する。標準の酸性処理法およびクロマトグラフィーによって標記化 合物が得られる。 実施例３１ Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチル］ −Ｎ−［（９−アデニニル）アセチル］グリシン（３１） Ａ．９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３１Ａ） アデニン（１０．０ｇ，７４ミリモル）および炭酸カリウム（１０．２９ｇ， ７４．０ミリモル）をＤＭＦ中に懸濁させてエチルブロモアセテート（８．２４ ｍｌ，７４ミリモル）を加えた。この懸濁液を室温下窒素雰囲気中で２．５時間 撹拌してから濾過した。この固体残留物をＤＭＦ（１０ｍｌ）で三回洗った。濾 液を合わせて真空中で蒸発乾固した。その黄橙色の固体物質を水（２００ｍｌ） 中に入れ、４Ｎ ＨＣｌを加えてｐＨを６にした。０℃において１０分間撹拌後 、固形物を濾別し、水洗して、９６％エタノール（１５０ｍｌ）で再結晶させた 。濾過して標記化合物を単離させて、エーテルで十分に洗った。収量３．４ｇ（ ２０％）。融点２１５．５−２２０℃。Ｃ₉Ｈ₁₁Ｎ₅Ｏ₂の元素分析。実測値（計 算値）：Ｃ：４８．８６（４８．６５）；Ｈ：５．０１（４．９１）；Ｎ：３１ ．６６（３１．４２）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ−ｄ₆）：（ｓ， ２Ｈ，Ｈ−２＆Ｈ−８），７．２５（ｂ．ｓ．，２Ｈ，ＮＨ₂），５．０６（ｓ ，２Ｈ，ＮＣＨ₂），４．１７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１１Ｈｚ，ＯＣＨ₂）および １．２１（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１３Ｈｚ，ＮＣＨ₂）。¹³Ｃ−ＮＭＲ．１５２． ７０，１４１．３０，６１．４０，４３．９０および１４．０７。ＦＡＢ−ＭＳ ．２２２（ＭＨ＋）。ＩＲ：振動数ｃｍ^-1単位（強度）。３８５５（５４．３） ，３２７４（１０．４），３２４６（１４．０），３１１７（５．３），２９８ ９（２２．３），２９４０（３３．９），２８７６（４３．４），２７５３（４ ９．０），２３．４６（５６．１），２１０６（５７．１），１８９９（５５． ７），１７６２（１４．２），１７４２（１４．２），１７４２（１．０），１ ６７１（１．８），１６４４（１０．９），１６０６（０．６），１５８２（７ ．１），１５２５（４３．８），１４７７（７．２），１４４５（３５．８）お よび１４２２（８．６）。アルキル化の位置は９６％エタノールで再結晶させて 得た結晶についてのＸ線結晶学で確認した。 また別に、９−カルボキシメチルアデニンエチルエステルを次の方法によって 調製することもできる。窒素導入管、機械撹拌機および滴下漏斗を備えた２Ｌの 三つ口フラスコ内のアデニン（５０．０ｇ，０．３７モル）のＤＭＦ（１１００ ｍｌ）懸濁液にヘキサンで洗った１６．４ｇ（０．４０７モル）の水素化ナトリ ウムの鉱油分散液を加えた。この混合物を２時間激しく撹拌した後、３時間にわ たってエチルブロモアセテート（７５ｍｌ，０．６７モル）を１滴ずつ加えた。 この混合物をさらに１時間撹拌すると、ｔｌｃによりアデニンの完全転化が示さ れた。この混合物を１ｍｍＨｇで蒸発乾固し、油状残留物に水（５００ｍｌ）を 加えて標記化合物を結晶化させた。９６％エタノール（６００ｍｌ）により該固 体を再結晶させた。乾燥後の収量５３．７ｇ（６５．６％）。ＨＰＬＣ（２１５ ｎｍ）によれば純度は９９．５％を上回る。 Ｂ．Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル(３１Ｂ) ９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３１Ａ，３．４０ｇ，１５． ４ミリモル）を穏やかに加熱しながら無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解して、２０ ℃に冷却し、次に１５分かけて、氷冷しつつあるＮ−エチル−Ｃｂｚ−イミダゾ ールテトラフルオロボレート（６２ミリモル）の塩化メチレン溶液に加えた。若 干の沈殿が認められた。氷浴を取り去って、その溶液を一夜間撹拌した。その反 応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和溶液（１００ｍｌ）で処理した。１０分間乾 燥後、相を分離させ、有機相を１容量の水、硫酸水素カリウム希薄溶液（２回） および塩化ナトリウム飽和溶液でつぎつぎに洗った。この溶液を硫酸マグネシウ ムで乾燥し、真空中で蒸発乾固して１１ｇの油状物質を得た。この物質を塩化メ チレン（２５ｍｌ）に溶解し、０℃に冷却して石油エーテル（５０ｍｌ）で沈殿 させた。この方法を一回繰返して３．４５ｇ（６３％）の標記化合物を得た。融 点１３２−３５℃。Ｃ₁₇Ｈ₁₇Ｎ₅Ｏ₄の元素分析。実測値（計算値）：Ｃ：５６． ９５（５７．４６）；Ｈ：４．７１（４．８２）；Ｎ：１９．３５（１９．７１ ）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ₃）：８．７７（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２ま たはＨ−８）；７．９９（ｓ，１Ｈ，Ｈ−２またはＨ−８）；７．４５−７．２ ６（ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．３１（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ ₂）；４．９６（ｓ，２ Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ ₂）；４．２７（ｑ，２Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ ₂ＣＨ₃）お よび１．３０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１５Ｈｚ，ＣＨ₂ＣＨ ₃）。¹³Ｃ−ＮＭＲ．１ ５３．０９；１４３．１１；１２８．６６；６７．８４；６２．５１；４４．２ ４および１４．０９。ＦＡＢ−ＭＳ：３５６（ＭＨ＋）および３１２（ＭＨ＋− ＣＯ₂）。ＩＲ：振動数ｃｍ^-1単位（強度）３４２３（５２．１），３１８２（ ５２．８），３１１５（５２．１），３０３１（４７．９），２９８１（３８． ６），１７４７（１．１），１６１７（４．８），１５．８７（８．４），１５ ５２（２５．２），１５１１（４５．２），１４９２（３７．９），１４６５（ １４．０）およびＴ４１３（３７．３）。 Ｃ．Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニン（３１Ｃ） Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニンエチルエステル（３１Ｂ，３ ． ２０ｇ；９．０１ミリモル）をメタノール（５０ｍｌ）と混合して０℃に冷却し た。水酸化ナトリウム溶液（５０ｍｌ；２Ｎ）を加えることによってこの物質は 急速に溶解した。０℃における３０分後、このアルカリ溶液を塩化メチレン（２ ×５０ｍｌ）で洗った。この水溶液を、０℃において４Ｎ ＨＣｌによりｐＨを １．０にさせ、それによって標記化合物を沈殿させた。濾過、水洗および乾燥後 の収量は３．０８ｇ（１０４％）であった。この生成物は塩を含み、元素分析は それを反映した。Ｃ₁₅Ｈ₁₃Ｎ₅Ｏ₄の元素分析。実測値（計算値）：Ｃ：４６．３ ２（５５．０５）；Ｈ：４．２４（４．００）；Ｎ：１８．１０（２１．４０） およびＣ／Ｎ：２．５７（２．５６）。¹Ｈ−ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ；ＤＭＳＯ −ｄ₆）：８．７０（ｓ，２Ｈ，Ｈ−２およびＨ−８）；７．５０−７．３５（ ｍ，５Ｈ，Ｐｈ）；５．２７（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ ₂）；および５．１５（ｓ， ２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ ₃）。¹³Ｃ−ＮＭＲ．１６８．７７，１５２．５４，１５１． ３６，１４８．７５，１４５．１３，１２８．５１，１２８．１７，１２７．９ ８，６６．７６および４４．６７。ＩＲ（ＫＢｒ）３４８４（１８．３）；３１ ０９（１５．９）；３０８７（１５．０）；２９６６（１７．１）；２９２７（ １９．９）；２３８３（５３．８）；１９６０（６２．７）；１７３９（２．５ ）；１６８８（５．２）；１６５５（０．９）；１５９４（１１．７）；１５６ ０（１２．３）；１５３０（２６．３）；１４９９（３０．５）；１４７５（１ ０．４）；１４５５（１４．０）；１４２９（２４．５）および１４１１（２３ ．６）。ＦＡＢ−ＭＳ：３２８（ＭＨ＋）および２８４（ＭＨ＋−ＣＯ₂）。シ ステム１のＨＰＬＣ（２１５ｎｍ，２６０ｎｍ）：１５．１８分で検出。少量の 不純物全部で２％未満。 Ｄ．Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエ チル］−Ｎ−［（９−アデニニル）アセチル］グリシン（３１） 標準法を用いて、Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアデニン（３１Ｃ） を酸塩化物に転化させ、実施例３０Ｄの方法に従って処理して標記化合物を得る 。 実施例３２ Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチル］ −Ｎ−［（１−ジトシニル）アセチル］グリジン（３２） Ａ．Ｎ−４−Ｃｂｚ−シトシン（３２Ａ） オーブン乾燥設備内の窒素雰囲気中で０℃におけるシトシン（８，２０．０ｇ ；０．１８モル）の無水ピリジン（１０００ｍｌ）懸濁液にＣｂｚクロリド（５ ２ｍｌ；０．３６モル）を約１時間にわたり１滴ずつ加えた。次にこの溶液を一 夜間撹拌し、その後ピリジン懸濁液を真空中で蒸発乾固した。水（２００ｍｌ） および４Ｎ塩酸を加えてｐＨを１にした。得られた白色沈澱物を濾別し、水洗し 、空気吸引により一部乾燥させた。まだ湿潤している沈澱物を無水エタノール（ ５００ｍｌ）と１０分間煮沸し、０℃に冷却し、濾過し、エーテルで十分に洗っ て、真空乾燥した。収量２４．７ｇ（５４％）。融点２５０℃を上回る。Ｃ₁₂Ｈ₁₁ Ｎ₃Ｏ₃の元素分析。実測値（計算値）；Ｃ：５８５９（５８．７７）；Ｈ：４ ．５５（４．５２）；Ｎ：１７．１７（１７．１３）。この生成物は溶解させる ことができなかったので、ＮＭＲスペクトルは記録されなかった。 Ｂ．Ｎ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシン（３２Ｂ） 機械撹拌機および窒素遮蔽を備えた三つ口丸底フラスコにメチルブロモアセテ ート（７．８２ｍｌ；８２．６ミリモル）ならびにＮ−４−Ｃｂｚ−シトシン（ ３２Ａ，２１．０ｇ；８２．６ミリモル）および炭酸カリウム（１１．４ｇ；８ ２．６ミリモル）の無水ＤＭＦ（９００ｍｌ）懸濁液を入れた。この混合物を一 夜間激しく撹拌し、濾過して、真空中で蒸発乾固した。水（３００ｍｌ）および ４Ｎ塩酸（１０ｍｌ）を加え、混合物を０℃で１５分間撹拌して、水（２×７５ ｍｌ）で洗った。単離した沈澱物を水（１２０ｍｌ）、２Ｎ水酸化ナトリウム（ ６０ｍｌ）で処理して、３０分撹拌し、濾過して、０℃に冷却して、４Ｎ塩酸（ ３５ｍｌ）を加えた。濾過により標記化合物を単離し、水で十分に洗い、メタノ ール（１０００ｍｌ）で再結晶させ、エーテルで十分に洗った。これにより純化 合物７．７０ｇ（３１％）が得られた。再結晶の母液を２００ｍｌの容積に縮減 させて、０℃に冷却した。これによってさらに２．３０ｇの物質を得た。この物 質はｔｌｃによれば純粋であったが、赤みを帯びていた。融点２６６−２７４℃ 。 Ｃ₁₄Ｈ₁₃Ｎ₃Ｏ₅の元素分析。実測値（計算値）；Ｃ：５５．４１（５５．４５） ；Ｈ：４．２３（４．３２）；Ｎ：１４．０４（１．３８６）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ ９ ０ＭＨｚ；ＯＭＳＯ−ｄ₆）：８．０２ｐｐｍ（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１Ｈ， Ｈ−６）；７．３９（ｓ，５Ｈ，Ｐｈ）；７．０１（ｄ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，１ Ｈ，Ｈ−５）；５．１９（ｓ，２Ｈ，ＰｈＣＨ ₂−）；４．５２（ｓ，２Ｈ）。 Ｃ．Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエ チル］−Ｎ−［（１−シトシニル）アセチル］グリシン（３２） 標準法によってＮ−４−Ｃｂｚ−Ｎ−１−カルボキシメチルシトシンを酸クロ リドに転化させ、実施例３０Ｄの方法に従って処理して、標記化合物を得る。 実施例３３ Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチル］ −Ｎ−［（２−アミノ−６−ベンジルオキシプリン−９−イル）アセチル］グリ シン（３３） Ａ．２−アミノ−６−クロロ−９−カルボキシメチルプリン（３３Ａ） ２−アミノ−６−クロロプリン（５．０２ｇ；２９．６ミリモル）および炭酸 カリウム（１２．９１ｇ；９３．５ミリモル）のＤＭＦ（５０ｍｌ）懸濁液にブ ロモ酢酸（４．７０ｇ；２２．８ミリモル）を加えた。この混合物を窒素雰囲気 中で２０時間激しく撹拌した。水（１５０ｍｌ）を加え、その溶液セライトに通 して濾過して黄色の透明な溶液を得た。この溶液を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性化し た。沈澱物を濾過し、適当な乾燥剤で真空乾燥した。収量（３．０２ｇ；４４． ８％）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：ｄ＝４．８８ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）；６ ．９５（ｓ，２Ｈ）；８．１０（ｓ，１Ｈ）。 Ｂ．２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（３３Ｂ ） ナトリウム（２．０ｇ；８７．０ミリモル）をベンジルアルコール（２０ｍｌ ）に溶解して、１３０℃、２時間加熱した。０℃に冷却後、２−アミノ−６−ク ロロ−９−カルボキシメチルプリン（３３Ａ，４．０５ｇ；１８．０ミリモル） のＤＭＦ（８５ｍｌ）溶液を徐々に添加し、得られた懸濁液を一夜間２０℃で撹 拌した。水酸化ナトリウム溶液（１Ｎ，１００ｍｌ）を加え、透明な溶液を酢酸 エチル（３×１００ｍｌ）で洗った。次いでこの水相を４Ｎ塩酸でｐＨ３に酸性 化した。この沈澱物を酢酸エチル（２００ｍｌ）に溶解して、水相を酢酸エ チル（２×１００ｍｌ）で抽出した。この有機相を合わせて塩化ナトリウム飽和 溶液（２×７５ｍｌ）で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、さらに真空中で蒸 発乾固した。残留物をエタノール（３００ｍｌ）で再結晶させた。適当な乾燥剤 による真空乾燥後の収量：２．７６ｇ（５２％）。融点１５９−６５℃。元素分 析（計算値；実測値）Ｃ（５６．１８；５５．９７），Ｈ（４．３８；４．３２ ），Ｎ（２３．４；２３．１０）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆）：４．８２ｐ ｐｍ（ｓ，２Ｈ）；５．５１（ｓ，２Ｈ）；６．４５（ｓ，２Ｈ）；７．４５（ ｍ，５Ｈ）；７．８２（ｓ，１Ｈ）。 Ｃ．Ｎ−［（Ｎ−フタロイル）（１−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエ チル］−Ｎ−［（２−アミノ−６−ベンジルオキシプリン−９−イル）アセチル ］グリシン（３３） ２−アミノ−６−ベンジルオキシ−９−カルボキシメチルプリン（３３Ｂ，１ ６．７ミリモル）、化合物３１Ｄ（２．８０ミリモル）、ジイソプロピルエチル アミン（４．１９ミリモル）およびブロモトリスピロリジノホスホニウムヘキサ フルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ（登録商標））（１．７１ミリモル）をＤ ＭＦ（２ｍｌ）中で４時間撹拌する。この透明溶液と炭酸水素ナトリウムの氷冷 溶液（１Ｎ；４０ｍｌ）中に注入して、酢酸エチル（３×４０ｍｌ）で抽出する 。この有機層を、硫酸水素カリウム溶液（１Ｎ；２×４０ｍｌ）、炭酸水素ナト リウム溶液（１Ｎ；１×４０ｍｌ）および塩化ナトリウム飽和溶液（６０ｍｌ） で洗う。この有機層を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥して真空中で濃縮する 。この固体残留物を酢酸エチル／ヘキサン（２０ｍｌ（２：１））で再結晶させ て、メチルエステルを得る。このエステルを濃厚水酸化ナトリウム（１ｍｌ）を 含有するエタノール／水（３０ｍｌ（１：２））に溶解して加水分解を行わせる 。２時間撹拌後、この溶液を濾過し、４Ｎ塩酸を加えてｐＨ３に酸性化する。濾 過すると標記化合物が得られる。純度はＨＰＬＣで判断される。 実施例３４ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチル］−Ｎ −［（１−チミニル）−アセチル］グリシン（３４） Ａ． （Ｏ−ベンジル）−２−Ｎ−Ｂｏｃ−ジアミノプロパノール（３４Ａ） 化合物３０Ｃを、５００ｍｌのフラスコ中で、２００ｍｌのエタノールに溶解 する。ヒドラジンを、攪拌しながら反応混合物に加える。混合物を油浴中で６０ −６５°Ｃに加熱し、１４時間還流させる。溶媒を真空中で蒸発させる。残留物 をジクロロメタン（２５０ｍｌ）に溶解し、同容量のＮＨ₄ＯＨで２回抽出する 。有機層を蒸発させると、粗化合物３４Ａが得られる。生成物は、さらに精製す ることなしに用いることもできるが、ＨＰＬＣによってさらに精製することもで きる。ＮＭＲを用いて、生成物の純度をアッセイする。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−グリシンメチルエステル（３４Ｂ） 実施例３０Ｂの方法に従って、化合物３４Ａをメチルブロモアセテートで処理 すると、表題の化合物が得られる。 Ｃ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−メチル−Ｏ−ベンジル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシン（３４） 実施例３０Ｃ記載の方法に従って、化合物３４Ｂをクロロカルボニルメチルチ ミンで処理すると、表題の化合物が得られる。 実施例３５ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（１−ヒドロキシメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［ （１−チミニル）−アセチル］グリシン（３５） 実施例３４Ａ記載の方法に従って、化合物３０をヒドラジンで処理し、フタル イミド基を遊離アミンに変換し、次いでＢｏｃ₂Ｏ／ＮａＯＨで処理すると、Ｎ −Ｂｏｃ中間体が得られ、次にＨ₂／Ｐｄ／Ｃで処理すると、表題化合物が得ら れた。 実施例３６ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−ヒドロキシメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ− ［（１−チミニル）−アセチル］グリシン（３６） 実施例３５記載の方法に従って、化合物３４を処理すると、表題の化合物が得 られる。 実施例３７ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（１−ホルミル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チ ミニル−アセチル］ダリシン（３７Ａ）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−ホル ミル）−２−アミノエチル−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシン（３７ Ｂ） ＯｍｕｒａおよびＳｗｅｒｎ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３４，１６５１（１ ９７８）の方法に従って、化合物３５または３６をオキサリルクロリド／ＤＭＳ Ｏで処理すると、表題化合物がそれぞれ得られる。 実施例３８ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（１−アミノメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１ −チミニル−アセチル］グリシン（３８Ａ）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２− アミノメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリ シン（３８Ａ） 化合物３７Ａおよび３８Ｂを４ｍｌのメタノール中に溶解した。酢酸ナトリウ ムｐＨ４．０（２ｍｌ）、ナトリウム・シアノボロヒドリド（０．０２ｇ，０． ３ｍｍｏｌ）およびアンモニア／水（３００μｌ）を反応混合物に加え、２時間 攪拌し、その後、真空中で濃縮する。残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）中に 溶解し、同容量の飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。水層をジクロロメタンで洗浄し 、有機層を合わせて同容量の飽和ＮａＣｌで洗浄する。水層をジクロロメタンで 洗浄し、有機層を合わせてＭｇＳＯ₄上で乾燥し濃縮する。残留物は、シリカゲ ルカラムを用い、５０％酢酸エチル／ヘキサンから１００％酢酸エチルの勾配で 溶出し、クロマトグラフィーを行う。所望の生成物（０．１５ｇ、８０％）は、 １０％メタノール／９０％酢酸エチルで溶出する。 実施例３９ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（１−チミニル）アセチル］−Ｌ −セリン（ＯＢｎ）（３９） Ａ． Ｎ−Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（３９Ａ） ３−（Ｂｏｃ−アミノ）−１，２−プロパンジオール（２１ｇ、１１０ｍｍｏ ｌ）を水（２００ｍｌ）に溶解し、過ヨウ素酸カリウムと共に、室温、アルゴン 下で２時間、攪拌した。反応混合物をろ過し、塩化メチレン（１００ｍｌ）で洗 浄した。水層を塩化メチレン（３ｘ１５０ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を食塩 水（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥するまで蒸発させると、薄桃色の油脂が得られた 。この油脂は、シリカゲルを用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーによっ て、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／酢酸エチルを用いて精製した。 Ｂ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｌ−セリン（Ｏ−ベンジル） メチルエステル（３９Ｂ） 方法Ａ： Ｌ−セリン（ＯＢｎ）メチルエステル（１６．９３ｇ、８１ｍｍｏ ｌ）およびＮ−Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（３９Ａ）（１２．８ｇ、８１ ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）に溶解し、アルゴン大気下、室温で 攪拌した。無水酢酸（１ｍｌ）を加え、混合物をさらに１５分間攪拌した。ナト リウム・トリアセトキシボロヒドリド（１８．９９ｇ、９０ｍｍｏｌ）は、一ま とめで、室温で加えた。３時間アルゴン下で攪拌した後、反応物をＣＨ₂Ｃｌ₂（ １００ｍｌ）で希釈した。有機層は、最初に飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）ｐ Ｈ７で洗浄し、次いで、水（５０ｍｌ）、その後食塩水（５０ｍｌ）で洗浄した 。有機抽出物を乾燥するまで乾燥させ蒸発させた。残留物はフラッシュクロマト グラフィーで、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトンを用いて精製した。要求され る生成物を含むフラクションを集め、乾燥するまで蒸発させると、泡状の純粋生 成物（８．０ｇ、２８％）が得られた。 方法Ｂ： Ｌ−セリン（ＯＢｎ）メチルエステル（２．６ｇ、１２．４４ｍｍ ｏｌ）およびＮ−Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒド（３９Ａ）（２．０７ｇ、１ ３ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ₃ＯＨ（３５ｍｌ）中に溶解し、パール（ｐａｒｒ）瓶 内に置いた。この溶液に、無水ＮａＯＡｃ（１．７７ｇ、１３ｍｍｏｌ）および Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．６ｇ）をアルゴン大気下で加えた。反応混合物を３ｐｓ ｉの水素で２時間水素化した。触媒をろ過し、メタノール（２０ｍｌ）で洗浄し 、ろ液を集めて乾燥するまで蒸発させた。残留物は、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５０ｍｌ） および飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）で分配し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機 抽出物を水（１００ｍｌ）および食塩水で洗浄し、乾燥するまで乾燥させ蒸発さ せた。残留物は、フラッシュカラムクロマトグラフィーで、溶離剤としてＣＨ₂ ＣＬ₂／アセトンを用いて精製した。純粋なフラクションを集め、乾燥するまで 蒸発させると、泡状の生成物（３．９ｇ、８９％）が得られた。 Ｃ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセ チル］−Ｌ−セリン（ＯＢｎ）メチルエステル（３９Ｃ） 基質３９Ｂ（７．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびＮ−１−カルボキシメチルチミ ン（３、３．６８ｇ、２０ｍｍｏｌ）を乾燥ＤＭＦ／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１：１；２０ ０ｍｌ）に溶解し、アルゴン大気下、氷浴中で０°Ｃに冷却した。この***液に 、ＤｈｂｔＯＨ（３．６２ｇ、２０ｍｍｏｌ）、次いでＥＤＣ（４．２０ｇ、２ ２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物は、アルゴン下、室温で一晩攪拌し、乾燥す るまで蒸発させた。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）および水（１００ｍｌ） の混合物中に溶解し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で抽出した。有機抽出物は、５％ＮａＨＣＯ₃ （１００ｍｌ）、水（１００ｍｌ）および食塩水（１００ｍｌ）で洗浄した。Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残留物は 、シリカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーで、溶離剤としてＣＨ₂Ｃ ｌ₂／Ｍ ｅＯＨを用いて、精製した。純粋なフラクションを集め、蒸発させると、泡状の 生成物（９ｇ、８７％）が得られた。 Ｄ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセ チル］−Ｌ−セリン（ＯＢｎ）（３９） 基質３９Ｃ（０．５２ｇ、１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解し、氷浴 中で０°Ｃに冷却した。この***液を攪拌しながら、これに、ＮａＯＨ（１Ｎ、 ５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を全て一時に加えた。反応混合物は、０°Ｃで１時間攪拌 し、乾燥するまで蒸発させた。残留物を水（１０ｍｌ）に溶解し、固体クエン酸 で、ｐＨを３−４に調整した。水溶液をＥｔＯＡｃ（３ｘ３０ｍｌ）で抽出した 。有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥するまで乾燥し蒸発させると、泡が得られ た。残留物は、固体のＮａＯＨ上で乾燥させ、ＨＮＭＲでチェックした。収率４ ０％（０．２５ｇ）。 実施例４０ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロロ−１， １−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン［（α−メトキシ− α−トリフルオロメチル−α−フェニル）−Ｏ−アセテート）メチルエステル（ ４０） Ａ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｌ−セリン（ＯＨ）メチルエ ステル（４０ａ） 基質３９ｂ（０．７ｇ，２ｍｍｏｌ）をメタノール（２００ｍｌ）中に溶解し 、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．２ｇ）で処理した。反応混合物を１２時間５０ｐｓｉ の Ｈ₂で水素化した。触媒をろ過し、ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）で洗浄した。ろ液を集 め、乾燥するまで蒸発させた。残留物をシリカゲルのフラッシュカラムクロマト グラフィーで、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨを用いて精製した。純粋なフ ラクションを集めて、蒸発させると、泡状の０．９ｇ（９５％）の生成物が得ら れた。 Ｂ． Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロロ− １，１−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン（ＯＨ）メチル エステル（４０ｂ） 基質４０ａ（２．６２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をエーテル（３０ｍｌ）に溶解し、 ２Ｎ−ＮａＨＣＯ₃溶液（２０ｍｌ）と混合した。この溶液を攪拌し、これに１ ，１−ジメチル−２，２，２−トリクロロエチルクロロホルメート（２．３９ｇ 、１０ｍｍｏｌ）／エーテル（２０ｍｌ）を室温でゆっくり１５分間かけて加え た。ＴｅｃＢｏｃＣｌを加えた後、反応物を１２時間攪拌し、乾燥するまで濃縮 した。残留物を水（５０ｍｌ）に懸濁し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２ｘ７５ｍｌ）で抽出し た。有機抽出物を水（５０ｍｌ）および食塩水（５０ｍｌ）で洗浄した。ＣＨ₂ Ｃｌ₂層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残留物をシ リカゲルのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてＣＨ₂ Ｃｌ₂／アセトンを用いて精製した。純粋なフラクションを集めて蒸発させると 、３．９ｇ（８５％）の油脂状生成物が得られた。 Ｃ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロ ロ−１，１−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン［（α−メ トキシ−α−トリフルオロメチル−α−フェニル）−Ｏ−アセテート］メチルエ ステル（４０） 基質４０ｂ（０．３ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ）に 溶解し、アルゴン下で０°Ｃに冷却した。この***液を攪拌し、これに乾燥ピリ ジン（１ｍｌ）、次いでα−メトキシ−α−トリフルオロメチル−α−フェニル アセチルクロリド（０．１８ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加えた。酸クロリドを加え た後、反応物を１２時間攪拌した。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂（７５ｍｌ）で希釈 し、５％ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）、水（５０ｍｌ）および食塩水（５０ｍｌ ）で洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発 させた。残留物は、シリカゲルカラムに負荷し、ＣＨ₂Ｃｌ₂を用いて溶出した。 過剰のモーゼル酸（Ｍｏｓｅｒ’ｓ ａｃｉｄ）は、最初にＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出し た。次いでカラムをＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン（８：２）で溶出すると、生成物が得 られた。生成物は、キラル純度について¹⁹Ｆでチェックした。¹⁹Ｆは、２０°Ｃ では、アミド結合の回転異性体の二つのピークを示した。しかし、二つのピーク は、８０°Ｃでは単一のピークになった。ラセミ化がなくなることが分かった。 実施例４１ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロロ−１， １−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン［（α−メトキシ− α−トリフルオロメチル−α−フェニル）−Ｏ−アセテート］メチルエステル（ ４１） Ａ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｄ−セリン（Ｏ−ベンジル） メチルエステル（４１ａ） 表題化合物は、Ｌ−異性体３９ｂの製造について記載した実施例３９の方法Ｂ に従って、製造した。用いた反応物：Ｂｏｃ−アミノアセトアルデヒト（８．２ ７ｇ、５２ｍｍｏｌ）、Ｄ−セリン（ＯＢｎ）メチルエステル（１１．０ｇ、５ ２．６３ｍｍｏｌ）、ＮａＯＡｃ（７．０７ｇ、５２ｍｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ（２ ｇ）および乾燥ＭｅＯＨ（１００ｍｌ）。粗生成物は、フラッシュクロマトグラ フィーで、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／酢酸エチルを用いて、精製した。収率１２ ｇ（６６％）。 Ｂ． Ｎ−（２−Ｂｏｃ−アミノエチル）−Ｄ−セリンメチルエステル（４１ ｂ） 表題化合物は、製造例ＹのＬ−異性体４０ａの調製について記載した方法に従 って、製造した。用いた反応物は：基質４１ａ（０．７１ｇ，２ｍｍｏｌ）、Ｐ ｄ／Ｃ（１０％、０．２ｇ）および乾燥ＭｅＯＨ（２０ｍｌ）であった。粗生成 物は、フラッシュクロマトグラフィーで、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨを 用いて精製した。収率０．９ｇ（９５％）。 Ｃ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロ ロ−１，１−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン（ＯＨ）メ チルエステル（４１ｄ） 表題化合物は、Ｌ−異性体４０ｂについて記載した方法に従って、製造される 。用いた反応物は：基質４１ｂ（０．５ｇ、１．９１ｍｍｏｌ）、１，１−ジメ チル−２，２，２−トリクロロエチルクロロホルメート（０．７２ｇ、３ｍｍｏ ｌ）、１Ｎ−ＮａＨＣＯ₃（５ｍｌ、５ｍｍｏｌ）およびエーテル（１０ｍｌ） ：である。組成生物は、フラッシュクロマトグラフィーによって、溶離剤として ＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトンを用いて精製した。収率０．５ｇ（５６％） Ｄ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−（２，２，２−トリクロ ロ−１，１−ジメチル−１−エチルオキシカルボニル）−Ｌ−セリン［（α−メ トキシ−α−トリフルオロメチル−α−フェニル）−Ｏ−アセテート］メチルエ ステル（４１ｂ） 基質４１ｃ１５（０．３ｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（３０ｍｌ ）に溶解し、アルゴン下で０°Ｃに冷却した。この***液を攪拌し、これに乾燥 ピリジン（１ｍｌ）、次にα−メトキシ−α−トリフルオロメチル−α−フェニ ル酢酸クロリド（０．１８ｇ、０．７ｍｍｏｌ）を加えた。酸クロリドを加えた 後、１２時間攪拌しながら反応させた。反応混合物をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈し、５％ ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）、水（５０ｍｌ）および食塩水（５０ｍｌ）で洗浄 した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。 残留物は、ＣＨ₂Ｃｌ₂を用い、シリカゲルカラムに負荷した。過剰のモーゼル酸 は、最初にＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出した。次いで、カラムをＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトン（８ ：２）で溶出すると、生成物が得られた。生成物は、キラル純度について¹⁹Ｆに よってチェックした。¹⁹Ｆは、２０°Ｃでは、アミド結合の回転異性体により二 つのピークを示した。しかし、二つのピークは、８０°Ｃでは単一のピークにな った。ラセミ化が無くなったことが分かった。Ｌ−異性体（４０）およびＤ−異 性体（４１ｄ）を混合し、¹⁹Ｆ ＮＭＲでチェックした。混合物は、２０°Ｃで 三重線（ｐｐｍ）−７０．７７２、−７０．８５６および−７０．９４７）を示 したが、８０°Ｃでは、三重線は、二重線（ｐｐｍ、−７０．６７９および−７ ０．７５８）になった。このことは、２０°Ｃでは、ＤＬ混合物に加えて回転異 性体が存在することについて説明している。他方、８０°Ｃでは、ＤＬ異性体の みとして存在する。 Ｅ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセ チル］−Ｄ−セリン（ＯＢｎ）メチルエステル（４１ｅ） 表題化合物は、Ｌ−異性体３９ｃの製造について記載した方法に従って、製造 した。用いた反応物は：基質４１ａ（１０．３ｇ、２９．３ｍｍｏｌ）、チミン −１−イル酢酸（６．０７ｇ、３３ｍｍｏｌ）、ＤｈｂｔＯＨ（５．４ｇ、３３ ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（６．３ｇ、３３ｍｍｏｌ）、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１５０ｍｌ ）および乾燥ＤＭＦ（５０ｍｌ）：である。粗生成物は、フラッシュクロマトグ ラフィーによって、溶離剤としてＣＨ₂Ｃｌ₂／アセトンを用いて精製した。収率 １３．２ｇ（８７％）。 実施例４２ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］− Ｌ（またはＤ）−セリンメチルエステル（４２） 化合物３９（０．５ｇ）をエタノールに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（５０ｍｇ）を加え る。混合物をパール（Ｐａｒｒ）の水素化装置上で２４時間振とうする。反応混 合物をろ過し濃縮する。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製す ると、表題化合物が得られる。 実施例４３ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］− Ｌ（またはＤ）−セリンメチルエステル（４３） 実施例３７に記載の方法を用いて、化合物４２を表題化合物に転化した。 実施例４４ Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］− Ｌ−セリンメチルエステル（４４） 実施例３８に記載の方法を用いて、化合物４３を表題化合物に転化した。 実施例４５ Ｎ−メチルＰＮＡモノマー、一般的合成方法およびオリゴマー化 １． 方法Ａ Ａ． Ｎ−メチル−１−アミノ−２，３−プロパンジオール（４５Ａ） メチルアミン（１７２ｍｌの４０％溶液／水、２ｍｏｌ）を０°Ｃに冷却し、 次に、温度を１０°Ｃまたはそれより低く保つ速度で、２，３−エポキシ−１− プロパノール（２５ｇ、０．３４ｍｏｌ）を加えた。混合物は、０°Ｃで３時間 攪拌した。過剰のメチルアミンおよび水を真空蒸発させ、１０３−１１０°Ｃ、 ０．５ｍｍＨｇで蒸留することによって生成物を精製すると、２５．６ｇ（７６ ％）の表題化合物が得られた。 Ｂ． Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−１−アミノ−２，３−プロパンジオール（４ ５Ｂ） Ｎ−メチル−１−アミノ−２，３−プロパンジオール（２１ｇ、０．２ｍｏｌ ）／水（３４０ｍｌ）の溶液を０°Ｃに保ち、これにＢｏｃ無水物（５２．３ｇ ，０．２４ｍｏｌ）を加えた。混合物は、室温で平衡にした。ｐＨは、４Ｎ−Ｎ ａＯＨで１０．５に調整し維持した。ＮａＯＨ（２当量）を加え、反応混合物は 窒素大気下で一晩室温に保った。反応混合物を０°Ｃに冷却し、ｐＨを４Ｎ−Ｈ Ｃｌで２．５に調整する。酸性混合物を酢酸エチル（６ｘ１００ｍｌ）で抽出す る。酢酸エチル抽出物を集め、半飽和のＫＨＳＯ₄（３ｘ１５０ｍｌ）および飽 和食塩水（１ｘ１５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、乾燥するまで蒸 発させた。表題化合物を、油脂として単離した（０．５ｍｍＨｇでのｂｐ１１０ −１１２°Ｃ）。表題化合物の収率は３１．３ｇ（８１％）であった。 Ｃ． Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−２−アミノ−アセトアルデヒド（４５Ｃ） Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−１−アミノ−２，３−プロパンジオール（２０ｇ、 ０．０９７ｍｏｌ）／水（１００ｍｌ）の溶液に、ＫＩＯ₄（２４．６８ｇ、０ ．１０８ｍｏｌ）を加えた。反応混合物は、窒素大気下で２．５時間攪拌し、次 いでろ過した。ろ液をクロロホルム（５ｘ５０ｍｌ）で抽出した。得られたクロ ロ ホルム抽出物をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、ろ過し、乾燥するまで蒸発させた。表題 化合物１３．２６ｇが透明な油脂（０．５ｍｍＨｇでｂｐ７６−８０°Ｃ）とし て単離された。 Ｄ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］グリシンエチ ルエステル（４５Ｄ） グリシンエチルエステル塩酸塩（０．５８ｍｏｌ）を無水エタノール（１００ ｍｌ）に溶解し、０°Ｃで、無水エタノール（１３０ｍｌ）中に溶解したＮ−Ｂ ｏｃ−Ｎ−メチル−２−アミノ−アセトアルデヒド（１０ｇ、０．０５８ｍｏｌ ）およびＮａＯＡｃ（９．３２ｇ、０．１１４ｍｏｌ）の溶液に、滴下で加えた 。この溶液は、Ｐｄ／Ｃ（１．６５ｇ）および水素（１当量）を用いて、一晩水 素化した。反応混合物をろ過し、水（８０ｍｌ）を加えた。ｐＨを２Ｎ−ＮａＯ Ｈで８に調整し、ジクロロメタン（５ｘ６０ｍｌ）で抽出した。有機層をＭｇＳ Ｏ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。残留物をｋｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留 （１００°Ｃ、０．５ｍｍＨｇ）で精製すると、透明油脂状の１０．６ｇ（７４ ．３％）の表題化合物が得られた。 Ｅ． モノマー（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）の一般的合成法および脱保護法 アセチルリンカーを通して連結した４つの天然塩基を含むモノマーは、Ｎ−Ｂ ｏｃ−Ｎ−メチル−１−アミノエチルグリシンエチルエステル（Ｘ）を用いて合 成した。Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル−１−アミノエチルグリシンエチルエステル（ Ｘ）１．８２ｇ、７ｍｍｏｌ）／乾燥ＤＭＦ（３０ｍｌ）の溶液に、ＤＨＢＴ− ＯＨ（１．２６ｇ、７．７ｍｍｏｌ）および塩基のカルボキシメチル誘導体を加 えた。ジクロロメタン（３０ｍｌ）を加え、溶液を０°Ｃに冷却した。ＤＣＣ（ １．７３ｇ、０．８４ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、混合物を１時間攪拌した 。反応混合物を室温にまで暖め、３時間攪拌し、次いでろ過した。 保護されたＡモノマー、Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−［（９−アデニニル）アセチル］グリシンエチルエステルは、上記の 方法を用いて合成した。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン（３００ｍｌ） に再溶解し、半飽和の水性ＮａＨＳＯ₃（３ｘ１００ｍｌ）、半飽和の水性ＫＨ ＳＯ₄（２ｘ１００ｍｌ）および飽和食塩水（１ｘ１００ｍｌ）で洗浄した。有 機層 をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。無水エタノール（６０ｍ ｌ）および水（３０ｍｌ）を残留物に加え、混合物を一晩攪拌した。得られた沈 殿をろ過し、乾燥すると、保護されたＡモノマーが得られた。 保護されたＡモノマーをＴＨＦ中に溶解し、０°Ｃに冷却した、ＬｉＯＨ（２ ５ｍｌ）を加え、反応混合物を３０分間攪拌した。ｐＨをＨＣｌ（２Ｎ）で１に 調整した。得られた沈殿物をろ過し、乾燥させると、Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ− メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（９−アデニニル）アセチル］−グリシ ンが得られた。 保護されたＣモノマー、Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−［（１−シトシニル）アセチル］グリシンエチルエステルは、上記の 方法を用いて合成した。反応混合物は、乾燥するまで蒸発させた。エーテル（５ ０ｍｌ）を残留物に加え、混合物を２時間攪拌し、ろ過した。これを二回繰り返 し、次いで半飽和の水性ＮａＨＣＯ₃を加え、ろ過し、乾燥させた。得られた残 留物を沸騰ジオキサン（６０ｍｌ）中に溶解し、水（６０ｍｌ）で沈殿させ、ろ 過し、乾燥させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー、メタノール／ジクロ ロメタン（５／９５）を用いて、沈殿物を精製すると、保護されたＣモノマーが 得られた。 保護されたＣモノマーをＴＨＦ中に溶解し、０°Ｃに冷却した。ＬｉＯＨ（６ ０ｍｌ）を加え、反応混合物を３０分間攪拌した。ｐＨをＨＣｌ（２Ｎ）で２に 調整した。混合物をジクロロメタンで抽出し、有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ 、蒸発させると、０．７２ｇ（２７％）のＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）− ２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−シトシニル）アセチル］グリシン（ｍｐ１８ １一１８４°Ｃ）が得られた。 保護されたＧモノマー、Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−［（９−グアニニル）アセチル］グリシンエチルエステルは、上記の 方法を用いて合成した。反応混合物を蒸発させ、ジクロロメタン（８０ｍｌ）に 再溶解し、半飽和の水性ＫＨＳＯ₄（３ｘ４０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾 燥させ、乾燥するまで蒸発させた。沈殿を酢酸エチル中で再結晶化すると、保護 されたＧモノマーが得られた。 保護されたＧモノマーをメタノール（４０ｍｌ）中に溶解し、ＮａＯＨ（４０ ｍｌ、２Ｎ）を加えた。混合物を室温で１時間攪拌し、次いで０°Ｃに冷却した 。ＨＣｌ（２Ｎ）でｐＨを２に調整した。得られた沈殿をろ過し、乾燥させ、無 水エタノールから再結晶させると、１．２７ｇ（４３％）のＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ −Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（９−グアニニル）アセチル］グ リシン（ｍｐ１８９−１９２°Ｃ）が得られた。 保護されたＴモノマー、Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチ ル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンエチルエステルは、上記の方 法に従って、合成した。ジクロロメタン（６０ｍｌ）を反応混合物に加え、得ら れた混合物を、半飽和のＮａＨＣＯ₃（３ｘ３０ｍｌ）、半飽和の水性ＫＨＳＯ₄ （２ｘ３０ｍｌ）および飽和食塩水（１ｘ３０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＭｇ ＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させた。残留物をジクロロメタンに再溶解し、０°Ｃ に冷却し、激しく攪拌しながら石油エーテルをゆっくり加えることによって沈殿 させた。混合物をろ過すると、白色固体の保護されたＴモノマーが得られた。 保護されたＴモノマーをメタノール（４５ｍｌ）中に溶解し、０°Ｃに冷却し た。ＮａＯＨ（４５ｍｌ、２Ｎ）を加え、混合物を室温で２時間攪拌した。ＨＣ ｌ（２Ｎ）でｐＨを２に調整し、有機層を酢酸エチルで抽出した。有機層をＭｇ ＳＯ₄上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させると、１．４５ｇ（５２％）のＮ− ［（Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル） アセチル］−グリシン（ｍｐ１１４−１１８°Ｃ）が得られた。 Ｆ． オリゴマー化の一般的方法 製造したモノマーが、ＭＢＨＡ樹脂上での固層ペプチド合成法によって、オリ ゴマー化するために、用いられた。 上記の方法を用い、以下のオリゴマーを製造した。 式中、^*はモノマーの２−アミノエチル部分上にＮ−メチル基を持つ機能性モ ノマーを表す。 ２． 方法Ｂ Ａ． Ｎ−Ｂｏｃサルコシルグリシンメチルエステル Ｂｏｃ−サルコシン（９．０ｇ、０．０４８ｍｏｌ）／ＣＨ₂Ｃｌ₂（７０ｍｌ ）の懸濁液に、−２０°Ｃで、イソブチルクロロホルメート（７．１ｇ、０．０ ５２ｍｏｌ）およびＮ−メチルモルホリン（４．８ｇ、０．０４７ｍｏｌ）を加 えた。２分後、グリシンメチルエステル、塩酸（７．１９ｇ、０．０５７ｍｏｌ ）およびＮ−メチルモルホリン（５．７６ｇ、０．０５７ｍｏｌ）／ＣＨ₂Ｃｌ₂ （６０ｍｌ）を加えた。反応物は、−１０°Ｃで１時間攪拌し、室温に暖めた。 ４時間後、室温で、反応物をろ過し、飽和ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）、１Ｎ− ＮａＨＣＯ₃（１００ｍｌ）、１Ｎ−ＫＨＳＯ₄（２ｘ１００ｍｌ）、水（１００ ｍｌ）および食塩水（７０ｍｌ）で洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥させ蒸 発させた。Ｂｏｃ−サルコシル−グリシンメチルエステルの収率は、８９％であ った。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）（１−チオカルボニル）−２−ア ミノエチル］−グリシンメチルエステル Ｎ−Ｂｏｃ−サルコシルグリシンメチルエステル（１０．０ｇ、０．０４１ｍ ｏｌ）およびＬａｗｅｓｓｏｎｓ試薬（９．８７ｇ、０．０２４ｍｏｌ）／トル エン（９０ｍｌ）の懸濁液を、８０°Ｃに１時間加熱し、次いで、乾燥するまで 蒸発させた。生成物をシリカゲルのカラムクロマトグラフィー（ＣＨ₂Ｃｌ₂／Ｍ ｅＯＨ９５：５）で精製すると、６３％の表題化合物が得られた。 Ｃ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−グリシン メチルエステル Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）（１−チオカルボニル）−２−アミノエ チル］−グリシンメチルエステル（２．６７ｇ、０．００９７ｍｏｌ）およびＮ ｉＣｌ₂・６Ｈ２Ｏ（１８．３９ｇ、０．０７７ｍｏｌ）／ＴＨＦ：ＭｅＯＨ１ ： １の懸濁液に、−２０°Ｃで、ＮａＢＨ₄（８．７８ｇ、０．２３ｍｏｌ）をゆ っくりと、温度が０°Ｃを越えないように、加える。ＮａＢＨ₄を加えた後、反 応物を室温に戻す。反応混合物を数回セライトを通してろ過し、乾燥するまで蒸 発させる。生成物は、シリカゲルのカラムクロマトグラフィーで溶離剤としてＣ Ｈ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ９０：１０を用いて単離した。表題化合物の収率は６０％で あった。 Ｄ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ １−チミニル）アセチル］グリシンメチルエステル Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−グリシンメチル エステル（０．９ｇ、０．００３７ｍｏｌ）およびＤＨＢＴ−ＯＨ（０．６５ｇ 、０．００４ｍｏｌ）／ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）の懸濁液に、ＤＭＦ（６ｍｌ） に溶解したＮ−１−カルボキシメチル−チミン（０．７４ｇ、０．０４ｍｏｌ） を加えた。溶液を氷浴中で冷却し、ＤＣＣ（０．９０５ｇ、０．０４９ｍｏｌ） を加えた。反応混合物を１時間攪拌し、氷浴を取り除いた。反応混合物を室温に １６時間置いた。反応混合物をろ過し、１Ｎ−ＫＨＳＯ₄（１５ｍｌ）で２回、 ＮａＨＣＯ₃（１５ｍｌ）で３回、食塩水（１０ｍｌ）および水（１０ｍｌ）で 洗浄し、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥させた。生成物は、シリカゲルのカラムクロマトグラ フィー、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ９５：５で溶出して精製した。表題化合物の収率 は、５５％であった。 Ｅ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ １−チミニル）アセチル］グリシン Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ−）（Ｎ−メチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１− チミニル）アセチル］グリシンメチルエステルは、ＭｅＯＨ／Ｈ₂Ｏ１：１中の １Ｎ−ＮａＯＨに溶解して２時間置いた。２Ｎ−ＨＣｌでｐＨを２に調整し、酢 酸エチル（５０ｍｌ）で抽出した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥し、乾燥するまで 蒸発させた。表題化合物の収率は７７％であった。 Ｆ．Ｎ−メチルモノマーのオリゴマー化 ＭＢＨＡ樹脂は、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ１：１中のＮ−Ｂｏｃ Ｎ’−２−クロ ロ−Ｚ−リシンおよびＤＩＣに２４時間浸し、負荷を０．１ｍｍｏｌ／ｍｇに調 整した。Ｎ−メチル誘導体を含むモノマーのカップリングは、ＰＮＡモノマーの 固体支持体へのカップリングに関する一般的方法に従う（実施例２６参照のこと ）。Ｎ−メチル化モノマーに続くモノマーのカップリングは、この方法に従う： ３当量のモノマーおよび３当量のＰｙＢｏｒＰを、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＤＭＦ中に溶解 し、固体層に加えた。ジイソプロピルエチルアミン（９当量）を加えた。反応混 合物は２４時間置いた。反応混合物をＤＭＦで２回、数秒間、ＤＭＦで１回、２ 分間洗浄した。次いで、それをＣＨ₂Ｃｌ₂で４回洗浄した。これを４回繰り返し 、次いで、ＰＮＡオリゴマー化のための標準的方法を再び行った。 実施例４６ 機能化ＰＮＡモノマーの製造のためのその他の合成経路 Ａ． （Ｓ）−３−アミノ−２−オキセタノン ｐ−トルエンスルホネート（ ４６Ａ） Ｂｏｃセリンを、Ｐｈ₃Ｐ、ＤＥＡＥ、およびＴＦＡ次いでＴｓＯＨで処理す ると、表題化合物が得られた。 Ｂ． ［（２−Ｎ−トシル）−３−Ｎ−Ｂｏｃ］プロピオン酸（４６Ｂ） 化合物４６ＡをＢｏｃ₂ＮＨで処理すると、表題化合物が得られた。 Ｃ． エチル（２−Ｎ−フタロイル）−（３−Ｎ−Ｂｏｃ）−２，３−ジアミ ノ−プロピオネート（４６Ｃ） 化合物４Ｂをエトキシカルボニルフタルイミド次いでエタノール、ＤＣＣおよ びＨＯＢＴで処理すると、表題化合物が得られた。 Ｄ． エチル−（２−Ｎ−フタロイル）−２，３−ジアミノプロピオネート（ ４６Ｄ）、エチル−（３−Ｎ−Ｂｏｃ）−２，３−ジアミノプロピオネート（４ ６Ｅ） 化合物４６Ｃは、ＴＦＡ／ジクロロメタンで処理することによってＣ−３Ｂｏ ｃ基を脱保護してアミノ基にすると、化合物４６Ｄが得られ、また、ヒドラジン で処理することによってＣ−２アミノ基を脱保護すると、４６Ｅが得られる。 化合物、エチル−（２−Ｎ−フタロイル）−２，３−ジアミノプロピオネート およびエチル−（３−Ｎ−Ｂｏｃ）−２，３−ジアミノプロピオネートは、実施 例３０−３８に記載の方法に従って、機能化ＰＮＡ主鎖の合成に直接用いられる 。 実施例４７ アミノエチルグリシン−ＰＮＡオリゴマー内へのビオチンの取り込み：Ｈ−ＴＴ Ｃ（ビオチン）−ＴＴ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号：３９） 保護されたアミノエチルグリシン−ＰＮＡオリゴマーは、おおよそ０．１０ｍ ｍｏｌ／ｇ置換のＢｏｃ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）修飾ＭＢＨＡ樹脂上で組み立てられ る。合成は、前もってジクロロメタンで膨潤させた１００ｍｇ（乾燥重量）のｔ −Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（ＣｌＺ）−ＭＢＨＡ樹脂上で開始される。アミノエチルグリ シン−ＰＮＡ−オリゴマーは、実施例２６に記載の方法に従って、合成する。段 階（３）では、実施例１０から１７からのａｅｇ−シトシンモノマーを、Ｓｐｒ ｏａｔ Ｂ．Ｓ．らの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８９，１７，３３７３−３３８６）に従ってさらに修飾して、Ｎ−４（５− トリフルオロアセチルアミノペンチル）で保護した連結部を含むようにした。Ｓ ｐｒｏａｔの方法は、脱保護されたＮ−４環外アミノ基、保護されたアミノエチ ルグリシンのアミノ基およびカルボキシル基を持つ、アミノエチルグリシンシト シンモノマーを単純に用いることによって、ＰＮＡモノマーで用いられるように 修飾した。アミノエチルグリシン−ＰＮＡは、実施例２８記載の方法に従って、 樹脂から切断された。収率：５．８ｍｇ（純度９０％）、ＲＰ−ＨＰＬＣ（μＢ ｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８）によって精製した。ＭＳ（ＦＡＢ＋）ｍ／ｚ：（実測 値／計算値）２７０３／２７０１。 実施例４８ ＰＮＡのＮ末端へのビオチンの結合 Ｎ−末端をＢｏｃでブロックしたＰＮＡを含む樹脂は、典型的には０．１−１ ０ミリモルのＰＮＡを提供するように計り分ける。この重量の樹脂を、１：１（ ｖ：ｖ）のジクロロメタン：ジクロロホルムアミド溶液中に懸濁（５ｍｌ／樹脂 １００ｍｇ）し、所望の期間、膨潤させた。次いで、溶媒をろ過によって取り除 き、樹脂をトリフルオロ酢酸に再懸濁（３ｍｌ／樹脂１００ｍｇ）し、２分間振 とうする。トリフルオロ酢酸をろ過によって取り除き、これを一回繰り返す。 得られた樹脂は、ピリジンに再懸濁（１ｍｌ／樹脂１０μｍｏｌ）し、ピリジン を取り除くために真空ろ過する。これを繰り返す。この洗浄段階を二回繰り返す 。樹脂を１：１（ｖ：ｖ）のピリジン：ジメチルホルムアミド中に懸濁し、この 懸濁液にビオチン（２−１０モル当量）、ＴＢＴＵ（１．９−９．９モル当量） およびジ−イソプロピルエチルアミン（５−２０モル当量）を加え、その結果、 ＰＮＡモノマーの最終濃度は０．２Ｍになる。懸濁液を１５−６０分間振とうし 、用いたカップリング溶液をろ過により取り除く。次いで、樹脂を１：１（ｖ： ｖ）のジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液（５ｍｌ／樹脂１００ｍｇ） で三回洗浄すると、Ｎ−末端にビオチンを結合したＰＮＡが得られた。このＰＮ Ａは、実施例２８に記載した方法に従って、樹脂から切断することができる。Ｂ ｏｃＧｏｙ−ＧＣＡＴ−ＣＯ−メリフィールド樹脂から出発すると、ビオチン− Ｇｌｙ−ＧＣＡＴ−ＣＯＯＨが得られ、ＢｏｃＧｌｙ−ＧＣＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯ −メリフィールド樹脂から出発すると、ビオチン−Ｇｌｙ−ＧＣＡＴ−ＣＯＯＨ が得られる。 実施例４９ ＰＮＡのＮ末端へのプテロイン酸の結合 Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｂｌｕ−でブロックしたＰＮＡを含む樹脂は、典 型的には０．１−１．０ミリモルのＰＮＡを提供するように計り分けられる。こ の重量の樹脂を、１：１（ｖ：ｖ）のジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶 液（５ｍｌ／樹脂１００ｍｇ）中に懸濁し、所望の期間膨潤させる。次いで、溶 媒をろ過によって取り除き、樹脂をトリフルオロ酢酸に再懸濁（１ｍｌ／樹脂１ ００ｍｇ）し、２分間振とうする。トリフルオロ酢酸をろ過によって取り除き、 これを一回繰り返す。得られた樹脂は、ピリジン溶液に再懸濁（１ｍｌ／樹脂１ ｇ）し、ピリジンを取り除くために真空ろ過する。これを繰り返す。１：１（ｖ ：ｖ）のジクロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液（５ｍｌ／樹脂１ｇ）を用 いて再懸濁しろ過する（「洗浄」と言う）。この洗浄段階を二回繰り返す。樹脂 を１：１（Ｖ：Ｖ）のピリジン：ジメチルホルムアミドに懸濁し、この懸濁液に Ｎ−Ｂｏｃプテロイン酸（プテロイン酸、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．か ら製造、２−１０モル当量）、ＴＢＴＵ（１．９−９．９モル当量）およびジ− イソプロピルエチルアミン（５−２０モル等量）を加え、その結果、ＰＮＡモノ マーの最終濃度は０．２Ｍになる。懸濁液を１５−６０分間振とうし、用いたカ ップリング溶液をろ過により取り除く。次いで、樹脂を１：１（ｖ：ｖ）のジク ロロメタン：ジメチルホルムアミド溶液（５ｍｌ／樹脂１００ｍｇ）で三回洗浄 すると、Ｎ末端に葉酸を結合したＰＮＡが得られる。このＰＮＡは、実施例２８ に記載した方法に従って、樹脂から切断することができる。Ｎ−Ｂｏｘ−Ｏ−ベ ンジル−Ｇｌｕ−ＧＣＡＴ−ＣＯ−メリフィールド樹脂から出発するとＢｏｃ− 葉酸−ＧＣＡＴ−ＣＯＯＨが得られ、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｏ−ベンジル−Ｇｌｕ−ＧＣ ＡＴ−Ｌｙｓ−ＣＯ−メリフィールド樹脂から出発するとＮ−Ｂｏｃ−葉酸−Ｇ ＣＡＴ−ＣＯＯＨが得られる。 実施例５０ ＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体の遊離ＣＯＯＨへのカップリング ＣＨ₃ＣＯＮＨ−ＧＣＡＴ−ＣＯＯＨのような一つの遊離ＣＯＯＨを持つＰＮ ＡまたはＰＮＡ誘導体をテトラヒドロフラン：水中に溶解し、ＰＮＡ中０．１Ｍ の溶液を提供し、これに１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカル ボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］およびローダミン１２３水和物を加えると、ＥＤ ＣＩおよびローダミン共０．１−１．０Ｍの溶液が得られる。溶液を０．１−２ 時間攪拌し、次いで固体になるまで蒸発させ、実施例２９に記載の方法に従って 、分離用ＨＰＬＣによって精製する。 この方法によって、以下の化合物を製造することができる。 ローダミン＝Ｒｈｏｄ 実施例５１ ６−Ｓ−トリチルチオヘキシルブロミド（５１）、６−Ｓ−トリチルチオヘキサ ン酸（５１Ａ）、６−Ｓ−トリチルチオヘキシルアミン（５１Ｂ）、６−Ｓ−ト リチルチオヘキシルメルカプタン（５１Ｃ） トリフェニルメタンチオール（Ｆｌｕｋａ；６９ｇ、２５０ｍｍｏｌ）／９５ ％エタノール（ＥｔＯＨ）（５００ｍｌ）溶液に、７５ｍｌの水に溶解した１１ ｇの水酸化ナトリウム（２７５ｍｍｏｌ）を加えた。アルゴン大気下で約１５分 間攪拌した後、漏斗を用いて、１００ｍｌの９５％ＥｔＯＨに溶解した１，６− ジブロモヘキサン（９１．５ｇ、３７５ｍｍｏｌ、５８ｍｌ）を、激しく攪拌し ながら、１時間以上かけて滴加で加えた。約１５分間攪拌の後、茶白色固体が反 応混合物から分離する。さらに４時間攪拌の後、反応混合物をろ過した。ろ液を 高真空下で蒸発させ、油脂状残留物をろ過残留物と共に集め、５００ｍｌのＣＨ₂ Ｃｌ₂中に溶解し、再びろ過した。ろ過液は、水（２００ｍｌ）で一回、飽和Ｎ ａＣＬ溶液で一回洗浄した。ＣＨ₂Ｃｌ₂層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させた後、２０ ０ｍｌ容量に濃縮した。約２００ｍｌのヘキサンを加え、溶液を冷凍庫に置いた 。３つの固まりのクリーム状白色生成物を単離すると、８１ｇの６−Ｓ−トリチ ルチオヘキシルブロミド（５１）、ｍｐ９１−９２°Ｃが得られた。 生成物の部分は、それぞれ独立的に、シアン化ナトリウムで処理して次いで加 水分解すると、関連する酸、６−Ｓ−トリチルチオヘキサン酸（化合物５１Ａ） が得られ、アジ化リチウムと共にトリフェニルホスフィンによって還元すると、 関連するアミン、６−Ｓ−トリチルチオヘキシルアミン（５１Ｂ）が得られ、硫 化水素ナトリウムでは、関連するチオール、６−Ｓ−トリチルチオヘキシルメル カプタン（化合物５１Ｃ）が得られる。 実施例５２ Ｎ−［（Ｎ−ＢＯｃ）（１−（６−Ｓ−トリチルヘキシルオキシメチル））２− アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンエチルエステル（ ５２Ａ）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）（２−（６−Ｓ−トリチルヘキシルオキシ メチル））２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンエ チルエステル（５２Ｂ） 化合物３５または３６の遊離カルボキシル基は、標準的方法（例えば、Ｇｒｅ ｅｎｅおよびｗｕｔｓ、「有機合成での保護基」”Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒ ｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”、第二版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１を参照のこと）に従っ て、エチルエステルとして保護される。得られたエチルアミノエチルグリシネー トを、ＤＭＦおよび水素化ナトリウム存在下、Ｓ−トリチル−６−メルカプトヘ キシルブロミドでアルキル化すると、表題化合物が得られた。 実施例５３ Ｎ［（（Ｎ−Ｂｏｃ−）（１−｛（６−チオ）ヘキシルオキシメチル｝）２−ア ミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］ダリシンエチルエステル（化 合物５３Ａ）およびＮ−［（（Ｎ−Ｂｏｃ−）（２−｛（６−チオ）ヘキシルオ キシメチル｝）２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシ ンエチルエステル（化合物５３Ｂ） 化合物５２Ａまたは５２Ｂ（０．１９ｍｍｏｌ）を４ｍｌのクロロホルムに溶 解する。硝酸銀（８ｍＭ）／ＥｔＯＨ（１２ｍｌ）を加え、反応混合物を４５分 間攪拌する。ジチオスレイトール（０．３５Ｍ）／クロロホルム（３ｍｌ）を加 え、反応物を一晩攪拌する。白色沈殿をろ過除去し、溶媒を真空下で除去した。 残留物をジクロロメタンに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ₃および飽和ＮａＣｌで一度 抽出し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させる。溶媒を真空下で除去する。生成物をシリカ ゲルかラムまたはＨＰＬＣによって精製する。生成物は、¹Ｈ、¹³Ｃおよび¹³Ｃ −ＡＰＴ ＮＭＲおよびマススペクトルによって分析する。 実施例５４ プリンの２位および８位へのチオールリンカーの連結 ａ． ２−フルオロヒポキサンチンは、実施例１８に記載の方法に従って、エ チルブロモアセテートで処理すると、９−カルボキシメチル−２−フルオロヒポ キサンチンエチルエステルが得られ、さらに、実施例２０および２１記載の方法 に従って、Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステルと反 応させると、Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（２−フルオロヒ ポキサンチン−９−イル）−アセチル］グリシンが得られる。Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ −２−アミノエチル）−Ｎ−［（２−フルオロヒポキサンチン）アセチル］グリ シンは、Ｈａｒｒｉｓらの方法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１ １３，４３２８）に従って、６−Ｓ−トリチルチオヘキシルアミンと反応させる 。得られたプリンＣ−２チオールリンカー、ＰＮＡモノマーは、ＰＮＡオリゴマ ーに取り入れられる。 ｂ． ８−ブロモアデニンは、実施例１８記載の方法に従って、エチルブロモ アセテートで処理すると、９−カルボキシメチル−８−ブロモアデニンエチルエ ステルが得られる。９−カルボキシメチル−８−ブロモアデニンエチルエステル は、実施例１９記載の方法に従って処理し、Ｎ−６の環外アミノ基上にＣｂｚ保 護基を付ける。得られたＮ−６−Ｃｂｚ−９−カルボキシメチルアテニンエチル エステルは、さらに実施例２０および２１に記載の方法に従って、Ｎ−（Ｎ−Ｂ ｏｃ−２−アミノエチル）グリシンエチルエステルで処理すると、Ｎ−（Ｎ−Ｂ ｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（｛Ｎ−６−Ｃｂｚ−８−ブロモ｝−９−ア デニル）−アセチル］ダリシンエチルエステルが得られる。Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ− ２−アミノエチル）−Ｎ−［（｛Ｎ−６−Ｃｂｚ−８−ブロモ｝−９−アデニル ） アセチル］グリシンエチルエステルは、さらにＨａｒｒｉｓらの方法（Ｊ．Ａｍ ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９１，１１３，４３２８）に従って、６−Ｓ−トリ チルチオヘキシルアミンと反応させる。得られたプリンＣ−８チオールリンカー 、ＰＮＡモノマーは、ＰＮＡオリゴマーに取り入れられる。 実施例５５ プリンの６位へのアミノリンカーの連結 ａ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−｛［（Ｎ−２−トリフル オロアセチル）Ｎ−６−トリフルオロアセチルアミノヘキシルアミノ−９−グア ニニル］アセチル｝グリシン（５５Ａ） グアニンをピリジンに溶解し、無水トリフルオロ酢酸で処理する。結果として 生ずる２（トリフルオロアセトアミド）−６−Ｏ−ピリリル−グアニン中間体を さらにペンタフルオロフェノールと反応させると、６−ペンタフルオロフェニル オキシ−２−トリフルオロアセトアミドグアニンが得られる。同様の反応スキー ムが、以前に、Ｇａｏら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，５７，６９５４ によって２’−デオキシグアノシンに関して記載されている。 さらに、２−（保護）機能化、６−保護核塩基は、実施例１８記載の方法に従 って、２−ブロモエチルアセテートと反応させると、９位が保護されたアセチル テザーが得られる。化合物をＮ−６−トリフルオロアセチル−ヘキサン−１，６ −ジアミンで処理すると、結果として二官能結合基［ＮＨ（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯＣ Ｆ₃］でＯ−Ｃ₆Ｆ₅の置換が起こる。この一方を保護されたジアミンリンカーは 、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９０，３１， １５４３に記載されている。保護された連結基を連結させた後、結果として得ら れた化合物を実施例２２に記載の方法に従って処理すると、表題化合物が得られ る。さらに、保護された結合部を持つ最終化合物は、標準的方法を用いてオリゴ マーに取り入れられる。保護された結合部をさらなる官能基、例えば、フルオレ セインまたはビオチン、で脱保護し機能化する。 ｂ． Ｎ−（Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル）−Ｎ−［（Ｎ−６−トリフルオ ロアセチル−アミノヘキシルアミノ−９−アデニニル）アセチル］グリシン（５ ５Ｂ） ヒポキサンチン（６−ヒドロキシプリン）をピリジンに溶解し、ペンタフルオ ロフェノールで処理すると、６−ペンタフルオロフェニルオキシ−プリンが得ら れる。修飾された核塩基は、実施例１８に記載の方法に従って、２−ブロモエチ ルアセテートでさらに処理すると、９位が保護されたアセチルテザーが得られる 。化合物をＮ−６−トリフルオロアセチル−ヘキサン−１，６−ジアミンで処理 すると、結果として二官能結合基［ＮＨ（ＣＨ₂）₆ＮＨＣＯＣＦ₃］でＯ−Ｃ₆Ｆ₅ の置換が起こる。保護された連結基を連結させた後、得られた機能化アデニン 核塩基を実施例２２に記載の方法に従って処理すると、表題化合物が得られる。 さらに、保護された結合部を持つ最終化合物は、標準的方法を用いて、オリゴマ ーに取り入れられる。保護された連結基を脱保護し、さらに官能基、例えばフル オレセインまたはビオチン、で官能化する。 実施例５６ ジスルフィド架橋による、チオール含有ＰＮＡモノマーへのコレステロールのカ ップリング 化合物５３Ａまたは５３Ｂは、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン） ／塩化メチレンで一晩処理する。沈殿した５−ニトロピリジン−２−チオンをろ 過によって取り除き、ろ液を濃縮する。得られた生成物（それぞれ５６Ｃまたは ５６Ｄ）をチオコレステロール／ＣＨ₂Ｃｌ₂で処理し、一晩振とうすると、ジス ルフィド結合を通して連結したコレステロールを持つ化合物（それぞれ５６Ａま たは５６Ｂ）が得られる。得られた化合物は、さらにＰＮＡ合成に用いられる。 実施例５７ トリチル保護基を持つチオールリンカーのジスルフィド連結によって保護された チオールリンカーへの転化 化合物５６Ｃまたは５６Ｄを、プロピルメルカプタン／ＣＨ₂Ｃｌ₂で処理し、 一晩撹拌する。得られたジスルフィド化合物（それぞれ５７Ａおよび５７Ｂ）は 、ＣＨ₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₆−Ｓ−Ｓ−ＣＨ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₃結合を持ち、さらに修 飾 され、ＰＮＡオリゴマーに取り込まれる。結合する前に、ジチオスリトール（Ｄ ＴＴ）を加えることによって、遊離チオール基が遊離する。 実施例５８ 塩基不安定チオールリンカーへの転化 化合物５６Ｃまたは５６Ｄを、ＣＢｚＣＬ（カルボベンジルオキシクロリド） ／トリエチルアミンで処理する。得られた化合物５８Ａまたは５８Ｂは、保護さ れたチオール基を含み、ＰＮＡオリゴマーの合成に用いられる。遊離のチオール 基は、モノマーが、アンモニア次いでＤＴＴで処理することによってＰＮＡオリ ゴマーに取り込まれるために用いられる前または後に、モノマーから再生させる ことができる。 実施例５９ ＰＮＡ−Ｏ−ヘキシルチオールリンカーへのコンジュゲート反応 ＰＮＡ−Ｏ−チオールテザーの結合の可能性を例証するために、ＰＮＡ Ｈ₂ Ｎ−ＧＣＡ^*Ｔ−ＣＯＯＨ（配列番号：１１３）を、実施例２６記載の方法に従 って、合成する。星印（^*）は、実施例５８に記載の方法に従って合成した、オ リゴマー内のモノマーのＣ−１位の２−アミノエチル部に連結した、ジスルフィ ドで保護されたチオールヘキシルオキシメチルリンカーの取り込みを示す。ＰＮ Ａを、０．１Ｍ−ＡｇＮＯ₃／ＴＥＡＡバッファーで処理し、次いでＤＴＴ処理 すると、遊離のチオール基が生成する。次いで、チオールＰＮＡは、それぞれハ ロアセトアミドまたはマレイミド基および他方の末端に所望の機能性を持つ、４ 種類の化合物と反応させる。以下の化合物が用いられる：（１）リン脂質マレイ ミド、ＰＮＡに細胞を標識化するおよび取り引きする性質を提供することができ る：（２）５−ヨード−アセトアミド−Ｏ−フェナントロリン、核酸切断試薬で ある；この特殊な結合は、この試薬が第一銅イオンと複合する場合にＣ’−１位 でのマイナーグローブ攻撃（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ａｔｔａｃｋ）を通し て反応するので、切断剤を最適な位置に配置すると言うさらなる利点を提供する ； （３）ピレンマレイミド、インターカレーションによってＰＮＡ−ＰＮＡ、ＰＮ Ａ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重らせんを安定化することができる；およ び（４）フルオレセインマレイミド、ＰＮＡの取り込みをモニターすることので きる一般的診断用の道具として用いられる。結合は、リン酸バッファー（ｐＨ８ ．０）内で行われる。反応の完了は、Ｃ−１８カラムを用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度を 毎分１％直線的に上昇させる、ＨＰＬＣ分析によって、モニターする。コンジュ ゲートは、サイズ除外ＨＰＬＣおよび逆層ＨＰＬＣによって精製され、それらの （適用できる範囲の）ＵＶ−ＶＩＳスペクトルによって特徴付けられる。フルオ レセインマレイミド、ピリンマレイミドおよびリン脂質マレイミドは、Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）から購入する。Ｏ− フェナントロリン−５−ヨードアセトアミドは、Ｓｉｇｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ，１９９０，２９，９０９７に記載の方法に従って合成される。 実施例６０ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−Ｔ−（５−フタロイルペンチルオキシメチル）−２−ア ミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンエチルエステル（５ ７）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−（５−フタロイルペンチルオキシメチル ）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）アセチル］グリシンエチルエ ステル（５７Ａ） 化合物３５および３６を、それぞれエタノール／ＤＣＣで処理すると、エチル エステルが生成し、次いで５−ブロモペンチルフタルイミドで処理すると、表題 化合物が得られる。 実施例６１ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−（５−フタロイルペンチルオキシメチル）−２−ア ミノエチル］−Ｎ−［（９−アデニニル）−アセチル］グリシンエチルエステル （６１）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−（５−フタロイルペンチルオキシメ チル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（９−アデニニル）−アセチル］グリシン エチルエステル（６１Ａ） 化合物６１および６１Ａは、実施例１から６、３５および３６に記載の一般的 方法を用いて製造され、さらに実施例６０記載の方法に従って処理すると、エチ ルエステル中間体および表題化合物が得られる。 実施例６２ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−（５−アミノペンチルオキシメチル）−２−アミノ エチル］−Ｎ−［（９−アデニニル）−アセチル］グリシンエチルエステル（６ ２）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−（５−アミノペンチルオキシメチル）− ２−アミノエチル］−Ｎ−［（９−アデニニル）−アセチル］グリシンエチルエ ステル（６２Ａ） 化合物６１および６１Ａは、５００ｍｌフラスコ中で、２００ｍｌのメタノー ルに溶解する。反応混合物を攪拌しながら、ヒドラジンを加える。混合物を、油 浴中で６０−６５°Ｃに加熱し、１４時間還流させる。溶媒を真空蒸発させる。 残留物をジクロロメタン（２５０ｍｌ）中に溶解し、同容量のＮＨ₄ＯＨで２回 抽出する。有機層を蒸発させると、粗生成物が得られる。ＮＭＲを用いて、生成 物の純度をアッセイする。生成物は、さらに精製することなく次の反応に用いら れる。 実施例６３ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−（５−フタロイルペンチルオキシメチル）−２−ア ミノエチル］−Ｎ−［（１−チミニル）−アセチル]ダリシンメチルエステル（ ６３） 基質４２は、実施例６０に記載の方法に従って、表題化合物に転化される。 実施例６４ Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−（５−アミノペンチルオキシメチル）−２−アミノ エチル］−Ｎ−［（１−チミニル）−アセチル］グリシンメチルエステル（６４ ） 基質６３は、実施例６２に記載の方法に従って、表題化合物に転化される。 実施例６５ アミン含有官能基を持つＰＮＡオリゴマーの合成 アミノエチルグリシン主鎖を持つ以下のＰＮＡオリゴマーは、実施例２６に記 載の方法に従って、合成される：以下参照。 式中、^*、^**または^***は、ヒドロキシメチル基を持つ位置にペンチル−Ｎ−フタ ルイミド官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを示している。^* は、実施例６０および６１で合成したように、モノマーの２−アミノエチル部の Ｃ−１炭素で、ヒドロキシメチル基に連結したペンチル−Ｎ−フタルイミド官能 基を示している。^**は、実施例６０および６１で合成したように、モノマーの２ −アミノエチル部のＣ−２炭素で、ヒドロキシメチル基に連結したペンチル−Ｎ −フタルイミド官能基を示している。^***は、実施例６３で合成したように、モ ノマーのセリン部分のセリン−Ｏにおけるフェニル−Ｎ−フタルイミド官能基を 示す。ＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３および６４は、ウシ乳頭腫ウイルス− １（ＢＰＶ−１）のＥ２領域と相補的な化合物である。ＰＮＡオリゴマー、配列 番号：６５および６６は、ＨＩＶ−１のＴＡＲ領域と相補的な化合物である。 実施例６６ 水酸基を通してのＰＮＡオリゴマーのコンジュゲート Ａ． ビオチンでの機能化 １． 単一部位の修飾 約１０−Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３は 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を取り除く。得られ たオリゴマー（実施例６５を参照のこと）をミクロフュージチューブ（ｍｉｃｒ ｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）中で乾燥させる。ＰＮＡオリゴマーを、２００μｌの０ ． ２Ｍ−ＮａＨＣＯ₃バッファー中に溶解し、Ｄ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル（２．５ｍｇ、７．３μｍｏｌ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏ ｕｉｓ，ＭＯ）、次いで４０μｌのＤＭＦを加える。溶液は、一晩放置する。次 いで、溶液を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（０．７ｘ１５ｃｍ）に負荷し 、ＰＮＡオリゴマーフラクションを集める。分析用ＨＰＬＣを用いて、生成物へ の転化％を測定する。生成物は、ＨＰＬＣ［Ｗａｔｅｒｓ６００Ｅ（９９１検出 器装備）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＰＲＰ−１カラム ０．７ｘ１５ｃｍ；溶媒Ａ： ５０ｍＭ−ＴＥＡＡ，ｐＨ７．０；Ｂ：８０％アセトニトリルを含む４５ｍＭ− ＴＥＡＡ：流速１．５ｍｌ：勾配：５％のＢ（最初５分間）、その後、毎分１％ ずつＢを直線的に上昇させる］によって精製し、さらにＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ− ２５で脱塩すると、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡモノマーのＣ−１ヒドロキシメチル基に連結したペンチル アミノ結合基を通して連結したビオチン官能基を取り込むように機能化されたＰ ＮＡモノマーを示す：が得られる。 ２， 複数部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６４は 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例６５参照のこと）は、上記の実施例６１（Ａ）（１）を用 い、３００μｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣＯ₃バッファー／５０μｌのＤＭＦ中のＤ −ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（５ｍｇ）で処理する。分 析用ＨＰＬＣを用いて、反応の進行をモニターする。ＨＰＬＣおよびＳｅｐｈａ ｄｅｘＧ−２５で精製すると、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのセリン部分の水酸基に、ペンチルアミノ結合基を通して 結合したビオチン官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを示す： が得られる。 Ｂ． フルオレセインでの機能化 １． 単一部位の修飾 １Ｍ−Ｎａ₂ＣＯ₃／１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃バッファー（ｐＨ９．０）は、１Ｍ− ＮＡ₂ＣＯ₃に１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃を加えることによって調整される。このバッフ ァーの２００μｌ部を、ミクロフュージチューブ中の１０−Ｏ．Ｄ．ユニットの ＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３（最初に上記の方法に従って、フタロイル保 護基を除去するために処理しておく）（実施例６５を参照のこと）に加える。５ ００μｌのＤＭＦ中に１０ｍｇ部のフルオレセイン−イソチオシアネートを加え ると０．０５Ｍ溶液が得られる。１００μｌ部のフルオレセイン溶液を、ミクロ フュージチューブ中のＰＮＡオリゴマー溶液に加える。このチューブをアルミニ ウムホイルで覆い、一晩放置する。反応混合物を、２５％（ｖ／ｖ）のエチルア ルコール／水で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５（０．７ｘ２０ｃｍ）に負 荷する。カラムは、同じ溶媒で溶出する。生成物の移動は、過剰のフルオレセイ ン試薬の暗黄色の帯から良く分離した黄色の帯として見ることができる。２６０ ｎｍおよび４８５ｎｍに吸光を示すフラクションを集め、実施例６６（Ａ）（１ ）に記載の精製方法に従って、ＨＰＬＣによって精製する。生成物を凍結乾燥し 、Ｓｅｐｈａｄｅｘで脱塩すると、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのＣ−１位の２−アミノエチル部で、ヒドロキシメチル基 にペンチルアミノ連結基を通して連結したフルオレセイン官能基を取り込むよう に機能化されたＰＮＡモノマーを表す：が得られる。 ２． 複数部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６４を 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例６０を参照のこと）を、実施例６０（Ｂ）（１）の３００ μｌの１Ｍ−Ｎａ₂ＨＣＯ₃／１Ｍ−Ｎａ₂ＣＯ₂バッファーに溶解し、実施例６１ （Ｂ）（１）の２００μｌのフルオレセイン−イソチオシアネート保存溶液を加 える。得られた溶液は、実施例６１（Ｂ）（１）記載の方法に従って、処理する 。分析用ＨＰＬＣを用いて、二重に標識された生成物の％を示す。後処理により 、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのセリン部の水酸基に、ペンチルアミノ結合基を通して結 合したフルオレセイン官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを表 す：が得られる。 Ｃ． コール酸での機能化 １． コール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル［化合物６１（Ｃ） （ａ）（Ａ）］ 無水ＤＭＳ（１５０ｍｌ）をコール酸（４．０９ｇ、１５ｍｍｏｌ）およびＮ −ヒドロキシスクシンイミド（５．２５ｇ、４５ｍｍｏｌ）の混合物に加えた。 混合物を、窒素存在下で撹拌した。次いで、ＥＤＡＣ（４ｍｌ、２５ｍｍｏｌ） を加え、混合物を一晩攪拌した。次いで溶液がガム状になるまで蒸発させ、１： １の酢酸エチル：４％ＮａＨＣＯ³溶液（ｐＨ７．９）（それぞれ１００ｍｌ） で分配した。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ 、蒸発させると、薄黄色泡状の表題化合物（４．６ｇ、９１％）が得られた。 ２． 単一部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３を 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例６０を参照のこと）を、２００μｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣ Ｏ₃バッファー／４０μｌＤＭＦ中、コール酸−ＮＨＳエステル（出願番号第７ ８２，３７４号の化合物１、５ｍｇ、９．９μｍｏｌｅ）で処理する。反応混合 物を４５°Ｃに１６時間加熱する。分析用ＨＰＬＣを用いて、生成物の形成％を 測定する。後処理により、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのＣ−１位の２−アミノエチル部で、ヒドロキシメチル基 にペンチルアミノ結合基を通して連結したコール酸官能基を取り込むように機能 化されたＰＮＡモノマーを表す：が得られる。 ３． 複数部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６４を 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例６５を参照のこと）を、３００μｌの０．２Ｍ−ＮａＨＣ Ｏ₃バッファー／５０μｌ−ＤＭＦ中、コール酸−ＮＨＳエステル（出願番号７ ８２，３７４号の化合物１、１０ｍｇ、１９．８μｍｏｌ）で処理する。反応混 合物を４５°Ｃに１６時間加熱する。生成物は、実施例６６（Ａ）（１）記載の 方法に従って、単離される。分析用ＨＰＬＣを用いて、二重および一重に標識さ れた生成物の％を測定する。実施例６６（Ａ）（１）記載の方法に従って後処理 して、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのセリン部分の水酸基に、アミノ結合基を通して連結した コール酸官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを表す：が得られ る。 Ｄ． ジゴキシゲニンでの機能化 １． 単一部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３を 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例６５を参照のこと）を、２００μｌの０．１Ｍホウ酸ｐＨ ８．３バッファー／４０μｌＤＭＦ中、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボ ニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｅｈ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐ ｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理する。反応混合物を一晩放置する。生成物を、実施例６ ６（Ａ）（１）記載の方法に従って単離する。後処理により、ＰＮＡオリゴマー ： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのＣ−１位の２−アミノエチル部で、ヒドロキシメチル基 にペンチルアミノ結合基を通して連結したジゴキシゲニン官能基を取り込むよう に機能化されたＰＮＡモノマーを表す：が得られる。 ２． 複数部位の修飾 約１０ Ｏ．Ｄ．ユニット（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマー、配列番号：６４を 、実施例６２記載の方法に従って処理し、フタロイル保護基を除去する。得られ たオリゴマー（実施例３０を参照のこと）を、３００μｌの０．１Ｍホウ酸ｐＨ ８．３バッファー／５０μｌ−ＤＭＦ中、ジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカル ボニル−ε−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｅ ｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｉｎｄｉａｎａ ｐｏｌｉｓ，ＩＮ）で処理する。反応混合物を一晩放置する。生成物を、実施例 ６６（Ａ）（１）記載の方法に従って単離する。実施例６６（Ａ）（１）記載の 方法に従って後処理して、ＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、ＰＮＡのセリン部の水酸基に、ペンチルアミノ結合基を通して連 結したコール酸官能基を取り込むように機能化されたヌクレオチドを表す：が得 られる。 実施例６７ ピレンでのＰＮＡモノマーの機能化 Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−｛（５−｛４−（１−ピレニル）ブタノイルアミノ ｝ペント−１−イル）オキシメチル｝−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル −１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（６７）およびＮ−［（Ｎ−Ｂ ｏｃ）−２−｛（５−｛４−（１−ピレニル）ブタノイルアミノ｝ペント−１− イル）オキシメチル｝−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）ア セチル］グリシンエチルエステル（６７Ａ） Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−（５−アミノペンチルオキシメチル）−２ −アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエ ステル（６７ａ）およびＮ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−（５−アミノペンチルオキ シメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グ リシンエチルエステル（６７ｂ）の製造 表題化合物は、実施例１から１１、３５、３９、６０および６２記載の方法に 従って合成される。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−｛（５−｛４−（１−ピレニル）−ブタノ イルアミノ｝ペント−１−イル）オキシメチル｝−２−アミノエチル］−Ｎ−［ （ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（６７）の製造 化合物６７ａまたは６７ｂ（０．７８ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１５ｍｌ） に溶解する。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．１７ｍｍｏｌ）および１ −ピレン−酪酸ペンタフルオロフェニルエステル（１．１７ｍｍｏｌ）を、反応 混合物に加える。混合物を、アルゴン下、室温で２時間攪拌し、その後真空濃縮 する。残ったＤＭＦは、トルエンと共蒸発させる。残留物をジクロロメタン（５ ０ｍｌ）に溶解し、同容量の飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。水層をジクロロメタ ンで洗浄し、あわせた有機層を等容量の飽和ＮａＣｌで洗浄する。水層をジクロ ロメタンで洗浄し、あわせた有機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濃縮する。残留物 を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製すると、相当する生成物 が得られる。 実施例６８ Ａ． Ｎ−［［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［（５−（５−フルオレセイニルチオウ レイド）−ペント−１−イル）オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（６８）の製造 フルオレセインイソチオチアネート（異性体Ｉ、Ｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ ａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡより入手できる）を、Ｅｔ₃Ｎ／ＴＨＦ中の１２当量のピ バロイルクロリドで処理すると、ジ−Ｏ−ピバロイルフルオレセインイソチオシ アネートが得られる。この化合物は、シリカゲルカラムを用い、３：１のヘキサ ン：酢酸エチルで精製した。次に、化合物６７ａを、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ピリミジン中 のジピバロイルフルオレセインイソチオチアネートと縮合させる。保護基は、希 酸で処理することによって除去する。次いで、表題化合物は、シリカカラムから 、溶離剤として酢酸エチルヘキサンを用いて溶出することによって精製する。 Ｂ． Ｎ−［［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［（５−（５−フルオレセイニルチオウ レイド）−ペント−１−イル）オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（６８Ａ）の製造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記方法を行うと、表題化合物が得られる であろう。 実施例６９ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［１−（｛Ｎ−（コレステロール−Ｏ−カ ルボキシ）−５−アミノペンチル｝オキシメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ− ［（ウラシル−１−イル）アセチル］］グリシンエチルエステル（６９）の製造 化合物６７ａ（６．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン／ジクロロメタン５０／５０ （ｖ／ｖ）（２０ｍｌ）に溶解する。コレステリルクロロホルメート（Ｆｌｕｋ ａ、６．６８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（２０ｍｌ）に溶解し、反応混合 物を撹拌しながら、アルゴン下、シリンジでゆっくり加える。混合物を、アルゴ ン下、室温で２時間攪拌し、その後、真空濃縮する。残留ＤＭＦをトルエンと共 に、共蒸発させる。残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、同容量の飽 和ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。水層をジクロロメタンで洗浄し、集めた有機層を、 同容量の飽和ＮａＣｌで洗浄する。水層をジクロロメタンで洗浄し、あわせた有 機層をＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮する。残留物は、シリカゲルカラム、２５ ％酢酸エチル／ヘキサンから１００％酢酸エチルへの勾配で、クロマトグラフィ ーを行う。所望の生成物は、１００％酢酸エチルで溶出し、ＴＬＣによって純度 についてアッセイする。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［１−（｛Ｎ−（コレステロール−Ｏ−カ ルボキシ）−５−アミノペンチル｝オキシメチル）−２−アミノエチル］−Ｎ− ［（ウラシル−１−イル）アセチル］］グリシンエチルエステル（６９ａ）の製 造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、表題化合物が得られ るであろう。 実施例７０ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［｛Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）− ５−アミノペンチル｝オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル −１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（７０）の製造 化合物６７ａ（１．３７ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解する。２ ，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ、０．２５ｇ、１．３７ｍｍｏｌ） を加え、混合物を機械振とう機上で振とうさせる。反応は、ＴＬＣによってモニ ターする。９０分後、さらに０．２５ｇのＤＮＦＢを加え、反応混合物をさらに ３０分間振とうさせ、次いで、さらに０．２５ｇのＤＮＦＢを加える。２．５時 間振とうした後、混合物を真空濃縮し、シリカゲルカラム上、２５％酢酸エチル ／ヘキサンから１００％酢酸エチルの勾配で溶出して、クロマトグラフィーを行 う。所望の生成物は１００％酢酸エチルで溶出し、ＴＬＣでその純度についてア ッセイする。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［｛Ｎ−（２，４−ジニトロフェニル）− ５−アミノペンチル｝オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル −１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（７０Ａ）の製造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、表題化合物が得られ るであろう。 実施例７１ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［（Ｎ−（Ｎ_α−Ｎ_im−Ｄｉ−ＦＭＯＣ−_L −ヒスチジニル）−５−アミノペンチル）オキシメチル］−２−アミノエチル ］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（７１） の製造 化合物６７ａ（１．５１ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（２５ｍｌ）に溶解し 、氷浴中で０°Ｃに冷却する。反応混合物をアルゴン下で撹拌しながら、Ｎ_α， Ｎ_im−Ｄｉ−ＦＭＯＣ−_L−ヒスチジンペンタフルオロフェニルエステル（３． １ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａより購入）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ ０．２４ｍｍｏｌ、Ｆｌｕｋａより購入）を加える。１５分後、氷浴を除去し、 混合物を、アルゴン下、室温で７２時間攪拌する。混合物を真空濃縮し、シリカ ゲルカラム、５０％酢酸エチル／ヘキサンから７０％酢酸エチル／ヘキサンの勾 配で溶出して、クロマトグラフィーを行う。所望の生成物は、７０％酢酸エチル で溶 出する。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［（Ｎ−（Ｎ_α−Ｎ_im−Ｄｉ−ＦＭＯＣ−_L −ヒスチジニル）−５−アミノペンチル）オキシメチル］−２−アミノエチル ］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル（７１Ａ ）の製造 ７８ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、表題化合物が得られ るであろう。 実施例７２ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［（Ｎ−（Ω−メチル−ポリエチレングリ コール−プロピオノイル）−５−アミノペンチル）オキシメチル］］−２−アミ ノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステル （７２）の製造 化合物６７ａ（１．５５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１５ｍｌ）に溶解する。１ −ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．７５ｍｍｏｌ）およびポリエチレングリ コール−プロピオン酸−ＮＨＳ−エステル（１．７５ｍｍｏｌ）を反応混合物に 加える。混合物は、アルゴン下、室温で２時間攪拌し、その後、真空濃縮させる 。残留ＤＭＦをトルエンで共蒸発させる。残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ） に溶解し、次いで同容量の飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。水層をジクロロメタン で洗浄し、有機層をあわせて、同容量の飽和ＮａＣｌで洗浄する。水層をジクロ ロメタンで洗浄し、有機層を集めてＭｇＳＯ₄上で乾燥させ濃縮する。残留物を シリカゲルカラム上、５０％酢酸エチル／ヘキサンから１００％酢酸エチルの勾 配で溶出し、クロマトグラフィーを行う。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［（Ｎ−（Ω−メチル−ポリエチレングリ コール−プロピオノイル）−５−アミノペンチル）−オキシメチル］］−２−ア ミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシンエチルエステ ル（７２ａ）の製造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、表題化合物が得られ るであろう。 実施例７３ Ａ． 大環状誘導ＰＮＡモノマーの製造 化合物６７ａ（１．５５ｍｍｏｌ）は、実施例６７記載の方法に従って、大環 状の４−｛１，４，８，１１−テトラザ−［トリ−（トリフルオロアセチル）シ クロテトラデシ−１−イル］｝メチル安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（Ｓｉｍｏｎ Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ，１９９１，２，４１６に従って製造）で処理すると、生成物が得られる。 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、２置換化合物が得ら れるであろう。 実施例７４ 葉酸での機能化 Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［（５−（Ｎ−ホレート）−アミノペンチ ル）オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）−ア セチル］グリシンエチルエステル（７４ａ）の製造 化合物６７ａは、実施例６７記載の方法に従って、葉酸ペンタフルオロフェニ ルエステル（イソブチリル保護基で保護）で処理すると、生成物が得られる。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［（５−（Ｎ−ホレート）−アミノペンチ ル）オキシメチル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）−ア セチル］グリシンエチルエステル（７４ｂ）の製造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、２置換の化合物が得 られるであろう。 実施例７５ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−［（Ｎ−（２−メトキシ−６−クロロ−９ −（６−アミノヘキサノイル）アクリジン）−５−アミノペンチル）オキシメチ ル］−２−アミノ−エチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシ ンエチルエステル（７５） ６，９−ジクロロ−２−メトキシアクリジン（Ａｄｌｒｉｃｈ、３６ｍｍｏｌ ）およびフェノール（２．５ｇ）は、攪拌棒を備えた丸底フラスコに共に置き、 これに、６−アミノ−ヘキサン酸（９．３ｇ、７１ｍｍｏｌ）を加え、フラスコ を１００°Ｃ（油浴）に２時間加熱した。ＴＬＣ（１０％メタノール／塩化メチ レン）は、出発物質が完全に見られないことを示した。反応混合物を冷却し、２ ００ｍｌのメタノール中に注いだ。生成物は、黄色の固体（約１０ｇ）として単 離される。次いで、この化合物を、そのペンタフルオロフェノールエステルに転 化した。 化合物６７ａ（７８ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１５ｍｌ）中に溶解する。１− ヒドロキシベンソトリアゾール（１．１７ｍｍｏｌ）および２−メトキシ-６− クロロ−９−（６−アミノヘキサノイル）アクリジンペンタフルオロフェニルエ ステル（１．１７ｍｍｏｌ）をこの反応混合物に加える。混合物を、アルゴン下 、室温で２時間攪拌し、その後、真空濃縮する。残留ＤＭＦをトルエンで共蒸発 させる。残留物をジクロロメタン（５０ｍｌ）に溶解し、同容量の飽和ＮａＨＣ Ｏ₃で洗浄する。水槽をジクロロメタンで洗浄し、有機層を集めて、同容量の飽 和ＮａＣｌで洗浄する。次いで、水層をジクロロメタンで洗浄し、有機層を集め て、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮する。残留物をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィーで精製する。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−［（Ｎ−（２−メトキシ−６−クロロ−９ −（６−アミノヘキサノイル）アクリジン）−５−アミノペンチル）−オキシメ チル］−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル）アセチル］グリシ ンエチルエステル（７５ａ）の製造 ６２ａの代わりに６２ｂを用いて、上記の方法を行うと、２置換の化合物が得 られるであろう。 実施例７６ Ａ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−１−｛（−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノ） ペンチル）オキシメチル｝−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル ）アセチル］グリシンエチルエステル（７６）の製造 化合物６７ａ（０．２９ｍｍｏｌ）を４ｍｌのメタノールに溶解する。酢酸ナ トリウムｐＨ４．０（２ｍｌ）、ナトリウム・シアノボロヒドリド（０．３ｍｍ ｏｌ）および３７％ホルムアルデヒド／水（３００μｌ）を、反応混合物に加え 、２時間攪拌し、その後、真空濃縮する。残留物を、ジクロロメタン（５０ｍｌ ）に溶解し、同容量の飽和ＮａＨＣＯ₃で洗浄する。水層をジクロロメタンで洗 浄し、有機層を集めて同容量の飽和ＮａＣｌで洗浄する。水層をジクロロメタン で洗浄し、有機層を集めてＭｇＳＯ₄上で乾燥させ、濃縮させる。残留物は、シ リカゲルカラム、５０％酢酸エチル／ヘキサンから１００％酢酸エチルの勾配で 、クロマトグラフィーを行う。所望の生成物は、１０％メタノール−９０％酢酸 エチルで溶出する。 Ｂ． Ｎ−［（Ｎ−Ｂｏｃ）−２−｛（−５−（Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノ） ペンチル）オキシメチル｝−２−アミノエチル］−Ｎ−［（ウラシル−１−イル ）アセチル］グリシンエチルエステル（７６ａ）の製造 ６７ａの代わりに６７ｂを用いて、上記の方法を行うと、２置換の化合物が得 られるであろう。 実施例７７ レポーター酵素、ペプチドおよびタンパク質でのＰＮＡオリゴマーの機能化 Ａ． ヘテロ二官能リンカーの使用 １． ＰＮＡ−マレイミドコンジュゲートの合成 ＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３を実施例６２記載の方法に従って処理し、 フタロイル保護基を除去する。結果として得られたオリゴマーを５ｍｌの洋ナシ 型フラスコ内で凍結乾燥させる。Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ試薬、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃ ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１）（４６μｍｏｌ）をリン酸 バッファー(８００μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７．０)に溶解し、ＰＮＡオリゴマーを 含むフラスコに加える。さらに２００μｌのバッファーを用いて、試薬を洗浄し 、それをＰＮＡオリゴマーを含むフラスコに移す。フラスコの含有物を一晩攪拌 し、フラクションコレクターを備えたＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（１ｘ４ ０ｃｍ）に負荷する。フラクションに含まれるＰＮＡオリゴマー−マレイミドコ ンジ ュゲートを集め、その他のＮＨＳ型生成物からの分離について分析用ＨＰＬＣに よって試験する。 ２． ＰＮＡオリゴマー−ペプチドコンジュゲートの合成 実施例７７（Ａ）（１）のＰＮＡオリゴマー−マレイミドコンジュゲートのア リコート（３００ｎｍｏｌ）をミクロフュージチューブ内で凍結乾燥させる。Ｓ Ｖ４０ペプチド（ｐｒｏ−ａｓｐ−ｌｙｓ−ｌｙｓ−ａｒｇ−ｌｙｓ−ｃｙｓ） （約２．５μｍｏｌ）を、リン酸バッファー（８００μｌ、０．１Ｍ、ｐＨ７． ０）中に取り、チューブに含まれるＰＮＡオリゴマー−マレイミドコンジュゲー トに加える。チューブ含有物は、アルゴン大気下で一晩攪拌する。反応混合物は 、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムを通し、ＰＮＡ−ペプチドコンジュゲートフ ラクションをＨＰＬＣによって同定する。ＨＰＬＣによる生成物を含むフラクシ ョンからの生成物の単離およびＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５による脱塩により、以 下の配列のＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、指定されたＰＮＡモノマーのヒドロキシメチル基に、ペンチル− アミノ−スルホ−ＳＭＣＣ（スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミド− メチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）結合基を通して連結したＳＶ ４Ｏペプチド官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを表す：が得 られるであろう。 Ｂ． ホモ二官能リンカーの使用 １． ＰＮＡ−オリゴマー−ジスクシンイミジルスベレートコンジュゲート の合成 ＰＮＡオリゴマー、配列番号：６３は、実施例６２記載の方法に従って、処理 し、フタロイル保護基を除去する。得られたオリゴマーは、乾燥するまで蒸発さ せ、新たに調製した０．１Ｍ−ＮａＨＣＯ₃／５０ｍＭ−ＥＤＴＡ(１００μｌ、 ｐＨ８．２５)に溶解する。次いで、溶液は、ＤＳＳ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒ０Ｃｋｆｏｒｄ，Ｉ１）（７μｍｏｌ）／ＤＭＳＯ（２０ ０μｌ）の溶液で処理する。溶液を、１５分間室温で保存し、その後すぐに、あ らかじめパックし、４°Ｃの水で洗浄したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム （１ｘ４０ｃｍ）に負荷する。ＰＮＡオリゴマーフラクションは、すぐに２５ｍ ｌの洋ナシ型フラスコに集め、ドライアイス／イソプロピルアルコール中で急速 に凍結し、粉末になるまで凍結乾燥させる。 ２． ＰＮＡオリゴマー−タンパク質コンジュゲートの合成 ウシ腸アルカリホスファターゼ溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）（２．０６ｍｌ、１４７ｎｍｏｌ）は、４°Ｃ、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎの微量 濃縮機中、６０００ｒｐｍで、容量が５０μｌより少なくなるまで、回転させる 。次いで、溶液を１ｍｌの冷トリスバッファー（ｐＨ８．５、０．１Ｍ、０．１ Ｎ−ＮａＣｌおよび０．０５Ｍ−ＭｇＣｌ₂を含む）に再溶解し、さらに２回濃 縮する。最終的に、濃縮液を４００μｌの同バッファーに溶解する。この溶液を 、実施例７７（Ｂ）（１）からの活性化ＰＮＡオリゴマーに加え、溶液を１８時 間室温に保存する。生成物をおおよそ３０ｍｌに希釈し、４°Ｃに維持したＳｅ ｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム（１ｘ２０ｃｍ、クロリド型）に負荷する。カラ ムを５０ｎＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ８．５で、フラクションのＵＶ吸収が０の値に 近くなるまで溶出する。次いで、カラムを０．０５Ｍから０．７５Ｍ（それぞれ １５０ｍｌ）のＮａＣｌの塩勾配で溶出する。異なるピークは、ＰＮＡオリゴマ ーの存在およびアルカリホスファターゼ活性の両方についてアッセイし、生成物 を含むフラクションを集める。典型的には、第一のピークは過剰の酵素であり、 第二のピークはＰＮＡオリゴマー−タンパク質コンジュゲートであり、第三のピ ークは未反応のＰＮＡオリゴマーである。ＨＰＬＣによって生成物を含むフラク ションから生成物を単離し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５によって脱塩すると、 以下の配列のＰＮＡオリゴマー： 式中、Ａ^*は、指定されたＰＮＡモノマーのアミノペンチルオキシメチルに、Ｄ ＳＳ連結基を通して連結したアルカリホスファターゼ官能基を取り込むように機 能化されたＰＮＡモノマーを表す：が得られるであろう。 実施例７８ レチノイン酸コンジュゲート化ＰＮＡオリゴマー Ａ.レチノイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル 無水ＤＭＦ（１５０ｍｌ）をレチノイン酸（１５ミリモル、フルカ）およびＮ −ヒドロキシスクシンイミド（４５ミリモル）の混合物に加えた。混合物をアル ゴン下で撹拌した。ＥＤＡＣ［エチル−３−(３−ジメチルアミノ)プロピルカル ボジイミド］（４ｍｌ、２５ｎモル）を次に加えそしてこの混合物を次に一夜に わたり撹拌した。溶液を次に蒸発させて黄色のゴムとし、２００ｍｌの酢酸エチ ル中に溶解し、４％ＮａＨＣＯ₃溶液（２００ｍｌ）および飽和ＮａＣｌ溶液で 連続的に洗浄し、無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、蒸発させて所望する化合物を黄色 の固体状で約９０％収率で生成した。 Ｂ.レチノイン酸機能化ＰＮＡモノマー 化合物６７ａ、６７ｂ、６２、または６２Ａを２００μｌの０.２Ｍ ＮａＨＣ Ｏ₃緩衝液の中に溶解し、レチノイン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル （７.３μモル）を加え、次に４０μｌのＤＭＦを加える。溶液を一夜にわたり 放置する。次に溶液をセファデックスＧ−２５カラム（０.７×１５ｃｍ）に適 用しＰＮＡオリゴマー画分を集める。分析用ＨＰＬＣを使用して生成物への転化 率を測定する。生成物をＨＰＬＣ（９９１検知器、ハミルトンＰＲＰ−１カラム ０.７×１５ｃｍを有するウォーターズ６００Ｅ；溶媒Ａ：５０ｍＭ ＴＥＡＡ ｐＨ７.０；Ｂ：８０％アセトニトリルを有する４５ｍＭ ＴＥＡＡ：１.５ｍｌ 流速：勾配：最初の５分間は５％Ｂ、その後はＢを毎分１％の線状増加）により 精製し、さらにセファデックスＧ−２５上で脱塩してレチノイン酸−ＰＮＡモノ マーコンジュゲートを与える。 Ｃ.レチノイン酸機能化ＰＮＡオリゴマー ＰＮＡモノマーのカルボキシル基の保護基除去および生じたモノマーの実施例 ２６の合成工程への加入により、実施例７８Ｂのレチノイン酸−ＰＮＡモノマー コンジュゲートをＰＮＡオリゴマー中に取り込ませる。 実施例７９ 葉酸コンジュゲート化オリゴヌクレオチド 葉酸（３０ｍｇ、６８μモル）および１−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール（ ３０ｍｇ、２２２μモル）の混合物を９ｍｌの乾燥ＤＭＦ中に溶解する。この溶 液に、５０μＬのＥＤＡＣ（３１２μモル）を加える。生じた黄色の粘着性物質 を良く撹拌し、この溶液からの５００μＬを、予め実施例６２の工程に従い処理 してＮＰＨＴＨ基を遊離アミンに転化させたＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：６３を含有する０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃緩衝溶液の中に移す。溶液を良く撹拌し 、アルミニウム箔で覆いそして１６時間にわたり反応させる。混合物を次にセフ ァデックスＧ−２５カラム（１×４０ｃｍ）上に充填する。ＰＮＡオリゴマー画 分を集め、濃縮しそしてセファデックスＧ−２５カラム中にもう１回通す。生成 物を有する画分からの生成物のＨＰＬＣによる単離およびセファデックスＧ−２ ５カラム上での脱塩により配列： ［ここでＡ^*は指定されたＰＮＡモノマーのアミノペンチルオキシメチルに結合 された葉酸官能基を取り込むように機能化されたＰＮＡモノマーを表す］ のＰＮＡオリゴマーを生成する。 実施例８０ 葉酸メチルコンジュゲート化ＰＮＡオリゴマー 実施例７９と同様な方法で、葉酸５−メチルを保護基が除去されたＰＮＡオリ ゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４とコンジュゲート させることにより、ＰＮＡオリゴマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結 合された、そして複数のコンジュゲート用部位を有するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４ を使用する時にはセリンＯ部分と結合されたコンジュゲート化葉酸メチル基を与 える。 実施例８１ ピリドキサルコンジュゲート化ＰＮＡオリゴマー ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３またはＰＮＡオリゴマーＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：６４を実施例６２の工程に従い処理してＮ−ＰＨＴＨ基を遊離アミン に転化させる。生じたＰＮＡオリゴマーを１００マイクロリットルの水中に溶解 し、 そして１００ｍｌの１Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５.０）を加え、次に５ｍｇの ピリドキサル塩酸塩（２４μモル）および５０μｌの６０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ₃溶 液を加える。溶液を撹拌し、一晩放置し、次にセファデックスＧ−２５カラム中 に通し、分析用ＨＰＬＣカラムの中でさらに精製する。 実施例８２ トコフェロールコンジュゲート化ＰＮＡオリゴマー Ａ.ビタミンＥ（トコフェロール）−ヘミスクシネート−ＮＨＳエステル α−トコフェロール−ヘミスクシネート（シグマ、５ｇ、９.４ミリモル）を ３当量のＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび２当量のＥＤＡＣで上記の実施例 ７８Ａに記載されているように処理した。処理は実施例５１と同じであり、標記 化合物を淡褐色のワックス状固体として生成する。 Ｂ.トコフェロールコンジュゲート化ＰＮＡオリゴマー α−トコフェロール−ヘミスクシネート−ＮＨＳエステルを上記の実施例７８ Ｂおよび７８Ｃの工程に従い処理して、所望するＰＮＡオリゴマーと結合基で結 合されたトコフェロールを得る。 実施例８３ アルキルアミノリンカーを有するＰＮＡオリゴマーからチオリンカーを有するＰ ＮＡオリゴマーへの転化 Ａ.ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８ ＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^* ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで*はオリゴマー中の指定されたモ ノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置で結合されたペンチルＮ−フタロイ ルオキシメチル基を表す］をヒドラジン／エタノールで処理し、次に０.２Ｍ Ｎ ａＨＣＯ₃緩衝液中の５ｍｇのＳＡＴＡ（Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−スクシンイ ミジル）で処理する。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム中に通し、Ｐ ＮＡオリゴマー画分を濃縮し、２００ｍＭヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液（１ ｍｌ）で処理する。生じたＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）Ｈ₂Ｎ −ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨはオリゴマー中 の指定された（^*）モノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結合したＣ Ｈ₂− Ｏ−(ＣＨ₂)₅−Ｎ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₂−ＳＨ基を有する。 Ｂ.ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９ ＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^{* **} ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***はオリゴマー中の指定さ れたモノマーのセリンＯ−部分で結合されたペンチルＮ−フタロイルオキシメチ ル基を表す］をヒドラジン／エタノールで処理し、次に０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃緩 衝液中の５ｍｇのＳＡＴＡ（Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−スクシンイミジル）で処 理する。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム中に通し、ＰＮＡオリゴマ ー画分を濃縮し、２００ｍＭ ヒドロキシルアミン塩酸塩水溶液（１ｍｌ）で処 理して、オリゴマー中の指定された（^***）モノマーのセリンＯ−部分と結合し たＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−Ｎ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₂−ＳＨ基を有するＰＮＡオリゴマー （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***ＴＣＣ ＴＣＴ Ｔ ＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨを与える。 実施例８４ ＰＮＡオリゴマーに対するｏ−フェナントロリンのコンジュゲート Ａ.ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０ 実施例８３（Ａ）からのＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８）Ｈ₂Ｎ −ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨを２ｍｇの５− (ヨードアセトアミド)−ｏ−フェナントロリン試薬で処理し、次に一晩中振る。 オリゴマーをサイズ排除カラムおよび逆相ＨＰＬＣにより精製して、 ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ ＰＮＡオリゴマ ーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２ −アミノエチル部分のＣ−１位置で構造−ＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨ−Ｃ(＝Ｏ )−ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−Ｃ(＝Ｏ)−ＮＨ−のチオールリンカーを介してフェナン トロリンで機能化されたＰＮＡモノマーを表す］を生成する。 Ｂ.ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１ オリゴマー中の指定された（^***）モノマーのセリンＯ−部分と結合されたＣ Ｈ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−Ｎ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ₂−ＳＨ基を有する実施例８３ＢからのＰ ＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***Ｔ Ｃ Ｃ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨを２ｍｇの５−(ヨードアセトアミド)−ｏ −フェナントロリン試薬で処理し、次に一晩中振る。オリゴマーをサイズ排除カ ラムおよび逆相ＨＰＬＣにより精製して、Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***ＴＣ Ｃ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１ ［ここで***はセリンＯ−位置で構造−ＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨ−Ｃ(＝Ｏ)− ＣＨ₂−Ｓ−ＣＨ₂−Ｃ(＝Ｏ)−ＮＨ−のチオールリンカーを介してフェナントロ リンで機能化されたＰＮＡモノマーを表す］を生成する。 実施例８５ ＰＮＡオリゴマーに対するピレンのコンジュゲート Ａ.単独部位修飾 ＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^* ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*は指定されたモノマーの２−ア ミノエチル部分のＣ−１位置におけるペンチルＮ−フタロイルオキシメチル基を 示す］（約６０ｎモル）をヒドラジン／エタノールで処理して遊離アミンを与え る。遊離アミンをマイクロフュージ管の中で乾燥し２００μｌの０.２Ｍ ＮａＨ ＣＯ₃緩衝液の中に溶解する。ピレン−１−酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド エステル（すなわち、スクシンイミジル−１−ピレンブチレート、３ｍｇ、７. ７９μモル、オレゴン州ユージのモレキュラー・プローブス）を加え、次に４０ ０μｌのＤＭＦを加える。混合物を３７℃において一晩インキュベートし、溶液 をセファデックスＧ−２５カラム（１×４０ｃｍ）に適用する。ＰＮＡオリゴマ ー画分を一緒にし、そして生成物をＨＰＬＣにより精製してＰＮＡオリゴマー（ ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*は指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ− １位置でＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨＣ(＝Ｏ)−(ＣＨ₂)₃−結合基により結合さ れたピレンを示す］を与える。 Ｂ.複数部位修飾 ＰＮＡオリゴマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４）Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^{* **} ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***は指定されたモノマーの セリン−Ｏ位置におけるペンチルＮ−フタロイルオキシメチル基を示す］をヒ ドラジン／エタノールで処理して遊離アミンを与える。遊離アミンを２当量のピ レン−１−酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（６ｍｇ、４００μｌのＤＭＦ中 ）でさらに処理し、実施例８５（Ａ）と同じ方式で処理する。セファデックスＧ −２５精製およびその後のＨＰＬＣ精製で二重ピレンコンジュゲート化ＰＮＡオ リゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***ＴＣＣ ＴＣ Ｔ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***はオリゴマー中の指定されたモノマー のセリン−Ｏ部分でＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨＣ(＝Ｏ)−(ＣＨ₂)₃−結合基に より結合されたピレンを示す］を与える。このオリゴマーを８５（Ａ）の工程に よりさらに精製する。 実施例８６ ＰＮＡオリゴマーに対するアクリジンのコンジュゲート Ａ.単独部位修飾 ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３（２μモル）をヒドラジン／エタノ ールで処理して遊離アミンを与える。遊離アミンを乾燥しそして２００μｌの１ Ｍ ＮａＨＣＯ₃／Ｎａ₂ＣＯ₃緩衝液、ｐＨ９.０の中に溶解する。９−アクリジ ニルイソチオシアネート（５ｍｇ、２.１μモル、オレゴン州ユージのモレキュ ラー・プローブス）を２００μｌのＤＭＦ中に溶解する。この溶液をＰＮＡオリ ゴマーに加え、そして混合物を撹拌し、アルミニウム箔で覆いそして３７℃にお いて一晩放置する。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム（１×４０ｃｍ ）中に通すことにより精製し、濃縮しさらにＨＰＬＣにより精製してＰＮＡオリ ゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*は指定された(^*)モノマーの２−アミノエチル 部分のＣ−１位置でＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨＳＣＮ−結合部分により結合さ れた９−アクリジニル基を示す］を与える。 Ｂ.複数部位修飾 ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*** ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨをヒドラジン／エタノールで処理して 遊離アミンを与える。遊離アミンを４００μｌの１Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃／ＮａＨＣＯ₃ 緩衝液（ｐＨ９.０）で処理しさらに４００μｌのＤＭＦ中の１０ｍｇの９−ア ク リジニルイソチオシアネートで処理する。反応混合物を撹拌し、アルミニウム箔 で覆いそして３７℃において一晩放置する。反応混合物を実施例８５（Ａ）の単 独部位反応のようにして精製する。二重コンジュゲート化アクリジン−オリゴヌ クレオチドが単独修飾生成物後にＨＰＬＣ中の最後のピークとして溶離してＰＮ ＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ***ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***はオリゴマー中の指定されたモノ マー上のセリン−Ｏ位置に対してＣＨ₂−Ｏ−(ＣＨ₂)₅−ＮＨＳＣＮ−結合部分 により結合された９−アクリジニル基を示す］を与える。 実施例８７ ＰＮＡオリゴマーに対するポルフィリンのコンジュゲート メチルピロポルフィリンXXIエチルエステル（アルドリッヒ）をＮ−ヒドロキ シスクシンイミドおよびＥＤＡＣを用いてアミノカプロン酸と縮合させる。生じ たカルボン酸を次に再びＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＥＤＡＣを用いて 活性化しそして実施例８５（Ａ）の工程に従いＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：６３で処理してＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*は指定されたＰ ＮＡオリゴマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結合された２−ポルフィ リン基を示す］を与える。 実施例８８ ＰＮＡオリゴマーに対するハイブリッドインターカレーター−リガンドのコンジ ュゲート Ａ.ホトヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド ホトヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド６−[[[９−[[６−(４−ニト ロベンズアミド)ヘキシル]アミノ]アクリジン−４−イル]カルボニル]アミノ]ヘ キサノイル−ペンタフルオロフェニルエステルを Egholm et al，J．Am．Chem． Soc．1992，114，1895 の工程に従い合成する。 Ｂ.単独部位修飾 １０ Ｏ.Ｄ.単位のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３をヒドラジン／ エタノールで処理してアミノ基を保護基除去する。生じた物質を１００μｌの０ .１ Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８.４）の中に溶解しそして３３０μｌの６−[[[９−[[ ６−(４−ニトロベンズアミド)ヘキシル]アミノ]アクリジン−４−イル]カルボ ニル]アミノ]ヘキサノイルペンタフルオロフェニルエステルのＤＭＦ溶液（１０ ｍｇ、１ｍｌのＤＭＦ中）で処理する。溶液をアルミニウム箔で覆い一晩反応さ せる。反応混合物をセファデックスＧ−２５およびＨＰＬＣ精製により精製して ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣ Ｃ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマ ーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結合基で結合されたホトヌクレアーゼ ／インターカレーターリガンドを示す］を与える。 Ｃ.複数部位修飾 １０ Ｏ.Ｄ.Ａ₂₆₀単位のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４をヒドラジ ン／エタノールで処理して保護されたアミノ位置を保護基除去する。生じた物質 を２００μｌの０.１Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８.４）の中に溶解し、６６０μｌ の６−[[[９−[[６−(４−ニトロベンズアミド)ヘキシル]アミノ]アクリジン− ４−イル]カルボニル]アミノ]ヘキサノイルペンタフルオロフェニルエステルの ＤＭＦ溶液（１０ｍｇ、１ｍｌの溶液中）で処理し、溶液をアルミニウム箔で覆 いそして一晩放置する。溶液をセファデックスＧ−２５および逆相ＨＰＬＣによ り精製してＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ Ｃ ＣＡ^***ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***はオリゴマー中の 指定されたモノマーのセリンＯ−位置と結合基で結合されたホトヌクレアーゼ／ インターカレーターリガンドを示す］を与える。 実施例８９ ＰＮＡオリゴマーに対するビピリジン複合体のコンジュゲート Ａ.ビピリジン複合体 スクシンイミジル−４−カルボキシ−４’−メチル−２,２’−ビピリジンをT elser，et al.，J．Am．Chem．Soc．1989，111，7221 の工程に従い合成する。 Ｂ.単独部位修飾 １０ Ｏ.Ｄ．Ａ₂₆₀単位のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３をヒドラ ジン／エタノールで処理して保護されたアミノ基を保護基除去する。生じた物質 を ０.１Ｍホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８.５／ＤＭＦ中の２００倍モル過剰のスクシンイ ミジル−４−カルボキシ−４’−メチル−２,２’−ビピリジンと反応させる。 溶液をセファデックスＧ−２５および逆相ＨＰＬＣにより精製してＰＮＡオリゴ マーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ Ｔ ＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨＨ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ［ここで^*はオリゴマー中の指定され たモノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置とリンカーを介して結合された ビピリジニル複合体を示す］を生成する。 実施例９０ ＰＮＡオリゴマーに対するアリールアジド光架橋剤のコンジュゲート Ａ.Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジド−ベンゾエート（ＨＳＡＢ ）のコンジュゲート ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３をヒドラジン／エタノールで処理し て遊離アミン−含有ＰＮＡオリゴマー： ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ ＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：９０［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部 分のＣ−１位置で結合されたペンチルアミノオキシメチル基を示す］を与える。 ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０（約５０ｎモル）を乾燥し、５００ ｍｌの０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃緩衝液、ｐＨ８.１の中に溶解しそして５００μｌの ＤＭＦ中に溶解した２５ｍｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドベ ンゾエート（ＨＳＡＢ、９６μモル、両社ともピアース・アンド・シグマから市 販されている）で処理する。混合物を３７℃において一晩撹拌しそしてセファデ ックスＧ−２５カラム（１×４０ｃｍ）上に２回通す。ＰＮＡオリゴマー画分を 逆相ＨＰＬＣ（５％→４０％ＣＨ₃ＣＮ、６０分間）により逆相カラム上で精製 してＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマー の２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結合基を介して結合されたＨＳＡＢ基を 示す］を与える。 Ｂ.Ｎ−スクシンイミジル−６−(４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミ ノ)ヘキサノエートのコンジュゲート ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０を５００ｍｌのＮａＨＣＯ₃緩衝液 （０.２Ｍ、ｐＨ８.１）の中に溶解し、５００ｍｇのＮ−スクシンイミジル−６ −(４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミノ)ヘキサノエート（ＳＡＮＰＡ Ｈ、１２８μモル、両者ともピアース・アンド・シグマから市販されている）を 含有する５００μＬのＤＭＦで処理する。反応瓶をアルミニウム箔で覆い３７℃ に一晩加熱する。反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム（１×４０ｃｍ） 上に２回通す。ＰＮＡオリゴマー画分を逆相ＨＰＬＣ（５％→４０％ＣＨ₃ＣＮ 、６０分間）により逆相カラム上で精製してＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ：９２ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^* はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位置と結 合基を介して結合された６(４’−アジド−２’−ニトロフェニル−アミノ)ヘキ サノエート基を示す］を与える。 実施例９１ ＰＮＡオリゴマーに対するイミダゾール−４−酢酸のコンジュゲート Ａ.活性化されたイミダゾール−４−酢酸 イミダゾール−４−酢酸を２,４−ジニトロフルオロベンゼンと反応させた。 生じたイミダゾール−Ｎ−(ＤＮＰ)−４−酢酸を実施例７８の工程に従いＮＨＳ ／ＥＤＡＣで処理することによりそのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに 転化させた。 Ｂ.ＰＮＡコンジュゲート １０ Ｏ.Ｄ.Ａ₂₆₀単位のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０を０.１Ｍ ホウ酸塩緩衝液、ｐＨ８.５／ＤＭＦ（各々２００μＬ）の中で１００倍モル過 剰のイミダゾール−Ｎ−(ＤＮＰ)−４−酢酸ＮＨＳエステルと反応させる。混合 物を一晩撹拌しそして２００μＬのメルカプトエタノールでさらに処理してＤＮ Ｐ保護基を分解する。生じた反応混合物をセファデックスＧ−２５カラム中に通 すことによりそしてその後の逆相ＨＰＬＣにより精製してＰＮＡオリゴマーＳＥ Ｑ １Ｄ ＮＯ９３ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯ Ｈ［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ −１位置と結合基を介して結合されたイミダゾリル基を示す］を与える。 実施例９２ ＰＮＡオリゴマーに対する金属キレート剤のコンジュゲート Ａ.ＥＤＴＡ複合体 核酸開裂剤としてＰＮＡオリゴマーとカップリングさせるためのＥＤＴＡＦｅ （II）複合体を製造するために、ＥＤＴＡのトリシクロヘキシルエステルを Slu ka，et al.，J．Am．Chem．Soc．1990，112，6369 の工程に従い合成する。 Ｂ.ＰＮＡオリゴマー修飾 ＥＤＴＡのトリシクロヘキシルエステル（１.２５ｍｇ、１.９４ミリモル）お よびヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ、１ｍｇ、６.６ミリモル）をＤ ＭＦ（５０μＬ）の中に溶解しそして１０μＬのＥＤＡＣを加える。この溶液に １００μＬの０.１Ｍホウ酸塩緩衝液中のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９０（１０ ＯＤ単位）を加えそして一晩放置する。溶液をセファデックスＧ− ２５カラム中に通しそしてＰＮＡオリゴマー画分を濃ＮＨ₃（１００μＬ）で１ 時間にわたり処理して酸保護基を分解する。最後にサイズ排除クロマトグラフィ ーおよびＨＰＬＣにより精製を行う。 Ｃ.ＤＴＰＡ部位修飾 ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０を０.１Ｍ ＮａＨＣＯ₃／ＤＭＦ中 のジエチレントリアミン五酢酸無水物で処理して単独部位修飾を与える。コンジ ュゲートをガドリニウムイオン（Ｇｄ III）と複合させて特に取り込み測定剤と して有用なコントラスト剤を生成する。生じたＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ Ｎ Ｏ：９４ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［こ こで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位 置と結合基を介して結合された複合体ガドリニウムイオンを示す］。 実施例９３ ＰＮＡオリゴマーに対するコレステロールのコンジュゲート Ａ.方法１−アミノリンカーを介する コレステロール−ヘミスクシネートを最初にそのＮ−ヒドロキシスクシンイミ ドエステルに転化し、それを次に実施例８５（Ａ）の工程に従いＰＮＡオリゴマ ーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０とコンジュゲートさせてＰＮＡオリゴマーＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：９５ ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^*ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＣＴ−ＣＯＯＨ［こ こで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位 置と結合基を介して結合されたコレステロールを示す］を与えるか、或いはＰＮ ＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４を最初にヒドラジン／エタノールで処理し てアミンを遊離しそして次に実施例８５（Ａ）の工程により処理してＰＮＡオリ ゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６ Ｈ₂Ｎ−ＣＴＧ ＴＣＴ ＣＣＡ^***ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＡ^***ＣＴ−ＣＯＯＨ［ここで^***はオリゴマー中の指定されたモノマーのセ リンＯ−位置と結合基を介して結合されたコレステロールを示す］を与える。 Ｂ.方法２−ジスルフィド架橋を介するコレステロールのコンジュゲート １.Ｓ−(２−チオ−５−ニトロピリジル)−チオコレステロール チオコレステロール（１.４ｇ、３.５ミリモル）を氷酢酸（４００μＬ）を含 有するクロロホルム（２０ｍＬ）中の２,２’−ジチオビス(５−ニトロピリジン )（１.４ｇ、４ミリモル）の撹拌されている溶液にアルゴン雰囲気下で加える。 室温において一晩反応を続け、その後に沈澱した５−ニトロピリジン−２−チオ ンを除去しそして溶液を蒸発させそしてシリカカラム上で精製してＳ−(２−チ オ−５−ニトロピリジン)−チオコレステロールを与える。 ２.ＰＮＡオリゴマーのコンジュゲート ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９ Ｈ₂Ｎ−ＧＣＡ^*Ｔ−ＣＯＯＨ［こ こで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分のＣ−１位 置と結合されたジスルフィド保護チオヘキシルオキシメチル結合基を示す］を過 剰のＳ−(２−チオ−５−ニトロピリジル)−チオコレステロールと反応させて、 コレステロール部分をジスルフィド架橋を介してＰＮＡオリゴマーのチオール基 と結合してＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７ Ｈ₂Ｎ−ＧＣＡ^*Ｔ−ＣＯ ＯＨ［ここで^*はオリゴマー中の指定されたモノマーの２−アミノエチル部分の Ｃ−１位置と結合基を介して結合されたコレステロール基を示す］を与える。 実施例９４ ＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体の第１級アミノ基に対するコンジュゲート基の結合 第１級アミノ基を有するＰＮＡおよびＰＮＡ誘導体は、末端アミン基およびＰ ＮＡオリゴマー合成中に「マスクし」そして後で再生される末端アミン基を含む それらと結合したコンジュゲート基を有することができる。 アミノヘキサン酸（ＡＨＡ）基をＮ−ｔ−ブチルオキシ−カルボニル−ε−ア ミノ−ヘキサン酸として、標準的方法に従い固相合成中にＰＮＡオリゴマーに加 える。 Ｉ.アミノ基を介するＰＮＡコンジュゲートの一般的合成 Ａ.Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂およびＡＨＡ−ＰＮＡ− ＮＨ₂（ＡＨＡ＝−ＮＨ−(ＣＨ₂)₅−Ｃ＝(Ｏ)Ｏ−）の第１級アミノ基との結合 以下の３種の２−アミノエチルグリシンをベースにしたＰＮＡ構造を各々が少 なくとも１つの遊離アミノ基を有するように合成した。 ［ここでＢは核塩基またはその誘導体である］。 Ｂ.Ｄ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＡＥ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（０.２μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（２.５μ Ｌ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃（２.５μＬ）、およびＣＨ₃ＣＮ（５μＬ）を含有 する反応フラスコに加える。ＢＡＥ（０.２μＬ、２０μｇ／μＬ、ＤＭＦ中） を３部分で反応フラスコにフラスコを振りながら加える。各々の添加後に反応を 室温において１５分間にわたり進行させる。最後の添加から１５分後に反応混合 物を下記の２種の緩衝液勾配系を使用してＨＰＬＣ（逆相Ｃ−１８カラム）によ り分離する： Ｃ.アクリジン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＡＥ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（２７.５μｇ）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（２.５μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃ （２.５μＬ）、およびＣＨ₃ＣＮ（５μＬ）を含有する反応フラスコに加える。 ＡＡＥ（０.７μＬ、２０μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を３部分で反応フラスコにフ ラスコを振りながら加える。各々の添加後に反応を室温において１５分間にわた り進行させる。最後の添加から１５分後に反応混合物を実施例４４（Ｂ）の工程 に従いＨＰＬＣにより分離する。 Ｄ.塩化アジドベンゾイル（ＡＢＣ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（２.５μ Ｌ）、およびＣＨ₃ＣＮ（５μＬ）を含有する反応フラスコに加える。塩化アジ ドベンゾイル（３０μｇ）を反応フラスコに加え、それを室温において１５分間 にわたり放置する。オルト燐酸（０.５μｌ、８５％溶液）を加え、そして溶液 をクロロホルムで５回抽出する。水相を次に実施例９４（Ｂ）の工程に従いＨＰ ＬＣ上で分離する。 Ｅ.塩化アルカノイルの結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（２.５μＬ ）、ＮａＨＣＯ₃（２.５μＬ）、およびＣＨ₃ＣＮ（５μＬ）を含有する反応フ ラスコに加える。１マイクロリットルの塩化アルカノイルを反応フラスコに振り ながら加え、そして反応を３７℃において１５分間にわたり進行させる。水相を ヘキサンで３回抽出し、そして生じた水相を実施例９４（Ｂ）の工程に従いＨＰ ＬＣにより分離する。 Ｆ.クロロ蟻酸コレステリルの結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（２.５μ Ｌ）、およびＣＨＣｌ₃（２.５μＬ）を含有する反応フラスコに加える。クロロ 蟻酸コレステリル（３０μｇ）を反応フラスコに加え、それを室温において昼夜 ５日間にわたり振る。水相を次に実施例９４（Ｂ）の工程に従いＨＰＬＣにより 分離する。 Ｇ.塩化ダンシル（ＤＣ）の結合 塩化ダンシル（０.１６μＬ、１μｇ／μＬ、ＣＨ₃ＣＮ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃（２.５μＬ）およびＮａＨＣＯ₃（０.５μＬ）を含有する反応フラスコに 加える。Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮ Ａ−ＮＨ₂（３.３４μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ）を次に加え、そして反応 混合物を暗所で室温において１.５時間にわたり進行させる。反応混合物を次に 実施例９４（Ｂ）の工程に従いＨＰＬＣにより分離する。 Ｈ.葉酸（ＦＡ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ）を葉酸（０.５μＬ、１μｇ／μＬ 、ＤＭＳＯ中）、ＥＤＣ（０.１６μＬ、１０μｇ／μＬ、ＤＭＳＯ中）および ＤＭＳＯ（３.３４μＬ）を含有する反応フラスコの中に入れる。反応を一夜に わたり暗所で室温において進行させ、そして次に葉酸（０.５μＬ、１μｇ／μ Ｌ、ＤＭＳＯ中）およびＥＤＣ（０.１６μＬ、１０μｇ／μＬ、ＤＭＳＯ中） をフラスコに加える。反応をさらに６時間にわたり暗所で室温において進行させ 、次に葉酸（０.５μＬ、１μｇ／μＬ、ＤＭＳＯ中）およびＥＤＣ（０.１６μ Ｌ、１０μｇ／μＬ、ＤＭＳＯ中）をさらに添加する。反応を一夜にわたり暗所 で室温において続ける。水（１６.２６μＬ）を加え、そして反応混合物を凍結 乾燥し、水中に加え、そして実施例９４（Ｂ）の工程に従いＨＰＬＣにより分離 する。 Ｉ.マレイミド活性エステル（Ｎ−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシス クシンイミドエステル）（ＭＡＥ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（１.２５ μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃（１.２５μＬ）、およびＣＨ₃ＣＮ（６.９μＬ） を含有する反応フラスコに加える。ＭＡＥ（０.２μＬ、２０μｇ／μＬ、ＤＭ Ｆ中）を３部分で反応フラスコにフラスコを振りながら加える。各々の添加後に 反応を室温において１５分間にわたり進める。最後の添加から１５分後に、ＴＦ Ａが勾配から省略されること以外は実施例９４（Ｂ）の工程に従い反応混合物を ＨＰＬＣにより分離し、そして生成物を集める。 Ｊ.キノン活性エステル（アントラキノン−２カルボン酸−ＯＤｈｂｔエステ ル）（ＱＡＥ）の結合 Ｈ−ＰＮＡ−ＮＨ₂、Ｈ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂、またはＡＨＡ−ＰＮＡ−Ｎ Ｈ₂（１.３μＬ、２.５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（１.３μ Ｌ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃（１.３μＬ）、およびＣＨ₃ＣＮ（５.２μＬ）を含 有する反応フラスコに加える。ＱＡＥ（０.９μＬ、５μｇ／μＬ、ＤＭＦ中） を３部分で反応フラスコにフラスコを振りながら加える。各々の添加後に反応を 室温において１５分間にわたり進行させる。最後の添加から１５分後に実施例９ ４ （Ｂ）の工程に従い反応混合物をＨＰＬＣにより分離する。 Ｋ.フルオレセインの結合 １個の遊離ＮＨ₂を有するＰＮＡまたはＰＮＡ誘導体、例えばＨ₂Ｎ−ＧＣＡＴ −ＣＯＯＨ、をテトラヒドロフラン：水の中に溶解してＰＮＡ中０.１Ｍ溶液を 与え、そしてこれをフルオレセインイソチオシアネートを加えてフルオレセイン イソチオシアネート中０.１−１.０Ｍ溶液を与える。溶液を０.１−２時間にわ たり撹拌し、次に蒸発させて固体としそして分取ＨＰＬＣにより精製する。 Ｌ.ＥＤＴＡの結合 ＥＤＴＡコンジュゲートをＥＤＴＡ−トリベンジルエステルから標準的な固相 合成法により製造する。精製はＨＰＬＣによる。 Ｍ.ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）の結合 ＮＴＡコンジュゲートをグリシン−ｔｅｒｔ−ブチルエステルからジベンジル エステル状で標準的な固相合成法により製造する。精製はＨＰＬＣによる。 Ｎ.５−アミノ−１,１０−フェナントロリン−グルタルアミド（Ｐｈｅｎ₁） の結合 １.５−アミノ−１,１０−フェナントロリン−グルタルイミド ５−アミノ−１,１０−フェナントロリン（３５０ｍｇ、１.８ミリモル）を無 水グルタル酸（２.０ｇ、１７.５ミリモル）と共にピリジン（３ｍＬ）およびト リエチルアミン（３ｍＬ）の中で２時間にわたり還流した。反応混合物を回転蒸 発により減量して粘着性油にする。シリカゲル上での塩化メチレン中１０％メタ ノールを用いるカラム精製（生成物はＴＬＣ上でＦｅ（II）で明るい赤い点を生 じた）で粗製生成物（３２０ｍｇ、１.１ミリモル）を与えた。粗製生成物のさ らなる精製は３０ｍＬの沸騰水からの１回の再結晶化によるものであって、標記 化合物（２５０ｍｇ、０.８５ミリモル）をセンチメートル長さの透明な針状結 晶として与えた。 ２.５−アミノ−１,１０−フェナントロリン−グルタルアミド 上記の９４（Ｉ）Ｎ（１）からの精製した標記化合物（２５０ｍｇ、０.８５ ミリモル）を水（３ｍＬ）およびトリエチルアミン（３ｍＬ）の中で１０分間に わたり還流した。この物質を回転蒸発器上で蒸発しそして３ｍＬ、１０ｍＬ部分 の 水と共にさらに同時蒸発させた。これが痕跡量のトリエチルアミンを不純物とし て含む標記化合物を定量的収率で与えた。この物質を水（３０ｍＬ）から再結晶 化して、乾燥後に、精製した標記化合物（２００ｍｇ、０.６１ミリモル）（７ ２％）を白色の巨大結晶性一水和物として与えた。 ３.ＰＮＡに対する結合 上記の実施例９４（Ｉ）Ｎ（２）からの５−アミノ−１,１０−フェナントロ リン−グルタルアミド（６０ｍｇ、０.１４ｍｇ）のトリエチルアンモニウム塩 をＤＭＦ（１ｍＬ）およびピリジン（０.５ｍＬ）の中に溶解した。ＨＢＴＵ（ ４５ｍｇ、０.１２ミリモル）を加え、次にジイソプロピルエチルアミン（０.０ ５ｍＬ、０.３ミリモル）を加えた。この溶液を次に成長中のＰＮＡのＮ−末端 に加えるかまたはゲルを機能化するために使用することができる。 Ｏ.ピペラジン−Ｎ−酢酸−Ｎ’−酢酸−(５’−フェナントリル)−アミド（ Ｐｈｅｎ₂）の結合 １.ピペラジン−Ｎ−酢酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−Ｎ’−酢酸−(５’− フェナントリル)−アミド ヨードアセトアミド−フェナントロリン（１５０ｍｇ、０.４１ミリモル）お よびピペラジン酢酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル（９０ｍｇ、０.４８ミリモル ）をＤＭＦ（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（０.５ｍＬ）の中で混合した。 試薬を室温において１時間にわたり撹拌しそして次に溶媒を回転蒸発器により除 去した。生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりＤＭＦ中ピリジン （１５％）を溶離剤として用いて（生成物はＴＬＣ上でＦｅ（II）で明るい赤い 点を生じた）、標記化合物を７０％収率で与えた（１２０ｍｇ、０.２９ミリモ ル）。 ２.ピペラジン−Ｎ−酢酸−Ｎ’−酢酸−(５’−フェナントリル)−アミド ピペラジン−Ｎ−酢酸−ｔｅｒｔ−ブチルエステル−Ｎ’−酢酸−(５’−フ ェナントリル)−アミド（１２０ｍｇ、０.２９ミリモル）をジクロロメタン（３ ｍＬ）およびトリフルオロ酢酸（３ｍＬ）の中に溶解した。混合物を室温におい て３時間にわたり撹拌しそして次に溶媒を真空中で０.１ｍｍＨｇにおいて除去 した。これが標記化合物（痕跡量の出発物質を有する）を定量的収率でトリフル オロ酢酸エステル状で与えた。 ３.ＰＮＡに対する結合 トリフルオロ酢酸エステル状のピペラジン−Ｎ−酢酸−Ｎ’−酢酸−(５’− フェナントリル)−アミド（１５０ｍｇ、０.２５ミリモル）をＤＭＦ（２ｍＬ） およびジイソプロピルエチルアミン（１ｍＬ）の中に溶解した。生じた溶液（１ .５ｍL）にＨＢＴＵ（３８ｍｇ、０.１ミリモル）を加えそしてこの溶液を次に 成長中のＰＮＡのＮ−末端に加えるかまたはゲルを機能化するために使用するこ とができる。 Ｐ.フルオル_phetおよびフルオル_metの結合 １.フルオレセイン−(２−フェニル)エチルエステル−Ｏ−酢酸−ｔｅｒｔ− ブチルエステル フルオレセイン−(２−フェニル)エチルエステル（３ｇ、６.９ミリモル）を ＤＭＦ（１０ｍＬ）およびトリエチルアミン（２.５ｍＬ）の中に溶解した。混 合物を７０℃に加熱し、そしてブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２ｇ、１ ０ミリモル）を加えた。反応混合物を７０℃に２時間にわたり保ちそして次に室 温に冷却した。ジクロロメタン（４０ｍｌ）を加えそして生じた溶液を５％Ｎａ ＨＣＯ₃（２×２０ｍＬ）で抽出した。有機相をＮａ₂ＣＯ₃上で乾燥し、濾過し そして真空中で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーを使用 してジクロロメタン中メタノール（３−１５％）を溶離剤として用いて２回精製 した。標記化合物が５３％収率で得られた（２.０ｇ、３.６ミリモル）。 ２.フルオレセイン−(２−フェニル)エチルエステル−Ｏ−酢酸 フルオレセイン−(２−フェニル)エチルエステル−Ｏ−酢酸−ｔｅｒｔ−ブチ ルエステル（２.０ｇ、３.６ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍｌ）およびト リフルオロ酢酸（１０ｍＬ）の中に溶解した。混合物を一夜にわたり撹拌しそし て次に蒸発させて粘着性の油とした。溶離剤としてジクロロメタン中メタノール （１０％）を用いる２回のカラム精製後に、標記化合物が最終溶離液から沈澱し 、そしてそれを暖かいエタノール（９６％、１５０ｍＬ）の中に溶解した。エタ ノールを蒸発させて約３０ｍＬとしそして冷却すると標記化合物が沈澱した。標 記化合物を微結晶性赤色粉末状で７８％収率で単離した（１.４ｇ、２.８ミリモ ル）。 ３.フルオレセイン−モノマー−エチルエステル フルオレセイン−(２−フェニル)エチルエステル−Ｏ−酢酸（１.０８ｇ、２. ０ミリモル）および化合物８すなわちＮ−Ｂｏｃ−アミノエチルグリシンエチル エステル（５００ｍｇ、２.０ミリモル）をＤＭＦ（１５ｍＬ）およびジクロロ メタン（５ｍＬ）の中に溶解し、ＨＤＢＴＵ（３２４ｍｇ）およびＤＣＣ（４８ ０ｍｇ）を加えた。混合物を１時間にわたり５０℃に加熱しそして次に室温にお いて一夜にわたり放置した。ＤＣＵを濾別しそしてエーテル（５０ｍＬ）を加え 、その後に５％ＮａＨＣＯ₃（２０ｍＬ）および５％ＮａＨＳＯ₄（２０ｍＬ）で 洗浄した。有機相を乾燥しそして蒸発乾固した。精製は溶離剤としてジクロロメ タン中メタノール（０−１５％）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィー によった。標記化合物を６７％収率で単離した（０.９８ｇ、１３.５ミリモル） 。 ４.フルオレセイン−モノマー−フルオル_phetおよびフルオル_met フルオレセイン−（２−フェニル）−エチルエステル（３００ｍｇ、４１ミリ モル）をＴＨＦ（２０ｍＬ）の中に溶解しそしてＬｉＯＨ（１Ｍ、５ｍＬ）を加 えた。混合物を室温において３５分間にわたり撹拌し、氷／希ＮａＨＳＯ₄上に 注ぎそして酢酸エチルで抽出した。有機相を乾燥しそして蒸発乾固した。精製は 溶離剤としてＤＭＦを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによった。標 記化合物であるフルオル_phetを濃赤色の油状で３０％収率で単離した（１００ｍ ｇ、１.４ミリモル）。このモノマーをＰＮＡオリゴマー中に標準的方法を用い て加える。（エステル交換生成物であるフルオル_metも１回の合成で観察されそ してＰＮＡコンジュゲートを生成するために使用された。） Ｑ.ＰＮＡ−スタフィロコッカル・ヌクレアーゼコンジュゲート 上記の９４（Ｉ）からのマレイミド−ＰＮＡ誘導体（３μｇ）を１０ｍＭ Ｎ ａＰＯ₄緩衝液（１００μＬ、ｐＨ７.０）の中に溶解しそしてＳＨ−スタフィロ コッカル・ヌクレアーゼ突然変異体Ｌｙｓ１１６−Ｃｙｓ（１０μｇ）（Corey ，et.al.，Science，1987，238，1401）を用いて室温において２時間にわたりイ ンキュベートした。ＰＮＡ−ヌクレアーゼコンジュゲートを過剰のマレイミド− ＰＮＡから１０ｍＭ ＮａＰＯ₄、ｐＨ７.０中でセファデックスＧ−５０上でク ロマトグラフィーにより分離した。 II.ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂に対するコンジュゲートの結合 Ａ.アクリジン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ ＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）を実施例 ２６の如き標準的方法および技術を用いて合成した。３３００μｇのＰＮＡ（Ｓ ＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（３００μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨ ＣＯ₃（３００μＬ）およびＣＨ₃ＣＮ（６００μＬ）の中に溶解した。反応容器 を振りながら、アクリジン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル（ＡＡ Ｅ）（１００μＬ、２０μｇ／μＬ ＤＭＦ）を５部分で加えた。各部分のＡＡ Ｅ後、に混合物を室温において１５分間にわたり放置した。反応をＨＰＬＣによ り逆相スフェリソープＳ５０ＤＳ１ Ｃ−１８カラム（２５０×４.６ｍｍ）並び に緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂Ｏ中）および緩衝液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０ ％ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変動濃度勾配を用いて監視した。出発物質である ＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₃ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の保持時間 は約１５分間でありそして最終的なＰＮＡであるアクリジン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ ＣＴ₄−ＮＨ₂のものは約２３分間であった。 反応の完了後に、ＰＮＡを１２ｍｌのイソブタノールを用いて沈澱させ、凍結 乾燥しそして次に１ｍｌのＨ₂Ｏの中に再び溶解した。アクリジン−ＰＮＡをＨ ＰＬＣにより逆相Ｃ−１８カラムおよび上記と同じ条件を用いて精製した。 その後のアクリジン−ＰＮＡのｄｓＤＮＡに対する結合検定では、Ｋｄは未修 飾ＰＮＡのものと比べて結合が１０−１００倍増加したこと、並びにこれが１５ ０ｍＭ塩におけるμモル（６.５）濃度でｄｓＤＮＡに対して結合していること を示す。 Ｂ.アントラキノン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ １１５μｇのＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ８）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（１１１μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃（１１１μＬ ）およびＣＨ₃ＣＮ（４４４μＬ）の中に溶解した。反応容器を振りながら、ア ントラキノン−ＤＨＢＴ−エステル（ＱＡＥ）（７９.５μＬ、５μｇ／μＬ Ｃ Ｈ₃Ｃｌ）を３部分で加えた。各部分のＱＡＥを加えた後に、混合物を室温にお いて１５分間にわたり放置した。反応をＨＰＬＣにより逆相スフェリソープＳ５ ０ＤＳ １ Ｃ−１８カラム（２５０×４.６ｍｍ）並びに緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂ Ｏ中）および緩衝液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０％ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変 動濃度勾配を用いて監視した。出発物質であるＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄− ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の保持時間は約２１分間でありそして最終的 なＰＮＡであるアクリジン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂のものは約３０分間 であった。 反応の完了後に、Ｈ₂Ｏ相をＰＮＡと共に凍結乾燥しそして次に１ｍｌのＨ₂Ｏ の中に再び溶解した。キノン−ＰＮＡをＨＰＬＣにより逆相Ｃ−１８カラムおよ び上記と同じ条件を用いて精製した。 Ｃ.ビオチン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ ７８μＬ、２.５μｇ／μＬのＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（１５０μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃ （１５０μＬ）およびＣＨ₃ＣＮ（３００μＬ）の中に溶解した。反応容器を振 りながら、ビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル（ＢＡＥ）（ １２０μＬ、２μｇ／μＬ ＤＭＦ）を４部分で加えた。各部分のＢＡＥを加え た後に、混合物を室温において１５分間にわたり放置した。反応をＨＰＬＣによ り逆相スフェリソープＳ５０ＤＳ１ Ｃ−１８カラム（２５０×４.６ｍｍ）並び に緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂Ｏ中）および緩衝液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０ ％ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変動濃度勾配を用いて監視した。出発物質である ＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の保持時間 は約１５分間でありそして最終的なＰＮＡであるアクリジン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ ＣＴ₄−ＮＨ₂のものは約４１分間であった。 反応の完了後に、Ｈ₂Ｏ相をＰＮＡと共に凍結乾燥しそして次に０.４５ｍｌの Ｈ₂Ｏの中に再び溶解した。ビオチン−ＰＮＡをＨＰＬＣにより逆相Ｃ−１８カ ラムおよび上記と同じ条件を用いて精製した。 Ｄ.葉酸−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ ４００μＬの２.５μｇ／μＬ ＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：９８）を１５４μＬの１.０μｇ／μＬ ＤＭＳＯ葉酸、５０μＬ の１０μｇ／μＬ ＤＭＳＯ ＥＤＣ、および１２２８μＬのＤＭＳＯと混合した 。 混合物を暗所で室温において一夜にわたり放置した。翌日に１５０μＬの１.０ μｇ／μＬ ＤＭＳＯ葉酸および５０μＬの１０μｇ／μＬ ＤＭＳＯ ＥＤＣを 加えそして混合物を暗所で室温において６時間にわたり放置した。次に１５０μ Ｌの１.０μｇ／μＬ ＤＭＳＯ葉酸および５０μＬの１０μｇ／Ｈ₂Ｏ ＤＭＳＯ ＥＤＣを加えそして混合物を暗所で室温において一夜にわたり放置した。次の 日にＨ₂Ｏ（５ｍＬ）を加えそしてＨ₂Ｏ−相を凍結乾燥しそして４００μＬのＨ₂ ＯおよびＤＭＳＯの１：１混合物の中に再び溶解した。反応をＨＰＬＣにより 逆相スフェリソープＳ５０ＤＳ１ Ｃ−１８カラム（２５０×４.６ｍｍ）並びに 緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂Ｏ中）および緩衝液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０％ ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変動濃度勾配を用いて監視した。出発物質であるＰ ＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の保持時間は 約２４分間でありそして最終的なＰＮＡである葉酸−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄− ＮＨ₂のものは約３４分間であった。 葉酸−ＰＮＡをＨＰＬＣにより逆相Ｃ−１８カラムおよび上記と同じ条件を用 いて精製した。 Ｅ.オクタノイル−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ ３７０μＬ、２.０μｇ／μＬのＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥ Ｑ ＩＤ ＮＯ：９８）を０.２Ｍ Ｎａ₂ＣＯ₃（３４０μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣ Ｏ₃（３４０μＬ）およびＣＨ₃ＣＮ（６８０μＬ）の中に溶解した。反応容器を 振りながら、８０μＬのＣＨ₃(ＣＨ₂)₆ＣＯＣｌを４部分で加えた。各部分のＣ Ｈ₃(ＣＨ₂)₆ＣＯＣｌを加えた後に混合物を室温において１５分間にわたり放置 した。反応をＨＰＬＣにより逆相スフェリソープＳ５０ＤＳ１ Ｃ−１８カラム （２５０×４.６ｍｍ）並びに緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂Ｏ中）および緩衝 液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０％ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変動濃度勾配を用い て監視した。出発物質であるＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ Ｉ Ｄ ＮＯ：９８）の保持時間は約２１分間でありそして最終的なＰＮＡであるア クリジン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂のものは約３０分間であった。 反応の完了後に、Ｈ₂Ｏ相をＰＮＡと共に凍結乾燥しそして次に０.４５ｍｌの Ｈ₂Ｏの中に再び溶解した。オクタノイル−ＰＮＡをＨＰＬＣにより逆相Ｃ−１ ８ カラムおよび上記と同じ条件を用いて精製した。 Ｆ.プソラレン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂ ４６００μｇのＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９８）をＨ₂Ｏ（９２０μＬ）、０.２Ｍ ＮａＨＣＯ₃（２３０μＬ）および１９ １７μＬのＤＭＦの中に溶解した。反応容器を振りながら、５５２μＬの１０μ ｇ／μＬ ＤＭＦプソラレン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド−エステル（Ｐ ＡＥ）を４部分で加えた。ＰＡＥの各部分を加えた後に混合物を室温において１ ５分間にわたり放置した。反応をＨＰＬＣにより逆相スフェリソープＳ５０ＤＳ １Ｃ−１８カラム（２５０×４.６ｍｍ）並びに緩衝液Ａ（０.１％ＴＦＡ、Ｈ₂ Ｏ中）および緩衝液Ｂ（０.１％ＴＦＡ、６０％ＣＨ₃ＣＮ、４０％Ｈ₂Ｏ）の変 動濃度勾配を用いて監視した。出発物質であるＰＮＡ ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄− ＮＨ₂（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）の保持時間は約２０分間でありそして最終的 なＰＮＡであるプソラレン−ＡＨＡ−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−ＮＨ₂のものは３０分間で あった。 反応の完了後に、Ｈ₂Ｏ相をＰＮＡと共に凍結乾燥しそして次に１ｍｌのＨ₂Ｏ の中に再び溶解した。プソラレン−ＰＮＡをＨＰＬＣにより逆相Ｃ−１８カラム および上記と同じ条件を用いて精製した。 ここでＬｙｓはリシンであり、Ｔｙｒはチロシンであり、ＡＨＡはアミノヘキ サン酸であり、ＮＴＡはニトリロ三酢酸であり、ＰＨＥＮ₁は Jenkins，Y．and Barton，J.K.，JACS 1992，114，8736-38 により報告されている置換されたフェ ナントロリンである。ＰＨＥＮ₂はピピラジンリンカーを加えた同様な化合物で ある。ＦＬＵＯ_phetは部分的に保護基除去されたフルオレセインモノマーであり 、ＦＬＵＯ_metはエステル交換されたフルオレセイン生成物である。 実施例９５ Ｎ−末端ポリアミン末端標識ＰＮＡオリゴマー ポリアミンを標準的方法および技術により合成した配列Ｈ₂Ｎ−ＧＣＡ ＴＧＣ ＡＴ−Ｃ(Ｏ)ＯＣＨ₃ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１を有するＰＮＡオリゴマーのＮ −末端部と結合させ、ここでポリアミンは下記の１種である： Ａ.ＰＮＡオリゴマーの製造 メチルエステルとして保護された末端カルボキシル基を有しそして遊離アミノ 末端基を有するＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１を実施例２６−２８ および標準的な保護方法に従い製造する。 Ｂ.ポリアミン機能化ＰＮＡオリゴマーの製造 上記の実施例９５（Ａ）からのＰＮＡオリゴマーを製造したてのＮａＨＣＯ₃ 緩衝液（０.２Ｍ、ｐＨ８.１）の中に溶解しそして１５０μｌのメチルスルホキ シド（ＤＭＳＯ）中に溶解させたジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）（約 ５ ｍｇ）の溶液で処理する。反応混合物を室温において２０分間にわたり反応させ る。混合物を次にセファデックスＧ−２５カラム（０.７×４５ｃｍ）上に通し て活性化されたＰＮＡオリゴマー−ＤＳＳを過剰のＤＳＳから分離する。ＰＮＡ オリゴマー−ＤＳＳを次に直ちに凍結しそして凍結乾固する。ポリアミンの０. ３３Ｍ ＮａＯＡｃ中溶液（３００μｌの０.３３Ｍ ＮａＯＡｃ中の約６ｍｇの ポリアミン、ｐＨ５.２、最終的溶液ｐＨ６−８.０）を乾燥ＰＮＡオリゴマー− ＤＳＳに加え、そしてこの混合物を室温において一夜にわたり反応させる。生じ たポリアミン−ＰＮＡオリゴマーコンジュゲートを逆相ＨＰＬＣおよび２０％変 性ゲルにより同定する。溶媒Ａは５０ｍＭ ＴＥＡＡであり、溶媒ＢはＣＨ₃ＣＮ である。ＨＰＬＣ勾配は０−１０分間の９５％溶媒Ａ、５％溶媒Ｂ；、次の５０ 分間の４０％溶媒Ｂへの線状増加であって、ウォーターズ・デルタ−パックＣ− １８逆相カラムを使用する。 ＨＰＬＣ分析は比較的大きいアミン類に関しては徐々に速くなる泳動時間を示 す。 Ｃ.ビオチン機能化ＰＮＡオリゴマーポリアミンコンジュゲートの製造 ＰＮＡ−オリゴマーポリアミンコンジュゲートをさらに同定するために、ビオ チンを上記の実施例で結合されたポリアミン類から製造できる遊離アミン類と結 合させる。約１０ Ｏ.Ｄ.単位（Ａ₂₆₀）のＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４（約５８ｎモル）をマイクロフュージ管 の中で乾燥する。 ＰＮＡオリゴマーポリアミンコンジュゲートを４００μｌの０.２Ｍ ＮａＨＣ Ｏ₃（ｐＨ８.１）緩衝液中で再水和しそしてＤ−ビオチン−Ｎ−ヒドロキシスク シンイミドエステル（１,６ジアミノヘキサンコンジュゲートに関して約５.０ｍ ｇのビオチン、ジエチレントリアミンに関して８.０ｍｇ）（シグマ）を加え、 その後に２００μｌのＤＭＦを加える。溶液を室温において一夜にわたり反応さ せる。溶液を次にＮＡＰ−２５カラム上を通しそして逆相ＨＰＬＣにより分析す る。溶媒Ａは５０ｍＭ ＴＥＡＡでありそして溶媒ＢはＣＨ₃ＣＮである。ＨＰＬ Ｃ勾配は０−１０分間の９５％溶媒Ａ、５％溶媒Ｂであり、次の５０分間では４ ０％溶媒Ｂへの線状増加、ウォーターズ・デルタ−パックＣ−１８逆相カラムを 使用 する。 実施例９６ 内部ポリアミン標識ＰＮＡオリゴマー：ホルミル−機能化モノマーに対する結合 １.Ｎ−[(Ｎ−Ｂｏｃ−１−ホルミル)−２−アミノエチル]−Ｎ−[(１−チミ ニル)−アセチル]グリシンエチルエステル]（９７Ａ） 化合物３５を標準的技術によりエチルエステルに転化させる。生じた化合物を 次に実施例３７の工程に従い処理して標記化合物を生成する。 ２.Ｎ−[(Ｎ−Ｂｏｃ){１−(６−アミノヘキシル)アミノメチル}−２−アミノ エチル]−Ｎ−[(１−チミニル)−アセチル]グリシンエチルエステル]（９７Ｂ） 化合物９７Ａを１００マイクロリットルの水中に溶解し、そして１００ｍｌの １Ｍ ＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ５.０）を加え、次に１,６ジアミノヘキサン塩酸 塩（２４μモル）および５０μｌの６０ｍＭ ＮａＣＮＢＨ₃溶液を加える。溶液 を撹拌し、一夜にわたり放置しそして分析用ＨＰＬＣカラム中で精製する。生成 物を次にカルボキシル基のところで保護基除去して標記化合物（９７Ｂ）を生成 する。 ３.Ｎ−[(Ｎ−Ｂｏｃ){１−(６−アミノヘキシル)アミノメチル}−２−アミノ エチル]−Ｎ−[(１−チミニル)−アセチル]グリシンエチルエステル]（９７Ｂ） のＰＮＡオリゴマー中への取り込み 化合物９７Ｂの遊離アミノ基は標準的技術を使用して保護されたＢｏｃである 。保護されたモノマーを次に実施例２６の工程に従いＰＮＡオリゴマー中に加え る。 実施例９７ Ｃ−８プリンおよびＣ−５ピリミジンコンジュゲート プリンのＣ−８位置およびピリミジンのＣ−５位置を Ruth，J.L.，Oligonucl eotides with reporter groups attached to the base，Oligonucleotides and Analogues，A Practical Approach，Eckstein，F.，IRL Press，New York に概 略記載されている工程により修飾する。 Ａ.Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−[(Ｎ−６−Ｃｂｚ)(８−[Ｎ− (６−トリフルオロアセチルアミノヘキシル)−３−(Ｅ)アクリルアミド]−９− アデニニル)アセチル]グリシン（化合物９７Ａ） 化合物９７Ａを上記参考文献の工程に従い合成する。プリン置換された保護さ れたＰＮＡモノマーがヌクレオシドの代わりに使用される。Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ− ２−アミノエチル)−Ｎ−[(Ｎ−６−Ｃｂｚ−９−アデニニル)アセチル]グリシ ンエチルエステル（２１）がアデノシンの代わりに出発物質として使用される。 保護された結合基が結合された後に、生じた化合物を実施例２２の工程により処 理して標記化合物を与える。保護された結合部分を有する最終的な化合物をさら にオリゴマー中に標準的方法を使用して加える。保護された結合部分を保護基除 去しそして別の官能基、例えばフルオレセインまたはビオチン、で機能化する。 Ｂ.Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−[(Ｎ−４−Ｃｂｚ)(５−[Ｎ− (６−トリフルオロアセチルアミノヘキシル)−３−(Ｅ)アクリルアミド]−１− シトシニル)アセチル]グリシン（化合物９７Ｂ） 化合物１６をシチジンの代わりに出発物質として使用すること以外は上記の参 考文献の工程を使用して化合物９７Ｂを合成する。保護された結合基が結合され た後に、生じた化合物を実施例１７の工程により処理して標記化合物を与える。 保護された結合部分を有する最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法 を使用して加える。保護された結合部分を保護基除去しそして別の官能基、例え ばフルオレセインまたはビオチン、で機能化する。 実施例９８ ５−プロピニルピリミジン類（シトシンおよびウラシル） Ａ.Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−[(Ｎ−４−Ｃｂｚ)(５−プロ ピニル)−１−シトシニル)−アセチル]グリシン（化合物９８Ａ） 化合物１６をシチジンの代わりに出発物質として使用すること以外は Wagner ，W.W.，et.al.，Science，1993，260，1510-1513 の工程を使用して化合物９８ Ａを合成する。５−プロピニル基を保護されたＮ−１−アセチルシトシンに結し た後に、生じた化合物を実施例１７の工程により処理する。５−プロピニル基を 有する最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法を使用して加える。 Ｂ.Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−[(５−プロピニル)−１−ウラ シニル)アセチル]グリシン（化合物９８Ｂ） 適用しうる実施例、例えば実施例１３−１７、において環外アミノ基用の保護 段階を省略しそしてシトシンをウラシルで置換すること以外は化合物９８Ａと同 様にして化合物９８Ｂを合成する。５−プロピニル基をＮ−１−アセチルウラシ ルに結合した後に、生じた化合物を実施例１７の工程により処理する。５−プロ ピニル基を有する最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法を使用して 加える。 実施例９９ Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピオン酸 炭酸水素ナトリウム（２.５２ｇ、３０ミリモル）および３−アミノプロピオ ン酸（１.００ｇ、１１.２ミリモル）を５０ｍｌの水中に溶解しそして５０ｍｌ のジオキサンを加えた。クロロ蟻酸フルオレニルメチル（３.１０ｇ、１２.０ミ リモル）の５０ｍｌのジオキサン中溶液を撹拌しながら滴下した。６時間後に、 溶液を水（１００ｍｌ）および飽和炭酸水素塩溶液（５０ｍｌ）で希釈し、ジエ チルエーテルで１回抽出し、そして水層を濃ＨＣｌでｐＨ２となるまで酸性化し た。曇った溶液を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出し、食塩水で洗浄しそし てＭｇＳＯ₄を用いて乾燥した。蒸発後に、標記生成物およびペプチド二量体の 混合物が得られた。純粋な生成物がフラッシュクロマトグラフィーにより得られ た。¹Ｈ ＮＭＲ：（ＣＤＣｌ₃、２００ＭＨｚ）δ７.９５−７.２６（８Ｈ,ｍ, ＡｒＨ）、７.４０−７.１５（３Ｈ,ｍ,ＣＨＣＨ₂Ｏ）、３.２０（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝ ８Ｈｚ,ＣＨ₂Ｎ）、２.４０（２Ｈ,ｔ,Ｊ＝８Ｈｚ,ＨＯＯＣＣＨ₂）。 実施例１００ Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−(Ｎ−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピ オノイル)グリシン（１００） この化合物は、実施例１０および１１に記載されている工程によりＮ−１−カ ルボキシメチルチミンをＮ−Ｆｍｏｃ−３−アミノプロピオン酸（９９）で置換 して製造される。最終的化合物をオリゴマー中に標準的方法を使用して加える。 実施例１０１ Ｎ−イミダゾリル−２−酢酸 イミダゾール（３.７ｇ、５４ミリモル）をナトリウムヒドラジド（２.６ｇの 油中６０％分散液、６０ミリモル）の５０ｍｌの乾燥ＴＨＦ中懸濁液に加えた。 ブロモ酢酸（３.４ｇ、２４ミリモル）を次に加えそして混合物を一夜にわたり 撹拌した。水（１ｍｌ）を次に加えそして溶媒を減圧下で除去した。残渣を水（ ５０ｍｌ、ｐＨ＞１０）の中に加え、エーテルで抽出しそして有機層を廃棄した 。水層を濃ＨＣｌを用いてｐＨ１となるまで酸性化しそして再びエーテルで抽出 した。水層を蒸発乾固した。油状残渣を無水エタノール（ＥｔＯＨ）中に溶解し てＮａＣｌを沈澱させ、そしてアセトン／メタノールから再結晶化させて１.２ ２ｇ（７.５ミリモル、３０％）の純粋な生成物を塩酸塩状で与えた。¹Ｈ ＮＭ Ｒ：（ＤＭＳＯ−ｄ６、２００ＭＨｚ）δ９.２０（ｓ,Ｈ２）、７.７６（ｄ,Ｊ ＝１.５Ｈｚ）、７.６９（ｄ,Ｊ＝１.５Ｈｚ）、５.２０（ｓ,ＣＨ₂）.０。 実施例１０２ Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−(Ｎ−イミダゾリル−２−アセチル) グリシン（１０２） この化合物は、実施例１０および１１に記載された工程によりＮ−１−カルボ キシメチルチミンをＮ−イミダゾリル−２−酢酸（１０１）で置換して製造され る。最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法を用いて加える。 実施例１０３ ３,６,９,１２−テトラオキサトリデカン酸ベンジル（１０３） トリエチレングリコールモノメチルエーテル（１０ミリモル）およびブロモ酢 酸ベンジル（１１ミリモル）を無水Ｋ₂ＣＯ₃（１５ミリモル）の５０ｍｌの無水 ＤＭＦ中懸濁液に加える。懸濁液を室温において一夜にわたり撹拌する。水を加 えそして乳化液を酢酸エチル（３×２００ｍｌ）で抽出し、水、食塩水で洗浄し 、そしてＭｇＳＯ₄を用いて乾燥する。溶媒を蒸発させそして残存している油を フラッシュクロマトグラフィーにより精製して標記化合物を与える。 実施例１０４ ３,６,９,１２−テトラオキサトリデカン酸（１０４） ３,６,９,１２−テトラオキサトリデカン酸ベンジル（１０３、５ミリモル） をメタノール（５０ｍｌ）中に溶解しそしてカーボン上１０％パラジウムを加え る（１００ｍｇの触媒／ミリモル）。懸濁液を３０ｐｓｉのＨ₂下で出発物質が 消費されるまで振る。懸濁液をセライトのショートパッドを通して濾過し、メタ ノー ルで十分洗浄し、そして溶媒を蒸発させる。生成物は精製せずに直接使用される 。 実施例１０５ Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−(３,６,９,１２−テトラオキサトリ デカノイル)グリシン（１０５） この化合物は、実施例１０および１１に記載された工程によりＮ−１−カルボ キシメチルチミンを３,６,９,１２−テトラオキサトリデカン酸（１０４）で置 換して製造される。最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法を用いて 加える。 実施例１０６ Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−グルタミン酸γ−ベンジルエステル（１０６） グルタミン酸γ−ベンジル（１０ミリモル）の５０ｍｌのジオキサンおよび５ ０ｍｌの水中溶液にトリエチルアミン（２５ミリモル）を加え、次にクロロ蟻酸 フルオレニルメチル（１１ミリモル）の５０ｍｌのジオキサン中溶液を加える。 混合物を出発物質が消費されるまで激しく撹拌する。溶液を濃ＨＣｌを用いてｐ Ｈ２となるまで酸性化し、酢酸エチル（２×２５０ｍｌ）で抽出し、食塩水で洗 浄し、ＭｇＳＯ₄を用いて乾燥し、そして蒸発させる。生成物は精製せずに直接 使用される。 実施例１０７ Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸フルオレニルメチルエス テル（１０７） Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−グルタミン酸γ−ベンジルエステル（１０６、５ミリモ ル）、フルオレニルメタノール（５.５ミリモル）およびジメチルアミノピリジ ン（０.５ミリモル）を５０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂の中に溶解する。ジメチルアミノ プロピルエチルカルボジイミド（ＥＤＣ、６.０ミリモル）を加え、そして溶液 を室温において撹拌する。出発物質の完全な消費後に、溶液をＣＨ₂Ｃｌ₂で希釈 し、１％ＨＣｌ、および食塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ₄を用いて乾燥しそして蒸発 させる。残渣をフラッシュクロマトグラフィーにより溶離剤として酢酸エチルお よびヘキサンを使用して精製する。 実施例１０８ Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−Ｌ−グルタミン酸α−フルオレニルメチルエステル（１０ ８） Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸フルオレニルメチルエ ステル（１０７、５ミリモル）をメタノール（５０ｍｌ）の中に溶解しそしてカ ーボン上１０％パラジウムを加える（１００ｍｇの触媒／ミリモル）。懸濁液を ３０ｐｓｉのＨ₂下で出発物質が消費されるまで振る。懸濁液をセライトのショ ートパッドを通して濾過し、メタノールで十分洗浄し、そして溶媒を蒸発させる 。生成物は精製せずに直接使用される。 実施例１０９ Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−[Ｎ−α−(ＦＭＯＣ)−Ｌ−グルタ モイル−α−フルオレニルメチルエステル]グリシン（１０９） この化合物は、実施例１０および１１に記載された工程により、Ｎ−１−カル ボキシメチルチミンをＮ−α−(ＦＭＯＣ)−Ｌ−グルタミン酸α−フルオレニル メチルエステル（１０８）で置換して製造される。最終的な化合物をさらにオリ ゴマー中に標準的方法を用いて加える。 実施例１１０ Ｎ−(Ｎ−Ｂｏｃ−２−アミノエチル)−Ｎ−(１−メチル−２−ピロールアセチ ル)グリシン（１１０） この化合物は、実施例１０および１１に記載された工程により、Ｎ−１−カル ボキシメチルチミンを１−メチル−２−ピロールカルボン酸（アルドリッヒ）で 置換して製造される。最終的な化合物をさらにオリゴマー中に標準的方法を用い て加える。 実施例１１１Ａ ＮＴＡ−Ｌｙｓ₂−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−Ｌｙｓ₂−ＮＨ₂によるプラスミド−ＤＮＡの 開裂 ２.０μＬの５.９μＭ ＰＮＡ ＮＴＡ−Ｌｙｓ₂−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−Ｌｙｓ₂− ＮＨ₂および０.２μＬの５.９μＭ Ｆｅ²⁺の混合物を室温において１０分間にわ たりインキュベートした。緩衝液（１００ｍＭ ＰＯ₄、ｐＨ６.５または１００ ｍＭ ＰＯ₄、ｐＨ６.５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）、９.５μＬのＨ₂Ｏおよび０.５ μＬの³² Ｐ−標識標的ＤＮＡであるｐＡ８Ｇ２を加えそしてインキュベーションを３７ ℃において１時間にわたり続けた。１μＬの４０ｍＭ ＤＴＴを加えそしてイン キュベーションを３７℃において１時間にわたり続けた。サンプルを８％ポリア クリルアミド配列分析ゲル上で下記の工程に従い分析した。 ５’^*はｐＡ８Ｇ２のＥｃｏＲＩ／ＰｖｕＩＩ断片が５’−末端で標識されてい ることを示し、３’^*はこの断片が３’末端で標識されていることを示す。ＤＭ Ｓは硫酸ジメチルおよびＫＭｎＯ₄での検査を示す。 実験結果をゲル電気泳動（図６参照）により分析した時には、ＰＮＡ ＮＴＡ Ｆｅ²⁺がオリゴヌクレオチド開裂剤として有効であったことが示された。レーン １と利用可能なＦｅ²⁺を競合的に結合するためにＥＤＴＡが使用されたレーン４ との比較は、Ｆｅ²⁺−ＮＴＡ複合体がＤＮＡ鎖の開裂に必要であり且つ有効であ ったことを示す。レーン１３とレーン１４との比較は開裂パターンがＰＮＡによ り置換された鎖のＫＭｎＯ₄開裂により位置決定されたＰＮＡ結合部位を越えて 伸びていることを示し、それはＦｅ²⁺−ＮＴＡ複合体がその末端に配向されてい ることと一致する。 実施例１１１Ｂ ＮＴＡ−ＰＮＡおよびＮＴＡ−ＰＮＡ−Ｌｙｓ−ＡＨＡ−Ｌｙｓ−ＡＨＡ−Ｌｙ ｓ−ＰＮＡ（ビスＰＮＡ）による³²Ｐ−末端標識ＤＮＡ制限断片の開裂 ＮＴＡ−Ｌｙｓ₂−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−Ｌｙｓ₂−ＮＨ₂を使用し、またビス−ＮＴ ＡであるＮＴＡ−Ｌｙｓ−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＡＨＡ−Ｌｙ ｓ−ＡＨＡ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂も用いて実 施例１１１Ａを繰り返した。標的ＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡ領域を含有する³²Ｐ−末 端標識二重鎖ＤＮＡ制限断片を使用した。開裂生成物を高解像度ポリアクリルア ミドゲル電気泳動により分析した。 これらの結果はＮＴＡ−ＰＮＡコンジュゲートが二重鎖ＤＮＡ標的を選択的に 開裂したことを示す。過酸化マンガン酸塩およびＤＭＳ−保護検査（Cherny，D. Y.，et.al.，Proc．Natl．Acad．Sci.，1993，90，1667 参照）を行ってＤＮＡ 標的に対するＰＮＡの結合を測定し、そしてこれらの結果（図７、レーン７、８ および１４）はＰＮＡがＰＮＡ−ＤＮＡ三重鎖置換により標的と結合しているこ とを示す。 制限断片の開裂は、ＮＴＡ−Ｌｙｓ₂−Ｔ₂ＣＴ₂ＣＴ₄−Ｌｙｓ₂−ＮＨ₂に関し ては３’および５’−末端上のＰＮＡ結合部位近くであり、ビス−ＮＴＡである ＮＴＡ−Ｌｙｓ−ＴＴＴ−ＴＣＴ−ＴＣＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＡＨＡ−Ｌｙｓ−ＡＨ Ａ−Ｌｙｓ−ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＴＴ−Ｔ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂に関しては５’−末 端のみであることが見いだされた。これらの結果はワトソン−クリックによる１ つの鎖結合並びにフーグスティーン結合モチーフを介する他の鎖結合を伴って起 きる三重鎖生成と一致する。 実施例１１２ 二本鎖ＤＮＡ標的に対するＰＮＡコンジュゲートの結合 指定されたプラスミドの２００ｃｐｓの³²Ｐ−標識ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断 片（ＥｃｏＲＩ部位の３’−末端で標識された大きな断片）、０.５μｇの担体 である牛胸腺ＤＮＡおよび３００ｎｇのそれと結合した適当なコンジュゲートを 有するＰＮＡの１００μｌ緩衝液（１０ｍＭ 燐酸Ｎａ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７）中混合物を３7℃において６０分間にわたりインキュベートする。５μｌの ２０ｍＭ ＫＭｎＯ₄を加えそして２０℃において１５秒間にわたりインキュベー トする。３μｌの０.５Ｍ ２−メルカプトエタノール、１Ｍ ＮａＯＡｃの添加 により反応を停止し、そして２５０μｌのエタノール中２％酢酸カリウムの添加 によりＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡを熱（５０℃）１Ｍピペリジンで処理しそし て１０％ポリアクリルアミド配列分析ゲル中での電気泳動により分析しそして放 射標識ＤＮＡバンドをオートラジオグラフィにより可視化する。 標的プラスミドはｐＣＵ１９中への適当なオリゴヌクレオチドのクローニング により製造される。標的Ａ１０：ＢａｍＨＩ部位中にクローニングされたオリゴ ヌクレオチドＣＡＴＣＣＡ１０ＧおよびＧＡＴＣＣＴ１０Ｇ（ｐＴ１０と称され るプラスミド）。標的Ａ５ＧＡ４：ＳａｌＩ部位中にクローニングされたオリゴ ヌクレオチドＴＣＧＡＣＴ４ＣＴ５ＧおよびＴＣＧＡＣＡ５ＧＡ４Ｇ（プラスミ ドｐＴ９Ｃ）。標的Ａ２ＧＡ２ＧＡ４：ＰｓｔＩ部位中のオリゴヌクレオチドＧ Ａ２ＧＡ２ＧＡ４ＴＧＣＡおよびＧＴ４ＣＴ２ＣＴ２ＣＴＧＣＡ（プラスミドｐ Ｔ８Ｃ２）。ゲル中の標的の位置は棒により左に示されている。Ａ／Ｇは標的Ｐ １０のＡ＋Ｇ配列ラダーである。 実施例１１３ Ａ.ＰＮＡオリゴマーを含有するチオールリンカーの細胞取り込みおよび活性 の測定 これは Chiang，et al.，J．Biol．Chem．1991，266 18162 の方法を利用する ＩＣＡＭ−１（細胞内付着分子−１）の阻害により測定される。 ＩＣＡＭ−１検定：細胞表面上のＩＣＡＭ−１発現はＥＬＩＳＡにより９６ウ ェルプレート中で集密状態まで成長した細胞を使用して測定される。細胞をダル ベッコ燐酸塩で緩衝された食塩水で３回洗浄しそして２０分間にわたりダルベッ コＰＢＳ中に希釈された２％ホルムアルデヒド中で固定する。細胞をダルベッコ ＰＢＳで３回洗浄し、３７℃においてダルベッコＰＢＳ中２％牛血清アルブミン を用いて１時間にわたり保護し、そしてＩＣＡＭ−１モノクローン抗体８４Ｈ１ ０（０.５μｇ／ｍｌ）と共に１時間にわたり３７℃においてインキュベートす る。細胞に結合した抗体をビオチニル化された山羊の抗−マウスＩｇＧの１：１ ０００希釈物を用いるインキュベーションおよびその後のβ−ガラクトシダーゼ ーコンジュゲートストレプトアビジンの１：１０００希釈物を用いるインキュベ ーションにより測定する。プレートを１００μｌの５０ｍＭ燐酸ナトリウムおよ び１.５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ７.０中３.３ｍＭクロロフェノールレッド−β− Ｄ−ガラクトピラノシドを用いて発色させる。生じた生成物は５７５ｎｍにおけ る吸収により検知される。このデータは上記の Chiang，et al.の参考文献によ り記載されているようにして計算し、対照活性の百分率で表示される。 細胞のＰＮＡオリゴマー処理：細胞を３７℃に予め暖められたＯｐｔｉ−ＭＥ Ｍで３回洗浄する。１０μｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ溶液（ＨＵＶＥＣ）または２０ ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＭＡ溶液（Ａ５４９細胞）のいずれかを含有するＯｐｔｉ− ＭＥＭをプレートの各々のウェルに加える（１００μｌ）。ＰＮＡオリゴマーを ０.２μＭセントレックス酢酸セルロースフィルターを通す遠心により殺菌した 。ＰＮＡオリゴマーを２０倍貯蔵溶液としてウェルに加えそして３７℃において ４時間にわたりインキュベートし、次に指示されているように適当なサイトカイ ンを用いて１４−１６時間にわたり刺激する。ＩＣＡＭ−１発現は上記の通りに して測定される。 アミノエチルグリシン主鎖を有する下記のＰＮＡオリゴマーを上記の実施例の 工程に従い合成する：Ｈ₂Ｎ−ＴＧＧ ＧＡ^*Ｇ ＣＣＡ ＴＡＧ ＣＧＡ ＧＣＣ− ＣＯＯＨ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７）、ＩＣＡＭ ＰＮＡ；およびＨ₂Ｎ−ＴＣ Ｔ ＧＡＧ ＴＡＧ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＧＣ ＴＡ^*ＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８） ；ＩＣＡＭの５’−キャップ領域中の配列。星印（^*）は実施例５８に従う保護 されたチオール官能基を含有するモノマーユニットの取り込みを示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７を有するＰＮＡオリゴマーは取り込み実験においてトリチル チオエーテル基を評価するためおよびＩＣＡＭ蛋白質発現を阻害するその能力を 測定するために役立つ。ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８はＯ−フェ ナントロリンとコンジュゲートされそしてＩＣＡＭ系の５’−キャップ−メッセ ンジャーＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡを開裂する。ＰＮＡオリゴマーを上記の 検定で使用してＩＣＡＭ発現に対するその効果を評価する。 Ｂ.チオールリンカーを含有するオリゴヌクレオチドを使用するＲＮＡ開裂 ＰＮＡオリゴマーＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８をチオール保護基除去しそしてＯ −フェナントロリン試薬とコンジュゲートさせる。コンジュゲートをＩＣＡＭ系 の５’−キャップＲＮＡに対して標的とする。ハイブリッドを３７℃において４ ８時間の期間にわたり過剰なＣｕ（II）塩の存在下で緩衝条件下でインキュベー トする。ゲル電気泳動による反応の分析（Baker，J．Am．Chem．SOc．1993，115 ，3378 により記載されている）は、オリゴヌクレオチド−Ｏ−フェナントロリ ン−Ｃｕ複合体が標的ＲＮＡ鎖を開裂することを示す。 実施例１１４ ＰＮＡ−コンジュゲートによる制限酵素開裂の阻害 ２μｇ部分のプラスミドｐＴ１０を２０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス −ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４）中の指示された量のＰＮＡコンジュゲ ートと混合し、２μ１の１０×緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.５、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中で３７℃において １２０分間にわたりインキュベートする。。ＰｖｕＩＩ（２単位）およびＢａｍ ＨＩ（２単位）を加えそしてインキュベーションを６０分間にわたり続ける。Ｄ ＮＡを５％ポリアクリルアミド中でゲル電気泳動により分析しそしてＤＮＡを臭 化エチジウム染色により可視化する。 実施例１１５ ＰＮＡコンジュゲート−ｄｓＤＮＡ鎖置換複合体生成の動力学 ２００ｃｐｓのｐＴ１０の³²Ｐ−標識ＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片（ＥｃｏＲ Ｉ部位の３’−末端で標識された大きな断片）、０.５μｇの担体牛胸腺ＤＮＡ 、および３００ｎｇのＰＮＡコンジュゲートの１００μｌの緩衝液（２００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ酢酸Ｎａ、ｐＨ４．５、１ｍＭ ＺｎＳＯ₄）中混合物を３ ７℃においてインキュベートする。定期的に、５０ＵのＳ₁ヌクレアーゼを７個 のサンプルの各々に加えそしてインキュベーションを２０℃において５分間にわ たり続ける。ＤＮＡを次に２５０μｌのエタノール中２％酢酸Ｋの添加により沈 澱させそして１０％ポリアクリルアミド配列分析ゲル中での電気泳動により分析 する。鎖置換複合体の量を、オートラジオグラフィのデンシトメーター走査によ り測定された標的配列におけるＳ₁−開裂の強度から計算する。 実施例１１６ ＰＮＡ−ｄｓＤＮＡ複合体の安定性 ２００ｃｐｓの³²Ｐ−ｐＴ１０断片、０.５μｇの牛胸腺ＤＮＡおよび３００ ｎｇの所望するＰＮＡコンジュゲートの混合物を１００μｌの２００ｍＭ Ｎａ Ｃｌ、５０ｍＭ 酢酸Ｎａ、ｐＨ４.５、１ｍＭ ＺｎＳＯ₄の中で３７℃において ６０分間にわたりインキュベートする。２μｇ部分のオリゴヌクレオチドＧＡＴ ＣＣＡ₁₀Ｇを加えそして各々のサンプルを指定温度で１０分間にわたり加熱し、 氷中で１０分間にわたり冷却しそして２０℃に暖める。５０Ｕ部分のＳ₁ヌクレ アーゼを加え、そしてサンプルを処理および分析し、そして結果を定量化する。 実施例１１７ ＰＮＡによる転写の阻害 １００ｎｇのプラスミドＤＮＡ（制限酵素ＰｖｕＩＩ（以下参照）を用いて切 断された）および１００ｎｇのＰＮＡコンジュゲートの１５μｌの１０ｍＭ ト リス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.４中混合物を３７℃において６０分間 にわたりインキュベートする。次に、４μｌの５×濃縮緩衝液（０.２Ｍ トリス −ＨＣｌ（ｐＨ８.０）、４０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ スペルミジン、１２５ ｍＭ ＮａＣｌ）を１μｌのＮＴＰ−混合物（１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＣＴ Ｐ、１０ｍＭ ＧＴＰ、１ｍＭ ＵＴＰ、０.ＴμＣｉ／μｌ ³²Ｐ−ＵＴＰ、５ｍ Ｍ ＤＴＴ、２μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１μｇ／ｍｌヘパリン）並びに３単位のＲ ＮＡ ポリメラーゼと混合する。インキュベーションを３７℃において１０分間にわた り続ける。ＲＮＡを次に６０μｌの９６％エタノール中２％酢酸カリウムの添加 により−２０℃において沈澱させそして８％ポリアクリルアミド配列分析ゲル中 での電気泳動により分析する。ＲＮＡ転写物をオートラジオグラフィにより可視 化する。下記のプラスミド類が使用される：ｐＴ８Ｃ２−ＫＳ／ｐＡ８Ｇ２−Ｋ Ｓ；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳ^-のＰｓｔＩ部位にクローニングされたオリ ゴヌクレオチドＧＡ₂ＧＡ₂ＧＡ₄ＧＴＧＡＣおよびＧＴ₄ＣＴ₂ＣＴ₂ＣＴＧＣＡ； ｐＴ１０−ＫＳ／ｐＡ１０−ＫＳ（挿入部の２つの配向が得られた）、ｐＴ１０ ＵＶ５：ｌａｃ ＵＶ５ 大腸菌プロモーターがＥｃｏＲＩ部位にクローニングさ れたｐＵＣ１８誘導体のＢａｍＨＩ部位にクローニングされたオリゴヌクレオチ ドＧＡＴＣＣＡ₁₀ＧおよびＧＡＴＣＣＴ₁₀Ｇ（Jeppesen，et al.，Nucleic Acid s Res.，1988，16，9545）。 実施例１１８ ＰＮＡの生物学的安定性 ＰＮＡコンジュゲート（１０μｇ）および対照である「正常」ペプチド（１０ μｇ）の４０μｌの５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.４中混合物を種々の量の 豚の腸粘膜からのペプチダーゼまたはストレプトマイセス・カエスピトススから のプロテアーゼで３７℃において１０分間にわたり処理する。ＰＮＡおよびペプ チドの量はＨＰＬＣ分析（逆相Ｃ−１８カラム：０−６０％アセトニトリル、０ .１％トリフルオロ酢酸または他の適当な溶媒系）により測定される。 実施例１１９ 遺伝子発現の阻害 ペプチド核酸がパピローマウイルスのＥ２ ｍＲＮＡの発現を阻害する能力を 試験するための好適な検定は、文献に記載されているＥ２のトランス−活性化性 質に基づいている。Spalholtz，et al.，J．Virol.，1987，61，2128-2137。レ ポータープラスミド（Ｅ２ＲＥＣＡＴ）はＥ２依存性エンハンサーとして機能す るＥ２応答要素を含有するように構成される。Ｅ２ＲＥＣＡＴはまたＳＶ４０初 期プロモーター、初期ポリアデニル化信号、およびクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）も含有する。このプラスミドに関しては 、Ｃ ＡＴ発現はＥ２の発現に依存する。Ｅ２の存在に対するＣＡＴ発現の依存性は、 ＢＰＶ−１により形質転換されたＣ１２７細胞、未感染Ｃ１２７細胞並びにＥ２ ＲＥＣＡＴおよびＥ２発現ベクターで同時形質転換されたＣ１２７細胞にこのプ ラスミドをトランスフェクションすることにより試験される。 Ａ.ＢＰＶ−１ Ｅ２発現の阻害 ＢＰＶ−１形質転換されたＣ１２７細胞を１２ウェルプレート中に播種する。 Ｅ２ＲＥ１を用いるトランスフェクションの２４時間前に、相補ＰＮＡコンジュ ゲートの成長培地への５、１５および３０ｍＭの最終濃度における添加により細 胞を予備処理する。翌日に細胞を１０μｇのＥ２ＲＥＣＡＴを用いて燐酸カルシ ウム沈澱によりトランスフェクションする。１０μｇのＥ２ＲＥＣＡＴおよび１ ０μｇの担体ＤＮＡ（ＰＵＣ１９）を２５０μｌの最終容量のＨ₂Ｏ中の６２μ ｌの２Ｍ ＣａＣｌ₂と混合し、次に２５０μｌの２×ＨＢＳＰ（１.５ｍＭ Ｎａ₂ ＰＯ₂、１０ｍＭ ＫＣｌ、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１２ｍＭ グルコースおよび ５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７.０）を添加し、そして室温において３０分間にわ たりインキュベートする。１００μｌのこの溶液を各々の試験ウェルに加えそし て３７℃において４時間にわたりそのままインキュベートする。インキュベーシ ョン後に、１分間にわたり室温において０.７５ｍＭ Ｎａ₂ＰＯ₂、５ｍＭ ＫＣ ｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ グルコースおよび２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐ Ｈ７.０中の１５％グリセロールを用いて細胞にグリセロールショックを与える 。ショック後に、細胞を血清を含まないＤＭＥＭで２回洗浄しそして１０％の胎 牛血清を含有するＤＭＥＭおよび初期濃度のオリゴヌクレオチドを含有するＤＭ ＥＭを再供給する。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を回収しそして ＣＡＴ活性に関して評価する。 ＣＡＴ活性の測定のために、細胞を燐酸塩緩衝食塩水で２回洗浄しそして剥が して集める。細胞を１００μｌの２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０の中に 再懸濁させそして３回の凍結−解凍により粉砕する。２４マイクロリットルの細 胞抽出物を各々の検定用に使用する。各々の検定のために下記のものを１.５ｍ ｌエッペンドルフ管の中で一緒に混合しそして３７℃において１時間にわたりイ ンキュベートする：２５μｌの細胞抽出物、５ｕｌの４ｍＭアセチルコエンザイ ム Ａ、１８μｌのＨ₂Ｏおよび１μｌの¹⁴Ｃ−クロラムフェニコール、４０−６０ ｍＣｉ／ｍＭ。インキュベーション後に、クロラムフェニコール（アセチル化形 態および非アセチル化形態）を酢酸エチルで抽出しそして蒸発乾固する。サンプ ルを２５μｌの酢酸エチル中に再懸濁させ、ＴＬＣプレートの上にスポットしそ してクロロホルム：メタノール（１９：１）中でクロマトグラフィーにかける。 クロマトグラフィーをオートラジオグラフィにより分析する。アセチル化および 非アセチル化¹⁴Ｃ−クロラムフェニコールに相当するスポットをＴＬＣプレート から切りとりそしてＣＡＴ活性の定量化のために液体シンチレーションにより計 数する。ＣＡＴ活性を用量依存方式で抑制するペプチド核酸は陽性であると考え られる。 Ｂ.ＨＰＶ Ｅ２ 発現の阻害 ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ２のペプチド核酸による阻害に関する検 定はＢＰＶ−１ Ｅ２に関するものと本質的に同じである。ＨＰＶ検定に関して は、適当なＨＰＶをＣＶ−１またはＡ４３１細胞中にＰＳＶ２ＮＥＯを用いて上 記の燐酸カルシウム方法を使用してトランスフェクションする。抗生物質Ｇ４１ ８を含有する培地の中でインキュベートすることによりＤＮＡを取り込む細胞が 選択される。Ｇ４１８−耐性細胞を次にＨＰＶ ＤＮＡおよびＲＮＡに関して分 析する。Ｅ２を発現する細胞が相補試験用の標的細胞として使用される。各々の ＰＮＡに関して、細胞を上記の通りに予備処理し、Ｅ２ＲＥ１ＣＡＴを用いてト ランスフェクションし、そして上記の通りにＣＡＴ活性に関して分析する。ペプ チド核酸コンジュゲートが用量依存方式でＣＡＴ活性を抑制できるなら、それら は陽性効果を有すると考えられる。 実施例１２０ ヨード化工程 結合されたコンジュゲートを有する５μｇ部分のＰＮＡを４０μｌの１００ｍ Ｍ 燐酸Ｎａ、ｐＨ７.０の中に溶解し、そして１ｍＣｉ Ｎａ¹²⁵Ｉおよび２μｌ のクロラミン−Ｔ（５０ｍＭ、ＣＨ₃ＣＮ）を加える。溶液を２０℃において１ ０分間にわたり放置しそして次に０.５＋５ｃｍのセファデックスＧ１０カラム 中に通す。放射活性を含有する最初の２つの画分（各々１００μｌ）を集めそし てＨ₂ Ｏ中０.１％ＣＦ₃ＣＯＯＨ中の０−６０％ＣＨ₃ＣＮ勾配または他の適当な溶媒 系を使用するＨＰＬＣ：逆相Ｃ−１８により精製する。¹²⁵Ｉ−ＰＮＡがＰＮＡ ピーク直後に溶離する。溶媒を減圧下で除去する。 実施例１２１ 突然変異体β−アミロイド前駆体蛋白質遺伝子発現（βＡＰＰ）の検出 β−アミロイドをコードする遺伝子中の点突然変異は家族性アルツハイマー病 （ＦＡＤ）に関連することが示唆されている。ＰＮＡオリゴマーを合成後にフル オレセインまたは上記のような他の蛍光タグで標識する。或いは、オリゴマーを オリゴマー合成の前または後に他のレポーター分子で標識することもできる。標 識されたＰＮＡオリゴマーを特異的なハイブリダイゼーションが起こりうる条件 下で異常なβＡＰＰ発現の疑いがある組織または細胞サンプルと接触させ、そし てサンプルを洗浄して結合されていないＰＮＡオリゴマーを除去する。サンプル 中に残っている標識は結合されたオリゴヌクレオチドを示し、蛍光定量計、蛍光 顕微鏡または他の一般的手段を使用して定量化する。 βＡＰＰ遺伝子中の点突然変異を発現する疑いのある組織または細胞サンプル を、βＡＰＰ ｍＲＮＡの突然変異体コドン７１７、コドン６７０またはコドン ６７１を標的とするフルオレセイン標識ＰＮＡオリゴマーと共にインキュベート する。細胞または組織の同一サンプルを、正常なβＡＰＰ ｍＲＮＡの同じ領域 を標的とする第二の標識ＰＮＡオリゴマーと共に特異的なハイブリダイゼーショ ンが起こりうる条件下でインキュベートし、そしてサンプルを洗浄して結合され ていないＰＮＡオリゴマーを除去する。サンプル中に残る標識は結合されたＰＮ Ａオリゴマーを示し、蛍光計または他の一般的手段を使用して定量化することが できる。第一のサンプルが標識ＰＮＡオリゴマーと結合しそして第二のサンプル が蛍光標識と結合しない場合には突然変異体βＡＰＰの存在が示される。 二重標識をＰＮＡオリゴマーおよび本発明の方法と共に使用して、突然変異体 βＡＰＰの発現を特異的に検出することもできる。１個の組織サンプルを、突然 変異体βＡＰＰ ｍＲＮＡのコドン７１７、コドン６７０またはコドン６７１を 標的とするローダミン−標識ＰＮＡオリゴマーおよびβＡＰＰ ｍＲＮＡの翻訳 開始部位を標的とするフルオレセイン−標識ＰＮＡオリゴマーと共に、特異的な ハイ ブリダイゼーションが起こりうる条件下でインキュベートする。サンプルを洗浄 して結合していないＰＮＡオリゴマーを除去し、そして標識を適当なフィルター を用いて蛍光定量計により検出する。サンプルがローダミン−標識ＰＮＡオリゴ マーと結合しないがフルオレセイン標識を保有する場合には突然変異体βＡＰＰ の存在が示される。 実施例１２２ 突然変異体Ｈ−ｒａｓ遺伝子発現の検出 Ｈ−ｒａｓ遺伝子中の点突然変異はＲａｓ経路の多数の異状に関連することが 示唆されている。ＰＮＡオリゴマーを合成後にフルオレセインまたは上記の他の 蛍光タグで標識する。或いは、オリゴマーをオリゴマー合成の前または後に他の レポーター分子で標識することもできる。標識されたＰＮＡオリゴマーを特異的 なハイブリダイゼーションが起こりうる条件下で異常なｒａｓ発現の疑いがある 組織または細胞サンプルと接触させ、そしてサンプルを洗浄して結合されていな いＰＮＡオリゴマーを除去する。サンプル中に残っている標識は結合されたＰＮ Ａオリゴマーを示し、そして蛍光定量計、蛍光顕微鏡または他の一般的手段を使 用して定量化する。 Ｈ−ｒａｓ遺伝子中の点突然変異を発現する疑いのある組織または細胞サンプ ルを、Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡの突然変異体コドン１２、コドン１３またはコドン ６１を標的とするフルオレセインで標識されたＰＮＡオリゴマーと共にインキュ ベートする。細胞または組織の同一サンプルを、正常なＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡの 同じ領域を標的とする第二の標識ＰＮＡオリゴマーと共に特異的なハイブリダイ ゼーションが起こりうる条件下でインキュベートし、そしてサンプルを洗浄して 結合されていないＰＮＡオリゴマーを除去する。サンプル中に残っている標識は 結合されたＰＮＡオリゴマーを示し、そして蛍光定量計または他の一般的手段を 使用して定量化することができる。第一のサンプルが標識ＰＮＡオリゴマーと結 合しそして第二のサンプルが蛍光標識と結合しない場合には突然変異体Ｈ−ｒａ ｓの存在が示される。 二重標識をＰＮＡオリゴマーおよび本発明の方法と共に使用して突然変異体ｒ ａｓの発現を特異的に検出することもできる。１個の組織サンプルを、突然変異 体Ｈ−ｒａｓ ｍＲＮＡのコドン１２、コドン１３またはコドン６１を標的とす るローダミン−標識ＰＮＡオリゴマーおよびｒａｓ ｍＲＮＡの翻訳開始部位を 標的とするフルオレセイン−標識ＰＮＡオリゴマーと共に、特異的なハイブリダ イゼーションが起こりうる条件下でインキュベートする。サンプルを洗浄して結 合していないＰＮＡオリゴマーを除去し、そして標識を適当なフィルターを用い て蛍光定量計により検出する。サンプルがローダミン−標識ＰＮＡオリゴマーと 結合しないがフルオレセイン標識を保有する場合には突然変異体ｒａｓの存在が 示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｄ 487/22 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 1/13 Ｃ０７Ｋ 1/13 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 エグホルム，ミカエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，レキシントン・リッジ・ド ライブ 1231 (72)発明者 ニールセン，ペーター デンマーク王国デーコー−2980 コーデダ ル，イェルテヴァンゲット 509 (72)発明者 エグホルム，ミカエル アメリカ合衆国マサチューセッツ州02173, レキシントン，レキシントン・リッジ・ド ライブ 1231 (72)発明者 ブシャート，オレ デンマーク王国デーコー−3500 ベルラー ゼ，サナーゴールスヴェイ 73 (72)発明者 ソンネシセン，ソレン・ホルスト デンマーク王国デーコー−2630 タストラ ップ，グロンホイゴールスベイ 13 (72)発明者 ローゼ，イェスペル デンマーク王国デーコー−2400 コペンハ ーゲン エヌ，スタエレヴェイ 52，２テ ーヴェー (72)発明者 マノハラン，ムシアー アメリカ合衆国カリフォルニア州92009, カールズバッド，レポサド・ドライブ 7634 (72)発明者 キーリー，ジョン アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，コルテ・ファシル 4230 (72)発明者 グリフィス，マイケル アメリカ合衆国カリフォルニア州92130, サン・ディエゴ，カーメル・ランディング 3686 (72)発明者 スプランクル，ケリー アメリカ合衆国カリフォルニア州92083, ヴィスタ，シカモア・アベニュー 920, アパートメント 61

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ペプチド核酸を含むペプチド核酸コンジュゲートであって； 前記ペプチド核酸は主鎖を有し； 前記主鎖は、アミノ末端、カルボキシル末端、および複数のアミノ基を有し； 前記アミノ基はそれぞれテザーされた核塩基を有し；かつ 前記ペプチド核酸にコンジュゲートが直接または連結部分を介して結合している ことを特徴とする、ペプチド核酸コンジュゲート。 ２．前記コンジュゲートが前記連結部分を介して、前記主鎖、前記テザー、また は前記核塩基の少なくとも１つに結合している、請求項１記載のペプチド核酸コ ンジュゲート。 ３．前記コンジュゲートが前記主鎖に結合している、請求項１記載のペプチド核 酸コンジュゲート。 ４．前記コンジュゲートが前記主鎖の前記アミノ末端または前記カルボキシル末 端の少なくとも１つに結合している、請求項３記載のペプチド核酸コンジュゲー ト。 ５．前記コンジュゲートが前記核塩基または前記テザーに結合している、請求項 １記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ６．前記コンジュゲートが、レポーター酵素、レポーター分子、ステロイド、炭 水化物、テルペン、ペプチド、蛋白質、芳香族親油性分子、非芳香族親油性分子 、リン脂質、インターカレーター、細胞レセプター結合分子、架橋剤、水溶性ビ タミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂複合体、金属キレーター、ポルフ ィリン、アルキレーター、または高分子アミン、高分子グリコールおよびポリエ ーテルから選択される高分子化合物である、請求項１記載のペプチド核酸コンジ ュゲート。 ７．次式： ［式中： ｍは１から約５０の整数であり； ＬおよびＬｍは、独立して、Ｒ¹²（Ｒ¹³）_aであり；ここで Ｒ¹²は、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に生ずる核塩基、 天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター、核塩基結合基 、複素環部分、レポーターリガンド、またはコンジュゲートであり； ただし、Ｒ¹²の少なくとも１つは、天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基 、ＤＮＡインターカレーター、または核塩基結合基であり； Ｒ¹³はコンジュゲートであり；および ａは０または１であり； ＣおよびＣｍは、独立して、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり；ここで Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立して、水素、天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖、（Ｃ₂ −Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁ −Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、コンジュゲート、ＮＲ³Ｒ⁴、 ＳＲ⁶であり、あるいはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環系または複素環系を完 成し； 式中、Ｒ⁵は、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ−、 アルコキシ−、またはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル；および Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒ ドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アル キル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオまたはアミノであり； ＤおよびＤｍは、独立して、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、式中、ｙ＋ｚの合 計は２より大きく１０以下であり； Ｇｍは、独立して、いずれの向きでもよい−ＮＲ³ＣＯ−、−ＮＲ³ＣＳ−、−Ｎ Ｒ³ＳＯ−、または−ＮＲ³ＳＯ₂−であり； Ａ−ＡｍおよびＢ−Ｂｍのそれぞれの対は： （ａ）ＡまたはＡｍは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の基であり、 かつＢまたはＢｍはＮまたはＲ³Ｎ＋であり；または （ｂ）ＡまたはＡｍは式（ＩＩｄ）の基であり、かつＢまたはＢｍはＣＨである ように選択され； 式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑのそれぞれは、０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０ 以下であり； ｒおよびｓのそれぞれは、０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０ 以下であり； Ｒ¹およびＲ²は、独立して、水素、(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ−置換（Ｃ₁ −Ｃ₄）アルキル、アルコキシ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、アルキルチオ−置 換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、ハ ロゲンまたはコンジュゲートであり； Ｉは、−ＮＲ⁸Ｒ⁹または−ＮＲ¹⁰Ｃ（Ｏ）Ｒ¹¹であり；ここで Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹は、独立して、水素、アルキル、アミノ保護基、レポ ーターリガンド、インターカレーター、キレーター、ペプチド、蛋白質、炭水化 物、脂質、ステロイド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ヌクレオチド二リン酸、 ヌクレオチド三リン酸、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、溶解性ポリ マー、非溶解性ポリマーまたはコンジュゲートであり； Ｑは、−ＣＯ₂Ｈ、−ＣＯ₂Ｒ⁸、−ＣＯ₂Ｒ⁹、−ＣＯＮＲ⁸Ｒ⁹、−ＳＯ₃Ｈ、−Ｓ Ｏ₂ＮＲ¹⁰Ｒ¹¹または−ＣＯ₂Ｈもしくは−ＳＯ₃Ｈの活性化誘導体であり；かつ 式中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰、Ｒ¹¹、Ｒ¹²およ びＲ¹³の少なくとも１つはコンジュゲートであり、前記コンジュゲートは、レポ ーター酵素、レポーター分子、ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋 白質、芳香族親油性分子、非芳香族親油性分子、リン脂質、インターカレーター 、細胞レセプター結合分子、架橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ ／ＤＮＡ開裂複合体、金属キレーター、ポルフィリン、アルキレーター、または 高分子アミン、高分子グリコールおよびポリエーテルから選択される高分子化合 物であり；かつ 式中、前記コンジュゲートは任意に連結部分を含んでいてもよい］ のペプチド核酸コンジュゲート。 ８．前記コンジュゲートが連結部分を含む、請求項７記載のペプチド核酸コンジ ュゲート。 ９．基Ｒ¹²の少なくとも１つがコンジュゲートである、請求項７記載のペブチド 核酸コンジュゲート。 １０．基Ｒ¹³の少なくとも１つがコンジュゲートである、請求項７記載のペプチ ド核酸コンジュゲート。 １１．Ｒ¹、Ｒ²またはＲ³の少なくとも１つがコンジュゲートである、請求項７ 記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １２．前記Ａ−Ａｍ基の少なくとも１つがＲ¹、Ｒ²およびＲ³の少なくとも１つ を含む、請求項１１記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １３．前記Ｂ−Ｂｍ基または前記Ｇ−Ｇｍ基の少なくとも１つが基Ｒ³の少なく とも１つを含む、請求項１１記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １４．Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹の少なくとも１つがコンジュゲートである、請 求項７記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １５．前記基ＱまたはＩの少なくとも１つが基Ｒ⁸、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹の少な くとも１つを含む、請求項１４記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １６．Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の少なくとも１つがコンジュゲートである 、請求項７記載のペプチド核酸コンジュゲート。 １７．前記基Ｄ−ＤｍまたはＣ−Ｃｍの少なくとも１つがＲ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶お よびＲ⁷の少なくとも１つを含む、請求項１６記載のペプチド核酸コンジュゲー ト。 １８．ｍが１から約２００である、請求項７記載のペプチド核酸コンジュゲート 。 １９．ｍが１から約５０である、請求項７記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ２０．ｍが１から約２０である、請求項７記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ２１．次式のいずれか： ［式中： Ｌは、Ｒ¹²（Ｒ¹³）_aであり；ここで Ｒ¹²は、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に生ずる核塩基、 天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター、核塩基結合基 、複素環部分、レポーターリガンド、またはコンジュゲートであり、Ｒ¹²の少な くとも１つは、天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、ＤＮＡインターカ レーター、または核塩基結合基であり； Ｒ¹³は、コンジュゲートであり；および ａは、０または１であり； ＡおよびＢは： （ａ）Ａは式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）または（ＩＩｃ）の基であり、かつＢはＮ またはＲ³Ｎ＋であり；または （ｂ）Ａは式（ＩＩｄ）の基であり、かつＢはＣＨであり； 式中： Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、ＮＲ³、ＣＨ₂またはＣ（ＣＨ₃）₂であり； Ｙは、単結合、Ｏ、ＳまたはＮＲ⁴であり； ｐおよびｑは、独立して、０または１から５の整数であり、ｐ＋ｑの合計は１０ 以下であり； ｒおよびｓは、独立して、０または１から５の整数であり、ｒ＋ｓの合計は１０ 以下であり； Ｒ¹およびＲ²は、独立して、水素、(Ｃ₁−Ｃ₄)アルキル、ヒドロキシ−置換(Ｃ₁ −Ｃ₄)アルキル、アルコキシ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、アルキルチオ−置換 （Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオ、アミノ、ハロ ゲンまたはコンジュゲートであり； Ｃは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり； Ｄは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり；ここで Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立して、水素、天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖、（Ｃ₂ −Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁ −Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、コンジュゲート、ＮＲ³Ｒ⁴お よびＳＲ⁵であり、またはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環系または複素環系を 完成し； Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒ ドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アル キル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオまたはアミノであり；および Ｒ⁵は、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ−、アルコ キシ−、もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は２ より大きく１０以下であり； Ｅは、独立して、ＣＯＯＨ、ＣＳＯＨ、ＳＯＯＨ、ＳＯ２ＯＨまたはそれらの活 性化もしくは保護誘導体であり； Ｆは、独立して、ＮＨＲ³またはＮＰｇＲ³（ここでＰｇはアミノ保護基である） であり；および Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ¹²およびＲ¹³の少なくとも１つはコン ジュゲートであり、前記コンジュゲートは、レポーター酵素、レポーター分子、 ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋白質、芳香族親油性分子、非芳 香族親油性分子、リン脂質、インターカレーター、細胞レセプター結合分子、架 橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂複合体、金属キレ ーター、ポルフィリン、アルキレーター、高分子アミン、高分子グリコールおよ びポリエーテルから選択されるまたは高分子化合物であり；および 式中、前記コンジュゲートは任意に連結部分を含んでいてもよい］ を有する化合物。 ２２．前記コンジュゲートが連結部分を含む、請求項２１記載のペプチド核酸コ ンジュゲート。 ２３．Ｒ¹²がコンジュゲートである、請求項２１記載のペプチド核酸コンジュゲ ート。 ２４．Ｒ¹³がコンジュゲートである、請求項２１記載のペプチド核酸コンジュゲ ート。 ２５．基Ｒ³の少なくとも１つがコンジュゲートである、請求項２１記載のペプ チド核酸コンジュゲート。 ２６．前記基Ａまたは前記基Ｂの少なくとも１つがコンジュゲートを含む、請求 項２１記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ２７．基Ｒ¹または基Ｒ²の少なくとも１つがコンジュゲートである、請求項２１ 記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ２８．Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷の少なくとも１つがコンジュゲートであ る、請求項２１記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ２９．前記基Ｃまたは前記基Ｄの少なくとも１つがコンジュゲートを含む、請求 項２１記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ３０．複数のＰＮＡモノマーを含むペブチド核酸コンジュゲートであって、前記 ＰＮＡモノマーの少なくとも１つが式： または式： または式： ［式中、 Ｌは、Ｒ¹²（Ｒ¹³）_aであり；ここで Ｒ¹²は、水素、ヒドロキシ、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルカノイル、天然に生ずる核塩基、 天然に生じない核塩基、芳香族部分、ＤＮＡインターカレーター、核塩基結合基 、 複素環部分、レポーターリガンド、またはコンジュゲートであり、かつＲ¹²の少 なくとも１つは、天然に生ずる核塩基、天然に生じない核塩基、ＤＮＡインター カレーター、または核塩基結合基であり； Ｒ¹³はコンジュゲートであり；および ａは０または１であり； Ｋは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_zであり； Ｊは、（ＣＲ⁶Ｒ⁷）_yであり；ここで Ｒ⁶およびＲ⁷は、独立して、水素、天然に生ずるアルファアミノ酸の側鎖、（Ｃ₂ −Ｃ₆）アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヒドロキシ、（Ｃ₁ −Ｃ₆）アルコキシ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルチオ、コンジュゲート、ＮＲ³Ｒ⁴お よびＳＲ⁵であり、またはＲ⁶およびＲ⁷は一緒になって脂環系または複素環系を 完成し； Ｒ³およびＲ⁴は、独立して、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₄）アルキル、ヒ ドロキシ−もしくはアルコキシ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₄）アル キル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルチオまたはアミノであり； Ｒ⁵は、水素、コンジュゲート、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ヒドロキシ−、アルコ キシ−もしくはアルキルチオ−置換（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり； ｙおよびｚのそれぞれは、０または１から１０の整数であり、ｙ＋ｚの合計は２ より大きく１０以下であり； ｌは１から５の整数であり；および Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ¹²およびＲ¹³の少なくとも１つはコン ジュゲートであり、前記コンジュゲートは、レポーター酵素、レポーター分子、 ステロイド、炭水化物、テルペン、ペプチド、蛋白質、芳香族親油性分子、非芳 香族親油性分子、リン脂質、インターカレーター、細胞レセプター結合分子、架 橋剤、水溶性ビタミン、脂溶性ビタミン、ＲＮＡ／ＤＮＡ開裂複合体、金属キレ ーター、ポルフィリン、アルキレーター、または高分子アミン、高分子グリコー ルおよびポリエーテルから選択される高分子化合物であり；および 式中、コンジュゲートは任意に連結部分を含んでいてもよい］ のものである、ペプチド核酸コンジュゲート。 ３１．前記コンジュゲートが連結部分を含む、請求項３０記載のペブチド核酸コ ンジュゲート。 ３２．Ｒ¹²がコンジュゲートである、請求項３０記載のペプチド核酸コンジュゲ ート。 ３３．Ｒ¹³がコンジュゲートである、請求項３０記載のペプチド核酸コンジュゲ ート。 ３４．Ｒ³、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、およびＲ⁷の少なくとも１つがコンジュゲートであ る、請求項３０記載のペプチド核酸コンジュゲート。 ３５．前記基Ｋまたは前記基Ｊの少なくとも１つがコンジュゲートを含む、請求 項３０記載のペプチド核酸コンジュケート。 ３６．前記基Ｒ³がコンジュゲートである、請求項３０記載のペプチド核酸コン ジュゲート。