JPH10503195A - 出血性疾患の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、またはＣＮＴＦのごときサイトカインを投与することによるフォン・ウィレブランド病（ｖＷＤ）の治療方法が、本発明によって提供される。一般的には、本発明は、出血性疾患の新規治療方法に関し、より詳細には、フォン・ウィレブランド病（von Willebrand Disease）（ｖＷＤ）、血友病Ａ、および***、硬変、先天性血小板欠損症、先天性ならびに後天性貯蔵プール欠乏症のごとき種々の止血障害、出血時間が説明がつかないほど長い患者の治療、ならびに手術前の予防的処置に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 出血性疾患の治療方法 発明の分野 本発明は、一般的には、出血性疾患の新規治療方法に関し、より詳細には、フ ォン・ウィレブランド病（von Willebrand Disease）（ｖＷＤ）、血友病Ａ、お よび***、硬変、先天性血小板欠損症、先天性ならびに後天性貯蔵プール欠乏 症のごとき種々の止血障害、出血時間が説明がつかないほど長い患者の治療、な らびに手術前の予防的処置に関する。 発明の背景 フォン・ウィレブランド病（ｖＷＤ）、血友病Ａのごとき血液凝固障害、およ び***、硬変、先天性血小板欠損症、先天性ならびに後天性貯蔵プール欠乏症 のごとき種々の止血障害の患者、および出血時間が説明がつかないほど長い患者 は、血漿誘導体で治療された場合、ウイルス感染の危険にさらされる。おだやか な形態のこれらの疾患にかかっている患者であって、通常は血液製剤の補給を必 要としない患者でさえも、外科的処置が行われる場合にはこれらの危険にさらさ れる。 フォン・ウィレブランド因子（ｖＷＦ）は異種多量体血漿糖蛋白であり（ジン マーマン ティー・エス（Zimmerman TS）、ロバーツ ジェイ（Roberts J）、 エジントン ティー・エス（Edgington TS）：ファクターVIII−リレイテッド・ アンチジェン：マルチプル・モレキュラー・フォームズ・イン・ヒューマン・プ ラズマ（Factor Vlll-related antigen:multiple molecular forms in human pl asma）、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン シズ・ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci USA）第７２巻：５１２１頁、１９７ ５年；ホイヤー エル・ダブリュ（Hoyer LW）、シャイノフ ジェイ・アール（ Shainoff JR）：ファクターVIII−リレイテッド・プロテイン・サーキュ レイツ・イン・ノーマル・ヒューマン・プラズマ・アズ・ハイ・モレキュラー・ ウェイト・マルチマーズ（Factor VIII-related protein circulates in normal human plasma as high molecular weight multimers）、ブラッド（Blood）第 ５５巻：１０５６頁、１９８０年）、血小板付着において重要な役割を果たして おり（サカリアッセン ケイ・エス（Sakariassen KS）、ボルフイス ピー・エ イ（Bolhuis PA）、シクスマ ジェイ・ジェイ（Sixma JJ）：ヒューマン・ブラ ッド・プラテレット・アドヒジョン・トゥ・アーテリー・サブエンドセリウム・ イズ・メディエイテッド・バイ・ファクターVIII／フォン・ウィレブランド・フ ァクター・バウンド・トゥ・ザ・サブエンドセリウム（Human blood platelet a dhesion to artery subendothelium is mediated by factor VIII/von Willebra nd factor bound to the subendothelium）、ネイチャー（Nature）第２７９巻 ：６３６頁、１９７９年；ステール エイチ・ブイ（Stel HV），サカリアッセ ン ケイ・エス、デ・グロート ピー・ジー（de Groot PG）ら：フォン・ウィ レブランド・ファクター・イン・ザ・ベッセル・ウォール・メディエイツ・プラ テレット・アドヘレンス（von Willebrand factor in the vessel wall mediate s platelet adherence）、ブラッド第６５巻：８５頁、１９８５年；ツリット ブイ・ティー（Turitto VT）、ウェイス エイチ・ジェイ（Weiss HJ）、ジンマ ーマン ティー・エスら：ファクターVIII／フォン・ウィレブランド・ファクタ ー・イン・サブエンドセリウム・メディエイツ・プラテレット・アドヒジョン（ Factor VIII/von Willebrand factor in subendothelium mediates platelet ad hesion）、ブラッド第６５巻：６２３頁、１９８５年）、因子VIIIに対する血漿 結合（キャリア）蛋白としても機能する。 ｖＷＦ欠乏症は２つの結果を招く。それらは、血小板機能不全および因子VIII 濃度低下である。ｖＷＦの濃度あるいは多量体パターンのいずれかが異常である フォン・ウィレブランド病（ｖＷＤ）において、共通した遺伝的出血性疾患は血 小板機能不全に関連した粘膜皮膚出血であり、これが主要な臨床的特徴である。 大部分のありふれた形態のｖＷＤ（Ｉ型）において、患者は、正常多量体パター ンを伴う血漿ｖＷＦの軽度ないし中程度の減少がみられる。他の形態のｖＷＤは 、 重度のｖＷＦ欠乏症により、あるいは電気泳動により正常パターンと識別できる 異常な多量体パターンにより特徴づけられる。 マヌッチ（Mannucci）、ブラッド（Blood）第７２巻（５）：１４４９〜１４ ５５頁（１９８８年）には、先天性ならびに後天性出血性疾患の輸血によらない 形態の治療が記載されており、そこでは、抗利尿性ホルモンＬ−アルギニンバソ プレッシンの合成アナログであるデスモプレッシン（１−デスアミノ−８−Ｄ− アルギニンバソプレッシン；ＤＤＡＶＰ）が一時的に因子VIII凝血活性およびヴ ォン・ウィレブランド因子の循環レベルを上昇させ、そのことにより、Ｉ型ｖＷ Ｄ患者の長い出血時間を短縮する。ＤＤＡＶＰは、軽度および中程度の血友病お よびフォン・ウィレブランド病の輸血によらない形態の治療法として確立された 。これらの知見の最初の臨床的適用は１９７７年に公表された。マヌッチら、ザ ・ランセット・リミテッド（The Lancet Ltd），８６９〜８７２頁（１９７７年 ４月２３日）。アドレナリン、バソプレッシン、およびインスリンのごとき化合 物の使用のような他の治療法はすべて、血友病ＡおよびｖＷＤの患者のみならず 健康な志願者において内在性の因子VIIIおよびフォン・ウィレブランド因子の短 期間の増加を誘導することができる。ＤＤＡＶＰは、因子VIII軽度欠乏（血友病 Ａ）の患者における小規模な出血の治療において効果的であることが示されてい るだけでなく、***のために血小板機能不全になっている患者の出血時間の改 善能が示されている。これらの症状のすべてにおいて、ＤＤＡＶＰは、血管内皮 細胞からのｖＷＦ貯蔵プールの放出を刺激することにより血漿ｖＷＦ濃度を一時 的に増加させると考えられている。ｖＷＦに対する効果の持続時間が短いこと（ 約１２時間）およびタキフィラキシー（繰り返し投与に伴う応答低下）として知 られる現象により、ＤＤＡＶＰの臨床的使用は制限されている。 発達のマーカーとしてｖＷＦ合成を用いる巨核細胞の成熟のアッセイを説明し たグリーンバーグ（Grenberg）らの記載（イクスペリメンタル・ヘマトロジー（ Exp.Hematol.）第１９巻：５３〜５８頁（１９９１年））は、一般的背景の上か ら本発明に対して重要である。 ホルジンガー（Holzinger）ら（イミュノロジー・レターズ（Immunology Letters）第３５巻：１０９〜１１８頁（１９９３年））はヒトのヘソの血管内 皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を研究した。ＩＦＮ−γまたはＩＬ−１の投与によりこれ らの細胞のｖＷＦ含量が減少することが見いだされた。内皮細胞はｖＷＦを産生 することができる。これらの単離された細胞を用いた場合、ＩＬ−１およびＩＦ Ｎ−γはｖＷＦ産生を阻害するが、研究使用した他のサイトカイン（ＩＬ−１、 ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ）は効果がなかった。 インビボでの研究（バーステイン（Burstein）ら、スロンボシス・アンド・ヘ モスタシス（Thrombosis and Haemostasis）第６９巻：７４９頁（１９９３年） ）は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）のイヌへの投与は、正常および血小板 減少症の動物における血小板数、血小板サイズおよび血漿フィブリノーゲンレベ ルを増大させたこと開示している。さらに彼らは、２ないし９日間のベースライ ンの２.７ないし３.６倍の範囲のｖＷＦレベルの増加、およびその後の正常化を 観察した。 モントゴメリー（Montgomery）、ヘモスタシス・アンド・スロンボシス：ベイ シック・プリンシプルズ・アンド・クリニカル・プラクティス（Hemostasis and Thrombosis:Basic Pronciples and Clinical Practice）、第７章、第３版、ペ ンシルベニア州フィラデルフィアのジェイ・ビー・リッピンコット（Lippincott ）社（１９９４年）は、ｖＷＤならびに治療形態についての要約を提供する。 当該分野において、出血性疾患等の治療における別の製品に対する必要性があ り続けている。 発明の簡単な概要 本発明は、一般的には、出血性疾患の新規治療方法に関し、より詳細には、フ ォン・ウィレブランド病（von Willebrand Disease）（ｖＷＤ）、血友病Ａ、お よび***、硬変、先天性血小板欠損症、先天性ならびに後天性貯蔵プール欠乏 症のごとき種々の止血障害、出血時間が説明がつかないほど長い患者の治療、な らびに手術前の予防的処置に関する。本発明の１の態様によれば、ＩＬ−１１、 ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、またはＣＮＴＦのごときサイトカインを医薬上許容 される担体中に入れて投与して上記疾患のいずれかを治療する。 発明の詳細な説明 ｖＷＤ、軽度の血友病Ａ、および***、硬変、先天性血小板欠損、先天性な らびに後天性貯蔵プール欠乏症において起こるような定性的な血小板欠損、出血 時間が説明がつかないほど長い患者の治療、ならびに手術前の予防的処置のため の、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、またはＣＮＴＦのごとき選択され たサイトカインの使用方法が本発明により提供される。本発明の１の方法は、Ｉ Ｌ−１１のごときサイトカインの投与を包含し、個体のベースラインレベルの２ 倍にまでｖＷＦを増加させることにおいて有用である。 インターロイキン１１（ＩＬ−１１）は、初期のリンパ造血前駆細胞を刺激し 、他の造血性増殖因子と相乗作用して巨核細胞の増殖および成熟を刺激する多面 発現性サイトカインである。ＩＬ−１１は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８０ ３（１９９１年５月３０日公開）ならびに米国特許第５,２１５,８９５号（１９ ９３年６月１日交付）において詳細に記載されている。クローン化されたヒト・ ＩＬ−１１は、１９９０年３月３０日に、メリーランド州ロックビル、パークロ ーン・ドライブのＡＴＣＣにすでに寄託されており、ＡＴＣＣ番号は６８２８４ である。そのうえ、米国特許第５,２７０,１８１号（１９９３年１２月１４日交 付）および米国特許第５,２９２,６４６号（１９９４年３月８日交付）に記載さ れているように、ＩＬ−１１を、別の蛋白との融合蛋白として組み換え法により 製造することもできる。今や慣用的となった遺伝子工学的手法によってＩＬ−１ １を種々の宿主細胞において製造することができる。さらに、ＩＬ−１１を種々 の細胞系、例えば、ヒト・肺線維芽細胞系ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ １７１）およびポール（Paul）らのヒト・栄養膜細胞系ＴＰＡ３０−１（ＡＴＣ Ｃ受託番号ＣＲＬ１５８３）から得ることができる。ヒト・ＩＬ−１１をコード するｃＤＮＡならびにその推定アミノ酸配列（アミノ酸１〜１９９）がプロシー ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・ ユーエスエイ（Proc.Natl.Acad.Sci USA）第８７巻：７５１２頁（１９９０年） に記載されている。上記米国特許第５,２９２,６４６号には、ＩＬ−１１の成熟 形態（アミノ酸２２〜１９９）のＮ末端プロリンが除去されているデス−プロ（ des-Pro）形態のＩＬ−１１（アミノ酸２３〜１９９）が記載されている。当業 者に理解されるように、ＩＬ−１１活性を有するいかなる形態のＩＬ−１１であ っても本発明に有用である。 組み換え法以外にも、既知の慣用的化学合成によりＩＬ−１１を製造すること もできる。本発明において有用なポリペプチドを合成的手段により構築する方法 は当業者に知られている。合成的に構築されたサイトカインのポリペプチド配列 は、１次、２次、または３次構造および配置の特徴を天然のサイトカインポリペ プチドと共有することにより、それらに共通した生化学的活性を有すると予想さ れる。かかる合成的に構築されたサイトカインポリペプチド配列、あるいはその 機能をそっくりそのまま有しているかまたは一部有しているそのフラグメントを 本発明方法に用いてもよい。よって、本発明方法に有用な、天然の精製サイトカ インに対する生物学的に活性な置換物あるいは免疫学的置換物として、それらを 使用してもよい。 これらのサイトカインまたはその活性フラグメントの蛋白、ペプチドまたはＤ ＮＡ配列における修飾によっても、本発明方法において使用されうる蛋白を製造 することができる。既知方法を用いて、当業者はかかる修飾サイトカインを製造 することができる。サイトカイン配列、例えばＩＬ−１１配列において興味ある 修飾は、コーディング配列における１個またはそれ以上の選択アミノ酸の置換、 挿入または欠失を包含する。かかる置換、挿入または欠失のための突然変異法も 当業者に知られている（例えば、米国特許第４,５１８,５８４号参照）。 本明細書記載のように治療上有用でありうるサイトカインポリペプチドの配列 の他の特別な変異は、例えば、１個またはそれ以上のグリコシレーション部位の 挿入を包含する。ペプチド配列中へのアミノ酸の、あるいはＤＮＡ配列中へのヌ クレオチドの欠失、置換または付加により、アスパラギン結合グリコシレーショ ン認識部位を配列中に挿入することができる。Ｏ−結合炭水化物の付加により修 飾される分子のいずれの部位でかかる変更を行ってもよい。かかる変化したヌク レオチドまたはペプチド配列の発現により、それらの部位においてグリコシレー ションされていてもよい変種が得られる。 全体的にあるいは部分的にその活性を保持または延長し本発明において有用で あると考えられる、選択サイトカインの配列のさらなるアナログおよび誘導体を 、当業者はやはり容易に製造することができる。１のかかる修飾は、サイトカイ ン配列中に存在するリジン残基上へのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の結合 、またはＰＥＧもしくはＰＥＧ誘導体と反応しうる１個またはそれ以上のリジン 残基または他のアミノ酸残基のＰＥＧ部分の結合を可能にする慣用的方法による 配列中への挿入であってもよい。 これらの選択サイトカインのさらなるアナログを、それらをコードしているＤ ＮＡ配列におけるアリール変異、またはそれらをコードしているＤＮＡ配列にお いおて誘導された変異により特徴づけてもよい。上記参考刊行物において開示さ れたすべてのアナログ（厳密な条件下または厳密でない条件下（サムブルック（ Sambrook）ら、モレキュラー・クローニング.ア・ラボラトリー・マニュアル（M olecular Cloning. A Laboratory Manual）、第２版、コールド・スプリング・ ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク（Cold Spring Harbor Laboratory,New York）（１９８９年））において開示されたサイトカイン配列にハイブリダイゼ ーションしうるＤＮＡ配列により特徴づけられるアナログを含む）は、同様に本 発明において有用であろうと予想される。 １のサイトカインの配列またはその生物学的に活性のあるフラグメントをもう １つのサイトカインもしくは蛋白性治療薬に融合させることにより製造される融 合分子、例えばＩＬ−６に融合したＩＬ−１１もこれらの方法において有用と考 えられる（例えば、１９９２年３月１９日公開のＰＣＴ／ＵＳ９１／０６１８６ （ＷＯ９２／０４４５５）に記載され融合方法参照）。別法として、本発明方法 に従って、サイトカインの組み合わせを一緒に投与してもよい。 よって、本発明方法の説明において特別なサイトカインを名前により述べる場 合には、命名されたサイトカインは、すでに当該分野において開示されている配 列により生産される蛋白、ならびに上記修飾により特徴づけられた蛋白であって ｖＷＦレベルまたは血小板機能を回復させることにおいて実質的に同様の活性を やはり保持している蛋白を包含する。治療の進行をモニターするために標準的な 研究室的試験が用いられる。例えば、ｖＷＤに関する研究室的試験はモントゴメ リーらの上記文献の１４３頁に記載されており、参照により本明細書に記載され ているものと見なす。ｖＷＦレベルは、「正常なプールされた血漿」中に見いだ されるそのパーセンテージで表され、またはＵ／ｄＬ（正常なものは１００Ｕ／ ｄＬ、重度のｖＷＤは２５Ｕ／ｄＬと定義）で表される。 よって、本発明は、ｖＷＤまたは血小板機能不全の患者の治療を包含し、さら に医薬担体中の有効量の選択サイトカインの投与を包含する。好ましくは、処置 は予防的なものであるが、上記疾患に関連した症状の発生した場合のものであっ てもよい。 適当な医薬上許容される担体はＩＬ−１１の投与を容易にするものであり、当 該分野において知られている。典型的な担体は、滅菌セイライン、ラクトース、 スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストリン、寒天、ペクチン、ピ ーナッツ油、オリーブ油、ゴマ油、および水を包含する。さらに、担体または希 釈剤は、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのみ、あ るいはそれらとロウのごとき時間遅延材料を包含する。さらに、除放性ポリマー 処方を用いることもできる。適当な持続性放出マトリックスは、下記のもののう ち１種またはそれ以上と混合された活性成分を含有する：ソジウムベントナイト 、エチルセルロース、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、アジピン酸、フ マル酸、ポリエチレングリコール、脱アセチル化キチン、および酢酸セルロース 。適当な保存料および／または安定化剤が含まれていてもよい。 別法として、選択サイトカイン、例えば、ＩＬ−１１、ＩＬ−６、ＯＳＭ、Ｌ ＩＦまたはＣＮＴＦを、上記疾患に関連した症状の改善において有用な他の慣用 的薬剤、他の造血性増殖因子もしくはＤＤＡＶＰ、または低温型沈降物のごとき 血液製剤と組み合わせることもできる。適当な処方は、例えば、ＩＬ−１１の場 合には、ＩＬ−１１ ５ｍｇ、ヒスチジン ３．１０ｍｇおよびグリシン ２２.５ｍｇであり、例えば、１ｍＬの注射用滅菌水で復元できる凍結乾燥粉末 とする。当業者に明らかなように、本発明方法によれば他の適当な処方も同等に 効果的である。 理論に拘束されるのを望まず、本発明者らは、ｖＷＦ産生細胞、例えば、巨核 細胞および血管内皮細胞からのｖＷＦの合成および放出を促進することにより本 発明治療方法が有効になると確信する。 ｖＷＤの治療において、ＩＬ−１１をいずれかの適当な経路で投与することが できるが、好ましくは、全身的に、すなわち、非経口的に投与する。非経口的経 路のうち、皮下および静脈が好ましい。 予防的処置を含む、治療を行っている患者についての適当な治療規則は、患者 の年齢、性別、体重および全身的健康状態のごとき因子に基づいて、担当医によ り決定されうる。一般的には、サイトカイン、例えばＩＬ−１１の適当な用量は 、体重１ｋｇあたり１μｇから体重１ｋｇあたり１０００μｇ未満の広い範囲で ある。さらに適当な用量範囲は体重１ｋｇあたり１０μｇから体重１ｋｇあたり １００μｇの範囲てあり、より好ましくは、体重１ｋｇあたり１０μｇから体重 １ｋｇあたり５０μｇである。所望であれば、これらの用量をユニットに直すこ とができる。慣用的には、適当なアッセイ、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９０／０６８ ０３に記載されたＩＬ−１１に関するアッセイであるＴ１１６５アッセイにおけ る最大刺激の半分を生じるポリペプチド濃度としてユニットが説明される。１日 から６カ月の間、あるいは治療すべき疾病の性質に応じて担当医による標準的試 験により容易に確認されるように必要かつ安全である限り、投薬を毎日行っても よい。適当ならば、有効な投与規則に到達するまで、用量を上方または下方修正 してもよく、例えば、１週間のあいだ（あるいは指示された場合には、数週間ま たは何週間も）毎日２５μｇ／ｋｇの用量のＩＬ−１１の投与が必要な投与規則 の場合、かかる用量がｖＷＦ（または対応マーカー）レベルの上昇を引き起こす かどうかを決定するためのｖＷＦレベルの測定値によっては治療期間ならびにｖ ＷＦレベル（マーカーレベル）等の測定期間を延長し、かつ用量を２倍にしても よい。本発明において有用なサイトカインの既知毒性に基づけば、用量の調 節は十分に当業者の範囲内である。 下記実施例は本発明方法、詳細には、ｖＷＦレベルを上昇させることにおける ＩＬ−１１使用を説明する。しかしながら、本発明の範囲を限定するものではな い。 二重盲検、ランダム化試験において、組み換えヒト・インターロイキン１１（ ＮＥＵＭＥＧＡ^TMｒｈＩＬ−１１増殖因子）またはプラシーボを与えられた正常 成人志願者におけるフォン・ウィレブランド因子（ｖＷＦ）の血漿濃度を研究す る。６人の男性および６人の女性対象に、１日に体重１ｋｇあたり２５μｇ（ｍ ｃｇ／ｋｇ／ｄ）のＩＬ−１１または同体積のプラシーボのいずれかを１日１回 皮下注射する。ＩＬ−１１またはプラシーボでの処置を７日間継続する。ベース ライン（処置前日）、投与３日目および８日目（最後のＩＬ−１１またはプラシ ーボ投与からの日数）において血漿ｖＷＦ濃度およびｖＷＦ多量体組成を測定す る。プラシーボを与えられた対象の血漿ｖＷＦ濃度は研究期間中有意に変化しな い。対照的に、ＩＬ−１１を与えられた対象の平均血漿ｖＷＦ濃度はベースライ ンにおいて７９.５（標準偏差（ＳＤ）２２.３）であり、３日目には１１８.０ （ＳＤ ３３.８）、８日目には１５３.７（ＳＤ ３３.４）である（８日目に おける処理群間の相違についてｐ＝０.０２、８日目とベースラインとの間の相 違についてｐ＜０.０１）。ｖＷＦ多量体のパターンは、ＩＬ−１１およびプラ シーボ両群において正常である。いずれの群においても血小板数はベースライン を越えない。 患者 年齢１８ないし４０歳の１２人の正常成人（男性６人、女性６人）が研 究を構成する。対象は、その伸長に対して１０％の正常範囲であり、正常な血液 学的機能、腎機能および肝機能を有する。以下の患者は除外した（男女とも）： ・いずれかのイー・コリ（E.coli）の蛋白に対する感受性があることが知られて いる者； ・いずれかの薬剤に対して重いアレルギー反応を起こした経験のある者； ・現在治療を要する何らかの感染症にかかっている者； ・Ｂ型もしくはＣ型肝炎、またはＨＩＶ感染の証拠のある者； ・血管閉塞症を包含する、主要な器官系の疾患を有する者； ・薬剤またはアルコール乱用の経験のある者； ・研究開始前１週間以内に処方箋または市販の医薬を用いた者； ・研究開始前１カ月以内にコルチコステロイドまたはバルビタール酸塩を用いた 者； ・研究開始前２カ月以内に何らかの試験的な薬剤を用いた者； ・研究開始前１カ月以内に何らかのタバコ製品を用いた者； ・いずれかのホルモン形態の避妊薬を用いた者；あるいは ・いずれかの通常に乱用される薬剤に関する試験が陽性（尿または血液）である 者。 処置 対象をランダム化して、組み換えヒト・インターロイキン１１（ＮＥＵ ＭＥＧＡ^TMｒｈＩＬ−１１増殖因子）２５ｍｃｇ／ｋｇ／日または同体積のプラ シーボのいずかを１日１回皮下注射する。ＮＥＵＭＥＧＡ^TMｒｈＩＬ−１１は、 マサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge）のジェネティックス・インステ ィテュート,インコーポレイテッド（Genetics Institute,Inc.）により、イー・ コリ中で製造されている。処方用バッファー（２０ｍＭヒスチジン、３００ｍＭ グリシン）をプラシーボとして用いる。ジェネティックス・インスティテュート ,インコーポレイテッドの生物統計学者に対象をランダムに割り当てるが性別は 分ける。処置の割り当ては臨床試験を受ける者には明らかにしない。毎日１回午 前１０時ごろに患者に注射する。注射部位は、患者の腹部、脇腹、大腿部をそれ ぞれローテーションさせる。 臨床的および日常的な研究室的評価 対象は研究施設内に留められ、研究期間 中、研究担当の看護婦により毎日モニターされる。 ｖＷＦの測定およびｖＷＦ多量体の分析 ｖＷＦの測定およびｖＷＦ多量体の 分析用の血漿試料を、ベースライン、３日目および８日目に採取する。血漿ｖＷ Ｆおよび多量体の分析に関するアッセイはスクリップス・イミュノロジー・リフ ァレンス・ラボラトリー（Scripps Immunology Reference Laboratory）により 行われるが、いかなる研究室によっても日常的に行われうる。固相酵素結合免疫 吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（モントゴメリーら、上記文献）により血漿ｖＷＦ を測定する。簡単に説明すると、採用する方法において、フォン・ウィレブラン ド因子に対する精製抗体で被覆したマイクロタイタープレートに希釈された対照 、標準物質および患者の標本を添加する。試料中に存在するｖＷＦ抗原はマイク ロタイタープレート上の抗体に結合する。洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗ｖＷ Ｆを添加して結合ｖＷＦ抗原とサンドイッチ複合体を形成させる。再度マイクロ タイタープレートを洗浄し、酵素基質を添加してサンドイッチ複合体を可視化す る。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（フォトメーター）を用いて色の濃さを読み、 その色の濃さはｖＷＦ抗原濃度に比例する。結果を、正常なプールされた血漿試 料と比較して、抗原のパーセント値として示す。血漿ｖＷＦ多量体パターンを、 ＳＤＳ−アガロースゲル電気泳動、ウェスタンブロッティング、そして化学発光 検出により評価する。 統計学的分析 まとめの統計学的数値を得て、ベースライン、３日目、および ８日目における２つの処置群に関する血漿ｖＷＦ濃度に関するデータを比較する 。２試料、２サイドのｔ−試験が各時点において行われ、ヌル仮説（null hypot hesis）（２つの処置群のついての平均値において差がない）が試験された。ｒ ｈＩＬ−１１とプラシーボとの比較により、５％未満のｐ値（ｐ＜０.０５）に おいてヌル仮説が否定された場合に、差は統計学的に有意であると見なされる。 さらに、ペアードｔ−試験（paired t-test）を用いて、各時点での血漿ｖＷＦ 濃度のベースラインからの変化パーセント値を試験する。この試験を各処置群に ついて別個に行う。 血漿ｖＷＦおよびｖＷＦ多量体 すべての対象に関するｖＷＦ血漿濃度を表１ に示す。プラシーボ群においては、ベースラインから８日目までの平均血漿ｖＷ Ｆ濃度に変化はない。対照的に、研究期間中、すべてのＩＬ−１１処置対象にお いては血漿ｖＷＦ濃度は漸次増加する。偶然にも、プラシーボ群（１０３.３± ３５.９）と比較すると、ベースラインにおいてＩＬ−１１群では平均血漿ｖＷ Ｆ濃度はわずかに低い（７９.５±２２.３）。この相違は統計学的に有意でない 。しかしながら、３日目において、ＩＬ−１１群の平均血漿ｖＷＦ濃度（１１８ .０±３３.８）はプラシーボ群（９３.５±３１）よりも高く、８日目までには ＩＬ−１１群の平均ｖＷＦ濃度（１５３.７±３３.４）とプラシーボ群の平均ｖ ＷＦ濃度（９７.８±３７.５）との間の差は統計学的に有意となる（ｐ＝０.０ ２）。ＩＬ−１１群におけるベースラインから８日目までのｖＷＦ濃度の変化は 統計学的に有意である（ｐ＜０.０１）。ＩＬ−１１またはプラシーボ群のいず れの対象においてもｖＷＦ多量体パターンの異常はない。 本発明を特別な方法および組成物に関して説明したが、本発明を考慮して当業 者が変更および改変を行うであろうと理解される。 上記実施例において説明された本発明における多くの変更および改変を当業者 が行うであろうと予想され、結果的に、添付した請求の範囲において存在するよ うな限定のみが変更および改変について課せられるべきである。したがって、特 許請求されている発明の範囲内にあるすべてのかかる均等な改変が添付した特許 請求の範囲に包含されると考えられる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．適当な医薬担体中の有効量のＩＬ−１１を投与する工程からなる、ｖＷＦ のレベルを増加させる方法。 ２．体重１キログラムあたり１０ないし１００μｇのＩＬ−１１からなる請求 項１の方法。 ３．体重１キログラムあたり２５μｇのＩＬ−１１からなる請求項１の方法。