JPH10502328A

JPH10502328A - 蛋白質をその中にカプセル化含有するリポソーム、並びにその調製方法、及びそれを含有する薬剤、整形剤

Info

Publication number: JPH10502328A
Application number: JP7519862A
Authority: JP
Inventors: クリスチアンシュミット，ピータ; カラウ，クリスチン; モーニカペッツラート; ハットーヴァルヒ
Original assignee: ドクターレンチュレーアルツナイミッテルゲーエムベーハーウントコー
Priority date: 1994-01-31
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 1998-03-03
Also published as: DK0740547T3; ES2128710T3; DE4402867C1; EP0740547B1; WO1995020379A1; ATE176865T1; GR3029581T3; DE59505146D1; EP0740547A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、有効成分として蛋白質、好ましくはインターフェロンをその中に包封するリポソームに関するものであって、該リポソームは、モル比で８−４：５−３：１．５−０．５：０．０１−０のホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルグリセロール、α−トコフェロールより成る。本発明はそのようなリポソームの調製法、これを含有する薬剤、整形剤調製物にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質をその中にカプセル化含有するリポソーム、並びにその調製方法、及びそれを含有する薬剤、整形剤本発明は、有効成分として蛋白質、好ましくはインターフェロンをその中に包封、即ち（カプセル化して）含有するリポソームに関し、該蛋白質は高包含効率（カプセル化率）でリポソーム内にカプセル化されている。本発明は更には、そのようなリポソームの調製法、並びに、該リポソームを含有する薬剤及び整形用調製物に関する。最近、種々のペプチドホルモン又は蛋白質が、ウイルス性及び／又はバクテリア性伝染病及び癌に加えて、糖尿病等の障害、ホルモン又は成長障害、甲状線障害を抑制する治療的効果剤として使用されている。そのようなペプチド類例としては、オキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、インシュリン、シクロスポリンＡ、インタロイキン、インターフェロンがある。ほとんどの場合、これらの蛋白質は、治療に際しては溶質として注射される。これらの蛋白質は、溶液又は注入後の血流のいずれにおいても不安定であることから大きな問題を有する。上記の蛋白質は、血流中で内因性のプロテアーゼにより急速に分解し、それぞれに特有の有効性を消失する。一方、蛋白質の特性により、それに関連する結果又は副作用のいずれかとなる免疫学上の反応を引き起こす抗原となる。これらの問題点、欠点はあるものの、ペプチドホルモン、蛋白質は、個々の細胞群又は細胞に対して、特有の高有効性を示すことから、上記の障害の治療においては、これらの使用に頼っていた。これを、インターフェロンの使用を例に、以下において詳述する。インターフェロンは、外部的な刺激に反応して、特定細胞（白血球又は繊維芽細胞）により産生される蛋白質又は糖蛋白質である。これらは１４０−１６０のアミノ酸に対応する約２０ｋＤの分子量を有する。インターフェロンは主にその抗ウイルス性活性により特徴付けられる。しかしながら、このような真のウイルス抑制は、従来の抗性物質を用いたのでは不可能である。細胞表面の受容器官を通じて、インターフェロンは、いわゆる“抗ウイルス性蛋白質”の合成を引起す。転写（トランスクリプション）抑制又はオリゴ−Ａ− 合成（ｏｌｉｇｏ−Ａ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）及びこれらにより生ずる細胞性リボ核酸分解酵素活性刺激のような種々のメカニズムにより、結果としてこれらの蛋白質はウイルス再生を阻止する。この効果は、これらの種に特有のものである。更に、これらのインターフェロンは、その成長抑制作用により、例えば、毛髪細胞白血病等の癌治療で細胞静止剤としても重要である。大食細胞、Ｔ−細胞及びキラー細胞を活性化することにより、免疫学的な反応が誘起される。更に、薬学上の観点から興味のある追加適用領域である腫瘍壊死因子αの分泌作用が誘起される。更に、インターフェロンは、Ｔ−細胞の抗原作用を増大し、大食細胞を活性化する（抗菌作用）。帯状疱疹、ウイルス性脳炎の如き急性ウイスル性障害、慢性活性肝炎Ｂ、コンジローム、疣又は頸管新生物等の慢性障害、毛髪細胞白血病、特発性疾患の血小板血病、慢性リンパ性又は骨髄性白血病、皮膚Ｔ−細胞リンパ腫又は形質細胞腫等の造血臓器増殖症等の周知の徴候に対して、インターフェロンが投与される。更に、インターフェロンは、カルシノイド、鼻咽腔癌、悪性黒色腫、又は腎臓細胞癌等の他の癌、種々の炎症障害（慢性多発関節炎）、火傷、凍瘡、アトピー性皮膚病、乾癬、鞏皮病の治療並びに複合硬化症の治療にも用いることができる（Ｍｅｄ．Ｍｏ．Ｐｈａｒｍ．６，１９９１，ｐ１６４〜１７３参照）。上記で一般的に述べたように、蛋白質、即ち、インターフェロンは製剤においても用いられていた。注射用液剤においてまずそれらを安定化するために特別の努力がなされた。例えば、インターフェロン安定化製剤は、ＤＥ−Ａ−３６４２２２３から知られる。更に、体内に注射した後、この蛋白質が体内で産生されたプロテーゼによりあまりに早く分解しないように保護する試みもされた。この目的のため、例えば蛋白質がリポソーム内に包封され、蛋白質とプロテーゼの間に存在する脂質膜により蛋白質は分解から保護される。単層及び多層小胞（リポソーム）のいずれもがこの効果のために用いられていた。ＵＳ−Ａ−５，０２３，０８７号によれば、カプセル化された蛋白質の放出速度を決定する因子は、充分に述べられているわけではないが、小胞のサイズ、層数、又は小胞を構成する成分のタイプである。薬学的に効果のある成分をその中にカプセル化するリポソームは１種又は数種の脂質成分より構成される。例えば、ＵＳ−Ａ−５，０２３，０８７は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及び／又はホスファチジルグリセロール（ＰＧ）／トコフェロールより成るリポソーム内に蛋白質をカプセル化することを述べている。また、通常は、７：３の比であるホスファチジルコリンとホスファチジルセリン（ＰＳ）より成るリポソーム内にインターフェロンをカプセル化することがＪ．ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＲｅｓ．１０（２），ｐ．１５３−１６０，１９９０（ β−ＩＦＮ）；Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ１ｎｓｔ．１８（１８），ｐ．１３８７−１３９２，１９８９（γ−ＩＦＮ）又はＪ．Ｂｉｏｌ，ＲｅｓｐｏｎｓｅＭｏｄｉｆ．９（４）ｐ．９５５−９６０，１９９０（α−ＩＦＮ）及びＥＰ−Ａ−８９８１０１３３に述べられている。非蛋白質薬剤又は蛋白質をカプセル化するためのＰＣ／ＰＧ／Ｃｈとある種のトロフェロール（ＷＯ−Ａ−９１１６８８２でのモル比約１２：８：１又はＷＯ−Ａ−８７０４５９５のモル比約１０：８：１）並びに、γ−ＩＦＮをカプセル化するためのホスファチジルグリセロール／コレステロール（Ｃｈ）（２：１）のような他の脂質組成物（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５７（１），ｐ１３２−１３７，１９８９，又はＪ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１５９（４），ｐ６１６−６２０，１９８９，モル比９：１）；インターフェロンをカプセル化するＰＣ／Ｃｈ／サルファイド（モル比５：４：１：）（ＪＰ６２２８３９３４）も用いられる。リポソームの使用、合成に不可欠な因子は、リポソーム内へ包封される関係成分のカプセル化率である。蛋白質が十分にリポソームで保護されるには、一般的に蛋白質は、単に小胞膜と接している又は中に取り込まれているというのではなく、完全にカプセル化されていなくてはならない。多くの蛋白質は親水性部分だけでなく、疎水性部分をも有するので、そのように完全にカプセル化するのは当然のことではない。もしカプセル率が非常に低いと、カプセル化された有効成分の濃度も非常に低い。例えば、ＷＯ−Ａ−９０１１７８０は、ＰＣ／ＰＧ／Ｃｈ＝７：３：６の比で６．９％のカプセル化率を述べている。多層水胞内への蛋白質の最大カプセル化率として、ＷＯ−８７９４５９２には１０〜２０％が述べられている、一方、ＰＣ：ＰＧ＝１１：１のリポソームについては５０％より大のカプセル化率が非蛋白質薬剤（アルブテロールスルフェート）について報告されている。このような高いカプセル化量は、蛋白質についてはいまだに達成されてない。従って、多量の蛋白質が小胞調製に用いられなくてはならない。それ故に、カプセル化された状態の蛋白質を含有する製剤を投与する際には、多量の物質を用いることも必要となる。これは高価でかつ得ることが困難なペプチドホルモンのような有効成分にとっては望ましくない。従って、本発明の目的は高カプセル化率で蛋白質を包封含有したリポソームを提供することであり、更にはその製法、並びにそのリポソームを含有する薬剤、整形剤調製物を提供することである。カプセル化率の改善が成されたとしても、所定の放出速度等のカプセル化の利点が阻なわれてはならない。驚くことに、リポソームへの蛋白質カプセル化率は、本発明に従ってホスファチジルコリン及びコレステロールと共にホスファチジルグリセロールを所定量比で用いることによって著しく増大されることが発見された。本発明のリポソーム調製法を用いることによって、上記の２０％にも満たない従来のカプセル化率に比べて、３５％を越えるリポソーム中へのカプセル化率が達成できる。このようなカプセル化率の増大により、より少量の蛋白質を用いて調製が可能となり、その結果、調製はコスト的に一層有利となる。その上、高投与量の治療剤を用いるこことが可能となる。又、小胞当たりの有効成分の単位量が一層多くなるので、投与容量を減少することもできる。本発明の方法は、リポソーム内にカプセル化された蛋白質の既知の利点の全てを有するリポソーム並びにそのようなリポソームを含有する製剤、整形剤を提供するものである。例えば、問題としている蛋白質は、決められた様式で小胞から放出されるが、カプセル化されていることにより、蛋白質加水分解で分解しないように保護されている。しかしながら、カプセル化率が高いので、この保護は従来法で得られたリポソームより重要になる。従って、これらの製剤を含む調製物は一層安定になる。更に、本発明の製剤は、カプセル化によりこれらの蛋白質が抗体に近づけないようにしているので、蛋白質の抗原効果に基づく免疫学的副作用の危険性を低減する。従って、本発明は、高カプセル化率でリポソーム内にカプセル化された蛋白質、並びに、その調製法、更にはそのようなリポソームを含有する薬剤、整形剤に関する。蛋白質含有のリポソームは、以下に述べる方法により、所定量比の脂質、コレステロール、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）又はその誘導体、更には所望により、トコフェロール、これに匹敵するブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）又はブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）のような安定化剤から形成される。本発明のリポソーム中での脂質：コレステロール：ＰＧ：トコフェロールのモル比は、８−４：５−３：１．５−０．５：０．０１−０、好ましくは、６：４：１：０．０１である。従って、重量比では８−４：２．５−１．５：１．５− ０．５：０．０１−０、好ましくは、６：２：１：０．０１である。一般に、蛋白質は全て、種々の目的のために、リポソーム内にカプセル化できる。しかしながら、好ましくは、これらは、オキシトシン、バゾプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板活性因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトシン、シクロスポリンＡ、インターロイキン、インターフェロンのように薬理効果のあるものである。インターフェロンが好ましく、特にα−インターフェロンが好ましい。好適なα−インターフェロンとしては、知られているあらゆるサブタイプのα−インターフェロン、及びその誘導体、混合物である。本発明のリポソーム製造に用いるに好適なホスフェチジルグリセロール誘導体は、飽和及び不飽和Ｃ_12-24脂肪酸含有のモノ−及びジエステルである。ここで用いている“脂質（Ｌｉｐｉｄ）”とは、ホスファチジルコリン、即ち、ＰＣ及びＰＧとして列挙される脂肪酸含有の脂肪酸エステルを表わし、例えば、市場で得られるリポイドＥ１００^TM又はエピクロン２００^TMのようなエピクロン類である。本発明は更に、上記のリポソーム含有の薬剤及び整形用調剤並びに蛋白質を高いカプセル化率で包封するリポソームの調製法をも提供する。該調製法は、以下の工程より成る。ａ）適切な溶媒にリポソーム部を溶解、ロータリエバポレーターで溶媒を除去、生成された脂質薄膜を乾燥する；ｂ）薬学上許容可能な溶液中に蛋白質を添加、次いで例えばガラス球によりリポソームを分離し、リポソームを薄膜押出しする；ｃ）工程ｂ）で得たリポソームを、既知の方法及び適当なキャリア、賦形剤を用いて、薬学上、又は整形用として適用可能な形態、例えばゲル、クリーム、ローション、溶液又はスプレー状にする。工程ｂ）の後に、直径約２００ｎｍのオリゴラメラリポソームが得られる。このようなサイズのリポソームは、本発明の調製法によって、３５％を越えるカプセル化率で包封された蛋白質の所定の制御された放出を可能とする。上記の方法で調製された製剤は、小胞当たり有効成分をより高い含有量で含みうる。従って、より高い投与量、又より小量の投与量のいずれもが可能となる。更に、本発明のリポソームは、包封された蛋白質を安定化する。従来技術でリポソーム内に包封された蛋白質と比べて本発明の生物学上の活性は、実際上は長時間に亘って変化せずにそのままである。従って、本発明のリポソーム含有の薬剤及び整形剤は、著しく改善された保存安定性を有する。本発明の方法において、脂質成分を溶液状とするために用いられる好適な溶媒としては、クロロホルム、メチレンクロライド、アセトン、メチルエチルケトン、ヘキサン、シクロヘキサン等の室温で高い蒸気圧を示す不活性有機溶媒のいずれもである。上記の薬学上使用可能な溶液は、緩衝等張液である。リン酸ナトリウムで緩衝され、ＮａＣｌで等張にされ、且つ血清アルブミン含有の溶液が好ましい。上記の各製剤において、リポソームは、包封された蛋白質に加えて、他の薬学的又は整形上有効な成分を包含できる。ゲル状で得るために、本発明者等は、蛋白質の主なる活性を損失をするような高剪断力を用いずに、リポソームとゲル剤形となりうる既知のゲル形成剤を用いた。このようなゲル形成剤は、半合成セルロース誘導体類及びアルギン酸塩類中に見出せる。アルギン酸ナトリウム並びにナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースが好ましい。クリーム及びローション剤は、既知の方法により形成できる。更に、これらの薬学上及び整形調剤は、リポソーム及びそれを構成する成分の安定性に影響を与えることがなければ、既知の安定化剤、抗酸化剤、顔料、芳香剤、その他の賦形剤のいずれをも含むことができる。上記の方法で得たリポソーム含有の溶液形の本発明製剤は、本発明の上記の方法に従って、リポソームを薬学上受容できる等張溶液で所望の濃度とすることにより調製できる。薬学上、整形上用いることのできる溶液は、リン酸ナトリウム又はクエン酸ナトリウムのような蛋白質の安定性に影響を与えない緩衝剤で調整される。又、ＮａＣｌ、ポリオール、糖、糖アルコールで等張にされていてもよい。これらの溶液に、通常用いられている既知の安定化剤、抗酸化剤、顔料、添加物、血清アルブミン等の蛋白質、糖、ポリオール、糖アルコールのいずれもが、これらの添加物がリポソーム成分の安定性に影響を及ぼさない限り、添加してもよい。本発明により得られた製剤は、種々の剤形で適用できる。溶質形とされる場合には、種々の方法により注入できる（ｉ．ｖ．，ｉ．ｐ．，ｉ．ｃ．，ｓ．ｃ．）。例えば、腫瘍内治療では、直接腫瘍に注入される。このためには、無菌リポソーム調製、溶液調製後の最終段階である滅菌瀘過によって得られる滅菌調製物が必要とされる。オリゴラメラリポソームは、孔径２００ｎｍの膜を通しての押し出しにより得られるので、最終段階の滅菌瀘過は、品質保証のための付加工程である。溶液についての他の適用形態は、リポソーム内に包封されている有効成分を、粘液状の膜皮を通して、投与するためのスプレーである。更に、薬剤、整形調製物は、局部に適用できる。このためには、リポソーム懸濁液は、上述のようにゲル、クリーム、ローション形態とされる。もちろん上記に列挙した添加物のいずれも、これらの異なる調製物に加えることができる。以下の実施例は、本発明を詳述するものであって、本発明を限定するものではない。実施例１ヒトのα−インターフェロンを含むリポソームを以下の方法で調製する。０．３３５ｇのリポイドＥ１００、０．１１ｇのコレステロール、０．０５５ｇのＰＧ、０．５ｍｇのα−トコフェロールを５０ｍｌのクロロホルムに溶解する。１００ｍｌの丸底フラスコにこの溶液２０ｍｌを入れ、室温下、ロータベーパー（Ｒｏｔａｖａｐｏｒ）で蒸発させ、その後、さらに、圧力０．７−２．０ｋＰａで１時間乾燥する。丸底フラスコの壁面に脂質膜が生成する。ヒトのα−インターフェロン（６，０００，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）２４０μ ｌをインキュベーション緩衝液の２，１６０μｌ（１リットルの水に対して、１．５ｇの血清アルブミン、０．３ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、８．０ｇのＮａＣｌを含む。１：１０希釈に対応）で希釈する。この溶液２ｍｌを、脂質膜含有の丸底フラスコに加える。この膜を０．６ｇのガラス球を使って除去する。インターフェロン含有の多重層小胞脂質の懸濁物を形成する。該懸濁物を０．５ｍｌずつ微小押出器を用いて、孔巾２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出す。インターフェロン含有のオリゴラメラーリポソーム懸濁物が得られる。ＥＬＩＳＡテストにより、この懸濁物を直接分析したところ、遊離のα−インターフェロン部分、リポソームの外側に結合したα−インターフェロン部の総量は、３９１，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであり、カプセル化された部分は、３５％に相当する２０９，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであることを示した。実施例２ヒトのα−インターフェロンを含むリポソームを以下の方法で調製する。０．３３８ｇのリポイドＥ１００、０．１１２ｇのコレステロール、０．０５ｇのジミリストイルホスファチジルグリセロール、０．５ｍｇのα−トコフェロールを５０ｍｌのクロロホルムに溶解する。１００ｍｌの丸底フラスコにこの溶液２０ｍｌを入れ、室温下、ロータベーパーで蒸発させ、その後、さらに、圧力０．７−２．０ｋＰａで１時間乾燥する。丸底フラスコの壁面に脂質膜が生成する。ヒトのα−インターフェロン（６，０００，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）２４０μ ｌをインキュベーション緩衝液の２，１６０μｌ（１リットルの水に対して、１．５ｇの血清アルブミン、０．３ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、８．０ｇのＮａＣｌを含む。１：１０希釈に対応）で希釈する。この溶液２ｍｌを、脂質膜含有の丸底フラスコに加える。この膜を０．６ｇのガラス球を使って除去する。インターフェロン含有の多重層小胞脂質の懸濁物を形成する。該懸濁物を０．５ｍｌずつ微小押出器を用いて、孔巾２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出す。インターフェロン含有のオリゴラメラーリポソーム懸濁物が得られる。ＥＬＩＳＡテストにより、この懸濁物を直接分析したところ、遊離のα−インターフェロン部分、リポソームの外側に結合したα−インターフェロン部の総量は、３１３，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであり、カプセル化された部分は、４８％に相当する２８７，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであることを示した。実施例３（比較例）ヒトのα−インターフェロンを含むリポソームを以下の方法で調製する。０．３７６ｇのリポイドＥ１００、０．１２４ｇのコレステロール、０．５ｍｇのα−トコフェロールを５０ｍｌのクロロホルムに溶解する。１００ｍｌの丸底フラスコにこの溶液２０ｍｌを入れ、室温下、ロータベーパーで蒸発させ、その後、さらに、圧力０．７−２．０ｋＰａで１時間乾燥する。丸底フラスコの壁面に脂質膜が生成する。ヒトのα−インターフェロン（６，０００，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）２４０μ ｌをインキュベーション緩衝液の２，１６０μｌ（１リットルの水に対して、１．５ｇの血清アルブミン、０．３ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、８．０ｇのＮａＣｌを含む。１：１０希釈に対応）で希釈する。この溶液２ｍｌを、脂質膜含有の丸底フラスコに加える。この膜を０．６ｇのガラス球を使って除去する。インターフェロン含有の多重層小胞脂質の懸濁物を形成する。該懸濁物を０．５ｍｌずつ微小押出器を用いて、孔巾２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出す。インターフェロン含有のオリゴラメラーリポソーム懸濁物が得られる。ＥＬＩＳＡテストにより、この懸濁物を直接分析したところ、遊離のα−インターフェロン部分、リポソームの外側に結合したα−インターフェロン部の総量は、５５４，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであり、カプセル化された部分は、８％に相当する１４６，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌであることを示した。再度、表１に実施例１、２、比較例３のカプセル比率を示す。リポソームを構成する脂質の所定の量比に基づく本発明の方法を使用することで、カプセル化率を大いに増大することが明らかである。実施例４ヒトのα−インターフェロンを含むリポソームを以下の方法で調製する。０．３３６ｇのリポイドＥ１００、０．１１１ｇのコレステロール、０．０５４ｇのジパルミトイルホスファチジルグリコール、０．５ｍｇのα−トコフェロールを５０ｍｌのクロロホルムに溶解する。１００ｍｌの丸底フラスコにこの溶液２０ｍｌを入れ、室温下、ロータベーパーで蒸発させ、その後、さらに、圧力０．７−２．０ｋＰａで１時間乾燥する。丸底フラスコの壁面に脂質膜が生成する。ヒトのα−インターフェロン（６，０００，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）２４０μ ｌをインキュベーション緩衝液の２．１６０μｌ（１リットルの水に対して、１．５ｇの血清アルブミン、０．３ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、８．０ｇのＮａＣｌを含む。１：１０希釈に対応）で希釈する。この溶液２ｍｌを、脂質膜含有の丸底フラスコに加える。この膜を０．６ｇのガラス球を使って除去する。インターフェロン含有の多重層小胞脂質の懸濁物を形成する。該懸濁物を０．５ｍｌずつ微小押出器を用いて、孔巾２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出す。インターフェロン含有のオリゴラメラーリポソーム懸濁物が得られる。実施例５ヒトのα−インターフェロンを含むリポソームを以下の方法で調製する。０．３３３ｇのリポイドＥ１００、０．１１ｇのコレステロール、０．０５７ｇのジステアロイルホスファチジルグリセロール、０．５ｍｇのα−トコフェロールを５０ｍｌのクロロホルムに溶解する。１００ｍｌの丸底フラスコにこの溶液２０ｍｌを入れ、室温下、ロータベーパーで蒸発させ、その後、さらに、圧力０．７−２．０ｋＰａで１時間乾燥する。丸底フラスコの壁面に脂質膜が生成する。ヒトのα−インターフェロン（６，０００，０００Ｉ．Ｅ．／ｍｌ）２４０μ ｌをインキュベーション緩衝液の２，１６０μｌ（１リットルの水に対して、１．５ｇの血清アルブミン、０．３ｇのＮａＨ₂ＰＯ₄、１．２ｇのＮａ₂ＨＰＯ₄、８．０ｇのＮａＣｌを含む。１：１０希釈に対応）で希釈する。この溶液２ｍｌを、脂質膜含有の丸底フラスコに加える。この膜を０．６ｇのガラス球を使って除去する。インターフェロン含有の多重層小胞脂質の懸濁物を形成する。該懸濁物を０．５ｍｌずつ微小押出器を用いて、孔巾２００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出す。インターフェロン含有のオリゴラメラーリポソーム懸濁物が得られる。実施例６３０ｍｇのナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＴｙｌｏｐｕｒＣ３００Ｐ^TM）を実施例１、２、４又は５で調製したリポソーム懸濁物１９７０μｌに加え、得られた混合物を６時間膨潤させる。皮膚上に容易に広がるゲルが得られた。実施例７４０ｍｇのヒドロキシエチルセルロース（ＴｙｌｏｓｅＨ３００^TM）を実施例１、２、４又は５で調製したリポソーム懸濁物１９７０μｌに加え、得られた混合物を６時間膨潤させる。皮膚上に容易に広がるゲルが得られた。実施例８２５０ｍｇのヒドロキシプロピルメチルセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｏａｔ６０６^TM）を実施例１、２、４又は５で調製したリポソーム懸濁物１９７０μｌに加え、得られた混合物を１２時間膨潤させる。皮膚上に容易に広がるゲルが得られた。実施例９３０ｍｇのアルギン酸ナトリウム（ＫｅｌｇｉｎＦ^TM）を実施例１、２、４又は５で調製したリポソーム懸濁物１９７０μｌに加え、得られた混合物を６時間膨潤させる。皮膚上に容易に広がるゲルが得られた。実施例１０リポソームの安定性をインターフェロンの含有率で決定した。リポソームを実施例２、３（比較例）と同様に調製し、４℃で所定時間保存した。インターフェロンの含有率は通常の方法で決定した。本発明に従って、担体としてＰＧを用いると、従来より長時間に亘ってインターフェロンをリポソーム内にカプセル化保存することができることを表３は明瞭に示している。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年６月２１日【補正内容】特許請求の範囲１．リポソームがモル比で６：４：１：０．０１のホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルグリセロールとトコフェロールより成ることを特徴とする蛋白質をその内部に包封するリポソーム。２．ホスファチジルグリセロール誘導体が、Ｃ^12-24の飽和又は不飽和脂肪酸を含有するモノ又はジエステルである先の請求項１に記載のリポソーム。３．ホスファチジルグリセロール誘導体がミリストイル、ステアロイル又はパルミトイルジエステルである請求項２記載のリポソーム。４．カプセル化された蛋白質がオキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトシン、シクロスポリンＡ、インターロイキン、又はインターフェロンである請求項１〜３のいずれかに記載のリポソーム。５．ゲル形態に調製され、且つゲル形成剤がセルロース誘導体又はアルギン酸塩である先の請求項のいずれかに記載のリポソームを含有するリポソーム製剤。６．ゲル形成剤が、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はアルギン酸ナトリウムである請求項５記載のリポソーム製剤。７．溶質形態で調製された請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム製剤。８．溶液が等張にされ、且つ薬学上受容可能な緩衝液を用いてｐＨ＝７に調整されている請求項７に記載の製剤。９．無菌方式で調製され、且つ膜瀘過法により滅菌化された請求項７、８のいずれかに記載のリポソーム製剤。１０．以下の工程より成る蛋白質をカプセル化含有するリポソームの調製法。ａ）適切な溶媒中で、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルグリセロール、トコフェロールを６：４：１：０．０１の量比で溶液とし、溶媒を蒸発、脂質膜を乾燥し；ｂ）蛋白質を薬学上受容可能な溶液中に添加、ガラス球によりリポソームを分離、次いでリポソームを薄膜押出しする。１１．ホスファチジルグリセロール誘導体が、Ｃ^12-24の飽和又は不飽和脂肪酸を含有するモノ又はジエステルである先の請求項１０に記載の調製法。１２．ホスファチジルグリセロール誘導体がミリストイル、ステアロイル又はパルミトイルジエステルである請求項１１に記載の調製法。１３．カプセル化された蛋白質がオキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトシン、シクロスポリンＡ、インターロイキン、又はインターフェロンである請求項１０〜１２のいずれかに記載の調製法。１４．薬剤又は整形調製物が伸ばし易い形態で得られ、工程ｂ）で得られたリポソームが既知の方法により、既知の担体又は賦形剤を用いてゲル、クリーム又はローション等の薬学上又は整形上受容可能な形態とされ、該ゲル形成剤がセルロース誘導体又はアルギン酸塩である先の請求項１０〜１３のいずれかに記載の調製法。１５．ゲル形成剤がナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はアルギン酸ナトリウムである請求項１４に記載の調製法。１６．工程ｂ）で得たリポソームを、キャリア又は賦形剤を用いて、既知の方法により、溶液状とすることによって、溶質形態の薬学上の調製物を得る先の請求項１０〜１３のいずれかに記載の調製法。１７．溶液がＮａＣｌで等張とされ、緩衝液でｐＨ＝７．４に調製されている請求項１６に記載の調製法。１８．薬剤調製物が無菌方式で調製され、膜瀘過法により滅菌される請求項１６、１７のいずれかに記載の調製法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 38/23 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/34 38/24 9051−4Ｃ 37/30 38/27 9051−4Ｃ 37/32 38/28 9051−4Ｃ 37/38 38/45 9051−4Ｃ 37/26 (72)発明者ペッツラートモーニカドイツ国Ｄ−88471 ラウプハイムフィンケンヴェーク３ (72)発明者ヴァルヒハットードイツ国Ｄ−88471 ラウプハイム−バウシュテッテンヴアイスドルンヴェーク 16

Claims

【特許請求の範囲】１．リポソームがモル比で８−４：５−３：１．５−０．５：０．０１−０のホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルグリセロールとトコフェロールより成ることを特徴とする蛋白質をその内部に包封するリポソーム。２．リポソームを構成する上記成分の比が６：４：１：０．０１である請求項１記載のリポソーム。３．ホスファチジルグリセロール誘導体が、Ｃ^12-24の飽和又は不飽和脂肪酸を含有するモノ又はジエステルである先の請求項１に記載のリポソーム。４．ホスファチジルグリセロール誘導体がミリストイル、ステアロイル又はパルミトイルジエステルである請求項３記載のリポソーム。５．カプセル化された蛋白質がオキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトシン、シクロスポリンＡ、インターロイキン、又はインターフェロンである請求項１〜４のいずれかに記載のリポソーム。６．カプセル化された蛋白質がインターフェロンである請求項５記載のリポソーム。７．カプセル化された蛋白質がα−インターフェロンである請求項６記載のリポソーム。８．ゲル形態に調製され、且つゲル形成剤がセルロース誘導体又はアルギン酸塩である先の請求項のいずれかに記載のリポソームを含有するリポソーム製剤。９．ゲル形成剤が、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はアルギン酸ナトリウムである請求項８記載のリポソーム製剤。１０．溶質形態で調製された請求項１〜７のいずれかに記載のリポソーム製剤。１１．溶液が等張にされ、且つ薬学上受容可能な緩衝液を用いてｐＨ＝７に調整されている請求項１０に記載の製剤。１２．無菌方式で調製され、且つ膜瀘過法により滅菌化された請求項１０又は１１のいずれかに記載のリポソーム製剤。１３．以下の工程より成る蛋白質をカプセル化含有するリポソームの調製法。ａ）適切な溶媒中で、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルグリセロール、トコフェロールを８−４：５−３：１．５−０．５：０．０１ −０の量比で溶液とし、溶媒を蒸発、脂質膜を乾燥し；ｂ）蛋白質を薬学上受容可能な溶液中に添加、ガラス球によりリポソームを分離、次いでリポソームを薄膜押出しする。１４．量比が６：４：１：０．１である請求項１３記載の調製法。１５．ホスファチジルグリセロール誘導体が、Ｃ^12-24の飽和又は不飽和脂肪酸を含有するモノ又はジエステルである先の請求項１３、１４のいずれかに記載の調製法。１６．ホスファチジルグリセロール誘導体がミリストイル、ステアロイル又はパルミトイルジエステルである請求項１５に記載の調製法。１７．カプセル化された蛋白質がオキシトシン、バソプレッシン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＬＨ、腫瘍壊死因子、成長因子、血小板促進因子、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、インシュリン、カルシトシン、シクロスポリンＡ、インターロイキン、又はインターフェロンである請求項１３〜１６のいずれかに記載の調製法。１８．カプセル化された蛋白質がインターフェロンである請求項１７記載の調製法。１９．カプセル化された蛋白質がα−インターフェロンである請求項１８記載の調製法。２０．薬剤又は整形調製物が伸ばし易い形態で得られ、工程ｂ）で得られたリポソームが既知の方法により、既知の担体又は賦形剤を用いてゲル、クリーム又はローション等の薬学上又は整形上受容可能な形態とされ、該ゲル形成剤がセルロース誘導体又はアルギン酸塩である先の請求項１３〜１９のいずれかに記載の調製法。２１．ゲル形成剤がナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース又はアルギン酸ナトリウムである請求項２０に記載の調製法。２２．工程ｂ）で得たリポソームを、キャリア又は賦形剤を用いて、既知の方法により、溶液状とすることによって、溶質形態の薬学上の調製物を得る先の請求項１３〜１９のいずれかに記載の調製法。２３．溶液がＮａＣｌで等張とされ、緩衝液でｐＨ＝７．４に調製されている請求項２２に記載の調製法。２４．薬剤調製物が無菌方式で調製され、膜瀘過法により滅菌される請求項２２、２３のいずれかに記載の調製法。