JPH10500843A

JPH10500843A - コンドロイチナーゼｉおよびｉｉ、その製造法および用途

Info

Publication number: JPH10500843A
Application number: JP7527838A
Authority: JP
Inventors: カンドゥケ，キラン・モノハール; ゴットー，ジョン; オイル，ウルスラ
Original assignee: アメリカン・サイアナミド・カンパニー
Priority date: 1994-04-22
Filing date: 1995-04-24
Publication date: 1998-01-27
Also published as: US5741692A; EP0756636A4; US5855883A; EP0756636A1; US5716617A; CA2188159A1; AU2428195A; WO1995029256A1

Abstract

(57)【要約】約０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの存在下、pＨ８.５で２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中の４ないし２０％の勾配のアクリルアミドのゲルにて電気泳動に付した場合、約８.４−８.４５の等電点および１１２ｋＤａの明らかな分子塊を有する蛋白質であるコンドロイチナーゼＩＩが単離かつ精製された。プロテウス・バルガリスにより産生されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質をアフィニティ・クロマトグラフィーにより共精製する方法もまた提供される。該蛋白質は、さらには、金属キレートクロマトグラフィーにより精製することもできる。単離されたコンドロイチナーゼＩおよびＩＩまたはコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの共精製された混合物の治療用または外科用組成物もまた開示されている。これらの組成物は目の神経網膜から硝子体を選択的または完全に辺縁部剥離させる方法にて用いられる。

Description

【発明の詳細な説明】コンドロイチナーゼＩおよびＩＩ、その製造法および用途発明の分野本発明は、酵素コンドロイチナーゼＩＩの同定、単離および精製ならびに酵素コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの共精製（copurification ）に関する。共精製された酵素混合物または単離された個々の酵素の組み合わせの組成物は、目の神経網膜から眼球硝子体を選択的かつ、完全に辺縁部剥離させるのに有効である。発明の背景コンドロイチナーゼは、ヒトの目の網膜と硝子体との間の結合を媒介するプロテオグリカン類の１成分であるコンドロイチン硫酸に作用する細菌起源の酵素である。コンドロイチナーゼ酵素の例は、プロテウス・バルガリス（P．vulgaris ）細菌により産生されるコンドロイチナーゼＡＢＣおよびエイ・アウレスセンス（A．aurescens）により産生されるコンドロイチナーゼＡＣである。本発明においては、コンドロイチナーゼＡＢＣをコンドロイチナーゼＩと称する。コンドロイチナーゼＡＢＣおよびＡＣは、蛋白核の分解なしに、蛋白質−多糖複合体における多糖側鎖を分解することによって機能する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分けると、コンドロイチナーゼＩは約１１０ｋＤａの１つの明らかな分子塊として泳動する（図１参照）。コンドロイチナーゼＩのＳＤＳ −ＰＡＧＥ分画では、他の人により、ダブレット（doublet）の出現が報告されている（サトーら、Agric．Biol．Chem.，５０：４，１０５７−１０５９（１９８６））。本発明者らは、このダブレットが、コンドロイチナーゼＩそのものと、９０ｋＤａの分解生成物であることを見いだした。商業的なコンドロイチナーゼＩ蛋白質調製物は、一定しない量の９０ｋＤａおよび１８ｋＤａ蛋白質分解生成物フラグメントを含有している（図１参照）。ヤマガタら（J．Biol．Chem.，２４３：１５２３−１５３５（１９６８））は、プロテウス・バルガリスの抽出物からのコンドロイチナーゼＡＢＣの精製を記載している。この酵素は、pＨ８において、コンドロイチンまたはヒアルロン酸よりも早い速度でグリコサミノグリカン類であるコンドロイチン−４−硫酸、デルマタン硫酸およびコンドロイチン−６−硫酸（各々、プロテオグリカン類の側鎖であるコンドロイチン硫酸Ａ、ＢおよびＣとも称される）を選択的に分解する。分解生成物は、高分子量の不飽和オリゴ糖類および不飽和二糖類である。しかし、コンドロイチナーゼＡＢＣは、ケラト硫酸、ヘパリンまたはヘパリチン硫酸を攻撃しない。キクチらの米国特許５,１９８,３５５号は、酵素含有溶液を不溶性硫酸化多糖類担体に吸着させ、ついで担体から単独の酵素を脱着することにより酵素を分画することによるコンドロイチナーゼＡＢＣのようなグリコサミノグリカン分解酵素類の精製を記載している。コンドロイチナーゼ酵素は、眼球の手術において、目の神経網膜への硝子体の結合を、迅速に、かつ特異的に非外科的に断ち、硝子体の摘出を容易にするための手段として使用されている。例えば、ハーゲマン（Hageman）の米国特許５,２９２,５０９号は、硝子体切除術の補助薬とする、哺乳類の目の眼球硝子体、網膜上膜または線維性細胞膜を、神経網膜、毛様体上皮および後水晶体表面から選択的かつ完全に辺縁部剥離（摘出）させる眼科硝子体切除術法を記載している。網膜硝子体接着の部位に特異的に局在しているコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを***または分解するのに有効な量の酵素を目に投与し、これにより、硝子体および／または網膜上膜を完全に辺縁部剥離させる。酵素はプロテアーゼ・フリーのグリコサミノグリカナーゼとすることができる。ハーゲマンは、典型的には、コンドロイチナーゼＩ分解生成物および／または蛋白性安定化剤を含有する純粋でない調製物である生化学工業株式会社（日本国、東京）から得たコンドロイチナーゼＡＢＣを利用した。蛋白性安定化剤は、ヒトの目に投与する治療的または外科的組成物には許容されないので望ましくない。いくつかのコンドロイチナーゼはまた、板組織（disc）の安定化コラーゲン成分を乱すことなく、板組織のヘルニアの軟骨を溶解するのに有効であると記載さている。ブラウン（Brown）の米国特許４,６９６,８１６号は、椎間板間隙にコンドロイチナーゼＡＢＣを含有する溶液の有効量を注入することによる、ヒトを含む哺乳動物の椎間板変位の治療方法を記載している。このコンドロイチナーゼＡＢＣはプロテウス・バルガリスの抽出物から単離、精製されたもので、この天然酵素物質は、脊柱板ヘルニアのような軟骨を溶解するように機能した。特に、この酵素は、プロテオグリカン類とランダムに分散されたコラーゲン繊維を含む髄核の選択的髄核融解を起こさせる。もう１つのコンドロイチナーゼであるコンドロイチナーゼＩＩは、この度、本発明者らにより、プロテウス・バルガリスから単離され、精製された。また、本発明者らは、コンドロイチナーゼＩとコンドロイチナーゼＩＩの混合物が都合よく得られる効率的な共精製法を見いだした。図面の簡単な説明図１は、コンドロイチナーゼ酵素調製物の抗体アフィニティ・クロマトグラフィー分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＡは未分画コンドロイチナーゼであり、レーンＢおよびＣは、アフィニティ精製コンドロイチナーゼＩ（１１０ｋＤａ）およびＩＩ（１１２ｋＤａ）およびコンドロイチナーゼＩの分解生成物の１つ（９０ｋＤａ）である。図２は、コンドロイチナーゼ酵素調製物の調製のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＡは精製コンドロイチナーゼＩ蛋白質、レーンＢは、精製コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質、レーンＣは、コンドロイチナーゼＩ蛋白質の９０キロダルトン酵素切断または分解生成物、レーンＤは、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質からなるダブレットを示すコンドロイチナーゼ酵素調製物である。図３は、精製コンドロイチナーゼＩＩ（レーンＡおよびＣ）、共精製コンドロイチナーゼＩおよびＩＩ（レーンＢ）および精製コンドロイチナーゼＩ（レーンＤ）の等電点電気泳動を示す。図４は、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質によるプロテオグリカン消化の薄層クロマトグラフィーによる分析を示す。図５は、ゲル・パーミエーション・クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって同定したコンドロイチナーゼＩによるコンドロイチン硫酸の消化による成分ピークを示す。空隙容量で溶出するピークＩはコンドロイチナーゼＩである。ピークＩＩはＩＩａおよびＩＩｂと命名した２つの異なる成分からなり、ＩＩａは濃縮形の１／３Ｒ．Ｆ．糖を含み、ＩＩｂは過剰に硫酸化された二糖類である。ピークＩＩＩ（ＩＩＩａおよびＩＩＩｂと表示）は、床容量近くで溶出し、ほぼ純粋な二糖類からなる。ピークＩＶは非糖成分からなる。図６は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）による図５に示したピーク成分の分析を示す。「消化」と表示したレーンは、ＧＰＣによる分画前に、コンドロイチナーゼＩで消化し、ＧＰＣカラムに載せたコンドロイチン硫酸物質である。他のレーンは図５に記載したＧＰＣピークに対応する。図７は、四糖類Δ４,５−Ｄ−グルクロン酸−β（１→３）−２−Ｎ−アセチル，６−スルホ，Ｄ−ガラクトサミン−β（１→４）−Ｄ−グルクロン酸−β（１→３）−２−Ｎ−アセチル，６−スルホ，Ｄ−ガラクトサミンを示す。図８は、本発明のアフィニティ・クロマトグラフィー・システムの調製および使用を示す図である。図９は、コンドロイチナーゼＩおよびＩＩの共精製における最初の工程を説明するグラフであり、導入されたプロテウス・バルガリス抽出物を、マクロプレプ・ハイ（MacroPrep High）Ｓカチオン交換クロマトグラフィーを用いて分画する。グラフ（実線）は、カラム溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を示す（ＵＢ：非結合、ＢＷ：緩衝液洗浄液、ＣＳ：コンドロイチン硫酸伴う特異溶出）。この挿入物は、非結合、緩衝液洗浄液およびコンドロイチン硫酸溶出フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを説明する。図１０は、マクロプレプ・ハイＱアニオン交換クロマトグラフィーによるコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの共精製を示すグラフである。この挿入物は、レーン１ − ハイＱロード、５倍希釈レーン２、３ − ハイＱ通過流、５倍希釈レーン４、５ − ハイＱ通過流、１０倍希釈レーン６、７ − ハイＱ通過流、２０倍希釈レーン８、９ − ハイＱ通過流、４０倍希釈レーン１０ − ハイＱ通過流、８０倍希釈レーン１１ − 標準コンドロイチナーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜２０％）を示す。図１１は、マクロプレプ・ハイＳカチオン交換クロマトグラフィーを用いるコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの単独分離を示す。グラフは、カラム溶出液の２８０ｎｍにおける吸光度を示す。この挿入物は、カラムに載せた物質（Load）、非結合物質（ＵＢ）、緩衝液洗浄液（ＢＷ）、コンドロイチナーゼＩ（１１０ｋＤａ）およびコンドロイチナーゼＩＩ（１１２ｋＤａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールを説明する。発明の概略等電点約８．４〜８．４５、約０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳの存在下、pＨ８．５で、２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中、４〜２０％グラディエントのアクリルアミド・ゲルで電気泳動した場合に１１２ｋＤａの明確な分子塊を有する蛋白質であるコンドロイチナーゼＩＩを単離し、精製した。コンドロイチナーゼＩＩのアミノ酸配列をＳＥＱＩＤＮｏ．２として提供する。プロテウス・バルガリスにより産生されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質のアフィニティ・クロマトグラフィーによる共精製法も提供する。この方法は、（ａ）誘導されたプロテウス・バルガリスの、pＨ５．８〜７．４を有する清澄ホモジネートを調製し、（ｂ）ホモジネートを陰性荷電のカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、ホモジネート中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを含むいずれの陽性荷電蛋白質をも、陰性荷電担体と非共有結合を形成させ、（ｃ）pＨ７．０〜９．５で、コンドロイチン硫酸の水性溶液で担体からコンドロイチナーゼ蛋白質を、まとめてアフィニティ溶出させ、（ｄ）アフィニティ溶出した蛋白質プールをアニオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せて非結合溶出液を得、（ｅ）非結合溶出液中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を回収することを包含する。他の態様において、蛋白質は、さらに金属キレート・クロマトグラフィーにより精製できる。この共精製法は、典型的には、約６０％コンドロイチナーゼＩ：４０％コンドロイチナーゼＩＩの重量／重量比をもたらすが、約８０％コンドロイチナーゼＩ：２０％コンドロイチナーゼＩＩまでの比率も得られる。単離されたコンドロイチナーゼＩおよびＩＩまたは共精製されたコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの混合物の治療用または外科用組成物も開示する。好ましくは、コンドロイチナーゼＩおよびＩＩの量は、辺縁部剥離有効量である。これらの組成物は、目の神経網膜から硝子体を選択的かつ完全に辺縁部剥離させる方法で使用される。組成物は、そのような治療の必要な目に、好ましくは、硝子体内、硝子体下、水晶体下および後眼房に投与される。発明の詳細な記載本発明は、酵素コンドロイチナーゼＩＩの同定および単離を包含する。コンドロイチナーゼＩＩは、酵素コンドロイチナーゼＩとは別に精製でき、または、これら２つの酵素は、やはり本発明に包含される方法により共精製することができる。これらの２つの酵素は、好ましくは、例えば、ウシ血清アルブミンのような蛋白性安定化剤や、これら２つの異なる酵素の混合物の性質に影響を及ぼす他の不純物の非存在下で、組成物に処方される。蛋白性安定化剤は、ヒト、特にヒトの目に投与するための治療用または外科用組成物に使用するには適していない。また、コンドロイチナーゼＩＩの分析も提供する。コンドロイチナーゼＩおよびＩＩは、目の神経網膜から硝子体を選択的かつ完全に辺縁部剥離させるために一緒に使用される。コンドロイチナーゼＩＩコンドロイチナーゼＩＩは、コンドロイチナーゼＩとは区別される酵素であるが、２つの酵素は、各々が網膜硝子体接着に関与するプロテオグリカン類の完全な分解に関与する点で相互に補足し合う。コンドロイチナーゼＩをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分割すると、それは、約１１０ｋＤａの１つの明らかな分子塊として泳動する（図１）。しかしながら、コンドロイチナーゼＩは、コンドロイチナーゼＩの蛋白分解生成物も同様に検出できるので、ダブレットとしても現れることがある。本発明者らは、特異的抗体を使用して、さらにこれらの分解生成物を９０ｋＤａと１８ｋＤａ種の等モル量と同定した。図１は、抗体アフィニティ・クロマトグラフィーによる効率的な調製物分画のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。分画は以下のとおり行った。夾雑蛋白質（より高分子量を有する）フリーの４Ｍ尿素中のＧＰＣにより、（９０＋１８）ｋＤａコンドロイチナーゼからコンドロイチナーゼ（１８ｋＤａ）のフラグメントを精製した。１８ｋＤａフラグメントに対する抗体を製造した。組換体コンドロイチナーゼのアミノ基をゲルに共有結合させることにより、コンドロイチナーゼ・アフィニティ・ゲルを調製した。このアフィニティ・カラムを用いて血清からの精製１８ｋＤａ特異的ＩｇＧを調製した。この１８ｋＤａ特異的ＩｇＧを蛋白質Ａ−ゲルに共有的に結合させた。蛋白質ＡはＩｇＧの定常部と結合するので、その結合方向に正しく配向する。コンドロイチナーゼからの小成分を、ゲルを使用して分画した。分解生成物の両方の種は、多分、典型的なコンドロイチナーゼＩ調製物における不純物からと同様に、コンドロイチナーゼＩそのものの内部で少なくとも１箇所エンドプロテアーゼにより切断されて形成される。単離され、精製されたコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の物理化学的性質を分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびマススペクトル分析コンドロイチナーゼＩＩは、あるＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で、無傷のコンドロイチナーゼＩ蛋白質よりも、ゆっくりと泳動する。しかしながら、コンドロイチナーゼＩＩは従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥシステムでは検出できなかった。それは、本発明者らにより、約０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの存在下、pＨ８．５において２３ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中のアクリルアミドのグラディエントから単離、精製された。７％ゲルも使用できる。コンドロイチナーゼＩＩは、上記のごとくＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動すると、１１２ｋＤａの１つの明らかな分子塊を有する。それは、図２、レーンＤの従前に分割されていないダブレットの上方のバンドとして観察される。マス・スペクトル分析により認められた精製天然コンドロイチナーゼＩＩについての質量は、エレクトロスプレー（electrospray）で１１１,７２５±２７ダルトンであり、レーザーデソープション（laser desorption）で１１１,７２５ ±２０ダルトンである。これらのデータは、コンドロイチナーゼＩＩをコードするＤＮＡ配列から予測される質量および組換体コンドロイチナーゼＩＩに観察される質量に相当する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、コンドロイチナーゼＩＩのバンドはダブレットの上方のバンドではあるが、コンドロイチナーゼＩＩの質量はコンドロイチナーゼＩよりは、７００〜８００ダルトンも少ない。等電点コンドロイチナーゼＩＩの等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、約８．４〜８．４５の等電点（ｐＩ）を生じ、これは、各々、約８．３〜８．３５と８．４〜８．４５の等電点を有するコンドロイチナーゼＩの２つのイソフォーム（isoform）のものと類似している。（図３参照）。ＩＥＦ条件はつぎのとおりである。用いたアンホライン範囲は５％ポリアクリアミド・ゲル中pＨ８〜９．５である。pＨグラディエントは、各々、１Ｍリン酸および１ＭＮaＯＨで誘導した。シーケンシングコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの誘導されたアミノ酸配列を、各々、ＳＥＱＩＤＮｏ．１およびＳＥＱＩＤＮｏ．２に示す。標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、これら２つの蛋白質は単一のバンドとして見えうるが、ここに記載する特別なＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件では、それらはダブレットととして分割される。これら２つの蛋白質のはっきりした性質は、さらに、各蛋白質のアミノ末端の最初の４０アミノ残基の配列およびそれらの塩基配列から推定されるそれらのアミノ酸配列の残りの部分から確認される。単離され、精製された天然のコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質のアミノ末端配列は、塩基配列から予測され、組み換えにより製造されたコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質のアミノ末端シーケンシング［プロシーケンサー・モデル６００(ProSequ encer Model ６００，Milligen／Bioserch，Milford，MA)を用い、製造者のマニュアルに従って実施］により決定されたと同じアミノ酸配列を有する。特に、アミノ末端の最初の２０残基（ＳＥＱＩＤＮｏ．２）は、組換体コンドロイチナーゼＩＩが天然の蛋白質には存在しないアミノ末端メチオニン残基を含む以外は、天然および組換体コンドロイチナーゼＩＩと一致する。残基２１〜４１のシーケンシングは、非特異的エドマン分解の増加により困難であった。しかし、この領域における残基の信頼できる同定が行える程度に行ったところでは、残基は、（上記したところを除いて）天然および組換体コンドロイチナーゼＩＩと同じである。天然および組換体コンドロイチナーゼＩ（ＳＥＱＩＤＮｏ．１）のアミノ末端シーケンシングについても同じである。抗体結合研究コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの差異を示すさらなる証拠はウエスターン・ブロットにおけるポリクローナル抗体結合研究によって提供される。コンドロイチナーゼＩは、予想どおり、コンドロイチナーゼＩに対するポリクローナル抗体と結合するが、コンドロイチナーゼＩＩに対するポリクローナル抗体には結合（交差反応）しない。同様に、コンドロイチナーゼＩＩは、予想どおり、コンドロイチナーゼＩＩに対するポリクローナル抗体と結合するが、コンドロイチナーゼＩに対するポリクローナル抗体とは結合（交差反応）しない。また、天然および変性条件下で、２つの異なる挙動が観察される。ＳＤＳによる洗剤処理のような変性条件下では、２つのコンドロイチナーゼ蛋白質間に交差反応はない。このことは、分子が広げられると、共用する（配列依存）エピトープがないことを示している。非変性条件（天然）下では、抗体アフィニティ・クロマトグラフィーに基づき少なくとも１つのエピトープが共用される証拠があり、そこで共精製される。特別な理論に縛られるものではないが、このエピトープは、これらの蛋白質のコンドロイチン硫酸結合／認識部位に位置しているものと考えられる。この領域は、コンドロイチン硫酸基質に結合するアミノ酸類の保存された三次元配置を示しうる。配置依存エピトープと異なり、高次（conformational ）エピトープは、蛋白質が変性されると失われる。かくして、抗体は、天然の蛋白質にのみ結合し、変性した蛋白質には結合しない。コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は、コンドロイチナーゼＩがそうであるように、ヘパリン硫酸に強い親和性も有する。生物学的活性コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の生物学的活性も、コンドロイチナーゼＩとは異なる。コンドロイチナーゼＩＩの生物学的活性を、まず、従前にin vivoで活性であることが示されてるコンドロイチナーゼ酵素調製物の１つのバッチからコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を選択的に除去することにより試験した。コンドロイチナーゼＩＩを欠くこのバッチを試験すると、それは最早、in vivoで十分には有効ではなく、不完全な硝子体辺縁部剥離をもたらした。コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩのプロテオグリカンに対する作用を、さらに、ＴＬＣを用いてin vitroで試験した。以下に詳細に記載するように、ランダムなエンド分解的（endolytic）切断により、コンドロイチナーゼＩは最初の段階で糖類の混合物を生じる。コンドロイチナーゼＩによる広範な消化は３つの最終生成物を生じ、その１つは、最終生成物二糖類（主として６Ｓ形）である。しかし、２つのさらなる消化生成物が見られ、１つは、該二糖類についてのＲ．Ｆ．の約１／３のところに泳動し、他の１つは約２／３のところに泳動する。これとは違って、コンドロイチナーゼＩＩそれ自体はプロテオグリカンを消化しない。しかし、コンドロイチナーゼＩＩをコンドロイチナーゼＩに添加すると、これら２つの消化生成物のいずれもが見られず、その代わり、全ての物質が完全に消化、すなわち、二糖類に消化される。これらの結果は、プロテオグリカンをコンドロイチン硫酸に置き換えても繰り返される。この完全消化は、コンドロイチナーゼＩＩの低い割合でも見られる。９０％コンドロイチナーゼＩ：１０％コンドロイチナーゼＩＩ（ｗ／ｗ）混合物は、プロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸の二糖類への完全な消化を与える。これらの結果は、以下に記載する in vivo実験でも繰り返された。目において、コンドロイチナーゼ蛋白質はプロテオグリカンのコンドロイチン硫酸側鎖を分解するが、プロテオグリカンの蛋白質核は分解しない。したがって、in vitro研究について、該蛋白質によって攻撃される部分がコンドロイチン硫酸であり、コンドロイチン硫酸を得るコストの方が、プロテオグリカンよりも非常に低いので、プロテオグリカンの代わりにコンドロイチン硫酸を使用することが許容される。コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質によるコンドロイチン硫酸の分解生成物の性質をＴＬＣ（図４参照）、ＧＰＣおよびマス・スペクトル分析で試験した。まず、シリカゲル・ベースのＴＬＣを展開し、コンドロイチン硫酸およびプロテオグリカンの二糖類分解生成物を分離し、未知の糖を同定した。二糖類０Ｓ、４Ｓおよび６Ｓは全て分離した。用いた溶媒系は種々の割合の酢酸エチル、酢酸および水を含有するものであった。二糖類は、還元糖を褐色に着色させるアルカリ性硝酸銀で見えるようにした。ＴＬＣは、わずか０．０２５ｍｌの試料を必要とするだけなので、コンドロイチン硫酸と比較して高価なプロテオグリカンの使用も許容された。生成物の分析に一次元ＴＬＣを使用すると、コンドロイチナーゼＩがプロテオグリカンに作用する場合、主生成物である二糖類とは別に生成した未知の組成の２つのオリゴ糖が存在した。これら２つのオリゴ糖は、二糖類についてのＲ．Ｆ．の１／３および２／３のところに移動した。２／３Ｒ．Ｆ．糖は、結局、コンドロイチナーゼＩによって長時間かかって（コンドロイチナーゼＩＩがこの糖を切断する速度の少なくとも１００倍遅い速度）切断されたものであった。反対に、１／３Ｒ．Ｆ．糖は長時間のインキュベーション後も切断されなかった。しかしながら、コンドロイチナーゼＩ蛋白質の１０重量％をコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質に置き換えると、２／３Ｒ．Ｆ．および１／３Ｒ．Ｆ．糖両方共に、検出レベルで蓄積されない程に迅速に消化された。このＴＬＣ実験を、最初はコンドロイチナーゼＩでの消化、ついでコンドロイチナーゼＩＩの消化による二次元で繰り返した。プロテオグリカンをコンドロイチナーゼＩで消化し、ついでＴＬＣの第一の次元に沿ってクロマトグラフィーに付した。分離した糖を、ついで、ＴＬＣプレート上で、純コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質で消化した。プレートを、ついで、第一の次元に用いたと同じ条件で、第二の次元に沿って展開した。かくして、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質によって切断されない糖は対角線に沿って移動し、切断された糖は、生成物が異なった移動特徴を有し、生成物が対角線から遠ざかるように移動した。この結果は、Ｒ．Ｆ．の約１／３のところに移動したオリゴ糖を除いて全てのスポットが対角線にあったことを示している。これは、コンドロイチナーゼＩによるプロテオグリカンの消化によって生成した大部分の糖は、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質により、さらに消化されなかったことを意味する。しかしながら、この特定のオリゴ糖は対角線位置から完全になくなり、その代わり、より速く移動する２つのスポットを示し、２つのより小さい糖に切断されたことを示している。ついで、マイクロ・プレパラティブ（micro-preparative）法を用いてＴＬＣを繰り返し、ＴＬＣプレートからこれらの未知の糖を掻き取り、抽出して単離した。これらの単離した糖を、ついで分析した。１０ｍｇのプロテオグリカン（IN C Biomedical Costa Mesa，CA）を、組換体または精製した天然のコンドロイチナーゼＩ蛋白質８μｇで３７℃にて１時間消化し、生成物をＴＬＣプレート上、試料をストリーク（streaks）で負荷してクロマトグラフィーに付した。クロマトグラフィー後、ＴＬＣプレートから５ｍｍづつ離れたバンドとしてシリカ・ゲルを掻き取った。これらのシリカ・ゲルをプールし、脱イオン水を用いて３回抽出した。これは、これらのフラクションに存在する大部分のオリゴ糖を可溶化するものと予想された。これらのフラクションを、ついで、ＴＬＣ上でクロマトグラフィーに付し、目的とするオリゴ糖を含有するフラクションを同定した。二糖類を含有するフラクションも同定し、以降の実験における対照として使用した。マイクロ・プレパラティブＴＬＣから回収された糖試料（１／３Ｒ．Ｆ．糖）の分析は十分には成功しなかった。これは、多分、ＴＬＣプレートからの抽出されたシリケートと糖の干渉によるものであった。この方法で回収された糖の量が少ないことも、さらなる分析を困難にした。プロテオグリカンは少量でも高価であり、また、商業的に多量に入手できないので、この物質を基質として使用すると、大規模な消化生成物の回収は非常に困難である。別のアプローチとして、豊富で、比較的安価な基質であるコンドロイチン硫酸を使用した。この基質は、少量の、部分的に分解したプロテオグリカンで汚染されていた。さらに、ＧＰＣを糖の単離に使用した。ＧＰＣは、糖の良好な分離を提供し、分析に適した量で回収された。また、シリケート汚染も除去された（マイクロ・プレパラティブＴＬＣとは異なり）。消化物を得るために、組換的に発現されたコンドロイチナーゼＩ蛋白質を用いた。この消化物を、ついで、ＧＰＣを用いてクロマトグラフィーに付した。２つの天然コンドロイチナーゼ蛋白質では、上記の精製法を使用しても、痕跡量（１％以下）の各蛋白質が他の蛋白質中に認められ、これは、所望の四糖類の収率を低下させて結果に影響した。これは、in vivoでは関係ないものと理解される。したがって、天然の精製したコンドロイチナーゼ蛋白質は、目における完全な硝子体辺縁部剥離を起こさせるのに適当である。天然のコンドロイチナーゼＩＩと共に組換体コンドロイチナーゼＩを使用するのが好ましいのは、in vitroの研究においてのみである。組換体コンドロイチナーゼＩは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した試料（ＡＴＣＣ６９２３４）の使用により、コンドロイチナーゼＩをコードする遺伝子のイー・コリ（E．coli）における発現で得た。組換体コンドロイチナーゼＩはコンドロイチン硫酸を、溶媒として０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で展開するＧＰＣ（Spectra／Gel TAc，Spectrum Med ical Industries Inc.，Los Angeltes，CA）からの４つのピークとして回収した生成物に消化する。Ｉと称する第１のピークは、空隙容量で溶出する小さいピークであり、還元糖を含有していなかった。これは主にコンドロイチナーゼＩであった。ＩＩと称する第二のピークは、ＩＩａおよびＩＩｂと称する２つの別々の成分からなっていた。ＩＩａは、１／３Ｒ．Ｆ．糖を豊富な形で含有しており、ＩＩｂは過剰硫酸化二糖類となっていた。ＩＩＩと称される最も大きい第三のピークは床容量に近く溶出され、ほとんど純粋な二糖類からなっていた。このＧＰＣを図５に示す（ピークＩＩＩはＩＩＩａおよびＩＩＩｂと表示している）。ピークＩＶは、非糖成分からなる。（コンドロイチン硫酸の代わりに、少量のプロテオグリカンを用いるＧＰＣ−ＨＰＬＣ系で、この操作を繰り返すと、同様な結果が得られた）。図５のＧＰＣからのピークをＴＬＣで分析し、目的のオリゴ糖（ピークＩＩａ）が上記の溶媒系で、消化物の主成分フリーの二糖類を溶出することを認めた。フラクションを凍結乾燥してＴＦＡ／水を除去し、分析した。消化された物質の約１／４が、オリゴ糖からなり、塩フリーの白色結晶粉末として得られた。このＴＬＣの結果を図６に示す。すべて１０００：１の基質：蛋白質比率として、異なるコンドロイチナーゼ蛋白質標品と精製オリゴ糖をインキュベーションした。純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は迅速にオリゴ糖を二糖の位置に移動する生成物にまで消化した。試験した最初の時点（１５分）において完全な消化が得られた。期待されたように、無傷のコンドロイチナーゼＩ蛋白質はこのオリゴ糖に影響を及ぼさず、試験の最終時点（４時間）においてさえも二糖は生成されなかった。純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質ほど迅速ではないが、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の共精製混合物（６０：４０ｗ／ｗ）も、このオリゴ糖を開裂した。重要なことに、オリゴ糖の開裂速度は、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質含量と非常によく対応していた。この観察結果により、オリゴ糖は、活性コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を定量するための、コンドロイチナーゼＩを妨害しない特異的基質として有用であることが示される。エレクトロスプレー・マス・スペクトル法（electrospray mass spectrometry ）を用いてピークＩＩａに対応するオリゴ糖を分析し、９１８ダルトンに相当するスペクトルを得た。この観察された質量は組成「Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ」からなる四糖の計算質量と非常によく一致する。ここに、２種の糖ＡおよびＢはそれぞれＤ −グルクロン酸および硫酸基が１個ついたＮ−アセチルＤ−ガラクトサミンであり、それらはコンドロイチン硫酸の繰り返し単位である。唯一プロトン化された糖であると同定された９１９ダルトン（Ｍ＋Ｈ）の主ピークのほかにも数個の小ピークが存在し、試験的な同定とともにそれらの質量を強度順に示すと：８３９ダルトン（Ｍ−ＳＯ₃）：１個硫酸基が失われた糖９０１ダルトン（Ｍ−Ｈ₂Ｏ）：１個水が失われた糖９４１ダルトン（Ｍ＋Ｎａ）：１ナトリウム塩８１１ダルトン（Ｍ−ＳＯ₃−Ｈ₂Ｏ）、７５９ダルトン（Ｍ−２ＳＯ₃）、７４１ダルトン（Ｍ−２ＳＯ₃−Ｈ₂Ｏ）であり、あとは他の組み合わせに由来する痕跡程度の他の関連ピークであった。さらに、いくつかの小さな未同定ピークも検出され、特に、４３１ダルトンと５３１ダルトンの２つのピークが検出された。後者の質量は２個硫酸基のついた二糖の予想質量と非常によく一致した。コンドロイチナーゼＩはコンドロイチン硫酸を部分的に分解し、不飽和の、２個硫酸基がついた四糖を生じ、四糖は、その化学式から計算され、さらにエレクトロスプレー・マス・スペクトル法により観察された９１８ダルトンの分子量を有する。四糖の主要形態（約６０％）の構造を図７に示し、ここに硫酸結合側鎖は左から２番目および４番目の環の６位にある。四糖の主要でない形態（約４０％；示さず）は、この硫酸結合側鎖を２番目および４番目の環の４位に有する。該４Ｓおよび６Ｓの糖は、コンドロイチナーゼＩＩにより、同様な速度で消化されて二糖を生じる。該四糖を、Δ４,５−Ｄ−グルクロン酸−β(１→３)−２− Ｎ−アセチル,６−スルホ,Ｄ−ガラクトサミン−β(１→４)−Ｄ−グルクロン酸 −β(１→３)−２−Ｎ−アセチル,６−スルホ,Ｄ−ガラクトサミン（図７）と称す。下表１はコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの特徴を掲載する。アッセイ四糖は、コンドロイチナーゼＩによる開裂に耐性であるので、コンドロイチナーゼＩＩのアッセイの開発のための良好な候補である（コンドロイチナーゼＩにより四糖の二糖への少しの開裂が起こるが、消化速度はコンドロイチナーゼＩＩについて見られる速度の数百分の一である）。逆に、コンドロイチン硫酸はコンドロイチナーゼＩＩによる開裂に耐性がある。in vitroでは、コンドロイチナーゼＩＩにより四糖は２〜３分のうちに完全に開裂されるが、同量のコンドロイチナーゼＩによっては数時間かけても開裂されない。上記情報を用いて、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の活性測定のためのアッセイを開発した。このアッセイは、四糖の二糖への変換を、高品質液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によりモニターする。コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は四糖を二糖に変換し、ポリメタクリル酸をマトリックスとして用いるショーデックス−ＯＨパックＫＢ−８０２（日本国、東京のショーコー（Shoko）社製）のごときＧＰＣ−ＨＰＬＣカラムによるＨＰＬＣにより二糖は基質から分離される。アッセイを以下のように行う。まず、四糖基質を適当な溶液中に調製する。純粋な四糖を水に溶解して約２倍のごとく適当に希釈する。好ましくは、０.１ＭＮａＯＨのごとき適当な塩基性溶媒を用いてｐＨを約８ないし９に合わせる。ストック用ホウ酸バッファー,ｐＨ８.５のごときバッファーを添加して最終バッファーモル分率を５ｍＭ,ｐＨ８.５とする。体積を調節して、濃度０.２〜２０ｍｇ／ｍｌのごとき適当な四糖基質溶液とする。次に、０.１〜５μｇ／ｍｌのごとき適当に希釈（好ましい希釈は２μｇ／ｍｌ）したいずれか一方の、あるいは両方のコンドロイチナーゼ蛋白質の混合物を基質溶液に添加する。コンドロイチナーゼ蛋白質に対する基質溶液の好ましい比率は６：１（ｖ／ｖ）である。アッセイ溶液を１０〜５０℃、好ましくは３７℃で適当時間、例えば１５分インキュベーションし、次いで、ショーデックス−ＯＨパックＫＢ−８０２（日本国、東京のショーコー（Shoko）社製）のごときＧＰＣ−ＨＰＬＣカラムを用いるＨＰＬＣによりクロマトグラフィーを行う。アニオン交換、疎水性相互作用、および逆相のごとき他のクロマトグラフィー法も適する。上記のごときＧＰＣ−ＨＰＬＣカラムに消化基質を負荷することにより二糖生成物を検出し、評価する。移動相は水中０.０３％ＴＦＡである。アセトニトリル−水、またはリン酸およびホウ酸のようなバッファーのごとき他の移動相を用いることもできる。不飽和四糖基質および二糖生成物のベースライン分離が存在する。これら２つのピークの下での物質の相対量を、例えば、一定の波長における吸光度の測定、質量分析、誘電率、屈折率および粘度を測定し、すでに精製されＴＬＣおよび他の方法により同定された標準物質と比較することにより評価する。２３２ｎｍにおける吸光度を測定することが、しばしば好ましい。ＧＰＣを用いると、四糖は二糖の前に溶離する。ＮａＯＨでｐＨを８.５に合わせ、３７℃で短時間（３０分まで）インキュベーションするような数段階の工程の間は、四糖は安定であることが示されている。コンドロイチナーゼ蛋白質に対する基質が高い比率である場合、例えば、２００００：１（ｗ／ｗ）でさえも、精製コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は、初期の時点の間、ほぼ直線的な割合で四糖を二糖に変換する。組み換えコンドロイチナーゼＩ蛋白質はこの変換を行うことができない。しかしながら、予想されたように、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の精製混合物（８５：１５ｗ／ｗ）はこの変換を触媒する。この変換の速度は、純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質について見られる速度よりも正比例的に遅く、さらに予想されたように、そのことはコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が低含量であることと一致する。コンドロイチナーゼ蛋白質の濃度が１００倍増加した場合（２００：１基質：コンドロイチナーゼ蛋白質）、純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質および８５：１５の共精製蛋白質混合物は、１５分で二糖への完全な変換を引き起こす。この高濃度を組み換えコンドロイチナーゼＩに用いても、有意な活性は検出されない。よって、このin vitroアッセイは、コンドロイチナーゼＩＩ含量のみに依存する四糖の二糖への変換をモニターする有用な方法を提供する。しかしながら、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の混入（約１ないし２％）が知られているプロテウス（Proteus）由来のコンドロイチナーゼＩを単独で用いる場合、コンドロイチナーゼＩは高度に精製した場合でさえも検出可能な変換を示す。精製種々の方法を用いて無傷のコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を単離し、精製することができるが、好ましい方法を説明する。この方法は、まず、ピー・バルガリス（P.Vulgaris）発酵物の粗抽出物からのコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の共精製を包含する（図９参照）。典型的には、共精製プロセスは、重量比率で約６０％のコンドロイチナーゼＩ：４０％のコンドロイチナーゼＩＩを生じるが、約８０％のコンドロイチナーゼＩ：２０％のコンドロイチナーゼＩＩの比率も得られることがわかる。次いで、さらなるカチオン交換クロマトグラフィーのごときさらなる処理工程により共精製蛋白質を相互に分離する。コンドロイチン硫酸を認識するコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の共精製のためにアフィニティ・クロマトグラフィー系を用いる。最初に、カチオン交換樹脂を用いてピー・バルガリス（P.Vulgaris）発酵物の粗抽出物からコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を結合させる。樹脂に結合しない混入蛋白質をカラムから洗浄する。コンドロイチン硫酸溶液を用いてコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質のアフィニティ溶離を行う。共溶離された蛋白質にはコンドロイチン硫酸およびその消化生成物が混入している。純粋でない混合物をアニオン交換樹脂に負荷することにより最終的な共精製を行う。樹脂はコンドロイチン硫酸、他の蛋白質、ＤＮＡおよびエンドトキシンならびに消化生成物を結合するが、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は結合せずに流出する。大規模に行う場合には、塩化ニッケルで帯電していて平衡化された樹脂を用いて最後の共精製を遂行する。大部分の残存混入蛋白質は流出するが、対象とする２種の蛋白質は結合する。次いで、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を樹脂から溶離する。ニッケル塩が好ましいが、亜鉛、銅および鉄のごとき他の塩も許容される。単純なクロマトグラフィー系を用いてピー・バルガリス発酵物から蛋白質を溶離する。さらに蛋白質を精製するが、蛋白質は効力の損失なくその生物学的活性を保持する。このプロセスに用いる樹脂を容易に調製でき、酸、アルカリサイクルでの再生という単純な処理により再利用できる。さらにそのうえ、イオン交換樹脂は比較的安価である。共精製蛋白質は、目の手術における硝子体の完全な辺縁部剥離における使用に適する。所望ならば、さらなるイオン交換クロマトグラフィーを包含するさらなる処理工程により共精製蛋白質を相互に分離することができる。別々に分離された蛋白質を共精製法により得られる割合とは異なる割合で使用することができる。詳細には、２種の蛋白質の共精製を下記のごとく行う。誘導されたピー・バルガリス発酵物を遠心分離し、得られたペレットをｐＨ６.８のリン酸ナトリウムバッファーに懸濁し、次いで、均質化する。ｐＨは６.５ないし７.０の範囲が最も好ましい。５.８ないし７.４の範囲も好ましい。５.８未満のｐＨでは酸性条件下での蛋白質沈殿により活性が消失する。活性の消失はｐＨ５未満において最も重大である。リン酸以外のバッファーを用いることもできる。好ましくは、酢酸を用いて上清をｐＨ６.８かつ少なくとも３ミリシーメンス（milliSiemens）／ｃｍまたはそれ未満の誘電率に合わせる。適当な誘電率は、引き続き行うカチオン交換樹脂へのコンドロイチナーゼ蛋白質の完全な結合を行うために重要である。誘電率は３ミリシーメンス／ｃｍ未満でなければならないことが実験で決定されている。これらの工程を行うことによって、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が次の工程のカチオン交換樹脂に結合する効率が増大する。約４〜５ミリシーメンス／ｃｍの誘電率までは少量のものは結合する。より高い誘電率により、蛋白質の大部分が非結合フラクションへと失われる。ｐＨを合わせ、清澄化し、均質化した抽出液をカチオン交換樹脂支持体マクロプレプ・ハイＳ（Macro-Prep^TMHigh S）（ニューヨーク州メルビルのバイオーラッド・ラボラトリーズ（Bio-Rad Laboratories））上に負荷する。好ましいカチオン交換樹脂は最小量の樹脂を用いることのできる高効率カチオン交換樹脂である。他の負に帯電した基も本発明における使用に適する荷電支持体樹脂材料に含まれる。例えば、カルボキシメチル（ＣＭ）を用いることもできる。いくつかの市販支持体を用いることができる。例えば、負に帯電し、正に帯電した蛋白質に結合しうる限り、アルリル支持体であるMacro-Prep^TM、または他の通常使用されるデキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、シリカ、もしくはポリメタクリル酸のごとき支持体を用いることができる。コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は樹脂に結合するが、大部分の蛋白質混入物は流出する。樹脂をｐＨ６.８のリン酸ナトリウムバッファーで洗浄して２８０ｎｍにおける吸光度をゼロ近くにし、次いで、ｐＨ８.３のホウ酸ナトリウム溶液で平衡化する。次の工程における有効／特異的溶離のためにこのｐＨ調節は重要である。このｐＨはコンドロイチナーゼ活性の最適ｐＨに近い。このｐＨにおいて、樹脂に結合したコンドロイチナーゼ蛋白質と過剰の遊離基質との間の非常に高度な特異的相互作用が存在して特異的溶離が引き起こされるが、非コンドロイチナーゼ蛋白質（混入物質）は結合したままである。このｐＨは蛋白質の等電点にも近く、そのことにより溶離がより容易になる。ｐＨ８.３ないし８,５が最良の結果をもたらし、最も好ましいのであるが、８ないし９のｐＨを用いることができる。このｐＨ範囲にある他のバッファーも許容される。８.５ないし９の好ましいｐＨ範囲のコンドロイチン硫酸１％水溶液を用いてアフィニティ溶離を行う。溶離ｐＨが７未満の場合には効率が低下する。ｐＨを水酸化ナトリウムで合わせる。他のアルカリを用いることもできる。基質濃度は０.２％程度ないし１０％程度であってよい。しかしながら、より低いパーセンテージはより低い収率となり（０.５％未満）、より高いパーセンテージは溶離液の誘電率を高めるため、高レベルの混入蛋白質を生じる。コンドロイチナーゼ活性の回収率は約７２％であり、蛋白質純度９０ないし９９％のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質混合物となる（図９参照）。溶液中にバッファーがないので（コンドロイチン硫酸は脱イオン水に溶解されている）コンドロイチン硫酸溶液のｐＨを調節するが、ｐＨを樹脂の平衡ｐＨ近く（先に溶離に使用したホウ酸バッファーのｐＨ）に維持し、この場合ｐＨ８. ３である。基質を用いる溶離により、塩溶液を用いるよりも高いコンドロイチナーゼ蛋白質純度が得られる。さらに、塩で溶離された蛋白質は、次のイオン交換工程の前にさらなる脱塩／透析濾過工程を必要とするが、アフィニティ溶離された蛋白質には必要ない。このことは、塩溶離に必要な誘電率は１％コンドロイチン硫酸溶液の約２０倍以上であるからである。好ましくは酢酸で、アフィニティ溶離された蛋白質プールを簡単にｐＨ６.８に合わせ、アニオン交換樹脂支持体マクロプレプ・ハイＱ（Macro-Prep^TMHigh Q ）（バイオーラッド；Ｑは４級アンモニウムを表す）または同等の効果の樹脂に負荷する。好ましいアニオン交換樹脂は最小量の樹脂の使用が可能な高効率アニオン交換樹脂ある。ＤＥＡＥのような他の正に帯電した基も使用可能である。コンドイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の両方がカラムから共溶離され、コンドロイチン硫酸およびその消化生成物が他の蛋白質、ＤＮＡ、およびエンドトキシンとともに樹脂に結合する。樹脂はコンドロイチン硫酸を除去し蛋白質純度を高めることができるのみならず、エンドトキシンの除去においても非常に効率的である。この工程における回収率は８６％であり、コンドイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の純度は９５〜９９％まで上昇する（図１０参照）。１０００リットルの醗酵スケールでは、カチオン交換カラムおよびアニオン交換カラムによる連続精製後の共精製コンドロイチナーゼＩおよびＩＩ酵素蛋白質純度は研究室スケールの精製で得られる純度よりも低い。金属キレートアフィニティ・クロマトグラフィー（ＭＣＡＣ）を用いる第３のクロマトグラフィー工程を用いて蛋白質純度を改善する。分離は、不溶性支持体に結合したキレート金属と相互作用する蛋白質の能力の相違に基づく。蛋白質は、主としてそのヒスチジンまたはシステイン含量により結合する。金属イオンおよび負荷バッファーのｐＨならびに塩濃度を変化させることにより、混入蛋白質が流出してコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質のみが結合する条件が確立される。ｐＨ８の５０ｍＭトリス−酢酸中、０.２ＭＮａＣｌ存在下のの５０ｍＭイミダゾールを溶離バッファーとして溶離することにより、in vivo活性を失うことなく９８％の蛋白質純度が得られる。イミダゾールが溶離蛋白質中に存在してもよく、水またはバッファーに対する透析または透析濾過により蛋白質から分離することができる。さらなる処理工程により共精製蛋白質を相互に分離することができる。その後、別々に精製された蛋白質を、共精製法により得られる割合とは異なる割合で再処方することができる。共精製コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を含有する溶離液をｐＨ６.８に合わせる。ホウ酸バッファー,ｐＨ８.５でカラムを洗浄する。ホウ酸バッファー中０〜１５０ｍＭＮａＣｌのグラディエントで、２種のコンドロイチナーゼ蛋白質をカラムから溶離する。別法として、ホウ酸バッファー中５０ｍＭＮａＣｌの単一モル濃度溶液も同等に効果的である。各場合において、コンドロイチナーゼＩ蛋白質は初めの方のフラクションに溶離され、後の方のフラクションに溶離されるコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質から分離される（図１１参照）。精製コンドロイチナーゼＩフラクションのアミノ末端配列は単一配列を生じ；精製コンドロイチナーゼＩＩフラクションのアミノ末端配列も別の単一の配列を生じる。各蛋白質は９８〜９９％の純度、８５〜９５％の収率で共精製蛋白質混合物から回収される。辺縁部剥離および治療組成物硝子体は目の５分の４の体積を占める結合組織コンパートメントであり、目の組織に対する構造上および代謝上の維持を提供する一方で、眼内圧の維持および網膜への光の到達を可能にしている。しばしば硝子体は、変性または炎症傷害部位の縁において網膜への２次的付着を形成する。次に、こらの付着は網膜表面上にピボット点を形成し、しばしば網膜は辺縁部剥離を起こす。硝子体切除術は硝子体の一部の外科的除去であり、処置されないならば失明を引き起こしうる病理学的状態、術中もしくは術後の状態の治療または予防に必要である。選択的および完全に目の硝子体を辺縁部剥離する方法を用いて硝子体切除術を行うことが好ましい。該方法は、コンドロイチン含有プロテオグリカンが硝子体網膜付着に関与しており、そのプロテオグリカンに作用する組成物は目の残りの部分に悪影響を与えることなく硝子体の辺縁部剥離を行うであろうという知識を利用する。単離され精製された無傷のコンドロイチナーゼＩおよびＩＩ蛋白質は、外科的硝子体切除術に必要な完全な辺縁部剥離を引き起こすのは個々の蛋白質のいずれかというよりはむしろ該２種の蛋白質の組み合わせであることを示す。本発明の１の態様は、硝子体網膜付着部位に特異的に局在化しているコンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン／プロテオグリカンを分解する有効量の２種のコンドロイチナーゼ酵素、すなわち、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを目に投与することからなる。コンドロイチン硫酸は、比較的高分子量のプロテオグリカンに結合したグリコサミノグリカンである。コンドロイチン硫酸は硝子体網膜付着の原因であり、コンドロイチン硫酸の分解は硝子体の完全な辺縁部剥離を引き起こす。これら２種の蛋白質の使用は硝子体網膜界面の酵素的崩壊を、特に、目の硝子体の酵素的辺縁部剥離（完全除去）のために提供する。 in vivoで、目の硝子体の完全辺縁部剥離に必要とされる２種のコンドロイチナーゼ蛋白質の用量を治療時間に応じて変更する。一般的には、治療期間が短いほど用量は多いが、その用量が網膜または繊毛体の損傷を引き起こすほど多くてはならないという制限がある。治療時間は１分から数時間までである。一般的には、目の網膜神経からの硝子体の選択的および完全辺縁部剥離には、外科用または治療用組成物は１ないし１００００単位（ＣＩ活性単位）の間のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質混合物を含有する。好ましくは、外科用または治療用の用量は約１５０ないし約１５００単位の間であろう。１単位は、３７℃、ｐＨ８.０において１分間にコンドロイチン硫酸から１マイクロモルの不飽和二糖の生成を触媒する蛋白質量である。完全に辺縁部剥離されるべき硝子体１ミリリットルあたりの蛋白質の単位についても用量が計算され、かくして用量は、１ｍｌあたりかかる単位数として０.０５〜０.１程度であってよい。医薬上許容される緩衝化溶液１ミリリットルあたりのミリグラム数について蛋白質活性を表すのがより好ましいかもしれない。コンドロイチナーゼＩに関しては５００単位／ｍｌが１ｍｇ蛋白質／ｍｌと等価である。好ましい用量範囲は１〜１０ｍｇ全蛋白質／０.４ｍｌ緩衝セイライン溶液（ＢＳＳ）であり、４ｍｇ全蛋白質／０.４ｍｌＢＳＳの用量が特に好ましい。次に、好ましい蛋白質の比率は、９０％コンドロイチナーゼＩ：１０％コンドロイチナーゼＩＩ（ｗ／ｗ）ないし６０％コンドロイチナーゼＩ：４０％コンドロイチナーゼＩＩ（ｗ／ｗ）の範囲である。好ましくは、濃縮蛋白質を緩衝液と混合することにより得られる医薬上許容される緩衝化溶液中に入れてコンドロイチナーゼ蛋白質を投与する。いかなる適当な緩衝液を用いてもよいが、適当な緩衝液は酢酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、または Balanced Salt Solution（テキサス州フォート・ワースのアルコン（Alcon）社製）を包含する。ｐＨ範囲４.５〜９.０、好ましくは約ｐＨ８.０において蛋白質は有効である。それゆえ、蛋白質用の緩衝化溶液について好ましいｐＨ範囲は約７〜８である。典型的な処方または１回分の剤型は、共精製もしくは単離された酵素および医薬上許容される賦形剤の両方を含有する滅菌凍結乾燥ケークを包含する。適当な賦形剤はクエン酸バッファーおよびデキストロースを包含するが、これらに限らない。医薬上許容される希釈剤を添加してもよい。適当な希釈剤は、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、および例えばＢＳＳ（コネチカット州ストールスのアルコン・サージカル・インコーポレイテッド（Alcon Surgical Inc.））のごとき水を含有するバランス塩希釈剤のようなバランス塩である。典型的には、凍結乾燥ケークは賦形剤を含み、典型的には、使用前に体積０. ５ないし２.０ｍｌの希釈剤中に復元される。例えば、マトリックスを確定し、各用量を患者に割り当てることにより、適当な用量が当業者により決定されうる。処方に関する非限定的な実施例を下表２に示す：サルにおけるin vivo試験により治療構成を示す。サルを麻酔し、硝子体内、硝子体下、レンズ下および後眼房投与のごとき当業者に知られた手段により２種のコンドロイチナーゼ蛋白質を目に投与する。１の手順において、目における第１の孔を通して挿入した硝子体切除器具により硝子体の一部を除去する。目における第２の孔を通して挿入したエンドイルミネーター（endoilluminator）により外科医用の光を供給する。注入ターミナルと呼ばれる第３の孔を通して本発明蛋白質溶液を注入することにより硝子体の残りを除去する。溶液は硝子体を通って拡散し、２種のコンドロイチナーセ蛋白質が作用して、硝子体を網膜に付着させているコンドロイチン硫酸を分解する。１５分程度のうちに分解完了後、完全に辺縁部剥離された硝子体を吸引により除去し、目をセイライン溶液ですすぐ。次いで、注入ターミナルを通して適正な圧力の緩衝液を投与する。時間がたつと、身体は硝子体を本質的に再構成するのに必要な分子を合成する。動物を屠殺し、肉眼試験、組織学ならびに病理学的試験、ソノグラフィー、透過型電子顕微鏡、および抗コンドロイチン硫酸抗体の使用のごとき方法により目を分析する。辺縁部剥離が不完全である場合、例えば、コンドロイチナーゼＩのみを投与する場合、硝子体床の領域の硝子体の一部は大型で、鉗子によって掴むことができる。完全な辺縁部剥離が行われる場合に網膜に対する損傷が観察されないという点で、２種のコンドロイチナーゼ蛋白質の選択性が示される。一連のサルの硝子体切除実験を行い、種々の精製プロテウス・コンドロイチナーゼ標品を試験した。これらの実験を以下にまとめる。いくつかの醗酵バッチのうちの１つから単離され精製された両方のコンドロイチナーゼ蛋白質を含有する組成物を与えられたサルは硝子体を辺縁部剥離した。コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を除去するために分画されたバッチは不完全な辺縁部剥離を引き起こした。組織に関する組織学により、コンドロイチナーゼＩＩが投与された用量中に含まれていなかった場合に未消化コンドロイチン硫酸が存在することが示された。コンドロイチナーゼＩＩを欠く分画されたバッチに精製コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を添加し直した場合（全蛋白質の約１２重量％まで）、うまく辺縁部剥離が行われた。外科的判断基準によるこれらの標品の評価に基づくと、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は完全な硝子体辺縁部剥離を行うことにおいて必須の役割を果たすと結論される。コンドロイチナーゼＩＩを含まない場合、コンドロイチナーゼＩのみでは動物モデルにおける完全な硝子体の辺縁部剥離の遂行には効果的でなかった。好ましい具体例の記載以下の実施例は本発明を制限することなく説明する。実施例１．精製誘導されたプロテウス・バルガリスのマッシュ（１０Ｌ容量）を６,４００ｇで２０分間遠心分離に付した。ペレットをpＨ６.８で１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液に再び懸濁させ、ついで再び遠心分離に付した。洗浄したペレットを前記の緩衝液に再び懸濁させ、Ｇaulinホモジナイザーを介して〜９０００p.s.i. で３回ホモジネートした。そのホモジネート（１.８リットル）を１７,７００ｇで１時間遠心分離に付した。大部分の清澄液（１.７リットルのうち１.４リットル）を１Ｍ酢酸を用いてpＨ６.８に、および脱イオン水で希釈することで３ミリジーメンス／ｃｍの伝導度に調整した。これらの工程は共にコンドロイチナーゼ蛋白質の以下に示すカチオン交換体への有効結合を確実にした。調整かつ清澄ホモジネート（６２.４Ｋ単位のコンドロイチナーゼＩ酵素活性を含有する２.４リットル（ＥＣ＃４.２.２.４））を、１８４単位／ｍｌの樹脂を負荷した、床容量３４０ｍｌのマクロプロプ・ハイＳカチオン交換カラム（Ｂio-Ｒad，Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）に載せた。コンドロイチナーゼ蛋白質は樹脂に結合していたが、夾雑蛋白質の大部分は結合せずに、流れ出た。該カラムを〜４床容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.８）で洗浄し、２８０ｎｍでの吸光度をベースライン近くにした。該樹脂をpＨ８.３で〜６床容量の４０ｍＭホウ酸ナトリウムで平衡にした。アフィニティ溶出を、ＮaＯＨでpＨを約８.５〜９に調整した、コンドロイチン硫酸（Ｆluka Ｂiochemicals）の水中１％溶液を用いて行った。２種の蛋白質が、床容量の約半分にて、鋭いピークで特異的に溶出した。コンドロイチナーゼ活性の回収は７２％であり、蛋白質の９６〜９８％はコンドロイチナーゼＩとコンドロイチナーゼII蛋白質の混合物であった。アフィニティ溶出した蛋白質プールを酢酸を用いてpＨ６.８に調整し、pＨ６. ８で平衡にした、床容量８５ｍｌのマクロプロプ・ハイＱアニオン交換樹脂（Ｂ io-Ｒad，Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）に載せた。コンドロイチナーゼ蛋白質は共に結合せず溶出したが、コンドロイチン硫酸およびその消化生成物はハイＱ樹脂に結合した。コンドロイチン硫酸およびその分解生成物の除去を、負荷物および流出物中の硫酸塩を微量分析に付し確認した。この工程により、負荷物中の硫酸塩の９９.６％が除去され、残りの０.４％は主として灰化の間に蛋白質のメチオニンの硫黄が部分酸化されたことによると説明することができる。コンドロイチン硫酸およびその生成物の除去に加えて、純度が約９８〜９９％まで上昇した。この工程の回収物は３８.３Ｋ単位のコンドロイチナーゼ（８６％）であった。実施例２ − 精製誘導されたプロテウス・バルガリスのマッシュ（２.６Ｌ容量）を６,４００ｇで２０分間遠心分離に付した。得られたペレットをpＨ６.８で３５０ｍｌの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に再び懸濁させ、ついで再び遠心分離に付した。ペレット（１４２ｇ）を脱イオン水（３５０ｍｌ）に再び懸濁させ、約１０,０００p.s.i.で３回ホモジネートした。そのホモジネートを１７,０００ｇで１時間遠心分離に付すことで清澄化し、清澄化ホモジナートを１Ｍ酢酸を用いてpＨを６.８に調整し、脱イオン水で３ミリジーメンス／ｃｍの伝導度にまで希釈した。調整かつ清澄化されたホモジナート（８５０ｍｌ中に１６.２Ｋ単位）を、床容量１０５ｍｌ（１５４単位／ｍｌの樹脂）のマクロプロプ・ハイＳカラム（Ｂ io-Ｒad，Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）に載せた。ついで、該カラムを約２床容量の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.８）で洗浄し、つづいて約８床容量の４０ｍＭホウ酸ナトリウム（pＨ８.３）で洗浄した。コンドロイチナーゼ蛋白質を次に１ＭＮaＯＨでpＨ９に調整した脱イオン水中１％コンドロイチン硫酸塩で共溶出し、約９６−９８％の純度および８８％の回収率であった。この溶出したフラクションをついで０.１Ｍ酢酸でpＨ６.８に調整し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（pＨ６.８）で平衡にした、床容量１０.５ｍｌのマクロプロプ・ハイＱカラム（Ｂio-Ｒad，Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）に載せた。コンドロイチナーゼ蛋白質が流れ出て、９５％の回収率および約９８〜９９％の純度で収集した。マッシュから精製蛋白質までの回収率は全体で７３％であった。実施例３− 精製７.９ｕ／ｍｌの最終コンドロイチナーゼ能を有するプロテウス・バルガリス醗酵物（１０００リットル）を生成した。醗酵物を脱イオン水（２０００リットル）で希釈し、１２℃に冷却した。希釈したマッシュを流速ないし８０Ｌ／分で遠心分離に付し、細胞固体からの醗酵ブロスを分離した。湿ったマッシュ固体を均質化の前に脱イオン水で希釈した。湿式細胞（２００リットル）をＧaulin Ｍ３ホモジナイザーを用い、８０００p.s.i.および５リットル／分の流速で３回ホモジネートした。該ホモジナートをさらに伝導率を下げるために清澄化の前に脱イオン水で希釈し、ついで遠心分離に付し、細胞残骸を除去した。清澄化ホモジナートをさらに希釈し、伝導率を３ミリジーメンス／ｃｍ以下に下げた。この物質（５７０Ｌ）を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（pＨ６.８）で平衡にした２４Ｌのマクロプロプ・ハイＳカラムカチオン交換（Ｂio-Ｒad、Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）に載せた。流速は１Ｌ／分であった。載せた後、樹脂を約３床容量の１０ｍＭリン酸塩（pＨ６.８）で洗浄し、ついで溶出についての適当なpＨが得られるまで、４０ｍＭホウ酸塩（pＨ８.３）（５床容量）で平衡処理した。負荷したコンドロイチナーゼＩ活性のうち１５％部は樹脂に結合せず、流出物中に検出された。溶出をpＨ８.９で１％コンドロイチン硫酸で行い、２８０ｎｍでの吸光度でモニター観察した。９Ｌを溶出し、吸光度が上昇し始めた後、５Ｌのフラクションを収集した。各フラクションをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性アッセイで分析した。所望のフラクションを合し、５.３５百万単位の回収量および８２％のステップ収率を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるコンドロイチナーゼＩおよびＩＩの純度は８１％であった。ハイＳ溶出液のpＨを、３Ｌマクロプロプ・ハイＱカラム（Ｂio-Ｒad、Ｍelvi lle、Ｎ.Ｙ.）に載せる前に１Ｍ酢酸で６.９に調整した。フィードを見かけ上リニアーな１００ｃｍ／時間の速度で１７８０ｕ／ｍｌ樹脂で樹脂に載せた。コンドロイチナーゼ蛋白質が流出物中にて回収され、それを１のプールで収集した。アニオン交換カラムからのステップ収率は９６％であった。流出物（５.１４百万単位を含有する９.９５Ｌ）を、注射用水に対する透析濾過に付す前に、３０Ｋ螺旋状溝を有するカートリッジを用いて限外濾過により約２Ｌまで濃縮した。ついで、保持体を凍結乾燥した。最終凍結乾燥粉末の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ由来の染色領域％によれば９４％であった。実施例４ − 精製１０Ｌの醗酵物より得られるコンドロイチナーゼ調製物を用いた。そのマッシュを実施例１に記載されているように加工処理した。夾雑蛋白質を含有する副フラクションを用い、大規模生産で得られる低純度を模擬実験した。これは大規模生で得られる純度（すなわち、約９０％純度）と同様なハイＱ工程後の調製を可能とした。これにより出発調製物が第３の金属アフィニティ精製工程に標準化されるようになる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるマクロプロプ・ハイＱからの溶出液の純度は約９０％であった。最終金属アフィニティ精製工程について、２３ｍｌの床容量を有するキレート化セファロース（Ｐharmacia ＬＫＢＢiotechnology，Ｉnc.、Ｐiscataway、Ｎ .Ｊ.）カラムを調製した。樹脂を脱イオン水で洗浄し、ついで１床容量の０.１Ｍ塩化ニッケルを充填した。樹脂を水で洗浄し、非結合ニッケルを除去し、ついで負荷緩衝液（５０ｍＭトリス−酢酸塩（pＨ８.０）、０.２ＭＮaＣl）で平衡処理した。低濃度のリン酸塩を含有するハイＱカラムからの溶出液に、１Ｍトリス酢酸塩（pＨ８）および２ＭＮaＣlを加え、負荷緩衝液の最終濃度の蛋白質溶液を調製した。調製試料を４３０ｕ／ｍｌ樹脂でカラムに載せた。流速は７５ｃｍ／時間の見かけのリニアー速度に対応する１５０ｍｌ／時間であった。試料を負荷した後、樹脂を負荷緩衝液（約５床容量）で洗浄した。活性アッセイおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによる流出体の分析により、負荷された活性の０.５％より少ないが、夾雑蛋白質の大部分はこのフラクションにて回収されることがわかった。出発緩衝液中５０ｍＭイミダゾールで溶出し、単一の蛋白質ピークの溶出液を得、フラクションを収集し、それをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。所望のフラクションを合し、８９％の収率および９６−９８％の推定コンドロイチナーゼ純度を得た。実施例５ − 精製負荷量を増加させる以外（９００ｕ／ｍｌ樹脂）、実施例４と同一条件で精製を繰り返した。カラムの収率は７５％であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるコンドロイチナーゼ純度は９８％であった。溶出液を濃縮し、水中に透析濾過し、凍結乾燥した。実施例６ − 精製７.５ｕ／ｍｌマッシュの誘導されたプロテウス・バルガリスの醗酵（１０００Ｌ）を、最初、実施例２に記載されているように処理した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるマクロプロプ・ハイＱ（Ｂio-Ｒad，Ｍelville、Ｎ.Ｙ.）カラムからの溶出液のコンドロイチナーゼＩおよびＩＩ純度は８３.９％であった。１８ｃｍ径のカラムに約９Ｌのキレート化セファロースのファースト・フロー樹脂（Ｐharm acia ＬＫＢＢioteclmology,Ｉnc.、Ｐiscataway、Ｎ.Ｊ.）を充填した。該樹脂を水で洗浄した後、塩化ニッケルをチャージさせ、０.２ＭＮaＣl含有の５０ｍＭトリス酢酸塩緩衝液（pＨ８）で平衡にした。ハイＱ流出物を５０ｍＭトリス酢酸塩（pＨ８）および０.２ＭＮaＣlの最終濃度に調整した。調製されたフィードを、７５ｃｍ／時間の見かけのリニアー速度に対応する１９.２Ｌ／時間の流速で６００ｕ／ｍｌ樹脂でカラムに載せた。コンドロイチナーゼ蛋白質を該カラムから出発緩衝液中５０ｍＭイミダゾールとした溶出緩衝液で溶出した。ステップ収率は８９％であり、コンドロイチナーゼＩおよびＩＩの純度は８３．９％から９６.４％に上昇した。実施例７ −コンドロイチナーゼ活性のアッセイに用いるための四糖類基質の単離精製された天然のコンドロイチナーゼＩ（５.８ｍｇ）を、０.１ＭＮaＯＨを含む、pＨ８.８に調整された、水（６００ｍｌ）中のコンドロイチン硫酸（Ｆlu ka Ｃhemicals、Ｂushs、スイス国）（８ｇ）に加えた。別法として、イー・コリ発現の組換えコンドロイチナーゼＩ（ＡＴＣＣ６９２３４の発現により利用可能）を用いた。その混合物を３７℃で３時間インキュベートし、部分凍結乾燥処理により５５ｍｌに濃縮した。濃縮物を水中０.１％ＴＦＡで１：１（ｖ／ｖ）に希釈した。コンドロイチナーゼＩはコンドロイチン硫酸を生成物に消化し、それは溶媒として０.１％ＴＦＡで溶出することにより、ゲル浸透カラム（Ｓpectr a／Ｇel ＴＡc、Ｓpectrum Ｍedical Ｉndustries Ｉnc.、Ｌos−Ａngeles，ＣＡ）より４つのピークとして回収された。第１のピーク（Ｉと称する）は空隙容量で溶出する小さなピークであり、コンドロイチナーゼＩからなり、いずれの還元糖をも含まなかった。第２のピーク（ＩＩと称する）はＩＩａおよびＩＩｂと称される２種の異なる化合物からなっていた。ＩＩａは１／３Ｒ.Ｆ. 糖を豊富な形で含有しており、一方ＩＩｂは過剰硫酸化二糖類であった。第３のピーク（ＩＩＩと称する）は床容量に近く溶出される最も大きいものであり、ほとんど純粋な二糖類からなっていた。このＧＰＣを図３（Ｆig.０１９）（ピークＩＩＩはＩＩＩａおよびＩＩＩｂと表示されている）に示す。ピークＩＶは非糖成分からなる。ＧＰＣからのピークをＴＬＣにより分析し、目的の四糖類（ピークＩＩａ）が消化物の主成分不含の二糖類を溶出することがわかった。フラクションを凍結乾燥してＴＦＡ／水を除去し、分析した。消化された物質の約１／４は、白色結晶の塩不含の粉末として、約２００ｍｇの収量で、かつ約９５％の純度で、四糖類からなっていた。実施例８ − 四糖類を二糖類に変換することにおけるコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の活性についてのin vitroアッセイアッセイを以下のように行った。第１に、四糖類基質を適当な溶液に調製した。純粋な四糖類を水中に約２.５ｍｇ／ｍｌまで溶かし、そのpＨを０.１ＭＮa ＯＨで約８ないし９に調整した。ストックのホウ酸緩衝液（pＨ８.５）を加えて５ｍＭの最終モル濃度（pＨ８.５）とした。容量を調整し、四糖類の２ｍｇ／ｍｌ溶液を得た。次に、基質溶液（６０μＬ）に、例えば０.１〜５μｇ／ｍｌのコンドロイチナーゼ蛋白質と、２μｇ／ｍｌの好ましい希釈体のいずれか、または両方の適当に希釈した混合物（１０μＬ）を加えた。アッセイ溶液を３７℃で１５分間インキュベートし、ついで２０μｌの消化基質をＨＰＬＣ、Ｓhodex−ＯＨｐａｋＫＢ−８０２.５ＧＰＣ−ＨＰＬＣカラム（Ｓhoko Ｃo．Ｌtd、東京、日本国）を用い、ＧＰＣでのクロマトグラフィーに付した。移動相は水中０.０３％ＴＦＡであった。四糖類基質および二糖類生成物のベースライン分離があり、２つのピークを、２３２ｎｍでの吸光度、および以前に精製され、ＴＬＣで同定された標品との比較で評価した。これらのＧＰＣの条件下、四糖類は約５.２ｍｌで溶出し、一方、二糖類は約６.３ｍｌで溶出し、その場合、床容量は約１０ｍｌであった。四糖類は、例えば、ＮaＯＨを用いてpＨを８.５に調整し、３７℃で短時間（３０分まで）インキュベートするなどの、数工程のアッセイの間、安定であることがわかった。操作時間は１２分間であるため、選択されるアッセイ時間は、新たにインキュベートされた反応物の連続的な負荷を可能とする１５分間であった。２０,０００：１（ｗ／ｗ）の基質のコンドロイチナーゼ蛋白質に対する比率でさえ、精製されたコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質は、少なくとも初期の時点の間、ほぼ直線的な割合で四糖類を二糖類に変換した。組換えコンドロイチナーゼＩ蛋白質はこの変換を行うことができなかった。しかしながら、予想どおり、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の共精製混合物（８５：１５ｗ／ｗ）はこの変換を触媒した。この変換の速度は、純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質について見られる速度よりもずっと遅く、さらに予想されるように、そのことはコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が低含量であることと一致する。コンドロイチナーゼ蛋白質の濃度が１００倍増加した場合（２００：１の比率）、純粋なコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質および共精製した蛋白質の混合物は共に、二糖類への完全な変換を引き起こした。この高濃度を組換えコンドロイチナーゼＩに用いても、有意な活性は検出されなかった。しかしながら、既知のコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の混入物（約１ないし２％）を含有するプロテウス由来のコンドロイチナーゼＩを単独で用いた場合、コンドロイチナーゼＩはこの高比率で部分的な変換を示した。かくして、このin vitroアッセイは、コンドロイチナーゼＩＩによる四糖類の二糖類への変換をモニターするための有用な方法を提供する。実施例９ − サルにおける硝子辺縁部剥離一連のサル硝子体切除実験を行い、種々の精製したプロテウス・コンドロイチナーゼ調製物を試験した。健康なサルを５つの群に分けた。４つの群に、以下のように０.４ｍｌのＢＳＳ中合計４ｍｇの用量のコンドロイチナーゼ蛋白質を投与した：群１にはコンドロイチナーゼＩを単独で投与した；群２にはコンドロイチナーゼＩＩを単独で投与した；群３にはコンドロイチナーゼＩとコンドロイチナーゼＩＩの６０：４０（ｗ／ｗ）混合物を投与した；および群４にはコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの８８：１２（ｗ／ｗ）混合物を投与した。第５の群は陰性対照として用い、０.４ｍｌのＢＳＳだけを投与した。サルを麻酔し、目の第１の孔を介して挿入された硝子体切除器具によって硝子体の一部を摘出した。外科医用の光は目の第２の孔を介して挿入されたエンドイルミネーターによって供給された。注入ターミナルと称される第３の孔を通して蛋白質溶液を注入することにより硝子体の残りを摘出した。あるとしたなら、分解が完了した後（１５分間）、動物を殺し、肉眼試験、組織学ならびに病理学的試験、ソノグラフィー、透過型電子顕微鏡、および抗コンドロイチン硫酸抗体の使用のごとき方法により目を分析した。結果を以下の表３に示す：本明細書に記載のすべての特許、出願、文献、刊行物および試験方法は出典明示により本明細書の一部とする。当業者であれば、前記した詳細な記載を考慮して、本発明の種々の修飾は明らかである。そのような明らかな修飾は添付した請求の範囲の意図する範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｑ 1/34 9051−4ＣＡ６１Ｋ 37/54 ＡＢＬ //(Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＮＺ，ＵＳ (72)発明者オイル，ウルスラアメリカ合衆国07446ニュージャージー州ラムジー、クレセント・ハーロウ４番

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテウス・バルガリスにより産生されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の共精製法であって、（ａ）誘導されたプロテウス・バルガリスの、pＨ５.８〜７.４を有する清澄ホモジネートを調製し、（ｂ）ホモジネートを陰性荷電のカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、ホモジネート中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを含むいずれの陽性荷電蛋白質をも、陰性荷電担体と非共有結合を形成させ、（ｃ）pＨ７.０〜９.５で、コンドロイチン硫酸の水性溶液で担体からコンドロイチナーゼ蛋白質を、まとめてアフィニティ溶出させ、（ｄ）工程（ｃ）のアフィニティ溶出した蛋白質プールをアニオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せて非結合溶出液を得、（ｅ）非結合溶出液中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を回収することからなる方法。２．工程（ａ）にて調製したホモジネートのpＨが６.５〜７.０であり、３ミリジメーメンス／ｃｍまたはそれ以下の伝導度を有する請求項１記載の方法。３．工程（ｂ）におけるカチオン交換樹脂に載せられたホモジネートがpＨ８〜９に平衡にされている請求項１記載の方法。４．コンドロイチン硫酸溶液のpＨが８.５〜９.０である請求項１記載の方法。５．コンドロイチン硫酸溶液中のコンドロイチン硫酸の濃度が０.２％〜１０％ｗ／ｖである請求項１記載の方法。６．工程（ｅ）が（ｉ）非結合溶出液を金属キレート・アフィニティクロマトグラフィー担体と接触させてコンドロイチナーゼ蛋白質を結合させ、（ii）適当な溶媒で溶出し、（iii）コンドロイチナーゼ蛋白質を回収することからなる請求項１記載の方法。７．金属キレート・アフィニティクロマトグラフィー担体が亜鉛およびニッケルからなる群より選択されるキレート金属からなる請求項６記載の方法。８．プロテウス・バルガリスにより産生されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の個々の精製法であって、（ａ）誘導されたプロテウス・バルガリスの、pＨ５.８〜７.４を有する清澄ホモジネートを調製し、（ｂ）ホモジネートを陰性荷電のカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、ホモジネート中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを含むいずれの陽性荷電蛋白質をも、陰性荷電担体と非共有結合を形成させ、（ｃ）pＨ７.０〜９.５で、コンドロイチン硫酸の水性溶液で担体からコンドロイチナーゼ蛋白質を、まとめてアフィニティ溶出させ、（ｄ）アフィニティ溶出した蛋白質プールをアニオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せて非結合溶出液を得、（ｅ）非結合溶出液中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を回収し、（ｆ）工程（ｅ）にて回収された蛋白質をカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、（ｇ）溶出液として塩化ナトリウムの溶液を用い、コンドロイチナーゼＩ蛋白質およびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を別々に溶出することからなる方法。９．基本的に、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの混合物からなる外科用組成物。 10．さらには、基本的に、医薬上許容される賦形剤からなる請求項９記載の外科用組成物。 11．賦形剤がデキストロースおよびクエン酸塩緩衝液からなる請求項１０記載の外科用組成物。 12．さらには、基本的に、医薬上許容される希釈体からなる請求項１０記載の外科用組成物。 13．希釈体が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび水の混合物からなる請求項１２記載の外科用組成物。 14．外科用組成物が蛋白性安定化剤を含まない請求項９記載の外科用組成物。 15．基本的に、辺縁部剥離に有効な量のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの混合物からなる外科用組成物。 16．コンドロイチナーゼＩの量が１〜１０,０００単位であり、コンドロイチナーゼＩのコンドロイチナーゼＩＩに対する重量／重量の比率が９：１ないし６：４の範囲である請求項１５記載の外科用組成物。 17．コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩが、以下の工程：（ａ）誘導されたプロテウス・バルガリスの、pＨ５.８〜７.４を有する清澄ホモジネートを調製し、（ｂ）ホモジネートを陰性荷電のカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、ホモジネート中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを含むいずれの陽性荷電蛋白質をも、陰性荷電担体と非共有結合を形成させ、（ｃ）pＨ７.０〜９.５で、コンドロイチン硫酸の水性溶液で担体からコンドロイチナーゼ蛋白質を、まとめてアフィニティ溶出させ、（ｄ）アフィニティ溶出した蛋白質プールをアニオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せて非結合溶出液を得、（ｅ）非結合溶出液中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を回収することからなる共精製法により調製される請求項１５記載の外科用組成物。 18．共精製されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩからなる外科用組成物。 19．さらには、医薬上許容される賦形剤からなる請求項１８記載の外科用組成物。 20．賦形剤がデキストロースおよびクエン酸塩緩衝液からなる請求項１０記載の外科用組成物。 21．さらには、基本的に、医薬上許容される希釈体からなる請求項１９記載の外科用組成物。 22．希釈体が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび水の混合物からなる請求項２１記載の外科用組成物。 23．辺縁部剥離に有効な量の共精製されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩからなる外科用組成物。 24．コンドロイチナーゼＩの量が約１５０〜約１５００単位である請求項１０に記載の外科用組成物からなる投与単位。 25．コンドロイチナーゼＩの量が約１５０〜約１５００単位である請求項２４に記載の外科用組成物からなる投与単位。 26．目の神経網膜から硝子体を選択的かつ完全に辺縁部剥離させる方法であって、かかる処理を必要とする目に、辺縁部剥離有効量の基本的にコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩの混合物からなる外科用組成物を投与することからなる方法。 27．投与が、硝子体内、硝子体下、水晶体下および後眼房投与からなる群より選択される請求項２６記載の方法。 28．外科用組成物が、さらには基本的に、医薬上許容される賦形剤からなる請求項２６記載の方法。 29．賦形剤がデキストロースおよびクエン酸塩緩衝液からなる請求項２８記載の方法。 30．外科用組成物が、さらには基本的に、医薬上許容される希釈体からなる請求項２８記載の方法。 31．希釈体が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび水の混合物からなる請求項３０記載の方法。 32．外科用組成物が蛋白性安定化剤を含まない請求項２６記載の方法。 33．コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩが、以下の工程：（ａ）誘導されたプロテウス・バルガリスの、pＨ５.８〜７.４を有する清澄ホモジネートを調製し、（ｂ）ホモジネートを陰性荷電のカチオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せ、ホモジネート中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩを含むいずれの陽性荷電蛋白質をも、陰性荷電担体と非共有結合を形成させ、（ｃ）pＨ７.０〜９.５で、コンドロイチン硫酸の水性溶液で担体からコンドロイチナーゼ蛋白質を、まとめてアフィニティ溶出させ、（ｄ）アフィニティ溶出した蛋白質プールをアニオン交換樹脂クロマトグラフィー担体に載せて非結合溶出液を得、（ｅ）非結合溶出液中のコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質を回収することからなる共精製法により調製される請求項２６記載の方法。 34．外科用組成物が共精製されたコンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩからなる請求項２６記載の方法。 35．組成物が投与単位形からなる請求項２８記載の方法。 36．投与単位中のコンドロイチナーゼＩの量が約１５０〜約１５００である請求項３５記載の方法。 37．ＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列からなる単離かつ精製された蛋白質。 38．ＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列から構成される単離かつ精製された蛋白質。 39．約０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの存在下、pＨ８.５で２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中の４ないし２０％の勾配のアクリルアミドのゲルにて電気泳動した場合、約８.４−８.４５の等電点および１１２ｋＤａの明らかな分子塊を有する単離かつ精製された蛋白質。 40．図２、レーンＤのダブレットの上方のバンドに対応する単離かつ精製された蛋白質。 41．コンドロイチナーゼＩと一緒になって、吸着部位に特異的に集中したコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを消化することにより、硝子体網膜の吸着を崩壊させる単離かつ精製された蛋白質。 42．ＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１−２０に対応するアミノ末端のアミノ酸配列および約８.４〜８.４５の等電点を有する単離かつ精製された蛋白質。 43．蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１−４０に対応するアミノ末端のアミノ酸配列を有する請求項４２記載の単離かつ精製された蛋白質。 44．プロテオグリカンまたはコンドロイチン硫酸の四糖類分解産物の二糖類への変換において、（ａ）純粋な四糖類を水中に溶かし、（ｂ）緩衝溶液を加えて０.２〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する基質溶液を得、（ｃ）その基質溶液にコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質含有の溶液を加え、得られたアッセイ溶液を１０〜５０℃の範囲の温度でインキュベートし、（ｄ）そのインキュベートしたアッセイ溶液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いるクロマトグラフィーに付し、（ｅ）その個々のＨＰＬＣピークの下の四糖類および二糖類の相対量を算定し、標品との比較からコンドロイチナーゼＩＩ活性を算定することを特徴とする請求項３７に記載のコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質の活性を測定するためのin vitroアッセイ。 45．ＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１−２０に対応するアミノ末端アミノ酸配列および約８.４〜８.４５の等電点を有する単離かつ精製されたコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質と、ＳＥＱＩＤＮｏ.１のアミノ酸番号１−２０に対応するアミノ末端アミノ酸配列を有する単離かつ精製されたコンドロイチナーゼＩ蛋白質とからなる組成物の有効量を目に投与することによって、目の神経網膜から眼球硝子体を選択的かつ完全に辺縁部剥離させるのに有用な物質の治療用組成物。 46．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１−４０に対応するアミノ末端アミノ酸配列を有する請求項４５記載の治療用組成物。 47．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列からなる請求項４５記載の治療用組成物。 48．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列から構成される請求項４５記載の治療用組成物。 49．約０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの存在下、pＨ８.５で２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中の４ないし２０％の勾配のアクリルアミドのゲルにて電気泳動した場合、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が約８.４−８.４５の等電点および１１２ｋＤａの明らかな分子塊を有する請求項４５記載の治療用組成物。 50．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が、図２、レーンＤのダブレットの上方のバンドに対応する請求項４５記載の治療用組成物。 51．さらには、医薬上許容される賦形剤からなる請求項４５記載の治療用組成物。 52．賦形剤がデキストロースおよびクエン酸塩緩衝液からなる請求項５１記載の治療用組成物。 53．さらには、医薬上許容される希釈体からなる請求項５１記載の治療用組成物。 54．希釈体が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムおよび水の混合物からなる請求項５３記載の治療用組成物。 55．コンドロイチナーゼＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.１の配列からなり、コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列からなる請求項４５記載の治療用組成物。 56．凍結乾燥したケーク投与単位形からなる請求項５１記載の治療用組成物。 57．目の神経網膜から眼球硝子体を選択的かつ完全に辺縁部剥離させる方法であって、ＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１−２０に対応するアミノ末端アミノ酸配列および約８.４〜８.４５の等電点を有する単離かつ精製されたコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質と、ＳＥＱＩＤＮｏ.１のアミノ酸番号１−２０に対応するアミノ末端アミノ酸配列を有する単離かつ精製されたコンドロイチナーゼＩ蛋白質とからなる組成物の有効量を目に投与することからなる方法。 58．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質がＳＥＱＩＤＮｏ.２のアミノ酸番号１ −４０に対応するアミノ末端アミノ酸配列を有する請求項５７記載の方法。 59．コンドロイチナーゼＩＩがＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列からなる請求項５７記載の方法。 60．コンドロイチナーゼＩＩがＳＥＱＩＤＮｏ.２の配列から構成される請求項５７記載の方法。 61．約０.１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳの存在下、pＨ８.５で２５ｍＭトリス／１９２ｍＭグリシン緩衝液中の４ないし２０％の勾配のアクリルアミドのゲルにて電気泳動した場合、精製されたコンドロイチナーゼＩＩが約８.４−８.４５の等電点および１１２ｋＤａの明らかな分子塊を有してなる請求項５７記載の方法。 62．コンドロイチナーゼＩＩ蛋白質が、図２、レーンＤのダブレットの上方のバンドに対応する蛋白質からなる請求項５７記載の方法。 63．組成物が硝子体内、硝子体下、水晶体下または後眼房投与により目に投与される請求項５７記載の方法。 64．組成物が、さらには、基本的に、医薬上許容される賦形剤からなる請求項５７記載の方法。 65．賦形剤がデキストロースおよびクエン酸塩緩衝液からなる請求項６４記載の方法。 66．組成物が、コンドロイチナーゼＩおよびコンドロイチナーゼＩＩ蛋白質ならびに医薬上許容される賦形剤を含む凍結乾燥したケークから構成される投与単位形からなる請求項６４記載の方法。 67．投与単位中のコンドロイチナーゼＩの量が約１５０と約１５００単位の間にある請求項６６記載の方法。 68．投与単位形が、さらには、希釈体からなる請求項６７記載の方法。