CN107177578B - 用于纯化硫酸软骨素酶abc的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法。该方法包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质中获得纯化的所述硫酸软骨素酶ABC。该方法能够获得高纯度的硫酸软骨素酶ABC，并且具有简单和高回收率的优点。

Description

用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法

技术领域

本发明涉及用于纯化硫酸软骨素酶ABC(ChABC)的方法，尤其涉及从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法。

背景技术

硫酸软骨素是生物***中最丰富的糖胺聚糖，由包括硫酸化葡萄糖醛酸、N-乙酰半乳糖胺、艾杜糖醛酸等的多种硫酸化和非硫酸化碳水化合物衍生物组成。该聚合物通常与蛋白质连接，形成硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)，在生物***中发挥许多结构和功能作用(例如，使细胞-细胞相互作用的细胞外基质、指导或抑制神经发育、合成软骨以及成为结构成分)。这些分子的生物合成并保持合适的位置对于人的正常功能是至关重要的。事实上，许多疾病与CSPG的缺乏、积累和脱位有关，如弥漫性路易体病、粘多糖病Ⅳ-A型和粘多糖病Ⅶ型、椎间盘突出症等。

硫酸软骨素酶是可以有效降解硫酸软骨素的细菌酶。这组酶可以分为具有不同活性和底物特异性的4种类型(硫酸软骨素酶ABC，软骨素酶AC，硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C)。最近已证明这些酶，特别是硫酸软骨素酶ABC是用于治疗许多CSPG相关疾病的潜在的新生物药物，例如，McMachon和同事已经发现ChABC可以显著促进受损的脊髓的功能恢复。Kubota和Naitoh也证明将硫酸软骨素酶注射到瘢痕疙瘩和/或肥厚性瘢痕患者的受影响部分可以大大改善症状。Takahashi还开发了使用ChABC治疗兔子椎间盘突出症的成功模型。近年的科学研究指出，ChABC还有更多有待开发的医学应用，包括治疗弱视、神经和脊髓损伤，后玻璃体脱离和抑制肿瘤转移。

ChABC能否成功作为生物治疗剂应用，明显取决于生产和纯化高纯度ChABC的工艺。ChABC的现有上游生产技术均是基于未修饰的普通变形杆菌(Proteus Vulgaris)或重组表达宿主(如大肠杆菌)的发酵。通过适当优化，这两种表达方法都可以产生大量未经纯化含有ChABC的菌液或粗酶液。因为菌液或粗酶液含有大量蛋白质、核酸及内毒素等杂质，开发高效的下游纯化方法对于获得高纯度ChABC至为关键。此外，来自不同表达宿主的杂质的份量和性质非常不同，所以为了纯化来自特定表达宿主的ChABC将需要单独制定的特定的下游纯化程序，特别是当只使用非特异性相互作用的离子交换(IEX)或疏水相互作用(HIC)层析时更是如此。事实上，IEX/HIC层析法的开发和优化非常耗时，需要投入大量人力物力，而通常的结果是需要多个IEX/HIC层析步骤以获得高纯度的目标蛋白，代价是大幅降低回收率及长时间的纯化流程。

相对于IEX/HIC层析法，在蛋白质纯化中应用亲和层析法具有显著的优点，例如相对快速的优化过程，简单的层析过程，高洗脱液纯度，高回收率等。在亲和层析法中，与靶蛋白的特异性相互作用的分子或分子部分固定在填料上。这种高度选择性相互作用能有效地提取需要的蛋白及去除杂质。此外，利用亲和层析作为ChABC的纯化工具从未被探索过，因此开发新的且有效的亲和层析方法对于生产作为生物治疗药物的ChABC将具有莫大贡献。

然而，设计ChABC的亲和层析是不容易的。这是因为可以特异性结合ChABC的大多数已知分子是ChABC的底物，其在与酶结合时将被降解。换句话说，如果这些底物分子固定在固定相上，那么它们在纯化过程中将被酶分解，从而不能从溶液中捕获ChABC。硫酸软骨素酶ABC具有比硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C具有更广的底物谱。这使得设计ChABC的亲和层析相比于硫酸软骨素酶AC、硫酸软骨素酶B和硫酸软骨素酶C更加困难。

在Yosizawa等人的研究(1979)中，公开了一种纯化硫酸软骨素酶B及硫酸软骨素酶C的方法，包括使用羟基磷灰石柱从肝素黄杆菌的粗酶提取物中分离粗硫酸软骨素酶C级分和粗硫酸软骨素酶B级分；然后使用磷酸纤维素柱进一步纯化粗硫酸软骨素酶C级分和粗硫酸软骨素酶B级分，最后用硫酸皮肤素包被的结合硫酸皮肤素的AH-Sepharose 4B柱使硫酸软骨素酶C与透明质酸酶分离，用硫酸皮肤素包被的结合肝素的AH-Sepharose 4B柱使硫酸软骨素酶B与Δ4,5葡萄糖醛酸酶(glycosiduronase)和硫酸酯酶分离。Yosizawa的研究强调采用同一种或另一种糖胺聚糖非共价包被糖胺聚糖结合(共价)的AH-Sepharose 4B对于硫酸软骨素酶的分离纯化是非常重要的。

因此，具有简单、高回收率优点的利用亲和层析纯化ChABC的技术仍是本领域所需的。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人发现，肝素不仅能够特异性结合ChABC，而且在结合时不会被降解。基于该意想不到的发现，本发明提供了一种从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法，包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从含有ChABC的基质中获得高度纯化的ChABC。

根据本发明的一个方面，所述方法包括将含有硫酸软骨素酶ABC的基质加载到结合有肝素的亲和柱上。

根据本发明的一个方面，本发明的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法包括如下步骤：

用预平衡缓冲液预平衡亲和柱；

将样品溶液加载到预平衡后的亲和柱上；

用洗涤液洗涤加载后的亲和柱以去除非特异性结合的蛋白质；以及

用洗脱液洗脱所述硫酸软骨素酶ABC；

其中，所述洗涤液为pH 8-10的缓冲液，所述洗脱液为pH 6-9NaCl线性梯度溶液。

根据本发明的另一个方面，本发明的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括在所述洗脱步骤之后通过过滤去除含有ChABC的洗脱液中的内毒素。

根据本发明的又一个方面，本发明的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括将所述含有硫酸软骨素酶ABC的基质的pH值调节至7.0，和/或将导电率调节到1-5mS/cm范围内。在一个实施方式中，本发明的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法还包括将导电率调节到1.2、1.6、2、3、4、4.5或4.8mS/cm。

根据本发明的又一个方面，所述洗涤液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Tris乙酸盐缓冲液。

根据本发明的又一个方面，所述基质包括细菌、真菌、昆虫或动物的细胞匀浆、含有表面活性剂的提取物和/或在发酵过程中收集的上清液。

根据本发明的又一个方面，所述基质包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的一种或多种的匀浆或提取物。

根据本发明的又一个方面，所述肝素固定在具有羟基、氨基和/或羧基的用于蛋白质纯化的树脂上。进一步地，所述肝素利用共价键结合到所述树脂上。

根据本发明的又一个方面，固定有肝素的亲和柱不进一步使用糖胺聚糖包被。

根据本发明的又一个方面，所述树脂包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、二氧化硅聚丙烯酰胺和丙烯酸聚合物的一种或多种。

根据本发明的又一个方面，所述预平衡缓冲液为pH7.0-7.5缓冲液。

本发明的从含有ChABC的基质纯化ChABC的方法能够获得高纯度的硫酸软骨素酶ABC，并且具有简单和高回收率的优点。

附图说明

图1示出本发明实施例2的层析图。

图2示出本发明实施例3的层析图。

图3示出本发明实施例3的SDS-PAGE图；

其中，泳道(1)分子标记，泳道(2)加载到柱上之前的基质，泳道(3)溢流，泳道(4)通过60mM Tris-乙酸盐(pH8.0)洗涤的杂质，泳道(5)通过100mM Tris-乙酸盐(pH9.2)洗涤的杂质，泳道(6)和(7)洗脱液。

图4示出本发明实施例4的层析图。

图5示出本发明实施例4的SDS-PAGE图；

其中，泳道(1)分子标记，泳道(2)加载到柱上之前的基质，泳道(3)溢流，泳道(4)通过100mM Tris-乙酸盐(pH9.2)洗涤的杂质，泳道(5)和(6)洗脱液。

图6示出本发明实施例5的层析图。

图7示出本发明实施例5的SDS-PAGE图；

其中，泳道(1)分子标记，泳道(2)加载到柱上之前的基质，泳道(3)溢流，泳道(4)通过100mM Tris-乙酸盐(pH9.2)洗涤的杂质，泳道(5)和(6)洗脱液。

具体实施方式

本发明提供了一种新颖且简单的ChABC的纯化方法，其可应用于各种含ChABC的基质。

如本文所用的术语“基质”是指ChABC与ChABC生产期间来自宿主细胞的细胞外材料或细胞内材料(蛋白质、DNA、脂质等)的混合物，包括但不限于细菌、真菌、昆虫或动物的细胞匀浆、含有表面活性剂的提取物、在发酵过程中收集的上清液等。

目前ChABC的现有上游生产技术均是基于未修饰的普通变形杆菌(ProteusVulgaris)或重组表达宿主(如大肠杆菌)的发酵。这两种表达方法都可以产生大量含ChABC的基质。在本发明中描述的含ChABC的基质可来自野生型普通变形杆菌或重组表达宿主，包括重组大肠杆菌、重组枯草芽孢杆菌、重组巴斯德毕赤氏酵母、重组酿酒酵母等。重组表达宿主可以通过使用重组表达质粒转化宿主细菌来制备。在使用重组表达质粒转化宿主细菌时，需要将编码硫酸软骨素酶的基因连接到含有启动子和Shine-Dalgarno(SD)序列且能够在宿主细胞中实现高转录水平的表达质粒中。用于大肠杆菌表达***的载体的启动子可以是T7、T5、Lac、Trp、araC或它们的任何杂交启动子。用于枯草芽孢杆菌的载体的启动子可以是Spac、SacB、Xyl、PBAD、Pgrac或它们的任何杂交启动子。此外，除了使用重组表达质粒转化宿主细菌来制备重组表达***外，将硫酸软骨素酶基因整合到宿主细菌染色体，也是可行的策略。例如对于枯草芽孢杆菌MG1P使用整合载体pMG1，或对枯草芽孢杆菌1A304(Ф105MU331)使用整合载体pSG1112。在一个实施方式中，由宿主细胞表达的成熟硫酸软骨素酶如SEQ ID NO:1所示。

由野生型普通变形杆菌或重组表达宿主获得含ChABC的基质的方法是本领域技术人员所熟知的。在使用野生型普通变形杆菌的情况下，例如可以通过流加发酵法将硫酸软骨素加入培养基中来诱导硫酸软骨素酶表达。在使用重组表达宿主的情况下，诱导物是取决于载体和启动子，例如用lac启动子的诱导物为IPTG，用于pBAD启动子的诱导物为***糖。根据发酵的规模，可以通过离心或交叉流微量过滤收集含有硫酸软骨素酶的菌体，可以通过机械破碎，例如超声处理、液体均质化、冻融等，或通过化学破坏，例如引入表面活性剂、溶菌酶或其它溶解酶由收集的菌体获得含ChABC的基质。

本发明的纯化方法是利用可选择性捕获ChABC的亲和柱的层析方法。亲和柱是固定有在层析法下与ChABC具有特异性相互作用的特定配体的柱。发明人筛选了大量的不同类型的多糖衍生物，例如糖胺聚糖或其它多糖例如藻酸盐、岩藻依聚糖、聚半乳糖醛酸、戊聚糖多硫酸盐、纤维素磷酸盐等。

尽管将选择的多糖固定在树脂上是测试这些配体对ChABC亲和层析法的适用性的最直接的方式，但配体和树脂表面之间的固定化学、配体密度、间隔基团等可以显著影响ChABC和固定化的多糖之间的相互作用。换句话说，测定溶液相中ChABC和多糖之间的结合对于揭示相互作用的强度是更合适和准确的。

存在用于定量研究蛋白质-小分子相互作用的若干现有方法，例如差示扫描量热法、石英晶体微量天平法，荧光各向异性等。然而，这些方法需要复杂的设备、昂贵且耗时的蛋白质固定化或蛋白质标记。为了节省时间和降低成本，可以应用半定量评估方法，如酶抑制测定法。在本发明中，通过监测所选择的多糖对ChABC的抑制来评价相对结合亲和力。观察到的抑制作用越强，ChABC和多糖之间的亲和力越高。更详细的实验设置在实施例1中显示。通过酶抑制测定，当施用等量的底物(硫酸软骨素C)时，发现肝素几乎完全抑制ChABC的活性。因此，确定肝素为那些选择的多糖中用于构建亲和柱最合适的配体。

在本发明中，肝素可以固定在具有用于配体固定的羟基、氨基、羧基的通常用于蛋白质纯化的不同树脂上。肝素可以利用共价键结合到所述树脂上。对于树脂，本发明没有特别的规定，只要肝素可以共价结合于其上的树脂都可以应用于本发明中，包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、二氧化硅聚丙烯酰胺、丙烯酸聚合物。肝素或树脂可以被各种活化剂活化，活化剂包括但不限于，溴化氰、EDC/NHS(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺/正羟基琥珀酰亚胺)、高碘酸钠、表氯醇等。

在本发明中，固定有肝素的亲和柱，尤其共价结合有肝素的亲和柱，无需进一步包被，例如可以不进行糖胺聚糖包被，尽管包被也是可行的。在一个实施方式中，本发明的固定有肝素的亲和柱，尤其共价结合有肝素的亲和柱，不使用糖胺聚糖进一步包被。

尽管肝素可以结合并且可以显著抑制ChABC，但是在层析中固定的肝素和ChABC之间的亲和力还是未知的。为了证明ChABC仍然对固定化的肝素具有亲和力，将纯化的ChABC加载到来自Bio-rad的Affi

肝素凝胶上并用实施例2中描述的各种缓冲液洗涤。事实上，将具有高于ChABC的等电点(pI＝8.5)的pH值的Tris乙酸盐缓冲液(pH9.2)施加到柱上，在这种条件下，当缓冲液的pH值高于pI时，ChABC会变成负电荷，ChABC和树脂上的负电荷肝素之间应该会有排斥。如果ChABC仅具有与肝素的非特异性电荷相互作用，则其将从柱上洗脱下来。然而，从实验结果来看，ChABC不仅成功地被树脂捕获，而且没有被pH高于pI的缓冲液洗脱。换句话说，ChABC与肝素具有特异性相互作用，而不是纯粹的非特异性电荷相互作用。

在本发明中，ChABC亲和层析柱与最常用于ChABC纯化的阳离子交换层析柱相比具有显著的优点，因为其具有显著较低量的非特异性结合到树脂上的杂质。因此，该层析可以应用于具有不同杂质谱的各种基质，包括但不限于来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和/或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的匀浆或提取物，从而获得高度纯化的ChABC。然而，由于肝素是带负电荷的多糖，少量的正电荷蛋白仍然可以被肝素固定化树脂非特异性捕获。然而，这些非特异性结合的蛋白质可以通过应用高pH缓冲液(pH 8-10)容易地去除，pH 8-10缓冲液为碳酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液或Tris乙酸盐缓冲液，例如碳酸钠缓冲液、磷酸钠缓冲液、碳酸钾缓冲液、磷酸钾缓冲液、硼酸钠缓冲液、硼酸钾缓冲液。在该pH范围内的缓冲液可以显著降低非特异性蛋白质相互作用，因为这些蛋白质杂质的大多数将变成带负电荷的，因此不再与肝素固定化树脂具有电荷相互作用，而具有特异性相互作用的ChABC不会受到高pH缓冲液的影响。去除蛋白质杂质后，用pH 6-9的NaCl线性梯度洗脱ChABC。洗脱液可含有纯度高达98-99％甚至以上且具有低内毒素水平的ChABC(实施例3-5)。内毒素可以通过使洗脱液通过内毒素捕获过滤器进一步除去。除了低内毒素和蛋白质杂质之外，该方法的另一个优点是简单性和高回收率。单步层析显著减少了处理时间，从而避免了处理过程中的活性损失。实际上，最终产率在70-80％的范围内(实施例3-5)，其显著高于所有现有方法。更重要的是，亲和层析可以应用于由不同宿主细胞产生的不同种类的基质。

实施例1

在本发明中，鉴定与ChABC的底物具有相似结构但对酶促降解呈惰性的分子是本发明的第一个关键部分。为了测试可以实际结合ChABC的活性位点的多糖，对所选择的多糖进行相对酶抑制测定：

490μL底物溶液在37℃温育至少15分钟，该底物溶液含有0.2％硫酸软骨素C、0.2％所选择的多糖和50mM pH8.0Tris HCl缓冲液。10μL具有约100U/L活性的ChABC在37℃下单独温育至少3分钟。温育后，轻轻混合两种溶液。然后混合物在37℃下温育20分钟以进行硫酸软骨素的酶促降解。20分钟后，通过在100℃水浴下2分钟热灭活ChABC来终止反应。除了在无20分钟温育的情况下立即热灭活混合物，以相同的方式单独地进行空白对照。然后测量热灭活溶液在232nm处的吸光度并按照式1所示计算表观活性。不存在所选择的多糖的测定也以与参照相同的方式进行。抑制百分比的计算如式2所示：

其中

Abs＝吸光度差值＝样品管中的OD_232nm-空白管中的OD_232nm

E＝来自硫酸软骨素C的不饱和二糖的毫克分子的消光系数＝5.5

t＝反应时间＝20分钟

Vt＝测定的总体积＝0.5mL

Vs＝使用的酶的体积＝0.01mL

DF＝稀释因子

1000＝将U/mL转换为U/L

其中

％rA＝残余活性百分比

A(poly)＝存在所选择的多糖时的活性

A(ref)＝不存在所选择的多糖时测定的吸光度

在所有多糖中，藻酸盐和聚半乳糖醛酸对酶活性没有显着影响，而肝素对ChABC具有最强的抑制作用。相对酶抑制测定的结果显示在表1中。

表1

样品	参照	肝素	多聚半乳糖醛酸	藻酸盐
					活性(U/L)	121	5.1	117	119
％rA	NA	4.2	97	98

此外，由于单独将ChABC与肝素温育后，没有产生任何吸光度的变化(结果未显示)，肝素对ChABC的酶促降解活性是惰性的。因此，固定肝素作为亲和纯化ChABC的配体是所选择的多糖中最合适的选择。

实施例2

为了测试ChABC是否与固定化肝素具有特异性相互作用，使用填充有来自Bio-rad的Affi

肝素凝胶的柱。在将样品装载到柱上之前，用25mM Tris-乙酸盐(pH 7.3)预平衡该柱。将ChABC溶解于25mM Tris-乙酸盐(pH7.5)中并装载到柱上。用(1)25mM Tris-乙酸盐(pH9.2)、(2)100mM Tris-乙酸盐(pH9.2)、(3)60mM Tris-乙酸盐(pH8)和(4)100mMTris-乙酸盐(pH7.5)洗涤该柱。这些缓冲液都不能从柱中洗脱出ChABC。而当应用0-0.3MNaCl线性梯度时，可以从柱上洗脱出ChABC。层析图如图1所示。

实施例3

以普通变形杆菌基因组为模版，利用PCR克隆出编码硫酸软骨素酶ABC(SEQ IDNO:1)的基因，产物通过T4DNA连接酶连接至pET3a质粒上，再通过电穿孔将该重组质粒导入大肠杆菌菌株BL21(DE3)。转化后的大肠杆菌接种在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上以选择成功转化的菌落。选择单个菌落，然后接种到含有50μg/ml氨苄青霉素、37℃的LB培养基中培养18小时，并将该培养物以比例1:100加入无菌、含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。该培养基在37℃下进一步温育至OD600＝0.8。添加1mM的IPTG诱导硫酸软骨素酶生产，然后进一步培养4小时。通过离心收获，并储存在-80℃。

将10克重组大肠杆菌细胞重悬于25mM Tris HCl(pH7.0)中并通过超声波裂解5分钟。通过在17000g下离心1小时从悬浮液中除去细胞碎片。收集上清液，通过加入NaOH将pH调节至pH 7.0。通过加入双去离子水将上清液的电导率调节至1.2mS/cm。

在加载到用pH 7.5 25mM Tris-乙酸盐预平衡的肝素固定化柱上之前，对含ChABC的上清液进行0.22μm过滤。然后用(1)100mM Tris-乙酸盐(pH7.5)、(2)60mM Tris-乙酸盐(pH8)、(3)100mM Tris-乙酸盐(pH9.2)洗涤该柱，柱上的ChABC通过0-0.5M NaCl进行线性梯度洗脱。层析图和SDS-PAGE显示在图2和图3中。

上述方法中的纯化程度示于表2中。

表2

可以看出，本实施例的方法能够获得纯度>99％的ChABC，回收率达到76％及内毒素水平低于0.0002EU/U。

实施例4

以普通变形杆菌基因组为模版，利用PCR克隆出编码硫酸软骨素酶ABC(序列SEQID NO:1)的基因，产物通过T4DNA连接酶连接至pHT43质粒上，再通过电穿孔将该重组质粒导入枯草芽孢杆菌菌株168中，转化后的枯草芽孢杆菌接种在含有5μg/ml氯霉素的2×TY琼脂平板上以选择成功转化的菌落。选择单个菌落，然后接种到无菌的含有5μg/ml氯霉素、37℃的2×TY培养基中培养18小时。该培养物以比例1：100加入到无菌、含有5μg/ml氯霉素的LB培养基中。该培养基在37℃下进一步温育至OD600＝0.8。添加1mM的IPTG诱导硫酸软骨素酶生产，然后进一步培养4小时。通过离心收获菌体，并储存在-80℃。

将5g重组枯草芽孢杆菌的细胞重悬浮于在30℃与1μg/ml溶菌酶温育20分钟的25mM Tris-乙酸盐(pH 7.0)中。通过超声处理5分钟将细菌细胞进一步裂解。通过在17000g下离心1小时从悬浮液中除去细胞碎片。收集上清液，通过引入NaOH将pH调节至pH 7.0。通过引入双去离子水将上清液的电导率调节至1.6mS/cm。

在装载到用pH 7.5 25mM Tris-乙酸盐预平衡的肝素固定化柱上之前，对含ChABC的上清液进行0.22μm过滤。然后用(1)pH7.5 25mM Tris-乙酸盐、(2)pH8 60mM Tris乙酸盐、(3)pH9 100mM Tris乙酸盐洗涤柱。柱上的ChABC通过0-0.5M NaCl线性梯度洗脱。层析图如图4和图5所示。纯化程度如表3所示。

表3

可以看出，本实施例的方法能够获得纯度>99％的ChABC，回收率达到74％及内毒素水平低于0.0002EU/U。

实施例5

将25g普通变形杆菌的细胞糊重悬于在37℃预热30分钟的含有2％Triton X-100的25mM Tris-乙酸盐(pH7.0)中。悬浮液在750rpm下连续搅拌并在37℃温育2小时。提取后，悬浮液用4-6℃高纯度水稀释2倍。然后通过以17700g离心速度进行高速离心来立即澄清稀释的悬浮液。通过孔径为0.2μm的微孔过滤进一步澄清上清液。将澄清的上清液的pH调节至pH 7.0，电导率调节至4.8mS/cm，然后加载到肝素固定化柱上。肝素固定化柱用pH7.0 25mMTris-乙酸盐预平衡。将上清液完全装载到柱上后，用(1)pH 7.0 25mM Tris-乙酸盐、(2)pH8.0 60mM Tris-乙酸盐和(3)pH 10 100mM Tris-乙酸盐9.2洗涤柱以去除包括不想要的蛋白质、DNA、内毒素的杂质。以0-0.5M NaCl线性梯度洗脱ChABC并测试内毒素水平低于0.0002EU/U。纯化的色谱图如图6和7所示。纯化程度如表4所示。

表4

可以看出，本实施例的方法能够获得纯度>99％的ChABC，回收率达到81％及内毒素水平低于0.0002EU/U。

本领域技术人员在以上教导的指导下，可以进行关于本发明的各种改进和变化。因此，可以理解的是，在不脱离本发明权利要求的发明思路的情况下，可以以除了本文具体描述的方式之外的其他方式实施本发明。

序列表

<110> 爱华生物科技有限公司

<120> 用于纯化硫酸软骨素酶ABC的方法

<130> P9340CN00

<160> 1

<210> 1

<211> 998

<212> PRT

<213> Proteus vulgaris

<400> 1

Met Ala Thr Ser Asn Pro Ala Phe Asp Pro Lys Asn Leu Met Gln Ser

1 5 10 15

Glu Ile Tyr His Phe Ala Gln Asn Asn Pro Leu Ala Asp Phe Ser Ser

20 25 30

Asp Lys Asn Ser Ile Leu Thr Leu Ser Asp Lys Arg Ser Ile Met Gly

35 40 45

Asn Gln Ser Leu Leu Trp Lys Trp Lys Gly Gly Ser Ser Phe Thr Leu

50 55 60

His Lys Lys Leu Ile Val Pro Thr Asp Lys Glu Ala Ser Lys Ala Trp

65 70 75 80

Gly Arg Ser Ser Thr Pro Val Phe Ser Phe Trp Leu Tyr Asn Glu Lys

85 90 95

Pro Ile Asp Gly Tyr Pro Thr Ile Asp Phe Gly Glu Lys Leu Ile Ser

100 105 110

Thr Ser Glu Ala Gln Ala Gly Phe Lys Val Lys Leu Asp Phe Thr Gly

115 120 125

Trp Arg Ala Val Gly Val Ser Leu Asn Asn Asp Leu Glu Asn Arg Glu

130 135 140

Met Thr Leu Asn Ala Thr Asn Thr Ser Ser Asp Gly Thr Gln Asp Ser

145 150 155 160

Ile Gly Arg Ser Leu Gly Ala Lys Val Asp Ser Ile Arg Phe Lys Ala

165 170 175

Pro Ser Asn Val Ser Gln Gly Glu Ile Tyr Ile Asp Arg Ile Met Phe

180 185 190

Ser Val Asp Asp Ala Arg Tyr Gln Trp Ser Asp Tyr Gln Val Lys Thr

195 200 205

Arg Leu Ser Glu Pro Glu Ile Gln Phe His Asn Val Lys Pro Gln Leu

210 215 220

Pro Val Thr Pro Glu Asn Leu Ala Ala Ile Asp Leu Ile Arg Gln Arg

225 230 235 240

Leu Ile Asn Glu Phe Val Gly Gly Glu Lys Glu Thr Asn Leu Ala Leu

245 250 255

Glu Glu Asn Ile Ser Lys Leu Lys Ser Asp Phe Asp Ala Leu Asn Ile

260 265 270

His Thr Leu Ala Asn Gly Gly Thr Gln Gly Arg His Leu Ile Thr Asp

275 280 285

Lys Gln Ile Ile Ile Tyr Gln Pro Glu Asn Leu Asn Ser Gln Asp Lys

290 295 300

Gln Leu Phe Asp Asn Tyr Val Ile Leu Gly Asn Tyr Thr Thr Leu Met

305 310 315 320

Phe Asn Ile Ser Arg Ala Tyr Val Leu Glu Lys Asp Pro Thr Gln Lys

325 330 335

Ala Gln Leu Lys Gln Met Tyr Leu Leu Met Thr Lys His Leu Leu Asp

340 345 350

Gln Gly Phe Val Lys Gly Ser Ala Leu Val Thr Thr His His Trp Gly

355 360 365

Tyr Ser Ser Arg Trp Trp Tyr Ile Ser Thr Leu Leu Met Ser Asp Ala

370 375 380

Leu Lys Glu Ala Asn Leu Gln Thr Gln Val Tyr Asp Ser Leu Leu Trp

385 390 395 400

Tyr Ser Arg Glu Phe Lys Ser Ser Phe Asp Met Lys Val Ser Ala Asp

405 410 415

Ser Ser Asp Leu Asp Tyr Phe Asn Thr Leu Ser Arg Gln His Leu Ala

420 425 430

Leu Leu Leu Leu Glu Pro Asp Asp Gln Lys Arg Ile Asn Leu Val Asn

435 440 445

Thr Phe Ser His Tyr Ile Thr Gly Ala Leu Thr Gln Val Pro Pro Gly

450 455 460

Gly Lys Asp Gly Leu Arg Pro Asp Gly Thr Ala Trp Arg His Glu Gly

465 470 475 480

Asn Tyr Pro Gly Tyr Ser Phe Pro Ala Phe Lys Asn Ala Ser Gln Leu

485 490 495

Ile Tyr Leu Leu Arg Asp Thr Pro Phe Ser Val Gly Glu Ser Gly Trp

500 505 510

Asn Asn Leu Lys Lys Ala Met Val Ser Ala Trp Ile Tyr Ser Asn Pro

515 520 525

Glu Val Gly Leu Pro Leu Ala Gly Arg His Pro Phe Asn Ser Pro Ser

530 535 540

Leu Lys Ser Val Ala Gln Gly Tyr Tyr Trp Leu Ala Met Ser Ala Lys

545 550 555 560

Ser Ser Pro Asp Lys Thr Leu Ala Ser Ile Tyr Leu Ala Ile Ser Asp

565 570 575

Lys Thr Gln Asn Glu Ser Thr Ala Ile Phe Gly Glu Thr Ile Thr Pro

580 585 590

Ala Ser Leu Pro Gln Gly Phe Tyr Ala Phe Asn Gly Gly Ala Phe Gly

595 600 605

Ile His Arg Trp Gln Asp Lys Met Val Thr Leu Lys Ala Tyr Asn Thr

610 615 620

Asn Val Trp Ser Ser Glu Ile Tyr Asn Lys Asp Asn Arg Tyr Gly Arg

625 630 635 640

Tyr Gln Ser His Gly Val Ala Gln Ile Val Ser Asn Gly Ser Gln Leu

645 650 655

Ser Gln Gly Tyr Gln Gln Glu Gly Trp Asp Trp Asn Arg Met Gln Gly

660 665 670

Ala Thr Thr Ile His Leu Pro Leu Lys Asp Leu Asp Ser Pro Lys Pro

675 680 685

His Thr Leu Met Gln Arg Gly Glu Arg Gly Phe Ser Gly Thr Ser Ser

690 695 700

Leu Glu Gly Gln Tyr Gly Met Met Ala Phe Asp Leu Ile Tyr Pro Ala

705 710 715 720

Asn Leu Glu Arg Phe Asp Pro Asn Phe Thr Ala Lys Lys Ser Val Leu

725 730 735

Ala Ala Asp Asn His Leu Ile Phe Ile Gly Ser Asn Ile Asn Ser Ser

740 745 750

Asp Lys Asn Lys Asn Val Glu Thr Thr Leu Phe Gln His Ala Ile Thr

755 760 765

Pro Thr Leu Asn Thr Leu Trp Ile Asn Gly Gln Lys Ile Glu Asn Met

770 775 780

Pro Tyr Gln Thr Thr Leu Gln Gln Gly Asp Trp Leu Ile Asp Ser Asn

785 790 795 800

Gly Asn Gly Tyr Leu Ile Thr Gln Ala Glu Lys Val Asn Val Ser Arg

805 810 815

Gln His Gln Val Ser Ala Glu Asn Lys Asn Arg Gln Pro Thr Glu Gly

820 825 830

Asn Phe Ser Ser Ala Trp Ile Asp His Ser Thr Arg Pro Lys Asp Ala

835 840 845

Ser Tyr Glu Tyr Met Val Phe Leu Asp Ala Thr Pro Glu Lys Met Gly

850 855 860

Glu Met Ala Gln Lys Phe Arg Glu Asn Asn Gly Leu Tyr Gln Val Leu

865 870 875 880

Arg Lys Asp Lys Asp Val His Ile Ile Leu Asp Lys Leu Ser Asn Val

885 890 895

Thr Gly Tyr Ala Phe Tyr Gln Pro Ala Ser Ile Glu Asp Lys Trp Ile

900 905 910

Lys Lys Val Asn Lys Pro Ala Ile Val Met Thr His Arg Gln Lys Asp

915 920 925

Thr Leu Ile Val Ser Ala Val Thr Pro Asp Leu Asn Met Thr Arg Gln

930 935 940

Lys Ala Ala Thr Pro Val Thr Ile Asn Val Thr Ile Asn Gly Lys Trp

945 950 955 960

Gln Ser Ala Asp Lys Asn Ser Glu Val Lys Tyr Gln Val Ser Gly Asp

965 970 975

Asn Thr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Tyr Phe Gly Ile Pro Gln Glu Ile

980 985 990

Lys Leu Ser Pro Leu Pro

995

Claims (8)

1.一种从含有硫酸软骨素酶ABC 的基质纯化硫酸软骨素酶ABC 的方法，其包括使用固定有肝素的亲和柱，通过层析法从所述含有硫酸软骨素酶ABC 的基质中获得纯化的所述硫酸软骨素酶ABC，其中所述方法包括：

将所述含有硫酸软骨素酶 ABC 的基质的 pH 值调节至 7.0，并将导电率调节到 1-5mS/cm 范围内，对所述含有硫酸软骨素酶 ABC 的基质进行0.22μm过滤，并将所述含有硫酸软骨素酶 ABC 的基质加载到经pH 7.5的25 mM Tris-乙酸盐预平衡缓冲液预平衡的所述固定有肝素的亲和柱上；

用洗涤液洗涤加载后的亲和柱以去除非特异性结合的蛋白质;以及

用洗脱液洗脱所述硫酸软骨素酶 ABC;

其中，所述洗涤如下之一进行：

用（1）pH7.5的100mM Tris-乙酸盐、（2）pH8的60mM Tris-乙酸盐和（3）pH9.2的100mMTris-乙酸盐洗涤；

用（1）pH7.5的25mM Tris-乙酸盐、（2）pH8的60mM Tris乙酸盐和（3）pH9的100mM Tris乙酸盐洗涤；或者

用（1）pH 7.0的25mM Tris-乙酸盐、（2）pH 8.0的60mM Tris-乙酸盐和（3）pH 10的100mM Tris-乙酸盐洗涤；

所述洗脱液为 pH 6-9的0-0.5M NaCl 线性梯度溶液；并且

纯化后硫酸软骨素酶 ABC 的内毒素水平低于 0.0002 EU/U，并且其中所述硫酸软骨素酶ABC由SEQ ID NO：1编码。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述方法还包括在所述洗脱步骤之后通过过滤去除含有所述硫酸软骨素酶 ABC 的洗脱液中的内毒素的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其中所述基质包括细菌的细胞匀浆和/或在细菌发酵过程中收集的上清液。

4.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于，其中所述基质包括来自大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、和普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的一种或多种的匀浆。

5.根据权利要求 1或2所述的方法，其特征在于，其中所述肝素固定在具有羟基、氨基和/或羧基的用于蛋白质纯化的树脂上。

6.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于，其中所述树脂包括琼脂糖、纤维素、葡聚糖、二氧化硅聚丙烯酰胺和丙烯酸聚合物的一种或多种。

7.根据权利要求5 所述的方法，其特征在于，其中所述肝素利用共价键结合到所述树脂上。

8.根据权利要求 1、2或7 所述的方法，其特征在于，其中所述固定有肝素的亲和柱不进一步使用糖胺聚糖包被。

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