JPH10500013A

JPH10500013A - 乳酸菌の培養物の増殖を阻害し、所望により該細菌細胞を溶解する方法および得られる溶菌培養物の用途

Info

Publication number: JPH10500013A
Application number: JP7529536A
Authority: JP
Inventors: ナウタ，アーイエン; フエネマ，ヘラルド; コク，ヤン; レデブール，アート・エム
Original assignee: クウエスト・インターナシヨナル・ベー・ベー
Priority date: 1994-05-12
Filing date: 1995-05-12
Publication date: 1998-01-06
Also published as: WO1995031562A1; AU702604B2; AU2354095A; EP0759999A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、乳酸菌培養物の増殖を阻止する方法、または該培養物を含む製品、例えばチーズ製品を提供し、該方法は、乳酸菌の細胞内において、グラム陽性菌のバクテリオファージ、特に乳酸菌のバクテリオファージから得られ得るholinをin situで産生し、該holinをコードする遺伝子は第一調節プロモーターのコントロール下にあり、該holinは、それがある系によって産生される細胞に対して静菌作用を示すことができ、それにより、自己溶菌酵素の自然産生は好ましくは損なわないで、細胞膜に穴をあけることができる。好ましくは、さらに、乳酸菌の細胞内で、乳酸菌またはそのバクテリオファージから得られ得る溶解素がin situ産生され、該溶解素をコードする遺伝子は第二調節プロモーターのコントロール下にあり、それにより、産生される溶解素は、乳酸菌の細胞の溶解を行なう。第二調節プロモーターは第一調節プロモーターと同じであってもよく、holinおよび溶解素をコードする遺伝子は各々、一つのオペロンにおいて、同じ調節プロモーター下におくことができる。好ましくは、プロモーターは、食品等級成分またはパラメーターによって規制することができる。本発明の他の用途としては、溶菌の後に遊離されるペプチダーゼによって変形されるペプチドの混合物の製造、溶菌培養物を有害細菌または病原性細菌に対する殺菌剤として使用することによる、溶菌培養物を含む製品の貯蔵期間の改善が挙げられる。

Description

【発明の詳細な説明】乳酸菌の培養物の増殖を阻害し、所望により該細菌細胞を溶解する方法および得られる溶菌培養物の用途発明の背景および公知技術本発明は、乳酸菌の培養物の増殖を阻害し、所望により該細菌の細胞を溶解する方法に関する。本明細書では、微生物の名前について下記の略号を使用する。 E.＝Escherichia（例えば、大腸菌(E．coli)） L.＝Lactococcus（例えば、L．lactis） M.＝Micrococcus（例えば、M．lysodeikticus） S.＝Streptococcus（例えば、糞便連鎖球菌(S．faecalis)および肺炎連鎖球菌(S ．pneumonia)）本発明は、一態様において、例えば発酵食品の製造（例えば、チーズの製造）において、溶解素により乳酸菌の培養物を溶解する方法、または該培養物を含む物質に関する。該方法は、WO 90/00599（；参考文献Ａ１）から公知である。その特許明細書によれば、チーズ製造中に、Lactococcus（好ましくは、伸長形頭部）由来の溶解素を使用して、細菌由来の培養物が溶解された。例として、Lact ococcus lactis ML3のバクテリオファージφvML3の溶解素が挙げられている。特に、該溶解素は、チーズ製品または、例えばホエイの除去、粉砕および塩処理の後のチーズの前段階混合物に添加することができる。しかし、この溶液は、溶菌細胞の内容物とチーズ製品との完全な混合が容易に得られないという欠点がある。別の欠点は、溶解素が、食品等級でない大腸菌細胞によって産生されるという点である。宿主細胞の細胞壁自体が該溶解素によって分解されないならば、該溶解素を分泌する形質転換宿主が、該溶解素による溶解を受けやすい細菌集団の抑制に有用と考えられることが明瞭に述べてある。が、チーズの風味の改善における形質転換宿主細胞の添加に関しては、何も言及していないし、形質転換された乳酸菌に関してはもちろん言及していない。その代わりとして、その特許明細書には、「溶解素を被包して、その添加時期に左右されぬようにする。被包剤は、チーズ製造の完了後に溶解し、従って、酸性化の役割が完了する前に出発菌に影響を及ぼすことはない。」ことが示唆されている。この示唆による代替法は、（ａ）被包物質を使用しなければならず、また、（ｂ）該物質は、チーズの製造工程終了まで溶解してはいけないという欠点を有する。さらに、被包溶解素をチーズ製造工程の始めに、例えばチーズ初期培養物をミルクに添加する際に加えると、その約90％はホエイとともに除去される。すなわち、必要な有効量の約10倍を添加しなければならず、それは、経済的に魅力的なものではない。後に公開されたC.A．Shear man，K．Jury & M.J．Gasson（参考文献Ａ２）には、クローン化された lactoc occalバクテリオファージφvML3溶解素遺伝子を発現する自己溶菌Lactococcus l actisが記載されている。特に、彼らは、「クローン化した溶解素の発現は、Lac tococcus lactis subsp．lactisおよびLactococcus lactis subsp．cremoris菌株の乳糖代謝能およびミルクを凝固させ、酸を産生する能力を損なわなかった（データは示していない）」と述べている。指数増殖期中は、溶解素は発現されないか、十分には発現されないことが示唆された。ただ、通常の発酵工程の終わりに生じる定常期には、かなりの割合の細胞を溶解するのに十分な量が発現されるだろう。該文献は、形質転換されたlact ococcal菌株の保持が問題と考えられると述べている。30℃未満の温度での保持は、溶解の開始をわずかに遅らせたが、 30℃では、溶解素耐性細菌の再増殖が発生した。代替法として、ショ糖の割合が 20％より高いショ糖培地での緩衝作用を施した。これは、発酵段階が30℃以上で生ずるチーズ製造のような発酵工程には適さず、20％より多いショ糖の存在は許容されないと思われる。さらに、その文献の最後には、定常期の発現は完全には制御されないことが示してある。さらに、チーズ成熟工程での浸透性緩衝液の使用は、時間に関して恐らくあまり効果的でない。所望の程度の塩の風味を達成するためにゴーダチーズをブライン浴に浸すのに必要な時間の長さを考慮すると、塩濃度の浸透効果はあまり速くは現れないだろう。チェダーチーズの製造法は、塩の添加工程がより効率的であるので、恐らくより適しているだろう。しかし、混合工程を必要とする。どちらの開示も、lactococcalバクテリオファージ溶解素由来の溶解素の使用を記載している。これは、バクテリオファージのような望ましくない物質によって天然に産生される酵素であることを意味する。なぜならば、酪農の大規模な工業的発酵法では、バクテリオファージ汚染が大きな問題であるからである。総説であるR．Young（参考文献Ａ３）は、バクテリオファージ溶解に関する技術の状態を、機構および調節の両方で概括したものである。特に、第468〜472頁の「グラム陽性宿主のファージ感染における溶解」の項では、Shearman c.s.（参考文献１８）によって見いだされたＤＮＡ配列（このＤＮＡ配列は、参考文献Ａ１にあるものと同じであると思われる）は恐らく誤りであり、それから推測されるアミノ酸配列は、読み取り枠のフレームずれを引き起こす突然変異により、全く異なる可能性があることを示している。特に、pneumococcalファージ関連溶解素遺伝子のような溶解素遺伝子のＤＮＡ配列には、細胞質膜を通り抜ける分泌をもたらすシグナルペプチドがないと推測される。しかし、このことは、典型的なＮ−末端シグナル配列がなく、溶菌酵素がどのように細胞質から脱出し、細胞壁への通路を獲得するかの疑問が持ち上がる点で当惑させられるものであった。 R．Youngの上記した総説（参考文献Ａ３、特に第469頁の両方の欄にかかるパラグラフおよび第472〜473頁のHOLIN FAMILYの項）では、感染細胞の細胞壁に対するバクテリオファージ溶解素の作用に対してはさらに別のタンパク質が必要であると論じている。この別のタンパク質は、ムレイン加水分解酵素（これは、バクテリオファージ溶解素に対する、より科学的な名称である）のムレイン基質への通路に対して必要である。その総説では、「holin」がこの別のタンパク質に対して使用された。その総説では、holinが細胞壁に穴を作ることにより溶解素の細胞壁通過を可能にし、その結果、溶解素は細胞壁のムレイン部分を加水分解することができると記載された。本明細書でも、「holin」は、溶解素の、その基質、すなわち細胞壁のムレイン部分への通過に対して必要なタンパク質またはペプチドを意味する。 Youngらの総説では、Shearmanの配列を再編成し、配列分析の誤りが開始コドンを不明瞭にしているという仮定の下に、このファージによりコードされるムレイン加水分解酵素の放出にholinが影響を及ぼすための要件を確立する可能性が示されると述べている。Youngらはさらに、「我々の分析が、今までのところ何かを我々に教えたとすると、それは、リゾチーム遺伝子を有するファージはいずれも、holin遺伝子を有するはずであるということである。」と述べている。しかし、この記載は、同じ論文で、holinをコードする配列を有していないと思われるmvlのlys Aクローンが溶菌活性を示すとして説明されている点で、多少矛盾している。 Youngらはさらに、holin科とされるものを調べて、holin機能の遺伝的または生理学的証拠が存在する、一次配列が類似しない８種類のタンパク質を開示している。構造および機能に関していくつかの仮定が成されているが、この問題に関しては、明確なものは何も解決されていないように思われる。彼らは、これらのタンパク質は小さく、疎水性で、酵素機能がなく、猛毒であるので、多数の生化学者を引きつけるような特徴ではないことを示している。すなわち、この分野はかなり複雑であって、事実上の知見はほとんどなく、推測が多いことが記載されている。 Ward c.s.（参考文献２６）の文献でも、Shearmanら（参考文献１８）の配列は恐らく誤りであることを示唆している。非常に類似したファージ溶解素遺伝子との比較により、Shearmanら（参考文献１８）の配列にフレームずれがないと、二つのＤＮＡ配列を対比できぬことが確認された。さらに、この比較は、真のファージ溶解素が、Shearmanら（参考文献１８）の開示よりも恐らく45塩基長い開放読み枠によってコードされることを示している。 C．PlatteeuwおよびW.M．de Vos（参考文献１４）は、Lactococcus lactisバクテリオファージφUS3の溶菌酵素をコードする遺伝子であるlytAの位置、配列決定および大腸菌での発現を記載している。広範囲のlactococcal菌株に対して活性であるφvML3溶解素は、公知溶菌酵素との相同性に欠けていることが記載されている。バクテリオファージφUS3は、チーズ製造菌株Lactococcus lactis SK 11(NIZO)に対して特異的なバクテリオファージの研究中に確認された。その結果、推定される LytAのアミノ酸配列は、Streptococcus pneumoniaの自己溶菌酵素のものと類似していることが分かり、このことは、バクテリオファージφUS3 がリゾチーム型のムラミダーゼでなくむしろアミダーゼをコードすることを示唆した。上記は、種々の生物からのＤＮＡ配列の単離をめざす当業者が面する困難性を示している。配列に関する情報の欠如および既知配列間の相同性の欠如のため、既知配列由来のプローブおよびプライマーを使用しても、種々の生物からho linをコードする正しいＤＮＡ配列がうまく単離されそうもない。 EP-A2-O 510 907（参考文献Ａ４）には、食品汚染性もしくは病原性の細菌のバクテリオファージまたはその溶解素を使用して該細菌を殺すことが記載されている。実施例として、Listeria monocytogenes（ファージφLM 4）およびClostridium tyrobutyricum（ファージφP）のバクテリオファージからの溶解素が挙げられている。また、細菌汚染に対するテストは、適切なバクテリオファージまたはその溶解素を使用し、細胞がそれによって溶解されるかどうかを測定することにより、特定の細菌に対して特異的に行なうことができる。その欧州特許は、従って、食品汚染性または病原性ですらある細菌のファージから得られる溶解素の使用を記載しているが、それは、食品用としては望ましくない。さらに、該溶解素の使用は、以下で説明する本発明の主題とは、それが乳酸菌の自己溶菌によって得られる食品の風味の改善にあるのではないので、かなり離れている。本発明の別の態様は、細胞を溶解することなく乳酸菌の培養物の増殖を阻害する方法に関する。乳酸菌の増殖は、いくつかの方法で阻害することができる。例えば、乳酸菌による通常の発酵（例えば、ヨーグルト製造）では、一定の低いｐＨになると、多量の乳酸により発酵が停止する。増殖は、対数増殖期から定常期に変わり、これは事実上、一種の増殖阻害である。別の可能性として、栄養素が不足してくると、いわゆる飢餓状態が生じることが考えられる。なぜならば、細菌の増殖に必要な成分がもはや利用できないからである。これは、それ以上増殖しないことを意味する。さらに別の可能性として、細胞死を引き起こす高温殺菌または滅菌作用が考えられる。発明の要旨本発明により、holinはそれ自体、大腸菌のようなグラム陰性菌および乳酸菌のようなグラム陽性菌に対してすでに静菌作用を有することが分かった。すなわち、本発明の第一の態様によれば、請求項１に記載した方法、すなわち、グラム陽性菌のバクテリオファージ、特に乳酸菌のバクテリオファージから得られ得る holinを、乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該holinをコードする遺伝子は第一調節プロモーターのコントロール下にあり、該第一調節プロモーターは、通常は該holin遺伝子と関係なく、該holinは、それがある系によって産生される細胞に対して静菌作用を示すことができ、それにより、自己溶菌酵素の自然産生は好ましくは損なわないで、細胞膜に穴をあけることができる、乳酸菌培養物の増殖を阻止する方法を提供する。本発明の第二の態様によれば、請求項２に記載した方法、すなわち、第一の態様による方法にさらに、乳酸菌、他の食品等級のグラム陽性菌またはそれらのバクテリオファージから得られ得る溶解素を乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該溶解素をコードする遺伝子は第二調節プロモーターのコントロール下にあり、それにより、産生した溶解素がグラム陽性菌またはグラム陰性菌、好ましくは乳酸菌の細胞の溶解を行なう方法を提供する。好ましくは、第二調節プロモーターは第一調節プロモーターと同じであり（請求項３）、より好ましくは、holinをコードする遺伝子および溶解素をコードする遺伝子が、同一オペロンにおいて、同じ調節プロモーターのコントロール下におかれる（請求項４）。第一もしくは第二プロモーターまたは両方が食品等級成分またはパラメーターによって調節することができると、食品発酵に有利である（請求項５）。本発明の方法は、乳酸菌培養物そのものに使用できるが、該培養物を含む製品に使用することもできる（請求項６）。後者の特定の態様は、乳酸菌培養物を、乳酸菌の発酵作用によって得られ得る発酵食品の製造に使用し、次いで、その発酵食品中の乳酸菌を溶解する方法である（請求項７）。該方法の特定の例は、発酵食品がチーズ製品である（請求項８）。次いで、さらにチーズの成熟工程を行なうと、溶解した細胞を除去した後の構成成分のいくつかにより、チーズ製品の組成物を変えることができる（請求項９）。本発明の第三の態様は、本発明の第二の態様による方法によって得られた溶解した培養物を殺菌剤として使用する、有害細菌または病原性細菌の除去法に関する（請求項１０）。殺菌剤としての使用法の一つは、商品の可貯蔵期間を改善する方法であり、本発明の第一または第二の態様による方法によって得られ、遊離のholinもしくは遊離の溶解素またはその両方を含む物質をある量で該商品に混入して、得られた商品における有害細菌または病原性細菌の増殖を阻害し、あるいは、それらの生存力を大幅に低下させる方法である（請求項１１）。そのような商品には、食品、化粧品ならびに繊維、硬質表面および皮膚の洗浄用製品が含まれる（請求項１２）。該製品の例としては、パンおよびパン改良剤；バター、マーガリンおよびそれに代わる低カロリー製品；チーズ；ドレッシングおよびマヨネーズ様製品；肉製品；ペプチド含有食品成分；シャンプー；皮膚用クリームまたはローション；石鹸および石鹸代用品；粉末または液体洗剤；ならびに調理機器および台所用品の洗浄剤が挙げられる。本発明の第四の態様は、ペプチド混合物の変性方法であり、該方法は、（１）乳酸菌培養物をタンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物と結合する工程で、該培養物の細胞は、第一調節プロモーターのコントロール下で holinをコードする遺伝子および第二調節プロモーターのコントロール下で溶解素をコードする遺伝子の両方を含み、第二および第一プロモーターは同じであってもよく、第一および第二プロモーターは通常は各遺伝子と関係しない工程、ならびに（２）該プロモーターを誘発してholinおよび溶解素の両方を、乳酸菌の細胞が溶解され、ペプチダーゼを含む細胞の中身がペプチド混合物の組成物を変性するような量で産生する工程を含む（請求項１３）。細菌の十分な増殖を達成するために、宿主細胞は、あまり速く溶解してはいけない。好ましくは、溶解が、対数増殖期の終わりまたは定常期の始めに生じるようにする。あるいは、タンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物を、本発明の第二の態様による方法によって得られた溶菌培養物で処理することを含む、ペプチド混合物の変形法がある（請求項１４）。タンパク質分解されるべきタンパク質としては、例えば、乳タンパク質もしくは植物性タンパク質、またはその両方が挙げられる（請求項１５）。請求項１〜１５に記載の上記方法には、holinが、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされ、および／または請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組換えベクターから発現され、および／または請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組換え細胞によって発現されたものも、本発明の範囲内として含む。さらに、本発明の方法の別の適する態様は、配列番号７のアミノ酸配列を有する、またはそれと機能的に同等である溶解素の誘発性発現に向けることができる。乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られるholinをコードする核酸配列も本発明の範囲内である。そのような核酸配列は、例えば、配列番号６のアミノ酸配列またはそれと機能的に同等のものをコードする（配列番号５のヌクレオチド103〜328の核酸配列など）ことができる。本発明に係る核酸配列はさらに、通常はholinをコードする配列と関係がない第一調節プロモーターで作動するよう連結することができる。また、本発明は、いずれかの請求項の核酸配列を含む組換えベクターも含み、好ましくは、該ベクターが食品等級のものである。さらに、本発明に係る該組換えベクターは、好適にはさらに、holinおよび乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL ．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られ得る溶解素の両方である溶解素をコードする核酸配列を含むことができる。本発明に係る組換えベクターの好ましい態様は、さらに、バクテリオファージの天然の付加／組込み系を含む。バクテリオファージの天然の付加／組込み系は、バクテリオファージ付加部位、ならびにholinおよび所望により溶解素遺伝子の組込みが生じるように位置したインテグラーゼ遺伝子を含むことができ、該系は、好ましくは、食品等級の宿主細胞、好ましくは乳酸菌から得られ得るバクテリオファージに由来する。本発明の適する組換えベクターは、holinをコードする核酸配列および溶解素をコードする核酸配列を、食品等級メカニズムによって誘発することができる食品等級誘発性プロモーターで作動するよう連結して含む。そのようなプロモーター系としては、例えば、EP94201355に開示され、プラスミドpIR14に存在する、温度感受性複合誘発性プロモーターが挙げられる。天然のバクテリオファージ以外の環境にある請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列および／または請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞が請求されている。上記態様の組換え宿主細胞のいずれにおいても、さらに溶解素をコードする核酸配列を含み、該溶解素が好ましくは乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られ得て、溶解素をコードする該核酸配列が好ましくはその天然のバクテリオファージまたは細菌以外の環境にあるものも好適である。本発明の組換え宿主細胞は、好ましくは、食品等級宿主細胞、好ましくは乳酸菌である。最も好ましくは、該宿主細胞が、holinおよび／または溶解素をコードする核酸配列を得たものと同じ種類のものである。図面の簡単な説明図１Ａは、lytP、lytR、ならびにlytPおよびlytRの結合の増幅に使用したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の概略を図で示したものである。開放読み枠(ORF)は、斜線を付けた矢印で示す。増幅プライマー１〜４(lyt1〜lyt4)の配列は表２および配列表の配列番号１〜４に示す。単位はキロベース（kb）である。図１Ｂは、プラスミドの構築を図示する。詳細は、材料および方法の項を参照。略号：Em^R：エリスロマイシン耐性マーカー；Amp^R：アンピシリン耐性マーカー；Cm^R：クロラムフェニコール耐性マーカー；P_spac：YansuraおよびHenner(29 )によって構築されたハイブリッド調節領域で、初期SP01プロモーターのＲＮＡポリメラーゼ認識配列およびlacオペレーターを含む；lacI：P_pen(29)と示されるBacillus licheniformisペニシリナーゼ転写および翻訳シグナルのコントロール下にあるlacリプレッサー；P₁およびP₂：バクテリオファージR1-tのプロモーターP₁およびP₂；T：転写終結因子；ori：複製起点；rro：R1-tリプレッサー遺伝子。図２は、ORF23およびL．lactis subsp．cremoris c2溶解素(c2)の配列である。アミノ酸残基が同じ場合は星印で示し、保存変化は点で示す。図３は、配列番号５で表される、lytPおよびlytRを有するR1-tの1200塩基対ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列である。これから推論される lytPおよびlytRのアミノ酸配列は、各々、配列番号６および７で示す。推定上のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は下線で示す。星印は停止コドンを示す。lytRの下流にあるステム− ループ構造は実線の矢印で示す。図４は、lytR遺伝子産物の溶菌活性の分析を示す。プラスミドpAG58（レーン１および２）またはpAG58R（レーン３および４）を有する大腸菌細胞の無細胞抽出物が、ＩＰＴＧ添加の２時間後に得られた。略号：ni：非誘発；i：誘発。矢印は、lytR遺伝子産物によって示された溶菌活性の結果としての透明化ゾーンの位置を示す。図５Ａは、lytP遺伝子産物の推論されるアミノ酸配列（配列番号６）である。予測されたトランスメンブラン部分は下線で示し、予測されるβ折返し領域はｔで示す。荷電アミノ酸残基は、電荷の符号に応じて＋または−で示す。図５Ｂは、コンピューター予測に基づく LytPのトポロジーモデルを示す。膜を貫通しているアミノ酸を示す。図６Ａは、大腸菌MC1000細胞の光学密度に対するlytP、lytR、またはlytPおよびlytRの結合の発現の効果を示す。pAG58(a)、pAG58R(b)、pAG58P(c)またはpAG5 8PR(d)のいずれかを有する大腸菌の、誘発剤（ＩＰＴＧ）を添加した場合（●）または添加しなかった場合（○）の光学密度測定値を時間の関数として示す。時間の目盛りは、誘発時（矢印で示す）からの前後の時間である。図６Ｂは、誘発の前（左の一群）および誘発の２時間後（右の一群）の、pAG5 8（白）、pAG58R（チェック）、pAG58P（斜線）またはpAG58PR（黒）のいずれかを有する大腸菌細胞1ml当たりコロニー形成単位数を示す。図７は、L．lactis subsp．cremoris LL302細胞の光学密度に対するlytP、lyt R、またはlytPおよびlytRの結合の誘発発現の効果を示す。各々、pIR12（●）、 pIR1P（△）、pIR1R（▲）またはpIR1PR（□）のいずれかを有する、誘発された L．lactis細胞の光学密度測定値を、増殖の関数として示す。pIR1PRを有するL．lactisの光学密度（ＯＤ）測定値の、マイトマイシンＣに曝さなかった場合を（○）で表す。時間の目盛りは、マイトマイシンＣ（ 1μg/ml）による誘発後の時間である。図８は、pBTS1構築クローン化経路を示す図である。EmR：エリスロマイシン耐性遺伝子；rro：R1-tリプレツサー遺伝子；po：バクテリオファージR1-t由来のプロモーター(p1/p2)／オペレーター領域；tec：λcroのトポロジー等価物；lyt P：R1-t holin遺伝子；lytR：R1-t溶解素遺伝子；T：prtPの転写集結因子；ORI+ ：lactococcalプラスミドpWV01の複製起点；p32：L．lactis のORF32のプロモーター配列；lacZ：大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；′intR：５’−切頭R1 -tインテグラーゼ遺伝子；amp：アンピシリン耐性遺伝子。関係する制限酵素部位のみを示す。図９は、バクテリオファージR1-tのインテグラーゼ遺伝子が５’−切頭型である pUC18Intd構築のクローン化経路を示す図である。intR：R1-tインテグラーゼ遺伝子；lacZ：大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；amp：アンピシリン耐性遺伝子；′intR：５’−切頭R1-tインテグラーゼ遺伝子。関係する制限酵素部位のみを示す。図１０は、pORI13（３２）（□）およびpBTS1（▲）を含むL．lactis LL108の OD600に対するマイトマイシンＣの影響を示す図である。培養物の誘発は、時間０（縦線）に1μg/mlのマイトマイシンＣにより行なった。図１１は、R1-tプロファージのゲノムＤＮＡのほとんどを食品等級的に除去して、鋳型バクテリオファージの誘発性調節領域が、そのプロファージによってコードされる溶菌機能のすぐ上流に位置するようにする操作を表す図である。一例として、インテグラーゼ遺伝子における pBTS1の組込みを示し、第二の組換えは、溶菌機能の領域で生じる。（Ａ）：インテグラーゼ領域；（Ｂ）：調節領域；（Ｃ）溶菌機能の領域；attR：「右」ファージ−宿主結合；intR：R1-tインテグラーゼ遺伝子；rro：R1-tリプレツサー遺伝子；tec：λcroのトポロジー等価物；PROPHAGE：R1-tプロファージのゲノムＤＮＡ；lytP：R1-t holin遺伝子；ly tR：R1-t溶解素遺伝子；attL：「左」ファージ−宿主結合；EmR：エリスロマイシン耐性遺伝子；lacZ：大腸菌のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；′intR：５’− 切頭R1-tインテグラーゼ遺伝子。プラスミドpBTS1由来の遺伝子には陰をつけている。プライマーである attBR、R100、attBLおよびR40は、表４に示す。図１２は、L．lactis R1K10およびMG1363のattB領域を比較した図である。att B部位には陰をつけてある。星印は、同一のヌクレオチドを示す。Lactococcus lactis subsp．cremorisバクテリオファージR1-t溶菌機能によって仲介されるLactococcus lactisの誘発性溶解要旨本研究は、鋳型Lactococcus lactis subsp.cremorisバクテリオファージR1-t の二つの遺伝子である、lytRおよびlytPの、その宿主を溶解する際の関与を記載する。lytRの遺伝子産物は、Micrococcus lysodeikticusの加圧滅菌した細胞壁を加水分解したので、溶菌活性を有するとされる。lytPの遺伝子産物は、細胞溶解の目安としての光学密度を監視する誘発実験によって示されたように、lytRと共存して、大腸菌での有効なin vivo溶解を得るために必要である。lytRのみの発現では、大腸菌細胞の十分な溶解は生じなかったが、lytPおよびlytRの同時発現により、この細菌の溶解が生じた。従って、 lytPは、大腸菌ファージλのＳタンパク質と同じ機能、すなわちムレイン基質を溶解しやすくする機能を有すると考えられる。lytPおよびlytRの両方を、L．lac tisに対する誘発性発現ベクターでサブクローン化した。両遺伝子をL．lactis中で誘発し、光学密度の減少によって監視すると、細胞の溶解が生じたことが分かった。序論鋳型バクテリオファージによる宿主細胞の溶解は、少なくとも２つの原理が異なる機構によって行なわれる(30)。小さい一本鎖ＤＮＡファージφX174は、完全なファージ粒子を宿主の細胞質から環境へ輸送するための通路を形成するタンパク質をコードする(4、7、27)。しかし、既知ファージのほとんどは、ムレイン分解活性を有する酵素をコードする。これらのいわゆる溶解素は、ペプチドグリカン層の破壊を生じ、次いで、宿主の溶解およびファージ粒子の放出が生じる。これまで解析されたグラム陰性菌のバクテリオファージの溶解素は、内膜を通過するための分泌に必要なシグナル配列に欠ける。効果的な溶解には、溶解素遺伝子のすぐ上流に位置する遺伝子によってコードされる第二の溶解機能が必要である。この遺伝子は、いわゆるholinをコードし、これは、細胞膜に穴を形成し、それによってムレイン基質を溶解素と接触しやすくすると考えられる(30)。最近まで、グラム陽性菌では、ファージによって仲介される溶解は、ファージによってコードされる溶解素の作用によってのみ行なわれると考えられた。ファージによってコードされる溶解素の膜の通過は、一般的な分泌経路により生じると考えられた。しかし、この種の輸送に必要なシグナル配列が、確認された多くの溶解素には存在しないという知見から、ムレイン分解活性部分がどのようにして細胞壁に接近するかという疑問が持ち上がった。現在、これらのファージの多くは、そのグラム陽性菌宿主の溶解に対する二次機能を必要とするという考えに対する支持が高まっている。最近、その溶解素遺伝子のすぐ上流に位置する Ba cillus subtillisファージφ29、遺伝子14が、ファージ溶解素の、その基質を含有する環境への効果的な放出に必要なタンパク質を特定することが分かった(20) 。完全なL．lactis subsp．cremorisバクテリオファージR1-tゲノムの配列分析により、他のバクテリオファージのいくつかの溶解素と同様の開放読み枠(ORF) の存在が明らかになった。本研究では、対応する遺伝子(lytRと命名)が実際に、in vitroで細胞壁分解活性を有するタンパク質をコードすることを示す。バクテリオファージ R1-t P335型、小さい誘導 lactococcalファージ、 L．lactis subsp．cremoris R1から単離 9，11 Em^r、Ap^rおよびCm^r は、各々、エリスロマイシン、アンピシリンおよびクロラムフェニコールに対する耐性を表す。二つの種特異的誘発性発現系を使用すると、大腸菌(E，coll)およびL，lactisの有効なin vivo溶解に対して、lytRは、lytRの上流にあるlytPによって特定される別の遺伝子産物が必要であることが分かる。材料および方法細菌菌株、ファージ、プラスミドおよび培地本研究で使用した細菌菌株、ファージおよびプラスミドを表１に示す。大腸菌は、TY培養基(17)中または1.5%の寒天で固化したTY培養基上で増殖させた。L．lactisは、グルコースM17培養基(21)中またはグルコースM17寒天上で増殖させた。エリスロマイシンは、大腸菌およびL．lactisに対して、各々、100μ g/mlおよび5μg/mlを使用した。大腸菌に対しては、アンピシリンおよびクロラムフェニコールを、各々、100μg/mlおよび5μg/mlの濃度で使用した。ＤＮＡ技法プラスミドＤＮＡを、本質的にBirnboimおよびDolyの方法(1)によって単離した。制限酵素、クレノウ酵素、T4ＤＮＡリガーゼおよびT4 ＤＮＡポリメラーゼは、Boehringer GmbH(Mannheim，Germany)から入手し、使用説明書に従って使用した。合成オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 381A ＤＮＡ合成装置(Applied Biosyst ems Inc.，Foster City，Calif.)を使用して合成した。ＰＣＲ反応は、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs Inc.，Beverly，MA)を使用して行なった。サンプルを2分間94℃に加熱した後、標的ＤＮＡを、94℃１分、50℃２分、73℃１分の条件下、25サイクルで増幅した。増幅に使用したプライマーは、表２および配列表の配列番号１〜４に示す。大腸菌を宿主として使用して組換えプラスミドを得た。大腸菌の形質転換は、MandelおよびHigaの方法(12)によって行なった。プラスミドは、複製が有効になるように細胞質上にpWV01 repA遺伝子のコピーを含むL．lactis subsp．cremoris LL302に、電気穿孔法(23)によって導入した。ＤＮＡおよびタンパク質配列の分析は、Stadenによって開発されたプログラム(19) を使用して行なった。lytPタンパク質の分析は、PC/Geneプログラム（version 6 .7；IntelliGenetics，Inc.，Geneva，Switzerland）で解析し、膜通過ドメイン探査プログラムSOAPまたはβターン探査プログラムBETATURNを使用して行なった。ＩＰＴＧおよびマイトマイシンＣ誘発一夜培養した培養物を、新しいグルコースM17培地(L．lactis)または0.5%のグルコースを補充したTY培地（大腸菌）で100倍に希釈し、培養物のOD600が0.3に達するまで増殖させ、その時点で、イソプロピル−β−Ｄ−チオールガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）またはマイトマイシンＣ(Sigma Chemical Co.，St．Louis ，MO.)を添加して、最終濃度を各々5mMまたは1μg/mlとした。大腸菌細胞は、ＩＰＴＧを添加する前に、遠心分離によって集め、等量のTY培地（グルコースは添加しない）に再懸濁した。溶菌活性測定法溶菌活性の測定は、本質的にはPotvinら(15)の記載によって行い、小変更をBu istら(2)の報告にあるようにいくつか行なった。プラスミドの構築 lytPおよびlytRを含むR1-tゲノム断片を、ＰＣＲ反応を使用して増幅した。ly tPおよびlytRの両方を含むR1-tゲノムの4.1-kb XbaI/NheI断片をpUC18のユニークなXbaI部位でサブクローン化すると、プラスミドpXNBが得られた。pXNBを鋳型として使用し、プライマーの３種類の組み合わせ（lyt1−lyt2、lyt3−lyt4、およびlyt1−lyt4；図１Ａ参照）により増幅すると、各々、lytP、lytRまたはlytP およびlytRの結合を有する３種類のＤＮＡ断片が得られた。SphIおよびHindIII による消化の後、これら３種類のＰＣＲ産物をHindIIIおよびSphIで切断したpAG 58でサブクローン化し、ＩＰＴＧ誘発性Ｐ_spacプロモーターのコントロール下で各々、lytP、lytR、ならびにlytPおよびlytRの結合を有するプラスミドpAG58P、 pAG58R、およびpAG58PRを得た（図１Ｂ）。L．lactisでの溶解の研究は、プラスミドpAG58P、pAG58R、およびpAG58PRをまず、SphIおよびSalIで切断した。次いで、lytP、lytRならびにlytPおよびlytRの結合を有するＤＮＡ断片を、SphI／SalIで切断したpUC18でサブクローン化した。これら３個の構築物（pUC18P、pUC18RおよびpUC18PRと命名）のHindII/HindIII断片をpIR12のNruIおよびHindIII部位でクローン化すると、R1-tプロモーター−オペレーター領域の転写コントロール下で、各々、lytP、 lytR、ならびにlytPおよびlytRの両方を含むプラスミドpIR1P、pIR1RおよびpIR1 PRが得られた（図１Ｂ）。これらのプラスミドは、pWV01由来のプラスミドの複製を有効にするために細胞質上にpWV01 repA遺伝子のコピーを含むL．lactis su bsp．cremoris LL302に対して形質転換された。プラスミドpIR12の構築は、同日に、「溶解素による乳酸菌培養物の溶菌法および得られる溶菌培養物の用途」と題して出願した、共に審査中のEP-94201353. 3に記載した（該明細書は参考文献として本明細書に添付する。）。結果 R1-t溶菌機能のクローン化および配列分析鋳型L．lactis subsp．cremorisファージR1-tの溶原サイクルから溶菌サイクルへの変換は、ファージによってコードされる溶菌機能により引き起こされる宿主細胞の溶解をもたらし、次いで、ファージ粒子が放出される。R1-tのＤＮＡ配列を調べると、計算による分子量が30,214 Daである270個のアミノ酸のタンパク質を特定するORF 23が、L．lactisバクテリオファージc2 （配列番号８）およびφML3(26，18)の溶解素遺伝子とかなり類似していることが分かった。ORF 23の推論されるアミノ酸配列とc2溶解素との類似性を図２に示す。さらに、ORF 23は、Streptococcus pneumoniaeバクテリオファージHB-3のアミダーゼHb1(16)およびS．pneumoniae LytA自己溶菌酵素(5)のＮ−末端タンパク質のアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列を有する。従って、ORF 23（以降、ly tRと言う（図３）（配列番号７））は、ファージによってコードされる溶解素遺伝子である可能性がある。このことは、先に引用したYoungの文献から明らかなように、予想できなかったことである。この推測をテストするために、lytRをＩＰＴＧ誘発性発現ベクターに入れてクローン化すると、pAG58Rが得られた（図１Ｂ）。pAG58Rを含む大腸菌細胞の無細胞抽出物の溶菌活性を、 Micrococcus lysodeikticusの加圧滅菌した細胞壁を共重合させて、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで測定した。細胞壁含有ゲルをメチレンブルーで染色した後、挿入した細胞壁の破壊による溶菌タンパク質に対応する位置に透明化ゾーン出現が予想される。図４に示すように、pAG58を含む大腸菌細胞の無細胞抽出物では、lytRによってコードされるタンパク質の予想分子量を有するタンパク質に対応する位置に透明化ゾーンは存在しなかった。しかし、pAG58Rを含む細胞の無細胞抽出物は、予想した位置に透明化ゾーンを生じた。未誘発細胞の無細胞抽出物は、lytR遺伝子の発現が少なく、弱い透明化ゾーンが得られた。誘発したpAG5 8R含有細胞の無細胞抽出物は広い透明化ゾーンを示し、誘発の２時間後に得られた抽出物では非常に大きくなった。 von Heijneの規則(25)によれば、lytRは、分泌輸送系により分泌されたタンパク質に対して特異的なシグナル配列は含んでいないと思われる。このシグナル配列の見かけ上の欠如は、グラム陰性菌およびグラム陽性菌両方の他のバクテリオファージの溶解素においても認められている。宿主細胞が溶解してこれらのファージを発生するためには、細胞質膜に穴を形成して、宿主細胞のペプチドグリカン層が溶解素の作用を受けやすくなるようにするタンパク質が必要である(30)。lytRの上流に位置するORF22は、7,688Daの予想分子量を有する75個のアミノ酸のタンパク質を同定する（配列番号６）。その予想されるアミノ酸配列は、他のファージで穴形成性推定タンパク質とは類似性を示さないけれども、ORF22のタンパク質産物（以降、lytPと言う）をコンピューター解析すると、これらのタンパク質との構造上の類似性が予測された。コンピューター解析すると、lytPとされるタンパク質は、βターン立体配置をとる可能性が高い配列を介する、一対のトランスメンブランドメインを含む確率が高いことが分かった（図５）。さらに、帯電したＣ末端を含み、かなり疎水的である。従って、このタンパク質は、R1-tによってコードされるlytRが細胞質膜を通り抜けて放出されるのに必要な穴形成タンパク質として機能すると考えられる。大腸菌での溶菌にはlytPおよびlytRが必要である。 lytPおよびlytR遺伝子産物が宿主細胞の溶解に関与するかどうかを調べるために、lytP、 lytR、ならびにlytPおよびlytRの結合を誘発性発現ベクターpAG58でサブクローン化し、各々、pAG58P、pAG58RおよびpAG58PRを得た（図１Ｂ）。これらのプラスミドを有する大腸菌MC1000を用いて誘発試験を行い、細胞の光学密度に対するクローン化遺伝子の発現の影響を調べた（図６Ａ）。lytR発現の誘発は、光学密度測定によって示されるように、pAG58Rを含む大腸菌細胞の溶解を引き起こさなかった。しかし、lytP発現の誘発は、ほとんどすぐに、pAG58P含有細胞の光学密度の増加を停止した。大腸菌でのlytPおよびlytRの両方の発現は溶菌を招いた。ＩＰＴＧをpAG58PR含有細胞に添加するとほとんどすぐに溶菌が起こった。これは、光学密度の減少によって示され、未誘発の対照と比較してコロニー形成単位（ＣＦＵ）の劇的な減少と関連した（図６Ｂ）。pAG58を有する細胞とpAG58Rを有する細胞との間のＣＦＵの相違はあまり認められなかった。しかし、lytPの誘発は、pA G58P含有細胞の生存力にかなり影響を及ぼした。ＣＦＵの数は、２時間内に200 倍以上低下した。Lactococcus lactisでのlytPおよびlytRの発現 L．lactis細胞の光学密度に対するlytP、lytRまたはlytPおよびlytRの結合の発現の影響を調べるために、プラスミドpIR1P、pIR1R、およびpIR1PRを構築した（図１Ｂ）。これらのプラスミドにおけるlytP、lytRならびにlytPおよびlytRの両方の転写は、その同族オペレーター領域の他にR1-tのリプレッサー(rro)を特定する遺伝子を組み入れる、ファージR1-tの調節領域によってコントロールされる（図１Ｂ参照）。発現は、ＤＮＡを害する物質であるマイトマイシンＣの添加によって誘発した。誘発試験は、上記プラスミドを有するL．lactis subsp．cremoris LL302 細胞に対して行なった。図７は、pIR12を有するL．lactis細胞にマイトマイシンＣを添加すると、pIR1P含有L．lactis細胞と同様に光学密度の増加が遅くなることを示す。マイトマイシンＣを、遺伝的に修飾されていないlactococciに添加すると、細胞のごく一部の溶解を引き起こした（結果は示していない）。lytRの発現ならびにlytPおよびlytRの同時発現は、マイトマイシンＣが添加したpIR12含有細胞と比較して、光学密度の減少を招いた。これは、細胞の溶解を示す。考察本発明者らは、最近、鋳型L．lactis subsp．cremorisバクテリオファージR1- tのヌクレオチド配列を決定した。推論されるアミノ酸配列と種々の（自己）溶菌酵素との類似性に基づいて、ORF23（lytRと命名）がそのファージによってコードされる溶解素を同定すると仮定した。lytR遺伝子産物は、270個のアミノ酸から成り、推定分子量が3 0,214Daである。lytRを発現する大腸菌細胞の無細胞抽出物を分析することにより、lytRが実際に溶菌活性を有するタンパク質を同定することが分かった。 lytRの類似性は、主に、lactococcalバクテリオファージc2およびφvML3の溶解素のＣ−末端部分に限られ、lytRのＮ−末端部分は、S．pneumoniae LytA自己溶菌酵素のＮ−末端部分のアミノ酸配列に類似している。LytAは、二つの機能性モジュール、すなわち、ムレイン基質に対する結合部位を特定するＣ−末端ドメインおよび酵素の特異性を決定するＮ−末端ドメインから成ることが提案されている(16)。LytAはＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ(6)であるので、lytRもＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼであると推測される。見かけ上シグナルペプチドがないため、lytRは、ファージによってコードされる他の多くの溶解素と同様、細胞壁に接近するための別の因子が必要であるという仮説を立てた。lytRのすぐ上流に位置するORF22（lytPと命名）は、いわゆるholinの特徴を有する75個のアミノ酸のタンパク質を同定する。holinは、他のファージの場合、ムレイン基質が、シグナルペプチドのない溶解素の影響を受けやすくなるようにすることが分かっている(30)。この仮説は、大腸菌の有効なin vivoの溶解には、実際、lytPの発現が必要であるという観察によって実証された。事実、lytR発現の誘発は、大腸菌の溶解を生じなかった。しかし、lytRの他にlytPも発現させると、大腸菌は溶解した。これらの結果から、内膜をlytRが通過するのは、lytP遺伝子産物に依存する。lytP のみの誘発は、ほとんど直ちに光学密度の増加を止め、誘発細胞の生存力に劇的な影響を及ぼした。これは、恐らく、内膜の非特異的な傷害およびそれによる膜ポテンシャルの消散を含む、タンパク質の脂質二重層への自然挿入によって引き起こされる(20)。恐らく、lytPは、細胞質膜に穴を形成し、こうして、lytRの細胞壁への接近を可能にする。最近、本発明者らの研究室で、Lactococciに対する誘発性発現系が開発され、 L．lactisでのlytP、lytRならびにlytP およびlytRの結合の発現の影響を調べることが可能になった。L．lactisでのlyt PおよびlytRの結合の発現の結果、細胞の溶解が生じた。大腸菌とは対照的に、l ytRのみの発現でも溶解が認められた。lytRだけを発現する細胞の溶解は、恐らく、マイトマイシンＣおよびlytRの結合効果により引き起こされる。マイトマイシンＣは、細胞の小部分を溶解するので（結果は示さない）、lytRが培地に広がり、こうして、外部から細胞壁に作用し、大腸菌の場合のように溶菌作用を及ぼすためのlytPに対する別の要件は遮蔽される。グラム陰性菌およびグラム陽性菌の両方のバクテリオファージの場合、ムレイン加水分解酵素および該加水分解酵素がそのムレイン基質に接近するために必要な第二のタンパク質に基づく系が溶菌法における一般的な現象であると考えられる。最近、B．subtilisファージφ29によってコードされる溶解素の他に、大腸菌の有効な溶解も遺伝子14産物を必要とすることが分かった。また、いくつかの lactococcalバクテリオファージは、宿主細胞の溶解に必要なさらに別の因子をコードすると考えられる。構造上の類似性に基づいて、バクテリオファージc2およびφvML3はholinをコードすると仮定された(26，30)。L．lactis SK11(14)から単離したビルレントバクテリオファージφU53のORF2の推論されるアミノ酸配列も、holinの特徴的な構造特性を共有し、それは、恐らく、そのファージによってコードされる溶解素lytAの翻訳に関与すると考えられる。しかし、本報告は、Lactococcusで特定されるholinがファージによって誘発される溶菌に必要であることを初めて証明するものである。鋳型Lactococcus lactis subsp．cremorisバクテリオファージR1-tの調節領域および溶解機能を使用する、食品等級の熱誘発性溶菌系の開発序論この系は、鋳型lactococcalバクテリオファージのゲノムＤＮＡのほとんどを食品等級的に除去して、その鋳型バクテリオファージの誘発性調節領域がそのプロファージによってコードされる溶菌機能のすぐ上流に位置するようにすることに基づく。同様の遺伝子構造を有するプロファージに対するこの方法の一般的応用の例として、バクテリオファージR1-tを取り上げた。所望の欠失を得るために、プラスミドpBTS1を構築した（図８）。将来は、rroをrro^TSで置き換えられて熱誘発性としたpBTS2を構築する予定である。実験方法細菌菌株、ファージ、プラスミドおよび培地この系で使用した細菌菌株、ファージおよびプラスミドを表３に示す。大腸菌 JM101は、激しく攪拌しながらTY培養基（１７）中、またはTY寒天上、37℃で増殖した。必要な場合は、アンピシリン、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ガル）（全て、Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO.)製）を、各々、100μg/ml、1mMおよび0.002%（重量／体積）の濃度で使用した。L ．lactis subsp．cremorisは、M17培養基（２１）中、またはM17寒天上、0.5%のグルコースまたはラクトースを補充して、30℃で増殖した。適切な場合、エリスロマイシン（Boehringer Mannheim，GmbH，Germany）およびＸ−ガルを、各々5 μg/mlおよび0.004％（重量／体積）の濃度で使用した。一般的ＤＮＡ技法および形質転換一般的ＤＮＡ技法は、Sambrookら(40)の記載に従って行なった。プラスミドＤＮＡの単離は、BirnboimおよびDoly(1)の方法により、QIAGEN Midi-Plasmid単離カラム（Qiagen Inc.，Chatsworth，CA.）を使用して行なった。制限酵素、アルカリ性ホスファターゼおよびT4 ＤＮＡリガーゼは、Boehringer Mannheimから入手し、使用説明書に従って使用した。大腸菌の形質転換は、MandelおよびHiga(1 2)の記載に従って行なった。L．lactis LL108の形質転換は、Gene Pulser(Bio-R ad Laboratories，Richmond，CA.)を使用する電気穿孔法によって、HoloおよびN es(31)の記載に、LeenhoutsおよびVenema(32)の示唆による改良を加えて行なった。L．lactis R1、R131およびR1K10の電気穿孔法は、van der Lelieら(41)の記載に従って行なった。オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 381A DNA合成装置(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)を使用して合成した。ＰＣＲ反応は、Ventポリメラーゼ(New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA.)を使用して行なった。サンプルを２分間94℃に加熱した後、標的ＤＮＡを、94℃で１分、50℃で２分、73℃で３分の条件下、30 サイクルで増幅した。ＰＣＲ断片を、QIAEX ＤＮＡゲル抽出キット(Qiagen Inc. )を使用して精製した。R1-tファージ粒子およびＤＮＡの単離 L．lactis R1を一夜培養し、500mlの新しいラクトースM17培地で100倍に希釈して、培養物のOD600が0.8に達するまで増殖させ、その時点で、マイトマイシンＣ（Sigma）を2.5μg/mlの最終濃度まで添加した。インキュベーションを30℃、暗所で、溶菌が生じるまで続けた。細胞破片を、6000rpmで10分間、遠心分離することにより除去した。ファージ粒子は、ＮａＣｌ(0.5M)およびポリエチレングリコール6000（10％〔重量／体積〕）とともに、氷上で３時間インキュベートすることにより沈殿させ、Sambrookら(40)に記載のＣｓＣｌ勾配法により精製した。バクテリオファージR1-t懸濁物を、150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウムに対して数回透析した。その懸濁物をフェノールで２回抽出することによりファージＤＮＡを得た。次いで、ＤＮＡ溶液を、10mMのトリス−ＨＣｌ／1mM のＥＤＴＡ(pH8.0)に対して透析した。attB−部位の配列分析バクテリオファージR1-t溶原菌L．lactis R1の結合部位attLおよびattRは、Ve nt(exo^-)ＤＮＡポリメラーゼを有するCircumVent熱サイクルジデオキシＤＮＡ配列分析キット（Biolabs，New England）を使用して、サイクル配列分析により決定した。隣にXbaIおよびPstI部位を有するプライマーattBLおよびattBR（表４）を使用して、L．lactis MG1363のattB部位をクローン化した。attBLおよびattBR によって得た272-bpのＰＣＲ断片をXbaIおよびPstIで切断し、pUC18のXbaI/PstI 部位でクローン化し、ジデオキシ−チェインターミネーター法（39）およびＴ７配列分析キット（Pharmacia AB，Uppsala，Sweden）を使用して配列分析を行なった。ファージ力価測定 L．Lactis R131から得た上清を、1mMのＭｇＳＯ₄で希釈した。指示菌株L．lac tis R1K10を、OD600が0.7になるまでGM17で増殖させた。２mlの培養物を遠心分離し、細胞を２mlの１mM ＭｇＳＯ₄に再懸濁した。希釈した100μlのファージ粒子を200μlの細胞に添加した。室温で20分インキュベートした後、３mlのTop 寒天（0.7％のGM17寒天、0.25％のグリシン、10mM のＣａＣｌ₂）を添加して混合し、グリシン（0.25％）およびＣａＣｌ₂（10mM）を含むGM17寒天−プレート（1.5％）に集めた。そのプレートを 30℃で一夜インキュベートし、プラーク数を求めた。L．Lactis R1K10の再溶原化 L．lactis R1K10にR1-tファージ粒子を感染させた後、濁りプラークを拾い出し、プロファージのＵＶ誘発を付与する能力をテストする。対数増殖期の培養物の細胞を遠心分離して１mlの１mM ＭｇＳＯ₄に再懸濁し、Mineralight U.V.ランプ（UVG-54型、254nm、3.2 Jm-2s-1: Ultra-violet Products Inc.）で10秒間照射した後、１mlのGM17＋10mMＣａＣｌ₂を２回添加する。溶菌が生じるまで培養物を30℃でインキュベートする。マイトマイシンＣ誘発 L．lactisを一夜培養し、新しいグルコースM17培地で100倍に希釈し、OD600が 0.3になるまで増殖させ、その時点で、マイトマイシンＣを１μg/mlの最終濃度まで添加した。プラスミドの構築 pIR1PRの2864-bp EcoRI/SphI断片を、EcoRIおよびSphI で切断したpORI280に入れてサブクローン化することにより、プラスミドpORIR1P RをL．lactis中に構築した（図８）。相同性分析により、R1-tゲノムのORF25は、バクテリオファージphi LC3の(34)のインテグラーゼ遺伝子と98%同一であることが分かり、従って、intRと命名した。intR領域を、ＰＣＲ法ならびにプライマーint1およびint2（表４）を使用して、隣のSacIおよびXbaI部位とともに増幅させた。得られた1326-bpのＰＣＲ断片をSacIおよびXbaIで消化し、pUC18のSacI/X baI部位に入れてクローン化することにより、プラスミドpUC18Intを構築した。５’−切頭intRを含むpUC18Intの1047-bp HindII断片を、pUC18のアルカリ性ホスファターゼ処理したSmaI部位に入れてサブクローン化した。得られたプラスミドpUC18IntdおよびpUC18Intは両方共、大腸菌JM101中に構築した（図９）。この５’−切頭intRを、EcoRIおよびBamHIによりpUC18Intdから切り出し、pORIR1PR のEcoRIおよびBamHI部位に入れてサブクローン化すると、pBTS1が得られた（図８）。後者の構築は、L．lactis LL108中で行なった。将来、この温度誘発性リプレッサーが入手できれば、rroを rro^TSで置き換える。これは、pBTS1の946-bp NcoI-EcoRI断片をrro^TSを含む対応する断片で置き換えることにより行なわれる。この結果、pBTS2が得られる。Cen traal Bureau voor Schimmelcultures（Baarn、オランダ）に寄託されているプラスミドpIR14は、そのような温度感受性rroを含む。詳細は、欧州特許出願9420 1355.8に記載されている。結果プラスミドpBTS1をL．lactis LL108に導入した。図１０に見ることができるように、pBTS1は、マイトマイシンＣ誘発の後も誘発性溶菌を生じることができる。最初の考えは、pBTS1をL．lactis R1に導入することであった。pBTS1は、L．l actisで複製することができないので（プラスミド複製タンパク質RepAのための遺伝子を欠く）、選択的条件下では、R1の染色体に融合する。融合は、３つの相同領域、すなわち、intR領域(A)、調節領域(B)または溶菌機能領域(C)のいずれかで生じる（図１１）。適切なプライマーの組み合わせにより、融合の場所を消すことができる（表５および図１１）。領域ＡまたはＣにおける最初の組換え工程の後、各々、領域ＣまたはＡでの二次組換え工程によって、所望の機能を除き、菌株R1の染色体からプロファージ全体およびプラスミドが削除される。これら二つの組換え工程は、L．lactisの染色体の十分特定された安定な場所にある一複製状態で、溶菌機能をR1-tの調節領域の直接のコントロール下におく。組込みが領域Ｂ（調節領域）で起こる場合、二次組換え工程により、intRおよびrroが、各々、５’−切頭intRおよびrro^TS（今後の研究）で置き換えられることはないだろう。intRの触媒作用による切り出しを防ぐために、インテグラーゼの欠失が必要とされる。 L．lactis R1の形質転換効率が極めて低いので（1形質転換体／μg pVE6007未満）、その天然のプラスミドの菌株の保蔵処理を試みた。L．lactis R1をグルコース上で増殖し、37℃でインキュベートすることにより、約50kbおよび２kbの二つのプラスミドの保蔵処理に成功した。得られた菌株L．lactis R131は、なおも R1-tプロファージを含むことがＵＶ−誘発によって分かった。これまで、pBTS1のL．lactis R131への導入は成功していない。プロファージは、電気穿孔法の後に誘発されると考えられる。これは、回収培地中のＭｇＣｌ₂ およびＣａＣｌ₂の存在とともに、細胞を溶解させる（表６）。従って、最近、二つの付加的手法によってpBTS1組込み体を得ることを試みている。最初に、pBTS1およびpVE6007を共にL．lactis R1K10に導入する。pVE6007 は、pBTS1を複製することができる温度感受性RepAタンパク質をコードする。得られる二重形質転換体をファージR1-tで再溶原化した後、温度を37℃に上げると、pBTS1が染色体に組み込まれる。「食品等級的」誘発性溶菌系を得るための第二の方法は、pBTS1およびpVE6007を共にL．lactis MG1363に導入することである。この菌株のattB領域の配列分析を行なうと、L．lactis R1K10のattB領域との相同性が99%であることが分かった（図１２）。L．lactis MG1363はそのcos部位で連結したR1-t ＤＮＡによって形質転換される。R1-t染色体がMG1363の結合部位にintR触媒作用により組込まれた後（図１２）、温度を37℃に上げると、pBTS 1を組み込むことができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９６年７月１２日【補正内容】請求の範囲１．グラム陽性乳酸菌のバクテリオファージから得られ得るholinを乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該holinをコードする遺伝子は第一調節プロモーターのコントロール下にあり、該第一調節プロモーターは、通常は該holin 遺伝子と関係なく、該holinは、それがある系によって産生される細胞に対して静菌作用を示すことができ、それにより、自己溶菌酵素の自然産生は好ましくは損なわないで、細胞膜に穴をあけることができる、乳酸菌培養物の増殖を阻止する方法。２．さらに、グラム陽性菌またはそれらのバクテリオファージから得られ得る溶解素を乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該溶解素をコードする遺伝子は第二調節プロモーターのコントロール下にあり、該第二調節プロモーターは、通常は該溶解素遺伝子と関係なく、それにより、産生した溶解素が乳酸菌の細胞の溶解を行なう、請求項１に記載の方法。３．グラム陽性菌が乳酸菌である、請求項２に記載の方法。４．第二調節プロモーターが第一調節プロモーターと同じである、請求項２または３に記載の方法。５．holinをコードする遺伝子および溶解素をコードする遺伝子が、一つのオペロンにおいて、同じ調節プロモーターのコントロール下におかれる、請求項４に記載の方法。６．第一もしくは第二プロモーターまたは両方が食品等級成分またはパラメーターによって規制される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。７．乳酸菌培養物が、該培養物を含む製品の一部である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。８．乳酸菌培養物を、乳酸菌の発酵作用によって得られる発酵食品の製造に使用し、次いで、その発酵食品中の乳酸菌を溶菌する、請求項７に記載の方法。９．発酵食品がチーズ製品である、請求項８に記載の方法。１０．さらにチーズの成熟工程を行ない、溶菌した細胞を除去した後の構成成分のいくつかにより、チーズ製品の組成物を変える、請求項９に記載の方法。１１．請求項２または３に記載の方法によって得られた溶菌培養物を殺菌剤として使用する、有害細菌または病原性細菌の除去法。１２．商品の貯蔵期間を改善する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって得られ、遊離のholinもしくは遊離の溶解素またはその両方を含む物質を、ある量で該商品に混入して、得られる商品における有害細菌または病原性細菌の増殖を阻害し、あるいは、それらの生存力を著しく低下させる方法。１３．商品が、食品、化粧品ならびに繊維、硬質表面および皮膚の洗浄用製品から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。１４．ペプチド混合物の変性方法であり、該方法が、（１）乳酸菌培養物をタンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物と結合する工程で、該培養物の細胞は、第一調節プロモーターのコントロール下でholinをコードする遺伝子および第二調節プロモーターのコントロール下で溶解素をコードする遺伝子の両方を含み、第二および第一プロモーターは同じであってもよく、第二および第一プロモーターは通常は各遺伝子と関係しない工程、ならびに（２）プロモーターを誘発してholinおよび溶解素の両方を、乳酸菌の細胞が溶菌され、ペプチドを含む細胞の中身がペプチド混合物の組成物を変性するような量で産生する工程を含む方法。１５．タンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物を、請求項２または３に記載の方法によって得られる溶菌培養物で処理することを含む、ペプチド混合物の変性法。１６．タンパク質が、乳タンパク質もしくは植物タンパク質、またはその両方を含む、請求項１４または１５に記載の方法。１７．holinが、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされ、および／または請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組換えベクターから発現され、および／または請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の組換え細胞によって発現される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。１８．溶解素が配列番号７のアミノ酸配列を有するか、またはそれと機能的に均等である、請求項２〜１７のいずれか一項に記載の方法。１９．グラム陽性乳酸菌または該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られるholinをコードする核酸配列。２０．乳酸菌がL．lactisである、請求項１９に記載の核酸配列。２１．配列番号６のアミノ酸配列をコードする請求項１９または２０に記載の核酸配列またはそれと機能的に均等のもの（配列番号５のヌクレオチド103〜328の核酸配列など）。２２．さらに、通常はholinをコードする配列と関係がない第一調節プロモーターに作動可能に連結した、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の核酸配列。２３．請求項１９〜２２のいずれか一項の核酸配列を含む組換えベクターであって、好ましくは、該ベクターがさらに食品等級のものである組換えベクター。２４．さらに溶解素をコードする核酸配列を含み、holinはグラム陽性乳酸菌から得られ得、溶解素はグラム陽性菌から得られ得るか、あるいは、holinはグラム陽性乳酸菌のバクテリオファージから得られ得、溶解素はグラム陽性菌のバクテリオファージから得られ得る、請求項２３に記載の組換えベクター。２５．グラム陽性菌が乳酸菌である、請求項２４に記載の組換えベクター。２６．乳酸菌がL．lactisである、請求項２５に記載の組換えベクター。２７．さらに、バクテリオファージの天然の結合／組込み系を含み、該系が、例えば、バクテリオファージ結合部位、ならびにholinおよび所望により溶解素遺伝子の組込みが生じるように位置したインテグラーゼ遺伝子を含む、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の組換えベクター。２８．該系が、食品等級の宿主細胞から得られ得るバクテリオファージに由来する、請求項２７に記載の組換えベクター。２９．食品等級の細菌が乳酸菌である、請求項２８に記載の組換えベクター。３０．holinをコードする核酸配列および溶解素をコードする核酸配列が、食品等級メカニズムによって誘発することができる食品等級誘発性プロモーターに作動可能に連結している、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の組換えベクター。３１．誘発性プロモーターが温度感受性複合誘発性プロモーターである、請求項３０に記載の組換えベクター。３２．その天然のバクテリオファージ以外の環境にある請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の核酸配列および／または請求項２３〜３１のいずれか一項に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。３３．さらに溶解素をコードする核酸配列を含む、請求項３２に記載の組換え宿主細胞。３４．溶解素をコードする該核酸配列が、その天然のバクテリオファージまたは細菌以外の環境にある、請求項３３に記載の組換え宿主細胞。３５．該溶解素がグラム陽性菌または該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られ得る、請求項３３または３４に記載の組換え宿主細胞。３６．グラム陽性菌が乳酸菌である、請求項３５に記載の組換え宿主細胞。３７．乳酸菌がL．lactisである、請求項３６に記載の組換え宿主細胞。３８．食品等級宿主細胞である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。３９．食品等級宿主細胞が乳酸菌である、請求項３８に記載の組換え宿主細胞。４０．宿主細胞が、holinおよび／または溶解素をコードする核酸配列が得られるのと同じ種類のものである、請求項３８または３９に記載の組換え宿主細胞。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者コク，ヤンオランダ国、エヌ・エル−9714・ハー・エル・フロニンゲン、フアン・ハメルストラート・34 (72)発明者レデブール，アート・エムオランダ国、エヌ・エル−3955・エヌ・エル・ロツテルダム、モンテイニープレイン・８

Claims

【特許請求の範囲】１．グラム陽性菌のバクテリオファージ、特に乳酸菌のバクテリオファージから得られ得るholinを乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該holinをコードする遺伝子は第一調節プロモーターのコントロール下にあり、該第一調節プロモーターは、通常は該holin遺伝子と関係なく、該holinは、それがある系によって産生される細胞に対して静菌作用を示すことができ、それにより、自己溶菌酵素の自然産生は好ましくは損なわないで、細胞膜に穴をあけることができる、乳酸菌培養物の増殖を阻止する方法。２．さらに、グラム陽性菌、好ましくは乳酸菌またはそれらのバクテリオファージから得られ得る溶解素を乳酸菌の細胞内でin situ産生することを含み、該溶解素をコードする遺伝子は第二調節プロモーターのコントロール下にあり、該第二調節プロモーターは、通常は該溶解素遺伝子と関係なく、それにより、産生した溶解素が乳酸菌の細胞の溶解を行なう、請求項１に記載の方法。３．第二調節プロモーターが第一調節プロモーターと同じである、請求項２に記載の方法。４．holinをコードする遺伝子および溶解素をコードする遺伝子が、一つのオペロンにおいて、同じ調節プロモーターのコントロール下におかれる、請求項３に記載の方法。５．第一もしくは第二プロモーターまたは両方が食品等級成分またはパラメーターによって規制される、請求項１または２に記載の方法。６．乳酸菌培養物が、該培養物を含む製品の一部である、請求項１または２に記載の方法。７．乳酸菌培養物を、乳酸菌の発酵作用によって得られ得る発酵食品の製造に使用し、次いで、その発酵食品中の乳酸菌を溶菌する、請求項６に記載の方法。８．発酵食品がチーズ製品である、請求項７に記載の方法。９．さらにチーズの成熟工程を行ない、溶菌した細胞を除去した後の構成成分のいくつかにより、チーズ製品の組成物を変える、請求項８に記載の方法。１０．請求項２に記載の方法によって得られた溶菌培養物を殺菌剤として使用する、有害細菌または病原性細菌の除去法。１１．商品の貯蔵期間を改善する方法であって、請求項１または２に記載の方法によって得られ、遊離のholinもしくは遊離の溶解素またはその両方を含む物質を、ある量で該商品に混入して、得られる商品における有害細菌または病原性細菌の増殖を阻害し、あるいは、それらの生存力を著しく低下させる方法。１２．商品が、食品、化粧品ならびに繊維、硬質表面および皮膚の洗浄用製品から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。１３．ペプチド混合物の変性方法であり、該方法が、（１）乳酸菌培養物をタンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物と結合する工程で、該培養物の細胞は、第一調節プロモーターのコントロール下でholinをコードする遺伝子および第二調節プロモーターのコントロール下で溶解素をコードする遺伝子の両方を含み、第二および第一プロモーターは同じであってもよく、第二および第一プロモーターは通常は各遺伝子と関係しない工程、ならびに（２）プロモーターを誘発してholinおよび溶解素の両方を、乳酸菌の細胞が溶解され、ペプチドを含む細胞の中身がペプチド混合物の組成物を変性するような量で産生する工程を含む方法。１４．タンパク質のタンパク質分解によって得られたペプチド混合物を、請求項２に記載の方法によって得られる溶菌培養物で処理することを含む、ペプチド混合物の変性法。１５．タンパク質が、乳タンパク質もしくは植物タンパク質、またはその両方を含む、請求項１３または１４に記載の方法。１６．holinが、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列によってコードされ、および／または請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組換えベクターから発現され、および／または請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の組換え細胞によって発現される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。１７．溶解素が配列番号７のアミノ酸配列を有するか、またはそれと機能的に均等である、請求項２〜１６のいずれか一項に記載の方法。１８．乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られるholinをコードする核酸配列。１９．配列番号６のアミノ酸配列をコードする請求項１８に記載の核酸配列またはそれと機能的に均等のもの（配列番号５のヌクレオチド103〜328の核酸配列など）。２０．さらに、通常はholinをコードする配列と関係がない第一調節プロモーターに作動可能に連結した、請求項１８または１９に記載の核酸配列。２１．請求項１８〜２０のいずれか一項の核酸配列を含む組換えベクターであって、好ましくは、該ベクターがさらに食品等級のものである組換えベクター。２２．さらに、溶解素をコードする核酸配列を含み、holinおよび溶解素が共に乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られる、請求項２１に記載の組換えベクター。２３．さらに、バクテリオファージの天然の結合／組込み系を含み、該系が、例えば、バクテリオファージ結合部位、ならびにholinおよび所望により溶解素遺伝子の組込みが生じるように位置したインテグラーゼ遺伝子を含むことができ、該系が、好ましくは、食品等級の宿主細胞、好ましくは乳酸菌から得られ得るバクテリオファージに由来する、請求項２１または２２に記載の組換えベクター。２４．holinをコードする核酸配列および溶解素をコードする核酸配列が、食品等級メカニズムによって誘発することができる食品等級誘発性プロモーターに作動可能に連結し、該プロモーターが例えば温度感受性複合誘発性プロモーターである、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の組換えベクター。２５．その天然のバクテリオファージ以外の環境にある請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の核酸配列および／または請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の組換えベクターを含む組換え宿主細胞。２６．さらに溶解素をコードする核酸配列を含み、該溶解素が好ましくは乳酸菌などのグラム陽性菌、特にL．lactisまたは該グラム陽性菌由来のバクテリオファージから得られ得、溶解素をコードする該核酸配列が好ましくはその天然のバクテリオファージまたは細菌以外の環境にある、請求項２５に記載の組換え宿主細胞。２７．食品等級宿主細胞、好ましくは乳酸菌であり、最も好ましくは、該宿主細胞が、holinおよび／または溶解素をコードする核酸配列が得られるのと同じ種類のものである、請求項２５または２６に記載の組換え宿主細胞。